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Caracterização morfológica da epiderme do
bagre neotropical Pimelodella cf. vittata
(Osteichthyes: Ostariophysi: Siluriformes:
Heptapteridae) com ênfase nas células
claviformes
Eduardo Medeiros Damasceno
Dissertação de Mestrado em Biodiversidade Tropical
Mestrado em Biodiversidade Tropical
Universidade Federal do Espírito Santo
São Mateus, Fevereiro de 2012
ii
Caracterização morfológica da epiderme do bagre
neotropical Pimelodella cf. vittata (Osteichthyes:
Ostariophysi: Siluriformes: Heptapteridae) com
ênfase nas células claviformes
Eduardo Medeiros Damasceno
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical
da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do
grau de Mestre em Biodiversidade Tropical.
Aprovada em 29/02/2012 por
______________________________________________
Profa. Dra. Karina Carvalho Mancini – Orientador, UFES
______________________________________________
Profa. Dra. Juliana Castro Monteiro – Co-orientadora, UFES
______________________________________________
Prof. Dr. Luiz Fernando Duboc – Co-orientador, UFES
______________________________________________
Prof. Dr. Marcos de Lucca Moreira Gomes, UFES
______________________________________________
Prof. Dr. Jorge Abdala Dergam dos Santos, UFV
Universidade Federal do Espírito Santo
São Mateus, Fevereiro de 2012
iii
Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Central da Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
Damasceno, Eduardo Medeiros, 1978-
D155c Caracterização morfológica da epiderme do bagre neotropical
Pimelodella cf. vittata (Osteichthyes: Ostariophysi: Siluriformes:
Heptapteridae) com ênfase nas células claviformes / Eduardo
Medeiros Damasceno. – 2012.
80 f. : il.
Orientadora: Karina Carvalho Mancini.
Coorientador: Juliana Castro Monteiro e Luiz Fernando
Duboc.
Dissertação (Mestrado em Biodiversidade Tropical) –
Universidade Federal do Espírito Santo, Centro Universitário
Norte do Espírito Santo.
1. Peixe. 2. Pele. 3. Histologia. 4. Microscopia eletrônica. I.
Mancini, Karina Carvalho. II. Monteiro, Juliana Castro. III. Duboc,
Luiz Fernando . IV. Universidade Federal do Espírito Santo.
Centro Universitário Norte do Espírito Santo. V. Título.
CDU: 502
iv
DEDICATÓRIA
A Juraci Lucas e Lucy (in memorian), que me
deram a vida.
A Profa. Dra. Karina Carvalho Mancini, por
acreditar em mim.
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Jeová Deus Pai Todo Poderoso, por ter me dado sabedoria e
discernimento.
Aos meus irmãos, pai e madrasta por me apoiarem em todos os
momentos de minha vida.
A minha orientadora Profa. Dra. Karina Carvalho Mancini, pois sem o seu
incentivo e esforços esse trabalho não teria acontecido, e por nunca “fechar a porta”
para quem tem “brilho nos olhos”! E por me ensinar que podemos evitar as quedas,
dando um passo depois do outro. Obrigado por existir!
A minha co-orientadora Profa. Dra. Juliana Castro Monteiro pelo incentivo
e ensinamentos. Obrigado por fazer parte de minha vida acadêmica!
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Luiz Fernando Duboc pelas coletas e
identificação dos espécimes. Obrigado pelas sugestões imprescindíveis para
realização deste trabalho. Obrigado por todo apoio e palavras de incentivo, foi muito
bom ter te conhecido.
Aos Profs. Drs. Marcos de Lucca Moreira Gomes e Jorge Abdala Dergam
dos Santos por terem aceito fazer parte da banca de dissertação.
Aos orientados do Prof. Dr. Luiz Fernando Duboc, Maria Cecília Sily,
Fernanda, Priscila Plesley, Natane e Gabriel Ramsauer que foram peças
fundamentais em minhas coletas. Obrigado!
Aos meus amigos Felipe Zanelato e Elândia por todo apoio. Obrigado!
Ao Prof. Dr. Breno Valentim e toda equipe do Laboratório de
Ultraestrutura Celular Carlos Alberto Redins (CCS/UFES) por sempre me receberem
de braços abertos.
A Profa. Dra. Mary Anne Heidi Dolder por abrir as portas do Laboratório
de Ultraestrutura Celular do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional
(IB/UNICAMP) para processamento de material de microscopia eletrônica.
A todos os funcionários do Centro de Microscopia Eletrônica
(IB/UNICAMP).
Ao Pedro Vale de Azevedo Brito por todo apoio e suporte em Campinas.
A Karine Freitas pela receptividade e hospedagem em Campinas.
vi
Ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical por me
conceder essa oportunidade.
As secretárias Silvia, Bernardeth e Kárita por serem prestativas.
Aos professores do programa por contribuírem com minha formação.
Aos meus colegas da Vigilância em Saúde – Pedro Canário – ES, em
especial ao meu chefe Gildenê por me liberar sempre que solicitado, e também a
Inês, Evaldo, Ieda, Nelcy, Eugênio, Islane, Edson, Valquides, Rubens e Gerbis por
serem companheiros e compreensivos. Muito obrigado!
vii
EPÍGRAFE
TUDO O QUE HOJE PRECISO REALMENTE SABER, APRENDI NO JARDIM DE
INFÂNCIA.
Tudo o que hoje preciso realmente saber, sobre como viver, o que fazer e como ser,
aprendi no jardim de infância. A sabedoria não se encontrava no topo de um curso
de pós-graduação, mas no montinho de areia da escola de todo dia.
Estas são as coisas que aprendi lá:
1. Compartilhe tudo.
2. Jogue dentro das regras.
3. Não bata nos outros.
4. Coloque as coisas de volta onde pegou.
5. Arrume sua bagunça.
6. Não pegue as coisas dos outros.
7. Peça desculpas quando machucar alguém.
8. Lave as mãos antes de comer e agradeça a Deus antes de se deitar.
9. Dê descarga. (esse é importante)
10. Biscoitos quentinhos e leite fazem bem para você.
11. Respeite o outro.
12. Leve uma vida equilibrada: aprenda um pouco, pense um pouco... desenhe...
pinte... cante... dance... brinque... trabalhe um pouco todos os dias.
13. Tire uma soneca a tarde. (isso é muito bom)
viii
14. Quando sair, cuidado com os carros.
15. Dê a mão e fique junto.
16. Repare nas maravilhas da vida.
17. O peixinho dourado, o hamster, o camundongo branco e até mesmo a
sementinha no copinho plástico, todos morrem... nós também.
Pegue qualquer um desses itens, coloque-os em termos mais adultos e sofisticados
e aplique-os à sua vida familiar, ao seu trabalho, ao seu governo, ao seu mundo e aí
verá como ele é verdadeiro claro e firme.
Pense como o mundo seria melhor se todos nós, no mundo todo, tivéssemos
biscoitos e leite todos os dias por volta de três da tarde e pudéssemos deitar com
um cobertozinho para uma soneca.
Ou se todos os governos tivessem como regra básica devolver as coisas ao lugar
em que elas se encontravam e arrumassem a bagunça ao sair. Ao sair para o
mundo é sempre melhor darmos as mãos e ficarmos juntos. “É necessário abrir os
olhos e perceber que as coisas boas estão dentro de nós, onde os sentimentos não
precisam de motivos nem os desejos de razão. O importante é aproveitar o
momento e aprender sua duração, pois a vida está nos olhos de quem souber ver”.
Pedro Bial
ix
SUMÁRIO
1. Lista de Ilustrações ............................................................................................. x
2. Lista de Abreviaturas .......................................................................................... xii
3. Resumo ............................................................................................................... xiii
4. Abstract ............................................................................................................... xiv
5. Introdução
Superordem Ostariophysi ............................................................................ 16
Ordem Siluriformes ..................................................................................... 16
Família Heptapteridae.................................................................................. 17
Epiderme dos Ostariophysi ......................................................................... 19
Células Claviformes..................................................................................... 19
Células de Substância de Alarme................................................................ 21
6. Objetivos ............................................................................................................. 27
7. Material e Métodos
Material
Local de coleta ............................................................................... 29
Material Biológico ........................................................................... 29
Métodos
Microscopia de Luz ....................................................,.................... 30
Microscopia Eletrônica de Transmissão ......................................... 32
Microscopia Eletrônica de Varredura ............................................. 32
8. Resultados .......................................................................................................... 35
9. Ilustrações ........................................................................................................... 39
10. Discussão ........................................................................................................... 58
11. Conclusões......................................................................................................... 67
12. Referências Bibliográficas .................................................................................. 70
x
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Exemplar adulto do bagre Pimelodella cf. vittata. 30
Figura 2: Microscopia de luz (HE). (A) Pele de Pimelodella cf. vittata
organizada em um tecido epitelial (TE) apoiado no tecido conjuntivo denso
(TC) e tecido muscular estriado esquelético (TM). (B) Tecido epitelial
estratificado composto por células claviformes (CC) e células epidérmicas
(CE).
40
Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura. Pele de Pimelodella cf.
vittata sob criofratura. CC: células claviformes, CE: células epidérmicas, TC:
tecido conjuntivo, TM: tecido muscular estriado esquelético.
42
Figura 4: Microscopia eletrônica de transmissão. Células constituintes do
epitélio de Pimelodella cf. vittata com ênfase nas células epidérmicas.
Células claviformes (CC), células epidérmicas superficiais (CES), células
epidérmicas densas (CED) e células epidérmicas abundantes (CEA).
44
Figura 5: Microscopia eletrônica de transmissão. Células constituintes do
epitélio de Pimelodella cf. vittata com ênfase nas Células claviformes (CC),
células epidérmicas superficiais (CES), células epidérmicas densas (CED) e
células epidérmicas abundantes (CEA). TC: tecido conjuntivo, MF:
melanóforo.
46
Figura 6: Epitélio de Pimelodella cf. vittata destacando as células
claviformes através de três microscopias distintas: microscopia de luz (HE)
(A), microscopia eletrônica de varredura (B) e transmissão (C). Em (C)
presença das células epidérmicas (CE) e notar as projeções e invaginações
(setas) das células claviformes (CC). N: núcleo, TC: tecido conjuntivo.
48
xi
Figura 7: Microscopia eletrônica de transmissão. Morfologia das células
claviformes (CC). Presença de dois núcleos (N) por célula e nucléolo
evidente (Nu). Ao redor do núcleo, citoplasma elétron lúcido composto de
mitocôndrias (mi). Notar presença de polirribossomos (pr) e complexo de
Golgi (cg) nesta região perinuclear. Em (A) e (C), invaginações e projeções
(setas) das células claviformes. CEA: célula epidérmica abundante, CED:
célula epidérmica densa, VA: vacúolo, TC: tecido conjuntivo.
50
Figura 8: Microscopia eletrônica de transmissão. Morfologia das células
claviformes. Detalhe da região mostrando mitocôndrias (mi),
polirribossomos (pr) e complexo de Golgi (cg). Em (F), citoplasma
filamentoso (CF), com secreção não vesicular. N: núcleo.
52
Figura 9: Microscopia eletrônica de transmissão. Detalhe dos tecidos
subjacentes ao epitélio (TE). (A) Lâmina basal composta por matriz
extracelular (ME) e fibroblastos (FB). Notar a presença de melanóforo (MF).
(B, C) Tecido conjuntivo denso composto por fibroblastos aprisionados em
ordenadas fibras de colágeno. (D) Tecido muscular estriado esquelético
(TM).
54
Figura 10: Microscopia de luz. (A) Método de PAS; (B) Método de Azul de
Bromofenol; (C) Método de Tricrômico de Mallory. Células epidérmicas
(CE), células claviformes (CC), tecido conjuntivo (TC), tecido muscular
estriado esquelético (TM).
56
xii
LISTAS DE ABREVIATURAS
CE - Células epidérmicas
CEA - Células epidérmicas abundantes
CED - Células epidérmicas densas
CES - Células epidérmicas superficiais
cg - Complexo de Golgi
CC - Células claviformes
ME - Matriz extracelular
MF - Melanóforo
mi - mitocôndria
N - Núcleo
Nu - Nucléolo
pr - polirribossomos
TC - Tecido conjuntivo
TM - Tecido muscular estriado esquelético
VA - Vacúolo
xiii
RESUMO
A epiderme de peixes Ostariophyisi é composta por três tipos celulares básicos: as
células epidérmicas, as células de muco e as células claviformes. Essas últimas
estão associadas à produção e armazenamento de uma substância que, uma vez
liberada na água, provoca reações diversas no restante do cardume. As análises
morfológicas da epiderme do bagre Pimelodella cf. vittata revelaram a presença de
células claviformes e células epidérmicas. As células claviformes ocorrem na
camada média da epiderme, representando as maiores células desse epitélio sendo
globulares e alongadas. O citoplasma é bastante pobre em organelas e rico em
secreção fibrilar não vesicular. As poucas organelas observadas (retículo
endoplasmático, complexo de Golgi, polirribossomos e mitocôndrias) estão
localizadas na região perinuclear, enquanto o restante do citoplasma é repleto de
uma substância filamentosa, que ocupa quase a totalidade do volume
citoplasmático. Ocasionalmente, ocorrem grandes vacúolos na periferia
citoplasmática. São células que possuem dois núcleos de formas irregulares,
nucléolo evidente, cromatina central pouco condensada, mas com regiões
periféricas de compactação. Através de análises histoquímicas, detectou-se
composição protéica do conteúdo citoplasmático e ausência de carboidratos. Essas
características morfológicas e histoquímicas são semelhantes àquelas descritas
para a maioria dos Ostariophysi. As células epidérmicas diferem do descrito na
literatura, sendo aqui caracterizadas em três tipos celulares distintos: superficiais,
abundantes e densas. Não foram encontradas células de muco em P. cf. vittata,
típicas de todos os Ostariophysi já estudados. O presente estudo corrobora as
informações observadas sobre morfologia das células claviformes em Siluriformes e
detecta importantes diferenças na composição da epiderme e na estrutura das
células epidérmicas de Pimelodella cf. vittata quando comparada aos dados da
literatura.
Palavras-chave: Peixe, pele, histologia, microscopia eletrônica, células epidérmicas.
xiv
ABSTRACT
The epidermis of Ostariophyi fish is composed by three basic cell types: epidermal,
mucus and club cells. These latter cells are associated with the production of a
secretion with distinct function and chemical composition. Morphological analyses of
the epidermis of the catfish Pimelodella cf. vittata indicated the presence of club cells
and epidermal cells. The club cells occur in the epidermis middle layer representing
the largest cells of the epithelium. They are elongated and globular. The cytoplasm is
poor in organelles and rich in a fibrillar secretion not encapsulated in vesicles. The
observed organelles (endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, mitochondria and
polirribosomes), are located in the perinuclear region, while the remainder of the
cytoplasm is filled with a fibrillar material. Occasionally, large vacuoles occur in the
cytoplasmic periphery. The club cells present, in general, two nuclei with irregular
shape, evident nucleolus, central loose chromatin and condensed chromatin in the
periphery. By histochemistry analyses, it was detected protein composition in the
cytoplasm and absence of carbohydrates. These morphological and histochemical
characteristics are similar to those described for the majority of the Ostariophysi. The
epidermal cells differ from that described in the literature, being described here in
three distinct cell types: surface, abundant and dense one. These types have never
been noted before. There was no evidence of mucus cells in P. cf. vittata, typical
cells found in all Ostariophysi studied. The present study corroborates the data about
club cell morphology in Ostariophysi and detects significant differences in the
epidermis composition and epidermal cells structure of P. cf. vittata when compared
to the literature.
Keywords: fish, skin, histology, electron microscopy, epidermal cells.
xv
INTRODUÇÃO
16
Superordem Ostariophysi
Os Ostariophysi compõem a segunda maior superordem de peixes, com mais
de 6.500 espécies descritas, representando aproximadamente 68% de todas as
espécies de peixes de água doce e mais de 28% de todas as espécies de peixes
conhecidas no mundo (NELSON, 2006). Os Ostariophysi estão presentes em todos
os continentes, exceto na Antártida, Groenlândia e Oceania (NELSON, 2006). A
importância deste táxon de peixes nas águas doces neotropicais é marcada
principalmente por sua abundância e diversidade (ROBERTS, 1972) e constitui mais
de 85% da ictiofauna continental (CASTRO, 1999). Nos últimos anos, novas
espécies de Ostariophysi vêm sendo descritas, aumentando assim as estimativas de
diversidade de espécies da ictiofauna de água doce Neotropical.
Esse táxon é composto pelas séries Anotophysi (= Gonorynchiformes) +
Otophysi (= "Ostariophysi" de antes). Esta estrutura geral foi corroborada por FINK &
FINK (1981) sendo então a composição mais amplamente aceita (LAUDER & LIEM,
1983; FINK & FINK, 1996). Atualmente, a superordem abrange cinco ordens -
Gonorynchiformes, Cypriniformes, Characiformes, Siluriformes e Gymnotiformes –
68 famílias, 1.075 gêneros e cerca de 7.900 espécies (NELSON, 2006).
Ordem Siluriformes
A ordem Siluriformes representa o grupo mais diversificado e amplamente
distribuído dos Ostariophysi (PINNA, 1998). Os Siluriformes são popularmente
conhecidos como cascudos, mandis, bagres, ou, do inglês, „catfishes‟, e são os
peixes mais amplamente distribuídos dentro dos Ostariophysi. Esta ordem é
17
composta por 35 famílias, distribuídas em 446 gêneros e 2.867 espécies (NELSON,
2006). Destas famílias, Ariidae e Plotosidae, consistem basicamente de espécies
marinhas (cerca de 120 espécies), mas elas também têm representantes que são
frequentemente encontrados em águas salobras, costeiras e, às vezes, apenas em
água doce (NELSON, 2006). A maior diversidade de bagres ocorre em regiões
tropicais, especialmente América do Sul, África sub-Saara e Sudeste da Ásia
(MALABARBA, 1998).
Seus representantes são facilmente identificados por possuírem o corpo nu e
envolto por pele espessa, que é o caso dos bagres, ou estar total ou parcialmente
coberta por placas ósseas (BRITSKI et al., 1988), que é o caso dos cascudos. São
animais de pouca movimentação, habitando fundo de rios e escondendo-se entre
pedras e vegetação (BRITSKI, 1981), com atividade predominantemente crepuscular
ou noturna. Possuem uma dieta extremamente variada, tendendo a herbívoria (como
muitos cascudos) e carnívoria (como muitos grandes bagres) (BURGESS, 1989). Em
especial, os bagres da Mata Atlântica são preferencialmente carnívoros,
alimentando-se principalmente de outros peixes e de macrofauna bentônica
(DUBOC, 2003).
Família Heptapteridae
A família Heptapteridae é endêmica da região Neotropical, distribuída desde o
México até o sul da Argentina, sendo um dos principais representantes da ordem
Siluriformes nos rios da América do Sul e Central (BOCKMANN & GUAZZELLI,
2003). Compreendem peixes de pequeno a médio porte, que dificilmente
ultrapassam 20 cm de comprimento. Entre os gêneros desta família, Pimelodella e
18
Rhamdia estão entre os mais comuns da América do Sul, contudo, sua biologia
ainda é pouco conhecida (MALABARBA,1998).
Pimelodella Eigenmann & Eigenmann 1888, objeto do presente estudo, é um
dos gêneros mais ricos em espécies, com 81 representantes, (BOCKMANN &
GUAZZELLI, 2003) e estão distribuídas desde o sul da América do Sul até o
Panamá e América Central (BURGESS, 1989). São animais de pequeno porte, em
média com 12 cm de comprimento (o maior registro é Pimelodella cristata com 34
cm), encontrados preferencialmente em córregos estreitos e com vegetação
abundante. O gênero é popularmente conhecido como mandi-chorão, devido ao som
que emite durante sua captura (BURGESS, op. cit). Possui hábito crepuscular ou
noturno, tendendo a ser sedentário ou de pequenos deslocamentos, ocorrendo
preferencialmente em ambiente lêntico. A dieta sugere ser basicamente generalista
e bentófaga, tendendo à carnívoria, demonstrando também oportunismo alimentar
(DUBOC, 2003).
A espécie ora estudada ainda não foi definitivamente identificada, podendo
inclusive tratar-se de uma espécie nova, estreitamente relacionada à Pimelodella
vittata, mas compartilhando feições também com P. lateristriga e P. laurenti, de
acordo com o manual de identificação utilizado (BRITSKI et al., 1988), pois não há
registros históricos confiáveis de exemplares do gênero tombados oficialmente e/ou
disponíveis para avaliação, bem como ainda não há chaves de identificação para as
espécies de peixes da bacia do rio São Mateus.
19
Epiderme dos Ostariophysi
O tegumento dos animais é um órgão exposto da superfície corpórea, que fica
em contato direto com o ambiente e atua em inúmeras funções relacionadas à
interface entre organismo e seu ambiente, além de estar envolvido na proteção
contra agentes físicos, químicos e biológicos, como os patógenos.
A estrutura básica da pele é semelhante entre os diferentes grupos de peixes,
mas características morfológicas e citológicas específicas podem ser observadas
(GARG et al., 2010). É constituída por uma epiderme separada por uma lâmina
basal da derme subjacente. A epiderme possui três tipos celulares característicos,
que são as células epidérmicas, as células de muco e as células claviformes, foco
principal do presente trabalho. As células epidérmicas são menores quando
comparadas às células de muco e as células claviformes, contudo, são mais
numerosas, e são encontradas desde camadas mais basais até as camadas mais
superficiais do epitélio (GUERRA et al., 2006). As células de muco são células
conspícuas, localizadas próximas à superfície apical do epitélio, arredondadas e
com núcleo periférico achatado. São importantes constituintes funcionais da
epiderme de peixes e secretam uma substância que constitui o revestimento da
superfície mucosa (SMITH, 1977).
Células Claviformes
As células claviformes são conspícuas e proeminentes constituintes do
epitélio dos peixes e receberam essa denominação devido ao formato de clava
observado em microscopia de luz. Foram descritas pela primeira vez em epiderme
20
de lampreias (KÖLLIKER,1860). Em microscopia de luz, as células claviformes dos
Ostariophysi diferem das células claviformes dos demais teleósteos quanto a sua
morfologia (PFEIFFER, 1960; PFEIFFER & PLETCHER, 1964). Estudos com
técnicas histoquímicas e microscopia eletrônica corroboraram essas diferenças
morfológicas (BERTOLINI et al., 1968;. HENRIKSON & MATOLTSY et al., 1968;
MITTAL & MUNSHI, 1969; MEDEIROS et al., 1970; PFEIFFER et al., 1971).
As células claviformes são encontradas em diferentes grupos de peixes,
contudo, sua função não está totalmente estabelecida, sendo associadas, a
princípio, a funções distintas (RALPHS & BENJAMIN, 1992). ZACCONE et al. (1990)
demonstraram a presença de serotonina nessas células e sugeriram uma função
feromonal, onde a serotonina, e possivelmente outros tipos de peptídeos bioativos,
podem exercer um efeito sobre o mecanismo de liberação do feromônio de alarme.
Alguns autores atribuíram a essas células função antipatogênica (SMITH 1982;
SUZUKI & KANEKO, 1986; AL HASSAN et al., 1987), assim como LUFTY (1964),
por sua vez, sugeriu função fagocítica. Em alguns peixes foi identificada a presença
de condroitina e queratina (RALPHS & BENJAMIN, 1992) o que poderia ter função
cicatrizante, ajudando na reparação dos tecidos danificados (IGER & ABRAHAM,
1990). Além disso, SUZUKI & KANEKO (1986) mostraram que essas células
secretam muco.
Dentre as diversas funções atribuídas às células claviformes nos mais
diversos grupos de peixes, incluindo os Ostariophysi, na maioria das espécies de
Ostariophysi essas células estão relacionadas com a sinalização/comunicação entre
os indivíduos do cardume, com produção de uma substância específica com
capacidade de gerar uma reação de alarme (FRISCH, 1938; 1941; PFEIFFER, 1960,
1962, 1977; SMITH, 1992, 1997). Foi PFEIFFER (1960) quem associou as células
21
claviformes com a reação de alarme, sendo então denominadas de células de
substância de alarme (do alemão Schreckstoffzellen: Schreck = susto + Stoff =
matéria + Zellen = célula).
Células de Substância de Alarme
As reações de alarme são fenômenos comportamentais apresentados por
animais de hábito social, visando maior proteção contra predadores (EDMUNDS,
1974). Nos Ostariophysi, a reação de alarme é desencadeada quando indivíduos
predados ou ameaçados têm sua epiderme lesada. Tal evento causa um
rompimento nas células claviformes, denominadas de células de substância de
alarme, e seu conteúdo citoplasmático é então liberado na água e percebido pelos
demais indivíduos do cardume. Como consequência, os indivíduos, pertencentes à
mesma espécie ou espécies distintas, mas filogeneticamente próximas (SMITH,
1977), apresentam um estado de pânico generalizado denominado por FRISCH
(1938, 1941) como Schreckreaktion (do alemão: Schreck = susto + Reaktion =
reação). A reação de alarme é o resultado de três fatores fundamentais: presença
das células de substância de alarme + produção e liberação de uma substância de
alarme pelo emissor + capacidade de resposta do receptor. A ausência de quaisquer
destes fatores inviabiliza a reação, mesmo que haja a transmissão visual.
Dada a intra-especificidade e a inter-especificidade da reação, tal fenômeno
representa um importante subsídio para uma melhor compreensão das relações
filogenéticas entre peixes. Por isso, as substâncias de alarme e a reação provocada
por elas têm sido descritas em muitas espécies (SCHUTZ, 1956; STEVEN, 1959;
VERHEIJEN, 1959, 1962, 1963; PFEIFFER, 1960, 1962, 1963, 1966, 1967, 1974,
22
1977; SKINNER et al., 1962; HEMMINGS, 1966; REED, 1966, 1969; THINÉS &
VANDENBUSSCHE, 1966; GANDOLFI, 1968; VERHEIJEN & REUTER, 1969;
REED et al., 1972; SMITH, 1973; THINÉS & LEGRAIN, 1973; AOKI & KUROKI,
1975; DUBOC, 2007).
Na ordem Siluriformes, entretanto, devido a escassez de estudos no grupo,
não se pode afirmar que todas as células claviformes são células de substância de
alarme. Em várias espécies dessa ordem, as células claviformes parecem descargar
seus conteúdos citoplasmáticos mesmo quando a pele não está lesionada (MITTAL
& MUNSHI, 1970) atribuindo, assim, outra função a elas.
As células de substância de alarme são quase sempre presentes em espécies
que apresentam a reação de alarme, mas, podem ser encontradas em algumas
espécies que não apresentam a reação, como por exemplo, o lambari cego das
cavernas mexicanas – Astyanax jordani (HUBBS & INNES, 1936), Characidae – as
piranhas e os pacus (ambos Characidae, Serrasalminae). Conforme SMITH (1977),
a não ocorrência da reação de alarme mesmo na existência das células claviformes
com função de células de substância de alarme pode ser resultado da baixa
ocorrência de predadores em cavernas ou a voracidade predadora das piranhas.
Esses fatores podem ter sido causais na redução das pressões seletivas para a
manutenção da reação de alarme, a qual é então reduzida ou perdida. A reação de
alarme pode variar de acordo com o nicho ecológico ou às adaptações de cada
espécie, de modo que a ausência de reação em várias espécies de Ostariophysi é
resultado de provável perda secundária (DUBOC, 2007). Os Ostariophysi que não
apresentam reação de alarme são espécies que têm adaptações relativamente
especializadas, como espécies cavernícolas, predadores com hábitos noturnos ou
espécies de hábitats crípticos (PFEIFFER, 1977).
23
PFEIFFER (1960; 1967) concluiu que essa reação de alarme é existente
apenas em Ostariophysi, entretanto, BARRETO et al. (2010), demonstraram a
existência de reação de alarme e presença de células claviformes com função de
células de substâncias de alarme em tilápias do Nilo Oreochromis niloticus (não-
ostariofiso) . Mas segundo CHIVERS et al. (2007), a função primária das células de
substância de alarme seria imunológica e o componente de alarme evoluiu
secundariamente.
Muitos autores estudaram a reação de alarme sem nenhuma abordagem
morfológica das células claviformes (FRISCH, 1938, 1941a, b; BRETT &
MACKINNON, 1954; SCHUTZ, 1956; VERHEIJEN, 1956, 1959, 1962, 1963;
SKINNER et al., 1962; HEMMINGS, 1966, REED, 1966, 1969; THINÉS &
VANDENBUSSCHE, 1966; ROSENBLATT & LOSEY, 1967; GANDOLFI, 1968;
VERHEIJEN & REUTER, 1969; MARKL, 1972; REED et al., 1972; THINÉS &
LEGRAIN, 1973; AOKI & KUROKI, 1975). Já outros autores, estudaram as células
claviformes sem considerar a reação de alarme (KAPOOR, 1953, 1966; HUSSAINI &
LUFTY, 1958; JAKUBOWSKI, 1958, 1959, 1960; NEDELEA & STEOPOE, 1967;
HENRIKSON & MATOLTSY, 1968; MITTAL & MUNSHI, 1969, 1970; MEDEIROS et
al., 1970; BIANCHI, 1975). Neste último grupo, encaixa-se o presente trabalho.
A presença dessas células em Ostariophysi constitui-se numa questão
intrigante para a teoria da evolução (NELSON, 1994). Essas células, aparentemente
especializadas para síntese e liberação de produtos químicos olfatórios, há muito
tempo têm interessado aos ecologistas evolutivos, onde os beneficiários principais
de uma sinalização de alarme não parecem ser os indivíduos que enviam o sinal
(WILLIANS, 1992), sugerindo um caso de altruísmo (SMITH ,1992).
24
A composição química definitiva da substância de alarme é ainda pouco
esclarecida, mas tem sido largamente discutida (PFEIFFER, 1962; MlTTAL &
MUNSHI, 1969; REED et al., 1973; BIRCH, 1974; PFEIFFER, 1982; PFEIFFER et
al., 1971, 1985). PFEIFFER et al. (1971), através de resultados histoquímicos,
determinaram a presença de atividade secretora e que a substância secretada é de
baixo peso molecular.
Acredita-se que seja constituída por um conjunto de compostos complexos
contendo óxido nítrico como grupo funcional. Estudos sugerem que a base púrica
3(N)-Óxido de hipoxantina seja o provável componente ativo da substância de
alarme em Ostariophysi (PFEIFFER et al., 1985; SMITH, 1986; SMITH, 1992;
BROWN et al., 2000, 2003). Essa molécula é relativamente pequena, com
considerável variedade de grupos funcionais, proporcionando vários sítios de
reconhecimento molecular.
Apesar dos estudos acerca do 3(N)-Óxido de hipoxantina, permanece
desconhecido se há um único grupo funcional ou se existe uma combinação de
grupos funcionais organizados por um esqueleto de purina (PFEIFFER et al., 1985).
BROWN et al. (2000), sugeriram que qualquer composto com um grupo funcional de
óxido de nitrogênio pode agir como um agente potencial de sinalização.
25
OBJETIVOS
26
Geral
Caracterizar a epiderme do siluriforme Pimelodella cf. vittata na Bacia do Rio
São Mateus, com ênfase na morfologia das células claviformes.
Específicos
Descrever a estrutura do tegumento;
Detalhar a morfologia das células que compõem a epiderme;
Analisar a distribuição das células claviformes ao longo da epiderme;
Determinar a composição química da secreção presente nas células
claviformes, através de técnicas citoquímicas;
Comparar os resultados obtidos com dados existentes na literatura;
Contribuir com maiores informações morfológicas sobre as células que
compõem a epiderme, relacionando com aspectos ecológicos e comportamentais.
27
MATERIAL E MÉTODOS
28
Local de coleta
As coletas foram realizadas em dois pontos da Bacia do Rio São Mateus (18°
39' 02.2'' S e 40° 07' 23.4'' W, 18° 39' 00.8'' S e 40° 05' 39.9'' W) durante os meses
de Julho e Setembro do ano de 2011. As capturas foram feitas com rede de arrasto,
sob licença SISBIO - Licença permanente para coleta de material zoológico - nº
19158-1 do Prof. Dr. Luiz Fernando Duboc.
A bacia hidrográfica do rio São Mateus possui uma superfície de cerca de
13.500km², sendo 7.710km2 no estado do Espírito Santo, e totalmente inserida na
Ecorregião Aquática da Mata Atlântica (MMA, 2006). Suas nascentes localizam-se
em Minas Gerais, a cerca de 1000m de altitude, e ao longo do seu curso agrega 15
afluentes principais que contribuem na drenagem de 23 municípios, sendo 11 no
Espírito Santo. O rio São Mateus strictu sensu (IBGE) possui cerca de 50 km, e é
formado pela união dos rios Cotaxé (ao Norte), com cerca de 250 km e Cricaré (ao
Sul), com cerca de 200 km (ANA, 2009). Possui uma série de nuances e impactos
antrópicos, desde desmatamentos, passando por poluição doméstica e industrial,
pesca e introdução de espécies.
Material
A identificação de Pimelodella cf. vittata (fig. 1) ocorreu ao menor nível
taxonômico, com o auxílio do Prof. Dr. Luiz Fernando Duboc. Exemplares
excedentes foram doados para a coleção zoológica do CEUNES/UFES, ainda em
construção.
29
Figura 1: Exemplar adulto do bagre Pimelodella cf. vittata coletado na Bacia do Rio São
Mateus. Barra: 2cm
Métodos
Microscopia de Luz
Fragmentos de pele de P. cf. vittata, com aproximadamente 1cm3, foram
removidos das regiões anterior e posterior dos animais (asteriscos, fig. 1) e fixados
com solução de Bouin durante 24 horas a 4°C. Os fragmentos foram então lavados
em tampão fosfato de sódio 0.1M, pH 7.2, desidratados em série crescente de etanol
por 3 minutos cada banho, diafanizados em xilol, por 30 minutos em cada solução
(xilol I e xilol II) e então incluídos em parafina (paraplast). Após inclusão, as
amostras foram seccionadas na espessura de 7µm em micrótomo rotativo
(Laboratório de Ultraestrutura Celular Carlos Alberto Redins, CCS, UFES) e
montadas sobre lâminas histológicas.
* *
30
Para colorações convencionais, as lâminas foram hidratadas e submetidas ao
método de Hematoxilina/Eosina. Nele, as lâminas foram coradas em Hematoxilina
de Harris por 3 minutos, lavadas em água corrente, coradas em Eosina 2.5% por 4
minutos, foram desidratadas, montadas e fotodocumentadas em microscópio de luz.
Para colorações citoquímicas, as lâminas foram hidratadas e submetidas aos
métodos de Tricrômico de Mallory, Ácido Periódico-Schiff (PAS) e Azul de
Bromofenol.
Para o método Tricrômico de Mallory, para evidenciação do tecido conjuntivo,
as lâminas foram coradas em Hematoxilina de Harris por 3 minutos, lavadas em
água corrente, coradas em Fucsina Ácida aquosa 0.5% por 2 minutos, banhadas em
solução de Azul de Anilina 0.5% – Orange G 2% – Ácido Fosfotúngstico 1% por 20
minutos. Em seguida, foram lavadas em água corrente, desidratadas, montadas e
fotodocumentadas.
Na técnica de PAS, para detecção de glicoproteínas, as lâminas foram
banhadas em Ácido Periódico 1% por 10 minutos, lavadas em água destilada e
mergulhadas em Reativo de Schiff por 20 minutos. Seguiu-se uma nova lavagem em
água de corrente por 10 minutos, coloração em Hematoxilina de Harris por 3
minutos, lavagens em água destilada, desidratação, montagem e fotodocumentação.
Na técnica de Azul de Bromofenol, para detecção de proteínas, as lâminas
foram colocadas diretamente em solução aquosa de Azul de Bromofenol 1% durante
15 minutos. Foram então lavadas em ácido acético 0.5%, desidratadas, montadas e
fotodocumentadas. O processamento das colorações convencional e citoquímicas
foram realizados no Laboratório de Biologia Estrutural, CEUNES, UFES.
31
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Fragmentos de pele de P. cf. vittata, com aproximadamente 1mm3, foram
removidos das regiões anterior e posterior dos animais. Os tecidos foram fixados
com solução Karnovsky (glutaraldeído 2.5%, paraformaldeído 4% em tampão fosfato
de sódio 0.1M, pH 7.2) durante 24 horas a 4°C. O material foi lavado no mesmo
tampão durante 2 horas, pós-fixado com Tetróxido de Ósmio 1% em tampão fosfato
de sódio, pH 7.2, durante 2 horas, a 4°C, desidratado em série crescente de
acetona, infiltrado por 4 dias e incluído em resina Epoxi. Os materiais incluídos
foram seccionados em micrótomo para identificação da área de interesse, e em
ultramicrótomo, onde foram coletados em telas de cobre (Laboratório de Microscopia
Eletrônica, Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, IB, UNICAMP). Os
cortes ultrafinos foram contrastados em soluções de Acetato de Uranila e Citrato de
Chumbo, observados e fotodocumentados em microscópio eletrônico de
transmissão (Centro de Microscopia Eletrônica, IB, UNICAMP).
Microscopia Eletrônica de Varredura
Fragmentos de pele de P. cf. vittata, com aproximadamente 1cm3, foram
fixados com solução Karnovsky (glutaraldeído 2.5%, paraformaldeído 4% em
tampão fosfato de sódio 0.1M, pH 7.2) durante dias a 4°C. O material foi lavado no
mesmo tampão durante 2 horas e seguiram-se banhos em soluções crescentes de
sacarose (0.5M; 1M; 1.5M; 2M; 2.5M e 3M) por 24 horas em cada solução a 4°C. Os
fragmentos foram congelados em nitrogênio líquido e fraturados com o auxílio de um
estilete. Tais fragmentos foram lavados em tampão fosfato de sódio 0.1M, pH 7.2,
32
por 30 minutos, pós-fixados em uma solução de Tetróxido de Ósmio 1% em tampão
fosfato de sódio 0.1M, pH 7.2 por 2 horas e desidratados em série crescente de
etanol. Em seguida, as amostras foram submetidas à secagem ao ponto crítico,
montadas sobre suportes de alumínio, recobertas com ouro/paládio, observadas e
fotodocumentadas em microscópio eletrônico de varredura (Centro de Microscopia
Eletrônica, IB, UNICAMP).
Para as análises morfométricas, as micrografias foram analisadas usando-se
as ferramentas de medidas do software de imagem Adobe Photoshop. A contagem
celular foi feita por observação e os dados morfométricos referentes à área celular
foram obtidos medindo comprimento x largura, e as medidas foram calibradas em
lâmina micrometrada.
33
RESULTADOS
34
A pele de Pimelodella cf. vittata é composta por um epitélio estratificado apoiado em
uma densa camada de tecido conjuntivo e abaixo deste tecido conjuntivo encontra-
se um vasto tecido muscular (figs. 2A-B, 3A-B).
O epitélio, quando analisado ao microscópio de luz, é composto por dois tipos
celulares morfologicamente distintos: as células epidérmicas e células claviformes
(fig. 2B). As células epidérmicas são pequenas, com diâmetro médio de 40µm,
quando comparadas as conspícuas células claviformes que possuem em média
480µm de tamanho. Esses dois tipos celulares formam um epitélio estratificado
heterogêneo, composto assim por pequenas células achatadas e grandes células
globulares (fig. 2B). O número de camadas varia em função da heterogeneidade e
disposição dos tipos celulares, apresentando em geral, duas camadas de células
claviformes e células epidérmicas dispostas entre elas (figs. 2B, 3A).
As células epidérmicas apresentam formato irregular achatado, núcleo denso
e discreto citoplasma. Ocorrem distribuídas por todo o epitélio, entre as células
claviformes, mas são preferencialmente observadas nas regiões apicais, delimitando
a superfície do epitélio (fig. 2B). O número de células epidérmicas é maior que o de
células claviformes, mas devido às dimensões das últimas, estas ocupam um
volume muito maior no tecido (fig. 3).
Quando analisadas ao microscópio eletrônico de transmissão, é possível
identificar que as células epidérmicas apresentam três morfologias distintas (figs. 4,
5). As células epidérmicas „superficiais‟ são achatadas, presentes na superfície do
epitélio e apresentam citoplasma elétron lúcido e núcleo pouco compactado (figs.
4A-B, 5A). As células epidérmicas „abundantes‟ são achatadas, distribuídas por todo
o epitélio e apresentam citoplasma denso e núcleo com regiões de cromatina
condensada (figs. 4, 5). As células epidérmicas „densas‟ são arredondadas,
35
distribuídas por todo o epitélio, mas em baixa quantidade, apresentam citoplasma
denso e núcleo globular com regiões de cromatina condensada (figs. 4C, 5).
Tanto em microscopia de luz quanto em microscopia eletrônica, não foram
observadas células de muco.
As células claviformes se dispõem, geralmente, em duas camadas,
constituindo a maior extensão do epitélio. São encontradas preferencialmente na
região mediana entre as células epidérmicas „superficiais‟ e a camada basal de
células epidérmicas „abundantes‟, raramente chegando à superfície apical (fig. 2B).
Apresentam formatos globulares e alongados (figs. 5, 6). O núcleo encontra-se
sempre central e possui, em média, 0.5 µm² de diâmetro (figs. 5, 6, 7A). São
encontrados dois núcleos por célula, muito próximos um do outro, de formato
irregular, com cromatina pouco condensada, mas com regiões periféricas de
compactação e, nucléolo evidente (fig. 7B-E).
O citoplasma das células claviformes é bastante pobre em organelas e rico
em secreção não vesicular (fig. 6B-C). As poucas organelas observadas (retículo
endoplasmático, complexos de Golgi, polirribossomos e mitocôndrias) estão
localizadas na região perinuclear (fig. 8A-E), enquanto o restante do citoplasma é
repleto de uma substância filamentosa (fig. 8F). O conteúdo citoplasmático pode
assim ser diferenciado em duas regiões: uma discreta e elétron lúcida, ao redor do
núcleo, e outra abundante e elétron densa, que ocupa quase a totalidade do volume
citoplasmático (figs. 7A -C, 8A). Ocasionalmente, grandes vacúolos são visualizados
na periferia citoplasmática (fig. 7A). A membrana plasmática, por toda sua extensão,
apresenta invaginações, tornando a superfície celular bastante irregular e associada
às células epidérmicas (figs. 6C, 7C).
36
Quanto à composição química do citoplasma das células claviformes, ou seja,
da secreção produzida e armazenada, foram feitas duas colorações histológicas
especiais. A técnica de PAS, para detecção de glicoproteínas, apresentou reação
negativa (fig. 10A), enquanto a técnica de Azul de Bromofenol, para detecção de
proteínas, apresentou reação positiva (fig. 10B).
Abaixo do epitélio, encontra-se uma camada de tecido conjuntivo frouxo com
fibroblastos e melanóforos associados (figs. 5B, 9A). Abaixo do tecido conjuntivo
frouxo, encontra-se uma espessa camada de tecido conjuntivo denso com
espessura média de 65µm, com fibroblastos aprisionados em fibras de colágeno
altamente orientadas (fig. 9C, D) e evidenciadas em azul pela técnica de Tricrômico
de Mallory (fig. 10C). Da mesma forma, segue abaixo da derme, camadas, também
espessas, de tecido muscular estriado esquelético (fig. 9D), evidenciado em
vermelho/marrom pela técnica de Tricrômico de Mallory (fig. 10C).
37
ILUSTRAÇÕES
38
39
Figura 2: Microscopia de luz (HE). (A) Pele de Pimelodella cf. vittata organizada em
um tecido epitelial (TE) apoiado no tecido conjuntivo denso (TC) e tecido muscular
estriado esquelético (TM). (B) Tecido epitelial estratificado composto por células
claviformes (CC) e células epidérmicas (CE). Barra: 25µm (A) e 15µm (B).
40
41
Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura. Pele de Pimelodella cf. vittata sob
criofratura. CC: células claviformes, CE: células epidérmicas, TC: tecido conjuntivo,
TM: tecido muscular estriado esquelético. Barra: 20µm (A, B); 10µm (C).
42
43
Figura 4: Microscopia eletrônica de transmissão. Células constituintes do epitélio de
Pimelodella cf. vittata com ênfase nas células epidérmicas. Células claviformes (CC),
células epidérmicas superficiais (CES), células epidérmicas densas (CED) e células
epidérmicas abundantes (CEA). Barra: 10µm (A); 5µm (B, C).
44
45
Figura 5: Microscopia eletrônica de transmissão. Células constituintes do epitélio de
Pimelodella cf. vittata com ênfase nas células claviformes: Células claviformes (CC),
células epidérmicas superficiais (CES), células epidérmicas densas (CED) e células
epidérmicas abundantes (CEA). TC: tecido conjuntivo, MF: melanóforo. Barra: 10µm
(A, B).
46
47
Figura 6: Epitélio de Pimelodella cf. vittata destacando as células claviformes
através de três microscopias distintas: microscopia de luz (HE) (A), microscopia
eletrônica de varredura (B) e transmissão (C). Em (C) presença das células
epidérmicas (CE) e notar as projeções e invaginações (setas) das células
claviformes (CC). N: núcleo, TC: tecido conjuntivo. Barra: 24µm (A); 10µm (B); 5µm
(C).
48
49
Figura 7: Microscopia eletrônica de transmissão. Morfologia das células claviformes
(CC). Presença de dois núcleos (N) por célula e nucléolo evidente (Nu). Ao redor do
núcleo, citoplasma elétron lúcido composto de mitocôndrias (mi). Notar presença de
polirribossomos (pr) e complexo de Golgi (cg) nesta região perinuclear. Em (A) e (C),
invaginações e projeções (setas) das células claviformes. CEA: célula epidérmica
abundante, CED: célula epidérmica densa, VA: vacúolo, TC: tecido conjuntivo.
Barra: 0,5µm (A); 1µm (D); 2µm (B, C, E).
50
51
Figura 8: Microscopia eletrônica de transmissão. Morfologia das células claviformes.
Detalhe da região mostrando mitocôndrias (mi), polirribossomos (pr) e complexo de
Golgi (cg). Em (F), citoplasma filamentoso (CF), com secreção não vesicular. N:
núcleo. Barra: 0,2µm (F); 0,5µm (A, D, E); 1µm (C); 2µm (B).
52
53
Figura 9: Microscopia eletrônica de transmissão. Detalhe dos tecidos subjacentes
ao epitélio (TE). (A) Lâmina basal composta por matriz extracelular (ME) e
fibroblastos (FB). Notar a presença de melanóforo (MF). (B, C) Tecido conjuntivo
denso composto por fibroblastos aprisionados em ordenadas fibras de colágeno. (D)
Tecido muscular estriado esquelético (TM). Barra: 0,1µm (D); 2µm (A, B, C).
54
55
Figura 10: Microscopia de luz. (A) Método de PAS; (B) Método de Azul de
Bromofenol; (C) Método de Tricrômico de Mallory. Células epidérmicas (CE), células
claviformes (CC), tecido conjuntivo (TC), tecido muscular estriado esquelético (TM).
Barra = 15µm.
56
DISCUSSÃO
57
O tegumento de Pimelodella cf. vittata apresentou um epitélio estratificado
heterogêneo composto por três tipos de células epidérmicas – „abundantes‟,
„superficiais‟ e „densas‟ – e ainda células claviformes. As células epidérmicas
„abundantes‟ são as mais comuns; as „superficiais‟ ocorrem na porção apical e as
„densas‟ possuem citoplasma e núcleo fortemente contrastados. As células
claviformes são volumosas, geralmente binucleadas com núcleos centrais e
citoplasma dividido em duas regiões distintas - uma perinuclear elétron lúcida com
organelas e outra elétron densa rica em material fibrilar. Seu citoplasma apresentou
reação negativa ao PAS e positiva ao Azul de Bromofenol. Subjacente ao epitélio,
separado pela lâmina basal, encontra-se a derme composta por tecido conjuntivo
frouxo, seguido de uma camada de tecido conjuntivo denso e tecido muscular
estriado esquelético.
No presente trabalho, foram analisados fragmentos de pele de duas regiões
corpóreas distintas: anterior e posterior. Entretanto, as análises morfológicas
revelaram que não existem diferenças quanto à ocorrência, densidade ou morfologia
das células claviformes nestas porções distintas.
O epitélio de P. cf. vittata, assim como em todas as espécies de Ostariophysi
estudadas, é organizado de forma estratificada e heterogênea. Entretanto, o número
de camadas e a espessura do epitélio, é bastante variada entre as espécies de
peixes. Em geral, encontra-se um epitélio estraficado com diversas camadas como
em alguns Siluriformes (GUERRA et al., 2006; LIZARAZO et al., 2008; WISENDEN
et al., 2008; AL-BANAW et al., 2009; PARK et al., 2010) em Characiformes (PARK
et al., 2003) e em não-ostariofiso como os Aguiliformes - Conger myriaster
(NAKAMURA et al., 2001) ao contrário de P. cf. vittata que apresenta somente uma
ou duas camadas de células claviformes ladeadas por pequenas células
58
epidérmicas. Essas células estão localizadas na região mediana do epitélio, não
atingindo a superfície. Tal localização está de acordo com o encontrado na literatura,
onde parece não existir diferenças na distribuição dessas células na epiderme de
Siluriformes de espécies marinhas e de água doce. Em Siluriformes ariideos
(SMITH, 2000; AL-BANAW et al., 2009), ictalurideos (CHAPMAN & JOHNSON,
1997), bagrideos (PARK et al., 2010), assim como no heptapterideo P. cf. vittata, as
células claviformes estão localizadas na região média do epitélio estratificado.
A presença de dois tipos celulares distintos na epiderme de P. cf. vittata -
epidérmicas e claviformes - é diferente daquela encontrada em Siluriformes que
tiveram sua estrutura epitelial descrita (YOAKIM & GRIZZLE, 1982; PFEIFFER et al.,
1985; PARK et al., 2003; GUERRA et al., 2006; LIZARAZO et al., 2008; AL-BANAW
et al., 2009; PARK et al., 2010) e em Cypriniformes (PFEIFFER et al., 1985;
HALBGEWACHS et al., 2009; STABELL & VEGUSDAL, 2010).
A grande diferença se deve à ausência de células de muco em P. cf. vittata,
observada em todas as demais espécies e distribuídas abundantemente pelo
epitélio. Em geral, as células de muco são caracterizadas por sua grande dimensão,
semelhante às células claviformes, citoplasma repleto de vesículas de secreção,
localização apical e presença de poros na membrana plasmática, por onde o muco é
secretado.
A ausência de células de muco em P. cf. vittata, pode estar relacionada a
fatores internos (hormonais). PFEIFFER et al., (1985), estudando os efeitos de
esteróides na epiderme de Phoxinus phoxinus (Cypriniformes), verificou que existe
uma estreita relação entre a ação de esteróides e a quantidade de células de muco
e células claviformes. Adicionalmente, fatores externos (ambientais) podem também
influenciar a composição da epiderme de P. cf. vittata.
59
Além das células de muco, em algumas espécies de Siluriformes
Callichthydeos (HENRIKSON & MATOLTSY, 1968) e na lampreia Ichthynyzon
unicuspis (DOWNING & NOVALES, 1971), podem ser observadas células globulares
granulares. Esse tipo celular, assim como as células claviformes, são bastante
volumosas, aparentemente liberam material citoplasmático na superfície da
epiderme (HENRIKSON & MATOLTSY, 1968) e também não foram observadas em
P. cf. vittata.
As células epidérmicas encontradas em P. cf. vittata e classificadas como
„abundantes‟, „superficiais‟ e „densas‟ ainda não haviam sido descritas em outras
espécies, onde somente eram denominadas de células epidérmicas. Entretanto,
observando as micrografias publicadas por DOWNING & NOVALES (1971), é
possível identificar tipos celulares distintos entre as células epidérmicas, os quais
não foram descritos. A grande maioria dos trabalhos envolvendo ultraestrutura de
epiderme de peixe (HENRIKSON & MATOLTSY, 1968; DOWNING & NOVALES,
1971; PFEIFFER et al., 1971; YOAKIM & GRIZZLE, 1982; PETERS et al., 1990)
apresentam micrografias com grandes aumentos o que em geral dificulta a
identificação desses tipos celulares.
Com relação às células claviformes em Ostariophysi, a característica mais
marcante desse tipo celular é sua dimensão, sendo facilmente identificado em
microscopia de luz. Apesar de serem consideradas células claviformes, ou seja, em
formato de clava, em P. cf. vittata elas apresentam formato irregular, variando entre
o globular e o alongado. Existe, de fato, uma variação morfológica nesse tipo celular.
Em Phoxinus laevis (Cypriniformes) (PFEIFFER, 1960) ela é considerada claviforme;
em Astyanax mexicanus (Characiformes) (PETERS et al., 1990) ela é descrita como
ovalada; nos Siluriformes há uma variação entre o globular e o alongado, no ariideo
60
Arius tenuispinis (AL-BANAW et al., 2009) é descrita como alongada, já em Arius
felis (SMITH, 2000) é globular, no bagrideo Pseudobagrus brevicorpus (PARK et al.,
2010), esse tipo celular varia entre o globular e o alongado, sendo alongadas para
os clariideos Clarias gariepinus (GUERRA et al., 2006) e Clarias batrachus (MITTAL
& GARG, 1994) e globular para o ictalurideo Ictalurus punctatus (CHAPMAN &
JOHNSON, 1997).
A morfologia das células claviformes em P. cf. vittata é bastante semelhante
ao descrito para outros Siluriformes, devido a sua grande dimensão, localização
central, serem binucleadas e terem reação negativa ao método de PAS (YOAKIM &
GRIZZLE, 1982; CHAPMAN & JOHNSON, 1997; GUERRA et al., 2006; AL-BANAW
et al., 2009) e em Cypriniformes (HALBGEWACHS et al., 2009; STABELL &
VEGUSDAL, 2010). A morfologia nuclear dessas células em P. cf. vittata, está de
acordo com o encontrado em outros Siluriformes (PFEIFFER, 1970; YOAKIM &
GRIZZLE, 1982; MITTAL & GARG, 1994; PARK et al., 2003; AL-BANAW et al.,
2009; PARK et al., 2010) e em Cypriniformes (STABELL & VEGUSDAL, 2010;
HALBGEWACHS et al., 2009) e em não-ostariofiso, como lampreias da espécie
Ichthyomyzon unicuspis (DOWNING & NOVALES, 1971) descrito como central,
formato irregular, com cromatina condensada na periferia, nucléolo evidente. Outra
característica comum às células claviformes dos Siluriformes é que geralmente são
binucleadas, que é um indicativo de serem células com atividade intensa, mas às
vezes, apresentam-se mononucleadas, contudo, em Characiformes como o
Astyanax mexicanus, por exemplo, é geralmente único (PETERS et al., 1990).
O citoplasma das células claviformes em P. cf. vittata é preenchido com
material fibrilar homogeneamente disperso, semelhante ao descrito em outros
Siluriformes como o callichthyideo Corydoras aeneus, (HENRIKSON & MATOLTSY,
61
1968), e no ictalurideo Ictalurus punctatus (YOAKIM & GRIZZLE, 1982) e em
Cypriniformes como Carassius auratus, Phoxinus phoxinus e Morulius
chrysophakedion (HENRIKSON & MATOLTSY, 1968; PFEIFFER et al., 1971).
Entretanto em grupos de peixes não-ostariofiso como na enguia Anguilla sp, o
citoplasma não revelou material fibrilar e sim filamentos em espiral organizados em
feixes deitados em vários planos (HENRIKSON & MATOLTSY, 1968). Da mesma
forma, na lampreia Ichthyomyzon unicuspis também foram descrito feixes de
filamentos (DOWING & NOVALES, 1971). A presença desse material fibrilar
citoplasmático, espiral ou disperso, é uma característica marcante nas células
claviformes dos Ostariophysi e parece representar a substância de alarme que
causa a reação de alarme, típica desse grupo de peixes. Na região periférica do
citoplasma das células claviformes, próxima à membrana plasmática, grandes
vacúolos foram visualizados em P. cf. vittata, assim como observado em Siluriformes
ictalurideo Ictalurus punctatus (YOAKIM & GRIZZLE, 1982) e no ariideo Arius felis
(SMITH, 2000), e em não-ostariofiso como em enguias (WHITEAR & ZACCONE,
1984). Diante do exposto, sugere-se que os vacúolos são estruturas tipicas de
células claviformes.
Na região perinuclear, diferente do restante do citoplasma fibrilar, encontram-
se as organelas das células de substância de alarme: retículo endoplasmático
rugoso, complexo de Golgi, ribossomos livres e agregados sob forma de
polirribossomos, mitocôndrias e lisossomos. Tal composição e organização
citoplasmática são observadas na grande maioria das espécies de Siluriformes e
Cypriniformes estudadas (HENRIKSON & MATOLTSY, 1968; PFEIFFER et al.,
1971; YOAKIM & GRIZZLE, 1982), incluindo P. cf. vittata. Ainda na região
perinuclear, HENRIKSON e MATOLTSY (1968) descreveram uma estrutura
62
incomum nesta região das células claviformes de Siluriformes como Corydoras
aeneus. Nela, ocorre agregação de vesículas de superfície lisa, com vesículas
concentricamente dispostas em torno de uma área ovóide central. A área central
apresenta-se fibrilar e, ocasionalmente, encontra-se vesículas em colapso. A
estrutura citoplasmática encontrada em Corydoras aeneus não foi observado em
Siluriformes como o ictalurideo Ictalurus punctatus (YOAKIM & GRIZZLE, 1982) e no
heptapterideo do presente estudo o P. cf. vittata e em Cypriniformes como Carassius
auratus (HENRIKSON & MATOLTSY, 1968), Phoxinus phoxinus e Morulius
chrysophakedion (PFEIFFER et al., 1971). Esta estrutura pode estar presente
apenas em certas espécies dos Ostariophysi, indicando uma diferença entre as
células claviformes deste grupo.
O citoplasma das células claviformes em P. cf. vittata apresentou reação
negativa ao método de PAS, indicando a ausência de glicoproteínas em sua
composição, assim como detectado em outros Siluriformes por (YOAKIM &
GRIZZLE, 1982; PARK et al., 2003; GUERRA et al., 2006; LIZARAZO et al., 2008) e
em Cypriniformes (HALBGEWACHS et al., 2009; STABELL & VEGUSDAL, 2010). Já
com o método de Azul de bromofenol, o citoplasma dessas células apresentou
reação positiva, indicando uma composição protéica, conforme também observado
em outros Siluriformes (YOAKIM & GRIZZLE, 1982; AGRAWAL & MITTAL, 1992;
PARK et al., 2003). A detecção de proteína e a não detecção de glicoproteínas,
corrobora com a observação, em P. cf. vittata, de uma grande quantidade de
ribossomos e poliribossomos em comparação com a baixa ocorrência de retículo
endoplasmático rugoso e complexo de Golgi. Sabe-se que os ribossomos livres
sintetizam proteínas, enquanto no retículo endoplasmático rugoso e complexo de
63
Golgi elas são modificadas, entre as modificações, destaca-se a glicosilação
(ALBERTS et al., 2006).
A membrana plasmática das células claviformes de P. cf. vittata, apresentou
notáveis invaginações, diferente do observado por HENRIKSON e MATOLTSY
(1968) no siluriforme Corydoras e no cypriniforme Carassius. Tais invaginações
conferem adesão celular, imprescindível ao epitélio devido às inúmeras pressões e
atritos que sofre.
A derme de P. cf. vittata é bastante semelhante ao encontrado na maioria dos
Siluriformes (DOURADO et al., 1997; GUERRA et al., 2006; AL-BANAW et al.,
2009), em Cypriniformes (HALBGEWACHS et al., 2009; STABELL & VEGUSDAL,
2010) e em Characiformes (SOUZA et al., 2003) estudadas, composta assim, por
uma lâmina basal e uma espessa camada de tecido conjuntivo denso modelado.
Alguns Siluriformes ainda apresentam uma camada de tecido adiposo abaixo do
tecido conjuntivo (PARK et al., 2003; LIZARAZO et al., 2008; GUERRA et al., 2006;
PARK et al., 2010) não encontrado no presente trabalho.
Apesar dos inúmeros trabalhos existentes na literatura sobre células
claviformes (e/ou células de substância de alarme) em peixe, a maioria refere-se à
relação entre as células e sua função, refletindo em estudos ecológicos e
comportamentais. Nos últimos anos, muitos trabalhos em citoquímica e
imunocitoquímica vêm surgindo na tentativa de elucidar a composição química da
secreção dessas células e com isso discutir suas prováveis funções. O presente
trabalho teve por objetivo descrever a morfologia da epiderme de um Siluriforme
sem se preocupar com aspectos funcionais. Poucos são os trabalhos existentes na
literatura no que se refere à microscopia eletrônica. Assim, o presente estudo
representa uma referência em ultraestrutura de epiderme de peixes Siluriformes.
64
Além disso, os poucos trabalhos existentes, apresentam micrografias com grandes
aumentos, não permitindo o estudo da organização e composição da epiderme.
Assim, devido às diferenças encontradas entre os estudos morfológicos e
citoquímicos/imunocitoquímicos na epiderme das espécies de peixe estudadas, faz-
se necessário mais análises, principalmente em microscopia eletrônica, na tentativa
de uma caracterização mais precisa dos componentes da epiderme em Ostariophysi
65
CONCLUSÕES
66
1 - A epiderme de Pimelodella cf. vitatta apresenta somente dois distintos tipos
celulares: as células epidérmicas e células claviformes, diferente do descrito
para os Ostariophysi;
2 - Não foram observadas células de muco P. cf. vittata, diferente do relatado na
epiderme de todos os Ostariophysi. Essas células podem estar presentes na
espécie estudada, porém fatores intrínsecos e extrínsecos podem ter
influenciado em sua ocorrência ou morfologia;
3 - A carência de estudos ao longo da Bacia do Rio Mateus torna complicado
inferências ambientais em relação à morfologia descrita. Assim, esta região
necessita de análises ecológicas/comportamentais/fisicoquímicas no sentido de
complementar/corroborar as análises morfológicas;
4 - As células epidérmicas de P. cf. vittata foram morfologicamente identificadas
como “superficiais”, “abundantes” e “densas”, distinção não descrita na literatura.
É possível que esses tipos celulares estejam presentes em outras espécies,
contudo, suas descrições até então não foram realizadas;
5 - A morfologia das células claviformes é semelhante àquela encontrada nos
demais Ostariophysi: (1) grandes células de formato globular a alongado; (2)
binucleadas, (3) citoplasma filamentoso; (4) poucas organelas localizadas na
região perinuclear; (5) ausência de secreção vesicular e (6) vacúolos periféricos;
6 - O citoplasma das células claviformes apresentou reação negativa ao PAS e
positiva ao Azul de Bromofenol, corroborando o encontrado em outras espécies
de Ostariophysi;
7 - Apesar de o conteúdo protéico parecer padrão entre as espécies, o citoplasma
das células claviformes é composto por um complexo protéico de origem ainda
67
desconhecida, mas função aparentemente definida. Assim, são necessários
estudos morfológicos e comportamentais em conjunto;
8 - Novos estudos precisam ser realizados no sentido de compreender melhor a
composição da epiderme dos Ostariophysi uma vez que as descrições
morfológicas, em suas diversas técnicas, têm mostrado muitas variações
principalmente no que se refere às células epidérmicas;
9 - A derme de P. cf. vittata apresentou organização e composição semelhante ao
descrito para os Ostariophysi: (1) epitélio apoiado em uma fina lâmina basal; (2)
presença de melanóforos e (3) espessa camada de tecido conjuntivo denso
subjacente;
10 - Futuros estudos morfológicos em P. cf. vittata serão realizados visando
elaboradas análises citoquímicas nas células claviformes e aprofundadas
análises ultraestruturais com ênfase nas células epidérmicas e prováveis células
de muco.
11 - O presente estudo representa uma referência na ultraestrutura de epiderme de
peixes Siluriformes, dado o detalhamento morfológico apresentado.
68
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