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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI/
CAMPUS ALTO PARAOPEBA
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS PRODUTORES DE
BIOAROMAS POR BIOTRANSFORMAÇÃO DE TERPENOS
LORENA DE OLIVEIRA FELIPE
ORIENTAÇÃO: PROF. DR. JULIANO LEMOS BICAS
CO-ORIENTAÇÃO: PROFA. DRA. ANA MARIA DE OLIVEIRA
OURO BRANCO – MG,
AGOSTO DE 2015
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ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS PRODUTORES DE BIOAROMAS POR
BIOTRANSFORMAÇÃO DE TERPENOS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: TECNOLOGIAS
PARA O DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
LORENA DE OLIVEIRA FELIPE
ORIENTAÇÃO: PROF. DR. JULIANO LEMOS BICAS
CO-ORIENTAÇÃO: PROFA. DRA. ANA MARIA DE OLIVEIRA
OURO BRANCO – MG,
AGOSTO DE 2015
DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
TECNOLOGIAS PARA O
DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
(PPGTDS) PARA A OBTENÇÃO DO
TÍTULO DE MESTRE.
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“Mas é preciso ter força, É preciso ter raça
É preciso ter graça É preciso ter sonho sempre”.
Milton Nascimento/Fernando Brant
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Dedico mais essa conquista aos meus pais, as pessoas mais especiais desse mundo.
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus pela oportunidade da vida, capacidade
intelectual e de sentir o mundo e as coisas ao meu redor com tanta intensidade.
Aos meus pais, por terem sempre priorizado a minha educação e da minha irmã
a todo custo, desfazendo-se de tudo para deixar o conhecimento como herança. Não
foi fácil chegar até aqui e nós sabemos muito por que, a estrada foi sempre muito
difícil, apertada e cheia de desafios.
À minha mãe, por ter tido papel tão importante na formação da minha
personalidade, dando cotidianamente lições de compaixão, equilíbrio emocional,
coragem e determinação. À ela também vai ficar sempre a minha eterna dívida em
retribuir toda a devoção dedicada a nossa criação, sempre com muito amor, respeito e
disponibilidade.
À Universidade Federal de São João del-Rei, especialmente ao Campus Alto
Paraopeba (CAP), por ter me proporcionado toda a formação acadêmica. Para a
maioria dos estudantes o CAP sempre foi limitação, para mim foi, sem dúvida alguma,
a melhor oportunidade da minha vida. É e sempre será a minha casa e voltarei
quantas vezes for necessário, com muita vontade de contribuir de alguma forma com
esse lugar que tem tanta representatividade para mim.
Ao Professor Juliano Lemos Bicas, por ser exemplo de profissional
comprometido, de grande conhecimento e projeção. Fica aqui a minha forte gratidão
por ter impactado tanto na minha formação, por ter sempre acreditado em mim, me
apoiando a todo o momento (presencialmente ou a distância), com tanta prontidão e
atenção.
À Professora Ana Maria de Oliveira, por ter contribuído com diferentes e
importantes sugestões para a construção desse texto, por toda a paciência dedicada
no Laboratório de Análise Instrumental e por mostrar que a transparência é sempre o
melhor caminho para resolver qualquer situação.
Aos demais professores do CAP, que de alguma forma, sempre contribuíram
com a minha formação e, principalmente agora no Mestrado: Prof. Ênio Nazaré de
Oliveira Júnior pelas opiniões no exame de qualificação e Prof. Bruno Meireles Xavier
por ter se tornado uma pessoa de grande confiança, me ajudando em momentos
difíceis, de dúvidas pessoais e sobre o futuro.
À Katialaine Corrêa de Araújo, minha cara metade mais oposta, o melhor
presente que o CAP me deixou em todos esses anos. Tenho muito a agradecer por
todas as provas de amizade em diferentes momentos, carinho e companheirismo,
além de tantas lições pessoais. O CAP teria sido muito vazio e sem graça sem você.
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Aos meus animais de estimação (Lindinha, Angelina e mais recentemente a
Mila) pelo companheirismo nas horas e horas a fio entregues à redação da
dissertação, sempre trazendo uma oportunidade de escape para o amor, para a
lealdade, com olhares tão ternos e me fazendo rir em momentos de tensão.
Especialmente a Angelina, pelas inúmeras manhãs que me acompanhou ao CAP nos
experimentos do Mestrado, seja durante os finais de semana ou em dias comuns.
Aos meus amigos de tão longa data – Lívia e Stella – por sempre oferecerem a
sua amizade mesmo quando passamos tanto tempo sem nos ver. À Família Bicalho,
minha segunda família, pelas conversas ao redor da mesa, sinceridade e tanto carinho
dedicado a mim. É nessas horas que a gente percebe o quanto a simplicidade pode
proporcionar momentos agradáveis e prazerosos.
Por fim, agradeço a todas as outras pessoas que me auxiliaram ao longo dessa
jornada e que plantaram um tijolinho na estrada que percorri para chegar até aqui.
Finalmente, relembrando Guimarães Rosa, em Grande Sertão Veredas:
"O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim:
esquenta e esfria, aperta e daí afrouxa,
sossega e depois desinquieta. O que ela quer da gente é coragem".
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SUMÁRIO
1. Introdução.................................................................................................... 16
2. Revisão bibliográfica.................................................................................... 17
2.1 Terpenos...................................................................................................... 17
2.1.1 α-pineno...................................................................................................... 21
2.1.2 Farneseno................................................................................................... 22
2.1.3 Limoneno.................................................................................................... 23
2.2 Aromas........................................................................................................ 24
2.3 Produção biotecnológica de aromas........................................................... 27
2.3.1 Métodos de obtenção................................................................................ 27
2.3.2 Seleção de linhagens................................................................................. 29
2.3.3 Modos de fermentação em bioprocessos para a produção de
bioaromas................................................................................................................ 31
2.3.4 Principais configurações de reatores empregados na produção de
bioaromas................................................................................................................ 36
2.3.5 Principais métodos de extração empregados na produção de
bioaromas................................................................................................................ 37
2.3.6 Resolução quiral da mistura racêmica de bioaromas................................ 40
2.4 Bioaromas – perspectiva para o desenvolvimento sustentável................. 42
2.4.1 Aspecto ambiental..................................................................................... 43
2.4.2 Aspecto econômico..................................................................................... 45
2.4.3 Aspecto social............................................................................................. 47
2.4.3.1 Bioprospecção............................................................................................ 47
2.4.3.2 Potencial biológico dos bioaromas............................................................. 49
3. Objetivos..................................................................................................... 51
3.1. Objetivo geral.............................................................................................. 51
3.2 Objetivos específicos.................................................................................. 51
4. Metodologia................................................................................................ 51
4.1 Reagentes................................................................................................... 51
4.2 Isolamento dos micro-organismos.............................................................. 52
4.3 Seleção dos microrganismos potencialmente biotransformadores............ 52
4.4 Processo de biotransformação................................................................... 53
4.5 Extração e análises cromatográficas dos produtos formados.................... 54
5. Resultados e discussão.............................................................................. 55
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5.1 Isolamento dos microrganismos................................................................. 55
5.2 Seleção dos microrganismos potencialmente biotransformadores............ 58
5.3 Análises cromatográficas dos produtos formados a partir das culturas
previamente selecionadas.......................................................................................
63
5.4 Processo de biotransformação com resting cells....................................... 64
5.4.1 Bactérias e levedura.................................................................................... 64
5.4.2 Fungos filamentosos.................................................................................... 66
6. Conclusão.................................................................................................... 76
7. Perspectivas futuras..................................................................................... 77
8. Referências bibliográficas............................................................................ 78
9. Agradecimento............................................................................................. 105
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ABREVIATURAS
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATP: adenosina trifosfato.
aw: atividade de água
CDB: Convenção da Diversidade Biológica
GC-MS: cromatógrafo a gás acoplado a espectrometria de massas
GC-O: cromatografia gasosa com detector olfatométrico
CTA: conhecimento tradicional associado
FDA: Food and Drug Administration
FEMA: Flavor Extract and Manufacturers Association
FES: fermentação em estado sólido
FS: fermentação submersa
RDC: Resolução da Diretoria Colegiada
WHO: World Health Organization
OMS: Organização Mundial da Saúde
vvm: vazão volumétrica
ATCC: American Type Culture Collection
POMS: polyoctylmethylsiloxane
PEBA: polyetheramide-block-copolymers
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LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 - Principais compostos terpênicos e seus derivados presentes em
alguns óleos essenciais. 18
Tabela 2 – Compostos de impacto de alguns alimentos. 26
Tabela 3 – Valores comerciais de mercado estimados para três diferentes
bioaromas em função da sua rota de produção 46
Tabela 4 – Fontes de obtenção e respectiva identificação dos micro-
organismos isolados por técnica de Gram 56
Tabela 5 – Intensidade de crescimento* dos micro-organismos em placa de
Petri contendo meio mineral DP e terpeno adicionado na tampa da placa
como única fonte de carbono e energia
59
Tabela 6 – Estudos relatados na literatura para a biotransformação de
substratos terpênicos por diferentes linhagens de bactérias. 66
Tabela 7 – Estudos relatados na literatura para a biotransformação de
substratos terpênicos por diferentes linhagens de fungos (filamentosos ou
leveduriformes).
72
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LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 - Exemplos de compostos de aroma de diferentes funções químicas
e suas respectivas notas sensoriais. 19
Figura 2 – Estrutura molecular dos enantiômeros da carvona, as quais
apresentam aromas completamente distintos. 20
Figura 3 – Formas isoméricas do pineno. 21
Figura 4 – Formas isoméricas do farneseno. (Bicas, 2009). 22
Figura 5 – Formas isoméricas do limoneno. 23
Figura 6 – Quadro comparativo mostrando as vantagens e desvantagens
dos métodos de obtenção de aroma: (i) rota química, (ii) extração da
natureza e (iii) via biotecnológica.
27
Figura 7 – Esquema ilustrativo mostrando a diferença entre os dois métodos
de obtenção por via biotecnológica de aromas: (A) síntese de novo, (B)
biotransformação.
28
Figura 8 – Estruturas químicas de alguns aromas
de ampla comercialização mundial. 32
Figura 9 – Tripé da sustentabilidade que deve ser integralmente
contemplado por uma tecnologia que se proponha ao desenvolvimento
sustentável.
43
Figura 10 – Resumo dos resultados obtidos nesse trabalho. 55
Figura 11 – Vias de metabolizações relatadas na literatura para o limoneno
por diferentes microrganismos. 61
Figura 12 – Vias de metabolização do pineno por alguns fungos
filamentosos relatados na literatura. 62
Figura 13 – Vias de metabolização do pineno por algumas bactérias
relatadas na literatura. 62
Figura 14 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do
limoneno (sem acúmulo) pelo micro-organismo 1 após 0h (azul), 24h
(vermelho), 48h (verde), 72h (rosa) de biotransformação.
65
Figura 15 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do
limoneno (sem acúmulo) pelo micro-organismo 10 após 0h (azul), 24h
(vermelho), 48h (verde), 72h (rosa) de biotransformação.
65
Figura 16 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do
farneseno (sem acúmulo) pelo micro-organismo 45 após 0h (azul), 24h 67
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(vermelho), 48h (verde), 72h (rosa) e 96h (bege) de biotransformação.
Figura 17 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do α-
pineno (sem acúmulo) pelo micro-organismo 41 após 0h (azul), 24h
(vermelho), 48h (verde), 72h (rosa) e 96h (bege) de biotransformação.
67
Figura 18 – Cromatogramas do padrão comercial de limoneno-1,2-diol (linha
vermelha) e do extrato da biotransformação do microrganismo 42 após 96 h
de fermentação, tendo limoneno como substrato (linha azul).
68
Figura 19 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do
limoneno pelo micro-organismo 42 após 0h (azul), 24h (vermelho), 48h
(verde), 72h (rosa) e 96h (bege) de biotransformação.
68
Figura 20 – Curva analítica do limoneno-1,2-diol obtida a partir de
cromatografia gasosa com detecção por ionização em chama (CG-DIC). 69
Figura 21 – Cinética de produção de limoneno-1,2-diol para o período de 0 a
96 h, a partir da biotransformação de R-(+)-limoneno por fungo filamentoso
isolado do orégano (microrganismo 42).
69
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RESUMO
FELIPE, Lorena de Oliveira. Universidade Federal de São João del-Rei/Campus Alto
Paraopeba, agosto de 2015. Isolamento e seleção de micro-organismos
produtores de bioaromas por biotransformação de terpenos. Orientador: Juliano
Lemos Bicas. Co-orientadora: Ana Maria de Oliveira.
Os aromas encontram larga aplicabilidade em diferentes setores industriais, contudo,
esse mercado é majoritariamente dominado por aromas quimicamente sintetizados.
Nesse contexto, considerando a relação positiva entre a qualidade dos alimentos
consumidos e o impacto na expectativa de vida, observa-se uma demanda cada vez
maior de substituição dos produtos sintéticos por naturais. Assim, a produção
biotecnológica de aromas demonstra ser uma opção bastante viável, já que dentre
outras vantagens, os aromas produzidos por essa via são considerados naturais.
Portanto, o objetivo desse trabalho foi isolar e selecionar micro-organismos que
fossem capazes de converter substratos terpênicos de elevada disponibilidade
comercial no Brasil – limoneno, α-pineno e farneseno – em bioaromas. Para a
prospecção dos micro-organismos foram utilizadas amostras comerciais de alecrim,
açafrão-da-terra, aniz, canela, cenoura, cominho, cravo, eucalipto, hortelã, lavanda,
limão, maçã, mamão, menta, orégano e tomilho consideradas fontes naturais de
terpenos. Foram isolados 45 micro-organismos (62,2% eram cocos Gram-negativos,
8,9% bastonetes Gram-positivo, 13,3% bastonetes Gram-negativo, 4,4% leveduras e
11,1% fungos filamentosos) resistentes ao meio de cultivo contendo 1% (v/v) de
limoneno e capazes de crescer em meio mineral contendo os substratos terpênicos
testados (1% (v/v)) como única fonte de carbono e energia. Após o isolamento, os
diferentes micro-organismos isolados foram submetidos ao procedimento de
biotransformação de substratos terpênicos. Este procedimento foi dividido em duas
etapas: i) obtenção de biomassa a partir do crescimento em meio YM (1% glicose,
0,5% peptona, 0,3% extrato de malte, 0,3% extrato de levedura) a 30°C, 150 rpm por
72h; ii) biotransformação propriamente dita, que consistiu em incubar a 30°C e 150
rpm a biomassa obtida anteriormente ressuspendida em tampão fosfato 20mmol pH
7,0 em presença de limoneno, farneseno ou α-pineno. A cada 24h foram feitas
extrações com acetato de etila adicionado de 1% de octano (1:1, v:v) para análises
cromatográficas dos produtos formados. Dentre os 45 micro-organismos selecionados,
apenas um dos isolados (fungo filamentoso isolado do orégano) foi capaz de acumular
um produto de biotransformação. Portanto, obteve-se um sucesso de 2% nos esforços
de prospecção. Por comparação com o tempo de retenção de padrões comerciais,
concluiu-se que tal produto seria o limoneno-1,2-diol, um derivado relativamente
inexplorado do limoneno. Sua concentração foi estimada em 0, 168,42; 220,89; 262,37
e 208,29 mg L-1 após 0, 24, 48, 72 e 96h de biotransformação, respectivamente.
Estesresultados demonstraram que a prospecção de micro-organismos é viável e
pode-se tornar uma ferramenta bastante útil para possibilitar industrialmente a
produção de bioaromas.
Palavras-chave: aroma, biotransformação, limoneno, limoneno-1,2-diol, prospecção.
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ABSTRACT
FELIPE, Lorena de Oliveira. Federal University of São João Del-Rei/Campus Alto
Paraopeba, August of 2015. Isolation and screening of producers bioaromas
microorganisms from terpenes biotransformation. Adviser: Juliano Lemos Bicas.
Co-adviser: Ana Maria de Oliveira.
The aromas are wide applicability in different industrial sectors, however, this market is
largely dominated by chemically synthesized flavorings. In this context, considering the
positive relationship between the quality of food consumed and the impact on life
expectancy, there is an increasing demand for replacement of synthetic products by
natural. Thus, the biotechnological production of flavorings proves to be a very viable
option, since among other advantages, the aromas produced in this way are
considered natural. Therefore, the aim of this study was to screening and isolate
microorganisms that were able to convert terpene substrates of high commercial
availability in Brazil - limonene, α-pinene and farnesene - in bioaromas. For prospecting
of microorganisms were used commercial samples of rosemary, turmeric, anise,
cinnamon, carrot, cumin, clove, eucalyptus, peppermint, lavender, lemon, apple,
papaya, mint, oregano and thymeconsidered sources of natural terpenes. 45
microorganisms were isolated (62.2% were Gram-negative cocci, 8.9% Gram-positive,
13.3% Gram-negative, 4.4% yeast and filamentous fungi 11.1%) resistant culture
medium containing 1% (v / v) and limonene able to grow in mineral medium containing
the terpene tested substrates (1% (v/v)) as the sole source of carbon and energy. After
isolation, the different micro-organisms isolated were subjected to biotransformation
procedure terpene substrates. This procedure was divided into two steps: i) obtaining
from biomass growth in YM medium (1% glucose, 0.5% peptone, 0.3% malt extract,
0.3% yeast extract) at 30°C/150 rpm for 72 hours; ii) actual biotransformation, which
consisted of incubating at 30°C and 150 rpm biomass obtained previously resuspended
in 20mmol phosphate buffer pH 7.0 in the presence of limonene, farnesene and α-
pinene. The extractions were performed every 24 hours with ethyl acetate added 1%
octane (1:1, v:v), to chromatographic analyzes of the products formed. Among the 45
selected microorganisms, only one of the isolates (isolated filamentous fungus
oregano) was able to accumulate a product of biotransformation. Thus, there was
obtained a success in the exploration of 2% efforts. By comparison with commercial
standards retention time, it was concluded that such a product would limonene-1,2-diol,
a relatively unexplored derived from limonene. Its concentration was estimated to be 0,
168,42; 220,89; 262,37 and 208,29 mg L-1 after 0, 24, 48, 72 and 96 hours
biotransformation, respectively. These results demonstrated that drilling micro-
organisms are viable and can become a useful tool to enable the production of
industrially bioaromas.
Keywords: aroma, biotransformation, limonene, limonene-1,2-diol, screening.
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1. INTRODUÇÃO
Os aromas encontram larga aplicabilidade em diferentes setores industriais,
sendo a indústria alimentícia a mais importante. Apesar da ampla utilização desses
compostos, esse mercado é majoritariamente dominado por aromas quimicamente
sintetizados. Contudo, os processos químicos de produção de aromas apresentam
baixa ou nenhuma enantioseletividade ao substrato, resultando na mistura de
produtos. Além disso, alguns aromas não são passíveis de serem produzidos por rotas
químicas. Por fim, tem sido cada vez mais claro o apelo mercadológico para a
substituição de produtos sintéticos por “naturais” e ingredientes mais saudáveis.
Dessa forma, faz-se necessária a busca por novos processos que tornem
possível a produção de aromas naturais que colaborem para contornar os problemas
relacionados às transformações químicas, entre os mais importantes: (i) condições
severas de operação, (ii) uso e potencial descarte volumoso de reagentes químicos,
(iii) baixa especificidade de reação, (iv) alteração na percepção sensorial dos
alimentos e (v) eventuais problemas toxicológicos, principalmente processos alérgicos,
associados ao consumo de aromas artificiais (Ben Akacha & Gargouri, 2014).
Considerado esse contexto, bem como a demanda por novas tecnologias que
colaborem efetivamente para o desenvolvimento sustentável, a produção
biotecnológica de aromas tem sido apontada como a mais promissora dentre as rotas
possíveis de obtenção dos compostos de aromas. Entre as vantagens mais
significativas associadas a esse modo de produção destacam-se: (i) os aromas podem
ser rotulados como naturais, aumentando a qualidade sensorial de alimentos quando
utilizado para esse fim; (ii) geram produtos de maior valor agregado; (iii) ocorrem em
condições mais amenas, demandando menor custo energético e menor volume de
descarte de reagente; (iv) a produção pode ser conduzida de modo contínuo e
controlado, não sofrendo efeitos sazonais associados a disponibilidade de matéria-
prima (Ben Akacha & Gargouri, 2014).
Outro aspecto importante da produção por via biotecnológica de compostos de
aroma centra-se na promissora alternativa de utilizar resíduos e subprodutos
agroindustriais como meio de cultivo ou substrato nas reações catalisadas por micro-
organismos. Tais compostos, de baixo valor agregado podem ser obtidos da indústria
citrícola ou de papel/celulose por exemplo, tornando potencialmente possível a
produção comercial de aromas naturais a baixo custo.
No Brasil, essa possibilidade é bastante promissora, já que o país é o maior
produtor de laranjas e apresenta importante participação na produção de
papel/celulose, sendo que tais subprodutos, respectivamente, são ricos em R-(+)-
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limoneno (≈ 130 mil ton ano-1) e pinenos (≈ 160 mil ton ano-1), ambos, substratos
terpênicos utilizados em processos biotecnológicos na produção de aromas (Bicas,
2009). Ainda, de acordo com Bicas (2009), os terpenos têm recebido destinação
pouco nobre (queima, produtos de limpeza, rações, etc.) quando comparado ao
potencial de contribuição dessas matérias-primas na indústria de química fina,
especialmente, na produção por via biotecnológica de aromas.
Por outro lado, apesar das vantagens anteriormente mencionadas em relação
aos bioprocessos focados na produção de aromas, alguns desafios ainda devem ser
superados de forma que seja possível tornar factível a produção em escala industrial
de tais compostos. Entre os principais avanços que permitirão uma produção eficiente
de bioaromas, podem ser citados: (i) esforços na prospecção/seleção de micro-
organismos capazes de bioconverter substratos específicos para a produção de
bioaromas; (ii) estudos relacionados à otimização de processos, para tornar a
concentração do produto de interesse comercialmente vantajosa; (iii) scale-up e
downstream para a escala industrial (Molina et al., 2015).
Portanto, o objetivo deste trabalho foi isolar e selecionar micro-organismos
capazes de biotransformar compostos terpênicos para a produção de bioaromas,
tendo como hipótese central o fato de que micro-organismos capazes de crescer em
meios contendo terpenos como única fonte de carbono e energia são capazes de
modificar quimicamente estas moléculas e, assim, produzir novos compostos de
aroma.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. TERPENOS
Os óleos essenciais e suas notas aromáticas são empregados e explorados
desde os tempos remotos pela humanidade, com datações estimadas a 3500 a.C
(Scott, 2005; Knowlton & Pearce, 1993). Com ampla utilização, principalmente na
perfumaria e cosméticos, encontram também significativa aplicabilidade na indústria
alimentícia por contribuirem no reforço ou na melhora da qualidade sensorial dos
alimentos (Ravindra & Kulkarni, 2015; Do et al., 2014; Gabbanini et al., 2009; Marais,
1983).
Como regra geral, os óleos essenciais são compostos majoritariamente por
terpenos ou seus derivados (Tabela 1). Tais substâncias constituem-se como um
extenso grupo de moléculas orgânicas produzidas como metabólitos secundários,
principalmente em plantas, para evitar injúrias promovidas por agentes externos. Além
das plantas, são também produzidos por animais e micro-organismos, como fungos e
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bactérias (Dvora & Koffas, 2013; Wawrzyn et al., 2012; Szucs et al., 2011).
Considerado esse importante aspecto, os terpenos apresentam reconhecida atividade
antimicrobiana (De Martino et al., 2015; Raut & Karuppayil, 2014; Lawal &
Ogunwande, 2013).
Tabela 1 - Principais compostos terpênicos e seus derivados presentes em
alguns óleos essenciais. Adaptado de Pastore et al. (2013)
Óleo essencial Principais componentes
Alcarávia S-(+)-Carvona, limoneno, mirceno, α-felandreno, α-pineno, β-pineno
Endro S-(+)-Carvona, α-felandreno, limoneno
Eucalipto 1,8-Cineol, α-pineno, p-cimeno, limoneno
Gengibre Zingibereno, α-curcumeno, β-sesquifelandreno,
bisaboleno, camfeno, β-felandreno, 1,8-cineol
Casca de laranja Limoneno, mirceno, linalool, citronelal,
neral, geranial,valenceno, α- e β-sinensal
Rosa Citronelol, geraniol, nerol, metil eugenol,
geranilacetato, eugenol, óxido de rosa
Quimicamente, os terpenos podem ser definidos como “alcenos naturais”, isto é,
apresentam uma dupla ligação carbono-carbono sendo caracterizado como um
hidrocarboneto insaturado (Mc Murry, 2011; Maimone & Baran, 2007; Breitmaier,
2006). Por outro lado, se um terpeno contém uma molécula de oxigênio, o mesmo é
denominado de terpenóide, o qual, por sua vez, pode apresentar diferentes funções
químicas como ácidos, álcoois, aldeídos, cetonas ou epóxidos terpênicos (Figura 1).
Apesar de apresentarem diferenças estruturais entre si, todos os terpenos/terpenóides
são basicamente estruturados em blocos de cinco carbonos – unidades de isopreno –
sendo que tais unidades derivam do precursor difosfato de isopentenila (Mendanha &
Alonso, 2015). Biossinteticamente, condicionado a estrutura final do produto e do
organismo produtor, o difosfato de isopentenila pode ser produzido por duas rotas
distintas, a citar: via de mevalonato e via do 1-desoxixilulose-5-fosfato (DXP) (Kitaoka
et al., 2015; Niu et al., 2015; Opitz et al., 2014).
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Hidrocarbonetos Álcoois Compostos
Carbonílicos
Ésteres e
Lactonas
Éteres e
fenóis Outros
Limoneno*
(cítrico)
3-hexen-1-ol
(ervas)
2,6-nonadien-1-
al (pepino)
Acetato de
isoamila
(banana)
1,8-
cineol*
(eucalipt
o)
Furfural
(caramelo)
α-pineno*
(coníferas)
1-octen-3-ol
(cogumelo)
5-metil-(E)-2-
hepten-4-ona
(avelã)
Acetato de
butila (maçã)
3,9-oxi-
1-p-
menteno
(anis)
2-metil-3-
furanotiol
(rosbife)
Mirceno*
(cítrico, fresco)
Nerol
(limão)
Geranial*
(limão)
γ-
butirolactona
(doce,
amanteigado)
Timol*
(tomilho)
5-acetil-
tiazol (carne
grelhada)
Figura 1 - Exemplos de compostos de aroma de diferentes funções químicas e suas
respectivas notas sensoriais. O asterisco (*) indica os compostos terpênicos.
(Adaptado de Pastore et al., 2013).
CH2OH CHOO
O O O CHO
OHO O
O O O
SH
CH2OH
CHO
O O OH
N
S
O
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A classificação dos terpenos é baseada nos múltiplos de cinco carbonos que
compõem a estrutura da molécula, dessa forma são assim denominados:
hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20),
triterpenos (C30) e tetraterpenos ou carotenos (C40) (Krivoruchko & Nielsen, 2014;
Hanson, 2012; Hill & Connolly, 2012; Fraga, 2011; Dewick, 2002).
Além da classificação geral, os monoterpenos podem ser assim sub-
classificados: moléculas abertas (monoterpenos acíclicos), monocíclicos, bicíclicos ou
tricíclicos (Dewick, 2002). As estruturas terpênicas de menor massa molar, entre os
quais, monoterpenos e sesquiterpenos, apresentam volatilidade acentuada,
contribuindo significativamente para os compostos de impacto de óleos essenciais e
alimentos, como por exemplo, no aroma de cítricos, ervas aromáticas e especiarias
(Kaur & Kaur, 2015; Cazzola & Cestaro, 2014; Farkas & Mohácsi-Farkas, 2014).
Já as moléculas de tamanho superior aos sesquiterpenos, devido ao tamanho da
cadeia, não apresentam volatilidade e, portanto, não colaboram com perfis aromáticos
de óleos essenciais. Contudo, o catabolismo de tetraterpenos (C40), pode fornecer
noroisoprenoides de 10 e 13 carbonos de importante contribuição para o aroma de
alguns produtos (Mendes-Pinto, 2009).
Outro ponto bastante interessante sobre a química dos terpenos centra-se na
isomeria das moléculas, em que isômeros ópticos podem conferir nota aromática
completamente diferente uma da outra. Tal fato pode ser claramente exemplificado
pela d-carvona [4S-(+)-carvona] que apresenta nota aromática de alcarávia, enquanto
que a l-carvona [4R-(-)-carvona] revela um odor bastante acentuado de hortelã (Figura
2) (Souza et al., 2013).
S-(+)-carvona
(aroma de alcarávia)
R-(-)-carvona
(aroma de hortelã)
Figura 2 – Estrutura molecular dos enantiômeros da carvona,
as quais apresentam aromas completamente distintos.
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Considerada essas diferenças, é possível perceber nitidamente a relação entre a
atividade dos terpenos e sua forma estrutural para a percepção dos inúmeros
compostos de impacto (Strub et al., 2014). Tal fato indica mais uma das vantagens de
aromas produzidos biotecnologicamente em comparação aos produtos de síntese
química. Enquanto os processos biotecnológicos ocorrem de maneira seletiva, é
comum que os processos químicos resultem em uma mistura de produtos, o que pode
ser determinante para a qualidade do produto obtido.
A seguir, serão descritos os terpenos empregados como substratos de meio de
cultivo nesse projeto.
2.1.1. α-PINENO
O pineno é um monoterpeno bicíclico (C10H16) que pode ser encontrado sob
duas formas isoméricas, o α-pineno e o β-pineno (Figura 3) (Simonsen, 1931;
Hepburn, 1911).
α-pineno β-pineno
Figura 3 – Formas isoméricas do pineno.
Está presente na composição de diferentes plantas, podendo ser encontrado em
mais de 400 óleos essenciais (Saeidnia, 2014). Entre os óleos essenciais com maior
disponibilidade de pineno está a terebintina, extraída de coníferas, que tem como
composição típica cerca de 70% de α-pineno e 25% de β-pineno (Yoo & Day, 2002;
Phillips & Croteau, 1999). Adicionalmente, o α-pineno e seus derivados - verbenona,
verbenol, mircetol e mirtenal - encontra significativa aplicação na produção de
fragrâncias aproveitadas em diferentes setores industriais (perfumaria e cosméticos,
por exemplo) (Kolicheski et al., 2007; Agrawal & Joseph, 2000).
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2.1.2. FARNESENO
O farneseno é um sesquiterpeno (C15H24) que pode ser encontrado em seis
formas isoméricas, duas para o β-farneseno e quatro para o α-farneseno (Figura 4).
No ambiente natural, o farneseno já foi detectado em cascas de maçã, posteriormente,
identificou-se que as formas isoméricas do farneseno podem assumir diferentes
funcionalidades em plantas e animais, entre as quais, amadurecimento de frutas e
feromônio de insetos (Yu et al., 2013; Lurie & Watkins, 2012; Chandran et al., 2011;
Sobotník et al., 2010).
(E)-β-farneseno (Z)-β-farneseno
(Z,E)-α-farneseno (E,Z)-α-farneseno
(E,E)-α-farneseno (Z,Z)-α-farneseno
Figura 4 – Formas isoméricas do farneseno.
Contudo, apesar de o farneseno ser encontrado em diferentes fontes naturais,
sua concentração é reduzida e limitada (Wang et al., 2011). Dessa forma, a obtenção
desse terpeno mostra-se dispendiosa, inviabilizando, atualmente, a utilização do
mesmo como substrato de cultivo em biossínteses catalisadas por micro-organismos.
Tal fato é claramente refletido na reduzida quantidade de publicações científicas
envolvendo tal terpeno em biotransformações microbianas, apesar do mesmo mostrar-
se bastante interessante em aplicações industriais. Isso porque, a partir da oxidação
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do α-farneseno, pode-se obter o α-sinensal, um composto de impacto de laranja
extremamente potente, com limite de detecção (threshold) da ordem de 0,05 ppb
(Berger, 2007).
Apesar da escassez de estudos científicos em relação à utilização do β-
farneseno em processos biotecnológicos, recentemente, a Amyris do Brasil requereu
patente do produto comercial – Biofene® - composto basicamente pelo isômero
anteriormente mencionado. A disponibilização comercial do Biofene®, identificado
como “diesel da cana” tornou-se possível a partir do re-engenheiramento metabólico
da levedura Saccharomyces cerevisiae, capaz de excretar farneseno, empregando
caldo de cana como substrato de cultivo (Edser, 2012; Amyris Biotechnologies). Dessa
forma, o cenário científico tornou-se mais otimista para a utilização do β-farneseno em
processos biotecnológicos focados na produção de bioaromas.
2.1.3. LIMONENO
O dipenteno (1-metil-4-isopropenil-1-ciclohexano) é o nome genérico dada à
mistura racêmica composta por R-(+)-limoneno (d-limoneno) e S-(-)-limoneno (l-
limoneno) (Figura 5) (Danon et al., 2015).
R-(+)-limoneno S-(-)-limoneno
Figura 5 – Formas isoméricas do limoneno.
Assim, é um monoterpeno com estrutura geral C10H16 (Ruiz & Flotats, 2014).
Ambas as formas enantioméricas podem ser encontradas na casca de limão e laranja,
com destaque para o R-(+)-limoneno, que está em concentrações acima de 90% (Sun,
2007).
Adicionalmente, o R-(+)-limoneno apresenta uma agradável nota aromática
cítrica, enquanto o S-(-)-limoneno possui odor que remete a pinho (Danon et al., 2015;
Zahi et al., 2015). O limoneno encontra diferentes aplicabilidades no setor industrial,
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servindo principalmente para a produção de solventes. Apesar disso, é também
empregado na produção de aromas naturais ou sintéticos para a indústria de
alimentos, cosmética e farmacêutica, além de ser considerado um importante
precursor de outros compostos de aroma, tais como o α-terpineol e a carvona (Molina
et al., 2015; Nikfar & Behboudi, 2014; Ruiz & Flotats, 2014).
2.2. AROMAS
Os cinco sentidos humanos são tradicionalmente descritos pelo tato, visão,
audição, paladar e olfato (Ellis, 2013; Bensmaia & Manfredi, 2012; Daly et al., 2012;
Doty, 2012; Feher, 2012a; Feher, 2012b). Esse último é responsável pela identificação
do odor e do aroma.
O odor é a resposta de compostos voláteis na via ortonasal após cheirar um
alimento (Moon et al., 2014; Secundo et al., 2014). Por outro lado, o aroma constitui-se
como a percepção de voláteis na via retronasal a partir da cavidade bucal quando o
alimento está no interior da boca. Assim, considerando que a percepção de sabor
(flavor) é a resposta integrada de substâncias voláteis aliadas às não voláteis,
atribuídas ao gosto (amargo, ácido, doce, salgado, umami) e demais sensações
(adstringência, pungência, refrescância), os compostos de aroma são determinantes
para o estabelecimento de uma extensa quantidade de sabores de diferentes
alimentos (Zellner et al., 2012; Manley, 2011; Collin, 1988). Tal fato pode ser
corroborado, ao considerar a relação entre a congestão nasal e a ausência de sabor
dos nutrientes ingeridos, influenciando diretamente no paladar (Cardello & Wise,
2008).
Contudo, apesar da importância dos aromas nos atributos de diferentes
produtos, é importante destacar que esses compostos voláteis não conferem nenhuma
função nutricional ou vitamínica aos mesmos (Baines, 2007).
Desse modo, os aromas são bastante complexos e constituem-se de uma família
bastante extensa de voláteis. Apresentam como características gerais: (i) moléculas
iguais ou menores a 300 Daltons; (ii) demonstram alto caráter hidrofóbico e (iii) baixa
polaridade em água (Jackson, 2002). Em produtos alimentares, já foram identificados
mais de 12.000 compostos voláteis com características e limiar de detecção sensorial
(threshold) diferenciados. De forma geral, considerado o último parâmetro, o threshold
da maior parte dos aromas situam-se na ordem de ppm (mg L-1/ mg Kg-1) ou ppb (µg L-
1/ µg Kg-1), sendo comum encontrar concentrações irrisórias desses compostos nos
alimentos, mas ainda assim de impacto, situados na ordem de ppt (ng L-1/ ng Kg-1)
(Siegmund, 2015; Jeleń et al., 2012).
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Levando-se em conta toda essa complexidade, a combinação de diferentes
aromas pode conferir uma quantidade quase infinita de notas aromáticas (Siegmund,
2015). Café, vinho e cerveja são produtos que ilustram claramente a inesgotável
possibilidade da combinação de compostos de aroma, já que o aroma característico
de cada um desses produtos está relacionado à interação simultânea de mais de
1.000 compostos voláteis (Sunarharum et al., 2014; Praet et al., 2012; Ferreira, 2010;
Webb & Muller, 1972).
Porém, frequentemente, uma única molécula, determinada de “composto de
impacto” (Tabela 2) pode determinar diretamente o aroma de um alimento, o qual, por
sua vez, remete ao aroma original da matriz (Jackson, 2002).
Considerado esse contexto, é importante citar que a ciência dos compostos de
aroma e seus derivados sofreram um forte desenvolvimento com o advento das
técnicas de identificação e a caracterização dos compostos voláteis. Inicialmente, a
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC/MS) foi impactante no
desenvolvimento dessa área.
Atualmente, outros métodos integrados de caracterização têm contribuído para
refinar o mapeamento do perfil aromático de diferentes alimentos. Assim, as frações
voláteis dos aromas são separadas por cromatógrafo gasoso com detector
olfatométrico, sendo posteriormente avaliadas por provadores “treinados” (electronic
tongue/nose) e identificadas por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de
massas (Chin & Marriott, 2015; Wyszynski & Nakamoto, 2015; Reineccius & Peterson,
2013; Zellner et al., 2012).
No que diz respeito aos aspectos legais da utilização de compostos de aromas
em escala industrial, o FEMA (Flavor Extract and Manufacturers Association – EUA) e
o FDA (Food and Drug Administration – EUA) - trabalham em parceria para assegurar
e nortear o consumo seguro de aditivos aromatizantes (Smith et al., 2005; Hallagan &
Hall, 1995). Entre os mais importantes resultados de tais iniciativas, foi a
compilação/publicação de listas contendo aromas de uso permitido, de concentrações
máximas regulamentadas (safrol e quinina), bem como de uso proibido (extrato de
fava-tonca, sassafrás e sabina) (ANVISA, 2007). Já no Brasil, a publicação da RDC
n°2, de 15 de janeiro de 2007, regulamenta a produção e comercialização de
compostos de aroma em todo o MERCOSUL (ANVISA, 2007).
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Tabela 2 – Compostos de impacto de alguns alimentos
Adaptado de Pastore et al. (2013)
Composto de impacto Alimento
S-(+)-Carvona* Alcarávia
Eugenol* Cravo
Sulfeto dialil Alho
Carvacrol Orégano
R-(+)-Carvona* Hortelã
Safranal* Açafrão-da-terra
β-damascenona* Maçã
Isoamil-acetato Banana
Citral* Limão
(Z)-6-Nonenal Melão
γ-undecalactona/γ-decalactona Pêssego
Alil caproato Abacaxi
Furaneol Morango
1-Octen-3-ol Cogumelos
Benzaldeídeo Amêndoas
2,5-Dimetilpirazina Amendoim
Dimetil sulfeto Aspargos
4-Metiltiobutil isotiocianato Brócolis
Dimetil sulfeto Repolho
γ-Nonalactona Coco
Metil(metiltio)pirazina Avelã
*Terpenos ou seus derivados
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2.3 PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICA DE AROMAS
2.3.1 MÉTODOS DE OBTENÇÃO
As vias de obtenção de aromas são constituídas basicamente por três métodos:
(i) extração da natureza; (ii) síntese química ou (iii) via biotecnológica (Molina et al.
2015) (Figura 6).
A extração de compostos de aromas diretamente da natureza apresenta como
características marcantes o baixo rendimento de produto, o alto custo, além de
demonstrarem forte dependência de fatores sazonais, climáticos e políticos. Além
disso, em função da atividade de extração, pode implicar em problemas ecológicos
(Zhou et al., 2014). A extração da essência de baunilha, contendo vanilina como
composto de impacto, ilustra bem esse cenário. Isso porque, para a produção de 1 Kg
de essência de baunilha, estima-se, que sejam necessárias cerca de 500 vagens da
orquídea Vanilla planifolia (Gallage & Møller, 2015).
Figura 6 – Quadro comparativo mostrando as vantagens e desvantagens dos métodos
de obtenção de aroma por rota química, extração da natureza e via biotecnológica.
(Adaptado de Bicas et al. 2015).
A rota de produção química, apesar de apresentar rendimento satisfatório,
apresenta como desvantagens a reduzida regio-seletividade, produzindo misturas
racêmicas que alteram substancialmente a percepção do aroma desejado para
determinado produto. Além disso, quando aromas sintéticos são utilizados, os mesmos
só podem ser descritos como “aroma artificial” ou “aroma idêntico ao natural”,
diminuindo o apelo mercadológico dos produtos aos quais eles são adicionados (Ben
Akacha & Gargouri, 2014).
Em se tratando da via biotecnológica, a obtenção de aroma é feita a partir da
utilização de enzimas isoladas, culturas de células ou micro-organismos que podem
ser usados como culturas em crescimento, células imobilizadas, células em repouso
(resting cells) ou em sistemas multifásicos (fase aquosa contendo biocatalisador e fase
Rota Química Extração da natureza Via biotecnológica
Sintético, artificial e idêntico ao natural
Natural
Alto rendimento, baixo custo Boa qualidade sensorial Parâmetros brandos de processo, produção contínua, sem
influência da sazonalidade Baixa seletividade, mistura de produtos
Baixa concentração, influência de fatores ambientais
Baixo rendimento
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orgânica contendo substratos/produtos). Os produtos obtidos por esse método podem
ser rotulados como “naturais”, além do fato de que alguns compostos de aroma
opticamente puros só são passíveis de serem produzidos biotecnologicamente, em
função da capacidade enantiosseletiva apresentada por sistemas biológicos (Waché &
Dijon, 2013). Optando por tal técnica, podem-se considerar, de forma geral, dois
modos possíveis de produção: (i) síntese de novo e (ii) biotransformação (Marriott
2012; Molina et al. 2015) (Figura 7).
Figura 7 – Esquema ilustrativo mostrando a diferença entre os dois métodos de
obtenção de aromas por via biotecnológica: (A) síntese de novo, (B) biotransformação
(Adaptado de Bicas et al.; 2015)
A síntese de novo, palavra originária do Latim, significa “do zero, do início”,
tornando importante não confundir com o sentido de “novamente”. Essa rota de
obtenção apresenta um produto final constituído de vários compostos de aroma,
obtidos por vias metabólicas complexas, a partir de meio de cultura simples e sem a
adição especial de substratos ao meio (Gallage & Møller, 2015). Entretanto, a
produção biotecnológica de aromas por esse método é pouco promissora em função
da reduzida concentração de produto obtida (<100 mg L-1), bem como pelas
dificuldades enfrentadas no processo downstream considerando a complexidade da
amostra (Bicas, 2009).
Já os processos de biotransformação são caracterizados pela adição de
precursores ou intermediários aos substratos de cultivos para a biossíntese de um
determinado composto de aroma (Hegazy et al., 2015). Atualmente, em função das
características desse processo anteriormente destacada, a biotransformação tem sido
amplamente descrita na literatura científica como um método bastante versátil e
promissor para a obtenção de inúmeros insumos de alto valor agregado, focado
principalmente na indústria de aromas e fármacos (Cao et al., 2015; Hegazy et al.,
2015; Palomo & Filice, 2015).
OH
Substratos
Produtos Biocatálise
Micro-organismos (fermentação)
Micro-organismos, enzimas
(A)
(B)
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Contudo, a obtenção de bioaromas tanto por síntese de novo ou por
biotransformação são diretamente afetadas por importantes fatores reacionais, entre
os quais: (i) composição e característica do meio de cultivo, (ii) concentração do
substrato e parâmetros de processo (temperatura, agitação e aeração) (Bicas, 2009).
Portanto, apesar dos avanços na área biotecnológica, alguns desafios ainda
devem ser solucionados, principalmente no que diz respeito à biotransformação de
terpenos em escala industrial, entre os quais pode-se citar: (i) acentuada volatilidade
do substrato e do produto; (ii) importante grau de toxidez do micro-organismo pela
adição de substratos precursores e (iii) inviabilização da produção em função do
reduzido rendimento de produto. Dessa forma, estudos mais direcionados devem ser
desenvolvidos de forma a tornar possível o escalonamento da produção biotecnológica
de terpenos em compostos voláteis de relevante interesse industrial (Bicas et al.,
2010).
Considerados os desafios anteriormente mencionados, frente aos bioprocessos
empregados na produção de bioaromas, a engenharia genética tem se mostrado uma
ferramenta de inegável importância. De fato, apesar de ser um instrumento que requer
inúmeros estudos experimentais e domínio para “engenheirar” o metabolismo de
determinados micro-organismos de interesse, a manipulação genética tem contribuído
de forma significativa nesse campo científico e, possivelmente, irá adquirir cada vez
mais espaço em função das possibilidades abertas pela mesma (Otte & Hauer, 2015;
Cho et al., 2014; Krivoruchko & Nielsen, 2014; Xiao et al., 2014; Alonso-Gutierrez et
al., 2013).
Portanto, as rotas de produção de aromas por via biotecnológica abrem
precedentes para inúmeros estudos científicos, apresentando assim, um cenário
bastante otimista para a obtenção de patentes e novos processos tecnológicos (Elman
& Zhang, 2014; Ferguson & Kaundinya, 2014; Steven Burrill, 2014; Wu & Huarng,
2014).
2.3.2 SELEÇÃO DE LINHAGENS
Entre as estratégias empregadas por alguns autores na tentativa de aumentar o
rendimento de alguns aromas obtidos por via biotecnológica está o isolamento e a
seleção de micro-organismos (Werf & Bont, 1998).
Frequentemente, amostras de solo têm sido empregadas para a prospecção de
micro-organismos potencialmente biotransformadores de compostos terpênicos. A
seguir, seguem alguns exemplos de linhagens de micro-organismos obtidos por esse
método: Zhao et al., (2006), isolaram Bacillus fusiformis CGMCC1347 capaz de
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biotransformar isoeugenol (50,0 g L-1) em vanilina (8,10 g L-1/72 h). Hua et al. (2007) a
partir de Bacillus pumilus obtiveram 3,75 g L-1 (150 h) de vanilina a partir de 50,0 g L-
1de isoeugenol. Furukawa et al. (2003) empregando Pseudomonas putida I58, em 40
min de incubação, obtiveram 98% de conversão de isoeugenol a ácido vanílico (forma
oxidada da vanilina servindo também de substrato para a produção da mesma).
Shimoni et al. (2000) isolaram uma cepa de Bacillus subtillis, o qual produziu 0,9 g L-1
de vanilina a partir de isoeugenol. Já Thanh et al. (2004) obtiveram quatro linhagens
de leveduras capaz de utilizarem limoneno como única fonte de carbono: Rhodotorula
philyla, Rhodotorula cycloclastica, Rhodotorula retinophila, Rhodotorula terpenoidalis.
Outras estratégias de isolamento/seleção também podem ser adotadas,
afirmando assim, a importância dos esforços de prospecção na produção
biotecnológica de aromas.
Ferraz et al. (2015) isolaram de uma amostra de queijo, Penicillium crustosum. A
lipase produzida pelo referido micro-organismo foi imobilizada no sistema de
fermentação, sendo responsável por catalisar a conversão de geraniol/ácido
propiônico em geranil propionato. A otimização dos parâmetros de fermentação
mostrou que a lipase produzida por Penicillium crustosum tem potencial para ser
largamente aplicada na produção de geranil propionato.
Pastore et al. (1994), a partir de amostras de beiju (uma comida típica do
norte/nordeste do Brasil produzida a partir de fécula de mandioca), isolaram oito
linhagens diferentes de Neurospora sp. identificadas como capazes de produzir
agradáveis aromas frutados.
Dai et al. (2015) isolaram uma linhagem de Bacillus subtilis DL01 proveniente de
sedimento marinho na China. A prospecção dessa bactéria mostrou-se bastante
encorajadora em função da tolerância demonstrada em sistemas com reduzida taxa de
aeração (0,4 vvm) e alta concentração de açúcar (210 g L-1 de glicose) para a
produção de acetoína (76 g L-1/ 1,0 g L-1 h-1/ 60,9 L-1 d-acetoína).
Karmakar et al. (2000) isolaram a partir de troncos de madeira em decomposição
Bacillus coagulans BK07. Tal linhagem demonstrou uma expressiva capacidade de
decompor em um período reduzido (7 h de fermentação), 95% do meio de cultivo
composto por ácido ferrúlico em vanilina, ácido vanílico e 4-vinilguaiacol.
Dionísio et al. (2009) isolaram de frutas do Brasil, nove linhagens diferentes de
fungos (Aspergillus sp., Penicillium sp. e Paecilomyces spp) os quais foram testados
na biotransformação de cinco terpenos (1S)-(−)-α-pinene, (R)-(+)-limoneno, γ-
terpineno, farneseno e citronelol). Dentre os micro-organismos testados, Penicillium
sp. produziu carvona, cis- e trans-carveol, contudo, o rendimento de produto foi pouco
significativo.
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Van der Werf et al. (2000) a partir de sedimento do Rio Reno, isolaram
Xanthobacter sp. C20, usando ciclohexano como única fonte de carbono e energia. Tal
linhagem mostrou-se capaz de biotransformar quantitativamente ambos enantiômeros
do limoneno em limoneno-8,9-epóxido (0,8 g L-1). Tal estudo mostrou-se inédito ao
descrever uma nova via de metabolização do limoneno que até então não havia sido
descrita.
Por outro lado, Dufossé et al. (1998) selecionaram entre quatro espécies
diferentes de Sporiobolous (S. salmonicolor, S. ruinenii, S. johnsonii, e S. pararoseus)
quais eram mais efetivas na conversão de ácido ricinoléico a γ-decalactona. Dentre as
espécies estudadas S. ruinenii mostrou-se a mais promissora, produzindo 5,5 g L-1
(240 h) de γ-decalactona. De forma semelhante, Ferrara et al. (2009) selecionaram
entre 20 espécies diferentes de micro-organismos (a maioria do gênero Candida) qual
tinha a habilidade de biotransformar limoneno. Yarrowia lipolytica se mostrou capaz de
metabolizar ambos enantiômeros do limoneno, apresentando ácido perílico como
produto majoritário de metabolização.
2.3.3 MODOS DE FERMENTAÇÃO EM BIOPROCESSOS PARA A
PRODUÇÃO DE BIOAROMAS
Há basicamente dois modos de condução de fermentações em bioprocessos: a
fermentação submersa (FS) e fermentação no estado sólido (FES), que serão
detalhados na sequência.
A fermentação submersa (FS) é considerada um bioprocesso clássico,
caracterizada por ocorrer em meio aquoso e com nutrientes solubilizados.
Na produção biotecnológica de aromas, alguns compostos de impactos de ampla
comercialização ao redor do mundo e com demanda da ordem de toneladas anuais
são tradicionalmente obtidos por esse método. Dentre esses compostos estão a
vanilina (composto de impacto de baunilha), o 2-feniletanol (composto de impacto de
amêndoas) e a γ-decalactona (composto de impacto de pêssego) (Ben Akacha &
Gargouri, 2014) (Figura 8).
Na literatura, os estudos envolvendo FS estão focados principalmente no
impacto do rendimento do produto de interesse em função da composição do meio e
outros parâmetros de processo. Topakas et al. (2003) empregando um fungo
termotolerante - Sporotrichum thermophile – observaram que a produtividade de
vanilina foi influenciada pela disponibilidade de substrato e fonte de carbono. Nas
condições otimizadas, esses mesmos autores obtiveram um rendimento de 4798 mg L-
1 de ácido vanílico a partir de ácido ferrúlico.
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Vanilina 2-feniletanol γ-decalactona
Figura 8 – Estruturas químicas de alguns aromas
de ampla comercialização mundial.
A mesma situação foi demonstrada por Gunnarsson & Palmqvist (2006), em que
diferentes fontes de carbono e pH alteraram drasticamente a produção de vanilina por
Streptomyces setonnii ATCC 39116.
Chung et al. (2000) empregando Pichia fermentans, em reator de 5L,
observaram que a produção de 2-feniletanol era diretamente afetada pela
concentração de diferentes nutrientes no meio de cultivo. Após a otimização do meio,
obteve-se um rendimento 156% superior de 2-feniletanol (de 284,4 mg L-1 para 453,1
mg L-1 em 16 h de fermentação).
García et al. (1999) estudaram a influência do pH, nível de aeração/oxigênio
dissolvido e concentração de substrato na produção de 3-hidroxi-γ-decalactona, tendo
observado impacto positivo na conversão de 3-hidroxi-γ-decalactona em função da
oxigenação e faixa de pH adotada. Lin et al. (1996) mostraram que o efeito da adição
de diferentes ácidos graxos na produção de γ-decalactona por Sporobolomyces
odorus afetava drasticamente o rendimento de produto. Assim, houve maior acúmulo
de γ-decalactona (135,4 mg L-1 após 216 h de fermentação) quando 0,06% de ácido
ricinoléico foi adicionado ao meio de cultura como fonte de carbono no início da
fermentação.
Homola et al. (2015) investigaram as condições otimizadas para a produção de
R-1-fenietanol por Pichia capsulata ATCC 16753, tendo sido identificados os seguintes
parâmetros-chave: período do processo de fermentação, concentração de glicose e
oxigênio dissolvido.
Tian et al. (2015) observaram que a adição de ácido ascórbico ao meio de cultivo
suprimiu consideravelmente a taxa de formação de co-produtos (ácido isobutírico,
ácido butírico, ácido isovalérico, butanol) responsáveis pela redução da qualidade de
2-feniletanol obtido a partir da biotransformação de glicose e fenilalanina por
Saccharomyces cerevisiae AS 2.1182.
Gomes et al. (2007) analisaram o impacto do coeficiente de transferência de
massa de oxigênio (KLa) na biotransformação de metil recinoleato em γ-decalactona
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por Yarrowia lipolytica. Observou-se que o coeficiente mencionado apresentou
correlação positiva com o rendimento de γ-decalactona, contudo, estava intimamente
ligado à concentração de substrato e densidade celular. Assim, a máxima
produtividade foi obtida quando os seguintes parâmetros foram estabelecidos: metil
recinoleato (1,08% v/v), 2,0 × 107 células mL-1 de Yarrowia lipolytica e KLa = 70 h−1.
Lopes & Macedo (2012) estudaram a concentração de óleo hidrolisado de
castor/linhaça que impactasse na maior produtividade de γ-decalactona e γ-
caprolactona empregando duas linhagens diferentes de micro-organismos: Geotrichum
sp. e Rhizopus sp. A adição de 5% de óleo hidrolisado de castor conduziu a melhor
produtividade. Rhizopus sp produziu maior concentração de γ-decalactona
(7,68 µL L-1), enquanto Geotrichum sp produziu maior concentração de γ-caprolactona
(0,38 µL L-1), ambos, após 72 h de fermentação.
Damasceno et al. (2013) investigaram o impacto na suplementação de nutrientes
na produção de compostos voláteis por Geotrichum fragrans empregando manipueira
(água de maceração de mandioca) como substrato de cultivo. Observou-se que dada
as características do meio de fermentação adotado, o enriquecimento com extrato de
levedura, glicose e frutose não alteraram o rendimento de produto. Após 72 h de
cultivo, foram identificados dez compostos voláteis diferentes.
Por outro lado, outro processo de fermentação que tem sido largamente
estudado para a produção biotecnológica de aromas é a fermentação em estado
sólido (FES). Tal bioprocesso pode ser definido pelo método de cultivo de micro-
organismo em um suporte sólido, com baixa ou nenhuma água livre.
O sistema de suporte sólido (não solúvel) apresenta basicamente dupla
funcionalidade: imobilização física e de nutrientes. Em relação à última funcionalidade,
o suporte sólido (muitas vezes empregado como fonte de carbono) é também utilizado
para a imobilização de suplementação (aminoácidos, vitamina ou fonte de carbono
adicional) para atender as demandas nutricionais de diferentes micro-organismos
(Thomas et al., 2013).
Adicionalmente, quando comparada à fermentação submersa, a fermentação em
estado sólido apresenta algumas vantagens, dentre as mais importantes: (i) maior
produtividade e estabilidade na produção, reduzindo a inibição por produto; (ii)
redução de custos em função da possibilidade de utilização de diferentes resíduos
agroindustriais como suporte sólido e (iii) minimização da taxa de
contaminação/formação de espuma ao considerar a baixa atividade de água do
sistema (Zhang et al., 2013).
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Contudo, apesar das vantagens anteriormente mencionadas, a FES apresenta
alguns desafios cruciais para expandir a sua aplicabilidade na produção biotecnológica
de diferentes compostos.
A escolha do suporte sólido (dependente de disponibilidade e custo) é um dos
pontos críticos do processo, ao considerar a estreita relação entre substrato e produto
obtido. Além disso, outros fatores cruciais devem ser estabelecidos para o êxito da
fermentação, entre os quais: atividade de água (aw), escolha adequada do micro-
organismo e ajuste dos parâmetros de processo (físicos, químicos e biológicos) para
aumentar a taxa de recuperação de produto (Zhang et al., 2013).
Portanto, segue abaixo alguns exemplos de estudos publicados na literatura
mostrando claramente os esforços empregados por diferentes autores na tentativa de
solucionar os desafios anteriormente mencionados focados na produção
biotecnológica de aromas por FES. Além disso, considerada a possibilidade do uso de
subprodutos agroindustriais como suporte sólido, a FES tem fomentado várias
pesquisas nessa área.
Feng et al. (2007), empregando Ceratocystis fimbriata, estudaram a influência da
fonte de carbono (melaço de cana/soja ) e nitrogênio (farelo de soja/ureia) no
rendimento de aroma frutado tendo a polpa de cítricos como suporte sólido. O melhor
rendimento de compostos voláteis foi alcançado – 99,60 μmol L-1 g-1 (120 h) – quando
a polpa de cítrico foi suplementada com 50% de farelo de soja, 25% de melaço de
cana e solução salina mineral.
De forma semelhante, Christen et al. (1997) empregando o mesmo micro-
organismo - Ceratocystis fimbriata – estudaram três substratos diferentes (farelo de
trigo, bagaço de mandioca e de cana) e mostrou que o perfil de compostos voláteis
obtidos está intimamente ligado ao tipo de substrato utilizado e a suplementação
disponibilizada. Assim, o enriquecimento do bagaço de cana com 200 g L-1 culminou
na produção de aroma frutado, enquanto a suplementação desse mesmo substrato
com leucina/valina produziu compostos voláteis com acentuado aroma de banana.
O mesmo perfil de diferenciação de voláteis foi ressaltado por Soares et al.
(2000) empregando casca de café como suporte sólido para Ceratocystis fimbriata. A
suplementação com glicose 20 e 35% resultou em aroma de abacaxi, com
rendimentos de 6,50 (20% glicose) e 5,24 mmol L-1 g-1 (35% glicose) de voláteis totais,
respectivamente. Por outro lado, a suplementação com 46% de glicose/leucina
resultou em um aroma de banana.
Larroche et al. (1999) também observaram a importância do enriquecimento do
meio para a otimização da produção. Empregando soja triturada como substrato sólido
enriquecido com L-treonina e acetoína, alcançou-se 2 g L-1 de rendimento na produção
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de pirazina (2,5-dimetilpirazina e tetrametilpirazina) a partir da biotransformação de
Bacillus subtillis IFO 3013.
Medeiros et al. (2000) utilizando a metodologia de superfície de resposta,
estudaram a influência de cinco resíduos agroindustriais na produção de compostos
voláteis por Kluyveromyces marxianus. Farelo de palma e bagaço de mandioca,
ambos suplementados com 10% de glicose, mostraram-se como os substratos mais
favoráveis para a biotransformação catalisada por esse tipo de levedura. Etanol (418
μmol L-1) e acetato de etila (1395 μmol L-1) foram os componentes majoritários obtidos
a partir de farelo de palma e bagaço de mandioca, respectivamente.
Mantzouridou et al. (2015) avaliaram a produção de voláteis por síntese de novo
catalisada por leveduras empregando casca de laranja como suporte sólido. Entre os
compostos voláteis identificados como produto de fermentação após 72 h estão
isoamil acetato (48,7 mg Kg-1), etil dodecanoato (25,2 mg Kg-1), decanoato (9,3 mg
Kg-1), octanoato (6,3 mg Kg-1) e fenil etil acetato (4,5 mg Kg-1). Ainda, após 48 h, a
síntese de etil hexanoato foi acelerada, obtendo-se 154,2 mg Kg-1. O balanço na
produção de ésteres voláteis (≈ 250 mg Kg-1) mostrou que essa rota de produção é um
caminho viável para agregação de valor para um dos resíduos da agroindústria de
Citrus.
Christen et al. (2000) analisaram quantitativamente e qualitativamente, a
característica dos compostos voláteis produzidos por quatro cepas diferentes de
Rhizopus a partir dos seguintes resíduos agroindustriais: bagaço de cana/maçã, grãos
de soja/amaranto, óleo de soja. Resultados mostraram que a cepa de Rhizopus oryzae
ATCC 34612 apresentou melhor performance na produção de compostos voláteis. O
meio composto por bagaço de mandioca suplementado com 5% (m/m) de grãos de
soja produziu voláteis de maior qualidade, enquanto que, o meio composto por grãos
de amaranto suplementado com solução salina produziu voláteis em maior
quantidade.
Madrera et al. (2015) testaram a relação quantitativa entre a produção de
compostos voláteis e o micro-organismo empregado. Casca de maçã foi empregada
como suporte sólido e quatro leveduras foram utilizadas: Saccharomyces cerevisiae
(obtida comercialmente) e outras três isoladas da bebida de cidra (Saccharomyces
cerevisiae, Hanseniaspora valbyensis e Hanseniaspora uvarum). Ao todo, a partir da
fermentação das 4 cepas, foram identificados 132 voláteis de diferentes famílias, tendo
sido possível concluir que a quantidade de voláteis produzidos é cepa-dependente.
Por fim, considerando que a atividade de água (aw) é outro parâmetro de
relevante importância na FES, Gervais & Sarrete (1990) demonstraram que a
produção de 2-heptanona (composto de impacto de queijo) por Trichoderma viride em
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suporte sólido de ágar, foi drasticamente afetado pelo parâmetro anteriormente citado,
sendo que a melhor produtividade de 2-heptanona foi alcançada com aw = 0,96.
2.3.4 PRINCIPAIS CONFIGURAÇÕES DE REATORES EMPREGADOS NA
PRODUÇÃO DE BIOAROMAS
Os biorreatores são considerados o “core” dos processos fermentativos,
correspondendo à ocorrência de reações biológicas em um determinado volume.
Atualmente, em função do desenvolvimento dos bioprocessos em inúmeras áreas,
comercialmente são disponibilizadas uma série de biorreatores com diferentes
aplicabilidades. A despeito da diversidade de biorreatores, geralmente, a escolha
desses equipamentos é baseada na relação custo/benefício, robustez do sistema e
facilidade no aumento de escala.
O modo de operação também é outro fator determinante na escolha do
equipamento. Tais modos podem ser assim classificados: (i) contínuo: a taxa de
alimentação de nutrientes e remoção de produtos é constante, (ii) batelada
alimentada: a adição de nutrientes ao sistema é contínua, até a perda de viabilidade
da cultura de fermentação e (iii) batelada simples: nutrientes são adicionados apenas
no início do processo e a remoção de produto é feita somente após o encerramento do
processo fermentativo.
Em se tratando especialmente da produção biotecnológica de aromas,
comumente, são empregadas duas configurações principais de biorreator: reator de
leito fixo e reator de leito fluidizado.
Em reator de leito fixo, Chang et al. (2007) avaliaram a produção de hexil laurato
– um éster de aroma frutado – pela metodologia da superfície de respostaa partir de
lipase isolada de Rhizomucor miehei. A avaliação dos parâmetros de fermentação
mostrou que as condições otimizadas de cultivo foram 45°C, razão molar de substrato
(1:1-1:3) e taxa de agitação igual a 4,5 mL min-1, permitindo assim obter 435,6 µmol
min-1 de hexil-laurato.
Raganati et al. (2013) a partir de Clostridium acetobutylicum DSM 792 tendo soro
de leite como substrato, obtiveram uma taxa de produtividade de butanol igual a
2,66 g L-1 h-1. O período de fermentação foi de 90 dias.
Já Carta et al. (1992) empregando lipase de Candida cylindracea imobilizada em
suporte de nylon, obtiveram maior rendimento nos produtos de fermentação –
etilpropionato, isoamilpropionato, isoamilbutirato – quando o sistema foi operado no
modo contínuo, assegurando a minimização da taxa de desnaturação da enzima
catalisadora da reação.
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Lee et al. (1995) obtiveram uma conclusão interessante acerca da
individualidade de cada microrganismo frente aos parâmetros de cultivo. Adotando
reator de leito fixo operado no sistema de batelada alimentada, inicialmente foram
avaliados o quanto a faixa de pH e a taxa de aeração afetavam o rendimento na
produção de γ-delactona por Sporobolomyces odorus. Assim, para a faixa de pH
estabelecida entre 4-6 e taxa de aeração do sistema entre 1,0-1,5 vvm, o rendimento
de produto não foi alterado (54,6 mg L-1 γ-delactona/120 h). Contudo, a alimentação do
sistema mostrou forte correlação positiva com o rendimento obtido de γ-delactona, isto
é, a adição de óleo de castor hidrolisado, entre o terceiro e quinto dia de fermentação
possibilitou um rendimento de γ-delactona igual a 208 mg L-1 após 168 h de processo.
Damnjanovic et al. (2012) testaram a produção de geranil butirato a partir de
lipase de Candida rugosa. A análise comparativa do desempenho de produção
considerou diferentes polímeros para a imobilização da lipase, duas configurações de
reator (reator de leito fixo e reator de leito fluidizado), temperatura, razão molar de
substrato, concentração de água e taxa de aeração. O ajuste dos parâmetros de
processo para ambas as configurações de reator mostrou que o reator de leito
fluidizado possibilitou alcançar 78,9% de conversão molar do substrato ao produto de
interesse em 10 h de processo. Já para o reator de leito fixo, alcançou-se 99,9% de
taxa de conversão molar após 48h de fermentação.
De forma semelhante, um estudo comparativo também foi conduzido por De
Carvalho & da Fonseca (2002) para testar o desempenho de três configurações
diferentes de reator na produtividade de carvona a partir de carveol, utilizando
Rhodococcus erythropolis. O melhor rendimento de conversão (0,164 mg h-1 mL-1) foi
alcançado empregando reator de leito fluidizado, com adaptação prévia da cultura ao
substrato (carveol), solvente e produto (carvona).
2.3.5 PRINCIPAIS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO EMPREGADOS NA
PRODUÇÃO DE BIOAROMAS
O processo downstream na produção biotecnológica de aromas assume um
papel fundamental e apresenta estreita ligação com a potencialidade de
comercialização desses produtos. Assim, as operações unitárias empregadas nesse
processo devem assegurar as características sensoriais dos compostos voláteis e
apresentar uma alta taxa de recuperação de produto. Em relação à última demanda,
considerada uma tarefa de alta complexidade, o grande desafio está em recuperar
produtos com uma alta taxa de diluição imprimidos em uma matriz complexa
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(geralmente combinados com outros metabólitos de fermentação) (Dawiec et al., 2015;
Mafi et al., 2013; Sahin, 2013).
Assim, nesse contexto, a recuperação de produto in situ mostra-se como
alternativa viável para contornar os problemas anteriormente descritos. Dentre as
vantagens desse método: (i) a toxidez causada por produto é reduzida, favorecendo a
produtividade; (ii) minimização da perda de voláteis por evaporação/degradação
(impactando na taxa de recuperação de produto) e (iii) simplificação das operações
unitárias durante as etapas de separação (Van Hecke et al., 2014).
Portanto, considerado os aspectos anteriormente mencionados, a remoção de
produto in situ na produção biotecnológica de aromas baseia-se em duas técnicas
principais: pervaporação organofílica empregando membranas/resinas e sistemas
bifásicos.
Mei et al. (1996) obtiveram 6,17 g L-1 de 2-feniletanol (24 h) com Saccharomyces
cerevisiae utilizando a resina D101. De forma semelhante, em outros três trabalhos
publicados subsequentemente, Wang et al. (2011), a partir de Saccharomyces
cerevisiae e com a resina FD0816, obtiveram um rendimento de fermentação de 32,5
g L-1 ou 0,45 g L-1 h-1 de 2-feniletanol. Wang et al. (2011), mostraram que
empregando resina macroporosa, a produtividade de 2-feniletanol a partir de l–
fenilalanina por Saccharomyces cerevisiae foi de 0,90 g L-1 h-1. Wang et al. (2012)
empregando resina ZGA330, obteve 52,5 g L-1 ácido propiônico e 43,04 mg L-1 de
vitamina B12, após 160 h de fermentação a partir de Propionibacterium freudenreichii
CICC 10019.
Chen et al. (2015) empregaram resina de troca aniônica (D301G) na produção
de 1,3-propanodiol e ácido lático por Lactobacillus reuteri. Uma importante observação
foi feita a partir desse experimento: a adição de resina alterou a rota metabólica do
micro-organismo. Isto é, quando adicionada no início da fermentação, Lactobacillus
reuteri usou preferencialmente glicose. Já quando a D301G foi introduzida após 12h
de fermentação, Lactobacillus reuteri aumentou o consumo de glicerol em 20%,
alterando positivamente o rendimento em 15% e 12% para 1,3-propanodiol e ácido
lático, respectivamente.
Mirata et al. (2009) utilizando Pseudomonas putida DSM 12264 na
biotransformação de limoneno a álcool perílico obtiveram um rendimento de 31 g L-1
após 168 h de fermentação (rendimento nunca antes relatado) empregando resina de
troca aniônica (Amberlite IRA 410 Cl).
Por outro lado, também empregando resina (HZ802), Zheng et al. (2007)
estudaram a produção de vanilina a partir de óleo de farelo de arroz (um resíduo da
agroindústria composto por ácido ferrúlico) empregando dois micro-organismos
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diferentes: Aspergillus niger CGMCC0774 e Pycnoporus cinnabarinus CGMCC1115.
Inicialmente A. niger, em fermentador de 25 L, converteu 4,0 g L-1 de ácido ferrúlico
em 2,2 g L-1 de ácido vanílico. Posteriormente, o ácido vanílico produzido por A. niger
foi disponibilizado para bioconversão por P. cinnabarinus, tendo sido obtido um
rendimento 2,8 g L-1 de vanilina a partir de meio suplementado com 5,0 g L-1 de
glicose.
Por fim, Bluemke & Schrader (2001) observaram uma íntima relação entre a
membrana empregada e o perfil de recuperação de compostos voláteis produzidos por
Ceratocystis moniliformis ATCC 12861. Assim, utilizando membrana POMS, a
concentração de ésteres no permeado foi maior, enquanto que o emprego da resina
PEBA possibilitou maior recuperação de terpenoides.
Em contrapartida, alguns estudos estão focados na utilização de sistemas
bifásicos para facilitar a recuperação de compostos voláteis. A partir dessa técnica,
três modos de extração são possíveis: sistema aquoso de duas fases, sistema
líquido/gasoso e sistema líquido/sólido.
No sistema de duas fases aquosas, Bicas et al. (2010) relataram um rendimento
inédito de 130 g L-1 de R-(+)-α-terpineol a partir de R-(+)-limoneno por Sphingobium
sp. A alta produtividade do sistema foi atribuída ao sistema bifásico adotado na
fermentação: sistema aquoso com concentrado de resting cells de Sphingobium sp. e
fase orgânica adicionada de óleo de girassol. Rito-Palomares et al. (2011) avaliaram a
adição de polietileno glicol sulfato/dextrana na produção de 6-pentil-α-pirona por
Trichoderma harzianum (inibida por 100 mg L-1 do produto 6-pentil-α-pirona). O
coeficiente de partição se mostrou mais favorável ao polietileno glicol sulfato,
beneficiando a produtividade e a recuperação de 6-pentil-α-pirona.
Já o sistema líquido/gasoso encontra aplicabilidade quando substrato/produto
estão na forma gasosa. Akacha & Gargouri (2009), para produzir compostos voláteis
C6, implementaram um reator onde as enzimas catalisadoras da reação foram
estabelecidas na fase líquida e um fluxo gasoso foi utilizado para a recuperação dos
voláteis. O rendimento da extração do produto foi de 75%, após a otimização das
condições experimentais de cultivo por delineamento experimental.
Em se tratando do sistema líquido/sólido, preferencialmente o composto volátil é
transferido para a fase sólida, imobilizado no adsorvente (resinas/membranas) que
deve ser insolúvel em água/etanol e apresentar alta seletividade. A exemplificação
desse tipo de sistema já foi apresentada previamente nesse texto.
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2.3.6 RESOLUÇÃO QUIRAL DA MISTURA RACÊMICA DE BIOAROMAS
Os enantiômeros são frequentemente encontrados entre os diferentes
compostos bioativos, como por exemplos, os fármacos e os compostos voláteis. Tais
substâncias apresentam identidade química e física, distinguindo-se apenas pela rota
de polarização da luz. Assim, se o composto apresenta desvio da luz a direita, é
definido como dextrogiro (+). Por outro lado, se o desvio ocorre para a esquerda, tem-
se o levogiro (-).
Contudo, apesar da identidade físico-química desses compostos, geralmente um
enantiômero apresenta propriedades organolépticas completamente distintas uma da
outra. Por exemplo, a (-)-nootkatona possui aroma de toranja, enquanto a (+)-
nootkatona apresenta aroma amadeirado (Brenna et al., 2003).
Considerado esse fato, um dos desafios na produção biotecnológica de aromas
centra-se na separação da mistura racêmica dos compostos voláteis obtidos do
processo fermentativo. Assim, além da pureza do produto conferir maior valor
agregado para a comercialização do mesmo, a separação desses compostos também
é interessante porque cada um dos enantiômeros gerados denotam notas aromáticas
completamente distintas uma da outra, cada qual com seu valor de mercado e
diferentes aplicabilidades (Fantin et al., 2000).
Alguns estudos relatados na literatura mostram que a resolução racêmica é
cepa-dependente, apresentando estreita relação com a composição do meio de cultivo
e parâmetros de processo adotado no processo de fermentação (exemplo: pH,
temperatura, razão molar de solvente) (Marchelli, 1996).
Zawirska-Wojtasiak (2004) estudou a pureza enantiômérica de 1-octen-3-ol a
partir da biotransformação de ácido linoleico por oito espécies de fungos (Agaricus
bisporus, Pleurotus ostreatus, Hericium erinaceum, Pholiota nameco e Lentinus
edodes, Boletus edulis, Xerocomus badius e Macrolepiota procera). A despeito do
rendimento de produto, preferencialmente (R)-(−)-1-octen-3-ol foi produzido por todas
as espécies. Agaricus bisporus e Xerocomus badius apresentaram 98,5% e 82,1% de
pureza óptica, respectivamente.
Análise semelhante foi feita por Bruni et al. (2006), em que tendo empregado
oito espécies diferentes de plantas (Brassica oleracea botrytis, Cucurbita maxima,
Cucurbita pepo, Cynara scolimus, Daucus carota, Foeniculum vulgare e Musa
sapientum) mostraram que a produção de (S)- e (R)-enantiômero é planta-
dependente.
Bicas et al. (2010) mostraram que Sphingobium sp. apresentou
enantioespecificidade ao substrato empregado na bioconversão. Isto é, quando R-(+)-
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limoneno foi disponibilizado, produziu-se R-(+)-α-terpineol com excesso enantiomérico
próximo a 100%. Já quando o substrato foi S-(-)-limoneno, o produto obtido foi S-(-)-α-
terpineol com excesso enantiomérico de cerca de 60%. Em um processo análogo
Adams et al. (2003) observaram que Penicillium digitatum converteu R-(+)-limoneno
em R-(+)-α-terpineol (com rendimento de 93%), enquanto que o enantiômero S-(-)-
limoneno não foi biotransformado. Os estudos de Tan et al. (1998) corroboraram as
pesquisas de Adams et al. (2003), pois aqueles autores também observaram que
Penicillium digitatum, cultivado em uma mistura racêmica de limoneno, converteu
apenas R-(+)-limoneno em R-(+)-α-terpineol.
A resolução cinética enzimática está entre as alternativas para a purificação de
misturas racêmicas na produção biotecnológica de aromas. Tal técnica pode ser
definida como a capacidade apresentada por uma enzima em diferenciar dois
enantiômeros apenas pela distinção do arranjo espacial de seus átomos. Assim, a
eficiência na enantioseletividade está ligada a preferência apresentada por uma
enzima por um dos enantiômeros em função do arranjo do sítio ativo do mesmo (de
Miranda et al., 2015).
A lipase (E.C. 3.1.1.3), uma hidrolase amplamente encontrada em diferentes
organismos, é responsável por catalisar a hidrólise de triacilgliceróis a ácidos graxos e
glicerol. Atualmente, desempenham um importante papel em inúmeros processos
biotecnológicos, sendo amplamente estudadas para a conversão de inúmeros
compostos voláteis de aroma com alta pureza óptica (de Miranda et al., 2015).
Dentre as principais vantagens da utilização dessa enzima está a alta
enantioseletividade e enantioespecificidade, além de apresentar baixo custo, fácil
acessibilidade (são ubíquas) e flexibilidade para catalisar a conversão de diferentes
substratos (de Miranda et al., 2015). Considerado tais aspectos, a aplicação de lipases
na produção biotecnológica de aromas tem sido estudada para a resolução da mistura
racêmica daqueles compostos.
Ujang et al. (2003) empregando lipase de Candida rugosa, mostraram que a
maior taxa de resolução cinética de ±2-(4-clorofenoxi)-ácido propiônico foi alcançada
quando o sistema operou a 30/40°C e com baixa atividade de água. A operação
contínua do sistema elevou a 100% o excesso enantiômérico de
(-)-2-(4-clorofenoxi) ácido propiônico. Também a partir de lipase de Candida rugosa,
Bai et al. (2006), mostraram que 88% de excesso enantiômérico de
(−)-metil propionato foi obtido a partir de (±)-mentol. O melhor desempenho do sistema
foi a 30°C por 2,5 h, com alimentação de 0,2 mol L-1 de (±)-mentol. Nesse caso, um
fato importante foi observado: a atividade e a enantioseletividade reduziu
gradualmente com o aumento da atividade de água.
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Por fim, Oda et al. (1999) testaram o acoplamento de um sistema enzimático
para a resolução cinética da conversão de citronelol por Pichia kluyveri IFO 1165.
Adicionalmente, estudaram o impacto no rendimento e na enantioseletividade
empregando duas configurações de reator diferentes: reator de leito fluidizado e
biorreatores multi-estágios. Assim, apesar do micro-organismo ter sido exposto a altas
concentrações de substrato (30% de citronelol), a adoção do sistema enzimático
(acetil-coenzima A e álcool acetiltransferase) e do reator multi-estágio impactou no
excesso enantiomérico de (S)-acetato de citronelil e (R)-citronelol.
Por outro lado, Chojnacka et al. (2007) estudaram a transesterificação de
diferentes álcoois catalisadas por lipase de Candida antarctica (Novozym 435) e
Burkholderia cepacia (Amano PS). A reação conduzida por Candida antarctica conferiu
um excesso enantiomérico de 97-100% para ésteres e de 91–100% para álcoois. Já a
transesterificação conduzida por Burkholderia cepacia apresentou um excesso
enantiomérico de 90-95% para (R)-álcool e 98-100% para (S)-éster.
2.4 BIOAROMAS – PERSPECTIVAS PARA O DESENVOLVIMENTO
SUSTENTÁVEL
O conceito de desenvolvimento sustentável foi criado a partir da necessidade de
aliar as atividades industriais em harmonia com o meio ambiente (Ekins, 1993).
Portanto, é um termo relativamente recente e que ainda encontra barreiras para a sua
ampla compreensão já que, muitas vezes, a sustentabilidade é diretamente associada
ao cumprimento de legislações que possibilitem apenas a preservação ambiental
(Cristina & Diana, 2014).
Contudo, a criação de tecnologias que se proponham ao desenvolvimento
sustentável devem abordar de forma indissociável os três aspectos que efetivamente
proporcione a sustentabilidade desse novo processo, a citar: aspecto ambiental,
econômico e social (Ashby, 2016). De fato, o conceito de desenvolvimento sustentável
estaria sujeito a uma considerável limitação se fosse necessário atender somente o
aspecto ambiental em detrimento do desenvolvimento econômico e social.
Em função disso, foi criado o tripé da sustentabilidade (Triple Bottom Line)
(Figura 9), baseado na indissociabilidade dos aspectos anteriormente mencionados.
Dessa forma, uma tecnologia só é reconhecida como sustentável caso atenda de
forma ampla e simultânea as três esferas do Triple Bottom Line (Gimenez et al., 2012).
Vários índices foram propostos para mensurar a sustentabilidade, entretanto,
tratando-se de uma quantificação complexa em virtude dos diferentes aspectos
envolvidos e dos contextos relacionados, cada índice apresenta pontos positivos e
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negativos, estando mais bem moldados dependendo da situação envolvida (Bellen,
2003).
Atualmente, a tendência dos processos industriais, principalmente dos processos
químicos, é focada na substituição de todo ou parte do procedimento por novas
tecnologias que façam uso de micro-organismos, isto é, por via biotecnológica, para a
fabricação de produtos de significativo valor comercial (Gavrilescu, 2005; Miller, 2000).
Tal fato é amplamente justificável em função do maior interesse das indústrias em
oferecer produtos que sejam “amigos” do meio ambiente, socialmente equitativos e
que abarquem alto valor agregado, atendendo assim às tendências mercadológicas
(Toldrá, 2015).
Nesse sentido, a produção de aromas por via biotecnológica é um exemplo
bastante claro de tecnologia que se propõe ao desenvolvimento sustentável.
Figura 9 – Tripé da sustentabilidade que deve ser integralmente contemplado
por uma tecnologia que se proponha ao desenvolvimento sustentável
(Evangelista, 2010).
2.4.1 ASPECTO AMBIENTAL
Os bioprocessos, processos em que são empregados biocatalisadores para a
fabricação de determinados produtos de interesse, são utilizados pela humanidade
desde a antiguidade, principalmente na produção de alimentos. Esse emprego pode
ser classicamente exemplificado na produção de queijos, bebidas fermentadas,
embutidos e conservas (Berger & Krings, 2014; Kwon et al., 2014).
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Contudo, ao longo dos anos, a utilização de micro-organismos como fábricas
biológicas para a elaboração de diferentes produtos extrapolou o setor alimentício,
sendo hoje amplamente empregado em áreas bastante distintas como medicina,
agricultura, remediação ambiental, dentre muitas outras. Tais adventos, associados ao
desenvolvimento dos bioprocessos, demonstram a versatilidade, adaptabilidade e
potencial do uso de micro-organismos na disponibilização de produtos de interesse
comercial (Papadimitriou et al., 2015; Demain, 2000).
Aliado a esse cenário, os processos que utilizam micro-organismos tornaram-se
ainda mais atraente após o surgimento do conceito de desenvolvimento sustentável e
a necessidade de adequação às legislações ambientais. Isso porque, a substituição de
processos clássicos por bioprocessos na indústria, de modo geral, representam a
adoção de condições menos drásticas dos parâmetros de operação, entre as quais,
requerem temperaturas brandas de cultivo, próximas à temperatura ambiente,
representando, assim, um menor gasto energético (Zhou et al., 2014; Boukroufa et al.,
2014; Marriott 2012).
Adicionalmente, a prospecção de micro-organismos promissores para a
fabricação de determinados produtos de interesse colaboram com a preservação
ambiental e a consequente manutenção da biodiversidade. Dessa forma, o acesso à
biodiversidade para esse fim evita a derrubada de áreas verdes, assoreamento de
corpos d’águas ou alteração na taxa de extinção de espécies. Assim, nesse caso, é
possível explorar o meio ambiente, sem, contudo, degradá-lo (Barrett & Lybbert,
2000).
Outro ponto de significativo interesse do uso de micro-organismos é a tendência
crescente de empregar meios de cultivo alternativo e não tradicionais nos
bioprocessos (Lo et al., 2007; Yu, 2007; Wen et al., 2007). Esses meios de cultivo são
representados por subprodutos de baixo valor comercial ou resíduos originados de
diferentes atividades industriais, principalmente do setor agropecuário, o qual é
marcado pela geração bastante volumosa de rejeitos (Madeira et al. 2014; Bicas et al.
2010; Damasceno et al. 2003).
Portanto, o emprego de meios alternativos sinaliza algumas vantagens do ponto
de vista do gerenciamento de resíduos, tais como: (i) redução do gasto financeiro para
adequação do passivo ambiental às normas vigentes e (ii) agregação de valor ao que
era considerado inutilizável (Mirabella et al., 2014).
O Brasil apresenta um forte setor agrário, mostrando expressiva produção em
vários campos, entre os quais o setor de cítricos e de papel/celulose. Contudo, apesar
da significativa contribuição econômica na balança comercial do país por esses
setores, o volume de resíduos produzidos por tais atividades são bastante
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consideráveis e representam um gargalo nessas indústrias em função da mitigação
ambiental a ser aplicada (Rodrigues et al., 2014).
Porém, considerando as características de alguns de seus subprodutos, ricos em
compostos terpênicos, tais como o R-(+)-limoneno oriundo do processamento de
laranja e α-pineno derivado da indústria de papel/celulose, estes encontram importante
aplicabilidade como substrato de cultivo para a biotransformação de terpenos em
produtos de alto valor agregado, como, por exemplo, os bioaromas (Birolli et al., 2015,
Núñez-Delgado, 2014; Schewe et al., 2007; Rottava et al., 2010).
Nesse sentido, é importante destacar que tanto o cultivo clássico de micro-
organismos quanto a tentativa de utilização de rejeitos industriais como meio de cultivo
requer maiores investimentos em pesquisa e formação de recursos humanos na área
de bioprocessos (Woodley et al., 2013). A multidisciplinaridade é também outro ponto
de grande importância, já que a compreensão das condições satisfatórias do cultivo de
micro-organismos requer conhecimento em diferentes áreas, como engenharia,
microbiologia e bioquímica (Doran, 2013; Zaborsky, 1995).
A partir disso, faz-se necessário o desenvolvimento de experimentos bem
planejados para o isolamento adequado de micro-organismos, a aplicação de técnicas
de planejamento experimental para a determinação das condições otimizadas de
produção, aliado aos parâmetros de scale-up e etapas downstream do produto-alvo
(Clarke, 2013b; Clarke, 2013a; Bohlmann, 2011; Rubin-Pitel et al., 2007; Shimoni et
al., 2000).
Superadas todas essas barreiras é possível tornar real e lucrativo a aplicação
em escala industrial de determinado bioprocesso em detrimento da escala de bancada
(Craig Shimasaki, 2014a; Steven Burrill, 2014). Por fim, é necessário considerar o
expressivo valor da exploração racional dos recursos naturais para o desenvolvimento
sustentável, bem como da ciência e da inovação tecnológica.
Deste modo, um dos meios possíveis de tornar real a preservação ambiental
aliada à processos inovadores consiste no emprego de micro-organismos como
fábricas biológicas na fabricação de produtos de agregado valor comercial (Klemick &
Simpson, 2013).
2.4.2 ASPECTO ECONÔMICO
A aceitação e a aplicação em escala industrial de inovações tecnológicas estão
intimamente ligadas à geração de lucro, demanda de mercado e rotatividade de
produtos. Caso esse cenário não seja amplamente contemplado, possivelmente, a
nova tecnologia não será perpetuada. Dessa forma, a criação de ideias traduzida na
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entrega de novos produtos e processos, não significa necessariamente que a mesma
será imediatamente adotada pelo setor industrial. Portanto, os processos inovadores
devem ser firmemente focados na viabilização em escala industrial a partir da escala
de bancada (Shimasaki, 2014a; Craig Shimasaki, 2014b; Shimasaki, 2014b).
Assim, no que diz respeito aos bioprocessos, os produtos gerados a partir dessa
rota são muitas vezes reconhecidos como produtos de alto valor agregado (Conner et
al., 2014; Otte & Hauer, 2015).
Em se tratando da produção de bioaromas, também um bioproduto, é
fundamental que o aspecto econômico que seja atendido de forma lucrativa,
favorecendo a viabilização comercial e a demanda desses mesmos produtos. Para
efeito comparativo, a Tabela 3 demonstra os valores de três diferentes bioaromas em
função da rota de obtenção dos mesmos.
Tabela 3 – Valores comerciais de mercado estimados para três diferentes
bioaromas em função da sua rota de produção (US$ Kg-1)
Compostos de
aroma
Sintética
Natural
“Biotec”
Referência
Vanilina 15 1.200 à
4.000 1.000
(Gallage & Møller
2015;
Xu et al., 2007)
γ-decalactona 150 6.000 300 (Schrader et al., 2004)
Butirato de etila 4 5.000 180 (Dubal et al., 2008)
Portanto, ao analisar tais dados (Tabela 3), é possível perceber claramente o
potencial da produção de compostos por via biotecnológica. Assim, o aspecto
econômico da produção de bioaromas mostra-se bastante promissor no que diz
respeito à aceitação mercadológica desses produtos quando ponderados o valor
comercial e o respectivo benefício associado à utilização dos mesmos em diferentes
setores.
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2.4.3 ASPECTO SOCIAL
2.4.3.1 BIOPROSPECÇÃO
A bioprospecção é uma atividade que consiste na investigação do meio
ambiente com o objetivo de encontrar agentes biológicos que possam ser empregados
na produção de mercadorias de valor comercial (Artuso, 2002).
Esses agentes biológicos podem ser bastante variados, bem como a
aplicabilidade encontrada para cada um desses. Entre os principais agentes biológicos
comumente explorados desde a antiguidade pela humanidade, estão extratos de
plantas, biomoléculas isoladas de determinados animais ou micro-organismos, como
fungos e bactérias (Verpoorte, 2015; Hicks & Prather, 2014).
Com o intuito de regulamentar o acesso à diversidade biológica, foi criada a
Convenção da Diversidade Biológica (CDB), que, em nível internacional, formulou os
princípios norteadores para a exploração sustentável da biodiversidade (David Cooper
& Noonan-Mooney, 2013).
O Brasil, com o objetivo de honrar o compromisso assumido com a CDB,
publicou em 2001 a Medida Provisória 2.186-16 que dispõe sobre os direitos e
obrigações relativas ao acesso dos recursos genéticos nacionais. Contudo, alguns
aspectos desta medida provisória têm sido questionados desde a sua implementação,
em função da burocratização oferecida pela mesma (Morales, 2015). Dessa forma, a
recente proposição do Projeto de Lei 7735/2014, embora ainda questionável, sugere a
simplificação da exploração dos recursos biológicos brasileiros.
De acordo com Morales (2010), o Brasil apresenta cerca de 70% das espécies
mundiais, integrando o grupo dos 17 países considerados megadiversos (de Lima et
al., 2010; Nunes & van den Bergh, 2001).
Apesar de a Amazônia apresentar grande parte desse patrimônio biológico,
biomas como o cerrado e a mata atlântica têm sido comumente apontados também
como hotspots de significativo valor para a busca de novos potenciais genéticos que
possam ser empregados em escala industrial (Marchese, 2014). Dessa forma, o Brasil
é visto como um local de relevante potencial para a exploração de riquezas naturais
(Adenle et al., 2015).
Nesse sentido, de forma geral, as atividades de bioprospecção mostram-se
bastante atraentes em função de três aspectos principais que vão além da
contribuição à inovação, a citar: (i) valorização dos recursos naturais; (ii) acesso ao
conhecimento tradicional associado (CTA) e (iii) apresentam potencial de contribuição
para a sustentabilidade financeira de determinadas localidades . Dessa forma, a
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bioprospecção assume um importante valor para a melhoria das condições sociais da
população, que apresenta recursos naturais como herança ambiental (Lewandowski,
2014).
Em relação a melhorias sociais, a valorização dos recursos naturais de
determinada região pode contribuir claramente para o aumento da qualidade de vida
das pessoas que ali habitam (Sandifer et al., 2015; Clark et al., 2014; Gerwick, 2013;
Ostfeld & Keesing, 2013). Tal fato é facilmente justificado pela preservação de áreas
verdes colaborando para a qualidade do ar; manutenção das nascentes de água,
considerado ultimamente um dos pontos mais críticos da exploração ambiental
indiscriminada e, por fim, a preservação de espécies endêmicas que representam uma
riqueza de expressivo valor em função da baixa probabilidade de serem encontradas
em outros locais que não aquele (Morrone, 2008).
Outro ponto de grande importância é o fato de que a bioprospecção se mostra
como uma atividade que valoriza o CTA ao saber da população local (Toledo, 2013).
Assim, confere relevante valor para o aprendizado ligado à própria experiência dos
habitantes que já desfrutam da utilização de certos potenciais biológicos para usos
mais nobres, como por exemplo: utilização de ervas típicas para a produção de
infusões com propriedades medicinais, fabricação de corante natural a partir da casca
de árvores ou extração de substâncias aromáticas provenientes da flora (Finegold et
al., 2005; Cox & King, 2013).
Adicionalmente, o CTA também pode colaborar para a sustentabilidade
financeira de determinados grupos que disponham e contribuam com esse
conhecimento para a inovação tecnológica e o desenvolvimento de novos produtos
para fins comerciais (Heal, 2001). A partir disso, pode-se tornar factível o aumento da
renda per capita de comunidades de baixa renda, através da criação de cooperativas
e/ou associações que promovam a repartição de benefícios em função da exploração
dos recursos naturais do local onde essa população se mantem (Onugu, 2002).
Portanto, a bioprospecção, apesar dos desafios que permeiam essa atividade,
mostra que é factível a exploração da biodiversidade aliada ao desenvolvimento social,
valorizando os saberes populares, além do aumento da qualidade de vida e financeira
dessas mesmas populações (Sukara, 2014; Neimark, 2012; Puppim de Oliveira et al.,
2011; Artuso, 2002).
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2.4.3.2 POTENCIAL BIOLÓGICO DOS BIOAROMAS
O câncer é uma doença de dimensões globais e que requer atenção. De acordo
com o Relatório Mundial de Câncer (2014) publicado pela Organização Mundial de
Saúde (OMS), em 2012, foram diagnosticados cerca de 14 milhões de casos e 8,2
milhões de óbitos associados ao câncer. Ainda, estimativas propõem, que as
estatísticas anteriormente mencionadas poderão sofrer um incremento de 70% nas
próximas duas décadas (Vineis & Wild, 2014; WHO, 2014; López-Gómez et al., 2013).
Considerado tal cenário, faz-se cada vez mais necessário o investimento em
pesquisas que possam elucidar drogas mais eficazes e específicas no tratamento de
tais doenças (Khazir et al., 2014; Neidle et al., 2014).
Tradicionalmente utilizados pela medicina popular, os óleos essenciais são
reconhecidos por auxiliar no tratamento de diferentes problemas de saúde,
apresentando assim inúmeras propriedades, tais como: anti-inflamatória,
antiespasmódica, anticancerígena, antimutagênica, antibacteriana, antifúngica,
antiviral e vermicida (Kittakoop, 2015; Raut & Karuppayil, 2014; Lawal & Ogunwande,
2013; Tchimene et al., 2013).
Assim, considerando as dimensões globais das doenças oncogênicas e a
atividade anticancerígena demonstrada por diferentes óleos essenciais, recentemente,
estudos focados na ação in vitro e in vivo de compostos terpênicos demonstraram
atividade efetiva contra a proliferação de células cancerígenas (Shojaei et al., 2014;
Bicas et al., 2011; Herrmann & Wink, 2011).
Entre os terpenos mais promissores estão o limoneno (Vandresen et al., 2014) e
seus derivados, como o álcool perílico (Ahn et al., 2003), carvona (Da Fonseca, 2006)
e α-terpineol (Hassan et al., 2010). Ainda que de forma discreta, o farneseol (Chen et
al., 2015; Rioja et al., 2000) – um análogo do farneseno - e o α-pineno (Matsuo et al.,
2011) também têm sido investigados para esse fim.
Pesquisas demonstram que a atividade anticarcinogênica associada aos
compostos terpênicos se deve a: (i) efeitos bloqueadores (fase de iniciação),
caracterizado pela indução das enzimas da fase I e fase II do metabolismo de
xenobióticos, o que está associado à detoxificação do agente carcinógeno; (ii) efeitos
supressores (fase de promoção), caracterizados (ii.a) pela inibição da proliferação
celular, indução da apoptose ou diferenciação ou (ii.b) pela inibição da isoprenilação
pós-traducional de proteínas reguladoras do crescimento celular (Crowell, 1999).
Dessa maneira, estudos in vitro sugerem a potencial aplicação desses
compostos contra câncer de próstata (Kassi et al., 2014; Sundin et al., 2012; Chen et
al., 2006), câncer de mama (Patel & Thakkar, 2014; Kim et al., 2012; Duncan & Archer,
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2006), câncer de cólo do útero (Chidambara et al., 2012a; Chidambara et al., 2012b),
câncer pulmonar (Imamura et al., 2014; Yeruva et al., 2007; Elegbede et al., 2003),
câncer bucal (Scheper et al., 2008), câncer de pele (Chaudhary et al., 2009), câncer
hepático (Chen et al., 2015) e gliomas cerebrais (Fischer et al., 2010; Afshordel et al.,
2015; Lee et al., 2015).
Em se tratando dos ensaios in vivo, um grupo liderado por pesquisadores da
Universidade Federal Fluminense e Universidade Federal do Rio de Janeiro
conduziram ensaios clínicos em pacientes com diferentes gliomas malignos em estado
terminal. A terapia adotada foi baseada na administração por inalação direta de álcool
perílico 0,3%, quatro vezes ao dia. Resultados mostraram que tal terapia foi bem
tolerada e que alguns pacientes revelaram regressão do tumor (da Fonseca et al.,
2008; da Fonseca et al., 2006a; da Fonseca et al., 2006b).
Outro estudo piloto, conduzido também pela mesma equipe anteriormente
citada, investigou a administração de álcool perílico em oito pacientes com câncer
pancreático (uma das formas mais letais da doença). Foi observada a redução do
tamanho do tumor em função do mecanismo de apoptose celular. Embora não tenha
sido demonstrada significância estatística, os pacientes apresentaram uma sobrevida
maior de 84 dias quando comparado ao grupo controle (Matos et al., 2008).
Apesar dos estudos anteriormente mencionados e da potencialidade
apresentada dos terpenos/terpenóides na quimioprevenção de diferentes tumores, na
literatura ainda são escassos os relatos acerca da atividade biológica de outros
derivados de biotransformação desses compostos, como por exemplo, alguns
derivados do limoneno (limoneno-1,2-diol, α-terpineol e carveol).
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3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Prospectar micro-organismos capazes de utilizar compostos terpênicos, de
elevada disponibilidade comercial no Brasil (R-(+)-limoneno, α-pineno e farneseno) e
utilizá-los na produção de bioaromas por biotransformação.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Isolar micro-organismos do meio ambiente que apresentem potencial aplicação
na biotransformação de terpenos;
Identificar, dentre os isolados, linhagens potencialmente produtoras de
bioaromas por meio da seleção de micro-organismos capazes de utilizar substratos
terpênicos como única fonte de carbono e energia;
Efetuar a biotransformação de R-(+)-limoneno, α-pineno e farneseno utilizando
os micro-organismos selecionados;
Identificar e quantificar os produtos eventualmente acumulados pelos
micro-organismos, utilizando cromatografia com detecção de ionização em
chama.
4. METODOLOGIA
4.1. REAGENTES
R-(+)-limoneno (Aldrich, 97% pureza), limoneno-1,2-diol (Aldrich, 97% pureza),
S-(-)-álcool perílico (Aldrich, 95% pureza), (-)-carveol mistura de isômeros (Aldrich,
97% pureza), R-(-)-carvona (Aldrich, 98% pureza), farneseno, mistura de isômeros
(Aldrich), α-pineno (Aldrich, 98% pureza), α-terpineol (Aldrich, 90% pureza), fosfato de
sódio monobásico anidro (Neon, 98% pureza), fosfato de sódio bibásico anidro
(Cromato), peptona (Merck), glicose (Kasvi), extrato de malte (Himedia), extrato de
levedura (Kasvi), ágar bacteriológico (Kasvi), cloreto de amônio (Vetec, 98% pureza),
fosfato de potássio bibásico (Synth, 98% pureza), sulfato de magnésio (Vetec, 98%
pureza).
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4.2. ISOLAMENTO DOS MICRO-ORGANISMOS
Os micro-organismos foram isolados de amostras comercialmente adquiridas de
ervas, frutas e vegetais (alecrim, açafrão-da-terra, aniz, canela, cenoura, cominho,
cravo, eucalipto, hortelã, lavanda, limão, maçã, mamão, menta, orégano, tomilho)
consideradas fontes naturais de terpeno.
Cada amostra foi incubada em meio de cultura líquido YM (5 g L-1 peptona; 10 g
L-1 glicose; 3 g L-1 extrato de malte; 3 g L-1 extrato de levedura). Uma alíquota de 1%
(v/v) de R-(+)-limoneno foi adicionada ao meio de cultura como forma de pré-
selecionar as linhagens mais resistentes, dado que muitos terpenos apresentam
atividade antimicrobiana e que tal fato representa um dos principais desafios para a
produção de bioaromas a partir de tais compostos.
Após 24 h de crescimento a 30°C/150 rpm, uma alçada do meio líquido foi
transferida para placas de Petri com meio YM sólido (20 g L-1 de ágar) utilizando-se o
método de esgotamento. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 30°C
até o crescimento de colônias sobre o meio de cultura da placa.
Além disso, de forma a assegurar a viabilidade das culturas, a cada sete dias, as
mesmas foram repicadas em placas de Petri contendo YM sólido.
Adicionalmente, uma cópia de cada uma dessas mesmas culturas foram
estocadas em tubos de ensaio contendo YM sólido acrescido de glicerol e
armazenadas em refrigeração a 4°C.
4.3. SELEÇÃO DOS MICRO-ORGANISMOS POTENCIALMENTE
BIOTRANSFORMADORES DE TERPENOS
Os micro-organismos inicialmente isolados conforme descrito no item 4.2 foram
submetidos a um método de seleção com o intuito de obter potenciais
biotransformadores de compostos terpênicos.
Conforme a técnica de enriquecimento descrita por Cadwallader et al. (2006) e
Chang & Oriel (2006), este procedimento se baseia na inoculação de um material em
um meio mineral DP (1,0 g L-1 NH4Cl; 0,5 g L-1 K2HPO4, 20 mg L-1 MgSO4.7H2O)
contendo o substrato terpênico (0,5% v/v) como única fonte de carbono e energia.
Após sucessivas renovações do meio, uma alçada da cultura foi esgotada em
meio mineral sólido (meio DP adicionado de 17 g L-1 ágar) em placas de Petri. Estas
foram então invertidas, e na tampa de cada uma delas foi adicionado 0,1mL do
substrato puro de um dos substratos terpênicos testados – α-pineno, álcool perílico,
carveol, carvona, farneseno ou limoneno.
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Com a incubação em estufa bacteriológica, os micro-organismos podem ser
capazes de utilizar o substrato como única fonte de carbono e energia conforme ele se
volatiliza. Esta técnica permite o isolamento direto de potenciais utilizadores dos
terpenos como fonte de carbono e energia e, portanto, teriam boas chances de
biotransformar estes compostos.
Posteriormente, aqueles micro-organismos que demonstraram capacidade de se
desenvolverem na placa invertida foram inoculados em meio mineral DP líquido
adicionado novamente de 1% (v/v) de terpeno (α-pineno, farneseno ou limoneno),
incubados em incubadora refrigerada com agitação a 30°C/150 rpm, durante 96 h. A
cada 24 h, alíquotas foram retiradas para serem analisadas por cromatografia gasosa
com detecção por ionização em chama. Os micro-organismos de maior potencialidade
na produção de produtos de interesse foram utilizados no processo de
biotransformação, como descrito a seguir.
4.4. PROCESSO DE BIOTRANSFORMAÇÃO
Os micro-organismos selecionados (item 4.3) foram testados na
biotransformação de terpenos.
As bactérias ou leveduras selecionadas foram inoculadas em meio YM líquido (5
g L-1 peptona; 10 g L-1 glicose; 3 g L-1 extrato de malte; 3 g L-1 extrato de levedura) e
após 24 h de crescimento em incubadora refrigerada com agitação (30°C/150rpm), 25
mL da suspensão foi transferida para um novo frasco cônico contendo 250 mL de meio
mineral DP (1,0 g L-1 NH4Cl; 0,5 g L-1 K2HPO4, 20 mg L-1 MgSO4.7H2O) e 1% (v/v) de
fonte terpênica (limoneno, α-pineno ou farneseno) foi adicionado (Bicas & Pastore,
2007).
Este frasco foi mantido em incubadora refrigerada com agitação a 30°C/150rpm
e após 72h de crescimento (fase exponencial), o material foi centrifugado em
condições assépticas (2500 g, 12 min, 4 °C) e a massa celular ressuspendida em
tampão fosfato 20 mmol L-1, pH = 7,0. Um volume igual a 50 mL desta suspensão
celular foi posteriormente transferido para um frasco cônico e 1% (v/v) de substrato
terpênico (limoneno, α-pineno ou farneseno) foi adicionado, dando início ao processo
de biotransformação.
No caso dos fungos filamentosos, para a produção de inóculo, cada micro-
organismo foi inoculado em placa de Petri com meio YM sólido e incubados a 30°C.
Após 72 h, em cada uma das placas, adicionou-se 15 mL de solução salina 0,85%. Em
seguida, procedeu-se a raspagem manual com alça de Drigalski para desalojar os
esporos da superfície da placa. Empregando uma dupla camada de gaze, a
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suspensão de esporos foi filtrada. Posteriormente, um frasco cônico com 50 mL de YM
líquido foi inoculado com 5 mL da solução de esporos filtrada e incubados em mesa
refrigerada com agitação a 30°C/150rpm. Após 72 h, a biomassa resultante foi
recuperada por filtração a vácuo e, na sequência, ressuspendida em 50mL de tampão
fosfato 20 mmol L-1 em pH = 7,0, adicionado de 0,5% (v/v) de substrato terpênico
(limoneno, α-pineno ou farneseno) para iniciar a biotransformação.
Tanto no caso das bactérias como dos fungos, amostras foram coletadas
periodicamente (0h, 24 h, 48h, 72 h e 96 h) para análise dos possíveis produtos
formados, os quais foram monitorados e quantificados por Cromatografia Gasosa com
Detector de Ionização por Chama (CG-DIC).
Além disso, para ambos os casos, dois grupos controles também foram
adotados: (i) controle abiótico, contendo meio mineral DP adicionado de biomassa
auto-clavada e o padrão terpênico, para rejeitar a hipótese de auto-oxidação e, assim,
confirmar que os produtos formados são mesmo resultados da ação microbiana; (ii)
controle sem substrato, contendo a suspensão celular em meio mineral DP, para
avaliar se o micro-organismo pode produzir algum composto terpênico por síntese de
novo.
4.5 EXTRAÇÃO E ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS DOS PRODUTOS
FORMADOS
As amostras das culturas retiradas para análise foram extraídas com acetato de
etila (1:1) contendo 1% de octano (padrão interno). Um microlitro de extrato foi injetado
no Cromatógrafo a Gás com Detector por Ionização em Chama Agilent HP6890
equipado com uma coluna HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). As condições de
operação foram: He como gás de arraste com vazão 1 mL min-1; temperatura no injetor
de 250°C, temperatura no detector de 250°C e a temperatura da coluna programada
para elevação de 80 a 200°C, a uma taxa de 20°C/min, com um tempo inicial de
espera de 3 min e 5 min na temperatura final e razão de split 1:10 (Bicas et al., 2008).
Os produtos formados foram quantificados com auxílio de uma curva analítica,
construída com diferentes concentrações do padrão comercial (50,100, 200, 300, 500,
1000, 2000 e 3000 mg L-1) em acetato de etila.
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.
Os principais resultados obtidos neste trabalho estão resumidos na Figura 10 e
serão detalhados na sequência
Figura 10 – Resumo dos resultados obtidos nesse trabalho.
5.1. ISOLAMENTO DOS MICRO-ORGANISMOS
De acordo com Belin et al., (1992) a seleção de micro-organismos que sejam
capazes de produzir concentrações aceitáveis de compostos voláteis é uma estratégia
essencial para a produção biotecnológica de aromas. Para tal, diferentes estratégias
de prospecção podem ser adotadas, entre as quais, isolamento de micro-organismos
do meio ambiente, a partir de banco de culturas ou de fermentações clássicas
(queijos, iogurtes, cervejas, vinho).
Partindo desse princípio, a prospecção de micro-organismos potencialmente
biotransformadoras de compostos terpênicos resultou no isolamento de 45 micro-
organismos (Tabela 4). Cada um dos isolados foi morfologicamente identificado pela
técnica de Gram, exceto os fungos filamentosos, tendo sido obtido a seguinte
predominância: vinte e oito eram cocos Gram-negativos (62,23%), quatro bastonetes
Gram-positivo (8,89%), seis bastonetes Gram-negativos (13,33%), duas leveduras
(4,44%) e cinco fungos filamentosos (11,11%).
Alecrim, açafrão, aniz, canela,
cominho, cravo, eucalipto, hortelã,
lavanda, limão, maçã, mamão,
menta, orégano, tomilho
Amostras
45 isolados:
62,3% cocos G- 8,9% bastonetes G+ 13,3% bastonetes G-
4,4% leveduras 11,1% bolores
Isolados
Isolamento Seleção
18
micro-organismos selecionados
Uso de terpenos
c/ única fonte C
Biotransformação
1 fungo filamentoso
biotransformador: acúmulo de
limoneno-1,2-diol (262,37 mg L
-1)
após 72h de biotransformação
de limoneno
Acúmulo de
produtos
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Tabela 4 – Fontes de obtenção e respectiva identificação dos micro-organismos
isolados por técnica de Gram
Identificação do
micro-organismo Fontes de isolamento Gram
1 Limão Cocos Gram (-)
2 Cominho Bastonete Gram (+)
3 Tomilho Cocos Gram (-)
4 Cominho Cocos Gram (-)
5 Canela Cocos Gram (-)
6 Alecrim Cocos Gram (-)
7 Cominho Cocos Gram (-)
8 Cominho Bastonete Gram (-)
9 Orégano Cocos Gram (-)
10 Eucalipto Bastonete Gram (-)
11 Eucalipto Cocos Gram (-)
12 Orégano Cocos Gram (-)
13 Açafrão-da-terra Bastonete Gram (+)
14 Aniz Levedura
15 Cravo Cocos Gram (-)
16 Orégano Cocos Gram (-)
17 Maçã Cocos Gram (-)
18 Cominho Cocos Gram (-)
19 Cominho Cocos Gram (-)
20 Aniz Levedura
21 Aniz Cocos Gram (-)
22 Aniz Cocos Gram (-)
23 Aniz Cocos Gram (-)
24 Aniz Cocos Gram (-)
25 Limão Cocos Gram (-)
26 Limão Cocos Gram (-)
27 Mamão Cocos Gram (-)
28 Mamão Bastonete Gram (-)
29 Hortelã Bastonete Gram (-)
30 Tomilho Bastonete Gram (-)
31 Cenoura Cocos Gram (-)
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Tabela 4 – Continuação
Identificação do
micro-organismo Fontes de isolamento Gram
32 Açafrão-da-terra Cocos Gram (-)
33 Lavanda Cocos Gram (-)
34 Lavanda Cocos Gram (-)
35 Menta Bastonete Gram (-)
36 Menta Cocos Gram (-)
37 Eucalipto Bastonete Gram (+)
38 Eucalipto Cocos Gram (-)
39 Cominho Cocos Gram (-)
40 Cravo Cocos Gram (-)
41 Aniz Fungo filamentoso
42 Orégano Fungo filamentoso
43 Aniz Fungo filamentoso
44 Maçã Fungo filamentoso
45 Mamão Fungo filamentoso
Após a retirada das amostras incubadas por 24 h em presença de 1% v/v de
limoneno (pré-seleção) e posterior plaqueamento em placa de Petri com YM sólido
observaram-se claramente três fatos importantes:
(i) ao contrário do que ocorre comumente durante os trabalhos de
bioprospecção, o plaqueamento das amostras incubadas não resultaram em uma
placa de Petri rica em diferentes culturas de micro-organismos, que por vezes,
demandam diversas passagens para o isolamento dessas mesmas culturas;
(ii) o plaqueamento resultou na obtenção de no máximo uma ou duas colônias
visualmente distinguíveis por placa;
(iii) em função do que foi observado a partir do perfil de plaqueamento, é
possível compreender o quão acentuado é a atividade antimicrobiana dos compostos
terpênicos e sua atuação eficiente na seleção de micro-organismos (Bound et al.,
2015; Asbahani et al., 2015; López-Malo et al., 1997).
Assim, de acordo com Calo et al. (2015), a atividade antimicrobiana dos
compostos terpênicos está associada à característica hidrofóbica dessas moléculas.
Dessa forma, interagem com os lipídios da membrana celular do micro-organismo,
Página 58 de 105
alterando a permeabilidade da mesma e consequentemente levando à morte celular.
Entre os principais efeitos da alteração na fluidez de membrana está a modificação na
força próton-motriz, causando assim uma deficiência na produção de energia na célula
com o decréscimo da geração de ATP (adenosina trifosfato).
Na literatura científica são relatados inúmeros estudos que comprovam a
efetividade da ação antimicrobiana de diferentes compostos terpênicos. Entre os
trabalhos mais relevantes, estão aqueles focados na utilização de óleos essenciais no
controle de micro-organismos patogênicos causadores de doenças alimentares, entre
os quais, Escherichia coli O157:H7 (Tomadoni et al., 2015; Landry et al., 2015;
Severino et al., 2015), Campylobacter jejuni (Kurekci et al., 2013; Nair et al., 2015;
Nannapaneni et al., 2009), Listeria monocytogenes (Pesavento et al., 2015; Silva et al.,
2015; Silva-Angulo et al., 2015), Staphylococcus aureus (Haba et al., 2014; Wu et al.,
2014; de Carvalho et al., 2015) e Salmonella Typhimurium (Yun et al., 2015; Chauhan
& Kang, 2014; Bukvicki et al., 2015).
Considerado esses aspectos, fica claro o quão desafiador é o trabalho de
prospecção na busca por novos micro-organismos que sejam capazes de resistir à
toxidez provocada pelo significativo potencial antimicrobiano demonstrado por
diferentes compostos terpênicos.
5.2 SELEÇÃO DOS MICRO-ORGANISMOS POTENCIALMENTE
BIOTRANSFORMADORES DE TERPENOS
Dentre os 45 micro-organismos isolados, apenas 40 foram testados quanto a
capacidade de crescer em placa de Petri com meio mineral DP sólido, adicionado de
uma alíquota de terpeno na tampa. Assim, dos 40 micro-organismos testados, apenas
18 foram capazes de apresentar crescimento em placa (Tabela 5). Embora tenham se
desenvolvido de forma discreta, tais micro-organismos demonstraram uma capacidade
bastante positiva de utilizarem o terpeno volatilizado no interior da placa como única
fonte de carbono e energia.
Os micro-organismos que demonstraram capacidade de se desenvolver na
presença de limoneno, podem seguir uma das seis vias relatadas na literatura (Bicas,
2009) (Figura 11).
O fato de determinado micro-organismo apresentar uma via metabólica
específica sugere que ele possa acumular alguns de seus intermediários. Portanto,
micro-organismos que apresentem a via que passa pelo álcool perílico, por exemplo,
pode indicar que estes o acumulem sob certas circunstâncias. Entre as vias possíveis,
a rota que permite a produção de álcool perílico e carvona são de maior interesse em
Página 59 de 105
função do potencial comercial e científico desses compostos (Afshordel et al., 2015;
Bhat et al., 2015; Tabassum et al., 2015; Imamura et al., 2014; Muruganathan et al.,
2013; Souza et al., 2013).
Tabela 5 – Intensidade de crescimento* dos micro-organismos em placa de
Petri contendo meio mineral DP e terpeno adicionado na tampa
da placa como única fonte de carbono e energia
Identificação
do micro-
organismo
α-
pineno Farneseno Limoneno
Álcool
perílico Carveol Carvona
1 2 1 4 2 1 1
2 1 0 1 0 0 0
3 0 0 3 0 0 0
4 0 0 3 0 0 0
5 0 1 3 0 2 0
6 1 2 3 1 0 2
7 1 1 3 1 0 0
8 0 1 0 1 0 0
9 1 0 2 0 0 0
10 2 0 3 2 0 0
11 0 1 3 0 3 0
12 0 0 0 0 0 0
13 0 2 2 1 0 0
14 1 3 4 2 1 1
15 1 2 0 0 0 0
16 0 0 2 0 0 0
17 0 0 1 0 0 0
18 1 2 4 1 1 1
19 0 0 0 0 0 0
20 2 1 3 2 0 0
*Na tabela é expressa a intensidade de desenvolvimento da cultura em placa,
determinada visualmente: (1) muito baixo; (2) baixo; (3) médio; (4) alto.
Página 60 de 105
Assim, a capacidade simultânea demonstrada pelos micro-organismos 1, 6, 7,
10, 13, 14, 18 e 20 de crescerem tanto em limoneno quanto em álcool perílico,
revelam que, possivelmente, esses micro-organismos optaram pela via que envolve a
produção deste álcool. Já a via da carvona poderia ser utilizada por micro-organismos
que são capazes de crescerem tanto em limoneno quanto em um de seus
intermediários da via, como o carveol ou a própria carvona. Dessa forma, os micro-
organismos 1, 5, 6, 11, 14 e 18 cresceram tanto em limoneno quanto em carveol ou
carvona, e, possivelmente, apresentam a rota metabólica que passa por esses
monoterpenoides.
Por outro lado, observou-se que os micro-organismos 1, 2, 6, 7, 9, 10, 14, 18 e
20 foram capazes de se desenvolver simultaneamente na presença de limoneno e α-
pineno. Sugere-se assim, que tais micro-organismos poderiam tanto biotransformar o
limoneno quanto seguir para uma das vias de utilização do α-pineno (Figuras 12 e 13)
(Pastore et al., 2013).
Já os micro-organismos 1, 5, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 15, 18 e 20 cresceram em
farneseno.
Adicionalmente, os micro-organismos 1, 14 e 18 demonstraram maior
versatilidade, sendo capazes de se desenvolverem na presença de todos os terpenos
testados. Portanto, considerando os resultados alcançados, os 18 micro-organismos
que demonstraram capacidade de crescer em placa de Petri contendo meio DP sólido
adicionado de substrato terpênico na tampa tiveram seus produtos de transformação
analisados por cromatografia gasosa, cujos resultados serão posteriormente discutidos
no item 5.3.
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Limoneno
Álcool
perílico
Aldeído
perílico
Ácido
perílico Perílico-CoA
Limoneno
-1,2-óxido
Limoneno
-1,2-diol
1-hidróxi-2-
oxólimonen
o
3-isoprepenil-6-
oxoheptanoato
3-isoprepenil-6-
oxoheptanil-
CoA
Carveol Carvona Dihidro-
carvona
α-terpineol
Isopi-
peritenol
Isopi-
peritenon
a
Limoneno
-8,9-óxido
Figura 11 – Vias de metabolizações relatadas na literatura para o limoneno.
(Adaptado de Bicas, 2008).
Página 62 de 105
Figura 12 – Vias de metabolização do pineno por alguns fungos filamentosos
relatadas na literatura. Pastore et al. (2013).
Figura 13 – Vias de metabolização do pineno por algumas bactérias relatadas na
literatura. Pastore et al. (2013).
Página 63 de 105
Em resumo, é importante ressaltar que tal experimento foi empregado para
refinar a seleção inicial de micro-organismos que eram capazes não apenas de resistir
à adição de terpeno ao meio de cultivo, mas de também utilizarem esse substrato
como fonte de carbono e energia para o desenvolvimento da cultura. Dessa forma,
esse método foi sugerido para contribuir na inferência de reais potenciais
biotransformadores, direcionando de forma mais direta aqueles micro-organismos de
interesse para o processo de biotransformação e análise dos produtos provenientes da
degradação de determinado terpeno em compostos voláteis de potencial interesse.
Na literatura científica, semelhantemente ao desenvolvido nesse trabalho,
existem alguns estudos que descrevem o isolamento e a seleção de micro-organismos
potencialmente biotransformadores de compostos terpênicos. E, da mesma forma
como imposto nesse trabalho, também foi enfrentado o desafio no processo de
prospecção ao considerar a atividade antimicrobiana dos compostos terpênicos.
Rottava et al. (2009) isolaram 405 micro-organismos a partir de amostras obtidas
da indústria de beneficiamento de eucalipto e laranja, dentre os quais, apenas 23
isolados se mostraram capazes de resistir/bioconverter o R-(+)-limoneno e o β-pineno
em α-terpineol. Já Bicas e Pastore (2007) isolaram do efluente da indústria de citrus
248 micro-organismos, dos quais, somente 70 se desenvolveram em meio contendo
limoneno como única fonte de carbono. Por fim, Bier et al. (2011) também relataram
que dos 21 micro-organismos prospectados, apenas dois se mostraram capazes de se
desenvolverem e biotransformarem determinado substrato terpênico. Tais estudos
anteriormente citados revelam que o sucesso no esforço de prospecção foi de
aproximadamente 6%, 28% e 9%, respectivamente.
5.3 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS DOS PRODUTOS FORMADOS A
PARTIR DAS CULTURAS PREVIAMENTE SELECIONADAS
A análise por cromatografia gasosa dos cultivos em meio líquido mineral
adicionado de limoneno, farneseno ou α-pineno como única fonte de carbono e
energia dos 18 micro-organismos selecionados (aqueles que cresceram em pelo
menos uma dos terpenos testados) mostrou que:
(i) limoneno: os micro-organismos 1, 5, 6, 10, 16, 18 e 20 foram capazes
de acumular traços de carvona e/ou carveol, porém em concentrações aparentemente
pouco acima daquela observada no controle abiótico. Por outro lado, outros micro-
organismos apresentaram traços de picos que, em função da baixa concentração para
identificação ou ausência de padrões, não permitiu a identificação dos mesmos.
(ii) α-pineno: não apresentou acúmulo aparente de intermediários;
Página 64 de 105
(iii) farneseno: em algumas amostras e também no controle, foi possível
identificar alguns produtos de menor massa molar, possivelmente oriundos de quebra
da molécula, e outros compostos em concentrações traço cujas identidades não
puderam ser estabelecidas.
Apesar da baixa concentração de produto inicialmente identificado nas linhagens
selecionadas, de acordo com trabalhos prévios desenvolvidos por Bicas et al. (2010),
o fato de não haver acúmulo de intermediários durante o crescimento em meio
contendo o substrato terpênico como única fonte de carbono e energia não exclui a
possibilidade de potencial produção durante a etapa de biotransformação a partir de
resting cells. Isso porque, nesse mesmo trabalho, Bicas et al. (2010) observaram que
traços de α-terpineol foram identificados durante o crescimento de Sphingobium sp.
em limoneno como única fonte de carbono e energia. Porém, quando essa biomassa
foi ressuspendida em tampão fosfato (resting cells), e colocada para biotransformar o
limoneno, uma grande quantidade de α-terpineol foi produzida (até 130 g L-1, com
rendimentos próximos a 100%). Assim, considerou-se que haveria potencial de
produção de bioaromas pela biotransformação do limoneno ou farneseno por resting
cells de alguns dos micro-organismos selecionados nesse trabalho.
Portanto, a partir dos resultados das análises cromatográficas, os micro-
organismos 1, 10, 11, 14 e 18 foram escolhidos para serem estudados no processo de
biotransformação empregando resting cells. Essa escolha foi baseada em função da
detecção de alguns picos nos cromatogramas dos extratos dos respectivos micro-
organismos, quando cultivados em meio mineral líquido contendo terpeno como única
fonte de carbono.
Além disso, considerou-se também a versatilidade dos mesmos frente à
capacidade de crescimento em placa de Petri contendo meio mineral sólido e terpeno
como única fonte de carbono adicionado a tampa.
5.4 PROCESSO DE BIOTRANSFORMAÇÃO COM RESTING CELLS
5.4.1 BACTÉRIAS E LEVEDURAS
O processo de biotransformação com resting cell para os micro-organismos 1,
10, 11, 14 e 18 não apontou acúmulo de nenhum metabólito de interesse em limites
detectáveis pela análise por cromatografia gasosa, levando-nos a concluir que apesar
desses micro-organismos terem se mostrado inicialmente promissores nos testes de
seleção previamente conduzidos, os mesmos não se revelaram capazes de acumular
nenhum intermediário da via de metabolização do limoneno (Figuras 14 e 15),
farneseno ou α-pineno.
Página 65 de 105
Tal fato nos leva a acreditar que tais micro-organismos provavelmente
mostraram-se apenas resistentes a adição de terpeno ao meio ou foram capazes de
mineralizar o substrato (transformando-os em CO2), sem, contudo, convertê-los em
produtos da via metabólica dos terpenos utilizados.
Apesar dos resultados terem sido negativos para as bactérias selecionadas
nesse trabalho, na literatura são encontrados diferentes estudos baseados no
potencial de diferentes bactérias na produção de compostos de aroma (Tabela 6).
Assim, é importante perceber que tais trabalhos evidenciam claramente a versatilidade
e a potencialidade de diferentes micro-organismos na conversão de diferentes
substratos para a produção de aromas naturais.
Figura 14 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do limoneno (sem
acúmulo) pelo micro-organismo 1 após 0h (azul), 24h (vermelho), 48h (verde), 72h
(rosa) de biotransformação.
Figura 15 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do limoneno (sem
acúmulo) pelo micro-organismo 10 após 0h (azul), 24h (vermelho), 48h (verde), 72h
(rosa) de biotransformação.
Padrão interno
Limoneno
Padrão interno
Limoneno
Página 66 de 105
Tabela 6 – Estudos relatados na literatura para a produção de bioaromas por
diferentes linhagens de bactérias.
Micro-organismo Aroma Substrato Rendimento/
produtividade Referência
Bacillus subtilis IFO
3013
Pirazina Soja triturada 2 g L-1 (Larroche et
al., 1999)
Clostridium
tyrobutyricum
Ácido
butírico
Bagaço de
cana
hidrolisado
20,9 g L-1
(Wei et al.,
2013)
Corynebacterium
glutamicum
(+)-
valenceno
Nootka
cypress
2,41 mg L-1
(Frohwitter et
al., 2014).
Nocardia iowensis
DSM 45197 Vanilina Isoeugenol -
(Seshadri et
al., 2008)
Propionibacterium
acidipropionici
Ácido
propiônico
Glicerol com
CO2 2,94 g L-1 dia-1
(Zhang et al.,
2014)
Pseudomonas
resinovarans SPR1 Vanilina Eugenol 0,24 g L-1
(Ashengroph
et al., 2011)
Pseudomonas sp
p-cimeno*
Limoneno
α-
terpinoleno
α-pineno / β-
pineno
198 mg L-1
64 mg L-1
98 mg L-1
(Yoo et al.,
2001)
*Produtos majoritários para ambos os substratos
5.4.2 FUNGOS FILAMENTOSOS
O processo de biotransformação utilizando os fungos filamentosos isolados (41,
42, 43, 44 e 45) foi conduzido para cada um dos três terpenos de interesse - α-pineno,
farneseno e limoneno.
Assim como ocorreu para as bactérias selecionadas, as análises
cromatográficas das biotransformações com fungos não apontou acúmulo de
intermediários na biotransformação do α-pineno e farneseno para nenhum dos cinco
fungos testados (Figuras 16 e 17). Alguns produtos de menor massa molar,
possivelmente produtos de quebra da molécula, também foram visualizados em alguns
Página 67 de 105
casos, embora estes não tenham sido identificados. Já para o limoneno, dentre os
cinco fungos testados, quatro deles não apresentaram acúmulo de intermediários.
Figura 16 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do farneseno (sem
acúmulo) pelo micro-organismo 45 após 0h (azul), 24h (vermelho), 48h (verde), 72h
(rosa) e 96h (bege) de biotransformação.
Figura 17 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do α-pineno (sem
acúmulo) pelo micro-organismo 41 após 0h (azul), 24h (vermelho), 48h (verde), 72h
(rosa) e 96h (bege) de biotransformação.
Contudo, o micro-organismo identificado pelo número 42 apresentou acúmulo de
um produto com tempo de retenção igual a 6,39 min (após injeção em colunas com
diferentes polaridades (Betadex e DB5), cuja área aumentou com o tempo de
biotransformação. Baseado na análise dos tempos de retenção de padrões comerciais
nestas diferentes colunas, este pico foi identificado como limoneno-1,2-diol (Figura
18). Análises com controles abióticos deixaram claro que esta produção não se refere
à auto-oxidação do limoneno (Figura 19).
Solvente
Padrão interno Farneseno
Solvente
Padrão interno α-pineno
Padrão interno
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Figura 18 – Cromatogramas do padrão comercial de limoneno-1,2-diol (linha
vermelha) e do extrato da biotransformação do microrganismo 42 tendo limoneno
como substrato (linha azul) após 96 h de fermentação.
Figura 19 – Cromatogramas sobrepostos para a biotransformação do limoneno pelo
micro-organismo 42 após 0h (azul), 24h (vermelho), 48h (verde), 72h (rosa) e 96h
(bege) de biotransformação.
Portanto, utilizando a curva analítica para a quantificação do limoneno-1,2-diol
(Figura 20), a cinética de produção deste composto indicou as concentrações de
limoneno-1,2-diol de 0, 168,42; 220,89; 262,37; 208,29 mg L-1 após 0, 24, 48, 72 e 96
h de biotransformação, respectivamente (Figura 21).
Assim, o pico de produção (72h de biotransformação) foi cerca de 10 vezes
menor que a concentração obtida por Molina et al. (2015) em um processo de
biotransformação de S-(–)-limoneno por Fusarium oxysporum 152b recentemente
relatado. Contudo, considerando que a eficiência de extração de limoneno-1,2-diol
com acetato de etila foi de 42,2% (Molina et al., 2015), podemos estimar que a
concentração real produzida no nosso estudo foi de aproximadamente 523,44 mg L-1.
Solvente
Padrão interno Limoneno
Acúmulo de produto a tr = 6,39 min
Página 69 de 105
Figura 20 – Curva analítica do limoneno-1,2-diol obtida a partir de cromatografia
gasosa com detecção por ionização em chama.
Figura 21 – Cinética de produção de limoneno-1,2-diol para o período de 0 a 96
h, a partir da biotransformação de R-(+)-limoneno por fungo filamentoso isolado do
orégano (microrganismo 42).
y = 1,3092x - 90,493 R² = 0,9989
0
1000
2000
3000
4000
0 1000 2000 3000 4000
Áre
a d
o p
ico
de lim
on
en
o-1
,2-d
iol
(u.a
)
[limoneno-1,2-diol] (mg L-1)
0
100
200
300
0 24 48 72 96
[lim
on
en
o-1
,2-d
iol]
(m
g L
-1)
Tempo (h)
Página 70 de 105
Ainda, considerando que o micro-organismo prospectado não teve suas
condições otimizadas de produção investigadas, quando comparado à estudos
relatados na literatura (Molina et al., 2015; Demyttenaere et al., 2001; Noma et al.,
1992; Abraham et al., 1985), o resultado obtido nesse trabalho foi tido como realmente
satisfatório.
Assim sendo, estudos futuros baseados na metodologia de superfície de
resposta para determinação das condições otimizadas de produção podem ser
bastante promissores para tornar a produção biotecnológica de limoneno-1,2-diol
atrativa. Tal perspectiva pode ser corroborada frente aos estudos conduzidos por
Bicas et al. (2008) em que a metodologia de superfície de resposta foi empregada
para otimizar a biotransformação por Fusarium oxysporum 152b de R-(+)-limoneno em
R-(+)-α-terpineol, tendo sido alcançado um rendimento de conversão 542% superior a
concentração de produto inicialmente obtida antes da otimização (de 450 mg L-1 para
2.440 mg L-1).
Adicionalmente, embora não tenha sido possível efetuar análises que
comprovassem a identidade do(s) diasteroisômero(s) de limoneno-1,2-diol presentes
no meio, espera-se que haja uma diferença entre o produtos obtidos neste estudo e
aqueles relatados por Molina et al. (2015), dado que estes autores empregaram outro
enantiômero do limoneno em seu processo. Portanto, acredita-se que estes métodos
possam gerar produtos com perfil de isômeros diferenciados, o que pode contribuir
com estudos da análise do potencial biológico do limoneno-1,2-diol. Outro aspecto
bastante interessante do resultado obtido nesse trabalho centra-se no fato de que o
limoneno-1,2-diol, apesar de encontrar aplicabilidade industrial, é um derivado do
limoneno relativamente inexplorado pela comunidade científica. Portanto, percebe-se
que tal metabólito do limoneno apresenta grande potencial de investigação,
principalmente no que diz respeito a sua obtenção por via biotecnológica e posteriores
estudos in vitro e in vivo para testar sua aplicabilidade.
No entanto, apesar da escassez de estudos científicos focados especificamente
no limoneno-1,2-diol, na literatura é possível encontrar alguns relatos que mencionam
a produção de limoneno-1,2-diol entre um dos metabólitos do limoneno promovido por
diferentes micro-organismos (Molina et al., 2015; Demyttenaere et al., 2001; Noma et
al., 1992; Abraham et al., 1985).
Considerado esse aspecto, Molina et al. (2015) compararam os produtos da
biotransformação por Fusarium oxsporum 152b a partir de dois substratos
enantioméricos do limoneno: R-(+)- limoneno e S-(-)-limoneno. Resultados mostraram
que o R-(+)-limoneno foi convertido em α-terpineol (4 g L-1 em 48 h) e o S-(-)-limoneno
foi biotransformado em limoneno-1,2-diol (3,7 g L-1 em 72 h).
Página 71 de 105
Por outro lado, Abraham et al. (1985), utilizando Corynespora cassiicola
obtiveram 900 g de 1S,2S,4R-limoneno-1,2-diol em 96 h a partir de 1.300 g de R-(+)-
limoneno em reator contendo 70 L de meio, alcançando-se assim uma conversão de
aproximadamente 60%. Posteriormente, estudos conduzidos por Demyttenaere et al.
(2001) corroborou os estudos de Abraham et al. (1985), em que, tendo também
utilizado Corynespora cassiicola e R-(+)-limoneno como substrato, alcançou também
aproximadamente 60% de conversão para 1S,2S,4R-limoneno-1,2-diol.
Adicionalmente, Noma et al. (1992), utilizando Aspergillus cellulosae M-77 mostraram
que tal micro-organismo foi capaz de converter preferencialmente tantos os
enantiômeros quanto a mistura racêmica de limoneno em limoneno-trans-1,2-diol.
Sendo assim, considerando todo o cenário anteriormente descrito, sugere-se
que a prospecção do fungo capaz de converter limoneno a limoneno-1,2-diol obtido
nesse trabalho deve ser investigada com maior detalhe em estudos posteriores, com o
intuito de entender sua rota metabólica, determinar as melhores condições de cultivo,
bem como reforçar a necessidade de estudos de prospecção focados em micro-
organismos capazes de converter substratos terpênicos em compostos de aroma,
contribuindo assim para tornar a biotransformação microbiana de aromas uma rota
robusta, promissora, atraente e factível.
Além disso, a despeito da produção de limoneno-1,2-diol, existem inúmeros
estudos acerca da produção biotecnológica de aromas empregando diferentes fungos
filamentosos e leveduras, seja em fermentação submersa ou em estado sólido,
resultando em diferentes rendimentos de produtos.
Em se tratando especialmente da fermentação submersa, método empregado
nesse trabalho, vários relatos científicos são citados para a obtenção de diferentes
aromas (Tabela 7).
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Tabela 7 – Estudos relatados na literatura para a biotransformação de substratos
terpênicos por diferentes linhagens de fungos (filamentosos ou leveduriformes)
Micro-organismo Composto
de impacto
Substrato
de
conversão
Rendimento/
produtividade Referência
29 cepas diferentes de
basidiomicetos
lignocelulolíticos foram
testados
113
compostos
voláteis
diferentes
identificados
(álcoois,
cetonas e
aldeídos)
Meio
sintético -
(Gallois et al.,
1990)
Aspergillus niger*
Linalol**
linalol, α-
terpineol e
limoneno***
geraniol
nerol
citral
- (Demyttenaere
et al., 2000)
Botryodiplodia
treobromae 1368
Yarrowia lipolytica
2.2ab
Phanerochaete
chrysosporiumoxidised
Nootkatona (+)-
valenceno
231,7 mg L-1
216,9 mg L-1
100,8 mg L-1
(Palmerín-
Carreño et al.,
2015)
Candida utilis Acetaldeido Etanol 8,0 g L-1 (Corzo et al.,
1995)
Ceratocystis fimbriata Citronelol Geraniol 6,0 mg L-1 (Fkyerat et al.,
1996).
Ceratocystis fimbriata
Geraniol,
citronelol,
linalol, α-
terpineol,
geraniale e
neral
Batata
dextrose -
(Lanza &
Palmer, 1977).
Página 73 de 105
Tabela 7 – Continuação
Micro-
organismo
Composto de
impacto
Substrato
de
conversão
Rendimento/
produtividade Referência
Ceratocystis
moniliformis
Etil acetato
propil acetato isobutil
acetato isoamil acetato
citronelol geraniol
Meio
sintético -
(Bluemke &
Schrader,
2001)
Corynespora
cassicola
Correspondentes
óxidos de linalol (±)-linalol -
(Etschmann
et al., 2014)
Ceratocystis
moniliformis
Etil acetato
propil acetato isobutil
acetato isoamil acetato
citronelol geraniol
Meio
sintético -
(Bluemke &
Schrader,
2001)
Corynespora
cassicola
Correspondentes
óxidos de linalol (±)-linalol -
(Etschmann
et al., 2014)
Ceratocystis
moniliformis
Etil acetato
propil acetato isobutil
acetato isoamil acetato
citronelol geraniol
Meio
sintético -
(Bluemke &
Schrader,
2001)
Corynespora
cassicola
Correspondentes
óxidos de linalol (±)-linalol -
(Etschmann
et al., 2014)
Ceratocystis
moniliformis
Etil acetato
propil acetato isobutil
acetato isoamil acetato
citronelol geraniol
Meio
sintético -
(Bluemke &
Schrader,
2001)
Lentinula
edodes
Foram identificados 20
compostos voláteis
diferentes como
produto de
fermentação
Mosto de
cerveja -
(Zhang et al.,
2015)
Neurospora
sp 1-octen-3-ol
Caldo
extrato de
malte
17 mg L-1
(de Carvalho
et al., 2011)
Página 74 de 105
Tabela 7 – Continuação
Micro-
organismo
Composto de
impacto
Substrato de
conversão
Rendimento/
produtividade Referência
Neurospora sp
3-methil-1-
butanol
1-octen-3-ol
etil acetato
etanol
Caldo extrato
de malte -
(Pastore et al.,
1994)
Pcynoporus
cynnabarinus Vanilina Ácido ferrúlico 64,0 mg L-1
(Falconnier et
al., 1994)
Penicillium
camemberti 1-octen-3-ol
Leite
reconstituído
suplementado
com óleo de
soja
60 g L-1 (Husson et al.,
2005).
Penicillium
solitum Verbenona α-pineno 35 mg L-1
(Pescheck et
al., 2009)
Piptoporus
soloniensis
γ-decalactona
γ-
octanolactona
Meio sintético
suplementado
com diferentes
ácidos graxos
7,9 mg L-1
1,4 mg L-1
(Kenji et al.,
2002)
Pleutorus
sapidus
cis:trans
carvona/carveol R-(+)-limoneno 1000 mg L-1
(Onken &
Berger, 1999)
Pleutorus
sapidus
car-3-em-5-ono
car-3-em-2-ono
car-2-em-4-ono
Car-3-eno
25,3 mg L-1
5,4 mg L-1
7,3 mg L-1
(Lehnert et al.,
2012)
Rodothorula
aurantiaca γ-decalactona Óleo de castor 6,5 g L -1
(Alchihab et
al., 2009)
Saccharomyces
cerevisiae Nootkatona (+)-valenceno 6 mg L-1
(Gavira et al.,
2013)
Saccharomyces
cerevisiae Citronelol Geraniol 1,18 g L-1
(Arifin et al.,
2011)
Sporobolomyces
odorus γ-decalactona
Meio sintético
suplementado
(óleo de castor)
8,62 mg L-1 (Lee & Chou,
1994)
Página 75 de 105
Tabela 7 – Continuação
Micro-
organismo
Composto de
impacto
Substrato de
conversão
Rendimento/
produtividade Referência
Tyromyces
chioneus
3-Fenipropanal
3-fenil-1-
propanol álcool
benzílico
Bagaço de
maça em
fermentação
submersa
290 µg L-1
270 µg L-1
100 µg L-1
(Bosse et al.,
2013)
Yarrowia
lipolytica γ-Decalactona Óleo de castor 220 mg L-1
(Moradi et al.,
2013)
* Culturas esporuladas cultivadas em superfície
**Produto majoritariamente obtido a partir da biotransformação de geraniol
***Produtos obtidos a partir da biotransformação de nerol e citral.
Assim, ao observar a Tabela 7, fica bastante evidente o potencial de diferentes
fungos na produção biotecnológica de aromas. Tal potencialidade se baseia
principalmente no fato de que fungos, sendo organismos eucariotos, apresentam uma
“maquinaria” semelhante às plantas para a excreção de compostos voláteis, como por
exemplo, apresentam um complexo sistema enzimático de secretoma. Tal complexo
enzimático é fundamental para a excreção de enzimas extracelulares, as quais, por
sua vez, são amplamente descritas como responsáveis por biotransformar diferentes
compostos terpênicos em seus respectivos metabólitos (Alfaro et al., 2014).
Considerado esses aspectos, fica claro que o emprego de cepas fúngicas em
diferentes bioprocessos é uma área que apresenta enormes possibilidades de
exploração. Adicionalmente, conforme relatado por Abraham (1985), o uso de fungos
ao invés de bactérias pode ser mais vantajoso nos processos de biotransformação,
pois aquelas têm um metabolismo muito ativo e destroem o substrato muito mais
rapidamente, enquanto que os fungos têm maior propensão ao acúmulo de
intermediários.
Página 76 de 105
6. CONCLUSÃO
A estratégia de isolamento e a seleção de micro-organismos para a produção
biotecnológica de aromas revelou ser um caminho fundamental para fomentar a
disponibilização de aromas naturais para o setor industrial.
Contudo, alguns desafios devem ser superados, sendo o mais importante, o fato
de que compostos terpênicos são reconhecidamente antimicrobianos, exigindo um
grande número amostral durante o procedimento de isolamento e seleção. Assim,
nesse trabalho, foram isolados 45 micro-organismos de amostras comercialmente
adquiridas, entre as quais, especiarias e vegetais. Posteriormente aos testes de
seleção, estudos de biotransformação foram conduzidos para alguns dos micro-
organismos obtidos. Resultados positivos, aqui considerado como acúmulo de
intermediários oxigenados, foi encontrado para apenas um dos isolados, tendo sido
obtido um sucesso de 2% no esforço de prospecção.
A partir da prospecção, isolou-se um fungo filamentoso do orégano, capaz de
biotransformar o substrato R-(+)-limoneno em limoneno-1,2-diol. A concentração
máxima, de 262,37 mg L-1, foi obtida com 72h de biotransformação. Embora o
rendimento tenha sido relativamente baixo, se comparado aos já relatados na
literatura, acredita-se que estudos posteriores apoiados na metodologia de superfície
de resposta possam contribuir para aumentar o rendimento de produção do limoneno-
1,2-diol a partir do micro-organismo descrito nesse trabalho. Este modelo de produção
também poderá ser útil para disponibilizar diferentes diasteroisômeros do limoneno-
1,2-diol para trabalhos que avaliem o potencial biológico destes compostos.
Página 77 de 105
7. PERSPECTIVAS FUTURAS
Consideramos que o estudo aqui relatado apresenta relevante potencial para a
continuidade de elucidações posteriores na pesquisa científica. A primeira delas está
relacionada à análise genética do micro-organismo prospectado e isolado do orégano
identificado como capaz de biotransformar o R-(+)-limoneno em limoneno-1,2-diol.
A otimização no rendimento do produto também mostra ser um passo
fundamental para tornar mais atraente a viabilização comercial de limoneno-1,2-diol ou
de estudos focados na investigação do potencial biológico do mesmo. O emprego de
ferramentas estatísticas, como por exemplo, Placket-Burman seguido de um estudo
baseado em metodologia de superfície de resposta mostra-se bastante adequado e
pertinente para a produção biotecnológica desse composto. Além disso, diferentes
parâmetros de processo também devem ser investigados, como por exemplo,
configurações de reator, fermentação em estado sólido/submersa, emprego de meios
de cultivos alternativos e modos de extração do produto a partir do processo
fermentativo.
Ainda, a identificação do diasteroisômero de limoneno-1,2-diol preferencialmente
produzido pelo micro-organismo aqui relatado é de fundamental importância para
determinar a aplicabilidade de tal composto, particularmente em estudos de avaliação
do seu potencial biológico.
Neste sentido, considera-se bastante promissor investigar e comparar o
potencial biológico dos seguintes produtos (potencialmente diasteroisômeros
diferentes): o limoneno-1,2-diol relatado nesse trabalho, produzido pela
biotransformação do R-(+)-limoneno e o limoneno-1,2-diol relatado no trabalho de
Molina et al. (2015) produzido a partir de S-(+)-limoneno por Fusarium oxysporum.
Portanto, a pesquisa desenvolvida nesse trabalho ainda requer inúmeras
respostas, mantendo aberto diferentes questionamentos, constituindo-se como um
primeiro passo para a condução de um estudo mais aprofundado acerca da produção
biotecnológica de aromas e, mais especificamente, nesse caso, acerca da
biotransformação de R-(+)-limoneno em limoneno-1,2-diol por fungo filamentoso
isolado do orégano.
Página 78 de 105
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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10. AGRADECIMENTO
Agradecemos à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais
(FAPEMIG) pelo financiamento da bolsa da aluna de Mestrado e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro
ao projeto (473981/2012-2).
