Regulação da Atividade G

ênica em Procariontes

INTRODUÇÃO A informação gênica unidimensional é transcrita em RNA e, posteriormente, traduzida em proteína como informação tridimensional, que é responsável por todos os processos biológicos essenciais ou auxiliares;

O comportamento de um organismo depende da natureza, da amplitude e das condições ambientais nas quais seus genes são expressos:

Genes que codificam proteínas de manutenção (housekeeper) - expressos o tempo todo;

Genes cujos produtos são sintetizados apenas nos momentos e em quantidades exatas necessárias - genes regulados.

A “regulação gênica” torna possível a adaptação, a variação, a diferenciação e o desenvolvimento celular.

Os sistemas regulatórios entre procariontes e eucariontes são diferentes, principalmente em razão das diferenças de estruturas e organização gênica.

Em procariontes (e provavelmente eucariontes unicelulares) os sistemas regulatórios são movidos para fornecer a máxima taxa de crescimento em um determinado ambiente, exceto quando tal crescimento for detrimental.

Em eucariontes multicelulares, por outro lado, uma célula embrionária deve não apenas crescer e se multiplicar, mas também sofrer considerável mudança em morfologia e bioquímica (diferenciar-se) e então manter-se inalterada neste estado.

Visão Geral da regulação da transcrição em procariontes e eucariontes.

Fundamentos da RegulaçãoOs mecanismos regulatórios mais bem compreendidos são os usados por bactérias e bacteriófagos;

A expressão gênica pode ser regulada pelo controle tanto da síntese de RNA quanto da síntese de proteína;

Existem sinais regulatórios para determinar a quantidade máxima de cada proteína que deve estar presente na célula (p.ex. 20 cópias de repressor lac e 100.000 cópias do fator de transcrição EF-Tu);

Por isso, existem atividades reguladoras do tipo “liga-desliga”, permitindo a síntese quando o produto gênico é necessário e inibindo quando não é;

No estado “desligado”, um nível basal de expressão gênica quase sempre é mantido, apenas no estado de esporos a expressão da maioria dos genes bacterianos está totalmente desligada;

Em eucariontes, entretanto, o desligamento total de um gene é uma condição prevalente;

A organização gênica em óperons, prevalente em procariontes, proporciona a regulação coordenada dos produtos de vários genes que participam de uma via metabólica;

Nos eucariontes os mRNAs são, em geral, monocistrônicos e os genes são organizados separadamente e dispersos em cromossomos diferentes, requerendo regulação individualizada;

Regulação ao Nível de TranscriçãoExistem vários mecanismos para regulação da transcrição, o tipo usado, em geral, depende se as enzimas reguladas agem em vias metabólicas de degradação ou de síntese de compostos;

Em um sistema degradativo de várias etapas, a disponibilidade da molécula a ser degradada frequentemente determina a síntese ou não das enzimas de degradação;

Em contraste, em uma via biossintética, o produto final é, em geral, a molécula regulatória;

Geralmente, os dois padrões de regulação se enquadram em duas categorias principais: regulação positiva ou regulação negativa.

Distinção entre regulação negativa e regulação positiva

Regulação negativaNestes sistemas, uma proteína específica (proteína repressora) inibe a transcrição de um gene (ou genes) quando presente na célula;

A inibição do repressor pode ser direta e a presença de um indutor (molécula antagonista do repressor) é necessária para que ocorra a transcrição;

Em outros casos, a proteína repressora pode depender de uma molécula sinal específica, com a qual forma um complexo para ser ativa.

Modelo geral de regulação negativa por um repressor de ação direta (A) e do efeito de um indutor na remoção do sítio operador (B).

A B

Regulação Positiva

No sistema de regulação positiva uma proteína, denominada de ativador, funciona para aumentar a taxa de transcrição de um óperon;

Alguns ativadores para serem efetivos também dependem de associação com alguma molécula sinal.

Modelo geral de regulação positiva por um ativador de ação direta (A) e do efeito da molécula sinal ou efetora que induz o ativador a se ligar no sítio operador (B).

A B

OBSERVAÇÕES GERAIS IMPORTANTES DA REGULAÇÃO GÊNICA

Os repressores e ativadores não são mutuamente excludentes em sua atuação e natureza: ambos podem estar presentes em um mesmo óperon e uma mesma proteína pode funcionar ora como repressora, ora como ativadora.

Um sistema degradativo pode ser regulado positiva ou negativamente, enquanto uma via biossintética é regulada, geralmente, negativamente.

Tanto em procariontes quanto em eucariontes a própria atividade enzimática pode ser regulada pelos produtos finais de uma sequência de reações (inibição feedback).

Pequenas moléculas que não os produtos da reação enzimática também são utilizadas para ativar ou inibir uma enzima (molécula efetora alostérica).

O MODELO DO ÓPERON lac EM E. coli

Em E. coli o metabolismo da lactose requer duas enzimas: uma permease para transportar a lactose para a célula e a β-galactosidase para quebrar a molécula de lactose;

A permease e a β-galactosidase são codficadas por duas sequências adjacentes, Z e Y, respectivamente;

Uma terceria sequência contígua codifica uma enzima adicional, denominada transacetilase, não envolvida no metabolismo da lactose;

Assim, as sequências Z, Y, A são de genes estruturais, ou sejam, genes que codificam a estrutura de proteínas (polipeptídeos);

Todos os três genes são transcritos em uma única molécula de mRNA, portanto, a regulação da produção deste mRNA coordena a síntese de todas as três enzimas.

O Modelo do Operon lac de E. coli

Experimentos que possibilitaram a compreensão da estrutura e funcionamento do operon lac

Utilização de linhagens bacterianas diplóides parciais produzidas por *plasmídeos F’:

*Plasmídeo F – molécula de DNA extracromossômico mas capaz de se integrar ao cromossomo bacteriano e de ser transferido entre células bacterianas (por meio da conjugação);

A transferência de uma cópia de um plasmídeo integrado pode levar junto alguns genes do cromossomo bacteriano, da bactéria doadora para a bactéria receptora;

Desde que haja um conjunto completo de genes para metabolizar a lactose, seja no plasmídeo seja no cromossomo, estes diplóides exibem um fenótipo Lac+;

Por convenção, o genótipo do plasmídeo é escrito à esquerda da barra diagonal e o do cromossomo à direita .

Os diplóides parciais F’lac+/lac- ou F’lac-/lac+ exibem fenótipo Lac+;

Nos diplóides parciais F’lac-/lac-, algumas células apresentaram fenótipo Lac- enquanto outras foram Lac+;

Todos os mutantes Lac- isolados caíram em dois grupos: os que tinham mutação no gene lacZ e os que tinha mutação no gene lacY;

Estes resultados evidenciaram que o sistema lac era constituído por pelos menos dois genes estruturais (lacZ e lacY);

Experimentos em que células foram colocadas em um meio com lactose marcada com 14C mostraram que nenhuma lactose entrava em uma célula lacY- mas entreva prontamente em uma célula lacZ-

As dosagens enzimáticas mostraram que a β-galactosidade está presente em células lacZ+, mas ausente em células lacZ-;

O mapeamento mostrou que os genes lacZ, LacY e LacA são adjacentes;

A produção do mRNA do operon lac só é realizada quando a lactose está presente no meio de cultivo como fonte única fonte de carbono;

Conclusão: o sistema é indutível, regulado ao nível de transcrição e a lactose atua como um indutor;

De fato, neste tipo de experimento não se utiliza lactose, mas um análogo denominado de isopropiltiogalctosídeo (IPTG), este análogo é um indutor mas não um substrato para a β-galactosidase.

Foram isolados mutantes em que o mRNA lac era produzido tanto na presença quanto na ausência do indutor (mutações constitutivas).

Testes com diplóides parciais portadores de duas mutações constitutivas mostraram a existência de duas classes: lacI+ e lacOc.

Expressão de lacZ

GenótipoIndutor ausente

(sem IPTG)

Indutor presente

(com IPTG)fenótipo

I+O+lacZ+ - + Indutível

I-O+lacZ+ + + Constitutivo

F’ I-O+lacZ+/I+O+lacZ+(ou -) - + Indutível

F’ I+O+lacZ+/I-O+lacZ+ - + Indutível

I+OclacZ+ + + Constitutivo

F’ I+OclacZ+/I+O+lacZ- + + Constitutivo

F’ I+OclacZ-/I+O+lacZ+ - + Indutível

F’ I+OclacZ-/I-O+lacZ+ - + Indutível

F’ I+OclacZ+/I-O+lacZ- + + Constitutivo

Conclusões:O produto do gene lacI deve ser uma entidade difundível denominada, posteriormente, de proteína repressora Lac;

As mutações Oc causam uma expressão constitutiva dos genes lac apenas quando a mutação e os genes estão na mesma molécula;

Apenas os genes cis adjacentes à Oc são afetados por ele, por isso a mutação é denominada de cis-dominante;

Logo, a região O não codifica um produto difundível, de fato ela é uma região não codificante envolvida na regulação e é denominada de operador;

A proteína repressora do gene lacI se liga ao operador O+ e impede a transcrição dos genes estruturais lac.

Outra classe de mutantes Lac- (denominada de P-) foi isolada e caracterizada como cis-dominante, em experimentos com diplóides parciais.

Estas mutações foram mapeadas em uma região adjacente ao operador e foi denominada de sítio promotor.

Resumindo: o sistema de uso de lactose consiste de dois tipos de componentes: genes estruturais que codificam produtos necessários para transportar e metabolizar lactose e elementos regulatórios (gene lacI, o operador (O) e promotor (P)). Juntos, os genes estruturais e os elementos regulatórios constituem o operon lac.

O operon lac exemplifica um tipo de regulação negativa, em que um indutor desativa o repressor pelo processo chamado de desrepressão.

Óperon lac bloqueado

Óperon Lac desbloqueado

Efeito da Glicose na expressão do óperon lacA β-galactosidase forma glicose e galactose pela quebra da lactose.

Por isso, se há glicose e lactose no meio de cultura, a atividade do óperon lac não é necessária.

O exame desta característica indica que o operon lac está também sujeito à regulação positiva:

A molécula AMP cíclico (cAMP) tem sua concentração intracelular relacionada à concentração de glicose.

Assim, quando o nível de glicose é baixo na célula, a concentração de cAMP é alta e vice versa.

O cAMP é responsável pela vinculação entre atividade do operon lac e concentração intracelular de glicose;

O cAMP se liga a outra proteína, denominada de receptor de cAMP (CRP ou CAP), formando o complexo cAMP-CRP, que se liga no sítio ativador, localizado na região do promotor, para que ocorra a transcrição do operon lac;

A ausência de complexo cAMP-CRP faz com a RNA polimerase se ligue fracamente ao promotor lac, de modo que a transcrição raramente é iniciada;

Assim o complexo cAMP-CRP é um regulador positivo, enquanto o produto do gene i (repressor) é um regulador negativo do operon lac.

c

Controle positivo do operon Lac:

Em baixas conc. de glicose é formado o cAMP que forma um complexo com o CAP (ou CRP);

O complexo se liga no sítio promotor do operon

Controle negativo e positivo do óperon Lac pelo repressor lac e pela proteína ativadora do catabolismo (CAP ou CRP) :Grande quantidade de mRNA é produzida apenas quando: A lactose está presente para inativar o repressor e,Os baixos níveis de glicose promovem a formação do complexo CAP-cAMP, que regula positivamente a transcrição.

Óperon da Galactose de E. coliO óperon gal é também é um sistema de indução com três cístrons (galE, galT e galK), regulado por cAMP-CRP, um repressor e dois sítios promotores, que são inversamente ativados pelo complexo cAMP-CRP;

cAMP-CRP ativa a transcrição a partir do promotor P1, mas inibe a transcrição a partir do promotor P2;

Foi demonstrado experimentalmente que a síntese de mRNA gal a partir dos dois promotores é inversamente proporcional à conc. de cAMP intracelular;

O produto do gene galR, o repressor do operon gal, se liga aos dois sítios operadores e induz a formação de uma alça no DNA, envolvendo as regiões promotoras, o que impede a ligação da RNA polimerase e o início da transcrição.

Óperon da ArabinoseO óperon ara, como os óperons lac e gal, é indutível;

As enzimas ara são sintetizadas apenas quando as células são expostas à arabinose, cuja transcrição é regulada pela proteína AraC;

AraC atua diretamente como repressora na ausência de arabinose, mas na sua presença forma o complexo arabinose-araC que ativa a transcrição a partir do promotor ara;

Se o gene araC é deletado, o operon ara nunca é expresso, mesmo na presença de arabinose;

Portanto AraC exemplifica o caso de uma proteína reguladora que atua tanto como repressor quanto como indutor.

Óperon de Triptofano e a Atenuação Em E. coli, a expressão das enzimas envolvidas na síntese

de muitos aminoácidos e vitaminas é regulada pela interação entre o repressor e co-repressor;

O co-repressor geralmente é o próprio produto da via biossintética;

O óperon trp, que controla a transcrição de cinco cístrons envolvidos na codificação das enzimas da biossíntese do triptofano funciona assim;

A proteína reguladora do sistema de repressão do óperon trp é codificada pelo gene trpR, localizado em outra região do genoma bacteriano;

O óperon trp contém 5 genes estruturais que codificam as enzimas envolvidas na biossíntese do triptofano, (trpE, trpD, trpC, trpB, trpA). Os elementos reguladores (sítio promotor, operador e sequência atenuadora localizam-se à montante do cistron trpE. O gene trpR localiza-se em outra região do genoma.

Existem dois níveis de regulação:

a) Altos níveis de triptofano desligam o sistema ao nível de co-repressor – neste caso a transcrição nunca começa porque o promotor está bloqueado;

b) Se os níveis de triptofano não são suficientemente altos, a expressão é submetida a um sistema de controle mais refinado, sensível à concentração intracelular de triptofano:

1- término prematuro da transcrição antecedente ao primeiro gene estrutural;

2- regulação da frequência deste término pela concentração intracelular de triptofano;

Regulação do óperon trp por dois processos distintos: (1) Altos níveis de triptofono - bloqueio da transcrição pela ligação, no sítio operador, do complexo co-repressor/repressor; (2) término prematuro da transcrição (mRNA atenuado) quando os níveis intracelulares de triptofano são intermediários.

O mRNA líder (L) contém 162 bases e várias características singulares:

1) Um códon AUG e um códon finalizador UGA que definem a codificação do polipeptídeo líder de 14 aminoácidos;

2) Dois códon adjacentes, correspondentes à 10ª e 11ª posições do peptídeo líder, especificam o aminoácido triptofano;

3) Quatro segmentos do mRNA líder são capazes de fazer pareamento intrafilamentar por dois modos mutuamente exclusivos, formando hastes-alças 1-2 e 3-4 ou apenas a haste-alça 2-3;

O mecanismo para efetuar o término prematuro da transcrição é baseado no potencial do mRNA em formar as haste-alças alternativas 1-2 (protetora) e 3-4 ( atenuadora) ou 2-3 (preemptora);

A orientação para término prematuro depende da formação ou não da estrutura atenuadora da haste-alça 3-4;

O término da transcrição no atenuador é mediado pela tradução do peptídeo lider, que é sensível à concentração de tRNAtrp carregado;

Se o suprimento intracelular de triptofono for baixo, a quantidade de tRNAtrp será insuficiente e a tradução ficará parada nos códons de triptofano (posições 10 e 11);

Dois pontos devem ser destacados:

1- todo pareamento de bases é eliminado no segmento de mRNA que está em contato com o ribossomo;

2 – se as hastes-alças 1-2 e 3-4 forem formadas simultaneamente, então a haste 2-3 não poderá estar presente;

Se a haste-alça 3-4 não for formada a transcrição segue adiante e uma molécula completa do mRNA do óperon é sintentizada.

Modelo do mecanismo de controle por atenuação do óperon trp de E. coli

Reguladores Específicos versus GlobaisProteínas reguladoras podem ser altamente específicas, como repressor Lac, ou podem ter um efeito mais global, como cAMP-CRP;

Outro exemplo de regulador geral é a proteína LexA, envolvida no controle da expressão de genes que codificam enzimas de reparo de danos induzidos por UV;

Estes genes estão localizados em diferentes regiões do genoma de E. coli e a proteína LexA se liga aos operadores de todos eles;

Um conjunto de genes ou óperons cuja expressão seja regulada por um regulador global é denominado de régulon;

Auto-regulaçãoGenes cujas exigências de seus produtos variem muito nas células, possuem mecanismo de auto-regulação, geralmente com o produto do gene funcionando diretamente como regulador positivo ou negativo, conforme o caso;

A auto-regulação pode ocorrer também ao nível de tradução como nos casos dos componentes protéicos do ribossomos, que se ligam ao mRNA , bloqueado a ligação de ribossomos intactos e a síntese protéica;

Os genes que codificam as diversas proteínas ribossômicas estão organizados em óperons com até 11 cístrons;

Em cada um destes óperons encontra-se pelo menos um cístron cujo produto tem atividade de repressão traducional;

Como cada cístron possui seu próprio sítio de ligação o ribossomo (RBS), seria esperado que apenas aquele onde houve ligação da proteína tivesse sua tradução bloqueada;

No entanto, devido à formação de estruturas secundárias no mRNA, a liberação dos diversos RBS depende da tradução dos cístrons antecedentes.

Genes Constitutivos Genes constitutivos são expressos o tempo todo na célula,

em taxas predeterminadas pela eficiência (força) de seus promotores;

Tais genes codificam proteínas de manutenção da célula viva, p.ex. os genes que codificam enzimas do metabolismo da glicose, cujos níveis permanecem mais ou menos constantes na célula.

Controle da tradução do mRNA do óperon S10, que codifica proteínas ribossômicas. A proteína L4, quando em excesso, liga-se em uma região à montante do cístron rpsJ e bloqueia a tradução da maioria dos genes, com exceção de rplP e rpmC.

Resumo dos mecanismos de controle transcricional da expressão gênica.

A linha fina de mRNA, no controle positivo, indica transcrição em um nível basal;

O X abaixo do promotor (P) indica bloqueio da transcrição;

Altos níveis de transcrição são indicados por várias cópias de mRNA .

Controle Pós-transcricionalEm geral, as taxas de sínteses de proteínas de diferentes cístrons de um mesmo óperon são desiguais;

Estas diferenças, resultantes de regulação pós-transcricional, são obtidas de dois modos:

1)Controle traducional

Determinado pela eficiência de ligação dos ribossomos à sequência crítica (Shine-Dalgarno) de cada cístron e também pela posição relativa dos cístrons;

ex. operon lac 100 lacZ : 50 lacY : 20 lacA;

A eficiência de ligação do ribossomo também é modulada pela formação de estruturas secundárias no mRNA, ou pela complementação de bases do mRNA com outra molécula de RNA com atividade reguladora.

2) Estabilidade do mRNA

Em bactérias esta estabilidade é da ordem de alguns minutos, facilitando as mudanças no espectro de síntese de proteínas.

Outro aspecto importante é modo como se dá a degradação do mRNA.

ex. o mRNA do operon lac é degradado da extremidade 3’ para 5’, por isso, sempre há mais segmentos de lacZ que lacY e de lacY que lacA;

Resumindo: a expressão geral de um operon é regulada pelo início da transcrição de um mRNA e/ou pelo seu término prematuro, enquanto a concentração relativa das proteínas codificadas é determinada tanto pela taxa de degradação do mRNA, quanto pela frequência do início da tradução de cada cístron.

Inibição Feedback e Controle AlostéricoInibição feedback se refere à paralisação reversível e específica da atividade catalítica de uma enzima, em uma via bioquímica pela ligação de um produto enzimático posterior na mesma via;

p.ex. Altas conc. de isoleucina inibem a atividade da primeira enzima da via metabólica de sua biossíntese a partir de treonina;

A isoleucina liga-se, reversivelmente, a sítio diferente de seu sítio ativo e muda a estrutura da proteína enzimática;

Proteínas cuja forma ou conformação é mudada pela ligação de uma pequena molécula (efetores alostéricos) em um sítio diferente de seu sítio ativo são chamada de proteínas alostéricas.

Inibição feedback da via biossintética da isoleucina

Alteração conformacional de uma proteína enzimática pela ligação de um efetor alostérico.

Algumas vias biossintéticas são ramicadas, sendo responsáveis pela síntese de dois ou mais produtos a partir de um precursor comum;

Um caso bem estudado é da síntese de lisina, metionina e treonina, tendo como precursor comum o aspartato (ver ilustração seguinte)

A inibição feedback ocorre tanto em procariontes quanto em eucariontes, em modos muito variados;

Todas as mudanças nas propriedades das proteinas regulatórias discutidas anteriomente são exemplos de mudanças de conformação alostéricas pela ligação de pequenas moléculas efetoras;

A inibição ou ativação por mudanças alostéricas proporcionam uma rápida resposta a mudanças no ambiente celular.