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FABIANA RIBEIRO VIANA
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA E FÍSICO-QUÍMICA DO “REQUEIJÃO DO NORTE”
ARTESANAL
Faculdade de Farmácia da UFMG Belo Horizonte, MG
2009
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1
FABIANA RIBEIRO VIANA
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA E FÍSICO-QUÍMICA DO “REQUEIJÃO DO NORTE”
ARTESANAL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do grau de Doutora em Ciência de Alimentos. Orientador: Prof. Dr. Afonso Liguori de Oliveira. Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa.
Faculdade de Farmácia da UFMG Belo Horizonte, MG
2009
2
Viana, Fabiana Ribeiro
V614c
Caracterização microbiológica e físico-química do “requeijão do norte” artesanal / Fabiana Ribeiro Viana. – 2009.
108 f. : il.
Orientador: Prof. Dr . Afonso de Liguori Oliveira Co-Orientador: Prof. Dr.Carlos Augusto Rosa Tese (doutorado) - Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos.
1. Requeijão – Controle de qualidade – Teses. 2. Queijo-de-
manteiga – Controle de qualidade - Teses. 3. Derivados do leite – Qualidade dos produtos - Teses. 4. Derivados do leite – Contaminação - Teses. I. Oliveira, Afonso de Liguori. II. Rosa, Carlos Augusto. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. IV. Título.
CDD 637.32
3
Dedico este trabalho às minhas filhas
Anna Clara e Anna Lara, à minha mãe
Tânia Mara e à minha avó
Maria Amélia (in memorian)
4
AGRADECIMENTOS
À Deus pela oportunidade e por dar a força que eu precisava nos momentos
mais difíceis.
À minha família, pelo grande apoio, incentivo e paciência. Aos meus irmãos
Adriana, Andréia e Marcelo pelo carinho e compreensão nos momentos em que
mais precisei, ao meu pai pelo orgulho por esta conquista.
Ao meu noivo Fredi, pelo amor, companhia e ajuda nos momentos finais
dessa jornada.
Ao Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa, pela confiança e incentivo. Obrigada pela
oportunidade que me concedeu para desenvolver este trabalho, e por me ensinar a
importância do profissionalismo em minha vida.
A Prof. Dr. José Virgílio Coelho, pela valiosa colaboração em disponibilizar o
laboratório de bromatologia para realização de parte deste trabalho.
Aos professores do curso de Pós-graduação em Ciência de Alimentos -
FAFAR e do curso de Pós-graduação em Microbiologia - ICB pelos conhecimentos
prestados nas disciplinas.
À “Dona” Aparecida e Regina, que durante toda a execução deste trabalho,
foram o meu apóio espiritual direito, o meu eterno agradecimento.
A Cristina Roscoe Viana, César Lúcio Farias e Beatriz Martins, pelo grande
incentivo, pelas idéias e apóio durante as etapas de trabalho na Biomol.
Ao funcionário do Laboratório de Bromatologia Marcos da Costa Lage.
Obrigada por ajudar a encontrar uma solução para os eventuais problemas técnicos
que surgiram ao longo deste trabalho.
5
À turma do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras do Instituto
de Ciências Biológicas da UFMG pelas dicas que muito ajudaram na concretização
deste trabalho.
Às “colegas de doutorado” Priscila, Luciana, Mariana Vieira, Fernandinha,
Renata Labanca e Sami pelo apoio, compreensão e companheirismo.
Ao professor José Virgílio Coelho pela gentileza de ceder o Laboratório de
Bromatologia para realização de algumas análises.
Ao pesquisador Dr. Michael da Fundação Ezequiel Dias pela colaboração na
correção dos trabalhos em inglês.
À Édina Sarmento, do município de Salinas - MG, pela importante
contribuição ao disponibilizar o acesso à linha de produção do Requeijão do Norte
durante a realização desta pesquisa e pela maravilhosa acolhida.
A todas as pessoas, que de algum modo, contribuíram para a realização
deste trabalho.
Muito Obrigada!
6
Não há nada de nobre em sermos superiores ao próximo.
A verdadeira nobreza consiste em sermos superiores ao que éramos antes.”
(Autor desconhecido)
7
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ........................................................................................ LISTA DE FIGURAS ......................................................................................... LISTA DE ABREVIATURAS .......................................................................... RESUMO.............................................................................................................. ABSTRACT ......................................................................................................... INTRODUÇÃO.................................................................................................... REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 1. REQUEIJÕES..................................................................................................... 1.1. ASPECTOS GERAIS ................................................................................... 1.2. COMPOSIÇÃO QUÍMICA ............................................................................ 1.3. TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DO REQUEIJÃO ..................................... 1.4. MICROBIOTA DE INTERESSE HIGIÊNICO-SANITÁRIO .......................... 1.4.1. Enterobactérias .......................................................................................... 1.4.2. Staphylococcus spp. ................................................................................. 2. LEVEDURAS EM PRODUTOS LÁCTEOS ..................................................... 3. OCORRÊNCIA DE FUNGOS FILAMENTOSOS ............................................. 4. AFLATOXINAS ................................................................................................ 5. BOAS PRÁTICAS DE FABRICAÇÃO ........................................................... 6. MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE FUNGOS E
LEVEDURAS .................................................................................................... OBJETIVOS ........................................................................................................ CAPÍTULO I – CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DO REQUEIJÃO DO NORTE ................................... RESUMO................................................................................................................ ABSTRACT ............................................................................................................ I.1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. I.2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. I.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ I.4. CONCLUSÕES................................................................................................. CAPÍTULO II – POPULAÇÃO DE LEVEDURAS E ATIVIDADE ENZIMÁTICA ASSOCIADAS AO REQUEIJÃO DO NORTE................................................................................................................. RESUMO................................................................................................................ ABSTRACT ............................................................................................................ II.1. INTRODUÇÃO................................................................................................. II.2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ II.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... II.4. CONCLUSÕES................................................................................................
09 10 11 12 13 14 16 16 16 17 18 21 22 23 26 27 28 30 31 34 35 35 36 37 38 41 47 49 49 50 51 52 54 60
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CAPÍTULO III – ESTUDO DA PRESENÇA DE FUNGOS FILAMENTOSOS E AFLATOXINA M1 EM REQUEIJÃO DO NORTE................................................................................................................. RESUMO................................................................................................................ ABSTRACT ............................................................................................................ III.1. INTRODUÇÃO................................................................................................ III.2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... III.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... III.4. CONCLUSÕES............................................................................................... CONCLUSÕES INTEGRADAS ...................................................................... CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................ REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. APÊNDICE I – BREVE DESCRIÇÃO SOBRE O PROCESSO DE FABRICAÇÃO DO REQUEIJÃO DO NORTE E AS CONDIÇÕES DE PROCESSAMENTO EM UMA PROPRIEDADE RURAL LOCALIZADA N O MUNICÍPIO DE SALINAS – MG .............................................................................
61 61 62 63 64 68 72 74 75 76 100
9
LISTA DE TABELAS
I.1
I.2
I.3
II.1
II.2
II.3
II.4
III.1
III.2
[CAPÍTULO I]
Coliformes Totais, Termotolerantes, Escherichia coli, Staphylococcus spp.,
Staphylococcus coagulase positivos e fungos presentes em amostras de
Requeijão do Norte obtidas em mercado varejista de Belo-
Horizonte.........................................................................................................
Enterotoxinas estafilocócicas e TSST-1 detectadas em amostras de
Requeijão do Norte obtidas em mercado varejista de Belo-
Horizonte.........................................................................................................
Análise físico-química das amostras de Requeijão do Norte obtidas em
mercado varejista de Belo-Horizonte..............................................................
[CAPÍTULO II]
Média das populações de leveduras isoladas em amostras de Requeijão
do Norte obtidas em mercado varejista de Belo Horizonte (log
UFC/g)............................................................................................................
Produção de β-galactosidase, protease e lipase pelas espécies de
leveduras em amostras de Requeijão do Norte obtidas em mercado
varejista de Belo Horizonte.............................................................................
Medida da atividade lipolítica dos isolados de leveduras pelo diâmetro
do halo............................................................................................................
Medida da atividade proteolítica dos isolados de leveduras pelo diâmetro
do halo............................................................................................................
[CAPÍTULO III]
Média das populações de fungos isolados em amostras de Requeijão do
Norte obtidas em mercado varejista de Belo Horizonte (log
UFC/g)............................................................................................................
Presença de aflatoxina M1 em amostras de Requeijão do Norte obtidas em
mercado varejista de Belo Horizonte..............................................................
42
43
45
55
57
58
59
70
72
10
LISTA DE FIGURA
Figura 1 – Fluxograma proposto das etapas de produção artesanal do
Requeijão do Norte. Município de Salinas – MG....................................................
20
11
LISTA DE ABREVIATURAS
ABIQ
AFB1
AFM1
AFM2
AOAC
BPF
CNI
CTAB
DNA
DNAr
FAO
INDI
ITS
LD
LIA
MNP
OSP
SDS
SE
SEBRAE
SENAI
TNase
TSI
TSST-1
UFC
YMA
- Associação Brasileira das Indústrias de Queijo
- aflatoxina B1
- aflatoxina M1
- aflatoxina M2
- Association of Official Analytical Chemists
- Boas Práticas de Fabricação
- Confederação Nacional da Indústria
- cetil trimetilamonio bromido
- ácido desoxiribonucléico
- ácido dexosiribonucléico ribossomal
- Food and Agricultural Organization of the United Nations
- Instituto de Desenvolvimento Industrial de Minas Gerais
- internal transcribed sequences
- limite de detecção
- lysine iron agar
- número mais provável
- sensibilidade ótima em placa
- dodecil sulfato de sódio
- enterotoxina estafilocócica
- Serviço Brasileiro de Apóio às Micro e Pequenas Empresas
- Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial
- Termonuclease
- triple sugar iron
- Toxina da Síndrome do Choque Tóxico-1
- unidade formadora de colônia
- yeast extract-malt extract agar
12
RESUMO
A qualidade microbiológica e as características físico-químicas do Requeijão
do Norte comercializados na cidade de Belo-Horizonte – MG foram avaliadas. As
análises microbiológicas realizadas em 25 amostras indicaram que este produto
pode apresentar risco ao consumo humano, devido à presença de Staphylococcus
coagulase positivos, além da enterotoxina B e da toxina TSST-1 detectadas em
algumas amostras. Contagens elevadas de Coliformes Termotolerantes e E. coli
foram encontradas. Quanto à caracterização físico-química do Requeijão do Norte,
uma grande variação dos parâmetros analisados foi observada, demonstrando a
falta de padronização existente no processo de fabricação. A avaliação das
populações de leveduras neste produto também foi realizada, e pôde ser observada
uma grande variedade de espécies. Em razão do número elevado das contagens de
leveduras apresentadas, a possibilidade de contaminação pós-processamento foi
constatada. Por outro lado, a atividade enzimática observada em algumas das
linhagens de leveduras isoladas evidencia a contribuição positiva das mesmas para
as características sensoriais do requeijão, uma vez que algumas destas linhagens
podem estar presentes como componentes naturais da microbiota do produto.
Posteriormente, foi avaliado a contaminação das amostras de requeijão por fungos e
a presença de AFM1. Foram detectadas concentrações de AFM1 em níveis que não
oferecem riscos à saúde do consumidor. Contagens elevadas de fungos foram
detectadas sugerindo que falhas no processamento e a ausência de embalagem do
produto propiciaram estes resultados. Espécies possivelmente produtoras de
micotoxinas como Penicillium citrinum e Penicillium paxilli foram isoladas, sendo
sugerido como proposta futura a investigação sobre o risco que a presença destes
fungos no Requeijão do Norte pode oferecer para o consumo humano.
Palavras-chave: Requeijão do Norte; Queijo de Manteiga; qualidade microbiológica;
caracterização físico-química; atividade enzimática; aflatoxina M1.
13
ABSTRACT
The microbiological quality and physical-chemical characteristics of “Requeijão
do Norte” marketed in the city Belo-Horizonte – MG were evaluated. Microbiological
analyses carried out on 25 samples indicated that the product can present risk to the
human consumption due to the presence of coagulase-positive Staphylococci
besides the enterotoxin B and the TSST-1 toxin detected in some samples. High
counts of fecal coliformes and E. coli were found. As for the physiochemical
characterization of the “Requeijão do Norte”, a great variation of the analyzed
parameters was observed, demonstrating a lack of standardization in the production
process. An evaluation of the populations of yeasts present in the product was also
carried out, and it can be observed that a great variety of species were present. The
high counts observed suggest the possibility of contamination after processing. On
the other hand, the enzymatic activity observed in some of the strains of isolated
yeasts indicated the positive contribution of these to the sensorial characteristics of
the cheese, since some of these strains can be present as natural components of
microbiota of the product. Later the contamination of the cheese samples by moulds
was evaluated, and the presence of AFM1 was confirmed. The concentration of AFM1
not presents a risk to the health of the consumers. High counts of moulds were found
suggesting a possible failure in the processing and the absence of wrapping of the
product propitiated these results. Species such as Penicillium citrinum and
Penicillium paxilli which can possibly produce mycotoxins were isolated. This
suggested the need for a future investigation of the risk that the presence of these
fungi in ‘Requeijão do Norte’ can offer for the human consumption.
Key-words: “Requeijão do Norte”; butter cheese; microbial quality; physico-chemical
characterization; enzymatic activity; aflatoxin M1.
14
INTRODUÇÃO
A produção de requeijão no Brasil já apresentava registros no período colonial
como uma das formas mais tradicionais de conservação do leite sob a forma de
alimento. Atualmente, o produto é fabricado em todo o território nacional, com
algumas variações de tecnologia características de cada região.
No nordeste do país, as produções de laticínios estão voltadas ao
processamento dos Queijos de Coalho e de Manteiga (AQUINO, 1983). O Queijo de
Manteiga, também conhecido como Requeijão do Norte, é um produto bastante
consumido nas regiões norte e nordeste (NASSU et al., 2003). A microrregião do
Seridó, localizada no estado do Rio Grande do Norte, destaca-se na elaboração do
Queijo de Manteiga. Este queijo é produzido de forma empírica, em fazendas, cuja
técnica é passada de pai para filho, através de gerações. O queijo, assim obtido, é
comercializado “in loco” e na capital do estado (LIRA, 1995).
Em Minas Gerais, situação semelhante pode ser observada para diferentes
produtos, como por exemplo, os requeijões artesanais da região norte do estado. A
produção é bastante empírica e alguns produtores têm seu próprio critério para
definir a formulação, o que tem levado à obtenção de produtos com características
variadas, comprometendo sua qualidade final. Além disto, constitui-se em um fator
quase exclusivo na geração de renda para muitas famílias, o que justifica a
importância de se intensificar o apoio ao desenvolvimento da agroindústria (SILVA &
CASTRO, 1995).
A comercialização do Requeijão do Norte de Minas é realizada em pequenas
feiras públicas e mercados municipais, onde estes produtos são encontrados
geralmente sem embalagem ou cobertos parcialmente por filmes plásticos à
temperatura ambiente. As condições de transporte são precárias e feitas por
atravessadores locais (relatos pessoais dos atravessadores).
Das alterações microbiológicas, o “mofo” é referido como o principal gerador
de problemas econômicos na indústria queijeira. Entre as conseqüências
provocadas pelo seu desenvolvimento, destacam-se a rejeição de produtos
mofados, perdas por raspagem ou retirada total da casca, além da redução do
tempo de vida útil do produto (MEDINA et al., 1984; TANIWAKI & VAN DENDER,
1991).
15
Fungos e leveduras também exercem contribuição de destaque em
requeijões. Positivamente favorecem as características de textura, aroma e sabor do
produto final, por outro lado, a presença destes microrganismos como
contaminantes pode provocar alterações sensoriais indesejáveis nos queijos, além
da possível presença de metabólitos tóxicos, as micotoxinas.
Dentre as condições do local de armazenamento, consideradas por LIRA
(1995), destaca-se a variação de temperatura, bastante comum na comercialização
desse produto, o que favorece o desenvolvimento de fungos em contagens mais
elevadas do que se estocado à temperatura contínua de 25 ºC. ESCUDERO et al.
(1981) analisaram os efeitos das alterações ocorridas na composição química sobre
a qualidade do Queijo de Manteiga durante 15 dias de armazenamento em
temperatura ambiente e de refrigeração, e observaram melhor sabor para as
amostras mantidas sobre refrigeração.
Diante da escassez de trabalhos científicos sobre o Requeijão do Norte e da
necessária intervenção para melhoria da qualidade higiênico-sanitária do produto
comercializado em nossa região, foi idealizado este trabalho. Foram analisados os
principais indicadores microbiológicos e a composição físico-química em amostras
de Requeijão do Norte comercializados na cidade de Belo-Horizonte-MG. A
avaliação da presença de enterotoxinas estafilocócicas no alimento foi realizada
paralelamente à pesquisa de isolados de Staphylococcus coagulase-negativos
potencialmente patogênicos, a partir da presença/ausência do gene da coagulase
para avaliação do risco de alerta sanitário. Também foi caracterizada a microbiota
fúngica e as leveduras presentes no Requeijão do Norte. Paralelamente, foi
realizado a quantificação de aflatoxina M1 no Requeijão do Norte com o intuito de
auxiliar na avaliação da inocuidade do produto para consumo humano.
16
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. REQUEIJÕES
1.1. ASPECTOS GERAIS
Registros sobre a fabricação de queijos no Brasil ocorreram a partir do ano de
1920, com o estabelecimento de imigrantes dinamarqueses no sul de Minas e de
holandeses na região de Santos Dumont e Barbacena (FURTADO, 1991). O
requeijão é um produto originário das antigas regiões produtoras de creme destinado
à fabricação de manteiga, onde o leite desnatado, tido na época como subproduto,
era utilizado na fabricação artesanal do requeijão. O consumo do produto era restrito
à própria unidade de fabricação (MUNCK & CAMPOS, 1984).
Atualmente, uma grande variedade de requeijões pode ser encontrada no
mercado. Essa diversificação está relacionada à diferenças de tratamento,
peculiares a cada tipo de requeijão, recebidas no momento em que a massa está
sendo processada. MUNCK & CAMPOS (1984) destacam quatro tipos de requeijão:
o Requeijão Mineiro ou Comum, disponível sob a forma fatiável e o Requeijão
Cremoso, ambos de cor clara e produzidos em escala industrial, e também o
Requeijão do Norte e o Requeijão do Sertão ou Crioulo, em geral de forma fatiável e
coloração mais escura, geralmente produzidos de forma artesanal.
O nome “Requeijão do Norte” representa a mais popular de suas
denominações, já tendo sido estabelecido em Regulamento Técnico de Identidade e
Qualidade específico (BRASIL, 1997).
Em relação ao cenário nacional, a produção de queijos e requeijões em Minas
Gerais é bastante expressiva. Em 2001, o Brasil produziu cerca de 394.175 t de
queijos sob inspeção e estima-se que a produção informal tenha sido ainda maior.
Calcula-se que a participação de Minas Gerais seja equivalente a 42% do total,
sendo que o requeijão corresponde a 11,9% da produção de queijos sob inspeção
Federal (INDI, 2002).
Em se tratando da produção artesanal do Requeijão do Norte, VENTURA
(1987) já afirmava que 80% da produção do requeijão era originada de pequenas
fábricas, isto é, tinha origem artesanal. Segundo dados fornecidos pelo INDI (2002),
foi estimado que apenas 0,2% da produção do Requeijão do Norte estava
17
regulamentada pelo Serviço de Inspeção Federal. Portanto, a quantificação da
produção artesanal não consta em estatísticas oficiais, mas a existência de
numerosas unidades de produção caseira que ainda comercializam extensivamente
seus produtos no mercado informal é uma realidade (NASSU et al., 2003).
1.2. COMPOSIÇÃO QUÍMICA
O Requeijão do Norte é um derivado lácteo rico em proteínas (até 25%) e
gorduras (até 36%). Considerado um produto de elevado significado cultural para as
regiões nordestinas, constitui-se em uma variedade de queijo com características
peculiares, elevado valor nutricional e de grande participação na alimentação da
população brasileira (ABIQ, 2005).
Por definição o “Requeijão do Norte” é o produto obtido pela fusão prolongada
e agitação de uma mistura de manteiga e massa de coalhada de leite integral,
semidesnatado ou desnatado (BRASIL, 1997), o que justifica os elevados teores em
gorduras e proteínas encontrados neste queijo.
A fixação de identidade e os requisitos mínimos de qualidade para queijos
foram estabelecidos pela legislação, de acordo com a AOAC e o Codex
Alimentarius. Com isto, a classificação dos queijos é determinada a partir dos seus
teores de gordura e umidade. Em relação ao Requeijão do Norte, os teores de
gordura nos sólidos totais variam de 25% a 59,9%, enquadrando-se portanto à
classificação corresponde aos queijos gordos e semi-gordos. Quanto aos teores de
umidade, este produto pode ser considerado como queijo de baixa até muito alta
umidade, com teor máximo de 58% (BRASIL, 1996).
O conteúdo de lactose em ácido láctico é de 0.3% aproximadamente. A
composição do Requeijão do Norte é semelhante à de produtos descritos na
literatura como: Requeijão do Nordeste (VENTURA, 1987), quanto aos teores de
umidade, proteínas, cinzas e pH; Requeijão cremoso tradicional (HOFFMANN et al.,
2001) quanto ao pH; Queijo de Manteiga (NASSU et al., 2003), quanto aos teores de
umidade, proteínas e gordura.
18
1.3. TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DO REQUEIJÃO
O processo de fabricação tradicional de requeijões inicia-se com a
desnaturação de proteínas do soro de leite aquecido a aproximadamente 95 ºC,
seguido das etapas de drenagem, desacidificação e cozimento da massa, momento
em que são adicionados os sais fundentes (sais de fosfatos e polifosfatos que
melhoram a textura e a maciez do requeijão). Outra forma de se produzir requeijões
consiste na coagulação do leite integral cru, pasteurizado ou desnatado a partir da
adição de ácidos orgânicos, por coagulação enzimática (coalho) ou mesmo
espontânea, com ou sem adição de cultura láctica (FURTADO & LOURENÇO
NETO, 1994; PINTADO & MALCATA, 1999).
O fluxograma de fabricação artesanal do Requeijão do Norte de Minas Gerais
proposto neste trabalho está representado na Figura 1. A tecnologia de produção
envolve, basicamente, as seguintes etapas:
1. Coagulação : o leite cru é deixado à temperatura ambiente por até 48 horas para
formação da coalhada resultante da ação da microbiota acompanhante.
2. Retirada do creme : remoção da camada de gordura sobre a superfície da
coalhada que, posteriormente, será utilizada para a fabricação da Manteiga de
Garrafa.
3. Precipitação : a coalhada é aquecida à temperatura de aproximadamente 45 ºC
por 20 minutos. As micelas de caseína se agregam resultando na liberação de soro.
4. Primeira dessoragem : a massa é colocada em sacos de pano branco
higienizados para filtragem do leite. O conjunto é suspenso e deixado em repouso
até a retirada completa de soro da massa.
5. Desacidificação : água quente é adicionada, em quantidade suficiente para cobrir
a massa, com o intuito de reduzir a acidez excessiva da massa. Em seguida a
massa é novamente colocada em sacos brancos para drenagem. Paralelamente, o
mesmo volume de leite cru, utilizado no preparo da coalhada, é aquecido à
temperatura de 90 °C por aproximadamente 3 horas. E sta etapa além de auxiliar na
redução da acidez vai favorecer a formação da cor característica do produto, devido
á caramelização dos açúcares do leite, e contribuir para o aumento no rendimento
da massa.
19
6. Cozimento : a massa, ainda ácida, é submetida á cocção (100 °C) juntamente
com o leite caramelizado que esporadicamente são agitados, por um período de até
2 horas. Nesta etapa as proteínas do leite precipitam em razão do baixo pH da
massa e se incorporam à mesma, com mais desprendimento de soro. A adição de
cloreto de sódio à massa também ocorre nesta fase.
7. Segunda dessoragem : da mesma forma que a etapa 4.
8. Amassamento : feito vigorosamente e sobre aquecimento para homogeneizar a
massa e manteiga. Nesta etapa o bicarbonato de sódio pode ser adicionado. O
objetivo é elevar o pH para corrigir a acidez da massa e conseqüentemente evitar a
formação de produtos com massa quebradiça.
9. Adição de Manteiga de Garrafa: a manteiga é incorporada à massa. Cor, sabor
e aroma característicos são realçados nesta etapa.
10. Enformagem : a massa é colocada em formas de madeira e moldada. Os
requeijões são retirados das formas já frios e armazenados em caixas de papelão,
cobertos com plástico e mantidos à temperatura ambiente, até o momento em que
serão distribuídos aos pontos de venda.
Em relação à Manteiga de Garrafa, sua elaboração geralmente ocorre
paralela ao processamento do requeijão. As etapas do preparo são:
1. Batimento do creme de leite : feito manualmente por 15 minutos até o início da
inversão de fases.
2. Lavagem da massa : à massa é adicionada ¼ do seu volume de água gelada. Em
seguida é iniciado batimento vigoroso e o líquido desprendido é drenado.
3. Fusão e evaporação da água : nesta etapa a manteiga é aquecida para retirada
de água residual.
4. Filtração : a manteiga é filtrada, e posteriormente será utilizada para a fabricação
do Requeijão do Norte.
O leite é a matéria-prima utilizada na fabricação do requeijão, e constitui o seu
principal ingrediente. Devido à natureza de suas características físico-químicas e a
forma de sua obtenção, pode representar uma fonte potencial de contaminação.
Portanto, a obtenção higiênica do leite é o primeiro ponto crítico no processo de
fabricação de derivados lácteos (PERRY, 2004).
20
Figura 1 – Fluxograma proposto das etapas de produção artesanal do Requeijão do
Norte. Município de Salinas – MG.
Recepção do leite
Medição/Filtração
Coagulação
Retirada do creme
Aquecimento da massa
Primeira dessoragem
Soro Lavagem da massa
Adição de leite
Segunda dessoragem
Amassamento
Incorporação de Manteiga de Garrafa Salga
Amassamento
Enformagem
REQUEIJÃO DO NORTE
Cocção da massa
21
Por outro lado, como o requeijão sofre um tratamento térmico mais intenso do
que o da pasteurização do leite, não há necessidade de pasteurização da matéria-
prima, sob o ponto de vista higiênico-sanitário (OLIVEIRA, 1984).
Outros fatores que interferem diretamente sobre a qualidade final do requeijão
são o manuseio da coalhada, a quantidade de gordura adicionada, bem como o
tempo e temperatura utilizados durante o processamento. PINTADO & MALCATA
(1999) relataram que os teores de gordura e umidade do requeijão são afetados
positivamente pelo tempo e temperatura de aquecimento, bem como pela adição de
leite, quando o aumento da temperatura leva a uma maior retenção de gordura.
Outra etapa que pode influenciar os teores de gordura e umidade é o tempo gasto
durante a dessoragem, que difere muito entre os produtores (NASSU et al., 2003).
A escolha das condições ideais para a produção de Requeijão deve estar
aliada a um elevado rendimento da massa do produto. Associadas a isto estão
também a padronização do processo e a implantação de boas práticas de manejo,
do gado até as etapas da fabricação.
1.4. MICROBIOTA DE INTERESSE HIGIÊNICO-SANITÁRIO
A avaliação da presença de microrganismos deteriorantes ou patogênicos em
alimentos têm sido alvo de inúmeras pesquisas em todo o mundo. No caso do
Requeijão do Norte, por se tratar de um produto estritamente artesanal, nem sempre
pode ser garantida a inocuidade alimentar necessária. O produto não é maturado e a
utilização de leite clandestino é uma realidade na cadeia de produção.
No comércio, a situação hora avaliada demonstra que alguns produtores têm
sido autuados por irregularidades e más condições higiênico-sanitárias de seus
produtos. Os respectivos estabelecimentos são interditados temporariamente pelo
serviço de fiscalização sanitária local em diferentes municípios da região norte do
estado (relatos pessoais de atravessadores).
Estudos realizados com outros tipos de requeijão, também relataram a
presença de contaminantes e/ou patógenos associados às más condições higiênicas
devidas à manipulação (SOUSA et al., 2002; FEITOSA et al., 2003; LOURENÇO &
SOUSA, 2005).
22
Os padrões microbiológicos para alimentos definidos pela RDC N° 12 para
este produto referem-se aos Coliformes a 45 °C ou C oliformes Termotolerantes e
estafilococos coagulase positivos (BRASIL, 2001a). Ainda que não contemplado
pela legislação, o estudo da presença de estafilococos coagulase negativos se faz
necessário, uma vez que cepas enterotoxigênicas não são necessariamente
coagulase positivas (VERAS et al., 2007). Análises microbiológicas complementares,
aqui consideradas a estimativa de coliformes totais, pesquisa de Salmonella sp. e a
presença de microbiota deteriorante, determinada pela Contagem em Placas de
fungos e leveduras, contribuem, respectivamente, para a avaliação da presença de
contaminantes e/ou patógenos que possam oferecer risco à saúde humana e a
qualidade microbiológica do alimento.
1.4.1. Enterobactérias
Determinadas bactérias da família enterobacteriaceae (Salmonella, Yersinia,
Shigella, Escherichia) podem ser enteropatogênicas devido à capacidade de
produzirem enterotoxinas provocando alterações gastrointestinais (GLATZ &
BRUDVIG, 1980). Populações de enterobactérias indicam a qualidade higiênica do
produto, e sua presença pode estar relacionada à contaminação de origem fecal.
Contagens elevadas no leite e em queijos, evidenciam práticas inadequadas durante
a ordenha, fabricação, transporte e/ou a estocagem destes produtos (TORNADIJO
et al., 2001).
Os coliformes totais são bastonetes Gram negativos, não esporulados,
aeróbios ou anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção
de gás, em 24 a 48 horas a 35 ºC. O grupo é representado pelos gêneros
Citrobacter, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella dentre os quais encontram-se
bactérias do trato gastrointestinal de humanos, bem como de outros animais de
sangue quente (JAY, 2005).
Os coliformes fecais ou termotolerantes têm a mesma definição do grupo de
coliformes totais, porém, são capazes de fermentar a lactose com produção de gás
em 24 horas a 44,5 ºC. O índice de coliformes fecais é empregado como indicador
de contaminação fecal. Presume-se que a população desse grupo seja constituída
23
de alta proporção de Escherichia coli, que habita exclusivamente o trato intestinal do
homem e de outros animais (JAY, 2005).
As bactérias pertencentes ao gênero Salmonella são caracterizadas como
bacilos não esporulados, Gram negativos, sendo a maioria móvel. Habitam o trato
gastrointestinal do homem e de animais, especialmente aves e suínos (FRANCO &
LANDGRAF, 2002). Espécies deste gênero estão entre as mais importantes
causadoras de gastroenterites de origem alimentar, apresentando índices de
mortalidade de 4,1% conforme a idade, sendo crianças e idosos os mais
susceptíveis (FERNANDES et al., 2006).
Enterobactérias potencialmente patogênicas isoladas de queijos foram
relatadas por diferentes autores. FEITOSA et al. (2003) no estado do Rio Grande do
Norte detectaram a presença de bactérias do grupo coliforme e Salmonella spp. em
amostras de Queijo de Manteiga. Em um estudo realizado por LOURENÇO et al.
(2005) foram analisadas amostras de Requeijão Marajoara, um queijo típico do
estado do Pará, em que também foram encontradas contagens elevadas de
coliformes fecais (240 NMP/g). Os resultados obtidos destes trabalhos estão
relacionados às más condições higiênico-sanitárias encontradas nas queijarias,
principalmente das que trabalhavam com produção artesanal.
Melhores condições higiênicas foram encontradas em estudos feitos por
CAVALCANTE & COSTA (2005) em Queijo de Manteiga no Ceará, onde não foi
detectada a presença de coliformes devido ao curto período de estocagem a que o
produto estava submetido (até 5 dias sobre refrigeração).
1.4.2. Staphylococcus spp.
Os estafilococos são descritos como cocos Gram positivos, mesófilos,
anaeróbios facultativos, catalase positivos, termonuclease e coagulase positivos ou
negativos, não esporulados e halófilos (BERGDOLL, 1989; KLOOS, 1990). Os
estafilococos coagulase positivos foram subdivididos em quatro espécies: S. aureus,
S. intermedius, S. hyicus e S. delphini. Os estafilococos coagulase negativos foram
subdivididos em espécies de acordo com o perfil fisiológico que apresentam em
relação à utilização de carboidratos, produção de termonuclease, produção de
acetoína e hemólise (KLOOS, 1990; CARMO, 2001).
24
Estes microrganismos são ubíquos na natureza. Nos mamíferos os
estafilococos podem ser encontrados na mucosa e na pele. Já no homem, a
cavidade nasal é o seu principal hábitat. Portanto, os manipuladores de alimentos
quando portadores nasais ou que possuam feridas infectadas por S. aureus,
representam fontes potenciais de contaminação do alimento (FRANCO &
LANDGRAF, 2002).
A contaminação por espécies de estafilococos patogênicas em diversos tipos
de alimentos também está relacionada às características intrínsecas da espécie. No
caso de S. aureus, a capacidade de crescer em uma ampla faixa de temperatura
(7 °C a 48,5 °C) , e de pH ( 4,2 a 9,3) (LE LOIR et al., 2003), justificam seu
crescimento nos alimentos e sua presença também está relacionada à práticas
inadequadas de higiene e manipulação (REIBNITZ et al., 1998).
No Brasil, estudos relatam as condições microbiológicas encontradas em
queijos produzidos artesanalmente (LEITE et al., 2005; ALMEIDA & FRANCO,
2003). BORELLI et al. (2006a) observaram contagens de Staphylococcus spp. entre
2,5 x 106 e 2,0 x 106 UFC/g em amostras de queijo da Serra da Canastra em Minas
Gerais durante o processo de fabricação, sendo que S. aureus esteve presente em
70% das amostras de queijo, em contagens superiores a 104 UFC/g.
A contaminação de queijos processados ou fundidos, geralmente ocorre pós-
processamento, uma vez que estes produtos são submetidos a tratamento térmico
final na faixa de 85 ºC a 90 ºC (ESCUDERO, 1979). ASSUMPÇÃO et al. (2003)
relataram a presença de Staphylococcus coagulase positivos em amostras de queijo
prato produzidos em Lavras, Minas Gerais em contagens entre 1,0 x 104 e 2,3 x 105
UFC/g.
A importância dos estafilococos em alimentos é atribuída à capacidade de
produção de enterotoxinas, sendo que muitas linhagens produzem uma ou mais
destas proteínas (CARMO et al., 2004; NORMANO et al., 2005). As enterotoxinas
estafilocócicas são polipeptídeos de cadeias simples, hidrossolúveis, de peso
molecular entre 26.000 e 29.000 Daltons e resistentes a ação de enzimas
proteolíticas como a pepsina, tripsina e renina (BERGDOOL, 1989). São
classificadas de acordo com o tipo sorológico em enterotoxina estafilocócica (SE) A
(CASMAN & BENNETT, 1963), B (CASMAN et al., 1963), C (C1, C2, C3)
(BERGDOOL et al., 1965), D (CASMAN et al., 1967), E (BERGDOOL et al., 1971), G
25
(MUNSON & BETLEY, 1991), H (SU & WONG, 1995), I (MUNSON et al., 1998), J
(ZHANG et al., 1998), K (ORWIN et al., 2001) e a toxina da síndrome do choque
tóxico (TSST-1) citada por IANDOLO (1989). Genotipicamente foram identificadas
nove tipos de enterotoxinas: K (ORWIN et al., 2001), L (FITZGERALD et al., 2001),
M, N, O (JARRAUD et al., 2001), P, Q (YARWOOD et al., 2002), R (OMOE et al.,
2003) e U (LETERTRE et al., 2003).
O quadro clínico observado na intoxicação estafilocócica é caracterizado por
vômito e diarréia, 30 minutos a 8 horas após a ingestão de alimento contaminado. A
dosagem mínima de enterotoxina causadora desses sintomas em seres humanos
pode variar de 100 ng a 1 µg (BERGDOOL, 1989). Acredita-se que sejam
necessárias entre 105 e 106 UFC de Staphylococcus aureus por grama de alimento
para que haja produção de enterotoxinas em quantidade suficiente para causar
intoxicação alimentar (CARMO & BERGDOOL, 1990).
As enterotoxinas apresentam a propriedade de termoresistência por isso
persistem nos alimentos após tratamento térmico, o que constitui ponto crucial em
controle de qualidade de alimentos (PEREIRA et al., 1999). Surtos envolvendo o
consumo de queijos, leite e derivados já foram registrados em decorrência da
presença das enterotoxinas estafilocócicas A, B, C2, D, H e TSST-1 (CARMO, 2001).
Em Minas Gerais, surtos envolvendo produtos lácteos como queijos já foram
registrados. Durante os períodos de 1988 a 1989 foram relatados 18 casos de surto
de intoxicação alimentar estafilocócica, em Belo Horizonte, dos quais dez casos
estavam relacionados à ingestão de queijo Minas e oito casos, por bolo confeitado
(CARMO & BERGDOOL, 1990).
A produção da enzima coagulase é um dos critérios mais utilizados para
identificação de S. aureus. Existe uma estreita relação entre a produção de
coagulase e a possibilidade do estafilococo ser enterotoxigênico, embora ocorram
na literatura relatos de estafilococos coagulase negativo produtores de enterotoxinas
(CARMO et al., 2001; BORELLI et al., 2006a; VERAS et al., 2007). Linhagens
coagulase-negativas referentes às espécies S. epidermidis, S. xylosus, S. capitis, S.
sciuri, S. warneri e S. saprophyticus também são microrganismos capazes de
produzirem enterotoxinas (SENA, 2000; BORELLI et al., 2006a).
SENA (2000) relatou a presença de “pools” de Staphylococcus coagulase-
negativos produtores de enterotoxinas e TSST-1 em amostras de queijo Coalho
26
comercializadas em Recife - Pernambuco. PIMENTEL et al., (2002) observaram a
presença de Staphylococcus coagulase-negativos produtores de enterotoxinas em
queijo ralado. As contagens variaram de 102 a 103 UFC/g, sendo detectadas SEB,
SEC e SED nas amostras estudadas. BORELLI et al., (2006a) detectaram a
presença de Staphylococcus coagulase negativos produtores de enterotoxinas B, C,
D e TSST-1 em queijo Canastra, indicando contaminação antes, durante e pós
processamento do produto. Esses dados evidenciam a importância da pesquisa de
Staphylococcus spp. e a necessidade de melhora das condições de processamento
e manipulação de queijos a partir de Boas Práticas de Fabricação (BPF).
2. LEVEDURAS EM PRODUTOS LÁCTEOS
Leveduras têm sido freqüentemente isoladas de queijos, sendo consideradas
como componentes importantes da microbiota de muitas, se não de todas as
variedades de queijos. Estes microrganismos são responsáveis pela produção de
compostos aromáticos resultantes das atividades lipolítica e proteolítica de
determinadas espécies, que em conjunto com os ácidos orgânicos presentes são
responsáveis pelas características finais do queijo (FLEET, 1990; WELTHAGEN &
VILJOEN, 1999; ADDIS et al. 2001; CORSETTI et al., 2001).
A presença de leveduras em contagens elevadas nos queijos está
relacionada à sua capacidade de tolerar bem os ambientes com baixo pH, atividade
de água reduzida e elevadas concentrações de sal. Além disto, esses
microrganismos possuem a habilidade de crescerem em baixas temperaturas de
estocagem, como acontece, por exemplo, nos ambientes para maturação de queijos
(FERREIRA & VILJOEN, 2003).
Normalmente as leveduras não causam prejuízos aos produtos lácteos, sob o
ponto de vista sensorial, a menos que ocorra a fermentação de lactose. Neste caso,
podem ser relacionados efeitos depreciativos a estes produtos como: formação
excessiva de gás, alterações na cor e textura dos produtos além de aroma e sabor
de frutas (FLEET, 1990; JAKOBSEN & NARVHUS 1996; BERESFORD et al., 2001).
Trabalhos sobre a ocorrência de leveduras isoladas em queijos relatam
contagens de 105 até 108 UFC/g, encontradas nestes produtos (FLEET, 1990;
ROOSTITA & FLEET, 1996; BORELLI et al., 2006b; LAURENCIK et al., 2008). As
27
leveduras de maior ocorrência em queijos referem-se a Debaryomyces hansenii,
Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica e diversas espécies de Candida
(PEREIRA-DIAS et al., 2000; VILJOEN, 2001; FADDA et al., 2004).
As leveduras estão presentes com freqüência no ambiente de fabricação de
laticínios, aparecendo muitas vezes como contaminantes naturais no leite cru, nas
mãos de manipuladores e nos utensílios utilizados durante o processamento
(WYDER & PUHAN, 1999). Normalmente a contaminação dos equipamentos deve-
ser atribuída às práticas de higiene inadequadas (VILJOEN & GREYLING, 1995).
3. OCORRÊNCIA DE FUNGOS FILAMENTOSOS
Os fungos são microrganismos ubíquos na natureza e de fácil disseminação,
seja pelo ar, pela água ou pelo solo, contaminando com freqüência os alimentos. O
mesmo pode ocorrer nos diferentes sítios da linha de processamento de queijos ou
mesmo ao produto final (HOCKING, 1997). A facilidade com que se desenvolvem
sobre a superfície de queijos é devida à capacidade que possuem em crescer sob
condições adversas aos outros microrganismos como baixas temperaturas, atividade
de água e pH, elevadas concentrações de sal e pouca disponibilidade de
carboidratos (HOCKING, 1997; COUSIN, 2003).
A ocorrência de fungos em queijos é desejável quando envolve a produção de
queijos maturados do tipo azul, onde a presença destes microrganismos é
indispensável (LÓPEZ-DÍAZ et al., 1996). Segundo HOCKING & FAEDO (1992) o
crescimento de fungos filamentosos pode ser considerado como um problema de
ocorrência esporádica na superfície de queijos duros e naqueles embalados a
vácuo. Os gêneros de maior ocorrência nos queijos relatados na literatura incluem:
Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Eurotium, Fusarium e Mucor (BULLERMAN &
OLIVIGNI, 1974; ARAN & EKE, 1987; HOCKING & FAEDO, 1992; TANIWAKI &
VAND DENDER, 1992; LUND et al., 1995).
Em certos tipos de queijos duros e naqueles embalados a vácuo, o
crescimento de fungos filamentosos pode ser considerado como problema, uma vez
que provocam a degradação destes produtos, descoloração da superfície e/ou a
produção de odores indesejáveis (HOCKING & FAEDO, 1992; KURE & SKAAR,
2000; BACHMANN et al., 2005).
28
A contaminação por fungos filamentosos em queijo Tulum foi estudada por
ERDOGHAN et al., (2003) detectando a presença de Penicillium roqueforti como a
espécie predominante (75%) e Geotrichum candidum (25%). KURE et al. (2004) na
Noruega encontraram grande diversidade de fungos, sendo Penicillium o gênero de
maior freqüência nos queijos. Em estudos feitos por BACHMANN et al. (2005) a
ocorrência de fungos isolados de manchas na superfície de queijos suíços
maturados foi relatada. Fusarium domesticum foi a espécie predominante, sendo
integrante da microbiota natural que, conforme os autores, possuem ação benéfica
para o produto.
O crescimento de fungos pode também representar riscos à saúde, devido a
possibilidade de produção de micotoxinas (PITT & CRUICKSHANK, 1990; FRISVAD
& THRANE, 1995). LÓPEZ-DÍAZ et al. (1996) na Espanha detectaram a presença de
Aspergillus potencialmente produtores de aflatoxina em duas variedades de queijo
maturado contaminados por fungos. ERDOGAN et al., (2003) na Turkia isolaram
linhagens de Penicillium roquefort com capacidade de produzir micotoxina em queijo
Tulum.
4. AFLATOXINAS
As aflatoxinas são metabólitos secundários de baixo peso molecular
produzidos por diferentes espécies de fungos filamentosos, capazes de
desencadear efeitos tóxicos em animais e humanos (PERAICA et al., 2000). Sua
ocorrência é maior em países de clima quente e úmido onde os fungos encontram
condições favoráveis ao seu crescimento (GIMENO, 2004).
O interesse pelo estudo das aflatoxinas surgiu a partir da década de 60
quando um grave acidente econômico ocorrido na Inglaterra provocou a morte de
mais de 400.000 perus. O desaparecimento dos sintomas era observado com a
troca das rações. Posteriormente, constatou-se que as rações produzidas com farelo
de amendoim contaminados por Aspergillus flavus estavam associadas à morte
destes animais. A doença foi denominada Turkey X Diseases (SCUSSEL, 1998).
Na literatura já foram registrados 18 tipos de aflatoxinas até o presente
momento, dentre as quais, destacam-se a aflatoxina B1 (AFB1) e a aflatoxina M1
(AFM1), um derivado metabólico de AFB1, como as aflatoxinas mais tóxicas. Outras
29
aflatoxinas importantes são G1, M2, B2 e G2, aqui relacionadas em ordem
decrescente de toxicidade.
Tanto AFM1 quando AFM2 podem ser encontradas no leite e na urina de
animais após a ingestão de rações contaminadas (SCUSSEL, 1998; GIMENO &
MARTINS, 2000; PERAICA et al., 2000). Em alimentos armazenados a temperatura
de 25 ºC e atividade de água de 0,95, espécies do gênero Aspergillus encontram as
condições adequadas para a produção de aflatoxinas. Linhagens de A. flavus por
exemplo, podem produzir aflatoxinas em temperaturas que variam de 6 ºC a 45 ºC
dependendo do substrato em que aparecem (HESSELTINE 1976).
Entre os efeitos provocados pela ingestão das aflatoxinas foram relatados a
atividade imunossupressora a partir da inibição de fagocitose e a inibição da síntese
protéica em nível de ribossomos, com alteração de absorção dos aminoácidos,
efeitos mutagênicos, teratogênicos e carcinogênicos, sendo o fígado o órgão alvo.
Os sintomas apresentados pela ingestão de alimentos contaminados são: leve
desconforto gastrointestinal, febre, edema dos pés, vômitos e em alguns casos
morte súbita (SCUSSEL, 1998; GIMENO, 2004; PERAICA et al., 2000).
Trabalhos relatados na literatura evidenciam que a contaminação de queijos
com AFM1 é freqüente. Na Itália, durante os períodos de 1991 a 1994, 223 amostras
de queijo tipo Grana Padano foram analisadas. Foi constatado que 91% dos queijos
estavam contaminados por AFM1 em concentrações de 0,005 a 0,100 µg/Kg e em
6,7% apresentaram níveis de 0,100 a 0,250 µg/Kg (PEITRTI et al., 1997). Em estudo
realizado por SARIMEHMETOGLU et al. (2004) na Turkia foi observado a presença
de AFM1 em amostras de queijo em quantidades de até 250 ng/kg. Outros trabalhos
também relatam a ocorrência de AFM1 em queijos e requeijões em níveis
inadequados para consumo, TEKINSEN & UÇAR (2008) na Turkia e VIRDIS et al.,
(2008) na Itália.
Em estudo realizado por PRADO et al. (2001) a ocorrência de aflatoxina M1
em queijo Prato e queijo Parmesão ralados comercializados na cidade de Belo
Horizonte – MG foi avaliada. Os autores detectaram a presença dessa aflatoxina em
100% das amostras de queijo prato analisadas em concentrações de até 0,54 ng/g e
em 93% das amostras de queijo parmesão em até 0,30 ng/g.
Os níveis de AFM1 estabelecidos para leite e derivados são variáveis nos
diferentes países, devido a divergências quanto à avaliação do risco ou às questões
30
econômicas (STOLOFF et al., 1991). Na União Européia o nível máximo de AFM1
em leite é de 50 ng/kg enquanto no Codex Alimentarius este valor é de 500 ng/kg.
Em relação aos queijos, países como a Holanda (200 ng/kg), Suíça (250 ng/kg) e
Itália (450 ng/kg) adotaram seus próprios limites para AFM1, principalmente pelo fato
de que a União Européia ainda não estabeleceu um limite máximo para estes
produtos (FAO, 2003). As normas estabelecidas pelo Codex Alimentarius foram
adotadas conjuntamente por países que compõem o MERCOSUL entre eles
Argentina, Brasil, Paraguai e Uruguai (GIMENO & MARTINS, 2000).
Em relação à AFM1 mesmo sendo hidrossolúvel, sua presença em queijos se
mantém após a dessoragem provavelmente pela associação com a caseína. Pode
também ser destacada a estabilidade que AFM1 possui em queijos e derivados
lácteos quanto ao processamento térmico. YOSEF & MARTH (1989) realizaram um
estudo sobre a estabilidade de AFM1 em determinados tipos de queijo, e
constataram que não ocorre redução nos níveis de AFM1, tanto durante o processo
de elaboração quanto após a cocção a 82-100 °C.
5. BOAS PRÁTICAS DE FABRICAÇÃO
As Boas Práticas de Fabricação (BPF) representam um conjunto de
procedimentos pré-determinados para assegurar a obtenção de produtos inócuos e
de qualidade higiênico-sanitária adequada durante o processamento de alimentos
até o produto final (CNI/SENAI/SEBRAE, 1999).
As portarias 326 da Secretaria de Vigilância Sanitária e 368 do Ministério da
Agricultura e do Abastecimento estabelecem conceitos e procedimentos, objetivando
a promoção e certificação da qualidade em termos de serviços, processos e
produtos, enquadrando-se nos atuais conceitos de melhoria contínua de qualidade e
prevenção de riscos (LOPES JR. et al., 2000).
Além da qualidade e segurança de alimentos, outros fatores positivos podem
ser atribuídos às BPF como melhoria econômica, competitividade e clientela
garantida (SOUZA et al., 1998). As BPF representam uma ferramenta de suporte
para implementação da APPCC (Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle)
um programa reconhecidamente internacional para garantia de controle de
qualidade (LOPES JR. et al., 2000; MARTINS & GERMANO, 2005).
31
Anteriormente à avaliação das boas práticas de fabricação é necessário
conhecimento prévio das características do produto e do processo de elaboração
envolvidos, para que possam ser avaliados os principais perigos e riscos de
contaminação, atuando de modo adequado à sua eliminação (PAZ et al., 1999).
Trabalhos na literatura relatam a necessidade de melhoria das condições
higiênicas e sanitárias em unidades de processamentos de queijos, bem como a
implantação de boas práticas de fabricação para estes produtos (TORNADIJO et al.,
2001; ASSUMPÇÃO et al., 2003; CARVALHO et al., 2005; SOUSA et al., 2005;
BORELLI et al., 2006a).
LOURENÇO & SOUSA (2005), estudando as características microbiológicas
e sensoriais do Requeijão Marajoara produzido no Pará, observaram a presença de
fungos e leveduras ao longo do período de estocagem do produto e constataram
condições higiênicas insatisfatórias.
LIMA (2005) avaliou as condições de produção do Queijo Minas artesanal
produzido na Serra do Salitre – MG. Após a implementação de BPF a autora
verificou a melhora da qualidade do produto, mesmo utilizando o leite cru, uma vez
que os padrões microbiológicos analisados estavam em conformidade com a
legislação. A implantação de BPF foi também acompanhada por SILVEIRA (2005)
em uma fábrica de queijo na região sul de Minas Gerais. A partir da identificação das
não conformidades durante todo o processo de elaboração, nas instalações,
equipamentos entre outros itens, a implantação de BPF para melhoria da qualidade
do produto foi alcançada.
6. MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE FUNGOS E L EVEDURAS
Historicamente, os sistemas de classificação de organismos baseiam-se em
características observáveis, isto é a análise dos caracteres fenotípicos. A
classificação e identificação de fungos, ao contrário de outros patógenos importantes
como as bactérias e os vírus, baseiam-se principalmente em critérios morfológicos.
O crescimento de cepas em meios de cultivo apropriados permitem o
reconhecimento de suas características mais importantes, como a cor e o aspecto
da colônia, o estado sexual (teleomorfo) e assexual (anamorfo) dos isolados,
32
estruturas de formação de esporos e características fisiológicas como a habilidade
em utilizar variadas fontes de carbono e nitrogênio (GUARRO et al., 1999).
Por outro lado, a análise fenotípica tem sido muito criticada pela falta de
padronização e terminologia estável, além de sua elevada subjetividade. Isto porque
determinadas características fenotípicas são consideradas instáveis e dependentes
de condições ambientais, que geralmente variam quando em condições de cultivos
artificiais. Outra limitação clara na identificação fenotípica é que a mesma não pode
ser aplicada a fungos que são incapazes de crescerem em determinados tipos de
cultivo (GUARRO et al., 1999).
A combinação das características morfológicas e fisiológicas é
tradicionalmente utilizada em estudos taxonômicos de fungos e leveduras.
Entretanto, nas últimas décadas, métodos moleculares têm sido desenvolvidos e
aplicados universalmente, em combinação aos métodos fisiológicos, ampliando
novas áreas de investigação dentro da sistemática e tornado possível a identificação
de novas espécies de fungos (KURTZMAN & FELL, 1998; DE BARROS LOPES et
al., 1998).
Entre os métodos de comparação do DNA nuclear, estudos de reassociação
de DNA (KURTZMAN & PHAFF, 1987), sequenciamento, Restriction Fragment
Length Polymorphisms - RFLP (BRUNS et al., 1991), Random Amplified Polimorphic
DNA - RAPD (HADRYS et al., 1992) e impressão genética por PCR são
frequentemente aplicados no estudo de identificação de espécies.
KURTZMAN & ROBNETT (1998) realizaram um estudo comparativo
envolvendo aproximadamente 500 espécies de leveduras identificadas pela análise
de sequências divergentes no domínio D1/D2 da subunidade maior do DNA
ribossomal 26S com resultados satisfatórios.
No estudo de taxonomia de fungos e leveduras, a aplicação da técnica de
PCR tem sido muito útil como ferramenta no auxílio de identificação de cepas em
laboratório, a partir da utilização de primers sintéticos que são específicos à regiões-
alvo.
DE BARROS LOPES et al. (1996) desenvolveram um método simples,
econômico e rápido para a diferenciação e identificação de linhagens de leveduras
utilizadas como culturas iniciadoras na fermentação de vinhos. Foram utilizados para
a técnica de PCR oligonucleotídeos sintetizados a partir de seqüências
33
complementares a sítios de rearranjo de íntrons, cujos alvos são as regiões
mutáveis no genoma de leveduras. Com esta técnica é possível diferenciar de
maneira segura um grande número de isolados de leveduras ao mesmo tempo.
Outra técnica eficiente é a utilização de primers de microsatelites sintetizados
a partir de seqüências de oligonucleotídeos que se repetem como por exemplo o
primer (GTG)5. Este método tem sido utilizado por diferentes autores como
ferramenta no auxílio da identificação de diferentes espécies de fungos
(LIECKFELDT et al., 1993, BRASILEIRO et al., 2004).
34
OBJETIVOS
1. OBJETIVO GERAL
Caracterizar microbiológica e físico-quimicamente o Requeijão do Norte,
comercializado na cidade de Belo-Horizonte – MG e identificar por técnica de
PCR a microbiota fúngica (bolores e leveduras) desse produto.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.1. Determinar a composição físico-química do requeijão.
2.2. Avaliar as condições higiênico-sanitárias das amostras de Requeijão
do Norte comercializadas em Belo-Horizonte, a partir da quantificação
de microrganismos indicadores e patogênicos (Coliformes Totais,
Coliformes Termotolerantes, E. coli, Staphylococcus spp. e Salmonella
spp.).
2.3. Determinar a presença do gene para coagulase em isolados de
Staphylococcus spp.
2.4. Verificar a presença de enterotoxinas estafilocócicas (SEs) A, B, C, D e
TSST-1 nas amostras de requeijão.
2.5. Caracterizar por métodos clássico e molecular as populações de
leveduras presentes no requeijão.
2.6. Identificar a presença de leveduras com atividade enzimática.
2.7. Caracterizar por métodos clássico e molecular as populações de
bolores presentes no requeijão.
2.8. Identificar e quantificar a presença de aflatoxinas nas amostras de
requeijão.
2.9. Estabelecer um fluxograma de produção, a partir do acompanhamento
do processo artesanal de fabricação do requeijão.
2.10. Avaliar uma unidade produtora e estabelecer propostas de ações para
implantação de BPF, com vistas à melhoria da qualidade e segurança
do produto.
35
CAPÍTULO I – CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS E
FÍSICO-QUÍMICAS DO REQUEIJÃO DO NORTE
RESUMO
Indicadores microbiológicos de qualidade higiênica e sanitária como presença
de Staphylococcus coagulase positivos, Coliformes Totais, Coliformes
Termotolerantes, E. coli e Salmonella spp., fungos e leveduras, foram investigados
em 25 amostras de Requeijão do Norte, um queijo semi-duro tradicional no Brasil.
Staphylococcus coagulase positivos foram encontrados em contagens de até 9,4 log
UFC/g. A presença do gene da coagulase foi detectada mesmo em isolados
fisiologicamente classificados como coagulase negativos. A enterotoxina
estafilocócica B e a toxina TSST-1 foram detectadas em duas das amostras.
Salmonella spp. não foram detectadas. As contagens de Coliformes Totais e de
fungos e leveduras foram elevadas, e as de Coliformes Termotolerantes estavam
acima do permitido pela legislação brasileira. Os valores médios percentuais para os
parâmetros físico-químicos (proteína, umidade, gordura e cinzas) e a atividade de
água apresentaram grandes variações. Estes resultados sugerem a diversidade na
composição físico-química e indicam um possível risco para a saúde publica que o
consumo deste produto tradicional pode representar para a população.
Palavras-chave: Requeijão do Norte; Queijo de Manteiga; Staphylococcus
coagulase positivos; análises microbiológicas; análises físico-químicas.
36
ABSTRACT
Microbiological indicators of hygienic quality and health as the presence of
coagulase-positive Staphylococci, total coliforms, thermotolerant, E. coli, Salmonella
spp., molds and yeasts, were investigated in 25 samples of ‘Requeijão do Norte’, a
semi-hard cheese traditionally in Brazil. Coagulase-positive Staphylococci were
found in quantities of up to 9.4 log cfu/g. The coagulase gene was detected in
isolates physiologically classified as coagulase-negative. The staphylococcal
enterotoxin B and TSST-1 were detected in two samples. Salmonella spp. were not
detected. The counts of total coliforms and moulds were of high, and of
thermotolerant coliforms were above the permitted by Brazilian legislation. For the
physico-chemical parameters, the average values (protein, moisture, fat and ash)
and water activity showed large variations. These results suggest a diversity in
physico-chemical composition and indicate a possible risk to public health that the
traditional consumption of this product may represent the population.
Keywords: Requeijão do Norte; butter cheese; coagulase-positive Staphylococci;
microbial analysis; physical-chemical analysis.
37
I.1. INTRODUÇÃO
O Requeijão do Norte é um produto feito de forma artesanal, em pequenas
propriedades rurais (NASSU et al., 2003; SILVA et al., 2006), sendo tradicional na
região Norte do estado de Minas Gerais. O processo de fabricação deste requeijão
envolve a utilização de leite integral cru, na maioria das vezes acumulado a partir de
ordenhas realizadas em períodos distintos. Ao início do processo o leite é acidificado
naturalmente, o creme que flota é separado, e o leite coalhado é aquecido a 45 ºC,
quando então é feita a retirada do soro. A massa é novamente aquecida a
temperaturas de até 90 °C, quando é lavada sucessiv amente com água e adicionada
de leite fresco para a redução dos níveis de acidez. Ao final desse processo, é
acrescentado à massa, ainda quente, o sal juntamente com uma manteiga especial,
denominada de Manteiga de Garrafa (BRASIL, 2001b). Esses ingredientes são
então misturados à massa e o requeijão ainda quente é colocado em formas de
madeira, onde passa por resfriamento natural. O produto é normalmente
comercializado sem embalagem, o que favorece a contaminação microbiana.
Em outros lugares do Brasil o Requeijão do Norte é também conhecido como
Queijo de Manteiga, sendo citado em literatura internacional (FAO, 1990) como um
produto brasileiro tradicional que é produzido em maior escala nas regiões sudeste e
nordeste do país. A tradicional denominação “Requeijão do Norte” foi regulamentada
pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento nos Padrões Técnicos de
Identidade e Qualidade (BRASIL, 1997). O Requeijão do Norte é bastante apreciado
em diferentes regiões do país e constitui-se de grande valor social, cultural, e
econômico. Devido ao processo de fabricação ocorrer muitas vezes em condições
de higiene inadequadas, patógenos como Staphylococcus aureus, Escherichia coli e
Salmonella spp. podem estar presentes nesse produto passando a representar um
risco potencial para a saúde dos consumidores (LELOIR, 2003; RODRÍGUEZ et al.,
2005). A presença de Staphylococcus coagulase positivos e a ocorrência de
enterotoxinas em alimentos são parâmetros importantes para a avaliação do risco
sanitário para os consumidores (AARESTRUP et al., 1995; LELOIR, 2003). Em vista
da produção artesanal do Requeijão do Norte e das situações de risco que os
consumidores desse produto podem estar expostos, foi realizado esse estudo, para
avaliar as populações de Staphylococcus coagulase positivos, a presença de
38
enterotoxinas estafilocócia (SE) A, B, C, D e a toxina TSST-1, Coliformes Totais,
Coliformes Fecais e Salmonella spp., fungos e leveduras além das suas
características físico-químicas.
I.2. MATERIAL E MÉTODOS
I.2.1. COLETA DE AMOSTRAS
Um total de 25 amostras de Requeijão do Norte foram coletadas,
aleatoriamente, entre os períodos de setembro de 2005 a abril de 2006. As coletas
foram realizadas em mercado varejista na cidade de Belo-Horizonte, Minas Gerais.
As amostras apresentavam a mesma origem (região nordeste do estado de Minas
Gerais) e procedências diversas (produzidas em diferentes fazendas). As amostras
foram coletadas em embalagens assépticas e transportadas ao laboratório sobre
refrigeração para análise microbiológica. Frações de cada amostra foram retiradas
para a realização de análises microbiológicas. O restante das amostras foram
armazenadas a -20 °C para as análises posteriores.
I.2.2. ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS
Amostras de 25 g de cada requeijão foram homogeneizadas em 225 mL de
água peptonada tamponada 0,1% com o auxílio de um Stomacher 400 Lab Blender
(London, UK) por um minuto. Diluições decimais adequadas foram preparadas
utilizando o mesmo diluente. Para a determinação do número mais provável de
Coliformes Totais, Coliformes Termotolerantes e E. coli foi realizada a técnica dos
tubos múltiplos utilizando três séries de três tubos. A partir de diluições seriadas, 1
mL de cada amostra foi inoculado em tubos contendo caldo lauril sulfato triptose
(Difco, USA) seguido de incubação a 35-37 °C por 24 a 48 horas. Dos tubos
considerados positivos, turvos e com bolhas de gás no interior do tubo de Duhran,
uma alçada foi transferida para caldo verde brilhante bile a 2% (Difco, USA) para
confirmação da presença de bactérias do grupo coliforme. Os tubos foram incubados
a 35-37 ºC por 48 horas. A presença de gás no interior do tubo de Durhan foi
considerada como resultado positivo. Posteriormente, dos tubos contendo caldo
39
verde brilhante bile 2% positivos, uma alçada foi transferida para tubos contendo
caldo EC Mug (Difco, USA), para a confirmação da presença de Coliformes
Termotolerantes e E. coli. Os tubos foram incubados em banho-maria a
44,5 ± 0,5 ºC durante 24 a 48 horas. As amostras foram consideradas positivas
quando houve formação de bolhas no interior do tubo de Duhran para Coliformes
Termotolerantes e a presença de fluorescência sob luz ultravioleta (UV 600nm) para
E. coli. Os resultados foram expressos em NMP/g (DOWNES & ITO, 2001).
Para detectar a presença de Salmonella spp. foi realizado um pré-
enriquecimento em água peptonada tamponada 1% estéril (24 h a 37 ºC) seguido do
enriquecimento seletivo em caldo selenito cistina (Biobrás, Brasil) e caldo
Rapapport-Vassiliads (Biobrás, Brasil). Os tubos foram incubados a 35 ºC e 42 ºC
por 24h, respectivamente. As culturas foram estriadas por esgotamento na superfície
de ágar Salmonella-Shigella (Biobrás, Brasil) e ágar Hektoen entérico (Biobrás,
Brasil). As placas foram incubadas a 35 ºC por 48 h. Colônias típicas foram testadas
para confirmação em Triple Sugar Iron agar (TSI) (Oxoid, UK) e Lysine Iron Agar
(LIA) (Oxoid, UK), teste de urease (Urea Broth, Oxoid, UK) e testes sorológicos
polivalentes como antígeno flagelar (H) e somático (O) (DOWES & ITO, 2001).
As populações de fungos e leveduras foram determinadas em ágar batata
dextrose (Difco) acidificado com uma solução estéril de ácido tartárico a 10%
(SILVA, 2001). O isolamento em profundidade foi realizado a partir de 1,0 mL das
diluições decimais adequadas, sendo as placas incubadas a 28 °C por cinco dias.
Para a determinação de Staphylococcus spp. foi realizada a contagem em
placas contendo ágar Baird-Parker (Biobrás - Brasil) enriquecido com gema de ovo e
adicionado de telurito de potássio. As placas foram incubadas a 37 °C por 48 h.
Após o crescimento, colônias típicas e atípicas foram classificadas segundo as
seguintes características típicas para Staphylococcus: coloração negra ou cinza
brilhante, forma arredondada, convexa, com bordos regulares, circundadas por um
halo branco (lipase) e um outro externo, maior e transparente (protease). Foram
consideradas atípicas as colônias cinzentas, ou negras brilhantes desprovidas de
halos, ou apresentando apenas um deles. Colônias isoladas de cada amostra, sendo
cinco típicas e cinco atípicas, foram selecionadas e transferidas para tubos contendo
ágar nutriente (cultura estoque) e testadas para a presença de coagulase e
termonuclease (TNase), fermentação anaeróbica de glicose e manitol e produção de
40
hemolisina em ágar sangue de carneiro para a identificação bioquímica de S. aureus
ou espécies coagulase positivas (DOWNES & ITO, 2001).
I.2.3. DETECÇÃO DO GENE DA COAGULASE EM ISOLADOS DE
Staphylococcus spp.
Os isolados de Staphylococcus spp. que apresentaram fenótipo negativo para
o teste de coagulase foram analisados quanto à presença do gene da coagulase
utilizando a técnica da reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction
- PCR). A extração de DNA e a PCR foram feitas segundo metodologia descrita em
AARESTRUP et al. (1995). Os primers específicos para o gene da coagulase Coa1
(5' ACCACAAGGTACTGAATCAACG 3') e Coa2 (5' TGCTTTCGATTGTTCGATGC
3') foram usados para amplificar fragmentos de aproximadamente 987 pb. Os
amplicons foram analisados em gel de agarose a 1%, corados com brometo de
etídio e fotografados.
I.2.4. DETECÇÃO DE ENTEROTOXINAS DE Staphylococcus spp.
A extração de enterotoxinas das amostras de Requeijão do Norte foi realizada
de acordo com os procedimentos descritos em CARMO et al. (2001). A presença de
enterotoxinas nos extratos do alimento foi analisada em triplicata utilizando o método
de Sensibilidade Ótima em Placas (Optimum Sensibility in Plate - OSP), como
descrito por ROBBINS et al. (1974). Os extratos foram testados contra os padrões
das enterotoxinas A, B, C, D, E, e da TSST-1. O limite de detecção do teste foi de
0,5 µg/g no alimento.
I.2.5. DETERMINAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍM ICAS DO
REQUEIJÃO DO NORTE
As características físico-químicas das amostras de Requeijão do Norte foram
determinadas pelas análises de umidade, proteínas, cinzas, gorduras, gordura no
extrato seco, acidez titulável e pH, conforme BRASIL (2003), e adicionalmente, a
atividade de água (aw) foi determinada utilizado o equipamento Texto 650 (Texto
41
GmbH & Co., Germany), de acordo com as recomendações do fabricante. Todas as
análises foram realizadas em triplicata.
I.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Contagens elevadas de Coliformes Totais foram encontradas em 16 das
amostras analisadas (Tabela 1). Coliformes Termotolerantes foram encontrados em
contagens superiores a 1100 pelo número mais provável em cinco das amostras e
contagens de 460 NMP/g em três amostras. Estes valores excederam a quantidade
máxima permitida pela legislação brasileira que é de 100 NMP/g, para este tipo de
produto (BRASIL, 2001). Estes resultados sugerem que as condições de produção
do Requeijão do Norte favoreceram a contaminação por Coliformes
Termotolerantes, em decorrência de práticas inadequadas de processamento e
manipulação dos ingredientes, ou mesmo do produto final após processamento. Em
oito amostras, E. coli foi detectada em contagens elevadas (20 a 460 NMP/g). A
presença de altas contagens de E. coli nas amostras também sugerem a falta de
procedimentos higiênicos adequados durante toda a cadeia de produção do
requeijão, incluindo a comercialização do produto sem embalagem. Salmonella spp.
não foram detectadas nas amostras estudadas.
Staphylococcus coagualse positivos foram identificados e quantificados em dez
das amostras analisadas. Níveis elevados de contaminação com Staphylococcus
coagualse positivos também foram encontrados em amostras de queijo da Serra da
Canastra em Minas Gerais (2,0X106 UFC/g) BORELLI et al. (2006).
42
Tabela 1 – Coliformes Totais, Termotolerantes, Escherichia coli, Staphylococcus spp., Staphylococcus coagulase positivos e fungos presentes em amostras de Requeijão do Norte obtidas em mercado varejista de Belo Horizonte.
Amostra Coliformes
Totais1
Coliformes
Termotolerantes1
E. coli 1 Staphylococcus
spp.2
Staphylococcus
coagualse positivos2
Fungos2
1 93 43 43 9,48 6,36 6,48
2 240 21 21 9,48 7,14 6,48
3 75 23 23 9,48 - 6,48
4 43 <3 <3 7,99 - 7,22
5 >1100 <3 <3 7,72 - <0,48
6 >1100 >1100 <3 8,29 - <0,48
7 23 <3 <3 7,57 - <0,48
8 >1100 >1100 <3 8,47 - 8,16
9 210 210 <3 9,48 7,14 8,27
10 93 93 <3 9,48 - 8,24
11 >1100 >1100 <3 9,48 - 8,06
12 >1100 >1100 <3 9,48 - 8,32
13 >1100 >1100 4 9,08 - 8,20
14 460 21 20 8,32 - 7,93
15 240 <3 <3 9,48 - 6,48
16 >1100 <3 <3 9,46 - 8,47
17 >1100 <3 <3 9,48 9,08 6,48
18 <3 <3 <3 8,08 8,08 6,48
19 1100 <3 <3 9,06 8,95 8,38
20 <3 <3 <3 9,48 9,48 6,48
21 <3 <3 <3 9,48 - 8,13
22 23 23 23 9,48 7,78 6,48
23 240 240 240 9,21 - 6,89
24 240 21 21 9,48 7,58 7,87
25 460 460 460 9,48 8,20 7,83
1- NMP/g (Número Mais Provável). 2- Log UFC/g (UFC = Unidade Formadora de Colônia).
43
LIMA et al. (2008) observaram que o queijo da Serra do Salitre apresentou
contagens de Staphylococcus coagulase positivos de até 5,0x104 UFC/g. O
isolamento de Staphylococcus coagulase positivos também foi relatado em queijo
prato em contagens de até 2,3x105 UFC/g (ASSUMPÇÃO et al., 2003).
Duzentos e quarenta e cinco isolados de Staphylococcus spp. foram analisados
pela técnica de reação em cadeia da polimerase – PCR, utilizando primers para o
gene Coa que são específicos à seqüência de nucleotídeos dentro da região
codificadora 3’ de S. aureus, e 36 destes isolados foram positivos quanto à presença
do gene. Cabe destacar que do total de 245 isolados testados apenas 13 foram
identificados fisiologicamente como Staphylococcus coagulase positivos.
Esses resultados sugerem um grau de imprecisão nas determinações
convencionais que podem ser atribuídas a fatores como disponibilidade de
nutrientes, ambiente ou condições fisiológicas intrínsecas da bactéria associadas à
não expressão do gene CoA (BERGDOLL, 1989). CREMONESI et al. (2005)
relataram que a presença do gene da coagulase não está necessariamente
associada com a expressão fenotípica. Estes autores detectaram a presença deste
gene pela PCR em populações de S. aureus enterotoxigênicos e em linhagens de
Staphylococcus coagulase negativos originados de queijo produzido com leite cru.
A intoxicação alimentar pela toxina estafilocócica é provocada pelo consumo
de alimentos onde essas enterotoxinas estejam presentes. Neste estudo, SEB foi
detectada em duas amostras de queijo (R24 e R25) e a toxina TSST-1 em uma
amostra (R8) em concentrações superiores a 0,5 µg/g de toxina no alimento (Tabela
2).
Tabela 2 – Enterotoxinas estafilcócicas e TSST-1 detectadas em amostras de
Requeijão do Norte obtidas em mercado varejista de Belo Horizonte.
Amostra Toxina detectada 1 Concentração 2
08 TSST-1 > 0,5
24 SEB > 0,5
25 SEB > 0,5
1- SEB, Enterotoxina estafilocócica B; TSST-1, Toxina da Síndrome do Choque Tóxico. 2- µg/g de toxina no alimento.
44
Quantidades de 0,1 µg de toxina podem provocar intoxicação alimentar em
humanos, embora estas quantidades possam variar dependendo da sensibilidade do
indivíduo (EVERSON et al., 1988). A detecção de toxinas e as concentrações
encontradas nas amostras, associadas à contagens elevadas de Staphylococcus
spp. sugerem que o Requeijão do Norte pode oferecer risco para os consumidores.
Resultados similares foram encontrados por SABIONE et al. (1994), que detectaram
a presença de SEB em amostras de queijo Minas envolvidos em surto de
toxinfecção alimentar. SEB é considerada uma das enterotoxinas mais associadas a
surtos de envenenamento alimentar estafilocócico (JETT et al., 2001). A presença
de linhagens de Staphylococcus aureus produtores de SEB e TSST-1 está
relacionada com a contaminação dos alimentos por manipulação humana
inadequada (NÁJERA-SÁNCHEZ et al., 2003; FUEYO et al., 2005). Os
manipuladores de alimentos podem perpetuar a cadeia epidemiológica de
contaminação dos alimentos através do contato direto ou indireto das mãos
(CARVALHO & SERAFINI, 1996).
Os fungos foram detectados contagens de até 8,47 log UFC/g (Tabela 1). A
microbiota fúngica que cresce, principalmente na superfície de queijos, como
acontece com o Requeijão do Norte, além de levar à perdas econômicas por
raspagem da casca, também provocam alterações sensoriais que prejudicam sua
qualidade. Além disso, algumas espécies de fungos produtoras de micotoxinas,
como Aspergillus flavus, Penicillium Palitans, P. commune, P. roqueforti podem
representar risco à saúde dos consumidores (VELD, 1996; KURE & SKAAR, 2000).
Neste estudo, dentre as amostras analisadas, 22 delas estavam contaminadas por
fungos. Este resultado pode estar associado com a manipulação excessiva do
Requeijão do Norte durante o transporte e a comercialização, como também pela
possível contaminação ambiental, já que o mesmo é comercializado em mercados e
feiras sem embalagem e é fabricado em condições higiênicas inadequadas.
Por outro lado as leveduras são reconhecidas como componentes
importantes da microbiota de muitas variedades de queijos, sendo que em alguns
casos, estas podem estar presentes de forma ocasional, influenciando as
características sensoriais do produto. A estas características podem ser atribuídas
as atividades de lipólise, proteólise e β-galactosidase, com efeitos significativos
sobre o aroma, sabor e textura do produto (FLEET & MIAN, 1987; FLEET, 1990).
45
Na caracterização físico-química do Requeijão do Norte, os valores referentes
ao percentual de umidade, gordura, gordura no extrato seco, proteínas, cinzas e
sólidos totais (ST) apresentaram grandes variações que podem ser observadas na
(Tabela 3).
Tabela 3 – Análise físico-química das amostras de Requeijão do Norte obtidas em
mercado varejista de Belo Horizonte.
Variação Parâmetro
Mínimo Máximo
Média
Sólido Totais – ST (%) 52,33 65,34 58,52 +3,10
Gordura (%) 17,35 30,49 24,79+3,71
Umidade (%) 34,65 45,98 41,51+3,12
Gordura no extrato seco – EST (%) 29,99 50,79 42,25+5,29
Proteínas (%) 16,50 31,37 25,16+3,76
Cinzas (%) 1,74 3,08 2,40+0,34
pH 4,93 7,47 5,68+0,53
Acidez titulável (% ácido lático) 0,12 0,61 0,28+0,13
Atividade de água (aw)) 0,88 0,99 0,94+0,02
Os valores de sólidos totais foram similares aos relatados por MENÉNDEZ et
al., (2004) em queijo Tetilla. A falta de padronização das operações de
processamento contribuiu para estas variações, bem como a utilização de
ingredientes variados no preparo do requeijão, seja o leite, a Manteiga de Garrafa ou
o sal. O tempo de processamento e a umidade do ambiente também podem ter
favorecido grandes modificações na umidade do produto (não embalados) e
conseqüentemente sobre sua composição centesimal.
As porcentagens de umidade e gordura em Requeijão do Norte variaram de
34,6% a 45,9% e 17,3% a 30,4%, respectivamente. A legislação brasileira (BRASIL,
1996) classifica os queijos em diferentes categorias quanto ao teor de umidade.
Avaliando o conteúdo de umidade observado nas amostras, apenas duas poderiam
ser classificadas como de baixa umidade ou queijo duro (teor de umidade de até
46
35,9%), enquanto as outras 23 amostras de queijo foram classificadas como de
média umidade ou queijo semi-duro (níveis entre 36,0 e 45,9% de umidade). Este
problema pode ser evitado a partir do controle das matérias-primas com
características físico-químicas de qualidade satisfatórias.O tempo e a temperatura
utilizados no processo de cozimento da massa podem afetar o teor de umidade, e a
variação na porcentagem de gordura do queijo pode também estar ligada à adição
de Manteiga de Garrafa, que é adicionada sem controle. JASSEN-ESCUDERO &
RODRIGUEZ-AMÁYA (1981) e NASSU et al. (2003) relatam variações consideráveis
na composição química do Requeijão do Norte, principalmente quanto ao teor de
gordura, atribuindo essas diferenças a proporção de manteiga adicionada ao
produto, com resultados similares aos apresentados neste estudo. As etapas de
lavagem da massa e a ausência de embalagem durante o transporte e a estocagem
também podem ser considerados como fatores que afetam a qualidade global do
Requeijão do Norte.
Quanto aos teores de gordura no extrato seco os valores obtidos indicam que
o produto pode ser classificado em dois tipos segundo a legislação em vigor para
queijos (BRASIL, 1996), que classifica como gordos os produtos com teores entre
45,0% a 59,9% e semigordos aqueles que contenham entre 25,0% a 44,9% de
gordura no EST. Este parâmetro, juntamente com o teor em umidade determina a
qualidade do produto. Neste trabalho, nove amostras de Requeijão do Norte foram
consideradas como queijo gordo (teores entre 45,73% a 50,79% de gordura no EST)
enquanto 16 amostras foram consideradas como semi-gordo (com níveis variando
entre 29,99% e 43,61%). As diferenças observadas neste estudo indicam a falta de
padronização existente para o Requeijão do Norte produzido em Minas Gerais.
Estes resultados são muito similares aos de outros trabalhos (CORBO et al., 2001)
que observaram valores médios para proteínas e gordura de aproximadamente
24,5% e 31%, respectivamente, embora a quantidade de umidade determinada foi
de 39,4% para o queijo Canestrato da Itália. NASSU et al. (2003) e SILVA et al.
(2006) também associaram a variação destes parâmetros à falta de padronização no
processo de fabricação do Requeijão do Norte.
Os valores de pH, atividade de água (aw) e acidez titulável do Requeijão do
Norte encontrados neste estudo apresentaram valores variando de 4,9 a 7,4; 0,88 a
0,99 e 0,12 a 0,61, respectivamente. NASSU et al. (2003) encontraram resultados
47
similares de pH, e relataram que diferenças na determinação do ponto final da
redução de acidez, seja por adição de bicarbonato de sódio e/ou lavagens
sucessivas da massa com água e adição de leite, afetam o pH e a acidez do produto
final. Estes fatores também foram observados neste estudo, os quais confirmam a
falta de padronização do processo. Em relação à aw, os valores observados foram
similares aos reportados para os queijos Idiazabal obtidos a partir de leite integral
cru (PÉREZ-ELORTONDO et al., 1999) e Tettila produzido com leite integral cru
através de coagulação enzimática (MENÉNDEZ et al., 2004). Parâmetros físico-
químicos como a aw influenciam o risco microbiológico do consumo do alimento,
pois Coliformes Totais, Coliformes Termtolerantes, Salmonella spp. e
Staphylococcus spp., são capazes de crescer em atividade de água mínima de 0,86,
com um ótimo maior que 0,99 (EUROPEAN COMMISSION, 2003).
I.4. CONCLUSÕES
A grande variação da composição físico-química do requeijão está
provavelmente associada com a diversidade dos processamentos, em razão da
inexistência de padrões no processo, sendo ainda praticada entre os pequenos
produtores rurais de forma empírica e artesanal, com total falta de controle sobre os
ingredientes. Estes resultados indicam a necessidade de se estabelecer métodos
bem definidos de identificação e padrões com o objetivo de controlar a qualidade do
produto, e melhorar sua segurança, e quem sabe poder transformá-lo em produto
passível de receber denominação de origem.
A qualidade microbiológica das amostras de Requeijão do Norte mostrou-se
insatisfatória, quanto à avaliação dos indicadores higiênicos quando confrontado
com a legislação em vigor (BRASIL, 2001). A possibilidade do Requeijão do Norte
representar risco à saúde da população pôde ser considerada, tornando-se
necessárias a implantação de medidas que possam garantir a segurança do produto
(BPF). Faz-se necessário realizar a correção dos procedimentos durante todas as
etapas do processo produtivo até a comercialização final, quando a manipulação
pós-processamento e o não uso de embalagem podem ser relacionados como os
mais importantes.
48
A implementação de medidas adequadas de transporte e armazenamento
deste alimento podem melhorar suas condições higiênicas e evitar riscos de
contaminação pós-processamento.
49
CAPÍTULO II – POPULAÇÕES DE LEVEDURAS E ATIVIDADE
ENZIMÁTICA ASSOCIADAS AO REQUEIJÃO DO NORTE
RESUMO
Foram estudadas 25 amostras de Requeijão do Norte, um queijo semi-duro
tradicional de grande consumo no Brasil, para caracterização das populações de
leveduras por taxonomia convencional. A comparação do gene da região D1/D2 do
DNAr 26S indicaram que Candida parapsilosis, Moniliella spathulata, Debaryomyces
hansenii e Kodamaeae ohmeri foram as espécies isoladas com maior freqüência.
Algumas destas leveduras apresentaram atividade lipolítica (26 isolados), atividade
proteolítica (8 isolados) e atividade β-galactosidase (55 isolados). Estes resultados
sugerem que a liberação destas enzimas pelas diferentes espécies de leveduras que
naturalmente ocorrem neste queijo pode apresentar um papel tecnológico
significativo (sabor e aroma) para o produto.
Palavras-chaves: Leveduras; Requeijão do Norte; queijo de Manteiga; atividade
enzimática; qualidade.
50
ABSTRACT
This study evaluated 25 samples of the ‘Requeijão do Norte’, a traditional
semi-hard cheese of great demand in Brazil were studied using conventional
taxonomic, physiological, biochemical and molecular biological methods. Sequence
comparisons of the D1/D2 region from the 26S rADN gene revealed that the yeasts
Candida parapsilosis, Moniliella spathulata, Debaryomyces hansenii and Kodamaeae
ohmeri were the species most frequently found species. Some of these yeasts
showed lipolytic activities (26 strains), proteolytic activity (8 strains) and β-
galactosidase (55 strains). These findings suggest that the production of these
enzymes by yeasts in the cheese may play a technologically significant role in the
development of flavor and smell.
Keywords : Yeasts; Requeijão do Norte; butter cheese; enzymatic activity; quality.
51
II.1. INTRODUÇÃO
As leveduras são mundialmente reconhecidas como componentes
importantes da microbiota de muitas variedades de queijos, podendo estar presentes
de forma intencional ou não. Não intencional nos casos em que estes
microrganismos são identificados como microbiota contaminante e/ou deteriorante.
Já as leveduras presentes de forma intencional, desempenham funções tecnológicas
e sensoriais. Características como o aroma, sabor e textura de diferentes variedades
de queijos são resultantes dessa microbiota fúngica natural ou intencionalmente
adicionada, bem como dos diferentes processos de fabricação, seja na massa crua
ou semi-cozida (FLEET & MIAN, 1987; FLEET, 1990).
Contagens elevadas de leveduras também estão relacionadas a fatores
externos relacionados à contaminação através do ar, roupas, mãos, utensílios e
equipamentos utilizados durante processo de fabricação e/ou comercialização de
queijos (WESTALL & FILTENBORG, 1998; WELTHAGEN & VILJOEN, 1999;
GARDINI et al., 2006).
As leveduras são consideradas importantes agentes nos processos de cura e
maturação de queijos. As atividades proteolítica e lipolítica destes microrganismos
têm papel importante na matriz dos queijos, e contribuem para a formação de
componentes de aroma e de sabor (aminoácidos livres, peptídeos, ácidos graxos,
etc.), os quais vão influenciar significativamente o “flavor” do produto final
(VASDINYEI & DEÁK, 2003; BOUTROU & GUÉGUEN, 2005). Diversos trabalhos
têm relatado a diversidade de leveduras encontradas em diferentes variedades de
queijos como o Cheddar, o queijo da Serra da Canastra, Cabrales e o Bryndza
(WELTHAGEN & VILJOEN, 1999; BORELLI et al., 2006b; ÁLVAREZ-MARTÍN, 2007;
LAURENCIK et al., 2008). Entretanto, para o Requeijão do Norte, por seu caráter
artesanal e de produção em pequena escala, ainda não existem na literatura
informações completas sobre a população de leveduras presentes nesse produto.
O Requeijão do Norte ou queijo de Manteiga é um queijo tradicional brasileiro
produzido principalmente na região Norte do estado de Minas Gerais. O processo de
fabricação deste queijo envolve a utilização de leite cru que é acidificado
naturalmente. A massa obtida é cozida, lavada e dessorada sucessivamente,
seguida da adição de Manteiga de Garrafa e sal. Embora as leveduras não
52
sobrevivam ao processo de cozimento, as mesmas têm sua presença identificada
nesse requeijão, podendo ser associada com à recontaminação que ocorre ao final
do processo de fabricação, devido a manipulação, transporte e comercialização em
condições que favorecem o seu acesso (JODRAL et al., 1993; NELSON, 1981).
Neste estudo, foram determinadas as populações de leveduras presentes em
amostras de Requeijão do Norte obtidas em mercado varejista na cidade de Belo
Horizonte. Os objetivos do trabalho foram a caracterização da população de
leveduras isoladas destas amostras e a detecção de atividade enzimática
(proteólise, lipólise e de β-galactosidase) com o intuito de avaliar o papel que essa
microbiota exerce sobre as propriedades funcionais e sensoriais do produto.
II.2. MATERIAL E MÉTODOS
II.2.1. COLETA DE AMOSTRAS
Um total de 25 amostras de Requeijão do Norte foram coletadas durante o
período de setembro de 2005 a abril de 2006. As amostras foram obtidas em
mercado varejista na cidade de Belo Horizonte. As amostras foram coletadas
assepticamente e em seguida transportadas ao laboratório para dar início ao
isolamento da microbiota fúngica. Frações de cada amostra foram retiradas para a
realização de análises microbiológicas. O restante das amostras foram armazenadas
a -20 °C para as análises posteriores.
II.2.2. ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS
Uma porção de 25 g de cada amostra foi homogeneizada em 225 mL de água
peptonada tamponada 0,1% em um Stomacher 400 Lab Blender (London, UK), por
um minuto. Diluições decimais adequadas foram preparadas utilizando o mesmo
diluente. O isolamento e a contagem de leveduras foi realizado por esgotamento em
superfície a partir de alíquotas de 0,1 mL das diluições decimais em ágar extrato de
malte e levedura (Yeast Extract-Malt Extract Ágar – YMA: 1% glicose, 0,5% peptona,
0,3% extrato de malte, 0,3% extrato de levedura e ágar 2% segundo KURTZMAN &
FELL (1998). Ao ágar base foi acrescido 200 mg/L de cloranfenicol. As placas foram
53
incubadas a 25 °C por 5 dias. Após o crescimento, a s colônias foram contadas,
isoladas e mantidas em culturas de YMA inclinado. As leveduras foram
caracterizadas fenotipicamente segundo procedimentos descritos em YARROW
(1998). Os seguintes testes fisiológicos foram realizados: fermentação da D-glicose,
D-galactose, sacarose, maltose, lactose e rafinose; crescimento em D-glicose, D-
galactose, L-sorbose, sacarose, maltose, celobiose, trealose, lactose, melibiose,
rafinose, melezitose, inulina, amido solúvel, D-xilose, L-arabinose, D-arabinose, D-
ribose, L-rhamnose, D-glucosamina, N-acetyl-D-glucosamina, metanol, etanol,
glicerol, eritritol, ribitol, galactiol, D-manitol, D-glucitol, xilitol, salicina, D-gluconato,
DL-lactato, succinato, citrato, inositol, hexadecano, acetona, 2-propanol e etil acetato
como fontes de carbono; crescimento a 30 °C, 37 °C e 40 °C; crescimento em meio
com 50% de glicose e em 10% de NaCl; tolerância a 1% de ácido acético, formação
de compostos amilóides extracelulares; reação de Diazonium Blue B e resistência a
0,01% e 0,1% de cicloheximida. As identificações foram verificadas utilizando
chaves taxonômicas descritas em KURTZMAN & FELL (1998).
Leveduras que ao final da caracterização fenotípica (YARROW, 1998)
apresentaram uma identificação duvidosa, foram avaliadas por seqüenciamento de
genes nos domínios variáveis D1/D2 da subunidade maior do DNAr utilizando a
técnica de PCR conforme descrito por LACHANCE et al. (1999), utilizando os
primers NL-1 (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL4 – (5’-
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’). A partir destes primers é possível identificar mais
de 500 espécies de leveduras atualmente reconhecidas (KURTZMAN & ROBNET,
1998). Sequências de aproximadamente 600 pares de base foram obtidas. Os
produtos amplificados foram concentrados e purificados utilizando o Kit WizardSV
(Promega, USA) e então seqüenciados em sistema automatizado MegaBACETM
1000 (Amersham Biosciences, USA). As seqüências obtidas foram editadas em
programa DNAMAN, versão 4.1 (Lynnon BioSoft, Vaudreuil, QC, Canadá) e
comparadas às de outras leveduras cujas seqüências encontram-se depositadas no
GenBank.
54
II.2.3. ATIVIDADES LIPOLÍTICA, PROTEOLÍTICA E β-GALACTOSIDASE
A detecção da produção de lipase foi testada a partir da habilidade das
linhagens de leveduras em hidrolisarem um meio basal contendo 0,5 g de extrato de
levedura em uma emulsão de manteiga comercial (10 mL de manteiga em 990 mL
de uma solução salina. O pH inicial foi ajustado para 7,0. A solução salina em água
destilada contém: 5,0 g (NH4)2HSO4; 5,0 g MgSO4.7H2O; 1,0 g NaCL e sais biliares
2,0 g acrescido de 15,0 g de ágar em 1000 mL. O meio foi adaptado segundo
condições descritas em COLEN (2005). A atividade proteolítica extracelular foi
testada inoculando as linhagens de leveduras em meio contendo ágar 2% acrescido
de leite em pó desnatado a 10% (HANKIN & ANAGNOSTAKIS, 1975). As leveduras
cultivadas foram estriadas em YMA e incubadas a 25 ºC por 72 horas. Do
crescimento obtido, uma alçada foi retirada e o conteúdo diluído em tubos contendo
3 mL de água destilada estéril. Os inóculos foram ajustados em escala nº 1 de
McFarland. Alíquotas de 20 µL de cada suspensão foram inoculadas em poços de 4
mm de diâmetro sobre a superfície do ágar. As análises foram feitas em triplicatas.
As placas foram incubadas a 25 °C por 5 dias. As at ividades proteolítica e lipolítica
foram detectadas pela presença de uma zona clara ao redor da colônia. Foram
medidos os diâmetros da colônia (C) e do halo (H) com o auxílio de um paquímetro.
Os resultados foram considerados positivos para os isolados cuja relação H/C foi
maior ou igual a 1,0 (COLEN, 2005). As leveduras foram testadas para a produção
de β-galactosidase em ágar Yeast Nitrogen Base (Difco, USA) onde a lactose foi
adicionada como única fonte de carbono (KURTZMAN & FELL, 1998). O
crescimento positivo foi considerado como habilidade em produzir a enzima.
II.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As contagens de leveduras encontradas em Requeijão do Norte foram
expressivas (Tabela 1). Os resultados apresentaram variações entre 4,0 a 8,4 log
UFC/g. Estes resultados foram superiores aos encontrados por BORELLI et al.
(2006b), TORKAR & VENGUST (2008) em queijos. Também pôde ser observada
uma grande diversidade de espécies de leveduras isoladas e identificadas nas
amostras analisadas.
55
Tabela 1 Média das populações de leveduras isoladas em amostras de Requeijão do Norte obtidas em mercado varejista de Belo Horizonte (log UFC/g).
AMOSTRAS
ESPÉCIES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Candida albicans 6,8 6,5
C. catenulata 7,2 7,2 4,6 6,5 7,7 8,1 5,4 4,3 5,7
C. haemunolii 6,5
C. krusei 5,0 6,3 6,7 7,0 6,5 7,4 6,5 6,0
C. lusitaniae 4,8 6,5
C. parapsilosis 6,0 6,6 5,9 5,2 5,5 5,3 5,0 7,8 6,5 8,0 7,3 7,1 7,1 8,3 6,3 6,3 7,9 6,5 6,9
C. tropicalis 4,3 6,0 7,4 7,9 7,7
C. zeylanoides 7,2
Debaryomyces hansenii 6,5 4,2 5,7 4,7 7,6 6,5 7,6 6,5 7,8 8,3 5,3 4,3 7,2 7,2
Galactomyces geotrichum 6,0 6,4 4,0 4,5
Geotrichum sp. 6,3 7,8 8,3 6,8
Issatchenkia orientalis 4,7 6,5
Kluyveromyces lactis 6,0 6,5 5,5 7,6 7,4
Kluyveromyces marxianus 8,0 7,7 7,8 6,9 6,7 7,7 6,8 5,5 5,3 5,5
Kodamaeae ohmeri 7,8 6,3 6,0 4,0 5,2 4,3 7,8 8,3 7,4 8,4 4,3 6,1
Pichia burtonii 7,7 7,1
Pichia caribbica 7,8 5,0 5,7 5,0 6,0 7,4 7,3 7,5 6,0 7,5
Pichia membranifaciens 4,8
Trichosporon asahii 7,2 7,4 6,9 6,5
Moniliella spathulata 5,3 5,0 4,9 4,8 6,6 7,6 7,6 6,5 6,8 6,3 7,8 7,7 6,9 7,2 6,7 6,9 7,1
Zygosaccharomyces sp. 6,2 5,3 7,2 6,6 7,7
Yarrowia lipolytica 6,1 6,9 7,1 6,9 6,5
55
56
Neste trabalho, o gênero Candida foi encontrado com freqüência nas
amostras de requeijão, sendo C. parapsilosis a espécie predominantemente isolada
(19 amostras) (Tabela 1). Outras espécies encontradas nos queijos foram
Trichosporonoides spathulata (17 amostras), D. hansenii (14 amostras) e
Kodamaeae ohmeri (12 amostras). Estas três espécies apresentaram contagens de
7,8 a 8,4 log UFC/g e em razão de sua abundância, provavelmente exercem um
papel importante juntamente com a microbiota deste queijo.
Vários autores relataram que Debariomyces hansenii, Kluyveromyces
marxianus, Yarrwia lipolytica e diversas espécies de Candida são leveduras que
estão tipicamente associadas com queijos (VILJOEN, 2001; FADDA et al., 2004;
LAURENCIK et al., 2008).
A ocorrência de M. spathulata no Requeijão do Norte foi considerável. Sabe-
se que este gênero está associado a substratos gordurosos ou alimentos em
processo de deterioração (DE HOOG & SMITH, 1998). Este é o primeiro registro do
isolamento de M. spathulata associado a queijo.
D. hansenii e K. ohmeri foram isoladas em queijos produzidos em países
distintos (BORELLI et al., 2006b; FADDA et al., 2004; PEREIRA-DIAS et al., 2000;
CORSETTI et al., 2001). D. hansenii é uma levedura freqüentemente encontrada em
produtos lácteos, podendo ser utilizada como parte de culturas iniciadoras para a
fabricação de queijo Cheddar (VAN DEN TEMPEL & NIELSEN, 2000; FERREIRA &
VILJOEN, 2003). Contudo, D. hansenii está relacionada com a deterioração de
queijo e contagens elevadas desta levedura resultam em formação de odores
indesejáveis (WESTALL & FILTENBORG, 1998).
A presença de K. ohmeri em Requeijão do Norte também foi expressiva. Esta
levedura foi isolada de amostras em contagens de até 8,4 log UFC/g. Esta levedura
é conhecida na indústria de alimentos por suas propriedades de fermentação em
produtos como picles, produtos em salmouras e na decomposição de frutas
(KURTZMAN & FELL, 1988). Entretanto, o papel de M. spathulata e K. ohmeri em
queijos ainda precisa ser determinado.
A contagem total de leveduras observada evidencia que as mesmas podem
ser consideradas como parte da microbiota do Requeijão do Norte. Presume-se
também que a presença de determinadas espécies de leveduras como D. hanseni,
57
Galactomyces geotrichum e K. lactis tenha um efeito benéfico sobre a qualidade do
Requeijão do Norte.
Das 275 leveduras isoladas, foram detectados oito isolados com atividade de
protease, vinte e seis com atividade de lipase e cinqüenta e quatro com atividade de
β-galactosidase (Tabelas 2, 3 e 4). Os demais isolados não apresentaram atividade
nos substratos analisados.
Tabela 2 Produção de β-galactosidase, protease e lipase pelas espécies de
leveduras em amostras de Requeijão do Norte obtidas em mercado varejista de Belo
Horizonte.
Espécies Número de
isolados
Número de isolados
produtores de enzima
β-galactosidase Protease Lipase
Candida albicans 3 - - 2
C. catenulata 14 1 - -
C. haemunolii 1 - 1 -
C. krusei 11 - - 1
C. lusitaniae 2 1 - -
C. parapsilosis 43 3 - 3
Debaryomyces hansenii 28 14 1 4
Galactomyces geotrichum 4 1 - 1
Geotrichum sp. 9 3 - -
Issatchenkia orientalis 3 1 - -
Kluyveromyces lactis 6 6 2 2
Kluyveromyces marxianus 16 4 1 2
Kodamaeae ohmeri 21 1 - 2
Pichia caribbica 17 3 - 2
Trichosporon asahii 4 1 - 2
Moniliella spathulata 35 9 1 -
Zygosaccharomyces sp. 8 - - 1
Yarrowia lipolytica 8 6 2 4
TOTAL 233 54 8 26
58
Tabela 3 – Medida da atividade lipolítica dos isolados de leveduras pelo diâmetro do
halo.
Espécies Número do
isolado
Diâmetro do halo (mm) a
Colônia (C) Halo (H) H/C
Candida albicans 170 0,65 0,78 1,20
Candida albicans 265 0,72 0,82 1,14
C. parapsilosis 206 0,79 1,03 1,30
C. parapsilosis 218 0,70 0,96 1,37
C. parapsilosis 219 0,72 1,06 1,47
Debaryomyces hansenii 67 0,83 1,22 1,47
Debaryomyces hansenii 70 0,72 0,94 1,30
Debaryomyces hansenii 79 1,06 1,23 1,16
Debaryomyces hansenii 141 0,64 0,77 1,20
Debaryomyces hansenii 250 0,84 1,00 1,19
Galactomyces geotrichum 249 3,12 3,30 1,06
Kluyveromyces lactis 190 0,52 0,70 1,35
Kluyveromyces lactis 223 0,75 0,95 1,27
Kluyveromyces marxianus 41 0,88 1,36 1,54
Kodamaeae ohmeri 74 0,78 1,20 1,54
Kodamaeae ohmeri 275 1,40 3,23 2,31
Pichia caribbica 58 0,78 1,04 1,33
Pichia caribbica 194 0,76 0,84 1,10
Trichosporon asahii 129 1,06 1,28 1,21
Zygosaccharomyces sp. 56 1,06 1,35 1,27
Zygosaccharomyces sp. 134 0,77 1,33 1,73
Yarrowia lipolytica 199 0,82 0,97 1,18
Yarrowia lipolytica 212 1,08 1,36 1,26
Yarrowia lipolytica 215 1,09 1,45 1,33 a – valores médios de triplicatas com duas repetições.
As leveduras D. hansenii, K. lactis e Y. lipolytica mostraram considerável
atividade proteolítica. A atividade lipolítica foi observada principalmente em K.
ohmeri, Zygosaccharomyces sp. e K. marxianus.
59
Tabela 4 – Medida da atividade proteolítica dos isolados de leveduras pelo diâmetro
do halo.
Espécies Número do
isolado
Diâmetro do halo (mm) a
Colônia (C) Halo (H) H/C
C, haemunolii 197 1,10 1,77 1,61
Debaryomyces hansenii 250 1,55 3,2 2,06
Kluyveromyces lactis 190 1,63 3,33 2,04
Kluyveromyces lactis 223 1,10 1,97 1,79
Moniliella spathulata 245 2,23 3,32 1,49
Yarrowia lipolytica 212 1,26 2,26 1,79
Yarrowia lipolytica 215 1,29 2,29 1,77 a – valores médios de triplicatas com duas repetições.
Várias linhagens hidrolisaram a lactose, dentre as quais D. hansenii, M.
spathulata, K. lactis e Y. lipolytica que foram os isolados ativos mais encontrados.
Resultados similares foram encontrados por outros pesquisadores que isolaram
linhagens de D. hansenii, K. lactis e Y. lipolytica produtores de protease e lipase em
produtos lácteos (WELTHAGEN & VILJOEN, 1999; PEREIRA-DIAS et al., 2000;
BORELLI et al. 2006b; GARDINI et al., 2006; LARPIN et al., 2006).
A atividade proteolítica e lipolítica de leveduras pode ter um impacto
significativo na qualidade, no desenvolvimento do flavour e na textura do produto
(ROOSTITA & FLEET, 1996; MARTIN et al., 1999; CORSETTI et al., 2001).
Por outro lado, a presença dessas leveduras pode também estar associada
ao estabelecimento de relações ecológicas complexas entre bactérias e fungos
filamentosos, estes últimos com risco potencial à saúde humana, pois existe a
possibilidade dessa microbiota produzir compostos tóxicos, como as micotoxinas
(PITT & CRUICKSHANK, 1990; FRISVAD & THRANE, 1995; ADDIS et al., 2001).
Entre as micotoxinas a aflatoxina M1 (AFM1) é um desses metabólitos que podem
estar presentes no leite de vacas e consequentemente nos derivados lácteos
elaborados com esse leite, como é o caso do Requeijão do Norte, pois a AFM1 tem
resistência ao calor (YOSEF & MARTH, 1989; GIMENO 2004; KAMKAR et al.,
2008).
60
II.4. CONCLUSÕES
A grande variedade de espécies isoladas durante este estudo associada à
contagens de mais de 107 UFC/g indicam uma forte tendência de contaminação do
requeijão após o processamento.
Algumas espécies foram dominantes em todas as amostras analisadas. Este
fato pode ser atribuído à existência de uma influência ambiental seletiva ou mesmo
uma competição intraespecífica, para garantir a predominância de determinadas
espécies.
Leveduras com atividade enzimática foram isoladas efetivamente. Estes
resultados indicam que estes microrganismos podem exercer um papel importante
na definição de sabor, aroma e textura do Requeijão do Norte.
Existe a possibilidade de que parte dessa microbiota fúngica ou mesmo do
leite já contaminado resultar em presença de AFM1 no Requeijão do Norte.
61
CAPÍTULO III – ESTUDO DA PRESENÇA DE FUNGOS
FILAMENTOSOS E AFLATOXINA M 1 EM REQUEIJÃO DO NORTE
RESUMO
Foram investigadas em 25 amostras de Requeijão do Norte, a microbiota
fúngica e seu potencial de produção de aflatoxina M1. As amostras foram coletadas
no mercado varejista da cidade de Belo-Horizonte – MG. A população de fungos
atingiu valores de até 7,3 log UFC/g em mais da metade das amostras analisadas
(52% do total). Foram identificadas 13 linhagens de fungos com destaque para os
gêneros Penicillium (7 amostras), Botryosphaeria (3 amostras) e Cladosporium (2
amostras). A presença de aflatoxina M1 foi determinada pelo método de ELISA
sendo que 16% das amostras de Requeijão do Norte apresentaram contaminação
por aflatoxina M1, em concentrações superiores a 50 ng/kg, o que pode provocar
efeitos tóxicos e carcinogênicos para a população. Neste trabalho valores de 61,13
ng/kg até 214,02 ng/kg foram detectados nos queijos analisados.
Palavras-chaves : Requeijão do Norte, fungos, aflatoxina M1, Penicillium.
62
ABSTRACT
The fungal microbiota and their potential for production of aflatoxin M1 were
investigated in 25 samples of ‘Requeijão do Norte’. The samples were collected in
the retail market of the city of Belo Horizonte - MG. The population of moulds
reached values up to 7.3 log cfu/g in more than half of the samples (52% of total).
We identified 13 strains of moulds principally from the genera Penicillium (7
samples), Botryosphaeria (3 samples) and Cladosporium (2 samples). The presence
of aflatoxin M1 was investigated by the ELISA method, 16% of samples of ‘Requeijão
do Norte’ showed contamination by aflatoxin M1 in concentrations above 50 ng/kg,
which can be toxic and carcinogenic for humans. In this work values that ranged from
61,13 ng/kg to 214,02 ng/kg were detected in the cheeses analyzed.
Key-words : Requeijão do Norte, moulds, aflatoxin M1, Penicillium.
63
III.1. INTRODUÇÃO
O requeijão do Norte é um produto tradicional do nordeste brasileiro,
produzido em sua maioria através de processos artesanais. Um grande problema
associado a este produto é o crescimento freqüente de fungos que tem levado à
perda do produto e conseqüentemente a prejuízos econômicos para os produtores.
Cabe destacar também que essa microbiota fúngica pode propiciar o aparecimento
de aflatoxina M1 (AFM1), um carcinógeno em potencial que representa grave risco a
saúde dos consumidores deste produto (ARDIC et al., 2009).
Os fungos representam um grupo de microrganismos que aparecem com
freqüência na superfície de uma grande variedade de queijos (KURE et al., 2004,
BACHMANN et al., 2005; FLÓREZ et al., 2007). São considerados ubíquos na
natureza podendo ser provenientes do ar, da água e do solo. A facilidade com que
os fungos crescem nos queijos é devida à capacidade que possuem de crescerem
em condições adversas como baixa aw e pH, menor disponibilidade de carboidratos,
concentrações elevadas de sal e baixas temperaturas (HOCKING, 1997; COUSIN,
2003), contaminando facilmente o ambiente de fabricação de queijos ou o próprio
produto durante a fabricação ou a estocagem.
A ocorrência de fungos em queijos é desejável quando envolve a produção de
algumas variedades de queijos maturados classificados como Queijos de mofo azul
Podem ser exemplificados aqui os queijos Roquefort, Gorgonzola, Stilton, entre
outros. Nesses tipos de queijo a presença de fungos como o Penicillium roqueforti
favorece as reações de lipólise, oxidação de ácidos graxos e proteólise. O
desenvolvimento do flavor é acentuado e, portanto, é indispensável a presença do
fungo para que o produto apresente uma textura e formação de aroma adequados
(LÓPEZ-DÍAZ et al., 1996). Entretanto, em certos tipos de queijos duros o
crescimento de fungos filamentosos pode ser considerado como problema, uma vez
que ao se desenvolverem sobre a superfície destes produtos, provocam reações de
degradação (proteólise e lipólise) com a descoloração da superfície e/ou a produção
de odores indesejáveis (HOCKING & FAEDO, 1992; KURE & SKAAR, 2000;
BACHMANN et al., 2005). O uso de embalagens a vácuo pode dificultar o
desenvolvimento dessa microbiota, pois os fungos são, em sua maioria, aeróbios
obrigatórios não sendo responsáveis por casos de deterioração de alimentos
64
embalados a vácuo (MORENO et al., 2002). Portanto, o efeito protetor só é efetivo
quando o produto encontra-se intacto, pois assim que a embalagem é retirada esses
fungos iniciam um rápido crescimento.
Uma grande variedade de fungos isolados de queijos já foram identificados e
relatados na literatura, com destaque para as espécies de Cladosporium e Fusarium
(HOCKING & FAEDO, 1992; TANIWAKI et al., 2001), Geotrichum, Aspergillus e
Mucor (BARRIOS et al., 1998; KURE et al., 2004; BACHMANN et al., 2005),
Penicilium (KURE & SKAAR, 2000; KURE et al., 2001; HAYALOGLU & KIRBAG,
2007), que são as espécies mais comuns para este tipo de produto.
Alimentos contaminados por fungos podem também representar riscos à
saúde humana, pois existe a possibilidade dessa microbiota produzir compostos
tóxicos conhecidos como micotoxinas (PITT & CRUICKSHANK, 1990; FRISVAD &
THRANE, 1995). Estas, ao estarem presentes no alimento, afetam órgãos e tecidos,
induzindo a várias patologias, tais como neoplasia, mutagênese, teratogênese,
imunossupressão entre outras (FERNANDEZ et al., 1997; FERNANDES, 2004;
KIESSLING, 1986).
A aflatoxina M1 (AFM1) é um desses metabólitos e pode estar presente em
leite de vacas que se alimentaram com dieta contaminada por aflatoxina B1 (AFB1).
O potencial de toxicidade de AFM1 refere-se à carcinogenicidade e mutagenicidade
em animais e humanos. Em derivados lácteos como os queijos, a contaminação por
AFM1 pode ocorrer devido à utilização de leite contaminado. Sua permanência
nestes produtos se justifica pela associação de AFM1 com a caseína após a
dessoragem, além da capacidade de resistência ao calor após o processamento
(YOSEF & MARTH 1989, GIMENO 2004, KAMKAR et al., 2008).
A partir do exposto acima foi proposto neste trabalho um estudo de
identificação da população de fungos presentes como contaminantes em Requeijão
do Norte e a avaliação do risco à saúde, quanto a possível presença da aflatoxina
M1 nestes queijos.
III.2. MATERIAL E MÉTODOS
III.2.1. AMOSTRAGEM
65
Foram coletadas 25 amostras de Requeijão do Norte em diferentes pontos de
venda no mercado varejista da cidade de Belo-Horizonte – MG. As coletas foram
realizadas entre os períodos de setembro a abril de 2006. As amostras foram
coletadas assepticamente e em seguida transportadas ao laboratório para dar início
ao isolamento da microbiota fúngica. Frações de cada amostra foram retiradas para
a realização de análises microbiológicas. O restante das amostras foram
armazenadas a -20 °C para as análises posteriores.
III.2.2. ISOLAMENTO E ENUMERAÇÃO DE FUNGOS NAS AMOS TRAS DE
REQUEIJÃO
Para o isolamento de fungos foi utilizado o Ágar Batata Dextrose (BDA-
Himedia) acidificado com ácido tartárico a 10% (pH 3,5) (SILVA et al., 2001).
Volumes de 1mL de diluições decimais apropriadas foram inoculadas em
profundidade ao meio de cultura. Em seguida, as placas foram incubadas a 25 °C
em BOD (Quimis - Brasil) durante 3-5 dias. A quantificação do número de fungos foi
expressa em unidades formadoras de colônias por grama (SIQUEIRA, 1995). Para
obtenção de culturas puras, os fungos foram repicados e cultivados em placas
contendo ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol incubadas a 25 °C. Todos os
isolados foram armazenados em água destilada estéril (CASTELLANI, 1967) e
mantidos a partir de repiques sucessivos em ágar BDA a 25 °C.
III.2.3. IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE FUNGOS
Para a identificação dos fungos foi realizado o seqüenciamento da região ITS
do DNA ribossomal. Inicialmente, os fungos foram cultivados em ágar Sabouraud
por sete dias a 25 °C. A extração do DNA foi feita de acordo com a metodologia
proposta por DE HOOG et al. (2003). Pequenos fragmentos de micélio do fungo
foram colocados em tubo de 1,5 mL acrescidos de 400 µL de tampão de lise (Tris-
HCl - trishidroximetilaminometano 0,05 M, EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético
0,005 M, NaCl 0,1 M e SDS – sódio dodecil sulfato 1% e deixado a –20 ºC por
aproximadamente 10 minutos. O micélio foi então triturado com o auxílio de um
bastão e acrescido de 5 µL de Proteinase K. Após homogeneização, o tubo foi
66
deixado por 30 min a 60 ºC em banho-maria. Após essa etapa, foi adicionado 162 µL
de CTAB - cetil trimetilamonio bromido (Tris 2 M, NaCl 8,2%, EDTA 2 M e CTAB
0,2%), seguido de homogeneização, sendo o tubo incubado por 10 min. a 65 ºC. A
seguir, foram acrescentados 570 µL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1).
Após homogeneização, o tubo foi incubado por 30 minutos a 0 ºC. Em seguida, foi
realizada uma centrifugação a 13.200 rpm por 10 minutos. O líquido sobrenadante
foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL sendo acrescentado 10% do volume de
acetato de sódio 3M. O tubo foi gentilmente vertido para homogeneização e
incubado a 0 ºC por aproximadamente 30 minutos. Uma nova centrifugação foi
realizada a 13.200 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para novo
tubo, e em seguida 50% do volume de isopropanol foi adicionado. A partir dessa
etapa, o tubo foi mantido constantemente no gelo. Foi realizada uma centrifugação a
13.200rpm por 5 minutos e o sobrenadante desprezado por inversão. Em seguida,
200µL de etanol 70% a frio foi adicionado e, com o auxilio de uma pipeta, a
suspensão foi gentilmente homogeneizada. Novamente foi realizada uma
centrifugação a 13.200 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado por
inversão, seguido por homogeneização, com etanol a 70%. Após a secagem do tubo
por aproximadamente 15 minutos, foram adicionados 100 µL de Tris-EDTA (Tris-HCl
0,01 M e EDTA 0,001 M) seguido de incubação a 65 ºC por 60 minutos para
hidratação do DNA. As amostras foram armazenadas em freezer a –20 ºC.
Os iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATGC) foram utilizados para amplificação da região ITS do
rDNA, conforme descrito por WHITE et al. (1990). Os amplicons gerados pela
reação de PCR foram purificados em colunas de purificação Kia Quik (Quiagen), de
acordo com as especificações do fabricante. As reações de seqüenciamento foram
realizadas pelo método de terminação da cadeia de DNA por incorporação de
dideoxinucleotídeos (SANGER et al., 1977), utilizando-se iniciadores fluorescentes e
uma DNA polimerase termo-resistente, seguindo as instruções do kit Thermo
sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing (Amersham/Pharmacia
Biothec). Para o seqüenciamento, foram usados os mesmos iniciadores utilizados na
reação de PCR (ITS1 e ITS4). Os resultados dos seqüenciamentos foram
armazenados sob a forma de cromatogramas e processados automaticamente pelo
aparelho, utilizando-se softwares próprios. Os cromatogramas foram posteriormente
67
editados para eliminação de regiões indesejadas. As seqüências editadas foram
comparadas com seqüências de DNA conhecidas, depositadas em bancos de dados
não redundantes, utilizando-se o programa BLASTn (ALTSCHUL et al., 1997),
considerando a maior homologia entre a seqüência obtida e as seqüências
depositadas, como indicador na identificação molecular das espécies. Os isolados
que tiveram seqüência acima de 97% de similaridade com aquelas depositadas no
Genbank foram consideradas como pertencentes à mesma espécie. Isolados com
seqüências de similaridade inferior a 97% foram considerados filogeneticamente
próximos à espécie indicada.
III.2.4. DETECÇÃO DE AFLATOXINA M 1 PELO MÉTODO DE ELISA
III.2.4.1. PREPARO DOS EXTRATOS
Para a extração de AFM1 nas amostras foi utilizada a metodologia descrita por
DRAGACII et al., (1995). As amostras foram previamente trituradas e
homogeneizadas. Em seguida, 40 mL de diclorometano foi adicionado em 2,0 g de
cada amostra de queijo sendo mantidas sob agitação por 15 min. A suspensão
obtida foi filtrada e 10 mL do filtrado foi evaporado em banho Maria a 60 °C sob
atmosfera de nitrogênio. O óleo residual foi resuspendido em 0,5 mL de metanol, 0,5
mL de tampão PBS e 1 mL de heptano que foram vigorosamente homogeneizados e
centrifugados a 2700g por 15 min. A camada superior de heptano foi completamente
removida. Uma alíquota da fase aquosa inferior metanólica foi coletada com o auxílio
de uma pipeta de Pasteur e 100 µL desta alíquota foi adicionada em uma solução de
metanol a 10% e 400 µL de tampão I. Para o teste foram retirados 100 µL do extrato.
III.2.4.2. PROCEDIMENTOS PARA O TESTE DE ELISA
Para a análise quantitativa de AFM1 nas amostras de requeijão foi utilizado o
método de ELISA imuno-enzimático competitivo conforme procedimentos descritos
pelo fabricante RIDASCREEN – Aflatoxin M1 30/15 (R-Biopharm AG, Darmstadt,
Germany).
68
As placas para o ensaio foram montadas de acordo com o número de poços
necessários para todos os padrões e amostras com três repetições. Inicialmente,
100 µL de cada solução padrão e de cada amostra foram adicionadas
individualmente nos poços. As placas foram agitadas manualmente para
homogeneização e em seguida incubadas à temperatura ambiente por 60 minutos
ao abrigo de luz. O líquido sobrenadante foi descartado e as placas foram vertidas
sendo vigorosamente batidas por três vezes sobre a superfície de um papel
absorvente para completa remoção do líquido presente no interior dos poços. Em
seguida os poços foram preenchidos com 250 µL de água destilada sendo
novamente removida como descrito acima. O procedimento de lavagem foi repetido
por duas vezes. Posteriormente, 100 µL do conjugado enzimático foi adicionado em
cada poço e as placas incubadas por 60 min. à temperatura ambiente ao abrigo de
luz. O líquido foi descartado e lavagens suscessivas foram novamente realizadas
por três vezes utilizando 250 µL de tampão de lavagem em cada poço. Um volume
de 50 µL de substrato e 50 µL de cromógeno foram adicionados em cada poço e
vigorosamente homogeneizados. As placas foram incubadas por 30 min. à
temperatura ambiente ao abrigo de luz. Finalmente, 100 µL de solução de parada foi
adicionada em cada poço, agitados manualmente e as placas submetidas à leitura
em leitor de ELISA (Bioteck – EL 808 – Vermont – USA) a 450 nm. Os resultados
obtidos foram calculados utilizando um sistema de coordenadas em escala semi-
logarítmica utilizando o software (Log/logito) conforme descrito por FINNEY (1978)
adaptado por OLIVEIRA (1996). As concentrações foram dadas em ppt ou ng por kg.
Uma curva de calibração foi utilizada para a leitura das concentrações de AFM1
segundo instruções do fabricante. O limite de detecção do teste foi de 50 ng/kg.
III.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
III.3.1. DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE FUNGOS EM AMOSTRAS DE
QUEIJO
As espécies de fungos isoladas de Requeijão do Norte estão relacionadas na
Tabela 1. Foi observado que 52% das amostras estavam contaminadas por fungos
em contagens que variaram entre 4,5 a 7,3 log UFC/g. As contagens elevadas de
69
fungos está relacionada à contaminação ambiental das amostras, uma vez que os
requeijões estavam sendo comercializados sem o uso de embalagem.
Resultados similares foram encontrados por KURE & SKAAR (2000) e KURE
et al. (2001) ambos na Noruega e HAYALOGLU & KIRBAG (2007) na Turkia,
quando estudaram, respectivamente os queijos semi-duros Jarlsberg e Norvergia e o
queijo Tuflu provenientes de fábricas e mercados locais e relataram que o gênero
Penicillium foi encontrado com maior freqüência nestes produtos. Estes autores
relataram ainda que a ocorrência destes espécimes estava associada às condições
não controladas durante o preparo e a comercialização destes queijos.
As seguintes espécies foram identificadas com maior freqüência nos queijos:
Penicillium citrinum (em cinco amostras), Botryosphaeria rhodinia (3 amostras),
Penicillium paxilli e Cladosporium cladosporioides (duas amostras). P. citrinum é um
fungo cosmopolita que cresce como contaminante dos alimentos sendo considerado
o principal produtor de citrinina, uma micotoxina tóxica para humanos (PITT &
HOCKING, 1999). O isolamento deste fungo em queijo foi registrado por SINHA &
RANJAN (1991) na Índia com a produção de citrinina.
B. rhodinia é a forma teleomorfa de Lasiodiplodia theobromae. Não existem
relatos anteriores de sua ocorrência em queijos. Este fungo ocorre em frutos e folhas
de coqueiros provocando a “queima” das folhas e em cocos, podendo também ser
encontrado em frutas como manga, goiaba, mamão, abacate, laranja, graviola,
sapoti e cajueiro, provocando doenças e o apodrecimento das frutas e raízes
(WARWICK,1990; CORREIA et al., 2005). Portanto, sua presença no requeijão está
relacionada à contaminação ambiental.
P. paxilli representa uma espécie de fungo de ocorrência pouco comum em
alimentos. A degradação visual em queijos foi observada por PITT & HOCKING
(1999). De acordo como estes autores, P. paxilli produz duas micotoxinas, a
verruculogen e a paxilina. Estas micotoxinas apresentam baixa toxicidade.
C. cladosporioides é um fungo não micotoxigênico. A sua ocorrência é muito
comum em alimentos como os queijos refrigerados (NORTHOLT et al., 1980) e
também naqueles embalados a vácuo (HOCKING & FAEDO, 1992), provocando a
deterioração destes produtos.
70
Tabela 1 – Média das populações de fungos isolados em amostras de Requeijão do Norte obtidas em mercado varejista de Belo
Horizonte (log UFC/g).
Espécies Amostras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Aspergillus flavips 6,6 Aspergillus oryzae 7,0 Aspergillus sydowii 7,0 Aspergillus sp. 7,0 7,0 Botryosphaeria rhodinia 5,6 7,4 Cladosporium cladosporioides 5,4 5,0 Fusarium oxysporum 5,0 Lasiodiplodia crassispora
7,3
Mucor circinelloides 7,3 Paecilomyces sinensis 7,0 Penicilium citrinum 5,4 5,2 5,3 7,0 6,7 Penicilium paxilli 5,0 5,6 Rhizomucor variabilis 4,5
70
71
O gênero Penicillium foi encontrado em sete das amostras analisadas, sendo
considerado, portanto, o de maior freqüência neste estudo (Tabela 1). Este gênero é
constantemente encontrado em uma grande variedade de queijos semi-duros, na
maior parte dos casos como conseqüência de más condições higiênicas de
processamento e/ou contaminação ambiental (KURE & SKAAR, 2000; ERDOGAN et
al., 2003; FLÓREZ et al., 2007; HAYALOGLU et al., 2007). Entretanto TORKAR et
al. (2008) encontraram resultados diferentes ao relatarem que Geotrichum foi o
gênero mais freqüente encontrado em queijo Kuflu, o que pode ser explicado pelas
diferenças sazonais e geográficas que afetam diretamente o crescimento de fungos.
Os gêneros de ocorrência esporádica isolados em Requeijão do Norte foram
Mucor, Paecilomyces e Rhizomucor, todos associados à deterioração de alimentos
além do gênero Fusarium, ao qual espécies potencialmente micotoxigênicas estão
associadas (PITT & HOCKING, 1999).
III.3.1. DETERMINAÇÃO DE AFM 1
Os resultados da presença de AFM1 obtidos pelo método de ELISA
(RIDASCREEN – R-BIOPHARM) estão representados na Tabela 2.
Em 16% das amostras de requeijão foram detectadas AFM1 em faixas de
61,13 a 214,02 ng/kg. Estes resultados foram superiores ao nível máximo tolerado
em produtos lácteos pela União Européia (FAO, 2003).
Comparativamente aos outros estudos realizados no Brasil, poucos trabalhos
podem ser encontrados na literatura. Entre eles PRADO et al. (1999) que verificaram
a ocorrência de AFM1 em 74,7% das amostras de queijo Minas (frescal, canastra e
padrão), e a AFM1 foi detectada em uma faixa de 0,02 a 6,92 ng/g.
Mundialmente, diversos pesquisadores têm relatado que a contaminação de
queijos por AFM1 é freqüente. Na Itália, VIRDIS et al. (2008) encontraram AFM1 em
9,8% de amostras de queijos originados de fazendas locais. Na Eslovênia, TORKAR
et al. (2008) detectaram a presença de AFM1 em 10% dos queijos analisados
originados de pequenas unidades de processamento artesanal em níveis superiores
a 50 ng/kg.
72
Tabela 2 – Presença de aflatoxina M1 em amostras de Requeijão do Norte obtidas
em mercado varejista de Belo Horizonte.
Amostra Concentração (ng/kg)* Desvio Padrão 1 <L.D. - 2 <L.D. - 3 <L.D. - 4 <L.D. - 5 <L.D. - 6 <L.D. - 7 N.D.** N.D. 8 <L.D. - 9 63,40 1,53
10 <L.D. - 11 <L.D. - 12 <L.D. - 13 <L.D. - 14 <L.D. - 15 69,88 0,34 16 N.D.** N.D. 17 <L.D. - 18 <L.D. - 19 <L.D. - 20 <L.D. - 21 <L.D. - 22 <L.D. - 23 214,02 0,96 24 <L.D. - 25 61,13 1,37
* - Média de Triplicata. ND - não detectado. Limite de Detecção: 50 ng/kg.
DASHTI et al. (2009) relataram a presença de AFM1 em 80% de amostras de
queijos industrializados na Turquia em níveis de 23,8 a 452,0 ng/kg. Em todos estes
trabalhos, os níveis de AFM1 detectados excederam os limites aceitáveis em seus
países.
III.4. CONCLUSÕES
A partir dos resultados apresentados neste estudo pode ser observado que a
contaminação por fungos está relacionada não só ao processo de fabricação, como
também à contaminação na comercialização dos queijos que são manipulados sem
embalagem permitindo a colonização destes microrganismos.
73
A presença de AFM1 nas amostras está associada ao consumo de alimentos
contaminados pelo gado leiteiro e/ou a más condições de estocagem do alimento
destinado a esse fim, uma vez que as medidas de controle de alimentos no Brasil
ainda são insuficientes (SANTURIO, 2000).
Espécies possivelmente aflatoxigênicas foram isoladas e identificadas nos
queijos. Além disto os níveis de AFM1 detectados superam os níveis de tolerância
máxima para AFM1 em produtos lácteos estabelecido pela União Européia que é de
50 ng/kg (FAO, 2003). No Brasil não há legislação específica para queijos e,
portanto, os níveis de AFM1 detectados neste trabalho não podem ser considerados
como um problema de saúde pública.
As alternativas para controlar ou corrigir as contaminações por fungos são o
emprego adequado de técnicas de conservação dos alimentos como tratamento
térmico, adição de conservantes, uso de embalagens ou a combinação destas no
preparo e durante a comercialização destes queijos.
74
CONCLUSÕES INTEGRADAS
A qualidade microbiológica do Requeijão do Norte foi insatisfatória em 40%
das amostras, tanto pela população dos indicadores higiênicos detectados, quanto
pela presença de Staphylococcus coagulase-positivos e E. coli, além da presença de
SEB (em 2 amostras) e TSST-1 (em 1 amostra).
Foi observada uma grande variação nos parâmetros físico-químicos do
Requeijão do Norte, provavelmente associado com a diversidade dos
processamentos e inexistência de padrões para o processo de elaboração.
A população de leveduras e fungos presentes no Requeijão do Norte foi
elevada, indicando a existência de condições higiênico-sanitárias inadequadas pós-
processamento (distribuição e comercialização).
Dentre a grande variedade de leveduras, as espécies isoladas com maior
freqüência foram Candida parapsilosis, Moniliella spathulata, Debaryomyces
hansenii e Kodamaeae ohmeri. Aproximadamente 27% dessas leveduras
apresentaram potencial biotecnológico, pela atividade enzimática (proteolítica,
lipolítica e β-galactosidase) observada.
Espécies possivelmente aflatoxigênicas foram isoladas e identificadas no
Requeijão do Norte. Entretanto a presença de AFM1 quantificada nas amostras
esteve abaixo dos níveis máximos de tolerância aceitos em alimentos.
A possibilidade do Requeijão do Norte representar um risco à saúde da
população pôde ser verificada, sendo necessária a implantação de medidas que
possam garantir a segurança (BPF).
75
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao início desta tese foi idealizada como uma das propostas de trabalho a
implantação das Boas Práticas de Fabricação em uma unidade produtora do
requeijão localizada no município de Salinas-MG. Foram realizadas visitas no local
de produção e coletas de amostras em pontos críticos nas etapas do processamento
previamente determinados. Problemas de logística relacionados a reformas iniciadas
na planta de fabricação, ainda não concluídas, e o contexto ao qual o produto se
encontra inserido economicamente, inviabilizaram a continuidade das atividades.
A partir dos resultados finais obtidos nesta tese pode ser observado que a
qualidade microbiológica do Requeijão do Norte comercializado na cidade de Belo-
Horizonte-MG encontra-se insatisfatória. A existência comprovada de risco
microbiológico à saúde humana aponta para a necessidade de melhorias voltadas
ao processamento, armazenamento refrigerado e à utilização de embalagem para o
produto. O investimento na qualidade do produto é viável, uma vez que o mesmo já
se encontra bem divulgado e a demanda está vinculada a uma clientela definida.
A implantação das Boas Práticas de Fabricação pode resolver os problemas
da qualidade, bem como abrir as portas para a expansão do comércio deste produto,
sendo sugerida a continuidade de estudos futuros nesta área.
76
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100
APÊNDICE I
BREVE DESCRIÇÃO SOBRE O PROCESSO DE FABRICAÇÃO DO R EQUEIJÃO
DO NORTE E AS CONDIÇÕES DE PROCESSAMENTO EM UMA PRO PRIEDADE
RURAL LOCALIZADA NO MUNICÍPIO DE SALINAS – MG.
Para a produção artesanal do Requeijão do Norte é utilizado o leite de vaca cru.
O processo inicia-se com a coagulação ácida do leite que é deixado à
temperatura ambiente por 24 hs a 48 hs. Após a formação da coalhada, o creme é
removido e o processamento da massa é iniciado pelo aquecimento brando (45 °C)
por até 20 minutos para a retirada de soro.
AQUECIMENTO DA MASSA
LAVAGEM - DESSORAGEM
COAGULAÇÃO ÁCIDA
RETIRADA DO CREME
101
A massa obtida é muito ácida e por isso deve passar pela desacidificação que
é realizada por um processo em que se alternam as lavagens com água, adição de
leite, fervura e remoção do líquido residual entre cada lavagem. Geralmente este
processo se alterna por até 3 vezes.
Ao final do preparo do requeijão, o sal é adicionado à massa fundida
juntamente com a Manteiga de Garrafa que é vigorosamente misturada. A massa é
colocada em formas de madeira e, após esfriarem, os requeijões são retirados das
formas e acondicionados em caixas de papelão forradas com plástico para serem
transportados aos pontos de venda.
Durante todo o processo de fabricação do requeijão, podem ser verificados
diferentes pontos críticos que propiciam a contaminação do produto. As instalações
são improvisadas e a obtenção do leite é informal. Medidas de suporte aos
pequenos produtores devem ser realizadas para que a melhoria das condições de
produção e da qualidade higiênica do Requeijão do Norte sejam alcançadas.
INCORPORAÇÃO DE SAL E
MANTEIGA DE GARRAFA
ENFORMAGEM
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