Camila Pinto Da Cunha

7/21/2019 Camila Pinto Da Cunha

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Universidade de So PauloEscola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

Desenvolvimento de marcadores microssatlites e caracterizao dadiversidade gentica molecular de acessos de alho (Al lium sativumL.)

Camila Pinto da Cunha

Dissertao apresentada para obteno do ttulo de Mestre emCincias. rea de concentrao: Gentica e Melhoramento dePlantas

Piracicaba2011


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Camila Pinto da CunhaEngenheira Agrnoma e Licenciada em Cincias Agrrias

Desenvolvimento de marcadores microssatlites e caracterizao dadiversidade gentica molecular de acessos de alho (All ium sativumL.)

Orientador:Prof. Dr. JOS BALDIN PINHEIRO

Dissertao apresentada para obteno do ttulo de MestreCincias. rea de concentrao: Gentica e Melhoramento dePlantas

Piracicaba2011


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DadosInternacionais de Catalogao na PublicaoDIVISO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP

Cunha, Camila Pinto daDesenvolvimento de marcadores microssatlites e caracterizao da diversidade

gentica molecular de acessos de alho (Allium sativum L.)/ Camila Pinto da Cunha. - -Piracicaba, 2011.

91 p. : il.

Dissertao (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2011.

1. Alho 2. Diversidade gentica 3. Germoplasma vegetal 4. Marcador molecularI. Ttulo

CDD 635.26C972d

Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor


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AGRADECIMENTOS

Agradecimento especial a Dra. Aluana Gonalves de Abreu, Carlos Eduardo de Arajo Batista,

Guilherme da Silva Pereira, Dra

. Maria Imaculada Zucchi, Dra

. Mariza Monteiro, Miklos MaximilianoBajay e Dra. Regina Helena Geribello Priolli pelas valiosas dicas sobre os procedimentos laboratoriais

e discusses de resultados. A Talita Moreira Val e Jaqueline Bueno de Campos pela colaborao e

assistncia tcnica. Ao Dr. Francisco Vilela Resende pela concesso de acessos de alho da Embrapa

Hortalias. Ao Prof. Dr. Mrcio de Castro Silva Filho por ceder gentilmente uma cepa de E. coli

TOP10. Aos funcionrios Domingos de Salvio Amaral, Mrcio Arajo Silva e Cladio Roberto

Segatelli pela ajuda no plantio e manuteno do germoplasma. A todos os colegas e funcionrios do

Laboratrio de Diversidade de Plantas e Melhoramento e do Programa de Ps-Graduao em Gentica

e Melhoramento de Plantas, ESALQ/USP, pela amizade e companheirismo. Ao Prof. Dr. Jos BaldinPinheiro, meu orientador, pelos ensinamentos, motivao e amizade. A Profa. Dra. Maria Imaculada

Zucchi e ao Prof. Dr. Giancarlo Conde Xavier de Oliveira pelas disciplinas, Gentica de Populaes

(NG262, UNICAMP) e Evoluo (LGN5803, ESALQ), que mudaram minha forma de pensar gentica.

A minha querida famlia, em especial, meus pais, Gisela e Sidney, meu irmo, Tiago, e Clarete. Ao

Dr. Jos Alberto Caram de Souza Dias e Dr. Cyro Paulino da Costa por serem, para mim, exemplos de

dedicao pesquisa e ensino. Finalmente, agradeo a Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de

Nvel Superior (CAPES) e a Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP,

auxlio pesquisa 2008/02936-5 e bolsa de mestrado 2009/03577-1).


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SUMRIO

RESUMO.................................................................................................................................... 7

ABSTRACT................................................................................................................................ 9

LISTA DE FIGURAS............................................................................................................. .... 11

LISTA DE TABELAS................................................................................................................ 13

1 INTRODUO................................................................................................................. ...... 15

2 REVISO BIBLIOGRFICA................................................................................................ 17

2.1 Importncia da espcie.......................................................................................................... 17

2.2 Sistema reprodutivo e ploidia............................................................................................... 19

2.3 Germoplasma e coleo nuclear........................................................................................... 21

2.4 Marcadores moleculares....................................................................................................... 23

2.5 Microssatlites...................................................................................................................... 25

2.6 Uso de marcadores moleculares em alho.............................................................................. 27

3 MATERIAL E MTODOS..................................................................................................... 29

3.1 Material vegetal.................................................................................................................... 29

3.2 Extrao de DNA.................................................................................................................. 29

3.3 Biblioteca genmica enriquecida com microssatlites......................................................... 30

3.4 Clulas quimicamente competentes e transformao gentica............................................. 32

3.5 Sequenciamento de clones positivos..................................................................................... 32

3.6 Identificao e anlise de motivos microssatlites............................................................... 34

3.7 Desenho de iniciadores......................................................................................................... 34

3.8 Otimizao das reaes em cadeia da polimerase (PCR)..................................................... 35

3.9 Preparo do gel de poliacrilamida e eletroforese.................................................................... 36


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3.10 Diversidade gentica........................................................................................................... 37

3.11 Estruturao gentica.......................................................................................................... 38

4 RESULTADOS E DISCUSSO............................................................................................. 394.1 Extrao de DNA.................................................................................................................. 39

4.2 Motivos microssatlites........................................................................................................ 40

4.3 Iniciadores para locos microssatlites................................................................................... 43

4.4 Gentipos multi locos idnticos (MLGs).............................................................................. 46

4.5 Caracterizao dos locos microssatlites.............................................................................. 48

4.6 Diversidade gentica dos bancos de germoplasma............................................................... 49

4.7 Coleo nuclear..................................................................................................................... 54

4.8 Estruturao gentica de bancos de germoplasma e MLGs................................................. 54

5 CONCLUSES....................................................................................................................... 63

REFERNCIAS.......................................................................................................................... 65

ANEXOS.................................................................................................................................... 83


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RESUMO

Desenvolvimento de marcadores microssatlites e caracterizao da

diversidade gentica molecular de acessos de alho (All ium sativum

L.)

O alho uma hortalia importante no s pelo atrativo culinrio, como tambm pelogrande nmero de propriedades medicinais. A utilizao efetiva de recursos genticos,conservados em bancos de germoplasma, em programas de melhoramento depende de criteriosacaracterizao, utilizando em combinao caracteres agromorfolgicos e marcadoresmoleculares. Neste estudo, 16 novos locos microssatlites especficos para a espcie foramdesenvolvidos, 10 polimrficos. Os bancos de germoplasma de alho, das instituies IAC,ESALQ e Embrapa, foram caracterizados utilizando 17 locos microssatlites polimrficos, setedeles disponveis na literatura. A maioria dos locos foi considerada moderado a altamenteinformativo, com PIC mdio de 0,545 e mximo de 0,851. Foram encontrados 90 alelos, com

riqueza allica mdia de 2,258 alelos por loco e ndice de Shannon de 1,176. A coleo daEmbrapa apresentou destaque, com maior nmero de alelos privados e gentipos multi locos(MLGs). Os 151 acessos avaliados foram representados por 65 MLGs. A estratgia M foiutilizada para definio de uma coleo nuclear, que foi constituda por 16 acessos, comcobertura de 100% dos alelos e mnima redundncia. O GSTgeral foi de 0,200 e para MLGs de0,068, indicando alta diferenciao gentica dentro dos bancos de germoplasma, e GISde 0,195,indicando excesso de heterozigotos, comum em espcies de propagao vegetativa como o alho.A estruturao gentica dos MLGs resultou na distino de dois subgrupos pelo mtodoBayesiano, consistente com os agrupamentos observados no dendrograma e PCA. Os gruposformados apresentaram coerncia com a classificao de acessos de acordo com o ciclofenolgico, em nobres e seminobres. Os marcadores microssatlites desenvolvidos neste trabalho

so ferramentas valiosas para estudos de diversidade gentica, conservao de germoplasma,mapeamento gentico e associativo e espera-se que sejam teis em futuros programas demelhoramento da espcie.

Palavras-chave: Alho; Coleo nuclear; Estruturao gentica; Germoplasma; Repeties deSequncia Simples; SSR


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ABSTRACT

Development of microsatellite markers and characterization ofmolecular genetic diversity among garlic (Al li um sativumL.) accessions

Garlic is an important crop not only for its culinary attractiveness, but also because of ahuge number of medicinal properties. The genetic resources in germplasm requirecharacterization by morphological traits and molecular markers to be effectively used in breedingprograms. A novel set of 16 SSR loci specific to garlic were developed. Ten loci werepolymorphic, moderate to highly informative, with an average PIC of 0.545 and maximum of0.851. A total of 151 accessions of garlic from three Brazilian germplam, IAC, ESALQ, andEmbrapa, were evaluated for genetic diversity using 10 novel polymorphic SSR loci and other 7available in the literature. A total of 90 alleles were detected, the average allelic richness was2.258 alleles per locus and the Shannon index 1.176. The Embrapa collection had the vastmajority of private alleles and multi locus genotypes (MLGs). The whole collection was reducedto 65 MLGs. The M strategy were used to define a core collection, 16 accessions were selectedwith 100% coverage of alleles and minimum redundancy. Overall GSTwas 0.200 and for MLGs,0.068, indicating a high genetic differentiation within collections, and GISwas0.195, indicatingan excess of heterozygosity, which was expected as garlic is vegetatively propagated. MLGswere structured in two subgroups by Bayesian approach, consistent with the clustering based ongenetic distances and PCA. The groups were coherent with the classification of accessionsaccording to phenology (noble and semi-noble). The new SSR loci are tools for future studies ofgenetic diversity, germplasm conservation, mapping, and associative genetics, and hopefully willshed light on garlic breeding programs.

Keywords: Core collection; Garlic; Genetic structure; Germplasm; Simple Sequence Repeats;SSR


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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Extrao de DNA de 80 acessos de alho (Allium sativum L.) do banco degermoplasma do IAC e da ESALQ pelo protocolo de Doyle e Doyle (1990)com modificaes. Anlise da qualidade e concentrao de DNA pelacomparao com padres de 50 ng (1), 75 ng (2), 100 ng (3), 150 ng (4),200 ng (5) e 300 ng (6) de DNA do fago , atravs de eletroforese em gel deagarose 0,8%, TBE 1X (120 V), corado com SYBR Safe (Invitrogen)............... 39

Figura 2Perfis de eletroferogramas de regies SSR isoladas de biblioteca genmica dealho (Allium sativumL.), (A) Asa52, (B) Asa43, (C) Asa36 e (D) Asa29........... 41

Figura 3Percentagem de sequncias SSR com motivos di, tri, tetra e pentanucleotdeodas classes perfeito, interrompido e composto encontradas em biblioteca

genmica de alho (Allium sativumL.).................................................................. 42Figura 4Nmero de repeties de motivos SSR dinucleotdeos (ATou TA)n, (GTou TG

ou CA ou AC)n e (CT ou TG ou AG ou GA)n encontrados em bibliotecagenmica de alho (Allium sativumL.).................................................................. 42

Figura 5 Perfil de genotpico de 80 acessos de lho (Allium sativum L.) em gel depoliacrilamida 7%; (A) Asa24, (B) GB-ASM-040 e (C) Asa10, polimrficos, e(D) Asa23, monomrfico...................................................................................... 45

Figura 6Distribuio das frequncias allicas dos 90 alelos encontrados em acessos dealho (Allium sativum L.) nos bancos de germoplasma do IAC (vermelho),ESALQ (verde), Embrapa (roxo) e global (azul), utilizando 17 locos

SSR....................................................................................................................... 51Figura 7 Histograma das frequncias de 90 alelos encontrados em bancos de

germoplasma de alho (Allium sativumL.) utilizando 17 locos SSR.................... 53Figura 8 Dendrograma construdo a partir da matriz de distncia gentica de Rogers

(1972) modificada por Wright (1978), atravs do critrio de agrupamentoUPGMA, para 65 gentipos multi locos idnticos de alho (Allium sativumL.)identificados nos bancos de germoplasma do IAC, ESALQ e Embrapa. Ocoeficiente de correlao cofentica 0,9060. As barras laterais so referentesaos agrupamentos obtidos pelo programa STRUCTURE para K igual a dois etrs. Valores de bootstrap inferior a 50% no apresentados................................. 59

Figura 9 Grfico com a identificao do K mais provvel pelo mtodo ad hoc K(EVANNO; REGNAUT; GOUDET, 2005) para estruturao gentica de 65gentipos multi locos idnticos de alho (Allium sativumL.) pelo STRUCTURE.... 60

Figura 10Anlise de componentes principais da matriz de distncia gentica de Rogers(1972) modificada por Wright (1978) de 65 gentipos multi locos idnticos dealho (Allium sativum L.) identificados nos bancos de germoplasma do IAC,ESALQ e Embrapa; pontos vermelhos e verdes so referentes aos gruposobtidos pelo programa STRUCTUREpara K igual a 2............................................ 62


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LISTA DE TABELAS

Tabela 1Novos iniciadores SSR para alho (Allium sativumL.)......................................... 44Tabela 2 Iniciadores SSR para alho (Allium sativumL.) desenvolvidos por Ma et al.

(2009).................................................................................................................... 45Tabela 3Gentipos multi locos idnticos (MLGs) com mais de um acesso representante

dos bancos de germoplasma de alho (Allium sativumL.) do IAC, ESALQ eEmbrapa................................................................................................................ 46

Tabela 4Gentipos multi locos idnticos (MLGs) com mais de um acesso representanteidentificados na anlise conjunta dos bancos de germoplasma de alho (Alliumsativum L.) do IAC, ESALQ e Embrapa..............................................................

47Tabela 5Parmetros de diversidade e polimorfismo utilizados para a descrio de locosSSR em alho (Allium sativumL.)......................................................................... 49

Tabela 6 ndices de diversidade obtidos para bancos de germoplasma (BAG) de alho(Allium sativumL.) utilizando marcadores SSR.................................................. 50

Tabela 7Teste exato para determinar aderncia das segregaes ao Equilbrio de Hardy-Weinberg (EHW) de 17 locos SSR em bancos de germoplasma (BAG) de alho(Allium sativumL.)............................................................................................... 55

Tabela 8Estruturao gentica de acessos e gentipos multi locos idnticos (MLGs) dealho (Allium sativum L.) dos bancos de germoplasma do IAC, ESALQ e

Embrapa atravs da estimativa das estatsticas G (Nei, 1973; 1987) eAMOVA............................................................................................................... 56


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1 INTRODUO

O alho (Allium sativum L.), famlia Alliaceae, uma das mais antigas hortalias usada

pela humanidade na culinria, devido ao sabor e aroma, e como planta medicinal. Hoje,apresenta recorde em nmero de pesquisas nas reas mdica, farmacolgica e nutricional e

um fitoterpico reconhecido e aprovado pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

(ANVISA) e pela Organizao Mundial da Sade (OMS). As propriedades medicinais so

inmeras, o consumo regular de alho reduz o risco de doenas cardacas, hipertenso, diabetes,

asma e cncer, para citar alguns exemplos. Por ser um excelente antifngico, bactericida e

inseticida, uma forma eficaz e ecologicamente correta para uso na agricultura no controle

biolgico de pragas. No Brasil, apesar do elevado consumo, com aumento de 4% ao ano, a

rea plantada vem reduzindo e o pas , hoje, dependente de importaes.

Devido importncia econmica do alho, muitos pases, como Alemanha, Argentina,

Austrlia, Brasil, Chile, Coreia do Sul, EUA, Holanda, Itlia, Japo, Reino Unido, Turquia,

entre outros, possuem bancos de germoplasma, mas o uso eficiente dessas colees requer

criteriosa e completa caracterizao, representando economia de tempo e recursos para

indicao de acessos de interesse em programas de melhoramento. Apesar de distines

relativamente simples entre cultivares de alho ser realizada frequentemente atravs de

caracteres agromorfolgicos e fisiolgicos, a alta influncia ambiental e os diferentes critriosem nvel nacional e internacional inviabilizam estudos comparativos.

Assim, os marcadores moleculares so os mais indicados para estudos de diversidade

gentica, mapeamento gentico e associativo, seleo assistida e filogenia, principalmente por

possurem segregao mendeliana e no sofrerem influncia ambiental. Nveis significativos

de variabilidade gentica em alho foram detectados utilizando marcadores RAPD, AFLP, SNP

e, recentemente, microssatlites (SSR). Apesar da grande diversidade de marcadores, os SSR

apresentam destaque, pela ampla distribuio e alta frequncia nos genomas de eucariotos,

com excelente deteco de polimorfismo, reprodutibilidade entre laboratrios e relativo baixo

custo.

Marcadores SSR especficos para a espcie foram desenvolvidos somente recentemente

por Ma et al. (2009) e utilizados para caracterizao de um banco de germoplasma por Zhao et

al. (2011). O pequeno nmero de locos SSR disponveis, quando comparado a outras espcies,

se deve provavelmente a complexidade do genoma, que apesar de diplide um dos maiores


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entre as plantas cultivadas, com excesso de duplicaes intracromossomais, alm de variaes

no caritipo, irregularidades na meiose e autopoliploidia.

O Brasil possui clones com denominaes regionais ou populares, que podem levar a

caracterizaes duvidosas do material, por isso, o estudo da diversidade gentica passoprimordial para conservao de acessos de alho em bancos de germoplasma. O presente

trabalho tem por objetivo o desenvolvimento e otimizao de locos SSR especficos para alho

e utilizao dos novos locos e daqueles disponveis na literatura para a caracterizao da

diversidade gentica dos bancos de germoplasma do Departamento de Gentica

(ESALQ/USP), Instituto Agronmico de Campinas (IAC) e da Embrapa Hortalias

(Embrapa). Entre os objetivos especficos destacam-se, a construo de biblioteca genmica

enriquecida com sequncias SSR e desenvolvimento de marcas informativas, anlise da

diversidade e estruturao gentica dos acessos dentro e entre as colees brasileiras

analisadas, identificao de gentipos multi locos idnticos e determinao de colees

nucleares para cada uma das instituies de pesquisa.


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2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 Importncia da espcie

O alho (Allium sativumL.) uma das mais antigas hortalias cultivada no mundo, usada

na culinria e como planta medicinal desde o perodo Neoltico (5.000 a.C.) pelas primeiras

civilizaes na ndia, China, Egito, Grcia e Roma (BREWSTER, 2008; ERNST, 2007;

ASSOCIAO NACIONAL DOS PRODUTORES DE ALHO - ANAPA, 2009). Hoje o alho

um fitoterpico aprovado pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) e pela

Organizao Mundial da Sade (OMS), recorde em nmero de pesquisas na rea mdica,

farmacolgica e nutricional.

A espcie pertence famlia Alliaceae e ordem Asparagales, segunda em importncia

econmica entre as monocotiledneas ficando atrs apenas dos cereais. O centro de origem

apesar de controverso considerado na sia Central, onde parentes selvagens do atual alho

comercial foram encontrados (SIMON; JENDEREK, 2003; ETOH; SIMON, 2002;

BREWSTER, 2008). Segundo Lisbo et al. (1993), o segundo centro de origem da espcie a

regio do Mediterrneo, se espalhando, em seguida, para China e Europa Ocidental e levado

para a Amrica por colonizadores espanhis, portugueses e ingleses. Vrios foram os eventos

de domesticao da espcie, o que explica a elevada diversidade gentica e adaptaes a

diferentes condies edafoclimticas (LISBO et al., 1993).

O alho uma planta herbcea com folhas lanceoladas, cujas bainhas formam o

pseudocaule; as gemas foliares subterrneas, em condies adequadas, se desenvolvero em

bulbilhos, que envolvidos pelas brcteas formam o bulbo (TRANI et al., 1997). Os bulbos e as

folhas so usados na alimentao, devido ao sabor e aroma, in natura, cozido, frito ou

desidratado. Substncias benficas a sade como oligossacardeos, glicosdeos esteroidais,

flavonides, antocianinas, lecitinas, leos essenciais, pectinas, frutanos, prostaglandinas,vitaminas B1, B2, B6, C e E, biotina, niacina, aminocidos essenciais, adenosina, compostos

fenlicos e selnio esto presentes no alho, mas o alto contedo de compostos volteis de

enxofre, em grande parte na forma de alicina, o responsvel por suas propriedades medicinais

(ARZANLOU; BOHLOOLI, 2010; BANERJEE; MUKHERJEE; MAULIK, 2003; BOZIN et

al., 2008; QUEIROZ et al., 2009).


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Alguns estudos sugerem que seu uso, como suplemento na dieta, aumente a imunidade

sistmica e atue contra problemas cardacos, hipertenso, diabetes e asma, alm de prevenir

alguns tipos de cncer, como de estmago e colo (ABOUL-ENEIN; ABOUL-ENEIN, 2005;

AGARWAL, 1996; ALI; THOMSON; AFZAL, 2000; ARIGA; SEKI, 2006). Na rea denutrio de ruminantes, estudos indicam que o uso de extratos alcolicos de alho na rao

pode substituir o uso de ionforos, auxiliando a fermentao e reduzindo a produo de gs

metano (GARCA-GONZLEZ et al., 2008; PATRA; KAMRA; AGARWAL, 2006).

Alm do uso farmacolgico e nutricional para humanos e animais, na agricultura, o alho

apresenta elevado potencial no controle biolgico de pragas (BANDYOPADHYAY; ROY;

DAS, 2001; CHIAM et al., 1999; CURTIS et al., 2004; FLINT et al., 1995;

GURUSUBRAMANIAN; KRISHNA, 1996; JARIAL, 1996; LATHA et al., 2009;

MACHIAL et al., 2010; PROWSE; GALLOWAY; FOGGO, 2006; REDDY; REDDY;

MURALIDHARAN, 2009; XIA; NG, 2005). Inseticidas comerciais a base de alho j esto

disponveis no mercado, como Garlic Barrier AG (Glendale, CA) e ENVIRepel (Cal Crop

USA, Greeley, CO).

O alho tambm um reservatrio de genes com potencial biotecnolgico, como o gene

ASAL (Allium sativum leaf agglutinin) e ASAII (Allium sativum bulb lectin II) usados,

respectivamente, na produo de plantas transgnicas de arroz resistente a cigarrinhas e

algodo resistente a larvas da ordem Lepidoptera, alm da protena ASS8P20, com atividade

celulsica de interesse industrial (KIM et al., 2010; SADEGHI et al., 2008; SAHA;

DASGUPTA; DAS, 2006; SENGUPTA et al., 2010).

Em termos econmicos, o consumo de alho no Brasil vem crescendo desde 1961,

passando de 0,5 Kg per capita para 1,2 Kg per capita em 2005 (LUCINI, 2008). Na dcada de

80, a produo brasileira supria 90% da demanda interna, hoje o pas dependente de

importaes. China e Argentina juntas suprem 70% da demanda e apenas 30% do alho

consumido internamente produzido nas regies Sul e Centro-Oeste do Brasil, com destaquepara o Cerrado, com produtividade de 15 a 20 toneladas por hectare por ano (LUCINI, 2010).

O grande entrave na produo brasileira se deve a falta de legislao e fiscalizao na

produo de alho-semente, pois, em geral, so os prprios produtores que escolhem os

melhores bulbos para serem plantados na safra seguinte, com isso viroses, nematides, fungos

e bactrias se mantm na cultura levando a produes cada vez menores (ANAPA, 2009). A


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importao de alho da China outro ponto importante, pois os preos baixos reduzem a

competitividade dos produtores nacionais (ANAPA, 2009). Alm disso, h o risco de

contaminao da cultura com pragas quarentenrias, srio problema para a produtividade de

hortalias e para a sade humana (ANAPA, 2009).Apesar do uso na medicina, nutrio e agricultura comprovado cientificamente e da

importncia econmica, o alho tema de poucos estudos bsicos em gentica, principalmente

aqueles que auxiliariam sobremaneira programas de melhoramento gentico da espcie, como

compreenso da infertilidade masculina, florescimento, citogentica e hibridizao, para citar

alguns exemplos. Sendo assim, utilizao de acessos em bancos de germoplasma baixa e os

programas de melhoramento gentico da espcie ficam comprometidos, com poucos avanos

observados. Pases como Alemanha, Argentina, Austrlia, Brasil, Chile, Coreia do Sul, EUA,

Holanda, Itlia, Japo, Reino Unido e Turquia vm colecionando acessos de alho. No entanto,

o uso eficiente dessas colees depender no somente de caracterizao e avaliao

criteriosa, mas tambm de uma melhor compreenso sobre a espcie (MATUS; GONZLEZ;

POZO, 1999; STRAUSS; PINO; COHEN, 1988).

2.2 Sistema reprodutivo e ploidia

O alho comercial estril e sua reproduo realizada exclusivamente por propagao

vegetativa, com presena de apomixia. Apesar de possuir todos os genes para florescimento,

condies fisiolgicas e morfolgicas levam ao bloqueio reprodutivo, pela no produo da

haste floral, aborto da inflorescncia em estdios iniciais de diferenciao ou pela substituio

da flor por bulbilhos areos (ROTEM et al., 2007). A falta de recombinao meitica limita a

variabilidade gentica presente na espcie, resultando em uma enorme quantidade de clones,

mas a grande desvantagem da propagao vegetativa para a agricultura reside na elevada

transmisso de doenas e presena de pragas, que reduzem a produtividade e a qualidade doproduto final e aumentam os custos com armazenamento de material para plantio (SIMON;

JENDEREK, 2003).

A sia Central abrange pases como Afeganisto, Turquia, Ir e Rssia, e nesta regio

que a maior variabilidade do gnero Allium encontrada, so mais de 600 espcies

catalogadas, incluindo ectipos do atual alho comercial, com sistemas reprodutivos distintos


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(SIQUEIRA; TAVARES; TRANI, 1996). A espcie selvagem A. longicuspis, que floresce e

produz sementes frteis, similar ao alho em relao morfologia, caritipo e perfil de

isoenzimas, RAPD e AFLP, chegando a ser considerada por alguns autores como a mesma

espcie (ETOH; SIMON, 2002; IPEK; IPEK; SIMON, 2003; SIMON; JENDEREK, 2003). Ocruzamento entre alho eA. longicuspisproduz hbridos frteis e viveis, o que corrobora para

a hiptese de esta ltima ser a espcie ancestral ou o parente mais prximo do atual alho

comercial (BOZZINI, 1991; ETOH; SIMON, 2002).

Devido a essas descobertas, provvel que o ancestral comum das espcies do gnero

Alliumapresentasse reproduo sexual (SIMON; JENDEREK, 2003). Mudanas no modo de

reproduo so, em geral, correlacionadas a condies ambientais adversas e o habitat natural

do alho ancestral, vales rochosos com clima semi-rido a rido, deve ter favorecido a

reproduo via bulbilhos (SIMON; JENDEREK, 2003; BEATTY et al., 2008). A dormncia

dos bulbilhos poderia ser vantajosa em perodos seco e frio, o que garantiria a sobrevivncia

em condies sub-timas. Com a falta de recombinao gamtica, o desequilbrio de ligao

entre fatores genticos de alto grau adaptativo se perpetuaria, evitando custos adicionais

relacionados ao sexo (FUTUYMA, 2006). Apesar de a propagao vegetativa levar uma

espcie a um beco sem sada evolutivo, a interveno humana pode ter favorecido este

estado e atravs da seleo de clones, novas variedades foram sendo obtidas (BOZZINI,

1991).

Estas hipteses foram confirmadas por Etoh e Simon (2002) com a descoberta de acessos

de alho frteis na sia Central, constatando que aps polinizao, 12% das sementes

produzidas germinaram. Esta descoberta permitir a realizao de melhoramento gentico

clssico, usando sementes e seleo de caracteres de interesse. No entanto, o xito da cultura

ainda bastante dependente da variabilidade gentica existente em bancos de germoplasma,

pois novas cultivares so obtidas via seleo de mutaes naturais ou induzidas em caracteres

de interesse (BURBA, 1993; VOLK; HENK; RICHARDS, 2004). Apesar disso, o alhocultivado exibe ampla variao morfolgica e adaptao s mais diversas regies, com

diferentes respostas a temperatura e fotoperodo, em relao ao crescimento, morfologia,

maturao, florescimento ou bulbificao, indicativos de plasticidade fenotpica (POOLER;

SIMON, 1993; SIMON; JENDEREK, 2003; SIQUEIRA; TAVARES; TRANI, 1996).


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O alho comercial diplide, com nmero de cromossomos 2n = 2x = 16, mas h relatos

de variedades com 2n = 2x = 12 e 2n = 2x = 18 (YZBASIOGLU; NAL, 2004). Alhos

tetraplides (2n = 4x = 32) foram encontrados na Itlia apresentando florescimento e produo

de sementes frteis (BOZZINI, 1991). A provvel autopoliploidia amplia ainda mais aspossibilidades de melhoramento gentico e evidencia a complexidade do genoma da espcie,

pois variaes no caritipo de alho foram tambm encontrados em relao localizao de

centrmeros, tamanho dos cromossomos e nmero de cromossomos satlites por Hong et al.

(2000). Alm disso, irregularidades na meiose, presena de multivalentes e delees,

duplicaes e translocaes cromossomais, encontradas no alho e comuns em outras espcies

de propagao assexual, podem estar relacionadas esterilidade de seus gametas (ETOH;

OGURA, 1977; ETOH; SIMON, 2002).

2.3 Germoplasma e coleo nuclear

Os bancos de germoplasma so definidos como unidades de conservao e manuteno de

recursos genticos vegetais, que contenham um nico exemplar de cada material gentico

(gentipo), seja indivduo vivo, semente, plen ou antera (ALLARD, 1971). As colees

possuem uma ampla gama de variedades e cultivares, incluindo aquelas em desuso, as

tradicionais e modernas, alm de parentes selvagens, que constituem a base gentica da

espcie. As cultivares apresentam elevada uniformidade e base gentica estreita e, por isso, a

busca por caractersticas de interesse relacionadas resistncia a estresses biticos ou

abiticos ou aspectos morfolgicos, deve ser feita primeiramente em bancos de germoplasma

da espcie (SINGH; LEBEDA, 2007).

As informaes obtidas pela caracterizao de acessos em bancos de germoplasma devem

estar organizadas em um banco de dados para auxiliar os geneticistas na escolha de acessos de

interesse. A caracterizao morfolgica e molecular das colees garante economia de tempo ede recursos financeiros, alm de permitir a identificao de acessos com mesmo gentipo ou a

necessidade de se coletar mais acessos ou incluir novos acessos provenientes de outros bancos

de germoplasma, com o objetivo de maximizar a variabilidade gentica presente. Outro ponto

importante realizar cada etapa do processo de manuteno de forma rigorosa, da separao


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de material para multiplicao, plantio, tratos culturais, colheita at o armazenamento,

evitando que materiais geneticamente distintos se percam ou que haja misturas de materiais.

A identificao de uma coleo nuclear, ou seja, de um subconjunto de acessos, que

represente a diversidade de toda a coleo sem redundncia ou que apresente determinadascaractersticas de interesse, tambm de grande auxlio para a tomada de deciso feita por

geneticistas em seus programas de melhoramento gentico (HAMON et al., 1995). Existem

inmeras estratgias descritas para definio de uma coleo nuclear.

Quando os acessos esto agrupados pela origem e no h informaes sobre caracteres

agromorfolgicos ou moleculares, as estratgias C, P e L podem ser usadas, com as colees

nucleares sendo definidas, respectivamente, de forma uniforme entre grupos, como uma

proporo relativa ao tamanho dos grupos e como uma proporo do logaritmo do tamanho de

cada um dos grupos (GOUESNARD et al., 2001).

Na presena de dados moleculares, as estratgias H e M so mais eficazes. A estratgia H

maximiza o nmero de alelos na coleo nuclear atravs da amostragem de acessos em cada

um dos grupos, de forma proporcional a diversidade gentica dentro deles (GOUESNARD et

al., 2001). A estratgia M, apesar de ser derivada da H mais robusta, pois se utiliza de

simulaes de Monte Carlo; assim, a partir de todas as possveis colees, aquela com maior

riqueza allica ou presena de desequilbrio de ligao entre marcas ser a candidata final

(GOUESNARD et al., 2001).

O alho cultivado no Brasil vem do Egito, Mxico e pases da Amrica Latina, entre eles,

Argentina e Peru (LISBO et al., 1993). A variabilidade da espcie no pas est assegurada

em acessos presentes em quatro bancos de germoplasma: Embrapa Hortalias, Empresa de

Pesquisa Agropecuria e Extenso Rural de Santa Catarina (Epagri/CEPA), Escola Superior

de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ/USP) e Instituto Agronmico de Campinas (IAC).

Estes bancos foram caracterizados parcialmente por caracteres agromorfolgicos e

isoenzimticos e recentemente com o uso de marcadores moleculares RAPD e AFLP, queacrescentaram informaes relevantes quanto representatividade destas colees e a relao

entre acessos.

De acordo com Siqueira, Tavares e Trani (1996), as variedades de alho so classificadas

de acordo com o ciclo fenolgico em (i) precoces, pouco sensveis ao fotoperodo, com

bulbificao em 4 a 4,5 meses, os exemplo so Branco Mineiro, Cajuru, Canela de Ema,


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Mossor, Gravat e Car; (ii) intermedirios, com ciclo fenolgico mdio entre 4,5 e 5,5

meses, os exemplos so Lavnia, Amarante, Peruano, Cateto Roxo, Areal, Assa, Chins,

Gigante, Gigante de Curitibanos, So Jos, Mendona e Roxinho; e ( iii) tardios, altamente

dependentes de fotoperodo e clima frio, com ciclos longos para bulbificao (mais de 5,5meses), os exemplo so Centenrio, Barbado, Chonan, Jonas, Roxo Prola de Caador e

Quitria.

Os grupos de variedades precoces e intermedirias so tambm conhecidos como alho

seminobre, pois no necessitam de tecnologia para plantio, apresentam baixa produtividade

com aproximadamente quatro toneladas por hectare e mais de 20 bulbilhos por bulbo

(SIQUEIRA; TAVARES; TRANI, 1996). Enquanto, os tardios so, em geral, material

importado, que precisa de vernalizao ou frigorificao antes do plantio, apresentando

elevada produtividade, com at 15 toneladas por hectare, e bulbos grandes e, por isso, so

conhecidos como vernalizados ou nobres (SIQUEIRA; TAVARES; TRANI, 1996).

2.4 Marcadores moleculares

Distines entre cultivares de alho em bancos de germoplasma so usualmente realizadas

por descritores morfolgicos e isoenzimticos (SIQUEIRA et al., 1985; MAA; KLAAS,

1995; BAGHALIAN et al., 2005; MOTA et al., 2005; TRANI et al., 2005; PANTHEE et al.,

2006; HOOGERHEIDE, 2009; OLIVEIRA et al., 2010). Os caracteres agromorfolgicos da

parte area (altura da planta, ngulo de insero e comprimento de folhas e brotao

prematura), bulbos (tamanho dos bulbos e bulbilhos, colorao da tnica do bulbo e pelcula

do bulbilho), florescimento (altura da haste floral, nmero e tamanho de bulbilhos na haste

floral e umbela), rendimento, produtividade, ciclo fenolgico e resistncia a pragas e doenas

e ao armazenamento, por exemplo, possibilitam a identificao de diferentes variedades

(SIQUEIRA; TAVARES; TRANI, 1996; LISBO et al., 1993).No entanto, a classificao de colees baseada somente na diversidade fenotpica

considerada ambgua e incompleta, pois apresenta diferentes critrios em nvel nacional e

internacional, criando situaes confusas quando se pretende realizar uma anlise

comparativa, alm de ser altamente influenciada pelo ambiente. Deste modo, existe uma

grande probabilidade de se encontrar em bancos de germoplasma, acessos com diferentes


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nomes, que apresentam o mesmo gentipo, ou acessos idnticos com diferentes denominaes

(SIQUEIRA; TAVARES; TRANI, 1996). O Brasil possui uma enorme quantidade de clones

com denominaes regionais ou populares, que resultam em caracterizaes duvidosas de

acessos, levando alhicultores a adquirir material para plantio de baixa produtividade ouconservao ps-colheita.

O avano da biologia molecular com o desenvolvimento de tcnicas baseadas em enzimas

de restrio, PCR (Polymerase Chain Reaction) e sequenciamento de DNA, levaram ao

desenvolvimento dos marcadores moleculares, que so definidos como qualquer sequncia de

DNA que revele polimorfismo entre indivduos. Atualmente, so esses marcadores os mais

indicados para estudos de mapeamento gentico, seleo assistida, diversidade gentica,

filogenia e taxonomia e so preferidos em relao aos fenotpicos por apresentarem

segregao mendeliana e ausncia de influncias ambientais.

Os principais marcadores moleculares so: (i) codominantes: RFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphism, BOTSTEIN et al., 1980), SSR (Simple Sequence Repeat, TAUTZ,

1989) e SNP (Single Nucleotide Polymorphism, CHO et al., 1999) e (ii) dominantes: RAPD

(Random Amplified Polymorphic DNA, WILLIAMS et al., 1990) e AFLP (Amplified

Fragment Length Polymorphism, VOS et al., 1995).

Apesar da grande diversidade de marcadores moleculares, os SSR apresentam destaque

em relao aos demais, por serem altamente polimrficos e por possurem ampla distribuio e

frequncia nos genomas de eucariotos, com alta reprodutibilidade entre laboratrios

(SCHLTTERER, 2004). Um loco tpico SSR pode apresentar mais de 10 alelos e elevada

heterozigosidade em amostras pequenas, caractersticas de grande interesse em estudos de

gentica de populaes (BOWCOCK et al., 1994, DEKA et al., 1995; PRIMMER et al.,

1996). Por isso, os SSR vm superando o uso de RFLP e RAPD (JARNE; LAGODA, 1996).

A grande vantagem dos SSR o uso de iniciadores especficos para amplificao de regies

genmicas bem definidas, cujo nmero de repeties do motivo SSR ser o responsvel pelavariabilidade observada. A desvantagem da tcnica est no tempo para identificao e

caracterizao de locos e a dificuldade em determinar precisamente o tamanho de fragmentos

(GOLDSTEIN; POLLOCK, 1997).


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2.5 Microssatlites

Microssatlites, SSR (Simple Sequence Repeats) ou STR (Short Tandem Repeats) so

sinnimos de sequncias genmicas compostas por motivos de um a seis nucleotdeosrepetidos em tandem, encontrados em alta frequncia no genoma e localizados tanto em

regies codantes e no codantes, como em clustersna heterocromatina (SCHWARZACHER,

2003; WEBER; MAY, 1989). Os SSRs podem ser neutros ou ter uma funo definida no

genoma, como regular a expresso de genes, conferir patogenicidade em microrganismos,

sinalizar hot spotsde recombinao e servir como um reservatrio de variabilidade gentica

(OLIVEIRA et al., 2006).

Os SSRs no genoma parecem no ocorrer aleatoriamente, especula-se que estas

sequncias surgem espontaneamente via proto-SSR (de novoSSR), atravs de eventos de indel

ou pela insero de formas primrias de SSR via transposons em regies receptivas do genoma

(BUSCHIAZZO; GEMMELL, 2006). Quando duplicaes em tandem so geradas, o deslize

durante a replicao, a recombinao intercromossomal desigual ou a mutao de ponto

podem amplificar ou restringir o comprimento dessas sequncias (BUSCHIAZZO;

GEMMELL, 2006).

O processo de mutao de um dado loco SSR encontra restries, que limitam o tamanho

dos alelos. Em geral, alelos longos tm maior chance de se tornarem menores a cada mutao

e raramente excedero 50 repeties (CALABRESE; DURRETT; AQUADRO, 2001). Com

os limites impostos ao tamanho dos SSR, um restrito nmero de estados allicos pode ser

encontrado, elevando a probabilidade de homoplasia. Apesar das sequncias SSR

apresentarem um equilbrio entre as etapas de expanso e contrao do nmero de repeties,

interrupes ocasionais podem levar a degenerao dessas sequncias, mas provvel que a

taxa de surgimento de novas sequncias seja muito superior a extino, o que explicaria a

riqueza e a ampla distribuio delas nos genomas (BUSCHIAZZO; GEMMELL, 2006).O polimorfismo detectado em locos SSR elevado. Em eucariotos, a taxa de mutao

estimada entre 10-7e 10-3mutaes por loco por gerao e a variao gentica encontrada ,

em geral, caracterizada por elevada heterozigosidade e mltiplos alelos (ELLEGREN, 2004).

Em plantas, a frequncia de SSR inversamente proporcional ao tamanho do genoma e varia


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entre txons, sendo localizados principalmente em regies codantes no traduzidas

(MORGANTE; HANAFEY; POWELL, 2002).

A complexa dinmica mutacional imposta aos SSR influenciada por um grande nmero

de variveis, entre elas: (i) caractersticas da sequncia (nmero de repeties, composio denucleotdeos e tipo do motivo), (ii) contexto genmico (taxa de mutao, composio das

sequncias flaqueadoras e posio no cromossomo), ( iii) contexto biolgico do indivduo

(sexo, idade, ambiente e mecanismo de reparo do DNA), ( iv) influncias seletivas (taxa

metablica, sistema reprodutivo e tempo de gerao) e (v) mecanismos de mutao

(intercmbio intercromossomais, deslize durante a replicao e interrupes) (BALLOUX;

LUGON-MOULIN, 2002; BUSCHIAZZO; GEMMELL, 2006).

O excesso de polimorfismo e a elevada taxa de mutao fazem dos marcadores SSR uma

excelente ferramenta para estudos de gentica de populaes. A definio de um modelo

mutacional terico para SSR obrigatrio para estimar os inmeros parmetros em gentica

de populaes a partir da heterozigosidade observada (OLIVEIRA et al., 2006). Nenhum dos

modelos tericos existentes inclui todas as variveis que influenciam na dinmica mutacional

dessas sequncias, no entanto, um modelo dever ser escolhido a priori.

Os modelos de mutao amplamente difundidos so o Infinite Alleles Model (IAM;

KIMURA; CROW 1964; LEWONTIN; HUBBY, 1966; TAJIMA, 1996) e o Stepwise

Mutation Model(SMM; KIMURA; OHTA, 1978). Muitos outros modelos esto descritos na

literatura, grande parte deles derivada ou baseada no IAM e SMM.

No modelo IAM, cada nova mutao, gera um novo alelo, a uma taxa conhecida, ,

assim, alelos idnticos o sero por descendncia (BALLOUX; LUGON-MOULIN, 2002). No

entanto, alelos SSR com motivos e nmero de repeties idnticos podem s-lo por

homoplasia e no por descendncia, pois sofreram passos mutacionais distintos. Esse modelo

s til se considerarmos que alelos idnticos so em estado (estrutura) e no devido

ancestralidade comum (ELLEGREN, 2004). As estatsticas F de Wright (1931) esto emconformidade com esse modelo mutacional (OLIVEIRA et al., 2006).

Outra opo o modelo SMM, que pressupe a cada nova mutao a gerao de um novo

alelo pela adio ou deleo de uma unidade de repetio SSR, com probabilidade igual /2

nas duas direes. Assim, alelos com tamanhos diferentes sero mais divergentes daqueles

com tamanhos similares (BALLOUX; LUGON-MOULIN, 2002). A restrio do modelo


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SMM que este no leva em conta as restries observadas no tamanho dos alelos, nem a

presena de homoplasia (ELLEGREN, 2004; OLIVEIRA et al., 2006). As estatsticas de

Slatkin (1995) e as de Nei (1973) utilizam alternativas do modelo SMM para estimao de

parmetros populacionais.Apesar dos modelos mutacionais especficos para SSR no refletirem todas as inmeras

variveis que afetam o ciclo de vida dessas sequncias, sua utilizao permite que estimativas

confiveis sobre a histria evolutiva de populaes naturais ou a relao entre acessos em

bancos de germoplasma sejam obtidas, vide o grande nmero de estudos disponveis na

literatura.

2.6 Uso de marcadores moleculares em alho

Nveis significativos de variabilidade gentica tambm foram observados em clones de

alho, presentes em bancos de germoplasma, usando marcadores moleculares dos tipos RAPD

(MAA; KLAAS, 1995; BRADLEY; RIEGER; COLLINS, 1996; AL-ZAHIM; NEWBURY;

FORD-LLOYD, 1997; MOTA et al., 2004, 2006; BAGHALIAN et al., 2005;BRANDOLINI

et al., 2005; FIGLIUOLO; DI STEFANO, 2007; VIEIRA; NODARI, 2007; BUSO et al.,

2008; IPEK; IPEK; SIMON, 2008b), AFLP (GARCA LAMPASONA; MARTNEZ;

BURBA, 2003; IPEK; IPEK; SIMON, 2008a; MORALES et al., 2010; VOLK; HENK;

RICHARDS, 2004) e mais recentemente SSR, com o desenvolvimento de oito marcas

polimrficas (MA et al., 2009; ZHAO et al., 2011).

Avanos na compreenso da gentica da espcie comearam com os estudos de

diversidade gentica, mas com a descoberta de acessos frteis estudos de grande interesse para

o melhoramento se tornaram possveis, como o mapeamento gentico. Novas ferramentas,

como o banco de dados de sequncias expressas de alho (EST; Expressed Sequence Tags)

GarlicESTdb, com 21.595 sequncias catalogadas, e a biblioteca BAC (Bacterial ArtificialChromossome) so valiosas para compreenso da gentica da espcie a nvel celular e

molecular, ainda pouco investigada (KIM et al., 2009; LEE et al., 2003). Tcnicas de

transformao gentica via Agrobacterium e bombardeamento j esto disponveis na

literatura, ampliando ainda mais as possibilidades de estudos genticos com a obteno de


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transgnicos, de interesse acadmico ou at comercial (KENEL; EADY; BRINCH, 2010;

SAWAHEL, 2002; ZHENG et al., 2004).

A espcie conta com um mapa de ligao baseado em marcas de EST-SNPs para

compreenso da fertilidade masculina observada em clones frteis e um mapa gentico debaixa densidade baseado em marcas de AFLP para enzimas relacionadas s propriedades

medicinais da planta (IPEK et al., 2005; ZEWDIE et al., 2005). O alto nmero de marcas com

segregao com a proporo 15:1 so evidncias do alto ndice de heterozigosidade e

duplicao (IPEK et al., 2005). Aliado a este fato est o tamanho do genoma do alho com

15.900 Mbp DNA por ncleo 1C, um dos maiores entre as plantas cultivadas, seis a 16 vezes

superior ao de arroz, indcios da complexidade do genoma da espcie (OHRI; FRITSCH;

HANELT, 1998; HAVEY et al., 2008).

Os mapas genticos so um grande avano para a espcie, mas necessitam de maior

nmero de marcas polimrficas para uma ampla e efetiva cobertura dos cromossomos e

obteno de maior confiabilidade na correlao de locos e caractersticas agronmicas. Entre

os marcadores moleculares, os SSR so os mais indicados para uma ampla gama de estudos

em gentica, principalmente, por serem altamente informativos e abundantes nos genomas.

Apesar de oito marcas SSR, especficas para alho, j estarem disponveis na literatura,

somente com a disponibilidade de maior nmero de marcas que estudos genticos mais

complexos podero ser realizados.

As possibilidades de melhoramento da espcie so, hoje, enormes, de melhoramento

clssico, mutagnese, manipulao da ploidia at transgenia, deixando para trs a idia

restritiva de seleo de mutaes naturais. No entanto, o estudo da diversidade gentica em

bancos de germoplasma passo primordial no s para conservao, manuteno e

classificao das colees, mas tambm para a identificao de acessos de interesse para

futuros programas de melhoramento gentico.


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3 MATERIAL E MTODOS

3.1 Material vegetal

No total foram avaliados 151 acessos de alho pertencentes a bancos de germoplasma

(BAGs) brasileiros: Instituto Agronmico de Campinas (IAC, Campinas/So Paulo) e

Departamento de Gentica, ESALQ/USP (Piracicaba/So Paulo), com 63 e 17 acessos (Anexo

A), respectivamente, e 71 acessos da Embrapa Hortalias (Braslia, Distrito Federal) (Anexo

B). Os acessos da Embrapa Hortalias foram selecionados de forma a incluir acessos de

diferentes origens, buscando manter a representatividade da coleo como um todo. Os

acessos do IAC e ESALQ foram plantados em campo experimental na ESALQ/US. Os

acessos nobres da Embrapa foram vernalizados (cmera fria a 10C) por 20 dias, quando

iniciaram a brotao e, em seguida, plantados em vasos na estufa. Folhas jovens foram

embaladas e transportadas para o laboratrio em nitrognio lquido e liofilizadas por 72 horas

a 50C e 0,04 mbar (Freeze Dryer ALPHA 1-2LD Plus, Christ). O material vegetal seco foi

triturado em moinho de facas e armazenado em frascos plsticos devidamente identificados

em temperatura ambiente.

3.2 Extrao de DNA

A extrao de DNA foi realizada de acordo com Doyle e Doyle (1990) com modificaes.

Em tubo, 800 L de tampo de extrao pr-aquecido (CTAB 2%, 1,42 M NaCl, 20 mM

EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, PVP 2% e -mercaptoetanol 0,6%) foram adicionados a 25

mg do material vegetal e mantidos em banho-maria 65C por 40 min. Aps a adio de 450

L de fenol e centrifugao a 10.000 rpm por 10 min, a fase intermediria formada (aquosa e

translcida) foi transferida para novo tubo. As etapas de transferncia do sobrenadante paranovo tubo e centrifugao foram repetidas aps a adio de 450 L de 1:1 fenol:CIA (CIA,

24:1 clorofrmio:lcool isoamlico) e 450 L de CIA. A precipitao do DNA foi realizada

com 600 L de isopropanol gelado e 100 L de 7,5 M de acetato de amnio, com incubao a

20C por 1h. O precipitado foi lavado, em duas etapas consecutivas, com etanol 70% e etanol

absoluto com centrifugao a 10.000 rpm por 5 min. O precipitado foi seco em temperatura


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Fragmentos contendo sequncias SSR foram selecionados pelas sondas biotinoladas,

Biotina-IIIII(CT)8 e Biotina-IIIII(GT)8, complementares s sequncias repetitivas GAe CA, e

recuperados pela Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles (Promega), de acordo

com fabricante, e detalhado a seguir. O DNA purificado foi diludo na proporo 1:4 em guamilli-Q (Millipore Corporation) e desnaturado a 95C por 15 min. Ao DNA foram adicionados

13 L de SSC 20X (3 M NaCl, 0,3M citrato de sdio, pH 7) e 3 L de cada um dos oligos

biotinolados e incubado temperatura ambiente por 20 min. Em seguida, microesferas

magnticas pr-lavadas foram adicionadas a mistura de hibridizao e incubada a temperatura

ambiente por 10 min. Os fragmentos contendo SSR foram recuperados, aps magnetizao,

atravs de lavagens das microesferas em SSC 0,1X, em 250 L d e gua milli-Q e armazenado

a20C.O nmero de cpias dos fragmentos selecionados foi amplificado via PCR, com tampo

1X, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,4 M de Rsa21, 3 U TaqDNA Polimerase (Fermentas

Life Science) e 20 L de suspenso de fragmentos selecionados, volume final de 100 L. A

reao foi realizada em termociclador BIORAD PTC-100 Peltier, com desnaturao inicial a

95C por 4 min; 30 ciclos 94C por 40 s, 60C por 1 min e 72C por 1 min; e extenso final a

72C por 8 min. O produto da reao foi analisado atravs de eletroforese em gel de agarose

1%, TBE 1X (100 V), corado com SYBR Safe (Invitrogen).

Os fragmentos amplificados foram clonados em pGEM-TEasy Vector System(Promega),

de acordo com fabricante. Clulas de Escherichia coli linhagem TOP10 competentes

quimicamente foram transformadas em dois eventos independentes e um evento controle

(vetor sem inserto). No total 770 colnias brancas (clones transformados) foram isoladas com

palitos estreis (esterilizados em autoclave a 120C por 20 min) e transferidas para meio 2YT-

HMFM lquido (1,6% de triptona, 1% de extrato de levedura, 0,5% de NaCl, 0,0076% de

MgSO47H2O, 0,045% de citrato de sdio, 0,09% de (NH4)2SO4, 4,4% de glicerol, 0,18% de

KH2PO4 e 0,47% de K2HPO4), com 100 g mL-1

de ampicilina em placas do tipo ELISA(Costar), fechada com adesivo (ABgene) com furos para aerao. Os clones foram incubados a

37C por 18 h e, em seguida, armazenados em ultrafreezer a 80C, devidamente

identificados.


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3.4 Clulas quimicamente competentes e transformao gentica

Recipientes, solues e meios de cultura foram esterilizados em autoclave (120C por 20

min), exceto glicerol. Colnia isolada e purificada deE. colilinhagem TOP10 foi incubada em5 mL de meio LB lquido (0,1% de triptona, 0,05% de extrato de levedura, 0,1 % de NaCl, pH

7,0) a 37C por 18 h. A suspenso bacteriana foi diluda na proporo 1:100 em meio LB e

incubada a mesma condio com constante monitoramento, at atingirem leitura entre 0,5 e

0,6 em espectrofotmetro a 600 nm. E, em seguida, transferida para tubos de centrfuga pr-

refrigerados a 4C, centrifugado a 5.000 rpm por 10 min (Rotina 380R, Hettich).

O sobrenadante foi descartado e as clulas, mantidas no gelo, foram ressuspendidas em

100 mL de 100 mM MgCl2pr-refrigerado e incubadas por 30 min. Aps centrifugao (4.000

rpm por 10 min a 4C), o sobrenadante foi descartado e as clulas ressuspendidas em 10 mL

de soluo contendo 100 mM CaCl2e 15% de glicerol, pr-refrigerados. Alquotas de 100 L

foram transferidas para tubos plsticos e armazenadas em ultrafreezera80C.

Para transformao, 100 L de clulas quimicamente competentes foram descongeladas

em gelo, evitando assim a perda da viabilidade e competncia, e mi sturada a 8 L de vetor de

clonagem e 32 L de tampo de transformao (100 mM KCl; 30 mM CaCl2; 50 mM MgCl2;

1,5% PEG) e incubada em gelo por 5 min. O choque trmico foi realizado a 37C por 10 min.

Em seguida, 1 mL de LB lquido foi adicionado a mistura e incubada imediatamente a 37C

por 1 h. A suspenso foi aplicada em placas de Petri contendo LB com 10 mg mL-1 de

ampicilina, 60 L de IPTG 20% e 90 L de X -Gal 2% e incubadas a 37C por 18 h. Colnias

brancas contendo o plasmdeo de interesse foram isoladas com descrito no item anterior.

3.5 Sequenciamento de clones positivos

No total 192 clones aleatrios foram preparados para sequenciamento. Estes forammultiplicados em meio LB lquido contendo 100 g mL-1 de ampicilina em placa com 96

canaletas de poo fundo (ABgene), a 37C por 22 h sob agitao a 300 rpm (G24

Environmental Incubator Shaker). A placa, com as suspenses bacterianas, foi centrifugada a

3.000 rpm por 6 min. O sobrenadante foi descartado e 240 L de GTE (0,92% glicose, 26 mM


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Tris-HCl pH 7,4, 10 mM EDTA pH 8) foram adicionados a cada poo, a placa foi agitada em

vortex por 2 min. Aps centrifugao a 4.000 rpm por 6 min, o sobrenadante foi descartado.

Foram adicionados 80 L de GTE ao precipitado e agitado em vortex por 5 min, 60 L da

suspenso foi transferida para placa ELISA (Costar) contendo 5 L de RNAse 10 mg mL -1(Ribonuclease A, Sigma) e 60 L de 0,2 mM NaOH -1% SDS por poo. A placa foi misturada

por inverso aps selagem com adesivo selador (ABgene) e incubada a temperatura ambiente

por 10 min. Aps spincom rotao mxima de 1.000 rpm, 60 L acetato de potssio 3 M

gelado foram adicionados a cada poo e a placa misturada por inverso devidamente selada, e

incubada a 90C por 30 min. A placa, aps esfriar no gelo por 10 min, foi centrifugada a 4.000

rpm por 4 min. O sobrenadante foi transferido para filtro (placa filtro, Millipore) acoplado a

placa com fita adesiva e centrifugado a 4.000 rpm por 4 min a 20C. Ao filtrado foram

adicionados 110 L de isopropanol. A placa foi misturada por inverso com adesivo selador

(ABgene) e centrifugada a 4.000 rpm por 45 min a 20C.

O sobrenadante foi descartado cuidadosamente e cada precipitado lavado com 180 L de

etanol 70% gelado, seguido de centrifugao a 4.000 rpm por 5 min a 20C. Aps descarte do

sobrenadante, os precipitados secaram em temperatura ambiente e foram ressuspendidos em

60 L de gua milli-Q. A qualidade da extrao plasmidial foi verificada em eletroforese em

gel de agarose 0,8%, TBE 1X (100 V), corado com SYBR Safe (Invitrogen), com marcador de

peso molecular de 100 bp (Fermentas Life Science).

A reao da PCR para sequenciamento foi realizada com 2 L de tampo Save Money (5

mM MgCl2, 200 mM Tris-HCl, pH 9), 5 pM iniciador SP6 (5CATACG

ATTTAGGTGACACTATAG3), 2 L da extrao plasmidial e 0,4 L de BigDye Terminator

v3.1 (Applied Biosystems) em volume final de 10 L. O programa apresentou desnaturao

inicial a 96C por 2 min; 26 ciclos 96C por 45 s, 50C por 30 s e 60C por 4 min. A reao foi

purificada antes do sequenciamento, em cada poo da placa foram adicionados 80 L de

isopropanol 65%.A placa foi deixada em repouso, ao abrigo da luz, por 15 min, e ento centrifugada a

4.000 rpm por 45 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 200 L de

etanol 70% e seco em temperatura ambiente, em local protegido da luz, por 1 h. O DNA foi

ressuspendido em 4 L de formamida deionizada (Hi-Di, Applied Biosystems). Antes do

sequenciamento, as amostras foram desnaturadas em termociclador, a 90C por 3 minutos, e


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colocadas sobre gelo por 5 minutos. A placa foi embalada em papel alumnio e enviada para

sequenciamento em sequenciador automtico capilar 3730 DNA Analyzer (Applied

Biosystems) no Centro APTA Citros Sylvio Moreira, Cordeiroplis, So Paulo. As sequncias

obtidas foram processadas pelo 3730/3730xl Data Collection Software verso 3.0 (AppliedBiosystems).

3.6 Identificao e anlise de motivos microssatlites

Os eletroferogramas referentes ao sequenciamento dos clones foram recebidos em

formato .ab1 e convertidos para o formato FASTA pelo programa BIOEDIT verso 7.0.9.0

(HALL, 1999). A verificao da qualidade e edio manual das sequncias foram realizadas

pelos programas CHROMAS verso 2.33 (Technelysium) e BIOEDIT verso 7.0.9.0 (HALL,

1999), respectivamente. Sequncias de baixa qualidade em todo o seu comprimento foram

excludas. Sequncias SSR foram identificadas pelo aplicativo WEBSAT (MARTINS et al.,

2009) e apenas motivos com o mnimo de 10 bases foram anotados. As sequncias dos

adaptadores (Rsa21 e Rsa25) foram eliminadas antes do desenho dos iniciadores. A

identificao de contigs e sequncias redundantes foi realizada pelo programa SEQUENCHER

verso 4.10.1 build 5828 (Gene Codes Corporation, 2009).

Os SSR foram classificados em relao organizao das repeties do motivo em: (i)

perfeito, quando o motivo no interrompido por nenhuma base diferente (p. ex.

CTCTCTCTCTCT); (ii) imperfeito, quando h um par de bases diferente do motivo (p. ex.

CTCTCTACTCTCT); (iii) interrompido, quando h mais de um par de bases interrompendo as

repeties do motivo (p. ex. CTCTCTGGACACTCTCT); e (iv) composto, quando h dois ou

mais motivos distintos adjacentes (p. ex. CTCTCTCTGAGAGAGA) (WEBER, 1990;

PEAKALL et al., 1998).

3.7 Desenho de iniciadores

O desenho dos iniciadores foi realizado no programa PRIMER3 (ROZEN; SKALETSKY,

1999), com os seguintes parmetros: (i) tamanho do fragmento amplificado variando entre 150

e 250 pb; (ii) tamanho entre 18 e 22 pb; (iii) temperatura de anelamento entre 57C e 60C; (iv)


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variao de temperatura entre forward e reverse de 3C; (v) percentagem de CG entre 40 e

60%; (vi) mxima complementaridade interna de 5 e mxima complementaridade na poro 3

de 3; e (vii) excluso de iniciadores com trs ou mais bases adenina ou timina naporo 3.A

probabilidade de formao de estruturas secundrias (hairpins e loops) foi verificada noprograma GENERUNNER verso 3.05 (Hastings Software Inc., 1994). Os iniciadores com baixa

probabilidade ou no ocorrncia de estruturas secundrias foram escolhidos (G inferior a 2;

BRESLAUER et al., 1986). Os pares de iniciadores selecionados foram sintetizados pela

empresa Eurofins.

Em 2007, Ortiz e colaboradores publicaram informaes sobre uma biblioteca genmica

de Allium sativum L. enriquecida com sequncias SSR e posteriormente nova biblioteca

genmica foi desenvolvida por Mariza Monteiro (dados no publicados), resultando nosiniciadores Asa01 a Asa24, que foram otimizados no presente trabalho. Ma et al. (2009)

publicaram oito locos SSR polimrficos especficos para alho (GB-ASM-35, 40, 52, 59, 72,

78, 80 e 109) que foram tambm sintetizados e usados no presente trabalho.

3.8 Otimizao das reaes em cadeia da polimerase (PCR)

Os iniciadores foram testados com diferentes temperaturas de anelamento: (i) Asa01 ao

Asa12, temperaturas de anelamento variando entre 48C e 65C; (ii) Asa13 ao Asa24, 45C e

60C; (iii) Asa25 ao Asa60, 50C e 55C; e (iv) GB-ASM-035, 40, 53, 59, 72, 80, 109, 45C a

65C. Diferentes concentraes de MgCl2(0,5 mM; 1 mM; 1,25 mM; 1,5 mM; 2 mM; 2,5 mM

e 3mM) foram testadas para os iniciadores que apresentaram bandas fracas ou amplificao

inespecfica. Os testes foram realizados com DNA de trs acessos diferentes Roxo de Araras,

Cateto Branco e Crespo. As concentraes dos reagentes da PCR foram: tampo 1X

(Invitrogen); 1,5 mM MgCl2 (Invitrogen); 0,2 mM dNTP (Fermentas Life Science); 0,2 M de

iniciadoresforwarde reverse; 1 U Taqpolimerase caseira ou Invitrogen e 20 ng de DNA; paraum volume final de 20 L.

As reaes foram realizadas em termociclador BIO-RAD MyClycler, com programa

especificado por Ma et al. (2009), com desnaturao inicial a 94C por 3 min; 30 ciclos a 94C

por 30 s, temperatura de anelamento especfica por 45 s e 72C por 1 min; 10 ciclos a 94C por

30 s, temperatura de anelamento 2C abaixo daquela especificada nos primeiros 30 ciclos por


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45 s e 72C por 1 min; e extenso final a 72C por 10 min. O produto da reao foi visualizado

atravs de eletroforese em gel de agarose 2%, TBE 1X (100 V), corado com SYBR Safe

(Invitrogen), o tamanho do produto da amplificao foi estimado a partir de marcador de peso

molecular de 100 bp (Fermentas Life Science). Produtos de reao, que apresentaram uma ouduas bandas de tamanho esperado, foram testados em gel de poliacrilamida 7%, como descrito

a seguir.

3.9 Preparo do gel de poliacrilamida e eletroforese

A genotipagem dos acessos foi realizada atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida

7%, preparado com 420 g de uria, 233,4 mL de acrilamida:bisacrialamida 29:1 (LGC

Biotecnologia) e 100 mL TBE 1X, aquecido a 40C sob agitao. A soluo foi filtrada duas

vezes consecutivas em filtro de papel e armazenada em frascos de vidro escuro a 4C.

Inicialmente, as placas de vidro (dimenso 35 x 45 cm) foram limpas com detergente e

gua corrente, seguida de etanol 70%. A placa bind foi tratada com 1 mL de cido actico

glacial 0,5%, etanol 99% e 5 L de PlusOne Bind Silane(Amersham Pharmacia Biotech). A

placa repel foi tratada com 1 mL de PlusOne Repel-Silane ES (Amersham Pharmacia

Biotech). O gel foi preparado com 80 mL de acrilamida 7%, 160 L de persulfato de amnio

10% e 160 L de TEMED (tetrametiletilenodiamina; Serva) e vertido entre as placas com

espessura de 0,4 mm.

Aps polimerizao, os gis foram posicionados nas cubas de eletroforese vertical

EPS3500 (Pharmacia Biotech) e a placa foi aquecida em pr-corrida a 70 W (150 mA e 3.500

V), TBE 1X, por 60 min. As amostras foram preparadas com 6 L de reao de PCR e 3 L de

tampo desnaturante (10 mM NaOH, xilenocianol 0,05%, azul de bromofenol 0,05% e 20 mM

EDTA em formamida) e desnaturadas por 5 min a 95C em termociclador e mantidas em gelo

para serem aplicadas rapidamente no gel. O preparo das amostras com formamida evita aformao de bandas fantasmas e permite melhor distino entre alelos prximos. No mximo

foram aplicadas 80 amostras por gel e para determinao do tamanho do fragmento foi

utilizado o marcador de peso molecular de 10 bp (Invitrogen). A eletroforese do gel ocorreu a

70 W por aproximadamente 3 h 30 min, com o tempo de corrida variando conforme o

tamanho do fragmento esperado.


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A colorao foi realizada de acordo com Sanguinetti, Dias Nero e Simpson (1994) com

modificaes. As etapas da colorao foram: (i) fixao, com etanol 10%, cido actico glacial

1%, por 10 min; (ii) impregnao com nitrato de prata 0,2% por 20 min sob agitao; (iii)

revelao com hidrxido de sdio 1,5%, formaldedo 0,15%, por 5 a 20 min; (iv) interrupoda revelao com cido actico 5% por 3 min; e (v) lavagem em gua destilada. Aps secarem,

as placas foram genotipadas manualmente com a ajuda de transiluminador (Konex).

3.10 Diversidade gentica

Os gentipos dos 151 acessos de alho foram determinados atravs da interpretao de gis

de poliacrilamida 7% para os 17 locos SSR polimrficos obtidos. A anlise dos dados foi

realizada considerando os 151 acessos em conjunto e separados em bancos de germoplasma

(BAG), denominados IAC, ESALQ e Embrapa.

O nmero de alelos por loco (A), frequncias allicas, heterozigosidade observada (HO) e

esperada (HE), e Polymorphism Information Content (PIC; BOTSTEIN et al., 1980) foram

calculados pelo suplemento para EXCEL MICROSATELLITE TOOLKIT (MSTOOLS; PARK,

2001). O programa GDA v.1.0 (LEWIS; ZAYKIN, 2009) foi utilizado para a identificao de

alelos privados. A riqueza allica corrigida para tamanho amostral (Ar) e sua varincia

(Var(Ar)) (EL MOUSADIK; PETIT, 1996; HURLBERT, 1971; KREBS, 1989) e o ndice de

diversidade de Shannon-Weaver (IS; SHANNON; WEAVER, 1949) foram calculados pelo

programa MICROSATELLITE ANALYSER(MAS v.4.05; DIERINGER; SCHLTTERER, 2003).

O teste exato para verificar se as segregaes de cada loco por BAG estavam em

concordncia com aquelas esperadas em EHW foi calculado no programa FSTAT verso 1.2

(GOUDET, 1995), com 10.000 permutaes e correo de Bonferroni com nvel nominal a

5% de probabilidade. A identificao de gentipos multi locos idnticos (MLG) foi realizada

pelo programa GENCLONE verso 2.0 (ARNAUD-HAOND; BELKHIN, 2007). Por fim, acoleo nuclear foi determinada pelo programa COREFINDER verso 1.0 (POLICRITI;

SGARRO, 2011) atravs da estratgia M com 10 repeties, mantendo 100% dos alelos

observados.


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3.11 Estruturao gentica

A estruturao gentica entre os bancos de germoplasma foi verificada atravs das

estatsticas G de Nei (1973, 1987), calculadas pelo programa FSTAT verso 1.2 (GOUDET,1995), com os parmetros: (i) heterozigosidade observada (HO), (ii) diversidade gnica mdia

dos BAGs (HS), (iii) diversidade gnica total e corrigida para tamanho amostral (HT e HT,

respectivamente); (iv) diversidade gnica mdia entre BAGs (DST e DST), (v) diferenciao

gentica entre BAGs (GST e GST), e (vi) GIS, deficincia ou excesso de heterozigotos em

mdia, a interpretao dos resultados foi realizada como descrito para as estatsticas F de

Wright (1931), por serem anlogas as estatsticas G (reviso em BALLOUX; LUGON-

MOULIN, 2002; HOLSINGER; WEIR, 2009), e pela Anlise de Varincia Molecular

(AMOVA), desenvolvida por Excoffier, Smouse e Quattro (1992) e calculada no programa

ARLEQUIN verso3.5 (EXCOFFIER; LISCHER, 2010).

O programa STRUCTURE (PRITCHARD; STEPHENS; DONNELLY, 2000) foi utilizado

para determinao da estruturao gentica dos acessos, atravs dos seguintes parmetros: (i)

500.000 simulaes de Cadeias de Markov Monte Carlo;(ii)com descarte inicial(burn in) de

500.000; (iii) modelo de ancestralidade sem miscigenao (no admixture); e (iv) modelo de

frequncias allicas correlacionadas. Foram feitas cinco simulaes para cada agrupamento

(K), variando de 1 a 10. O K mais provvel foi calculado pelo mtodo de Evanno, Regnaut e

Goudet (2005) pelo aplicativo STRUCTUREHARVESTERv.0.6.5 (EARL, 2011).

A matriz de distncias genticas de Rogers (1972) modificada por Wright (1978) (Rogers-

W) foi obtida pelo programa TFPGA v.1.3 (MILLER, 1997) e usada na construo de

dendrograma no programa NTSYS verso 2.1 (Exeter Software, Setauket, Nova Iorque;

ROHLF, 2000), pelo critrio de agrupamento UPGMA (SOKAL; MICHENER, 1958) e

mtodo SAHN (Sequencial, Agglomerative, Hierarquical, and Nested, SNEATH; SOKAL,

1973). A estabilidade dos agrupamentos foi testada atravs de 10.000 reamostragens bootstrape pelo coeficiente de correlao cofentica, calculado pelo teste de Mantel com 1.000

permutaes, no NTSYS verso 2.1 (Exeter Software, Setauket, Nova Iorque; ROHLF, 2000).

A relao entre acessos foi tambm verificada pela Anlise de Componentes Principais (PCA),

utilizando a mesma matriz de distncia gentica da anlise anterior, no programa PAST verso

2.09 (HAMMER; HARPER; RYAN, 2001).


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4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 Extrao de DNA

A extrao de DNA garantiu que o precipitado final apresentasse colorao esbranquiada

a transparente, com baixa contaminao por polissacardeos e compostos fenlicos,

comumente presentes no alho. Somente para efeito ilustrativo, a qualidade e a concentrao do

DNA extrado dos acessos 1 ao 80 podem ser verificadas na Figura 1. Os demais acessos

apresentaram resultados semelhantes.

Figura 1 Extrao de DNA de 80 acessos de alho (Allium sativumL.) do banco de germoplasma do IAC e daESALQ pelo protocolo de Doyle e Doyle (1990) com modificaes. Anlise da qualidade econcentrao de DNA pela comparao com padres de 50 ng ( 1), 75 ng (2), 100 ng (3), 150 ng(4), 200 ng (5) e 300 ng (6) de DNA do fago , atravs de eletroforese em gel de agarose 0,8%,TBE 1X (120 V), corado com SYBR Safe(Invitrogen)


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4.2Motivos microssatlites

O desenvolvimento da biblioteca genmica enriquecida com os motivos SSR, CTe GT,

em alho resultou no isolamento de 768 clones, dos quais 192 tiveram a fita 5-3sequenciada.O tamanho mdio das sequncias originais foi de 847,9 pb, com reduo para 526,5 pb aps

edio, com a deleo em mdia de 38% de nucleotdeos das extremidades 5 e 3

conjuntamente. No total, 32 sequncias foram descartadas por apresentar picos sobrepostos e

excesso de rudo.

Na anlise dos eletroferogramas observou-se, em alguns casos, a terminao abrupta da

sequncia na regio SSR. O aproveitamento das sequncias poderia ser superior ao

apresentado caso houvesse o sequenciamento de ambas as fitas de DNA. Alm disso, estaestratgia garantiria que iniciadores 3 fossem desenhados em regies mais confiveis dos

eletroferogramas.

No total, 40 motivos SSR, contendo no mnimo 10 bases, foram anotados em

eletroferogramas de alta qualidade (Figura 2), nenhum deles redundantes ou formando contigs,

representando uma eficincia de enriquecimento de aproximadamente 21% e reduzida para

18% aps o desenho de iniciadores, pois apenas 35 sequncias foram utilizadas. Em biblioteca

genmica enriquecida com SSR desenvolvida para alho por Ma et al. (2009), o uso de maior

nmero de endonucleases e de sondas biotiniladas di e trinucleotdeo resultaram em eficincia

de enriquecimento 6% superior a apresentada neste trabalho, diferentemente 13% dos clones

foi redundante.

A classe majoritria de SSR encontrados foram os perfeitos (93,4%), seguido de

interrompidos (4,4%) e compostos (2,2%). Os motivos di (57,8%) e trinucleotdeos (28,9%)

apresentaram destaque em relao a tetra e pentanucleotdeos (13,3%) (Figura 3). A relao

completa dos motivos SSR isolados est disponvel no Anexo C.

A classe de SSR dinucleotdeos perfeitos foi a de maior frequncia com 25 motivosisolados, sendo 64% de (CTou TCou GAou AG)n, 32% de (GTou TGou CAou AC)n e 4% de

(ATou TA)n, com n repeties variando entre cinco e 28, com o intervalo entre cinco e oito

repeties com maior nmero de sequncias; apenas um motivo interrompido foi identificado

para esta classe SSR (Figura 4). Os locos SSR dinucleotdeos perfeitos, com maior nmero de

repeties, so ideais para obteno de marcas altamente informativas por apresentarem nveis


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de polimorfismo maior, em decorrncia da taxa de mutao ser superior aos tri e

tetranucleotdeos, por isso, so amplamente utilizados em estudos genticos (ELLEGREN,

2004).

Figura 2 Perfis de eletroferogramas de regies SSR isoladas de bibliotecagenmica de alho (Allium sativum L.), (A) Asa52, (B) Asa43, (C)Asa36 e (D) Asa29

A identificao de maior nmero de sequncias SSR dinucleotdeos das classes (CTou TC

ou GAou AG)n e (GTou TGou CAou AC)n esto em concordncia com o uso das sondas CTe

GT

. Estes motivos foram tambm os mais freqentes em bibliotecas genmicas enriquecidascom SSR, utilizando sondas GAe CA,para 18 espcies das famlias Amaranthaceae, Araceae,

Araliaceae, Brassicaceae, Ebenaceae, Fabaceae, Labiateae, Pedaliaceae, Poaceae,

Polygonaceae, Rosaceae, Rutaceae e Zingiberaceae (Yu et al., 2009).

No total, 84,6% dos motivos trinucleotdeos foram perfeitos, com os motivos (CTT ou

TTC)n e (TCC ou CTT)n com n repeties entre trs e cinco de maior frequncia. Motivos

A

B

C

D


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maiores, como tetra e pentanucleotdeos perfeitos, foram raros e apresentaram de trs a cinco

repeties, curiosamente, um dos pentanucleotdeos apresentou cinco repeties. A baixa

frequncia de tetra e pentanucleotdeos tambm foi relatada por Yu et al. (2009) e Ma et al.

(2009).

Figura 3 Percentagem de sequncias SSR com motivos di, tri, tetra epentanucleotdeo das classes perfeito, interrompido e compostoencontradas em biblioteca genmica de alho (Allium sativumL.)

Figura 4 Nmero de repeties de motivos SSR dinucleotdeos (AT ouTA)n, (GT ou TG ou CAou AC)n e (CTou TGou AG ou GA)nencontrados em biblioteca genmica de alho (Allium sativumL.)

N de sequncias


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4.3 Iniciadores para locos microssatlites

A partir da biblioteca genmica desenvolvida, 36 novos pares de iniciadores SSR foram

desenhados (Asa25 a Asa60). No total, 16 iniciadores foram otimizados, 10 polimrficos eseis monomrficos (Tabela 1), e dos oito iniciadores disponveis na literatura (MA et al.,

2009), sete foram polimrficos (Tabela 2). Para efeito ilustrativo os perfis genotpicos em gel

de poliacrilamida 7% para quatro locos SSR so apresentados na Figura 5. O trabalho foi

concludo com 17 iniciadores polimrficos para anlise da diversidade e estruturao gentica

de BAGs de alho. A melhor concentrao de MgCl2foi de 1,5 mM para todas as reaes de

PCR.

Para os demais iniciadores, a grande maioria dos produtos da PCR, visualizados em gis

de poliacrilamida 7%, resultou em (i) excesso de bandas, provavelmente devido ao tamanho

do genoma do alho, que possui duplicaes (OHRI; FRITSCH; HANELT, 1998; IPEK et al.,

2005), inviabilizando o uso de alguns locos e (ii) amplificao observada em gel de agarose

durante teste inicial e no amplificao em volumes de reaes maiores, provavelmente devido

instabilidade de amplificao como observado por Volk et al. (2004) em marcas AFLP.


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Tabela 1Novosiniciadores SRR para alho (Allium sativumL.)

LocoIniciadores

(5-3)Motivo e repeties Ta (C) Alelos (pb)

GenbankID

Asa04 F:AGACTTTTGGAGGCTAGGGC

R:CCCTGGTCTCTTTCAACCAA(TCC)5 (TCC)4 (TCC)5 54 264 JN084085

Asa06 F:GGGGTGTTACATTCTCCCCT

R:ACCGCCTGATTTTGCATTAG(TG)5 57 192 JN084086

Asa07 F:CTCGGAACCAACCAGCATA

R:CCCAAACAAGGTAGGTCAGC(TG)7 58 229-235 (6) JN084087

Asa08 F:TGATTGAAACGAATCCCACA

R:GGGGTTACCTGAACCTGTTA(GT)8 56 209-257 (28) JN084088

Asa10 F:TTGTTGTTCTGCCATTTT

R:GATCTAAGCCGAGAGAAA(AC)7 48 225-239 (14) JN084089

Asa14 F:TCTATCTCGCTTCTCAGGGG

R:CTGACAGAAGTAGTCTTTCC(GT)7 48 220-234 (14) JN084090

Asa16F:CACGACTTTTCCTCCCATTT

R:CTAATGTTCATGTCCCCAGT (TG)5 C (GT)6 48 148-154 (6) JN084091

Asa17 F:TCCACGACACACACACACAC

R:ATGCAGAGAATTTGGCATCC(CA)12 (CT)28 56 126-196 (70) JN084092

Asa18 F:TCAAGCTCCTCCAAGTGTCC

R:TCGGGATATGACAGCATTTG(TG)8 45 254-264 (10) JN084093

Asa20 F:GAAGCAGCAAAGATCCAAGC

R:CGTGCAGAACTTAACCTT(G)12 48 260 JN084094

Asa23 F:GGAGGGGGAAAAAGGATAG

R:TGTGAAGCAAGTGGGATCAA(GA)5 55 271 JN084095

Asa24 F:TTGTTGTGCCGAGTTCCATA

R:AGCAATTTACCAAAGCCAAG

(GT)4 (GT)3 (GT)5 48 149-161 (12) JN084096

Asa25 F:GCACTTCACTTTCCCCATTC

R:GGCGACGGTGAAGAGAGAG(CT)3 (CT)27 51 117-127 (10) JN084097

Asa27 F:GGGAGAGAATGGCTTGATTG

R: GGACAGCATCATCACCAC(TC)17 (TC)5 55 127 JN084098

Asa31 F:CAGAGACTAGGGCGAATGG

R:ATGATGATGACGACGACGAG(CTT)7 50 237-243 (6) JN084099

Asa59 F:CGCTTACTATGGGTGTGTGTC

R:CAAGTGGGAGACTGTTGGAG(ATCA)3 50 290 JN084100

Notas: Ta, temperatura de anelamento; Alelos, tamanho dos alelos em pb e em parnteses variao em pb entre omaior e menor alelo; Genbank ID, localizador da sequncia de nucleotdeos no National Center for Biotechnology

Information(NCBI).


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Tabela 2 Iniciadores SSR para alho (Allium sativum L.) desenvolvidos por Ma et al.(2009)

Loco Motivo e repeties Ta (C) Alelos (pb)

GB-ASM-035 (GCC)3 (TCC)3 50 304

GB-ASM-040 (AC)6 (AC)14 (AT)5 50 252-298 (46)GB-ASM-053 (CA)15 (AC)8 50 160-168 (8)

GB-ASM-059 (TG)11 (TG)5 50 260-295 (35)

GB-ASM-072 (TA)7 (TG)5 GC (GT)9 T (TG)8 45 182-188 (6)

GB-ASM-078 (GT)12 50 184-218 (34)

GB-ASM-080 (CCG)5 45 152-158 (6)

GB-ASM-109 (ACC)4 45 202-224 (22)

Notas: Ta, temperatura de anelamento; Alelos, tamanho dos alelos em pb e em

parnteses variao em pb entre o maior e menor alelo.

Figura 5 Perfil genotpico de 80 acessos de lho (Allium sativumL.) em gel depoliacrilamida 7%; (A) Asa24, (B) GB-ASM-040 e (C) Asa10,polimrficos, e (D) Asa23, monomrfico

B

A

C

D

161 pb

149 pb

298 pb

252 pb

239 pb225 pb

271 pb


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4.4 Gentipos multi locos idnticos (MLGs)

O nmero de gentipos multi locos (Multi Loci Genotypes, MLGs) foi identificado para

cada um dos BAGs avaliados. MLGs contendo um nico acesso representante foramidentificados pelo nome do prprio acesso e MLGs com mais de um representante foram

identificados pelas letras (A a L) ou nmeros romanos (I a XI) (Tabela 3 e Tabela 4). No total

foram identificados no (i) IAC, 6 MLGs: Sacaia Goinia, BGH-0525, Formosa I-4713,

Peruano Biso ESALQ, MLG A e MLG B; (ii) ESALQ, 2 MLGs: Crespo e MLG C; e

(iii) Embrapa, 58 MLGs: Barbado, Branco Dourado, Branco Mineiro, Caturra, Centralina A,

Chins Real, Cuiab, Dourado, Gigante de Inconfidentes bulbos longos, Gigante Roxo,

Hozan, Inconfidentes II, Inhumas A, Inhumas Casca Roxa, Jacobina, Jundia, Juiz de Fora,

Juria, Morano Arequipeno, Mucug, Novo Cruzeiro, Paraba III, Peruano, Pinheiral,

Piracicabano Amaralino, Tempero de Bode, Ugarte, DDR6024, DDR6807, DDR6822,

PI38383, PI540318, PI540351, RAI27, RAI41, RAI75, RAI159, RAI751, RE PSK, RE6820,

UO73, UO74, UO79-3, UO94-5, UO94-11, WE8407, WE10735, WE12832, Quitria e MLG

D a MLG L.Com a identificao de MLGs os BAGs do IAC, ESALQ e Embrapa foram

reduzidos em 90,5%, 88,2% e 18,3%, respectivamente. Na anlise conjunta dos BAGs foram

identificados 65 MLGs, 54 com um nico acesso representante e 11 contendo mais de um

acesso, MLG I a MLG XI(Tabela 4). O MLG B(IAC) e MLG C(ESALQ) na anlise

conjunta representam um nico MLG, MLG XI.

Tabela 3 Gentipos multi locos idnticos (MLGs) com mais de um acesso representante dos bancos degermoplasma de alho (Allium sativumL.) do IAC, ESALQ e Embrapa

(continua)MLG N de acessos Identificao dos acessos

A 9Canela de Ema, Car, Mineiro, Gravat A, Do Reino I-2118, Mossor, Santa CatarinaBranco, BGH-5936 e Roxo de Minas (Dr. Joaquim)

B 50

BGH-4814, BGH-4823, BGH-4842, BGH-5935, BGH-5947, BGH-5952, BGH-5963,

BGH-6394, Roxo de Araras, Roxo de Araras (2), Andradas Manoel Lopez, AndradasManoel Lopez (2), Assa I-3703, Piedade, Santa Catarina Roxo, Chins I-4653,Roxinho I-5063, Peruano Biso, Amarante, Mexicano Br, Roxo Capim Branco I-3969,Cateto Precoce I-1634, Alho Bepe, Lavnia I-3208, Lavnia I-1632, Lavnia IAC-1632(2), Bom Repouso I-5085, So Jos I-4999, Catetinho do Paran I-1234, Mendona I-5062, Tatu I-3705, Gigante Tiet I-4652, Gigante de Curitibanos, Areal n2 I3968,Vera Cruz I-5004, Chins-ESALQ, Chins-ESALQ (2), Cateto Roxo I-99, BulbinhoAreo, Sr. Wilson (Bairro Godo), Bulbinho Areo Gigante de Curitibanos, ChinsMogi, A, B, C, D, E, F e Embrapa Cateto Roxo Livre de Vrus


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Tabela 3 Gentipos multi locos idnticos (MLGs) com mais de um acesso representante dos bancos degermoplasma de alho (Allium sativumL.) do IAC, ESALQ e Embrapa

(concluso)MLG N de acessos Identificao dos acessos

C 16

Gigante, Centenrio, Gigante Dez, So Jos, Lavnia, Caiano Branco, Cateto

Branco, Gigante Vinte, Cajuru, Peruano, Ouro Fino, Sergipe, Mineiro Branco,Babs, Chins Quatapara e Chins-ESALQ (3)

D 2 Catigu e Chileno (PR)E 2 Gravat e Roxo Dourado

F 2 Mexicano e Mexicano A

G 2 DDR6804 e DDR6811H 3 Araguari, Gigante de Lavnia e Gigante Roxo

I 3 Chonan, Roxo Prola de Caador e JonasJ 2 Mexicano B, Mexicano II

K 2 Santa Izabel e Seleo I

L 4 Ito, San Valentin, Roxo Caxiense e Bergamota

Notas: MLG A a B, banco de germoplasma do IAC; MLG C, banco de germoplasma da ESALQ; e MLG D aK, banco de germoplasma da Embrapa.

Tabela 4Gentipos multi locos idnticos (MLGs) com mais de um acesso representante identificados na anliseconjunta dos bancos de germoplasma de alho (Allium sativumL.) do IAC, ESALQ e Embrapa

MLG N acessos Identificao de acessosI 2 Catigu e Chileno (PR)II 2 Gravat e Roxo Dourado

III 2 Mexicano e Mexicano A

IV 2 Mexicano B e Mexicano IIV 2 DDR6804 e DDR6811

VI 2 Santa Izabel e Seleo I

VII 3 Araguari, Gigante de Lavnia e Gigante RoxoVIII 3 Chonan, Roxo Prola de Caador e Jonas

IX 4 Ito, San Valentin, Roxo Caxiense e Bergamota

X 9Canela de Ema, Car, Mineiro, Gravat A, Do Reino I-2118, Mossor, SantaCatarina Branco, BGH-5936 e Roxo de Minas (Dr. Joaquim)

XI 66

BGH-4814, BGH-4823, BGH-5947, Roxo de Araras, Roxo de Araras (2),Andradas Manoel Lopez, Andradas Manoel Lopez (2), Assa I-3703, Piedade,Santa Catarina Roxo, Chins I-4653, Roxinho I-5063, Roxinho I-5063 (2),Peruano Biso, Amarante, Mexicano Br, Roxo Capim Branco I-3969, CatetoPrecoce I-1634, Alho Bepe, Lavnia I-3208, Lavnia I-1632, Lavnia IAC-1632

(2), Bom Repouso I-5085, BGH-5935, So Jos I-4999, BGH-4842, Catetinho doParan I-1234, Mendona I-5062, Tatu I-3705, Gigante Tiet I-4652, Gigante deCuritibanos, Areal n2 I-3968, Vera Cruz I-5004, Chins-ESALQ, Chins-ESALQ (2), Chins-ESALQ (3), Cateto Roxo I-99, BGH-5963, BGH-6394,BGH-5952, Bulbinho Areo, Sr. Wilson (Bairro Godo), Bulbinho Areo Gigantede Curitibanos, Chins Mogi, Gigante, Centenrio, Gigante Dez, So Jos,Lavnia, Caiano Branco, Cateto Branco, Gigante Vinte, Cajuru, Peruano, OuroFino, Sergipe, Mineiro Branco, Babs, Chins Quatapara, A, B, C, D, E, F eEmbrapa Cateto Roxo Livre de Vrus


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4.5 Caracterizao dos locos microssatlites

A diversidade e o polimorfismo dos locos SSR foram investigados pelos parmetros:

nmero mdio de alelos por loco (A), riqueza allica (Ar), ndice de Shannon-Weaver (IS) ePIC (Tabela 5). A mdia de alelos observada por loco foi de 5,3, com mximo de 13 alelos

para os locos GB-ASM-040 e GB-ASM-059. A Arestimada variou entre locos, com mnimo

1,434 (Asa18) e mximo de 3,312 (GB-ASM-040), com mdia de 2,258. O IS tambm

apresentou variao entre locos de 0,389 (Asa18) a 2,246 (GB-ASM-040), com mdia de

1,176.

O PIC mdio foi de 0,545, com ampla variao entre locos, de 0,202 (Asa18) a 0,851

(GB-ASM-040). Os locos foram agrupados em: (i) no informativos (PIC menor ou igual a

0,30), Asa16, Asa18 e GB-ASM-080; (ii) moderadamente informativos (PIC entre 0,30 e

0,60), Asa07, Asa17, Asa31, GB-ASM-053, GB-ASM-072 e GB-ASM-078; e (iii) altamente

informativos (PIC maior ou igual a 0,60), Asa08, Asa10, Asa

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Camila Pinto Da Cunha