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CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA ASSOCIAÇÃO EPIFÍTICA E

ENDOFÍTICA ENTRE MICRORGANISMOS E PLANTAS EM UM

AMBIENTE AGRÍCOLA TROPICAL.

LÍLIAN ESTRELA BORGES

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

MARÇO - 2006

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA ASSOCIAÇÃO EPIFÍTICA E

ENDOFÍTICA ENTRE MICRORGANISMOS E PLANTAS EM UM

AMBIENTE AGRÍCOLA TROPICAL.

LÍLIAN ESTRELA BORGES

Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia, com ênfase em Biologia Celular.

ORIENTADOR: PROF. FÁBIO LOPES OLIVARES

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

MARÇO - 2006

SUMÁRIO

RESUMO......................................................................................................................1

ABSTRACT..................................................................................................................2

1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................3

2. REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................4

2.1. Biodiversidade e Sistemas Tropicais................................................................4

2.2. Interações entre plantas e bactérias.................................................................6

2.3. Bactérias endofíticas.......................................................................................11

2.4. Aplicação de bactérias endofíticas na agricultura e biotecnologia..................15

2.5. Bactérias epifíticas e biofilme..........................................................................16

2.6. Aplicação de bactérias epifíticas na agricultura e biotecnologia.....................20

2.7. Anatomia vegetal e microscopia aplicada ao estudo das interações entre

plantas e bactérias.....................................................................................................21

3. OBJETIVOS...........................................................................................................23

3.1. Objetivo geral..................................................................................................23

3.2. Objetivos específicos.......................................................................................23

4. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................24

4.1. Caracterização agroecológica do local de coleta............................................24

4.1.1. Caracterização dos diferentes agroecossistemas........................................25

4.2. Material botânico.............................................................................................26

4.3. Processamento de amostras para microscopia ótica......................................29

4.4. Processamento de amostras para microscopia eletrônica de varredura........30

5. RESULTADOS.......................................................................................................32

5.1. Bactérias epifíticas nas amostras da lâmina foliar..........................................32 5.2. Fungos epifíticos nas amostras da lâmina foliar.............................................42 5.3. Microrganismos epifíticos nas amostras da raiz..............................................42

5.4. Microrganismos endofíticos.............................................................................42

6. DISCUSSÃO..........................................................................................................56

6.1. Microrganismos epifíticos nas amostras da lâmina foliar................................56

6.2. Microrganismos epifíticos nas amostras da raiz..............................................64

6.3. Microrganismos endofíticos.............................................................................65

7. CONCLUSÕES......................................................................................................67

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................68

AGRADECIMENTOS

Ao Marihus, aos meus pais, Antônio e Maeli, e aos irmãos, Lavínia e

Leonardo, pelo apoio, incentivo, confiança e carinho, dedico esse trabalho.

Ao Professor Fábio Lopes Olivares, pela orientação e ensinamentos nesses

anos de convívio.

À Professora Maura da Cunha, pela revisão e sugestões, essenciais para a

melhoria dessa dissertação.

Ao Sr. Husdonil e à Sra. Marília, pela possibilidade de realização desse

estudo na propriedade rural Pedra Lisa e por toda a atenção e carinho.

Aos membros da comissão examinadora do projeto, Prof. Silvaldo Felipe da

Silveira, Profa. Maura da Cunha, Profª. Kátia Valevski Sales Fernandes, e aos

membros da comissão examinadora da dissertação, Prof. Flávio Costa Miguens,

Prof. José Roberto Vieira Júnior, Prof. Reginaldo da Silva Romeiro, por todas as

críticas e sugestões.

Ao Marihus, pela colaboração durante a coleta do material botânico e

caracterização agroecológica da propriedade.

À Beatriz, Giovana, Ricardo, Rosane e Noil, pelo apoio técnico durante o

preparo das amostras e utilização dos microscópios.

A todos os professores, colegas e funcionários do Laboratório de Biologia

Celular e Tecidual, pelo aprendizado que de alguma forma me proporcionaram e

pela amizade e convívio tranqüilo durante esses anos. Em especial aos amigos

do grupo de pesquisa, Erineudo, Lúcia e Vanessa, pela amizade e por todos os

auxílios.

À Universidade Estadual do Norte Fluminense, ao Centro de Biociências e

Biotecnologia e ao Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, pela oportunidade

de realização desse trabalho.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela bolsa concedida.

RESUMO

Atualmente, a tendência do setor agrícola é utilizar técnicas e estratégias

biotecnológicas para aumentar a produção, aliada à qualidade do produto e

preservação ambiental. Nesse contexto, os estudos sobre bactérias epifíticas e

endofíticas, que colonizam respectivamente a superfície e o interior de plantas

assintomáticas se destacam, pois essas bactérias podem contribuir para o

crescimento e desenvolvimento da planta hospedeira, além de atuarem no equilíbrio

dinâmico dos ecossistemas. Entretanto, a caracterização estrutural da interação

entre a flora tropical e bactérias em ambiente natural ainda tem sido pouco

explorada. Logo, o presente estudo teve como objetivo caracterizar a

micromorfologia e anatomia da associação natural epifítica e endofítica entre

microrganismos e plantas em um ambiente agrícola tropical. Foram coletadas

amostras de raízes e folhas sem sintomas de doença, de quarenta e sete espécies

vegetais, pertencentes a vinte e oito famílias botânicas, em uma pequena

propriedade rural localizada no município de Jerônimo Monteiro, ES, e processadas

para microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura. Em todas as espécies

vegetais foi observada colonização microbiana. As bactérias foram os colonizadores

mais abundantes do filoplano, seguido por fungos, na forma de esporos e de hifas.

Predominaram nas superfícies foliares bactérias no formato de bastonete, seguido

por cocos, aderidos à parede periclinal externa das células epidérmicas e tricomas

por adesão apolar. As bactérias estavam presentes no filoplano como células

solitárias, ou formando microcolônias, ou estruturadas em biofilmes. Houve o

predomínio de biofilmes multiespecíficos, compostos por bactérias e fungos. Os

locais preferenciais de estabelecimento bacteriano epifítico foram as flanges

cuticulares, os tricomas secretores, os tricomas tectores, os complexos estomáticos

e as nervuras. Os caracteres anatômicos influenciaram no estabelecimento da

microbiota epifítica, sendo a presença de tricomas uma característica favorável, e a

presença de cera epicuticular do tipo plaqueta uma característica desfavorável à

interação bactéria-planta. A microscopia eletrônica de varredura, aliada à

microscopia ótica, foram ferramentas eficazes para o estudo estrutural da interação

epifítica entre microrganismos e a planta hospedeira. Colonização endofítica fúngica

foi observada nas amostras radiculares como associações micorrízicas.

ABSTRACT

Nowadays, the tendency of the agricultural section is to use biotechnologycal

techniques and strategies to increase production, allied to the quality of the product

and environmental preservation. In this context, the study of epiphytic and endophytic

bacteria, which colonize, respectively, the surface and the interior of healthy plant

tissues stand out, because those bacteria can contribute for plant host growth and

development, besides they act in the dynamic balance of the ecosystems. However,

the structural characterization of the interaction between tropical flora and

microorganisms in natural environments has still been little explored. In this direction,

the objective of this study was to characterize the micromorfology and anatomy of

epiphytic and endophytic natural associations between microorganisms and healthy

plants in a tropical agro-environment. Roots and leaves samples were collected from

forty seven plant species, belonging to twenty-eight botanical families, in a small rural

property located in Jerônimo Monteiro, ES., and processed for light microscopy and

scanning electron microscopy. In all plants, microbial colonization was observed,

being bacteria the most abundant settlers of the phylloplane, followed by fungi spore

or hyphae. Bacteria with rod cell shape prevail in leave surface, followed by coccoide

cell, adhered to the epiderm cell wall by apolar attachment. Bacteria occurred, on the

phylloplane, as a solitary cell, or forming microcolonies, or structured in biofilm.

Multiespecific biofilm, composed by bacteria and fungi, prevail on the phylloplane.

The preferencial sites of phylloepiphytic bacteria establishment were epidermal cell

wall junctions, glandular trichomes, non-glandular trichomes, stomata and veins. The

anatomical characters influence the epiphytic microorganism establishment, being

the presence of trichomes a favorable caracter and the presence of epicuticular wax

like plates an unfavorable caracter for plant-bacteria interaction. Scanning electron

microscopy, allied to light microscopy, can be considered important tools for

structural studies of phylloepyphytic associaions between microorganisms and host

plant. Fungi endophytic colonization was observed in root samples like mycorrhiza.

1. INTRODUÇÃO

As plantas abrigam microecossistemas complexos, possuindo diferentes

habitats, explorados por bactérias benéficas, como as simbióticas, e por bactérias

maléficas, como as fitopatogênicas.

Há mais de 50 anos, diversos trabalhos têm demonstrado que as bactérias

presentes epifiticamente (Lindow & Brandl, 2003) e endofiticamente (Hallmann et al.,

1997; Sturz et al., 2000; Lodewyckx et al., 2002) podem ser isoladas de tecidos

vegetais sadios, não estabelecendo de forma clara interações simbióticas ou

patogênicas.

Recentemente, foi descoberto que essas bactérias podem conferir vários

benefícios ao seu hospedeiro, como promoção do crescimento vegetal (Baldani et

al., 1997; Cássan et al. 2001) e maior resistência a condições de estresse biótico e

abiótico (Whipps, 2001; Zahir et al., 2003), além de possuírem uso biotecnológico

(Lindow & Leveau, 2002). Portanto, as definições de bactérias epifíticas e

endofíticas, que antes se referiam apenas à localização do microrganismo, evoluem

para representar associações entre bactérias e plantas saudáveis (Andrews &

Harris, 2000; Baldani et al., 2002).

As bactérias epifíticas e endofíticas apresentam uma ampla diversidade

genética e metabólica (Andrews & Harris, 2000; Yang et al., 2000) e atuam

diretamente nos ciclos biogeoquímicos de nutrientes e no crescimento e

desenvolvimento vegetal (Baldani et al., 1997; Gilbert et al., 1998; Bloemberg &

Lugtenberg, 2001). Apesar de possuírem importância global e local no equilíbrio

dinâmico dos ecossistemas, são escassos os levantamentos sobre as associações

naturais entre bactérias epifíticas e endofíticas com a planta hospedeira em

ambientes tropicais.

Questionamentos básicos ainda persistem, como: quais espécies vegetais

são colonizadas por bactérias epifíticas e endofíticas? Existem diferenças nos

padrões de colonização e estabelecimento epifítico e endofítico considerando órgãos

vegetais, famílias botânicas e espécies vegetais? Como é caracterizada

anatomicamente a interação entre bactérias epifíticas e endofíticas com a planta

hospedeira?

Nessa direção, a anatomia vegetal aliada à microscopia, pode ser utilizada

de forma promissora para elucidar essa interação, pois permite observar e

caracterizar o microrganismo em seu habitat natural, gerando informações sobre a

estrutura, localização e distribuição dos mesmos nos microecossistemas vegetais.

Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar

estruturalmente a associação natural epifítica e endofítica entre microrganismos e

plantas em um ambiente agrícola tropical.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Biodiversidade em Sistemas Tropicais

Diversidade biológica ou biodiversidade é a variabilidade de organismos

vivos de todas as origens, compreendendo, dentre outros, os ecossistemas

terrestres, marinhos e os complexos ecológicos de que fazem parte; compreendendo

ainda a diversidade dentro de espécies, entre espécies e de ecossistemas (Brasil-

M.M.A., 1998).

A biodiversidade, juntamente com os fatores abióticos, é responsável pela

manutenção da estabilidade dos ecossistemas, bem como, fonte inestimável de

recursos econômicos potencialmente exploráveis. Neste sentido, além de seu valor

intrínseco, a diversidade biológica possui valores ecológicos, genéticos, sociais,

econômicos, científicos, educacionais, culturais, recreativos e estéticos (Odalia-

Rímoli et al., 2000).

Wilson (1997) sugere que os ecossistemas tropicais são os ambientes que

apresentam a maior biodiversidade, porém, estão sofrendo um processo de

acelerada degradação, que pode ocasionar perdas irreversíveis através da extinção

de inúmeras espécies.

Os sistemas tropicais possuem características diferenciadas dos sistemas

temperados, referentes não apenas a localização geográfica e ao clima, com

temperaturas mais elevadas e constantes durante o ano, mas também, em relação

aos solos, bastante intemperizados, naturalmente inférteis e resilientes. Segundo

Novais & Smyth (1999), com o aumento do intemperismo, os solos se tornam mais

eletropositivos, resultando em uma diminuição da capacidade de troca catiônica e

aumento da retenção de ânions como o fosfato, sulfato e molibdato. Logo, os solos

passam gradualmente de fonte para dreno de nutrientes.

Por apresentarem características peculiares, os sistemas tropicais

necessitam serem estudados de forma constante e interdisciplinar, pois só com a

compreensão integral da dinâmica desse ambiente, poderão ser criadas técnicas de

manejo agrícola sustentáveis.

O Brasil possui a maior diversidade biológica do planeta, tanto em relação

às potencialidades genéticas, como em relação ao número de espécies e

ecossistemas (Odalia-Rímoli et al., 2000). O país possui também a mais alta taxa de

endemismo, além de utilizar diversas espécies exóticas, que representam a base

para as atividades agropecuárias (Brasil-M.M.A., 1998).

Segundo Altieri (2002), nos agroecossistemas, a biodiversidade além de ser

fornecedora de matéria-prima, apresenta importantes funções ecológicas, como a

reciclagem de nutrientes, regulação do microclima, supressão de organismos

indesejados e detoxificação de compostos químicos. Portanto, é de fundamental

importância que se intensifique a implementação de programas de pesquisa na

busca da compreensão e de um melhor aproveitamento da diversidade biológica.

Dados sobre o número de espécies atualmente conhecidas e a estimativa

das que estão por ser descobertas estão presentes na tabela 1.

Tabela 1. Participação das espécies conhecidas e estimadas da população de espécies existentes,

adaptado de Azevedo (1999) e Manfio (2003).

Número de espécies

Grupos Conhecidas (C) Estimadas (E) % C/E

Bactéria 4.700 40.000 a 3.500.000 < 12,00

Fungi 69.000 1.500.000 4,60

Protoctista 30.800 100.000 30,80

Plantae 307.750 3.010.000 10,22

Animalia 9.827.000 80.615.000 12,19

Vírus 5.000 130.000 3,84

O levantamento indica que os conhecimentos atuais a respeito da

diversidade biológica ainda são bastante incipientes, principalmente em relação aos

microrganismos. Sem conhecê-los, torna-se impossível preservá-los e utilizá-los.

Além dos prejuízos na biota local, a diminuição da diversidade microbiana

pode causar danos em escala global. Segundo Gilbert et al. (1998), as bactérias

metanotróficas oxidam mais da metade do metano produzido na Terra, para

obtenção de energia e como fonte de carbono. Esses microrganismos impedem que

o metano atinja altas concentrações, o que poderia resultar em um aumento da

temperatura do globo e causar diversas alterações químicas na atmosfera. As

bactérias metanotróficas estão presentes no solo e também colonizam os tecidos de

plantas, como, por exemplo, plantas de arroz, sendo responsáveis pela oxidação de

10 a 50 % do metano produzido nos campos de arroz inundado.

Sendo assim, as interações entre bactérias e plantas são de extrema

importância para a manutenção do equilíbrio nos diversos ecossistemas. Há a

necessidade de estudos contínuos para elucidar a dinâmica das diferentes

associações entre plantas e microrganismos, gerando informações relevantes para o

desenvolvimento de técnicas e estratégias aplicadas na agricultura e biotecnologia.

2.2. Interações entre plantas e bactérias

Os fisiologistas e anatomistas vegetais, freqüentemente, consideram as

plantas como organismos únicos, desconsiderando a existência de associações

microbianas. Entretanto, o avanço da ciência vem demonstrando que as plantas

podem abrigar microecossistemas complexos, possuindo diferentes habitats,

explorados por uma ampla variedade de bactérias (Hallmann et al., 1997; Kuklinsky-

Sobral, 2004).

Os habitats incluem tanto a superfície externa do vegetal (rizoplano e

filoplano), onde bactérias denominadas epifíticas predominam, quanto o interior das

plantas, onde predominam bactérias endofíticas (Lodewyckx et al., 2002). Para

Hallmann et al. (1997), essa distinção nem sempre é de fácil percepção, pois existe

um gradiente entre esses grupos bacterianos, ou seja, há populações que podem

flutuar entre a colonização epifítica e endofítica.

Diversos fatores bióticos e abióticos, tais como: a presença de outros

microrganismos associados à planta, presença de nematóides parasitas,

características edafoclimáticas, tipo de tecido vegetal e características da própria

bactéria, podem influenciar na colonização e distribuição de bactérias na planta

hospedeira (Kuklinsky-Sobral, 2003). As bactérias utilizam várias estratégias para colonizarem os

microecossistemas vegetais, incluindo interações benéficas, através de bactérias

simbióticas e interações maléficas, causadas pela ação de bactérias fitopatogênicas

(Montesinos et al., 2002).

As bactérias fitopatogênicas são conhecidas pelos cientistas desde a

segunda metade do século XIX, sendo consideradas importantes patógenos de

plantas, pois provocam graves enfermidades em culturas exploradas

economicamente e são de difícil controle (Romeiro, 1995). Para ocorrer a doença é

necessário que se estabeleça uma interação dita compatível, na qual a bactéria é

fitopatogênica, a planta é sua hospedeira suscetível e o ambiente apresenta

condições favoráveis à interação (Romeiro, 1995; Agrios, 1997; Montesinos et al.,

2002).

O processo patogênico depende, primeiramente, que ocorra migração e

adesão da bactéria à superfície da planta hospedeira, para posteriormente, ocorrer a

infecção (Leite et al., 2001). A penetração ocorre principalmente de forma passiva,

sem o rompimento mecânico ou enzimático do sistema de revestimento das plantas,

podendo ser através de aberturas naturais, como estômatos, hidatódios, nectários,

lenticelas, flores, ou através de ferimentos causados pelo vento, chuva, insetos,

nematóides, fungos, abscisão de folhas, tratos culturais e durante a emergência de

raízes laterais e adventícias. Tanto as substâncias secretadas pelas aberturas

naturais como os exsudados de fluido intercelular dos ferimentos podem exercer

quimiotactismo positivo sobre as bactérias (Ponte, 1980; Huang, 1986; Romeiro,

1995; Agrios, 1997).

Segundo Romeiro (1995), a bactéria coloniza um determinado tipo de tecido

vegetal, dependendo do tipo de interação bactéria-planta, do grau de

susceptibilidade do hospedeiro, do grau de agressividade da bactéria, do modo e

local de penetração e das condições ambientais. Porém, é consenso que as

fitobactérias são parasitas extracelulares, colonizando preferencialmente os espaços

intercelulares e os vasos do xilema. A colonização dos espaços intercelulares resulta

em sintomas como manchas, podridão-mole, hipertrofia e morte dos meristemas

apicais e a colonização dos vasos do xilema resulta em sintomas como murcha,

morte dos meristemas apicais e cancros.

As bactérias fitopatogênicas podem apresentar em seu ciclo de vida as

fases patogênica, saprofítica, residente e latente. Na fase patogênica as bactérias

demandam nutrientes dos tecidos vegetais vivos, resultando em doença no

hospedeiro. Quando os nutrientes são obtidos de restos vegetais em decomposição,

as bactérias são denominadas saprófitas. Na fase residente, as bactérias estão

presentes na superfície das plantas, obtendo nutrientes dos exsudados de seus

órgãos, sendo capazes de se multiplicarem sem infectar o hospedeiro. Na fase

latente, as bactérias encontram-se no interior da planta, em baixas populações,

tendo sua multiplicação paralisada e os sintomas não se evidenciam (Leben, 1981).

A disseminação de doenças nas espécies vegetais é limitada, pois a

interação patógeno-hospedeiro tende a ser específica e as plantas possuem

diversos mecanismos de defesa contra os ataques microbianos (Mithöfer, 2002).

A especificidade da interação entre bactérias patogênicas e planta

hospedeira é explicada pela necessidade de um reconhecimento gênico mútuo. As

bactérias possuem um gene avirulento (avr) homólogo ao gene de resistência (R) da

planta. Uma combinação não complementar desses genes resulta na interação

compatível denominada doença, enquanto a combinação complementar desses

genes resulta na interação incompatível, na qual há o estímulo dos mecanismos de

defesa da planta hospedeira (Montesinos et al., 2002).

As plantas, durante sua evolução, vem desenvolvendo várias estratégias de

adaptação e resistência às condições ambientais adversas (Margis-Pinheiro et al.,

1999). Os mecanismos de defesa são classificados em constitutivos, expressos

como uma característica inerente ao desenvolvimento do organismo, e induzidos,

expressos em função do contato com o agente invasor. Ambos mecanismos podem

atuar utilizando aspectos estruturais, baseados na anatomia e ultraestrutura vegetal

e aspectos químicos, referentes aos compostos químicos com atividade biológica de

defesa, sintetizados pelas plantas (Shewry & Lucas, 1997; Sticher et al., 1997;

Mauch-Mani & Métraux, 1998; Montesinos et al., 2002).

As defesas constitutivas ou preexistentes variam conforme a espécie

vegetal, podendo ser reconhecida, por exemplo, pela presença de cutícula espessa.

Segundo Kerstiens (1995), a cutícula pode atuar de forma direta contra a penetração

de patógenos através da formação de uma barreira mecânica, e de forma indireta,

reduzindo a retenção de água na superfície vegetal e protegendo a planta contra

danos mecânicos. Outros caracteres anatômicos como a organização da parede

periclinal externa, a periderme, a coifa, os apêndices epidérmicos, podem também

dificultar a infecção, colonização e reprodução do patógeno no hospedeiro

(Bergamin Filho et al., 1995). Assim como a presença de diversos metabólitos

secundários, saponinas (Osbourn, 1996), compostos fenólicos (Beckman, 2000) e

proteínas constitutivas (Shewry & Lucas, 1997) que possuem atividade

antimicrobiana. Os taninos, por exemplo, um tipo de composto fenólico

freqüentemente encontrado em tecidos vegetais, inibem enzimas extracelulares

microbianas e diminuem as fontes nutricionais dos patógenos através da

complexação de íons metálicos, sendo a concentração de tanino mínima inibitória

para bactérias entre 0,012 e 1 g L-1 (Scalbert, 1991).

A resistência induzida pode ser local ou sistêmica. A defesa local é

reconhecida, por exemplo, pela reação de hipersensibilidade (HR), que é a morte

rápida das células vegetais situadas no local de infecção, limitando a proliferação do

patógeno e adicionalmente, produzindo moléculas sinalizadoras que induzem a ação

de diversos genes relacionados com a defesa (Margis-Pinheiro et al., 1999; Cohn et

al., 2001; Gara et al., 2003).

Uma variedade de mudanças metabólicas pode ocorrer associadas com

HR, incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio, como os superóxidos

(Gara et al., 2003), explosão oxidativa (Doke et al., 1996), mudança no fluxo iônico

(Cohn et al., 2001), espessamento da parede celular perto do local de infecção

(Margis-Pinheiro et al., 1999), síntese de fitoalexinas (Romeiro, 2001; Grayer &

Kokubun, 2001), síntese de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR)

(Shewry & Lucas, 1997; Loon & Strien, 1999; Okushima et al., 2000), e produção de

moléculas sinalizadoras como o óxido nítrico (Cohn et al., 2001) e o ácido salicílico

(Mauch-Mani & Métraux, 1998).

A defesa induzida também pode ser sistêmica, através da resistência

sistêmica adquirida sinalizada pelo ácido salicílico, ou através da resistência

sistêmica induzida, que requer a presença de alguns microrganismos (Sticher et al.,

1997; Mauch-Mani & Métraux, 1998). A resistência sistêmica protege a planta contra

novos ataques de um mesmo patógeno, sendo na literatura, freqüentemente

associada com o processo de imunização que ocorre em animais (Margis-Pinheiro et

al., 1999). Sticher et al. (1997) relatam que rizobactérias promotoras de crescimento,

localizadas na rizosfera, podem induzir SIR no caule e nas folhas, protegendo a

planta de vários patógenos.

Além das interações patogênicas citadas acima, as plantas se associam

com vários microrganismos considerados simbiônticos, resultando em melhorias no

seu crescimento e desenvolvimento. A simbiose pode ser definida como uma

melhoria recíproca dos organismos, sendo que o fluxo bilateral de nutrientes não é

uma característica requerida de forma exclusiva, qualquer efeito protetor entre

organismos, que aumente a capacidade de sobrevivência ou reprodução, é

suficiente para que se configure uma relação simbiôntica (Selosse et al., 2004).

Uma simbiose, com relevante importância agronômica e ecológica, ocorre

entre bactérias fixadoras de nitrogênio e leguminosas, por meio da formação de

estruturas altamente especializadas denominadas nódulos. Dentro dos nódulos, as

bactérias, principalmente as pertencentes aos gêneros Azorhizobium,

Bradyrizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium e Rhizobium, transformam o

nitrogênio atmosférico (N2) em amônia (NH3). A amônia é assimilada pela planta,

que em contrapartida, supre a bactéria de fotoassimilados, estabelecendo uma

interação mutuamente benéfica (Mithöfer, 2002).

Djordjevic et al. (1987) consideram a associação rizóbio-planta como uma

interação parasítica bastante evoluída, pois exibe seletividade ao hospedeiro e

reconhecimento mútuo. Esses autores sugerem uma seqüência evolutiva na

associação bactéria-planta, que se inicia por uma interação comensalista, na qual as

bactérias se aproveitam dos exsudados vegetais, sendo denominadas saprófitas.

Nessa interação primitiva, as bactérias produzem enzimas não específicas que

destroem o tecido vegetal antes da colonização, logo há pouca seletividade e troca

de sinais. A transição comensalista para parasítica ocorre quando as bactérias

conseguem penetrar e colonizar tecidos vivos, se alimentando dos nutrientes da

própria planta. De alguma maneira, ainda não completamente elucidada, as

bactérias conseguem evitar ou inativar os mecanismos de defesa e colonizar todo o

hospedeiro. O parasitismo mais evoluído é o que causa cada vez menos danos à

planta, sendo a simbiose considerada a mais bem sucedida interação

microrganismo-planta, uma vez que beneficia ambas as espécies através de

mecanismos bastante regulados e específicos.

Muitas espécies bacterianas tem sido isoladas de diferentes tecidos

vegetais sadios (Hallmann et al., 1997; Baldani et al., 2002; Sturz et al., 2000;

Lodewyckx et al., 2002). Essas bactérias, presentes endofiticamente, não são

consideradas patogênicas, pois não provocam sintomas de doenças. Recentemente,

foi descoberto que elas podem conferir vários benefícios ao seu hospedeiro, como

promoção do crescimento vegetal e resistência contra patógenos e parasitas

(Hallmann et al., 1997).

Sendo assim, a definição literal de bactérias endofíticas (“endo” é derivado

da palavra grega “endon” e significa posição interior, e “fito” é derivado da palavra

grega “phyton” e significa planta) referente à localização do microrganismo no

interior da planta evoluiu para descrever a natureza de uma associação entre

bactérias que habitam o interior das plantas sem causar sintomas visíveis de doença

(Baldani et al., 2002).

Hallmann et al. (1997) sugerem que evolutivamente as bactérias endofíticas

são intermediárias entre as bactérias saprófitas e patogênicas, além de especularem

a possibilidade das bactérias endofíticas serem mais evoluídas que as patogênicas

por se nutrirem do hospedeiro sem matá-lo. Essa especulação pode ser reforçada

pela seqüência evolutiva proposta por Djordjevic et al. (1987), que contempla a idéia

de que a mais bem sucedida interação entre microrganismo-planta não apenas

explora os vegetais como fonte nutritiva, mas através do tempo causa menos danos

a planta.

Segundo Olivares (1997), os endófitos podem ter se tornado

endossimbiontes pela coevolução. Um achado novo e relevante é o fato das

rizobactérias possuírem genes em um plasmídeo simbiótico ou na ilha simbiótica dos

cromossomos, homólogos aos genes do sistema de secreção tipo-III, utilizado pelas

bactérias patogênicas na transferência dos fatores de virulência para as células

hospedeiras (Freiberg et al., 1997; Göttfert et al., 2001). Resultados recentes

demonstram que o sistema de secreção tipo-III em rizobactérias secretam proteínas

específicas envolvidas no estabelecimento da simbiose (Bloemberg & Lugtenberg,

2001). Assim, as bactérias endofíticas talvez possam ser evolutivamente a transição

entre as bactérias patogênicas e as bactérias simbiontes.

2.3. Bactérias endofíticas

Bactérias endofíticas têm sido reconhecidas por mais de 50 anos em

diferentes tecidos vegetais sem causar sintomas de doença (Terver and Hollis,

1948). Apesar das numerosas investigações a respeito desses microrganismos,

muitos questionamentos e controvérsias ainda necessitam serem elucidados. O

próprio conceito de bactéria endofítica (James & Olivares, 1997; Baldani et al., 2002;

Sturz et al., 2000; LodewycKx et al., 2002) é bastante discutido e sujeito a diferentes

interpretações na literatura.

Kado (1992) definiu bactérias endofíticas como aquelas que colonizam os

interior de plantas sem causar danos ou receber benefícios da interação. Esse

conceito é bastante restritivo, pois desconsidera a possibilidade de ocorrerem

associações simbióticas ou patogênicas entre endófito-planta. No entanto, Quispel

(1992) considera como endofíticas apenas as bactérias que estabelecem uma

endossimbiose com a planta hospedeira. Hallmann et al. (1997) agrupam essas

definições considerando endofíticas as bactérias que podem ser isoladas de tecidos

vegetais desinfetados superficialmente ou extraída do interior de plantas e que não

causa mal ao hospedeiro. Essa definição inclui tanto as associações neutras quanto

as benéficas.

Não existe, portanto, um claro limite entre bactérias endofíticas, patogênicas

e simbiontes. Conclui-se que o conceito de bactérias endofíticas não mais se refere

à localização e sim a função que esses microrganismos exercem no ecossistema,

estando em constante modificação, por depender de informações sobre a

associação endófito-bactéria que ainda não estão completamente compreendidas.

A origem, forma de penetração, colonização e transmissão de bactérias

endofíticas ainda são bastante discutidas. Bactérias endofíticas provavelmente se

originam de sementes, material propagado vegetativamente, rizosfera e filoplano

(Hallmann et al., 1997). A penetração pode ocorrer por aberturas naturais, como

estômatos, hidatódios, nectários, lenticelas e por ferimentos causados

principalmente pela emergência de raízes laterais, sendo a penetração ativa relatada

em bactérias que secretam celulases e pectinases (Hallmann et al., 1997; Reinhold-

Hurek & Hurek, 1998; Sturz et al., 2000).

A colonização de bactérias endofíticas pode ser local, em um tecido

específico da planta, como o córtex, ou pode ser sistêmica, sendo transportada

através dos elementos condutores ou via apoplástica (James et al., 1994). A

colonização é preferencialmente intercelular, com apenas poucos relatos de

colonização intracelular (Hallmann et al., 1997).

O fato das bactérias serem capazes de colonizar o interior das plantas pode

conferir uma vantagem ecológica e evolutiva comparado com a colonização epifítica.

Os tecidos vegetais podem prover um ambiente mais uniforme e protegido para as

bactérias que a superfície vegetal, por não estarem diretamente exposto às

condições ambientais extremas como incidência de radiação ultravioleta, variação de

temperatura e umidade. No entanto, fatores limitantes internos, como a presença de

compostos com atividade antimicrobiana, existem, e as bactérias têm que ser hábeis

para conseguirem colonizar as plantas endofiticamente (Sturz et al., 2000).

O estudo de bactérias endofíticas, por muitos anos utilizou-se dos métodos

de isolamento e contagem microbiológica. Amostras de plantas eram desinfestadas

superficialmente, utilizando-se diferentes produtos químicos, como hipoclorito de

sódio e peróxido de hidrogênio (Lodewyckx et al., 2002) e posteriormente, eram

trituradas, ou centrifugadas, ou submetidas a vácuo para isolamento bacteriano.

Essas bactérias eram cultivadas em meios artificiais e a população era estimada

através da contagem das colônias, considerando o fator de diluição ou aplicando a

técnica do número mais provável (Hallmann et al., 1997).

Em várias espécies vegetais pertencentes a diferentes famílias botânicas,

interações com bactérias endofíticas foram estudadas através dos métodos de

isolamento aliados ou não com as técnicas de biologia molecular, sem a confirmação

microscópica da presença bacteriana, conforme os exemplos da tabela 2.

Tabela 2. Espécies vegetais que apresentam associações com bactérias endofíticas, constatadas

através dos métodos de isolamento bacteriano aliados ou não as técnicas de biologia molecular, sem

a confirmação microscópica.

Família Nome científico

(nome vulgar) Órgão vegetal Bactéria Referência

Apiaceae Daucus carota L.

(cenoura)

Raiz Pseudomonas

Staphylococcus

Agrobacterium

Surette et al., 2003

Asteraceae Lactuca sativa L.

(alface)

Semente, raiz,

caule, folha

Bacillus Gomes et al., 2003

Areaceae Cocos nucifera L.

(coqueiro)

Folha, raiz Enterobacter

Pseudomonas

Fernandes et al., 2001

Bromeliaceae Ananas comosus L.

Merril

(abacaxi)

Raiz, caule,

folha, fruto

Azospirillum

Burkholderia

Herbaspirillum

Weber et al., 1999;

Tapia- Hernández et

al., 2000

Convolvulaceae Ipomoea batatas

Lam. (batata-doce)

Caule Pantoea

Enterobacter

Assis Jr & Adachi,

2003

Cucurbitaceae Cucumis sativus L.

(pepino)

Semente, raiz,

caule, folha

Bacillus

Enterobacter

Silveira et al., 2004

Fabaceae Phaseolus vulgaris L.

(feijoeiro)

Raiz Rhizobium Gutiérerz-Zamora &

Martínez-Romero,

2001

Malvaceae Gossypium hirsutum

L. (algodoeiro)

Semente, raiz,

caule

Não identificada McInroy & Kloepper,

1990; Adams &

Kloepper, 2002

Continuação da Tabela 2.

Musaceae Musa spp

(bananeira).

Raiz, caule,

folha, fruto

Azospirillum

Burkholderia

Herbaspirillum

Weber et al., 1999;

Martinez et al., 2003

Poaceae Brachiaria

decumbens Stapf.

(capim braquiária)

Raiz Herbaspirillum Olivares et al., 1996

Poaceae Digitaria decumbens

Stents

(capim pangola)


Poaceae Melinis minutiflora

Beauv.

(capim gordura)

Raíz Herbaspirillum Olivares et al., 1996

Poaceae Oryza sativa L.

(arroz)

Caule, raíz Azoarcus Stoltzfus et al., 1997;

Engelhard et al., 2000

Poaceae Panicum maximum

Jacq. (capim

colonião)

Raíz Herbaspirillum Olivares et al., 1996

Poaceae Pennisetum

purpureum

Schumach (capim

elefante)

Raiz, caule,

folha

Azospirillum

Herbaspirillum

Olivares et al., 1996;

Kirchhof et al., 1997

Poaceae Saccharum sp.

(cana-de-açúcar)

Raiz, caule,

folha

Glucanocetobacter

Pantoea

Azospirillum

Herbaspirillum

Olivares et al., 1996;

Reis Jr et al., 1999;

Loiret et al., 2004

Poaceae Sorghum bicolor

(sorgo)


Poaceae Zea mays L. (milho) Raiz, caule,

folha

Herbaspirillum

Rhizobium

Olivares et al., 1996

Rubiaceae Coffea arbica L.

(cafeeiro)

Raiz, caule Glucanocetobacter

Jimenez-Salgado et

al., 1997; Fuentes-

Ramírez et al., 2001

Solanaceae Solanum tuberosum

L. (batata)

Caule Curtobacterium

Pantoea

Pseudomonas

Bacillus

Clavibacter

Agrobacterium

Acidovorax

Sturz et al., 1999

Apesar da importância que o método de isolamento adquiriu para identificar

bactérias em diferentes órgãos vegetais, e mesmo aliado as novas técnicas

moleculares, há certas limitações que o torna inviável para caracterizar a associação

entre endófitos-planta.

A desinfestação superficial não é totalmente eficaz, os produtos químicos

utilizados podem penetrar nos tecidos vegetais e matar as bactérias endofíticas,

subestimando o valor total de bactérias no interior da planta (Hallmann et al., 1997).

Muitas bactérias epifíticas que estão envoltas por mucilagem ou aderidas fortemente

à parede periclinal externa podem permanecer na planta após a desinfestação e

serem consideradas erroneamente como endofíticas, superestimando o resultado

(Reinhold-Hurek & Hurek, 1998).

O cultivo em meios artificiais somente considera viáveis as bactérias

capazes de utilizarem os nutrientes daquele meio, logo, os microrganismos contados

podem representar apenas uma pequena fração do total da população endofítica

(Halmann et al., 1997).

O isolamento, portanto, caracteriza-se por ser um método indireto, gera

evidências da colonização endofítica de bactérias em tecidos vegetais, porém há a

necessidade da confirmação dessa interação através de estudos microscópicos

(Reinhold-Hurek & Hurek, 1998).

2.4. Aplicação de bactérias endofíticas na agricultura e biotecnologia

Segundo Azevedo (1999), o estudo da interação entre bactérias endofíticas

e plantas tropicais é escasso, mas vem se desenvolvendo rapidamente, resultando

em descobertas de interesse acadêmico e aplicado. As bactérias endofíticas podem

ser utilizadas no manejo sustentável dos sistemas agrícolas tropicais, visando

conferir ao seu hospedeiro, características como maior resistência a condições de

estresse biótico e abiótico, promoção de crescimento vegetal e amplo uso

biotecnológico (Whipps, 2001; Kuklinsky-Sobral, 2003; Zahir et al., 2003).

Os mecanismos de promoção de crescimento vegetal incluem ações diretas

como a fixação biológica de nitrogênio (Baldani et al., 1997; Reis et al., 2000;

Kennedy et al., 2004), produção de reguladores de crescimento vegetal (Cassán et

al., 2001; Kuklinsky-Sobral et al., 2004), solubilização de fosfato inorgânico (Verma

et a., 2001; Kuklinsky-Sobral et al., 2004), e ações indiretas como o controle

biológico (Benhamoul et al., 1998; Kloepper et al., 1999; Benchimol et al., 2000;

Alström, 2001; Siddiqui & Shaukat, 2003; Schena et al., 2003), produção de

sideróforos (Lodewyckx et al., 2002) e indução de resistência sistêmica no

hospedeiro (Kloepper et al., 1999; Jetiyanon & Kloepper, 2002).

O uso de bactérias endofíticas na biotecnologia é bastante amplo, incluindo

a produção de antibióticos e outras moléculas bioativas (Strobel, 2002), aplicação

nos processos de bioremediação (Lodewyckx et al., 2002) e nas técnicas de

transgenia (Baldani et al., 2002).

Todos esses mecanismos são potencialmente aplicáveis no campo,

objetivando a melhoria quantitativa e qualitativa da produção agrícola. Segundo

Kuklinsky-Sobral (2003) a utilização real dos endófitos na agricultura depende do

conhecimento sobre os mecanismos de interação bactéria-planta e da habilidade de

manter, manipular e modificar populações benéficas sob condições de campo.

Portanto, torna-se fundamental a caracterização da interação endófito-

planta sob o enfoque estrutural, para gerar informações que possam auxiliar no

desenvolvimento de técnicas e estratégias aplicadas à agricultura tropical.

2.5. Bactérias epifíticas e biofilme

Bactérias epifíticas etimologicamente se referem às bactérias que habitam a

superfície vegetal (“epi” é derivado da palavra grega “upon” e significa posição

superior, e “fito” é derivado da palavra grega “phyton” e significa planta) (Jacques &

Morris, 1995).

Hirano & Uper (1983) definem bactérias epifíticas, como aquelas que podem

ser removidas de superfícies de órgãos aéreos vegetais através de lavagens.

Entretanto, Romantschuk (1992) sugere que as células mais bem adaptadas ao

ambiente epifítico não são removidas facilmente por lavagens, pois a adesão

representa uma vantagem seletiva nesse ambiente. Andrews & Harris (2000),

definem microrganismos epifíticos como aqueles que habitam a superfície vegetal e

não são patogênicos. Recentemente, tem sido descrito que as bactérias epifíticas

podem ser benéficas as plantas como, por exemplo, através do controle biológico

(Singh et al., 2004; Özaktan & Bora, 2004; Byrne et al., 2005; Han et al., 2005).

Sendo assim, a definição literal de bactérias epifíticas referente à

localização do microrganismo no exterior da planta também está evoluindo para

descrever a natureza de uma associação entre plantas e bactérias que habitam a

superfície das plantas sem causar sintomas visíveis de doença.

O filoplano e o rizoplano são ambientes bastante distintos, que apresentam

peculiaridades com relação à incidência luminosa, aeração, umidade, topografia,

longevidade, forma e quantidade de nutrientes e de moléculas sinalizadoras entre

planta-microbiota (Andrews & Harris, 2000). Jager & Korsten (2001), por exemplo,

estudando o filoplano de mangueira observaram diferenças de densidade e

diversidade microbiana dependendo do estágio de desenvolvimento e da posição da

folha com relação à incidência luminosa. Mercier & Lindow (2000) constataram que a

disponibilidade de carbono na superfície foliar é um fator limitante no

estabelecimento de bactérias epifíticas do filoplano. Todas essas características

propiciam diferenças na composição microbiana e sua dinâmica temporal e espacial,

pois influenciam os processos de imigração, emigração, crescimento e morte de

bactérias (Kinkel, 1997).

As bactérias associadas às plantas podem ser observadas isoladas ou

agrupadas na forma de agregados, microcolônias, simplamatas e biofilmes (Morris &

Monier, 2003).

Segundo Costerton et al. (1995), biofilme pode ser definido como uma

população microbiana coberta por uma matriz extracelular, com bactérias aderidas

umas as outras e a uma superfície ou interface, cuja formação pode ser influenciada

por vários fatores como disponibilidade de nutrientes, temperatura, osmolaridade,

pH, oxigênio (O’Toole et al., 2000). Para Jefferson (2004), quatro fatores principais

direcionam as bactérias a formarem biofilmes: para se protegerem contra condições

de estresse, para formarem uma comunidade e se beneficiarem dos processos de

cooperação, para colonizarem uma área rica em nutrientes, ou é um modo de

crescimento.

A formação de biofilme é um evento dinâmico no qual microrganismos

planctônicos adquirem a capacidade de viverem de forma séssil, logo, sua formação

envolve as etapas de adesão celular em uma superfície, formação de microcolônia,

maturação do biofilme, destacamento e posterior dispersão (Costerton et al., 1999).

A primeira teoria proposta para formação de biofilme foi descrita por

Marshall et al. (1971) (citado por Poulsen, 1999) e ressalta que a adesão é um

processo tempo dependente que pode ser dividido em duas fases: reversível e

irreversível. Na primeira fase, a reversibilidade é decorrente do processo de adesão

do microrganismo na superfície ocorrer por interações a longa distância, como forças

de Van der Walls e de atração eletrostática. Na segunda etapa, a irreversibilidade é

decorrente de interações a curta distância, incluindo dipolo-dipolo, íon-dipolo,

ligações covalentes, ligações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio, portanto, há um

aumento da interação química da célula com a superfície.

Recentemente, diversos estudos (Pratt & Kolter, 1998; 1999; Stickler, 1999)

vêm demonstrando que para algumas bactérias o estabelecimento do contato entre

célula e superfície é depende da mobilidade flagelar e pilosa, pois, possivelmente,

as forças geradas por esses movimentos auxiliam a célula a sobrepor as forças

repulsivas da superfície. Uma vez que ocorra contato entre bactéria e superfície, a

adesão é estabelecida por proteínas extramembranares, as adesinas (Poulsen,

1999).

Durante e pós a adesão, as bactérias secretam polisacarídeos

extracelulares (EPS) formando uma matriz que recobre toda a microcolônia em

formação. Os polisacarídeos extracelulares podem ser compostos de glicose,

frutose, galactose, manose (Johansen et al., 1997). São várias as funções desses

polisacarídeos como, por exemplo, facilitar a adesão bacteriana na superfície, formar

e manter a estrutura do biofilme, aumentar a resistência do biofilme a condições de

estresse ambiental e a antibióticos, facilitar a absorção de água e nutrientes

(Poulsen, 1999).

Os eventos responsáveis pela formação de biofilmes a partir de

microcolônias produtoras de EPS ainda não estão completamente elucidados.

Através de análises genéticas, alguns autores puderam inferir a existência de

diferentes rotas para formação de biofilme dependendo do tipo de microrganismo e

do ambiente (Pratt & Kolter, 1999; O’Toole et al., 2000).

Sinais extracelulares e o sistema “quorum-sensing” foram confirmados, por

Kjelleberg & Molin (2002), como essenciais para a diferenciação de microcolônias

em biofilmes. Davies et al. (1998) ilustraram a importância de acil homoserina

lactonas (acyl-HSLs), um tipo de molécula “quorum-sense”, na formação da estrutura

tridimensional de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. Nesse trabalho, mutantes

lasI incapazes de sintetizarem N-(3-oxododecanoil)-L-homoserina lactona

produziram biofilmes com estrutura tridimensional anormal.

A estrutura tridimensional ou arquitetura do biofilme depende dos tipos de

microrganismos presentes e do ambiente, porém é consenso que os biofilmes

possuem uma estrutura porosa com canais na forma de capilares nos quais ocorre

influxo de água e nutrientes e efluxo de excretas (Costerton et al., 1995; Pratt &

Kolter, 1999).

Segundo Kumar & Anand (1998), o destacamento e a dispersão do biofilme

ocorre através de células isoladas ou pedaços de biofilme que são quebrados e

podem ser transportados para colonizar novas superfícies. Para Costerton et al.

(1999), o destacamento e dispersão de biofilmes devem envolver diversos

mecanismos ainda não completamente conhecidos.

As bactérias que estão crescendo em biofilmes apresentam características

diferentes de quando estão crescendo em suspensão (Costerton et al., 1995;

Stickler, 1999; O’Toole et al., 2000; Morris & Monier, 2003; Jefferson, 2004). Pois,

ocorre nos biofilmes o aumento da síntese de exopolisacarídeos, desenvolvimento

de resistência a antibióticos, aumento da resistência a radiações ultravioleta,

aumento das trocas genéticas, alteração das capacidades biodegradativas e

aumento da produção de metabólitos secundários (O’Toole et al., 2000). Todos

esses fatores tendem a criar um ambiente seguro, protegendo as bactérias contra

condições de estresses presentes na planta hospedeira.

Jacobs et al. (2004) relatam que os mecanismos que aumentam a

resistência a radiações ultravioleta incluem a pigmentação e mecanismos de

reparação do DNA, que protegem as bactérias dos comprimentos de onda UVa (320

a 400 nm) e UVb (290 a 320 nm).

Cada micro-ambiente da planta possui características próprias de radiação,

disponibilidade de nutrientes, química de superfície, influenciando fortemente a

forma e atividade de biofilmes (Morris & Monier, 2003).

O filoplano, por exemplo, apresenta uma variabilidade de ambientes, que

incluem variações topográficas como a superfície da base e do ápice dos tricomas, a

superfície da nervura, os complexos estomáticos, hidatódios, nectários extraflorais,

flanges cuticulares e a superfície da parede periclinal externa das células

epidérmicas propriamente ditas, bem como variações na composição química

desses ambientes. Além disso, as plantas apresentam diferenças morfológicas,

como as várias filotaxias, aumentando a variabilidade de condições ambientais na

superfície foliar (Esau, 1974; Cutter, 1986; Fahn, 1990).

O rizoplano também apresenta uma grande variabilidade ambiental devido,

principalmente, às diferenças físico-químicas no perfil do solo (aeração, umidade,

concentração de gases, luminosidade, temperatura, pH, granulação), e às diferenças

fisiológicas nas regiões radiculares (coifa, meristemática, alongamento, maturação,

colo) que propicia uma heterogeneidade no processo de exsudação (Taiz & Zeiger,

1991; Walker et al., 2003). Através da exsudação de uma grande variedade de compostos, as raízes

talvez possam regular a comunidade microbiana na rizosfera (Walker et al., 2003).

Os flavonóides, por exemplo, exsudados pelas raízes de leguminosas ativam os

genes responsáveis pelo processo de nodulação nas bactérias do gênero Rhizobium

(Peters et al., 1986).

Portanto, é necessário aprofundar os estudos relacionados à diversidade e

localização das bactérias epifíticas do filoplano para gerar informações que possam

auxiliar a compreensão das interações entre planta-microbiota.

2.6. Aplicação de bactérias epifíticas na agricultura e biotecnologia

O estudo de bactérias epifíticas aplicado na agricultura tropical e na

biotecnologia ainda é incipiente, porém, promissor.

Bactérias epifíticas podem ser empregadas na promoção de crescimento e

desenvolvimento vegetal, através da fixação biológica de nitrogênio (Kuklinsky-

Sobral et al., 2004), produção de reguladores de crescimento vegetal como auxinas

(Brandl & Lindow, 1998) e solubilização de fosfato inorgânico (Kuklinsky-Sobral et

al., 2004).

Muitas bactérias epifíticas também possuem atividade antagônica contra

bactérias e fungos fitopatogênicos, podendo, potencialmente, serem empregadas

como agentes de controle biológico (May et al., 1997; Postmaster et al., 1997;

Benhamou et al., 1998; Stromberg et al., 2000; Özaktan & Bora, 2004; Singh et al.,

2004; Byrne et al., 2005; Han et al., 2005).

Um exemplo bem sucedido de controle biológico é a aplicação de

preparações liofilizadas, já disponíveis no mercado americano, de Pseudomonas

fluorescens estirpe A506 e Pantoea agglomerans C9-1, em flores de macieira e

pereira inibindo a colonização epifítica da bactéria fitopatogênica Erwinia amylovora

(Lindow & Leveau, 2002). A utilização dessa tecnologia reduz a necessidade de

aplicações contínuas de agroquímicos.

Outro exemplo, também aplicado na agricultura de clima temperado, é a

utilização de bactérias epifíticas (ice- bactéria) que competem com bactérias

nucleadoras de gelo (ice+ bactéria), evitando que as últimas incitem na planta

hospedeira injúrias por baixas temperaturas (Lindow & Leveau, 2002).

As bactérias epifíticas nucleadoras de gelo, como a Pseudomonas syringae,

apresentam um alto valor biotecnológico, sendo utilizadas para produção artificial de

neve, e são potencialmente aplicáveis em indústrias de alimentos e na climatologia

objetivando aumento da pluviosidade e controle das chuvas de granizo (Drainas et

al., 1995).

Outro tipo de bactérias epifíticas que potencialmente podem ser

empregadas na biotecnologia são as produtoras de biosurfactantes, que alteram a

permeabilidade da superfície foliar, visando obter um ambiente mais úmido e

propício ao desenvolvimento microbiano (Boureau et al., 2004; Schreiber et al.,

2005).

O estudo de bactérias epifíticas também é essencial para a sanidade

alimentar, uma vez que diversas enfermidades que afetam os seres humanos são

decorrentes da ingestão de frutas e verduras contaminadas superficialmente por

bactérias. Albrecht et al. (1995) verificaram que amostras de alface, tomate, brócolis

e couve-flor coletados em um mercado local apresentavam coliformes a 105 – 107

UFC por grama do produto. Brandl & Mandrell (2002) relataram a capacidade de

Salmonella enterica persistir no filoplano de coentro (Coriandrum sativum L.).

Rayner et al. (2004) confirmaram a prevalência de bactérias crescendo

como biofilmes na superfície de alimentos frescos, como tomate, cenoura e

cogumelos, logo, apresentando uma maior resistência aos processos de desinfecção

e representando uma real preocupação para as indústrias de alimentos (Poulsen,

1999; Kumar & Anand, 1998).

2.7. Anatomia vegetal e microscopia aplicada ao estudo das interações entre plantas e bactérias

A anatomia vegetal é o ramo da botânica que estuda a estrutura interna dos

organismos vegetais (Esau, 1974; Cutter, 1986; Fahn, 1990; Appezzato-da-Glória &

Carmello-Guerreiro, 2003), podendo ser uma ciência apenas descritiva, como

também geradora de valiosas informações sobre o desenvolvimento vegetal e sobre

as associações da planta com os fatores bióticos e abióticos.

Logo, a anatomia vegetal, pode ser aplicada em diversos estudos, como,

por exemplo, na taxonomia e sistemática. Os caracteres anatômicos podem se

constituir em bons parâmetros taxonômicos, tanto pelo seu valor diagnóstico como

unificador, dependendo do táxon analisado (Solereder, 1908; Metcalfe & Chalk,

1950). São muitos os trabalhos na literatura, que utilizam a anatomia como base

para identificação de diversas famílias de plantas, como se verifica nos trabalhos

mais recentes descritos para as Asteraceae (Sajo & Menezes, 1994; Castro et al.,

1997), Eriocaulaceae (Castro & Menezes, 1995; Scatena et al., 1999; Coan et al.,

2002), Lauraceae (Moraes & Paoli, 1999), Leguminosae (Mendes & Paviani, 1997),

Orchidaceae (Oliveira & Sajo, 2001; Zanega-Godoy & Costa, 2003), Rubiaceae

(Mantovani et al., 1995; Klein et al., 2004; Moraes, 2005); Simaroubaceae

(Franceschinelli & Yamamoto, 1993), Xyridaceae (Sajo et al., 1995), entre outros.

Além da identificação e descrição das espécies vegetais, a anatomia

vegetal, aliada às técnicas microscópicas, pode ser utilizada de forma promissora

para compreender as interações entre plantas e microrganismos.

Diferente dos métodos de isolamento, que apenas geram evidências

indiretas da presença de bactérias no interior das plantas, a microscopia pode ser

considerada um método direto no estudo da interação entre plantas e microbiota,

pois o microrganismo é visualizado em seu habitat natural. Geram-se informações

sobre a quantidade, localização e dinâmica das bactérias nos microecosistemas

vegetais, bem como a possibilidade de caracterizar a anatomia e ultraestrutura da

associação bactéria-planta. Segundo Reinhold-Hurek & Hurek (1998), os melhores

resultados microscópicos para caracterizar a interação endofítica são obtidos

utilizando materiais embebidos em resina, nos quais as bactérias são fisicamente

fixadas em sua posição original.

Atualmente, com o avanço das técnicas imunológicas e de biologia

molecular, há a possibilidade do microscópio gerar informações mais completas que

a simples localização das bactérias no tecido vegetal, e envolvem o posicionamento

taxonômico da bactéria in situ, detecção específica de uma estirpe ou da expressão

de genes e biomacromoléculas envolvidas na interação endófito-planta (Baldani et

al., 1998).

3. Objetivos

3.1. Objetivo geral

O presente trabalho teve como objetivo caracterizar estruturalmente a

associação natural epifítica e endofítica entre microrganismos e plantas de diferentes

famílias botânicas, localizadas em um ambiente agrícola tropical.

3.2. Objetivos específicos

- Descrever os locais preferenciais de colonização e distribuição de

microrganismos associadas à superfície de raízes e da lâmina foliar de

diferentes espécies de plantas.

- Descrever a estrutura da associação endofítica entre microrganimos e os

tecidos da raiz e da lâmina foliar de diferentes espécies de plantas.

- Relacionar características anatômicas da lâmina foliar de diferentes espécies

de plantas com o padrão de colonização, freqüência e ocorrência das

bactérias.

4. Material e Métodos

4.1. Caracterização agroecológica do local de coleta

As amostras foram coletadas na propriedade rural Pedra Lisa, localizada às

margens da rodovia Alegre – Cachoeiro do Itapemirim (BR 482), município de

Jerônimo Monteiro, ES (Fig.1), em Junho de 2004.

Este município está situado na região sul do Estado do Espírito Santo a 20º

47’25’’ de latitude sul e 41º23’48’’ de longitude oeste, distando 147 km da capital

Vitória. O clima da região segundo a classificação de Köppen é Aw, quente e

chuvoso, sem estação fria e com período seco. A precipitação média anual é de

958,7 mm, apresentando uma estação chuvosa de Novembro a Abril e uma estação

seca de Maio a Setembro. A temperatura média anual é de 23,2 ºC, sendo a média

dos meses mais quentes, de Dezembro a Março, de 30 ºC, e a dos meses mais

frios, de Junho a Agosto, de 18,1 ºC. Predominam, no município, os solos

classificados como Latossolos Vermelho-Amarelos Distróficos, com fertilidade

variando de baixa a média e pH em torno de 5,0 (ES/SAEP, 1993; EMBRAPA,

1999).

A gênese dos solos nessa região também resulta, em alguns casos, na

formação de outras classes de solos, principalmente através de cortes originados

nos topos e encostas, pela ação do intemperismo, seguido de deposições. As

deposições podem ocorrer nos fundos dos vales e sofrerem influência do lençol

freático, originando solos Hidromórficos ou então serem depositados em áreas

planas nas margens de rios ou córregos, ou ainda, formarem solos mais férteis,

denominados “terraços” que podem originar a classe dos Argissolos como os

Argissolos Vermelho-Amarelos Eutróficos (EMBRAPA, 1999).

A região era originalmente coberta por Floresta Atlântica (Ombrófila Densa),

tendo sido no século XIX, devastada para implantação de atividades agropecuárias,

destacando-se a cafeicultura, pecuária e atualmente a fruticultura (Ambiente Brasil,

2004).

A propriedade rural possui 497.557 m2 e é classificada como uma pequena

empresa rural, sendo manejada pelos proprietários, juntamente com parceiros e

trabalhadores sazonais, como a maioria das propriedades da região.

Figura 1. Mapa do Estado do Espírito Santo, destacando o município de Jerônimo Monteiro,

adaptado de GuiaNet (2005).

4.1.1. Caracterização dos diferentes agroecossistemas

As amostras foram coletadas de plantas cultivadas nos agroecossistemas:

pomar, horta, encosta, pastagem, campos (milharal, cafezal), e também de plantas

nativas (Tabela 3). Ressalta-se que não houve aplicação de agrotóxicos.

O pomar foi implantado em solos de terraço, Argissolo Vermelho-Amarelo

Eutrófico, realização de aplicação esporádica de adubos químicos e esterco,

manejo de plantas concorrentes através de capinas, realização de poda quando

necessário, relevo plano.

Na horta, os canteiros foram construídos em Argissolo Vermelho-Amarelo

Eutrófico, mantidos na capacidade de campo, realização de aplicação de esterco e

palha de café, rotação de culturas, manejo de plantas concorrentes através de

capina e catação, relevo plano.

A encosta apresentava solo classificado como Latossolo Vermelho-Amarelo

Distrófico, realização do preparo do solo para a implantação da cultura de eucalipto

(abertura de covas, calagem, adubação química, controle de formigas), relevo

íngreme.

Jerônimo Monteiro

A pastagem nativa de capim pernambuco (Paspalum mandiocanum) foi

substituída por capim braquiarão (Brachiaria brizantha) e colonião (Panicum

maximum), presença esporádica de capim braquiaria (Brachiaria decumbens),

capim jaraguá (Hyparrhenia rufa) e capim elefante (Pennisetum purpureum). Solos

classificados como Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico na parte mais baixa do

terreno e Latossolo Vermelho-Amarelo Distrófico nas encostas e nos morros. O

único manejo é a limpeza dos pastos. Lotação em torno de 5 a 10 unidades animal

(gado) por hectare.

O milharal foi implantado em Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico, preparo

do solo realizado apenas com grade aradora. Rotacionado com a cultura do feijão e

consorciado com a cultura de abóbora. Aplicação de sulfato de amônio quando

necessário.

O cafezal foi implantado em Argissolo Vermelho-Amarelo Eutrófico. Cafeeiro

conillon adulto, produção aproximada de 15 a 20 L de café cereja por planta. Poda

de condução, 4 - 6 hastes por planta (multicaule). Realização de calagem,

adubação química (NPK 25-05-20, contendo B e Zn) no início da estação chuvosa,

retorno da palhada.

4.2. Material botânico

Foram coletadas amostras de raízes e parte aérea de quarenta e sete

espécies vegetais sem sintomas visíveis de doenças, pertencentes a vinte e oito

famílias botânicas e identificadas conforme a tabela 3.

As amostras foram retiradas de raízes com coloração clara, localizadas na

profundidade entre 0 a 10 cm da superfície do solo. Para coleta da parte aérea,

amostras do terço médio da lâmina foliar foram retiradas de folhas completamente

expandidas localizadas no terceiro ou quarto nó.

Durante a coleta, as amostras foram imediatamente seccionadas em

segmentos de 1 a 2 cm de comprimento (raízes e lâmina foliar) por 0,5 a 1 cm de

largura (lâmina foliar). As secções foram obtidas utilizando uma navalha de aço

nova, através de cortes a mão livre sobre uma placa de parafina, estando as

amostras imersas na solução fixadora. O fixador primário utilizado foi uma solução

de glutaraldeído 2,5 %, formaldeído 4 %, em tampão fosfato 0,1 mol / L (pH 7,0).

As amostras fixadas foram transportadas para o Laboratório de Biologia

Celular e Tecidual do Centro de Biociências e Biotecnologia – UENF e foram

mantidas a 4 ºC.

Tabela 3. Descrição das espécies botânicas coletadas para análise de colonização microbiana.

Família Botânica Nome Científico (nome vulgar) Observações durante a coleta

Anacardiaceae Spondias mombin L. (cajazeiro) Arbórea, 3 m de altura, presença de

frutos, cultivada no pomar

Mangifera indica L. (mangueira haden) Arbórea, 2,5 m de altura, fase

vegetativa, cultivada no pomar

Annonaceae Annona muricato L. (graviola) Arbórea, 3,0 m de altura, presença de


Apiaceae Petroselium crispum Hill (salsinha) Herbácea, 0,3 m de altura, cultivada

na horta

Arecaceae Cocos nucifera L. var. anã

(coqueiro anão)

Arbórea, 2,0 m de altura, presença de


Colocasia antiquorum Schott. (taioba) Herbácea, 0,5 m de altura, fase


Asteraceae Bidens pilosa L. (picão) Herbácea, 1,0 m de altura, presença

de botões florais, nativa

Chicorium intybus L. (almeirão roxo) Herbácea, 0,3 m de altura, fase

vegetativa, cultivada na horta

Lactuca sativa L. (alface americana) Herbácea, 0,3 m de altura, fase


Porophyllum ruderale (Jacq.) Cass.

(arnica)

Arbustiva, 1,5 m de altura, fase

vegetativa, nativa

Balsaminaceae Impatiens walleriana L.

(maria-sem-vergonha)

Herbácea, 0,5 m de altura, fase

vegetativa, planta ornamental

Brassicaceae Brassica oleraceae L.

(couve manteiga)



Caricaceae Carica papaya L. (mamoeiro papaya) Arbustiva, 2,0 m de altura, fase


Crassulaceae Kalanchoë brasiliensis Camb. (saião) Herbácea, 0,5 m de altura, fase

vegetativa, nativa

Cucurbitaceae Cucumis sativus L. (pepino) Herbácea, 1,0 m de altura, presença

de frutos, cultivada na horta

Curcubita moschata Duchesne

(abóbora jacaré)


vegetativa, consorciada com milho


Euphorbiaceae Manihot esculenta Crantz

(mandioca cacau)

Arbustiva, 1,5 m de altura, presença

de botões florais, horta

Fabaceae Cajanus cajan (L.) Millsp.

(feijão-guandu)


vegetativa, nativa

Lamiaceae Leonurus sibiricus L. (macaé) Herbácea, 1,0 m de altura, fase

vegetativa, nativa

Plectranthus barbatus Andrews (boldo) Herbácea, 1,0 m de altura, fase

vegetativa, nativa

Liliaceae Allium schoenoprasum L. (cebolinha) Herbácea, 0,4 m de altura, fase


Malvaceae Abelmoschus esculentus (L.) Moench

(quiabo)

Herbácea, 1,5 m de altura, presença

de frutos, localizada no pomar

Hibiscus rosa-sinensis L. (hibisco) Arbórea, 2,0 m de altura, presença de

flores, planta ornamental

Malpighiaceae Malpighia glabra L. (acerola) Arbustiva, 2,0 m de altura, presença

de frutos, cultivada no pomar

Meliaceae Cedrela fissilis Vell. (cedro) Arbórea, 3,0 m de altura, fase

vegetativa, nativa

Myrtaceae Myrciaria cauliflora Berg.

(jabuticabeira)

Arbórea, 1,5 m de altura, fase


Corymbia citriodora (Hook)

(eucalipto citriodora)

Arbórea, 3,5 m de altura, fase

vegetativa, cultivada na encosta

Psidium guajava L. (goiabeira) Arbórea, 2,0 m de altura, presença de


Moraceae Morus nigra L. (amoreira) Arbustiva, 2,5 m de altura, fase

vegetativa, localizada no pomar

Musaceae Musa sp. cv nanica (bananeira nanica) Arbórea, 2,0 m de altura, presença de


Oxalidaceae Averrhoa carambola L. (carambola) Arbórea, 1,5 m de altura, fase


Poaceae Brachiaria brizantha (Hochst.) Staff

(capim braquiarão)


vegetativa, pastagem

Brachiaria decumbens Staff

(capim braquiaria)



Hyparrhenia rufa (Nees.) Stapf

(capim jaraguá)



Panicum maximum Jacq.

(capim colonião)



Pennisetum purpureum Schumach

(capim elefante)




Zea mayz L. var. palha roxa

(milho palha roxa)

Herbácea, 1,5 m de altura, presença

de flores, milharal

Rubiaceae Coffea canephora Pierre var. conillon

(cafeeiro conillon)

Arbustiva, 1,5 m de altura, fase

vegetativa, cafezal

Rutaceae Citrus aurantifolia Swingle var. taiti

(limoeiro taiti)



Citrus limonia Osbeck (limoeiro cravo) Arbórea, 1,5 m de altura, fase

vegetativa, cultivada na encosta

Citrus reticulata Blanco

(tangerina poncã) Arbórea, 1,5 m de altura, fase


Citrus sinensis L. Osbeck

(laranjeira pêra)



Solanaceae Capsicum annum L. (pimentão) Herbácea, 0,15 m de altura, fase


Capsicum frutescens L.

(pimenta malagueta)

Arbustiva, 1,0 m de altura, presença

de frutos, nativa

Solanum gilo Raddi (jiló) Arbustiva, 1,5 m de altura, presença

de frutos, pomar

Verbenaceae Duranta repens L. (pingo-de-ouro) Arbustiva, 1,0 m de altura, fase

vegetativa, planta ornamental

Vitaceae Vitis vinifera L. (videira) Arbórea, 1,5 m de altura, presença de


4.3. Processamento de amostras para microscopia ótica

As amostras foram processadas para microscopia ótica conforme James et

al. (1994), com algumas modificações.

Uma parte do material fixado foi transferida para microtubos de 2,0 mL e

pós-fixado com tetróxido de ósmio 1 % em tampão fosfato 0,1 mol / L por 2 horas.

As amostras foram lavadas 2 vezes por 15 minutos em tampão fosfato 0,1

mol / L e desidratadas em série etanólica ou acetônica crescente (30, 50, 70, 90, 3 x

100 % etanol ou acetona em água v/v), permanecendo 30 minutos em cada mistura.

Após a desidratação as amostras foram embebidas em resina Unicryl ®,

durante 7 dias, sendo mantidas em geladeira.

Para as amostras das espécies Mangifera indica, Manihot esculenta,

Plectranthus barbatus, Hibiscus rosa-sinensis, Malpighia glabra, Cedrela fissilis,

Corymbia citriodora, Psidium guajava, Averrhoa carambola, Cocos nucifera,

Hyparrhenia rufa, Panicum maximum, Coffea canephora, Citrus aurantifolia, Citrus

reticulata, Citrus sinensis e Duranta repens, foi necessário substituir o álcool ou

acetona gradualmente pela resina.

Amostras individuais foram transferidas com pinça de ponta fina para

cápsulas transparentes de gelatina contendo a resina e polimerizadas em estufa a

60º C por 12 horas.

As cápsulas polimerizadas foram selecionadas, levadas à lupa do

ultramicrótomo Reichert Ultracuts Ultramicrotome, lapidadas a mão livre utilizando

lâminas de aço para obtenção de blocos trapezoidais contendo a amostra. A partir

desses blocos foram obtidas seções semifinas (0,8 a 1,0 µm) utilizando facas de

vidro.

Os cortes semifinos foram colocados sobre lâminas de vidro contendo água,

fixados em placa metálica aquecida e contrastadas com uma solução contendo azul

de toluidina 1 %, tetraborato de sódio 0,1 % em água destilada, para observação no

microscópio ótico Axioplan - Zeiss.

As imagens foram capturadas em um microscópio ótico Axioplan – Zeiss,

acoplado a um sistema de aquisição de imagem digital, câmera ZVS-47EC,

utilizando o programa Analysis®.

4.4. Processamento de amostras para microscopia eletrônica de varredura

As amostras foram processadas para microscopia eletrônica de

varredura conforme James et al. (1994), com algumas modificações.

Amostras de raízes e das lâminas foliares foram fixadas e pós-fixadas da

mesma forma como descrito no item 4.3. Depois, foram lavadas por três vezes em

tampão fosfato 0,1 mol / L e desidratadas em série acetônica crescente (30, 50, 70,

90, 3 x 100 % etanol ou acetona em água v/v), permanecendo 30 minutos em cada

mistura.

Em seguida, amostras selecionadas foram transferidas para o equipamento

Critical Point Drying Apparatus (Mod CPD 030, Bal-tec) e após secagem, foram

montadas em “stub” de alumínio e metalizadas com ouro utilizando o Automatic

Sputter Coater (SCD 050, Bal-tec).

As amostras foram observadas a 15 - 25 kv, no microscópio eletrônico de

varredura DSEM 962 - Zeiss.

Para cada amostra foliar foram observados fragmentos de 0,5 cm de largura

por 1,0 cm de comprimento das superfícies adaxiais e abaxiais. As observações

foram realizadas por toda superfície das amostras, gerando dados sobre ocorrência,

freqüência e localização das bactérias sobre os diversos caracteres anatômicos

foliares, assim como o modo de adesão, agregação e morfologia bacteriana.

5. Resultados

Em todas as espécies vegetais coletadas, isentas de sintomas de doença,

foi observada colonização microbiana. Dentre os microrganismos, as bactérias foram

os colonizadores mais freqüentes, sendo observadas na superfície de todas as

amostras das lâminas foliares. Fungos também foram observados no filoplano na

forma de esporos e hifas fúngicas e nas raízes em associações micorrízicas.

A colonização bacteriana variou entre as famílias botânicas, entre as

espécies vegetais pertencentes ao mesmo táxon, entre os órgãos estudados (raiz,

folha) de um mesmo sistema biológico e entre os tecidos vegetais de um mesmo

órgão. A variação também ocorreu entre e dentro dos diferentes agroecossistemas

(pomar, horta, encosta, pastagem, campos). No entanto, com relação à colonização

e estabelecimento bacteriano epifítico no filoplano algumas semelhanças puderam

ser constatadas, conforme será descrito.

5.1. Bactérias epifíticas nas amostras da lâmina foliar

Através da microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura foi

visualizado colonização bacteriana epifítica em todas as amostras das lâminas

foliares.

O sumário dos resultados obtidos através da microscopia eletrônica de

varredura foram baseados em características microbiológicas da superfície abaxial,

acrescentando-se as comparações realizadas entre ambas superfícies (Tab. 4 e 5),

e em características anatômicas das lâmina foliares (Tab. 6 e 7).

Foi possível separar dois grupos de plantas que apresentaram

características distintas, um com uma baixa freqüência de bactérias colonizando o

filoplano (Tab. 4 e 6) e outro com uma alta freqüência (Tab. 5 e 7). A separação

desses dois grupos foi obtida observando-se toda superfície epidérmica foliar (de no

mínimo 50.000.000 µm2 cada amostra adaxial e abaxial) através do microscópio

eletrônico de varredura com aumento de 3000 x.

Tabela 4. Características microbiológicas do filoplano das espécies vegetais com baixa freqüência de bactérias.

Bactéria Família botânica

Espécie vegetal

Localização(1) Distribuição(2) Forma(3)

Fungo(4)

Comparação com a

superfície epidérmica

adaxial

Apiaceae Petroselium crispum F, Ce S, M Ba + Similar

Araceae Colocasia antiquorum - - - + M, F, Ba

Arecaceae Cocos nucifera F, Ce S, M Ba + inclui F, N, S

Asteraceae Chicorium intybus F, Ce S Ba + bactéria não observada

Lactuca sativa F S Ba - Inclui M e T

Porophyllum ruderale F, T S, M Ba + Similar

Balsaminaceae

Impatiens walleriana F, Ce S Ba ++ Similar

Brassicaceae Brassica oleraceae F S Ba ++ bactéria não observada

Caricaceae Carica papaya F S Ba + inclui M

Crassulaceae Kalanchoë brasiliensis F S Ba - bactéria não observada

Euphorbiaceae Manihot esculenta F, T, N S, M Ba - similar, inclui Co

Liliaceae Allium schoenoprasum - - Ba + bactéria não observada

Myrtaceae Myrciaria cauliflora F S Ba +++ bactéria não observada

Musaceae Musa sp. F S Ba +++ Similar

Oxalidaceae Averrhoa carambola F S Ba + bactéria não observada

Poaceae Brachiaria brizantha Ce, T S, M Ba, Co + Inclui F

Brachiaria decumbens F, T S, M Ba + somente F

Hyparrhenia rufa F S Ba ++ bactéria não observada

Panicum maximum F S Ba + bactéria não observada

Pennisetum purpureum F, T S, M Ba, Co + bactéria não observada

Zea mayz F S Ba + inclui T

Solanaceae Capsicum annum F, Ce S Ba + Similar

Verbenaceae Duranta repens T S Ba ++ inclui F, M (1) Localização: refere-se aos locais preferenciais de colonização bacteriana; F, flanges cuticulares; T, tricomas; Ce, complexo estomático; N, nervura. (2) Distribuição: distribuição das células bacterianas; S, solitárias; M, microcolônias; B, biofilmes. (3) Forma: forma da célula bacteriana; Ba, bastonete; Co, cocos. (4) Fungo: refere-se à freqüência fúngica; +++, alta freqüência; ++, média freqüência; +, baixa freqüência; -, ausente.

Tabela 5. Características microbiológicas do filoplano das espécies vegetais com alta freqüência de bactérias.

Bactéria Família botânica Espécie vegetal

Localização(1) Distribuição(2) Forma(3) Fungo(4)

Comparação com a

superfície epidérmica

adaxial

Anacardiaceae Spondias mombin Todos os locais S, M, B Ba +++ similar

Mangifera indica F S, M Ba +++ similar

Annonaceae Annona muricata Todos os locais M, B Ba +++ S e M em

baixa frequência

Asteraceae Bidens pilosa Todos os locais S, M Ba, Co + similar

Cucurbitaceae Cucumis sativus F, T S, M Ba + similar

Cucurbita moschata F, T, N S, M Ba +++ similar

Fabaceae Cajanus cajan F, T, Ce S, M, B Ba - similar

Lamiaceae Leonurus sibiricus Todos os locais S, M, B Ba + baixa frequência

Plectranthus babatus Todos os locais S, M Ba + baixa frequência

Malvaceae Abelmoschus esculentus F, T, Ce S, M, B Ba + similar

Hibiscus rosa-sinensis F, T S, M Ba + similar

Malpighiaceae Malpighia glabra F, Ce, N S, M Ba ++ similar

Meliaceae Cedrela fissilis Todos os locais S, M, B Ba, Co +++ similar

Myrtaceae Corymbia citriodora F S, M Ba +++ inclui F, M, B

Psidium guajava F, T, N S, M Ba, Co +++ similar

Moraceae Morus nigra F, T, N S, M, B Ba +++ similar

Rubiaceae Coffea canephora F, Ce S, M Ba, Co ++ similar

Rutaceae Citrus aurantifolia F, Ce, N S, M, B Ba, Co ++ inclui B

Citrus limonia F, Ce S, M Ba +++ similar

Citrus reticulata F M, B Ba +++ similar

Citrus sinensis F, Ce S, M Ba +++ similar

Solanaceae Citrus frutescens F, T S, M Ba +++ similar

Solanum gilo T S Ba ++ inclui M, F

Vitaceae Vitis vinifera F, Ce S Ba ++ inclui M (1) Localização: refere-se aos locais preferenciais de colonização bacteriana; F, flanges cuticulares; T, tricomas; Ce, complexo estomático; N, nervura. (2) Distribuição: distribuição das células bacterianas; S, solitárias; M, microcolônias; B, biofilmes. (3) Forma: forma da célula bacteriana; Ba, bastonete; Co, coco. (4) Fungo: refere-se a freqüência fúngica; +++, alta freqüência; ++, média freqüência; +, baixa freqüência; -, ausente.

Tabela 6. Características anatômicas foliares das espécies vegetais com baixa freqüência de bactérias.

Epiderme Mesofilo Tecido vascular

Família botânica

Espécie vegetal Contor-

no(1)

Cera epicuticu-

lar(2)

Indu-mento(3)

Célula especia-lizada (4)

Estô-mato (5) Forma(6) Tipo de

feixe(7)

Apiaceae Petroselium crispum Si - - - Anf Do Co

Araceae Colocasia antiquorum R - - - Hip Do Co

Arecaceae Cocos nucifera R + - - Hip Do Co

Asteraceae Chicorium intybus Si plaquetas - - Anf Do Co

Lactuca sativa Si - Tt, Ts - Anf Ho Co

Porophyllum ruderale Si - Tt, Ts - Anf Do Co

Balsaminaceae Impatiens walleriana Si - - - Hip Do Co

Brassicaceae Brassica oleraceae R - - - Anf Do Co

Caricaceae Carica papaya R plaquetas

em rosetas

- - Hip Do Co

Crassulaceae Kalanchoë brasiliensis R - - - Hip Ho nd

Euphorbiaceae Manihot esculenta R + em Eb

Tt na nervura e

Ts no limbo

- Anf Do Co

Liliaceae Allium schoenoprasum R plaquetas - - Anf Ho nd

Myrtaceae Myrciaria cauliflora R - - - Hip nd nd

Musaceae Musa sp. R + - Anf Do Co

Oxalidaceae Averrhoa carambola R plaquetas

Tt na nervura de Ed e Tt e Ts em Eb

- Hip nd nd

Poaceae Brachiaria brizantha R - Tt Cb, Cs Anf Ho Co

Brachiaria decumbens R - Tt Cb, Cs Anf Ho Co

Hyparrhenia rufa R + Tt Cb, Cs Anf Ho Co

Panicum maximum R - Tt Cb, Cs Anf Ho Co

Pennisetum purpureum R - Tt Cb, Cs Anf Ho Co

Zea mayz R - - Cb, Cs Anf Ho Co

Solanaceae Capsicum annum Si - - - Anf Do Co

Verbenaceae Duranta repens R - Tt, Ts - nd Do Co (1) Contorno: contorno das paredes anticlinais das células epidérmicas; R, reto; Si, sinuoso. (2) Cera epicuticular: tipo de cera epicuticular; plaquetas; plaquetas em rosetas; +, cera epicuticular diferente de filme, porém não nomeada; -, cera epicuticular tipo filme ou ausente. (3) Indumento: Tt, tricoma tector; Ts, tricoma secretor. (4) Célula especializada: Cs, célula silicosa, Cb, célula buliforme. (5) Estômato: localização do complexo estomático; Anf, anfiestomático; Hip, hipoestomático. (6) Forma: forma do mesofilo: Do, dorsiventral; Ho, homogêneo. (7) Tipo de feixe: Co, colateral. Abreviações: Ed, epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; nd, não disponível.

Tabela 7. Características anatômicas foliares das espécies vegetais com alta freqüência de bactérias.

Epiderme Mesofilo Tecido vascular Família

botânica Espécie vegetal Contor-

no(1)

Cera epicuticu-

lar (2)

Indu-mento(3)

Célula especial-lizada(4)

Estô-mato(5) Forma(6) Tipo de

feixe(7)

Anacardiaceae Spondias mombin R - - - Anf (em Ed na N) Do Co

Mangifera indica R + - - Hip Is Co

Annonaceae Annona muricata R - Tt e Ts emEb - Hip Do Co

Asteraceae Bidens pilosa Si - Tt, Ts - Anf Do Co

Cucurbitaceae Cucumis sativus nd - Tt, Ts (muito na N)

- Anf Do Co

Cucurbita moschata R - Tt, Ts (muito na N)

- Anf Do nd

Fabaceae Cajanus cajan R - Tt, Ts - Hip Do Co

Lamiaceae L.eonurus sibiricus Si - Tt, Ts - Hip Do Co

Plectrnthus babatus nd - Tt, Ts - Hip Do Co

Malvaceae Abelmoschus esculentus R - Tt, Ts Cm Anf Do Co

Hibiscus rosa-sinensis R - Ts Cm Hip Do Co

Malpighiaceae Malpighia glabra R - - - Hip Do Co

Meliaceae Cedrela fissilis R - Tt, Ts (Ts em

Eb) - Hip Do nd

Myrtaceae Corymbia citriodora R - - - Anf Ho Ac, Co

Psidium guajava R - Tt (em Ed só na N)

- Hip Ho Ac

Moraceae Morus nigra R - Tt, Ts Cm Hip Ho Co

Rubiaceae Coffea canephora R - - - Hip nd nd

Rutaceae Citrus aurantifolia R - - Cm Anf Do Ac, Co

Citrus limonia R - - Cm Anf Do Co

Citrus reticulata R - - Cm Hip Do Co

Citrus sinensis R - - Cm Hip Do Co

Solanaceae Citrus frutescens Si - Tt na N e Ts no limbo

- Anf Do Ac, Co

Solanum gilo Si - Tt, Ts - Anf Do Ac, Co

Vitaceae Vitis vinifera R - Tt - Hip Do Co

(1) Contorno: contorno das paredes anticlinais das células epidérmicas; R, reto; Si, sinuoso. (2) Cera epicuticular: tipo de cera epicuticular; +, cera epicuticular diferente de filme, porém não nomeada; -, cera epicuticular tipo filme ou ausente. (3) Indumento: Tt, tricoma tector; Ts, tricoma secretor. (4) Célula especializada: Cm, célula mucilaginosa epidérmica ou sub-epidérmica. (5) Estômato: localização do complexo estomático; Anf, anfiestomático; Hip, hipoestomático. (6) Forma: forma do mesofilo: Do, dorsiventral; Is, isobilateral; Ho, homogêneo. (7) Tipo de feixe: Co, colateral; Ac, anficrival. Abreviações: Ed, epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; N, nervura; nd, não disponível.

Apesar das variações estruturais e microbiológicas existentes entre, e mesmo

dentro, desses dois grupos de plantas, semelhanças e padrões no estabelecimento

bacteriano epifítico no filoplano puderam ser constatadas.

Na superfície foliar de todas as espécies vegetais estudadas houve o

predomínio de bactérias no formato de bastonete (Fig. 2A e B), seguido por 17 %

das espécies vegetais colonizadas também por bactérias no formato de cocos (Fig.

3D) (Tab. 4 e 5).

As bactérias epifíticas estavam aderidas à superfície foliar por adesão apolar

(Fig. 2A e B), ou seja, paralela à superfície (Olivares, 1997). As bactérias epifíticas

se apresentavam distribuídas pelo filoplano como células solitárias (Fig. 2A e B), ou

formando microcolônias (Fig. 2C e D), ou estruturadas em biofilmes (Fig. 2E e F).

Foram classificados como microcolônias, o conjunto de células

espacialmente próximas, porém, não necessariamente, recobertas por uma matriz

extracelular comum. As microcolônias variaram bastante quanto ao número de

células presentes, estando na mesma classificação microcolônias mais populosas,

como em Capsicum frutescens (Fig. 2C e D) e microcolônias menos populosas,

como em Leonurus sibiricus (Fig. 3C). Apesar de algumas microcolônias não se

apresentarem totalmente recobertas por uma matriz extracelular comum, as

bactérias, muitas vezes, estavam em contato uma com as outras, e aderidas à

parede periclinal externa das células e de apêndices epidérmicos, através de

microfibrilas, como observado em Abelmoschus esculentus (Fig. 3A) e Brachiaria

decumbens (Fig. 8A). Ressalta-se que a presença de uma matriz extracelular

recobrindo as bactérias, ao invés de apenas microfibrilas, foi mais freqüente em

microcolônias mais populosas.

Foram classificados como biofilmes, populações microbianas numerosas,

cobertas por uma matriz extracelular comum, com bactérias aderidas umas as

outras e a superfície vegetal. As bactérias estruturadas em biofilmes foram

visualizadas apenas nas plantas pertencentes ao grupo com maior freqüência de

bactérias (Tab. 5), como, por exemplo, em Spondias mombin (Fig. 2E e F), Cucumis

sativus (Fig. 7A), Cucurbita moschata (Fig. 6A), Leonurus sibiricus (Fig. 7C - E),

Citrus aurantifolia (Fig. 9D, E), Citrus reticulata (Fig. 9A - C) e Citrus frutescens (Fig.

5A, B), enquanto no grupo de plantas com baixa freqüência de bactérias, células

solitárias e microcolônias foram predominantes (Tab. 4).

A maioria dos biofilmes estava localizada sobre a parede periclinal externa

das células epidérmicas propriamente ditas, sendo formados por associações entre

fungos e bactérias. Biofilme exclusivamente bacteriano também foi visualizado na

base do tricoma secretor de Leonurus sibiricus (Fig. 7C - E). Em Citrus reticulata

(Fig. 9A), os biofilmes foram formados sempre em locais onde hifas fúngicas

estavam presentes, não sendo encontrado biofilme exclusivamente bacteriano.

Com o auxílio da microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura,

foi constatado que as bactérias epifíticas não se distribuem aleatoriamente no

filoplano, existem locais preferenciais de estabelecimento e colonização microbiana

que estão diretamente relacionados às características anatômicas foliares da planta

hospedeira.

As características micromorfológicas e anatômicas das lâminas foliares

observadas no presente estudo foram: contorno das paredes anticlinais das células

epidérmicas (reto ou sinuoso), tipo de cera epicuticular (classificada conforme

Barthlott et al., 1998), presença de tricomas tectores e tricomas secretores, presença

de células especializadas da epiderme (ex: silicosas, buliformes, mucilaginosas),

localização dos estômatos na lâmina foliar (folha anfiestomática, hipoestomática e

epiestomática), forma do mesofilo (dorsiventral, isobilateral, homogêneo), tipo de

feixe vascular (colateral, bicolateral, anficrival, anfivasal) (Tabelas 6 e 7).

As bactérias não estavam distribuídas homogeneamente no filoplano. A

topografia foliar apresentava locais preferenciais de estabelecimento bacteriano, que

incluiam as flanges cuticulares (Fig. 3A - D), os complexos estomáticos (Fig. 4A - D),

as nervuras (Fig. 5A - F), os tricomas tectores (Fig. 6A - F) e os tricomas secretores

(Fig. 7A - H).

Em todas as amostras foliares foram visualizadas, em microscopia

eletrônica de varredura, bactérias solitárias ou em microcolônias, colonizando as

flanges cuticulares. Em Abelmoschus esculentus (Fig. 3 A) pode ser observado

bactérias aderidas as paredes periclinais externas de células epidérmicas adjacentes

e a outras bactérias através de microfibrilas. Tanto bactérias como fungos

colonizavam as flanges como observado no filoplano de Vitis vinifera (Fig. 3B). Em

Leonurus sibiricus (Fig. 3C) as bactérias foram visualizadas nas flanges, cujo

contorno é sinuoso. Em Psidium guajava (Fig. 3D) tanto bactérias no formato de

bastonete quanto no formato de cocos habitavam as flanges, cujo contorno é reto.

Os complexos estomáticos também podem ser considerados

microecossistemas explorados por diferentes microrganismos, como observado em

Spondias mombin (Fig. 4B) e Petroselinum crispum (Fig. 4C e D). Na epiderme

abaxial de P. crispum (Fig. 4D) o estabelecimento de microrganismos,

principalmente hifas fúngicas próximo ao complexo estomático foi muito mais intenso

que na epiderme adaxial, onde predominou a colonização bacteriana (Fig. 4C). Em

outras espécies vegetais, também anfiestomáticas, como, por exemplo, Citrus

citriodora, não foi constatado comportamento diferente de colonização bacteriana

entre as superfícies adaxiais e abaxiais. Na maioria das espécies hipoestomáticas, a

colonização microbiana foi mais intensa na superfície foliar abaxial. De modo geral,

foi observada uma maior quantidade de microrganismos colonizando as superfícies

foliares abaxiais.

Mediante a utilização da microscopia ótica e da microscopia eletrônica de

varredura, foi verificado que as nervuras também foram locais de colonização

bacteriana, sendo visualizadas bactérias solitárias como em Impatiens walleriana

(Fig. 2B), em microcolônias como em Manihot esculenta (Fig. 5C), estruturadas em

biofilmes como em Capsicum frutescens (Fig. 5A e B) e associadas a fungos como

em Malpighia glabra (Fig. 5D). Nas espécies vegetais, que apresentavam tricomas

tectores e secretores nas nervuras, foi observada abundante colonização bacteriana,

como exemplificado em Cucurbita moschata (Fig. 5E e F).

Os tricomas tectores também apresentavam colonização microbiana. Em

Psidium guajava (Fig. 6C e D), por exemplo, uma população microbiana

diversificada, composta por cocos, bastonetes e hifas fúngicas, foi encontrada na

base e sobre os tricomas tectores. Em Cucurbita moschata (Fig. 6A e B) e Bidens

pilosa (Fig. 6E) a base dos tricomas tectores foi o microecossistema preferencial de

estabelecimento epifítico, sendo encontrado biofilmes, microcolônias e esporos

fúngicos. Em outras espécies de plantas, como Morus nigra (Fig. 6F) microcolônias

foram constantemente observadas próximas a tricomas tectores.

Os tricomas secretores também estavam colonizados por microrganismos.

Em todas as espécies vegetais que apresentavam tricomas secretores, foram

visualizadas bactérias na base dos mesmos. A microscopia ótica permitiu a

observação de biofilmes na base e próximos aos tricomas secretores de Cucumis

sativus (Fig. 7A) e em microscopia eletrônica de varredura, foi confirmada a

presença de bactérias habitando a células da cabeça e a base do tricoma secretor

(Fig. 7B). Biofilmes também foram visualizados, em microscopia ótica, na base do

tricoma secretor de Leonurus sibiricus (Fig. 7C), e através da microscopia eletrônica

de varredura, foi confirmada a presença de bactérias cobertas por uma matriz

extracelular comum, na base do tricoma (Fig. 7D e E). Em Hibiscus rosa-sinensis

(Fig. 7F - H) microcolônias foram observadas na base do tricoma secretor, na flange

entre a célula epidérmica propriamente dita e o tricoma.

Ressalta-se que 58 % das espécies vegetais com alta freqüência bacteriana

apresentavam tricomas secretores em pelo menos uma das superfícies da lâmina

foliar, enquanto apenas 21 % das espécies vegetais com baixa freqüência possuíam

essa característica anatômica em pelo menos uma das superfícies (Tab. 6 e 7). Apesar da amostragem empregada nesse estudo ter sido baseada em uma

diversidade de famílias botânicas e não em uma variedade de espécies

pertencentes a uma mesma família, semelhanças na associação bactéria-planta

entre espécies pertencentes ao mesmo táxon foram observadas, como pode ser

verificado nas famílias Poaceae e Rutaceae.

Todas as seis espécies, Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens,

Hyparrhenia rufa, Panicum maximum, Pennisetum purpureum, Zea mays,

pertencentes à família Poacea, apresentaram baixa freqüência de bactérias e

fungos, habitando as superfícies foliares abaxiais e adaxiais. As bactérias estavam

presentes como células solitárias como pode ser observado em B. decumbens (Fig.

8A), ou formando microcolônias como em B. brizantha (Fig. 8C e D). Apesar da

baixa freqüência de bactérias no filoplano, há uma diversidade microbiana, pois

foram encontradas bactérias no formato de cocos (Fig. 8B e D) e no formato de

bastonete (Fig. 8A e C) em ambas as espécies vegetais. Na superfície abaxial de B.

decumbens (Fig. 8A), microfibrilas estavam presentes ancorando a bactéria na

superfície foliar. Em B. brizantha (Fig. 8C) as bactérias provavelmente degradaram a

cutícula presente ao redor da célula para obterem uma ancoragem mais eficiente.

Em todas as espécies de plantas da família Poaceae foi visualizado células silicosas

na epiderme (Tab. 6).

Diferentemente da família Poaceae, a família Rutaceae apresentou uma alta

freqüência de colonização microbiana nas superfícies adaxial e abaxial de todas as

quatro espécies estudadas, Citrus aurantifolia, C. limonia, C. reticulata, C. sinensis.

As bactérias estavam presentes como células solitárias, ou formando microcolônias,

ou estruturadas em biofilmes na parede periclinal externa das células epidérmicas.

Os biofilmes sempre eram compostos por hifas fúngicas e bactérias

predominantemente no formato de bastonete, como pode ser visualizado no

filoplano de C. reticulata (Fig. 9A, B). Através da microscopia ótica foi constatada a

presença de células mucilaginosas e biofilme na lâmina foliar de C. aurantifolia (Fig.

9C). Com o auxílio da microscopia eletrônica de varredura, foi confirmada a

presença de bactérias e fungos estruturados em biofilme (Fig. 9D, E).

Todas as espécies de plantas pertencentes à família Rutaceae

apresentavam células mucilaginosas na lâmina foliar (Tab. 6). Células mucilaginosas

também estavam presentes em outras espécies vegetais com alta freqüência de

bactérias como Morus nigra, Abelmoschus esculentus e Hibiscus rosa-sinensis (Tab.

6). No entanto, nas espécies de plantas com baixa freqüência de colonização

microbiana não foi constatada a presença desse caracter anatômico (Tab. 7).

Algumas similaridades na microbiota epifítica puderam ser verificadas em

espécies vegetais pertencentes a diferentes famílias botânicas, mas que

apresentavam características anatômicas semelhantes. Nas espécies vegetais

Averrhoa carambola (Oxalidaceae), Chicorium intybus (Asteraceae) e Carica papaya

(Caricaceae), por exemplo, que apresentaram cera epicuticular do tipo plaquetas,

não foi visualizado com freqüência colonização microbiana. Em A. carambola, a cera

epicuticular em plaquetas (Fig. 10A), provavelmente dificultou a colonização

microbiana e foi rara a presença de bactérias e de hifas fúngicas (Fig. 10B). Em C.

intybus bactérias foram visualizadas apenas onde as plaquetas (Fig. 10C) não

estavam presentes, como por exemplo, no complexo estomático (Fig. 10D). Em C.

papaya, ocorreu o mesmo padrão de colonização, microcolônias foram visualizadas

apenas onde a cera epicuticular, plaquetas no formato de rosetas (Fig. 10E),

estavam ausentes (Fig. 10F). A presença de cera epicuticular do tipo plaqueta foi

mais intensa nas espécies vegetais com baixa freqüência de bactérias (Tab.6).

Entre todas as características anatômicas analisadas, aquelas que não

tiveram influência no padrão de distribuição das bactérias epifíticas no filoplano

foram o contorno das paredes anticlinais das células epidérmicas, forma do mesofilo

e tipo de feixe vascular. As demais características parecem influenciar o

estabelecimento bacteriano (Tab. 6 e 7).

5.2. Fungos epifíticos nas amostras de tecidos foliares Na maioria das espécies vegetais estudadas foram observadas estruturas

fúngicas na forma de esporos ou de hifas. O filoplano da nervura central de

Corymbia citriodora, por exemplo, apresentou, em microscopia ótica, intensa

colonização microbiana (Fig.11A), sendo confirmada, por microscopia eletrônica de

varredura, a presença de estruturas fúngicas (Fig. 11B).

Os fungos além de colonizarem a parede periclinal das células epidérmicas,

também foram visualizados colonizando os locais preferenciais de estabelecimento

bacteriano, como, por exemplo, a base dos tricomas tectores e secretores (Fig.

11C), as flanges cuticulares de Abelmoschus esculentus (Fig. 11D), a nervura

central de Mangifera indica (Fig. 11E) e os complexos estomáticos de Impatiens

walleriana (Fig. 11F).

Ressalta-se que a alta freqüência bacteriana estava associada à alta

freqüência fúngica (Tab. 6 e 7).

5.3. Microrganismos epifíticos nas amostras de tecidos radiculares

A observação das amostras de raiz foi dificultada em microscopia eletrônica

de varredura pela presença de material mucilaginoso, partículas de solo, e

principalmente devido ao rompimento das células epidérmicas e peridérmicas.

Em microscopia ótica foi visualizada, no rizoplano, a presença de material

mucilaginoso de diferentes espessuras, como observado em Lactuca sativa (Fig.

12A), Chicorium intybus (Fig. 12B), Carica papaya (Fig. 12E e F) e Citrus limonia

(Fig. 12G e H). Material mucilaginoso também foi observado próximo aos pêlos

radiculares como, por exemplo, em Brachiaria decumbens (Fig. 12C) e Hibiscus

rosa-sinensis (Fig. 12D).

5.4. Microrganismos endofíticos Nas secções transversais radiculares foram observados, com freqüência,

estabelecimento fúngico endofítico na forma de associações micorrízicas, como

pode ser verificado, por exemplo, no córtex das espécies Capsicum frutescens (Fig.

13A e B), Annona muricato (Fig. 13C e D), Vitis vinifera (Fig. 13E) e Brachiaria

decumbens (Fig. 13F).

Com o auxílio da microscopia ótica, foi constatado que a maioria das

micorrizas são do tipo endomicorrizas. Em Capsicum frutescens (Fig. 13B), por

exemplo, características das endomicorrizas vesicular-arbusculares puderam ser

identificadas, tais como a formação de arbúsculos através da ramificação de hifas

nas células do córtex e a preservação estrutural da parede celular.

Colonização bacteriana endofítica não foi visualizada nas amostras de

raízes e lâminas foliares estudadas.

Figura 2. Microscopia eletrônica de varredura (MEV). Padrões de distribuição de

bactérias epifíticas no filoplano: (A e B) solitárias, (C e D) microcolônias e (E e F)

biofilmes; (A) bactérias solitárias em adesão apolar na superfície abaxial de

Brachiaria brizantha (Poaceae) e (B) na nervura central de Impatiens walleriana

(Balsaminaceae); (C e D) microcolônia na flange de Capsicum frutescens

(Solanaceae); (E e F) bactérias e outros microrganismos estruturados em biofilme no

filoplano de Spondias mombin (Anacardiaceae). Abreviações: Eb, epideme abaxial;

Ce, complexo estomático; seta, bactérias; estrela, hifa fúngica.

Figura 3. MEV. Flanges cuticulares, local de colonização bacteriana epifítica; (A)

bactérias nas flanges da superfície adaxial da lâmina foliar de Abelmoschus

esculentus (Malvaceae), presença de microfibrilas de adesão; (B) bactérias e hifa

fúngica nas flanges de Vitis vinifera (Vitaceae); (C) microcolônia na flange de

Leonurus sibiricus (Lamiaceae); (D) cocos e bastonetes na flange de Psidium

guajava (Myrtaceae). Abreviações: Ed, epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; seta

fina, bactérias na forma de bastonete; seta grossa, bactérias na forma de cocos;

estrela, hifa fúngica.

Figura 4. Microscopia ótica (MO) (A) e MEV (B, C e D). Complexo estomático local

de colonização bacteriana epifítica; (A e B) Spondias mombin (Anacardiaceae), (A)

seção transversal da lâmina foliar evidenciando complexo estomático na epiderme

abaxial, (B) bactérias e hifas fúngicas próximas ao complexo estomático; (C e D)

Petroselinum crispum (Apiaceae), (C) microcolônia sobre o complexo estomático na

epiderme adaxial, (D) agregado fúngico e bacteriano sobre o complexo estomático

na epiderme abaxial. Abreviações: Pl, parênquima lacunoso; Eb, epiderme abaxial;

Ed, epiderme adaxial; asterisco, complexo estomático; seta, bactéria; estrela, hifa

fúngica.

Figura 5. MO (A e B) e MEV (C, D, E, F). Nervura, local de colonização bacteriana

epifítica; (A e B) seção transversal da lâmina foliar de Capsicum frutescens

(Solanaceae) mostrando biofilme bacteriano sobre a nervura; (C) microcolônia sobre

a medula de Manihot esculenta (Euphorbiaceae); (D) bactérias e fungos sobre a

medula de Malpighia glabra (Malpighiaceae); (E e F) bactérias colonizando a nervura

de Cucurbita moschata (Cucurbitaceae) próximo aos tricomas. Abreviações: Co,

colênquima; P, parênquima; Ed, epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; Tt, tricoma

tector; Ts, tricoma secretor; seta, bactérias; estrela, hifa fúngica.

Figura 6. MO (A) e MEV (B, C, D, E, F). Tricoma tector, local de colonização

bacteriana epifítica; (A e B) Cucurbita moschata (Cucurbitaceae), (A) seção

transversal da lâmina foliar evidenciando biofilme bacteriano sobre o tricoma tector,

(B) detalhe do agregado bacteriano na base do tricoma tector; (C e D) Psidium

guajava (Myrtaceae), (C) diversidade microbiana (cocos, bastonete, fungos)

estruturada em biofilme na base do tricoma tector, (D) microcolônia sobre tricoma

tector; (E) esporos fúngicos na base e bactérias sobre o tricoma tector de Bidens

pilosa (Asteraceae); (F) microcolômia próximo ao tricoma tector de Morus nigra

(Moraceae). Abreviações: P, parênquima; Tt, tricoma tector; Eb, epiderme abaxial;

Ed, epiderme adaxial; seta preta, biofilme; seta fina, bastonete; seta grossa, cocos;

estrela, hifa fúngica; triângulo, esporo fúngico.

Figura 7. MO (A, C, F) e MEV (B, D, E, G, H). Tricoma secretor, local de colonização

bacteriana epifítica; (A e B) Cucumis sativus (Cucurbitaceae), (A) seção transversal

da lâmina foliar mostrando biofilme no filoplano próximo ao tricoma secretor, (B)

colonização bacteriana sobre a cabeça e na base do tricoma secretor; (C, D, E)

Leonurus sibiricus (Lamiaceae), (C) seção transversal da lâmina foliar mostrando

biofilme na base do tricoma secretor, (D, E) confirmação da presença de biofilme

bacteriano na base do tricoma secretor; (F, G, H) Hibiscus rosa-sinensis

(Malvaceae), (F) seção transversal da lâmina foliar mostrando tricoma secretor, (G,

H) microcolônia na base do tricoma secretor. Abreviações: Ts, tricoma secretor; Eb,

epiderme abaxial; P, parênquima; Tt, tricoma tector; seta, bactérias.

Figura 8. MEV. Poaceae, família botânica com baixa freqüência de observações

bacterianas; (A e B) Brachiaria decumbens, (A) bactérias no formato de bastonete

aderidas na parede periclinal externa das células epidérmicas abaxiais, presença de

microfibrilas de adesão, (B) bactérias no formato de cocos aderidas na parede

periclinal externa das células epidérmicas adaxiais; (C e D) epiderme abaxial de B.

brizantha, (C) bactérias no formato de bastonete aderidas na superfície foliar, (D)

cocos localizado no filoplano. Abreviações: Eb, epiderme abaxial; Ed, epiderme

adaxial; seta fina, bastonete; seta grossa, cocos.

Figura 9. MO (C) e MEV (A, B, D, E). Rutaceae, família botânica com alta freqüência

de observações bacterianas; (A e B) bactérias e fungos estruturados em biofilme na

epiderme abaxial de of Citrus reticulata; (C) corte transversal da lâmina foliar de C.

aurantifolia evidenciando a presença de células mucilaginosas e biofilme no

filoplano, (D e E) confirmação da presença de bactérias e fungos estruturados em

biofilme. Abreviações: Eb, epiderme abaxial; Ed, epiderme adaxial; seta grossa,

biofilme; seta fina, bactéria; estrela, hifa fúngica.

Figura 10. MEV. Cera epicuticular do tipo plaquetas dificulta a colonização

bacteriana no filoplano; (A e B) epiderme abaxial de Averrhoa carambola

(Oxalidaceae), (A) cera epicuticular do tipo plaquetas e (B) rara presença de

bactérias e hifas fúngicas sobre a superfície epicuticular; (C e D) epiderme abaxial

de Chicorium intybus (Asteraceae), (C) cera epicuticular do tipo plaquetas e (D)

bactérias colonizando o complexo estomático, onde as plaquetas estão ausentes; (E

e F) epiderme adaxial de C. papaya (Caricaceae), (E) cera epicuticular do tipo

plaquetas no formato de rosetas, (F) microcolônia localizada onde as plaquetas no

formato de rosetas estão ausentes. Abreviações: Eb, epiderme abaxial; Ed,

epiderme adaxial; Ce, complexo estomático; seta, bactérias; estrela, hifa fúngica.

Figura 11. MO (A) e MEV (B, C, D, E, F). Presença freqüente de estruturas fúngicas

no filoplano das espécies vegetais estudadas; (A e B) epiderme adaxial de Corymbia

citriodora (Myrtaceae), (A) seção transversal da nervura central da lâmina foliar

evidenciando a presença de biofilmes microbianos no filoplano e (B) a confirmação

da presença de estruturas fúngicas; (C e D) Abelmoschus esculentus (Malvaceae),

(C) superfície foliar contendo hifas fúngicas sobre as células epidérmicas

propriamente ditas e próximas aos tricomas tectores e secretores, (D) hifa fúngica

presente nas flanges , assim como bactérias; (E) presença de hifas fúngicas na

nervura central de Mangifera indica (Anacardiaceae); (F) colonização fúngica sobre o

complexo estomático de Impatiens walleriana (Balsaminaceae). Abreviações: Ed,

epiderme adaxial; Eb, epiderme abaxial; Co, colênquima; Es, esclerênquima; Ce,

complexo estomático; Tt, tricoma tector; Ts, tricoma secretor; seta, bactéria; estrela,

hifa fúngica.

Figura 12. MO. Presença de material mucilaginoso no rizoplano de diferentes

espécies vegetais; (A) Lactuca sativa (Asteraceae); (B) Chicorium intybus

(Asteraceae); (C) Brachiaria decumbens (Poaceae); (D) Hibiscus rosa-sinensis

(Malvaceae); (E e F) Carica papaya (Caricaceae); (G e H) Citrus limonia (Rutaceae).

Abreviações: Ep, epiderme; Co, colênquima; P, pêlo radicular; seta, mucilagem.

Figura 13. MO. Presença de fungos micorrízicos em diferentes espécies vegetais;

seção transversal da raiz evidenciando a presença de micorrizas no córtex de (A e

B) Capsicum frutescens (Solanaceae); (C e D) Annona muricato (Annonaceae); (E)

Vitis vinifera (Vitaceae); (F) Brachiaria decumbens (Poaceae). Nota-se em C.

frutescens (B) a ramificação de hifas para formação de arbúsculo na célula cortical.

Abreviações: Co, colênquima; seta, micorriza; estrela, mucilagem.

6. Discussão 6.1. Microrganismos epifíticos nas amostras de tecidos da lâmina foliar

Mediante a utilização da microscopia ótica e da microscopia eletrônica de

varredura foram visualizados microrganismos habitando todas as espécies vegetais

assintomáticas, sendo as bactérias, os habitantes mais freqüentes e numerosos.

Esse fato, aliado aos estudos de Azevedo (1999) e Manfio (2003), os quais relatam

que são pouquíssimas as espécies bacterianas atualmente conhecidas em relação

às estimadas, reforçam a importância e necessidade de estudos contínuos sobre as

interações entre bactéria-planta para real compreensão, macro e micro, dos

agroecossistemas tropicais.

A presença de uma maior colonização bacteriana, seguida por fungos, no

filoplano das espécies tropicais estudadas, coincide com os dados encontrados na

literatura para ambientes temperados. Karamanoli et al. (2000), por exemplo,

estudando as plantas aromáticas do mediterrâneo (Lavandula angustifolia,

Rosmarius officinalis, Salvia fruticosa e Origanum vulgare) estimaram através das

técnicas microbiológicas uma população bacteriana epifítica no filoplano entre 4 x

102 a 5 x 105 UFC / g de folha. Krimm et al. (2005), estudando o filoplano de

morango (Fragaria ananassa cv. Elsanta), identificaram por sequenciamento gênico

do 16S rRNA, 324 estirpes bacterianas, pertencentes principalmente aos gêneros

Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bacillus e Arthrobacter. Independentemente da

técnica utilizada, micromorfológica, microbiológica, ou de biologia molecular, os

dados indicam uma abundância de bactérias colonizando as superfícies foliares.

O filoplano se constitui em um extenso habitat bacteriano. Segundo Morris &

Kinkel (2002), é estimado que a superfície foliar terrestre colonizada por

microrganismos seja de aproximadamente 6,4 x 108 km2. Esses autores também

estimaram que a população bacteriana epifítica global pode ser maior que 1026

células, devido ao grande número de bactérias já relatadas no filoplano de plantas

de ambientes temperados, somado a população bacteriana de ambientes tropicais.

Apesar de serem observadas bactérias na superfície vegetal de todas as

espécies estudadas, o filoplano, aparentemente, possui características bastante

hostis para a colonização de microrganismos, como uma alta incidência de

radiações ultravioleta, rápidas flutuações de temperatura e umidade relativa, limitada

disponibilidade de nutrientes, impactos mecânicos freqüentes ocasionados, por

exemplo, por partículas presentes no vento e gotas de chuva.

Para sobrepor essas barreiras, as bactérias utilizam mecanismos do próprio

sistema biológico, aliado a mecanismos da comunidade microbiana, além de

colonizarem nichos específicos na topografia foliar.

As bactérias associadas às plantas são freqüentemente visualizadas

reunidas em comunidades denominadas agregados, microcolônias e biofilmes

(Morris & Monier, 2003). O biofilme pode ser definido como microrganismos aderidos

uns aos outros e a uma superfície através de uma matriz extracelular comum

(Costerton et al., 1995; Donlan, 2002; Morris & Monier, 2003). Porém, para

descrever agrupamentos bacterianos menores e não necessariamente recobertos

por uma matriz extracelular comum, os termos agregados e microcolônias se

confundem, representando comunidades bacterianas com tamanhos variados.

No presente estudo, foram visualizadas bactérias como células únicas,

classificadas como solitárias, reunidas em grupos de tamanhos variados e não

necessariamente recobertos por uma matriz extracelular, classificadas como

microcolônias e grupos mais populosos, com microrganismo unidos uns aos outros e

à superfície foliar por uma matriz extracelular comum, classificados como biofilmes.

Bactérias em microcolônias foram freqüentemente observadas aderidas

umas as outras e à superfície foliar através de microfibrilas. Essas estruturas

filamentosas são provavelmente formadas pela secreção bacteriana de

polissacarídeos extracelulares (EPS). Como o processamento para microscopia

eletrônica de varredura envolve várias etapas de lavagem e desidratação, muitos

microrganismos epifíticos e principalmente muitos polissacarídeos extracelulares

podem ter sido extraídos. Essas microfibrilas talvez representem o remanescente

desidratado de uma matriz extracelular que originalmente recobria toda a célula ou

até mesmo toda comunidade bacteriana. Portanto, nem sempre é possível, através

da microscopia eletrônica de varredura, distinguir biofilmes de microcolônias.

A produção de EPS é considerada um fator essencial para o

estabelecimento dos agregados bacterianos, pois protege as bactérias da

dessecação, concentra minerais e nutrientes, reduz o contato bacteriano com

compostos tóxicos, aumenta a aderência bacteriana na superfície foliar e pode estar

envolvida com os processos patogênicos (Denny, 1995). Kemp et al. (2004)

constataram que mutantes de Xanthomonas axonopodis pv. manihotis não

produtores de xantana (EPS) possuíam patogenicidade severamente atenuada,

sendo mais suscetíveis a toxidade por peróxido de hidrogênio e possuindo

dificuldade de dispersão no interior da planta. Esses autores também constataram

que esses mutantes possuíam reduzida sobrevivência epifítica, pois eram mais

vulneráveis às radiações ultravioleta.

As bactérias presentes em agregados, portanto, apresentam uma maior

persistência no ambiente comparado com as células isoladas, como confirmado pelo

experimento de Monier & Lindow (2003). Estudando a colonização de Pseudomonas

syringae no filoplano de feijão submetido a diferentes condições de umidade, esses

autores constataram que as bactérias presentes em agregados apresentaram uma

maior sobrevivência comparada com as bactérias solitárias, concluindo que a

agregação aumenta a resistência das bactérias a estresses hídricos, possivelmente

devido à presença de uma matriz de EPS.

Por meio da microscopia eletrônica de varredura foi constatado que

microcolônias mais populosas apresentavam, com mais freqüência, uma matriz

extracelular recobrindo as células, ao invés de microfibrilas, refletindo o conceito de

densidade-dependente. As bactérias através do sistema “quorum sensing” percebem

e respondem a densidade populacional, através da produção e difusão de moléculas

sinalizadoras, sendo a síntese de EPS um dos fatores regulados por esse

mecanismo (Whitehead et al., 2001; Bodman et al., 2003). Como o presente estudo

não possui escala temporal, pode se supor que essas microcolônias talvez estejam

evoluindo para formação de biofilmes através da contínua produção de EPS e

crescimento do agregado (Pratt & Kolter, 1999; O’ Toole et al., 2000; Sutherland,

2001).

Os biofilmes foram visualizados em várias espécies vegetais, pertencentes

a diferentes famílias botânicas, na superfície epidérmica abaxial e adaxial. A maioria

dos biofilmes era composta por bactérias associadas a estruturas fúngicas, sendo

observado poucos biofilmes exclusivamente bacterianos. Watnick & Kolter (2000) e

Sutherland (2001) citam que em ambientes naturais, biofilmes monoespecíficos são

raros, a maioria são multiespecíficos, compostos por uma mistura de

microrganismos. Os biofilmes visualizados podem ser considerados comunidades

microbianas complexas, onde ocorrem interações interespecíficas e intraespecificas

(Andrews & Harris, 2000) ainda não completamente compreendidas.

Vale ressaltar, que em algumas espécies vegetais estudadas, como por

exemplo, Citrus reticula, foram observados vários biofilmes e também agregados

microbianos compostos sempre por fungos e bactérias e distribuídos

sistematicamente por todo filoplano. A formação dessas comunidades microbianas

estruturadas parece depender de modificações microambientais realizadas pelas

espécies fúngicas. As hifas fúngicas juntamente com a planta hospedeira, talvez, ao

liberarem nutrientes no filoplano, estejam sustentando o estabelecimento bacteriano

e em contrapartida criando um microambiente mais protegido para o crescimento

fúngico. Ou o contrário pode estar ocorrendo, modificações microambientais

provocadas pelas bactérias talvez estejam influenciando a colonização fúngica.

Estudos posteriores sobre sucessão ecológica são necessários para elucidar essa

questão.

Através dessas observações surgem alguns questionamentos, como: quais

os eventos que levam a formação de biofilmes multiespecíficos? Quais as interações

que ocorrem entre esses diferentes microrganismos? E entre biofilme multiespecífico

e a planta hospedeira?

As bactérias usufruem de vários processos cooperativos quando presentes

em comunidade (O´Tole et al., 2000; Jefferson, 2004), logo a formação de biofilme

pode ser bastante vantajosa para o estabelecimento e sobrevivência bacteriana na

superfície hostil das folhas.

Os resultados obtidos mostram que para sobrepor aos estresses presentes

no filoplano, as bactérias além de formarem comunidades, colonizavam locais

específicos na topografia foliar, como as flanges cuticulares, os complexos

estomáticos, as nervuras, os tricomas tectores e secretores. As razões pelas quais

as bactérias habitam preferencialmente esses locais, ainda não estão

completamente identificadas.

Apesar de não serem comuns dados em escala micrométrica sobre a

incidência de radiação ultravioleta, disponibilidade de nutrientes, umidade relativa e

físico-química de superfície desses locais, provavelmente, são esses os fatores que

diferenciam esses microecossistemas do restante da superfície foliar, apresentando

características mais propícias para o estabelecimento e colonização bacteriana.

As fontes de nutrientes no filoplano podem ter origem exógena, como grãos

de pólen, poeira, fragmentos de inseto, ou origem endógena, através da exsudação

de substâncias do interior foliar. Mesmo plantas saudáveis exsudam carboidratos,

ácidos orgânicos e aminoácidos no filoplano, sendo a quantidade exsudada variável

conforme a espécie vegetal, idade da folha, fisiologia e condições ambientais (Taiz &

Zeiger, 1991).

A disponibilidade de carbono é considerada um dos fatores mais limitantes

na colonização bacteriana epifítica (Mercier & Lindow, 2000). Leveau & Lindow

(2001) observaram que o consumo de frutose e sacarose por Erwinia herbicola

ocorre preferencialmente nas flanges cuticulares, nervuras, complexos estomáticos e

ferimentos localizados na superfície foliar de Phaseolus vulgaris. Esses dados

indicam que os nutrientes não estão uniformemente distribuídos no filoplano,

influenciando diretamente a dinâmica da microbiota epifítica.

Em todas as amostras foliares foram visualizadas bactérias colonizando as

flanges cuticulares, ou seja, as junções das paredes periclinais externas das células

epidérmicas das superfícies adaxiais e abaxiais. As paredes celulares estão em

contato uma com as outras através da lamela média, uma camada cimentante que

apresenta natureza péctica (Apepezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro, 2003). As

pectinas formam um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados constituídos

por unidades de ácido galacturônico unidos através de ligações α 1 – 4 e carregados

negativamente. Devido às cargas negativas, as pectinas são altamente hidratadas e

se associam ao Ca2+, adquirindo consistência gelatinosa e propiciando uma união

das paredes celulares vegetais adjacentes (Raven et al., 2001). Talvez, essa maior

disponibilidade de Ca2+ nas flanges , seja um fator favorável ao estabelecimento

bacteriano, pois auxiliaria no processo de adesão celular. O cálcio faria a mediação

entre as superfícies negativamente carregadas da bactéria e da superfície foliar.

Esse mecanismo de adesão microrganismo-planta já foi descrito para a bactéria

fixadora de nitrogênio Rhizobium leguminosarum (Smit et al., 1989) e para o fungo

Colletrotrichum graminicola (Leite et al., 2000).

Através da microscopia eletrônica de varredura, foi observado que as

flanges formam depressões na superfície foliar. Portanto, os nutrientes lavados do

filoplano pela chuva podem se depositar juntamente com a água, nesses locais,

propiciando um ambiente mais adequado ao estabelecimento microbiana. Além

disso, é provável que essas depressões estejam menos expostas aos efeitos do

vento e da radiação incidente, sendo um ambiente mais protegido para as bactérias.

Os complexos estomáticos já foram relatados como locais preferenciais de

colonização de bactérias fitopatogênicas e como um tipo de abertura natural por

onde pode ocorrer à penetração das mesmas (Huang, 1986). A preferência

bacteriana por esse microecossistema pode ser devido a maior umidade desses

locais comparado ao restante da lâmina foliar. Os complexos estomáticos estão

relacionados com as trocas gasosas entre planta-atmosfera e com a saída de água

pelo processo transpiratório (Taiz & Zeiger, 1991), apresentando-se como um local

mais úmido e propício para o estabelecimento de microrganismos.

A presença de bactérias nos complexos estomáticos também pode estar

relacionada com a presença de estruturas fúngicas. Foram visualizados fungos

habitando os complexos estomáticos e penetrando na planta através do ostíolo.

Freqüentemente, bactérias foram observadas associadas a essas estruturas

fúngicas. Apesar do estudo das interações entre fungos e bactérias epifíticas se

restringirem às interações maléficas, visando desenvolvimento de técnicas e

estratégias aplicadas no controle biológico (Postmaster et al., 1997; Abanda-Nkpwatt

et al., 2006; Singh et al., 2004), supõe-se que interações benéficas entre esses

microrganismos também ocorram com freqüência nas superfícies foliares.

De modo geral, a colonização microbiana foi mais abundante na superfície

epidérmica abaxial, o que pode ser o reflexo da presença mais freqüente dos

complexos estomáticos. Outros fatores, como: menor incidência de radiação

ultravioleta, diferenças na composição das paredes periclinais externas das células

epidérmicas e características da própria bactéria, podem estar envolvidos. Kemp et

al. (2004), por exemplo, constataram que Xanthomonas axonopodis se estabelece

preferencialmente na superfície epidérmica adaxial das folhas anfiestomáticas de

mandioca, provavelmente devido à alta hidrofobicidade da cera presente sob a

superfície epidérmica abaxial.

As nervuras da lâmina foliar foram observadas como locais de

estabelecimento bacteriano, sendo visualizadas bactérias solitárias, microcolônias e

biofilmes. Brandl & Mandrell (2002), ao estudarem a colonização de Salmonella

enterica no filoplano de Coriantrum sativum, também observaram, por microscopia

confocal, a tendência de bactérias colonizarem, como agregados, as nervuras das

lâminas foliares.

A nervura representa o local no qual está situado a maior quantidade de

elementos celulares do sistema vascular da lâmina foliar, possuindo as funções de

transportar água e solutos dissolvidos na corrente transpiratória e translocar os

produtos da fotossíntese para outras partes da planta (Appezzato-da-Glória &

Carmello-Guereiro, 2003). A preferência bacteriana por esse local talvez esteja

relacionada à maior presença de água e nutrientes translocados do sistema vascular

para o exterior foliar.

As paredes periclinais externas das células epidérmicas presentes nas

nervuras podem apresentar características físico-químicas diferentes das paredes

periclinais externas das células que compõem o restante da lâmina foliar, refletindo

em uma superfície mais propícia para a adesão e colonização microbiana. Em

algumas espécies vegetais, a nervura apresenta diferentes tricomas tectores e

secretores, o que pode influenciar no estabelecimento microbiano.

Os tricomas podem ser considerados locais de colonização bacteriana. A

grande diversidade existente de tricomas tectores e secretores, com diferentes

características estruturais e químicas, produzindo, acumulando e secretando

diferentes compostos do metabolismo primário e secundário (Metcalfe & Chalk,

1950; Ascensão & Pais, 1997; Ascensão et al., 1999), pode se refletir em uma

diversidade de associações entre microbiota-planta, variando entre interações

benéficas a maléficas.

Monier & Lindow (2004) observaram por microscopia epifluorescente,

agregados da bactéria fitopatogênica Pseudomonas syringae habitando a base dos

tricomas de Phaseolus vulgaris, confirmando a preferência das bactérias

fitopatogênicas de colonizarem esse sítio. As bactérias fitopatogênicas, além de

colonizarem, também podem penetrar na planta através de aberturas que surgem

por injúrias e por ferimentos dos tricomas (Huang, 1986).

No entanto, visando impedir o estabelecimento da doença, as plantas

possuem mecanismos de defesa que incluem a secreção através dos tricomas

secretores de metabólicos secundários com atividade antimicrobiana (Karamanoli et

al., 2000; Proestos et al., 2006).

São vários os tipos de substâncias sintetizadas nos tricomas secretores

através do metabolismo secundário, incluindo os grupos dos terpenos, dos

compostos fenólicos e dos compostos nitrogenados (Taiz & Zeiger, 1991). A função

desses compostos na dinâmica da microbiota benéfica epifítica ainda é pouco

compreendida, pois por muito tempo os estudos foram focados em compostos com

atividade antifúngica e antibacteriana (Croft et al., 1993; Kalemba & Kunicka, 2003).

Recentemente, Abanda-Nkpwatt et al. (2006), observaram que bactérias

epifíticas dos gêneros Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bacillus, Arthrobacter são

capazes de metabolizarem compostos voláteis produzidos pelos tricomas secretores

de morango, ao contrário do fungo fitopatogênico Botrytis cinerea que apresentou

inibição de crescimento. Logo, os metabólicos secundários secretados pelos

tricomas atuam diretamente na dinâmica da microbiota epifítica, possuindo

diferentes efeitos dependendo do tipo de substância e microrganismo.

Semelhanças na associação bactéria-planta entre espécies pertencentes ao

mesmo táxon foram observadas, refletindo a importância e influência que as

características botânicas exercem na microbiota epifítica.

Todas as espécies vegetais pertencentes à família Poaceae apresentaram

uma baixa frequência de colonização bacteriana, ao contrário do observado na

família Rutaceae. Provavelmente as características da parede periclinal externa das

células epidérmicas, como presença de sílica e alta hidrofobicidade, seja um dos

fatores determinantes da baixa freqüência de colonização bacteriana na família

Poaceae, pois dificultaria o processo de adesão celular. A presença de células

mucilaginosas na lâmina foliar das espécies vegetais da família Rutaceae talvez

exerçam influência positiva no estabelecimento bacteriano epifítico, ao exsudarem

mucilagem para o filoplano, que serviria como fonte de água e nutrientes. Estudos

mais aprofundados são necessários para compreender esses diferentes padrões.

A presença de cera epicuticular do tipo plaqueta pode ser considerado uma

característica anatômica determinante na dinâmica da microbiota epifítica,

influenciando negativamente o estabelecimento bacteriano. Esses resultados estão

de acordo com os dados obtidos por Kinkel et al. (2000) que utilizando métodos

microbiológicos obtiveram um maior número de bactérias culturáveis de folhas de

Cucumis sativus e Phaseolus vulgaris comparado com folhas cerosas de gramíneas.

A interação entre bactéria e cutícula ou cera epicuticular ainda é pouco

compreendida. Alguns estudos indicam que algumas bactérias são capazes de

influenciar as propriedades da cutícula, como a permeabilidade, para obterem água

e nutrientes do interior foliar (Knoll et al., 2000, Schreiber et al., 2004, Singh et al.,

2004, Krimm et al., 2005). No presente estudo foram visualizadas por microscopia

eletrônica de varredura bactérias aderidas ao filoplano em “cavidades” que

provavelmente surgiram pela digestão da cutícula ou cera epicuticular através de

substâncias secretadas pelas bactérias, como moléculas com atividade

biosurfactante (Knoll et al., 2000, Schreiber et al., 2004).

Através da comparação dos resultados obtidos no presente estudo com os

dados encontrados na literatura, pode se inferir que o comportamento bacteriano

epifítico é bastante semelhante em ambientes temperados e tropicais (Andrews &

Harris, 2000; Lindow & Leveau, 2002; Lindow & Brandl, 2003). Logo, as

caraterísticas intrínsecas das plantas hospedeiras (ex: presença de tricomas,

presença de cera epicuticular do tipo plaqueta) supostamente exercem uma maior

influência na colonização bacteriana epifítica que as condições ambientais.

A microscopia eletrônica de varredura convencional, aliada a microscopia

ótica, foi utilizada nesse estudo com eficácia para descrever as interações epifíticas

entre bactéria-planta, devido principalmente, a possibilidade de observar toda a

morfologia da superfície epidérmica da lâmina foliar, ao alto poder de resolução do

equipamento e a facilidade de descrição das imagens bidimensionais com aspecto

tridimensional. Porém, algumas difilcultadas metodológicas foram constatadas, como

por exemplo, a geração de artefatos, que pode dificultar e até mesmo gerar

equívocos na interpretação dos resultados. O processamento envolve várias etapas

de desidratação que podem gerar perdas de bactérias, redistribuição de células e

destruição ou desidratação das microfibrilas e da matrix extracelular. A microscopia

eletrônica de varredura convencional também gera limitadas informações sobre

viabilidade e identidade celular e é um método essencialmente qualitativo ou

semiquantitativo. Logo, estudos posteriores devem ser realizados aliando a

microscopia eletrônica de varredura a outras técnicas microscópicas, microbiológicas

e moleculares, para propiciar uma compreensão integral das interações epifíticas

entre microbiota e planta hospedeira.

6.2. Microrganismos epifíticos nas amostras de tecidos da raiz

Por meio da microscopia ótica, foi observada intensa presença de material

mucilaginoso no rizoplano das quarenta e sete espécies de plantas sem sintomas de

doença.

A mucilagem da raiz possui as funções de reduzir o atrito entre as raízes e

as partículas do solo, evitar a dessecação e melhorar o contato entre a raíz e a

solução do solo (Rougier & Chabound, 1985). Além disso, a mucilagem afeta

diretamente a microbiota benéfica do solo como fungos micorrízicos (Bansal &

Mukerji, 1994), bactérias simbióticas (Bacilio-Jiménez et al, 2003) e também

microrganismos patogênicos (Hawes, 1990). As células da raiz secretam para o

rizoplano, passivamente e ativamente, diversas substâncias que atuam diretamente

na dinâmica microbiana, atraindo ou repulsando bactérias e criando um

microambiente mais úmido e nutricionalmente rico para o estabelecimento epifítico

(Nehl et al., 1996; Sturz & Nowak, 2000; Bacilio-Jiménez et al, 2003; Walker et al.,

2003).

6.3. Microrganismos endofíticos

No presente estudo foram visualizados, com bastante freqüência, fungos

endofíticos no córtex radicular como associações micorrízicas. De acordo com

Wilcox (1991), as micorrizas ocorrem em 83 % das dicotiledôneas, 79 % das

monocotiledôneas e em praticamente todas as gimnospermas, sendo considerada a

associação simbiótica mais comum entre microrganismos e espécies vegetais

(Trappe, 1987).

Os fungos micorrízicos beneficiam a planta hospedeira através do aumento

da habilidade das raízes em absorverem água e nutrientes, principalmente o fósforo

(Sylvia et al., 1999) e também ao aumento da resistência da planta a doenças

(Pfleger, 1994). Em contrapartida, o vegetal supre a micorriza de fotoassimilados

(Siqueira & Franco, 1988).

Foram observadas, principalmente, micorrizas denominadas

endomicorrizas, que são caracterizadas morfoanatomicamente pelo estabelecimento

inter e intracelular, ausência de manto e de modificações morfológicas nas raízes,

sendo as ericóides, as orquidóides e as arbusculares os tipos mais estudados

(Sylvia et al., 1999).

Cortes transversais das raizes foram observados em microscopia ótica,

possibilitando identificar as estruturas típicas dos fungos micorrízicos arbusculares,

que são: os arbúsculos, com função de transferência de nutrientes entre os

simbiontes (Gianinazzi-pearson & Gianinazzi, 1983); as vesículas, com a função de

reserva e armazenamento (Harley & Smith, 1983); e as hifas, responsáveis pela

absorção e transporte de água e nutrientes (Siqueira & Franco, 1988).

A avaliação rotineira da presença de fungos micorrízicos arbusculares por

microscopia ótica é realizada seguindo o protocolo proposto por Grace & Stribley

(1991). Tal protocolo consite em clarificar as raízes com KOH e, posteriormente,

contrastar com azul de metil para visualização em microscopia ótica de campo claro.

Essa metodologia é rápida e eficaz para confirmar a presença de fungos micorrízicos

arbusculares e a porcentagem de micorrização em raízes finas que se tornam

translúcidas com o processamento. Porém, para a identificação de micorrizas em

raízes mais grossas e também para um estudo mais refinado sobre morfologia e

anatomia da micorrização a metodologia empregada nesse estudo pode ser

considerada uma alternativa promissora.

No presente estudo não foi possível visualizar bactérias endofíticas.

Segundo James & Olivares (1997) a colonização bacteriana endofítica não ocorre

por todo o interior dos vegetais. Para tal, existem locais específicos de

estabelecimento bacteriano que incluem principalmente os espaços intercelulares e

os vasos xilemáticos. Esses dados, assim como a maioria dos estudos envolvendo

caracterização estrutural da associação endofítica, foram obtidos através de estudos

microscópicos de plantas inoculadas em laboratório, onde se presupõe a existência

de elevada população bacteriana.

No presente estudo, foram coletadas pequenas amostras das lâminas

foliares e das raizes visualmente sadias de plantas adultas cultivadas no campo,

objetivando através de cortes micrométricos, observados em microscopia ótica,

caracterizar associações naturais endofíticas entre bactéria e planta hospedeira.

Porém, não foi possível visualizar bactérias endofítica, pois a diluição da colonização

endofítica foi maior que a eficiência da amostragem.

7. Conclusões - A microscopia eletrônica de varredura, aliada à microscopia ótica, pode ser

considerada importantes ferramentas para o estudo estrutural da associação epifítica

entre microrganismos e planta hospedeira.

- Microrganismos habitam plantas saudáveis. As bactérias foram os colonizadores

mais abundantes do filoplano, seguido por fungos, na forma de esporos e de hifas

fúngicas.

- Predominaram no filoplano bactérias no formato de bastonete, seguido por coco,

aderidos à parede periclinal externa das células epidérmicas ou tricomas por adesão

apolar.

- As bactérias estavam presentes no filoplano como células solitárias, ou formando

microcolônias ou estruturadas em biofilmes.

- Houve o predomínio de biofilmes multiespecíficos, constituídos por bactérias e

fungos.

- Os locais preferências de estabelecimento bacteriano epifítico no filoplano foram as

flanges cuticulares, os tricomas secretores, os tricomas tectores, os complexos

estomáticos e as nervuras.

- Os caracteres anatômicos influenciaram no estabelecimento da microbiota epifítica,

sendo a presença de tricomas uma característica favorável e a presença de cera

epicuticular do tipo plaqueta uma característica desfavorável à interação bactéria-

planta.

- Fungos endofíticos estavam presentes nas amostras radiculares como associações

micorrízicas.

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CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA ASSOCIAÇÃO … · maléficas, como as fitopatogênicas. Há mais de 50 anos, diversos trabalhos têm demonstrado que as bactérias presentes epifiticamente