Madalena Martins Sant’Ana Barroso

Caracterização ultraestrutural e da textura do

polímero de laminina obtido em tampão

ácido e seu uso terapêutico em lesões

raquimedulares

Rio de Janeiro

2008

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Ciências Biomédicas

Departamento de Histologia e Embriologia

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Madalena Martins Sant’Ana Barroso

Caracterização ultraestrutural e da textura do

polímero de laminina obtido em tampão

ácido e seu uso terapêutico em lesões

raquimedulares

Orientadora: Tatiana Lobo Coelho de Sampaio

Rio de Janeiro

2008

Tese de doutorado apresentada ao Programa

de Ciências Morfológicas do Instituto de

Ciências Biomédicas, Centro de Ciências da

Saúde, Universidade Federal do Rio de

Janeiro, como pré-requisito à obtenção do

título de doutor em Ciências Morfológicas.

Ficha Catalográfica

Barroso, Madalena Martins Sant’Ana

Caracterização ultraestrutural e da textura do polímero de laminina obtido em tampão ácido e seu uso terapêutico em lesões raquimedulares/ Madalena M. S. Barroso. - 2008.

112 p. Tese (doutorado em Ciências Morfológicas) - Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas, Rio de Janeiro, 2008. Orientador: Tatiana Lobo Coelho de Sampaio 1. Laminina. 2. Polimerização. 3. Geometria. 4.Neuritogênese. 5.Lesões Raquimedulares. - Teses I. Coelho-Sampaio, Tatiana Lobo (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Programa de Ciências Morfológicas III. Título

Banca Examinadora

Dr. Alexandre Malta Rossi

(CBPF/ UFRJ)

Dr. Jorge Marcondes de Souza

(HUCFF/ UFRJ)

Dr. Marcos Farina de Souza

(PCM/ UFRJ)

Suplentes

Dra. Cecília Heidin Pereira

(PCM/ UFRJ)

Dra. Gabriela de O. Paiva e Silva

(IBqM/ UFRJ)

Orientadora

Tatiana Lobo Coelho de Sampaio

(PCM/ UFRJ)

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia da Matriz Extracelular no

Departamento de Histologia e Embriologia do Instituto de Ciências Biomédicas

da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob orientação da Professora

Tatiana Lobo Coelho de Sampaio e colaboração do Professor Leonardo Andrade

ambos deste departamento. O projeto contou com o auxílio financeiro do

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da

Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB/UFRJ). A aluna recebeu bolsa de

doutorado do CNPq e bolsa de doutorado sanduíche fornecida pela

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal em Nível Superior (CAPES).

A meus pais,

Lourdes e Wagner, por

todo o apoio.

Agradecimentos

Agradeço a todos que de

alguma forma me ajudaram

nesta conquista.

Em especial, minha família,

minha orientadora, meus colaboradores,

meus amigos e colegas de laboratório.

"The Master in the art of living makes little distinction between his work and his

play, his labor and his leisure, his mind and his body, his education and his

recreation, his love and his religion. He hardly knows which is which. He simply

pursues his vision of excellence in whatever he does, leaving others to decide

whether he is working or playing. To him he is always doing both."

- Zen Buddhist text

Resumo

A laminina (LM) é uma proteína da matriz extracelular que se auto-

polimeriza. Anteriormente mostramos que a acidificação do meio acelera a

polimerização e que neurônios cultivados sobre polímeros ácidos exibem

expressivo aumento da neuritogênese. Aqui estudamos a estrutura dos

polímeros ácidos de LM por microscopia eletrônica, de força atômica e

confocal para demonstrar sua correspondência com a lâmina basal

produzida naturalmente. A reconstrução das superfícies formadas pelos

polímeros ácido e neutro revelou geometrias de superfície distintas. A

análise da neuritogênese sobre substratos artificiais escolhidos para

mimetizar tais geometrias revelou a existência de uma resposta celular à

topologia da superfície. Para investigar se a LM ácida promoveria

crescimento axonal in vivo, o polímero foi injetado na medula de ratos que

sofreram contusão medular experimental. Foi observada uma melhora na

locomoção dos animais tratados, sugerindo um possível efeito terapêutico

da LM ácida em lesões do sistema nervoso central.

Abstract

Laminin (LM), an extracellular matrix glycoprotein, can self polymerize in a

cell-free system. Our group has previously shown that pH acidification

renders self polymerization independent of protein concentration and that

cortical neurons cultivated over this acidic matrix show increased

neuritogenesis in comparison to what occurs on matrices assembled in

neutral pH. Here we studied the ultrastructure of acid induced LM polymers

using electron and atomic force microscopies and showed that acidic

matrices mimic in vitro the molecular structure of the naturally-assembled

basal lamina. Confocal laser microscopy analyses of the acidic and neutral

polymers revealed that acidic matrices were smoother than the neutral one.

When cortical neurons were cultivated over artificial surfaces, used to

mimic the topologies of both LM matrices, an intense neuritogenesis was

observed on the smooth surface, indicating signaling properties of the

topology recognized by neuron cells. To investigate whether acidic LM

would improve the functional outcome of animals submitted to spinal cord

injury, LM was injected into moderately contused rat spinal cord. Our

results suggest that LM improves functional recovery of the contused rat

spinal cord, suggesting its therapeutic use to treat injuries of the central

nervous system.

Índice

Introdução 1 A molécula da laminina

1.1 Estrutura 12 1.2 Localização 14 1.3 Isoformas 17

2 Polímeros de laminina 2.1 Membrana Basal 19 2.2 Outros polímeros de laminina in vivo 21 2.3 Polímeros de laminina in vitro 22 2.4 Laminina em pH ácido 27

3 Funções da laminina 3.1 Receptores 28 3.2 Papel da laminina

3.2.1 Durante o período embrionário 33 3.2.2 No período pós-natal 33

4 A laminina no Sistema Nervoso Central (SNC) 4.1 Desenvolvimento do SNC 34 4.2 Regeneração do SNC 35 4.3 Lesões do SNC 39

Objetivos 42 Metodologia 43 Resultados

1 Investigação da estrutura supramolecular das matrizes de laminina formadas a partir da polimerização a pH ácido 54

2 Estudo da resposta de células neurais embrionárias à geometria da superfície 66

3 A utilização de laminina ácida como terapia em lesão medular experimental 76

Discussão 85 Conclusão 96 Referências 97 Anexo 112

12

Introdução

Na introdução desta tese, iremos descrever a molécula da laminina, sua

estrutura e função e elencar diversos polímeros de laminina, entre eles o polímero

ácido descrito anteriormente por nosso grupo. Além disso, abordaremos o papel da

laminina no sistema nervoso central e os processos que ocorrem durante a lesão

medular e impedem a regeneração neuronal. Desta forma, será possível

contextualizar os resultados que serão descritos aqui, onde foram investigadas as

características do polímero ácido de laminina e apresentar as análises iniciais da

utilização deste polímero como terapia na lesão medular experimental.

1 A molécula da Laminina

1.1 Estrutura:

A laminina (LM) é uma glicoproteína heterotrimérica formada por três cadeias

polipeptídicas e que possui peso molecular de aproximadamente 800 KDa. As cadeias

que constituem a molécula são conhecidas como α, β e γ, sendo que a cadeia α possui

aproximadamente 400 KDa e as cadeias β e γ apresentam em torno de 200 KDa cada

uma (Timpl, 1989; Luckenbill-Edds, 1997). A estrutura molecular da laminina é

tridimensional e consiste de três braços curtos e um braço longo, sendo que os braços

curtos se posicionam num plano ortogonal em relação ao braço longo (Burgeson et al.,

1994, Aumailley et al., 2005). Este arranjo acontece porque as cadeias individuais se

juntam para formar uma hélice tripla, que constitui o braço longo da molécula (Paulsson

et al., 1987; Miner e Yurchenco, 2004) (Figura 1A).

13

O braço longo da laminina apresenta 77 nm, os braços curtos correspondentes

às cadeias β e γ possuem 34 ± 4 nm cada e o braço curto correspondente à cadeia

α, 48 ± 4 nm (Bruch et al., 1989). Em seus braços curtos, onde se localizam os

terminais amino das três cadeias, as cadeias β e γ apresentam dois domínios

globulares separados por domínios não-globulares. Os domínios não-globulares

contêm em suas seqüências, cisteínas em posições regulares, o que torna estas

seqüências homólogas ao Fator de Crescimento Epidermal (EGF, do inglês

Epidermal Growth Factor) (Engel, 1989). A cadeia α, que é a maior das cadeias,

apresenta três domínios globulares em seu braço curto. Além disso, a cadeia α

apresenta na região carboxi terminal, no final do braço longo, o domínio-G que

possui cinco módulos globulares homólogos conhecidos como domínios LG (Sasaki

et al., 1988; Timpl et al., 2000) (Figura 1B e 1C).

A união das três cadeias é feita através de pontes dissulfeto que se localizam no

braço longo da molécula. Existem três pontes dissulfeto, duas destas pontes estão

localizadas próximas ao vértice da molécula e a outra, próxima aos domínios LG no

final do braço longo (Utani et al., 1994; Aumailley e Krieg, 1996; Malinda e

Kleinman, 1996). No braço longo também estão concentradas as glicosilações.

Foram calculados em torno de 25 a 27% de carboidratos (Knibbs et al., 1989; Dean

III et al., 1990), distribuídos pelas três cadeias da proteína.

14

1.2 Localização:

A laminina é um dos principais componentes da matriz extracelular (MEC) e é

encontrada especificamente em um tipo especializado de matriz extracelular, a

lâmina basal (LB). Na lâmina basal, juntamente com o colágeno tipo IV, a

glicoproteína entactina/nidogênio e os proteoglicanos perlecan, agrina entre outros,

a laminina forma uma rede fina e flexível que possui entre 40 e 120 nm de

espessura (Figura 2). A lâmina basal é encontrada tipicamente sob todos os tecidos

epiteliais, separando-os da camada de tecido conjuntivo subjacente. Além disso,

podemos encontrar lâmina basal ao redor das células musculares, dos adipócitos e

Figura 1. A estrutura molecular da laminina. Esquema extraído de Li et al., 2002 e imagem de sombreamento rotatório extraída de Yurchenco e Schittny, 1990.

A B

C

100nM

15

das células de Schwann. Ela também se localiza entre camadas de células nos

glomérulos renais onde funciona como um filtro molecular (Farquhar, 1981).

Figura 2. A estrutura da lâmina basal. A) A análise por microscopia eletrônica mostra a lâmina basal (BL) entre o conjuntivo (C) e o tecido epitelial (E). Extraído de Alberts et al., 2002.

A lâmina basal possui diversas funções que vão além de ajudar a filtrar o sangue

nos glomérulos renais. Ela pode determinar a polaridade celular, influenciar no

metabolismo da célula, promover sobrevivência, diferenciação e proliferação

celulares e servir como suporte pra migração celular. Estudos mostram também um

papel importante na organização do citoesqueleto e um papel instrutivo tanto no

desenvolvimento embrionário quanto na regeneração tecidual.

16

A arquitetura molecular da lâmina basal consiste de uma rede organizada de

laminina, diretamente ligada às células. Sobre esta rede, existem moléculas de

colágeno tipo IV associadas entre si formando uma outra rede poligonal. A

glicoproteína entactina/nidogênio, se liga, através de seu terminal amino, à região

central da molécula de laminina, e através de seu terminal carboxi, a sítios na

molécula de colágeno IV, conectando desta forma, as duas malhas (Aumailley et al.,

1989; Fox et al., 1991). O colágeno IV também pode se ligar diretamente aos

braços longos e curtos da laminina (Charonis et al., 1985). O proteoglicano

perlecan, através de suas cadeias glicosaminoglicanas, ancora a laminina e o

colágeno em seu dímeros e oligômeros, unindo firmemente as malhas e

estabilizando a lâmina basal (Figura 3).

17

Figura 3. Os componentes da lâmina basal. O modelo mostra a associação dos componentes da lâmina basal entre eles e com a membrana celular. Extraído de Colognato e Yurchenco, 2000.

1.3 Isoformas:

A molécula de laminina pode se apresentar no organismo de diversas formas.

Até hoje foram descritas 16 isoformas diferentes desta proteína (Miner e Yurchenco,

2004) sendo que a primeira delas foi descrita há 26 anos atrás (Timpl et al., 1979).

Estas isoformas diferentes são resultado não só da combinação de diversas

cadeias α, β e γ, como também, uma pequena parte, resultado de “splicing” de RNA

(Tabela 1). Cinco cadeias α, três cadeias β e três cadeias γ já foram identificadas

em mamíferos e cada uma destas subunidades é codificada por um gene diferente.

A laminina 111, formada pela combinação das cadeias α1, β1 e γ1, foi a primeira

Entactina/

Nidogênio

Colágeno IV

Laminina

Distroglican

Integrina

Membrana

Plasmática

18

isoforma identificada, analisada estruturalmente e seqüenciada (Engel et al., 1981;

Sasaki et al., 1987, 1988; Sasaki e Yamada, 1987; Timpl et al., 1979).

Tabela 1. As isoformas da laminina. Cada isoforma possui uma nomenclatura alternativa muito utilizada na literatura que são as abreviações. Extraído de Aumailley et al., 2005.

Todas as lâminas basais possuem laminina, mas é possível encontrar isoformas

diferentes desta proteína em diferentes lâminas no mesmo organismo. Foi

observada uma variação nos níveis de RNAm das cadeias α, β e γ em diferentes

tecidos da mesma espécie, revelando a formação de isoformas tecido-específicas

(Boot-Handford et al., 1987; Kleinman et al., 1987) (Tabela 2). O motivo para essa

diversidade pode ser permitir que cada membrana basal tenha suas diferentes

funções, mas mantendo uma mesma arquitetura molecular (Yurchenco et al., 2004).

Nomenclatura das 16 lamininas

Padrão Abreviada

19

A distribuição destas isoformas de laminina pode variar ao longo do tempo em

alguns tecidos. No glomérulo renal, por exemplo, a expressão das isoformas

apresenta um padrão temporal específico. Em fases iniciais, observa-se a

expressão da cadeia α1. Em fases mais intermediárias, ocorre a expressão de α4 e

em fases maduras, α5 e β2 (Durbeej et al., 1996; Miner et al., 1997; Sorokin et al.,

1997).

Tabela 2. Expressão das cadeias de laminina nos diferentes tecidos. Extraído de Colognato e Yurchenco, 2000.

2 Polímeros de Laminina

2.1 Membrana Basal:

A laminina é a primeira proteína a ser depositada durante a embriogênese na

membrana basal (termo usado para designar o conjunto de lâmina basal e fibrilas

de colágeno) (Beck e col, 1990). Uma vez secretada, a laminina se liga à superfície

20

celular através de seu braço longo e se auto-polimeriza utilizando os braços curtos

e formando uma malha inicial de ancoramento (Yurchenco et al., 1994). Este

polímero1 de laminina é importante para a integração subseqüente dos outros

componentes da membrana basal. Por este motivo, as membranas basais não são

formadas na ausência de laminina, mesmo que estejam presentes nidogênio,

colágeno tipo IV e perlecan (Li e cols, 2002, Murray e Edgar, 2000).

Polímeros de laminina foram observados na membrana basal do tumor

murino EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) e também em células cultivadas de

carcinoma embrionário (ECC). O tumor EHS caracteriza-se por sintetizar e secretar

grandes quantidades de componentes da membrana basal, principalmente laminina

e colágeno IV (Kleinman et al., 1982). Já o carcinoma ECC, secreta uma matriz rica

em laminina, mas sem colágeno IV (Brauer e Keller, 1989). A laminina polimerizada

nestas matrizes se mostrou uma malha regular e homogênea, semelhante a uma

colméia, com filamentos interligados (Figura 4A). Estes filamentos, chamados de

“struts”, apresentaram medidas em torno de 31±8nm (Yurchenco et al., 1992). O

tamanho destes filamentos e o fato de que eles se encontram em cada vértice com

mais outros dois filamentos é compatível com um modelo no qual cada braço curto

interage com mais dois braços curtos formando polígonos (Yurchenco e Cheng,

1993) (Figura 4B).

Com o objetivo de dissociar as membranas basais destes tumores, foram

utilizados fragmentos proteolíticos da molécula de laminina. Os fragmentos que

1 O termo polímero será aplicado nesta tese para definir um complexo multi-molecular formado por várias

moléculas do trímero de laminina

21

correspondem aos braços curtos da proteína promoveram uma dissociação

acentuada das matrizes, indicando que esta parte da proteína está fortemente

envolvida na polimerização da laminina (Yurchenco et al., 1992).

Figura 4. A estrutura da membrana basal do tumor murino EHS e modelo da polimerização da laminina. Em A, imagem obtida através de freeze-etching extraída de Yurchenco et al., 1992 e em B, modelo da polimerização da laminina extraído de Yurchenco e Cheng, 1993.

2.2 Outros Polímeros de laminina in vivo:

Já foram descritos outros polímeros de laminina in vivo, o que indica que

possam existir tipos diferentes de matrizes naturais desta proteína. Assim,

dependendo da região observada, a organização estrutural da matriz de laminina in

vivo pode variar. Em montagens planas de retina em desenvolvimento obtidas de

ratos recém-nascidos, a laminina foi observada através de imunomarcação e se

mostrou desorganizada na parte mais central e mais plana e organizada na periferia

(Freire et al., 2002) (Figura 5). Zhou, em 1990, descreveu quatro tipos diferentes de

A

B

50nm

22

organização da laminina no cérebro em desenvolvimento. Estes padrões de

organização apresentaram uma distribuição temporal, indicando funções diferentes

ao longo do desenvolvimento. Outras análises demonstraram também que as

matrizes de laminina produzidas em cultura por astrócitos isoldados de diferentes

regiões do cérebro (Garcia et al., 1995 a,b) ou de diferentes idades embrionárias

(Freire et al., 2004) apresentam estruturas distintas. Estas estruturas distintas estão

associadas a capacidades variadas de indução de crescimento neurítico.

Figura 5. Morfologia da laminina observada em montagem plana de retina. Em F, a laminina com organização regular presente na região periférica da retina e em G, a laminina depositada na região central da retina de forma desorganizada. Barra, 100 µm. Extraído de Freire et al., 2002.

2.3 Polímeros de laminina in vitro:

A laminina possui a capacidade de se auto-polimerizar in vitro sem a

presença dos outros componentes da membrana basal. Esta polimerização foi

descrita por Yurchenco e colaboradores, em 1985, como dependente de

temperatura (35ºC), dependente de uma concentração mínima de proteína (60 nM)

23

e também da presença de cálcio. Este processo de polimerização possui duas

etapas: na primeira etapa, a temperatura induz a formação de pequenos

agregados2 de laminina. Na segunda etapa, o cálcio se liga a região amino terminal

da cadeia β e provoca mudanças conformacionais na molécula (Yurchenco e

Cheng, 1993), gerando com isso agregados maiores.

Diversas análises demonstram que a formação do polímero da laminina

envolve somente a participação dos braços curtos da molécula. Deste modo,

enquanto as extremidades amino terminal das três cadeias se ligam umas às

outras, o braço longo estabelece as ligações com a membrana da célula (McKee e

Yurchenco, 2007; Yurchenco et al., 2004, Colognato e Yurchenco, 2000; Yurchenco

e Cheng, 1993 e Beck, 1990). Entretanto, alguns trabalhos (inclusive do mesmo

grupo) relatam a possibilidade de participação do braço longo na formação do

polímero (Yurchenco et al., 1985; Yurchenco et al., 1990; Charonis et al., 1986 e

Yurchenco et al., 1992) o que revela a complexidade do estudo do processo de

polimerização da laminina.

Em imagens realizadas através de microscopia eletrônica, utilizando a

técnica do sombreamento rotatório, foram observados dímeros de laminina onde

são claramente visíveis ligações estabelecidas entre os braços longos da molécula

(Figura 6). Nestas imagens, os braços longos não só, conectam-se entre si, mas

também aparecem ligados aos braços curtos (Yurchenco et al., 1985; Schittny e

Yurchenco, 1990; Yurchenco 1992).

2 Apesar de este termo ser usado para indicar complexos multimoleculares formados a partir da perda terciária

(desnaturação), nesta tese, a palavra será utilizada no sentido canônico de complexos multimoleculares, ou seja,

como um sinônimo de polímeros.

24

Figura 6. Dímeros de laminina. Observação através de sombreamento rotatório das moléculas de laminina ligadas através de seus braços longos. Barra, 100 nm. Extraído de Yurchenco et al., 1985.

Acreditando que as interações entre as moléculas de laminina e a superfície

celular são importantes para a correta arquitetura da matriz, Kalb e Engel, em 1991,

polimerizaram a laminina na presença de bicamadas lipídicas artificiais compostas

de sulfatídeos. Verificaram que a concentração crítica necessária para polimerizar a

laminina sobre estas superfícies era muito menor (10 nM) que para agregá-la em

solução (50-150 nM). Este trabalho sugeriu que os carboidratos sulfatados

carregados negativamente na superfície da membrana poderiam ser críticos não só

para promover a ligação desta proteína com a membrana como para polimerizar a

matriz de laminina. É importante chamar a atenção para o fato de que nessa época

25

já se sabia que os sulfatídeos ligavam-se especificamente com o braço longo da

lamina, funcionando como um verdadeiro receptor (ver adiante).

Em 2000, nosso grupo demonstrou que era possível tornar a polimerização

da laminina independente da concentração de proteína bastando pra isso que fosse

promovida uma acidificação do pH do meio como um todo ou apenas na região do

microdomínio de interface com a membrana pela adição da sulfatídeos ácidos

(Freire e Coelho-Sampaio, 2000). A organização estrutural desta matriz de laminina

produzida em pH ácido (pH 4,0), observada através de imunomarcação, se mostrou

plana, homogênea e com aspecto de colméia, compatível com a organização da

laminina produzida in vivo durante o desenvolvimento da retina. Já a matriz

produzida em pH neutro (pH 7,0) apresentou uma morfologia irregular de agregados

desorganizados (Freire et al., 2002) (Figura 7).

Figura 7. Matrizes artificiais de lamina formadas em pH 7,0 (A) e pH 4,0 (B). Em A, a matriz com agregados desorganizados formada pela laminina diluída em pH neutro e em B, a matriz regular e plana formada por laminina diluída em pH ácido. Barra, 50 µm. Extraído de Freire et al., 2002.

A B

26

Polímeros artificiais de laminina foram observados através de microscopia

eletrônica, com a técnica de freeze-etching (Yurchenco et al., 1990; Yurchenco et

al., 1992). A estrutura dessas matrizes3 construídas in vitro também se mostrou

semelhante à das matrizes de laminina in vivo, encontradas nas membranas basais

dos tumores EHS e ECC. Entretanto, vale salientar que a concentração de laminina

utilizada para esta análise foi extremamente alta (3,5 mg/mL), algo que dificilmente

seria encontrado em condições fisiológicas (Figura 8).

Figura 8. Matriz artificial de laminina purificada em alta concentração (3,5 mg/mL). Extraído de Yurchenco e col, 1990.

3 Utilizamos esta expressão para se referir a um polímero adsorvido a uma superfície.

27

2.4 Laminina em pH ácido

Após a caracterização do processo de polimerização da laminina a pH ácido,

a principal pergunta a ser respondida por nosso grupo foi se os polímeros ou

matrizes gerados através desse processo, apresentariam propriedades biológicas

diferentes daquelas apresentadas por polímeros obtidos a pH neutro em alta

concentração. Para abordar esta questão foi testado se neurônios embrionários de

córtex cerebral foram cultivados sobre as duas matrizes, ácida e neutra, se

comportariam de forma distinta. Enquanto na matriz de pH ácido houve uma

promoção de crescimento neurítico, na laminina polimerizada em pH neutro, houve

uma maior proliferação das células. Um outro efeito notável desta matriz ácida de

laminina foi a indução de expressiva migração celular e crescimento neurítico em

explantes de córtex cerebral de animais nascidos (Freire et al., 2002) (Figura 9).

Estes resultados indicaram uma forma de sinalização particular promovida pelos

diferentes polímeros. Duas hipóteses foram levantadas para explicar tal efeito. Na

primeira hipótese, a diferente organização das moléculas de laminina, nos dois

polímeros, resultaria na exposição às células de partes distintas da molécula. Com

isso, a sinalização dessas duas organizações seria diferenciada. Na segunda

hipótese, investigada nesta tese, as topologias das duas superfícies é que estariam

sinalizando para os precursores neurais. Neste caso, a matriz plana e bidimensional

de pH ácido é que induz a neuritogênese e migração celular, já a matriz

desorganizada e tridimensional de pH neutro, a proliferação das células.

28

Figura 9. Explantes de córtex cerebral de ratos recém nascidos (P2) observados através de microscopia de campo claro. Os explantes foram colocados sobre matrizes artificiais de laminina previamente polimerizadas em pH 7,0 (A) ou pH 4,0 (B). A migração das células é mais acentuada na matriz ácida de laminina (B) que na matriz neutra (A). Barra, 100µm. Extraído de Freire et al., 2002.

3 Funções da laminina

3.1 Receptores:

A laminina se liga à superfície celular através de receptores na membrana

plasmática que tem o papel não apenas de ancorar esta proteína à superfície da

célula, mas também de promover a redistribuição de proteínas intracelulares

(Colognato et al., 1999). Já foram descritos diversos receptores celulares para a

laminina e, entre eles, os principais são as integrinas, o distroglican, a leukocyte

antigen-related protein (LAR), a proteína precursora de β amilóide (APP, do inglês

amiloid precursor protein), o heparan sulfato e os sulfatídeos.

As integrinas são receptores heterodiméricos (α β) com afinidade por

diversos componentes da MEC. Atualmente existem 15 subunidades α e 8

subunidades β, criando uma família de pelo menos 20 heterodímeros diferentes.

Estes receptores são componentes “integrais” da membrana plasmática com um

29

terminal carboxi que interage com elementos do citoesqueleto no citoplasma e um

terminal amino que interage com componentes da MEC. Algumas integrinas

reconhecem a mesma seqüência peptídica em diferentes moléculas da MEC, com

isso uma mesma integrina pode se ligar à laminina, ao colágeno e à fibronectina

(Tomaselli et al., 1988). Da mesma forma, alguns tipos celulares neuronais podem

usar mais de uma integrina para interagir com a MEC durante o crescimento

neurítico (Venstrom e Reichardt, 1995). Para reconhecer o braço longo da laminina,

várias células utilizam a integrina α6β1(Aumailley et al., 1990; Sonnenberg, 1990) e

algumas, como os mioblastos e melanomas, utilizam α7β1 (Kramer et al., 1991; von

der Mark col., 1991) (Figura 10).

Figura 10. Os receptores da laminina. Extraído de Colognato e Yurchenco, 2000.

30

O distroglican é o segundo maior receptor da laminina nas membranas

celulares e também é considerado essencial para a formação da membrana basal

(Henry e Campbell, 1998). Ele é composto por uma subunidade α extracelular e

uma subunidade β transmembrana que é o componente central do complexo

distrofina-glicoproteína (DGC). A região citoplasmática do β-distroglican se liga a

distrofina e utrofina no citoplasma que por sua vez podem se ligar a F-actina. Além

disso, esta região citoplasmática contém vários domínios com papel na transdução

de sinal (Ibraghimov-Beskrovnaya et al., 1993). O α-distroglican se liga à laminina

através dos dois últimos domínios LG na região carboxi do braço longo e esta

ligação é inibida por heparina, sugerindo que o distroglican se ligue à molécula de

laminina no mesmo sítio do heparan sulfato (Brancaccio et al., 1995; Chiba et al.,

1997; Gee et al., 1993). As interações distroglican-laminina são importantes para a

ramificação na morfogênese epitelial no rim, pulmão e glândula salivar, uma vez

que anticorpos contra os domínios LG da laminina perturbam o processo de

ramificação (Sorokin et al., 1992, Durbeej et al., 1995, Durbeej e Ekblom, 1997) . A

cranina, um tipo de receptor distroglican, foi purificada do cérebro de roedores. Ela

se liga ao braço longo da laminina na cadeia α1 e promove crescimento neurítico

(Smalheiser e Kim, 1995).

Leukocyte antigen-related protein (LAR) é um membro da família das

tirosinas fosfatases de transmembrana que ocorre em sítios de desorganização da

adesão focal. A laminina é um ligante para uma variante de “splicing” deste

receptor, mas seu sítio de ligação, ainda não foi determinado (O’Grady et al., 1998).

Células HeLa que expressam este receptor estendem grandes processos em

31

resposta à laminina. Membros desta classe de receptor têm sido implicados na

orientação axonal e no desenvolvimento da glândula mamária (Elchebly et al., 1999;

Gershon et al., 1998; Krueger et al., 1996; Schaapveld et al., 1997)

A laminina liga-se também à proteína precursora de β-amilóide, tal ligação

ocorre através da seqüência IKVAV localizada na cadeia α especificamente na

região do braço longo. Ainda não é clara a resposta biológica mediada por esta

interação (Kibbey et al., 1993; Kleinman et al., 1991).

Moléculas de heparan sulfato são normalmente encontradas nas

membranas basais ou na superfície celular, em ambos os casos fazendo parte de

proteoglicanos. As interações entre estas moléculas e laminina envolvem a região

LG4-LG5, ou a região amino terminal da cadeia α da laminina (Colognato-Pyke et

al., 1995; Mann et al., 1988; Roberts et al., 1988; Sung et al., 1993, 1997;

Yurchenco et al., 1990). Heparan sulfato apresenta efeito modulatório na

constituição dos polímeros de laminina in vitro, o que sugere que tais moléculas

associadas à proteoglicanos da membrana basal possam indiretamente influenciar

efeitos celulares induzidos por polímeros de laminina (Colognato e Yurchenco,

2000).

Finalmente, certos glicoconjugados também interagem com laminina. HNK-

1, um carboidrato presente em glicolipídeos e vários receptores neurais, liga-se a

subdomínios LG2 (Hall et al., 1997). Estes carboidratos associados à integrinas

podem estar envolvidos em mediar interações axonais com laminina (Hall et al.,

1993; Lallier e Bronner Fraser, 1991; Smalheiser e Collins, 1992).

32

Os sulfatídeos, glicolipídeos sulfatados presentes na membrana plasmática

de algumas células, se ligam fortemente à laminina (Roberts, 1985, 1986) através

da sua região LG4-LG5 (Tisi et al., 2000; Wisemann et al., 2003). Um estudo feito

por Kalb e Engel, em 1991, demonstrou a interação da laminina com bicamadas

sintéticas de sulfatídeos levando à polimerização facilitada da laminina e sua

agregação na superfície destes lipídeos. Com isso, foi descrita pela primeira vez a

participação dos sulfatídeos na construção da membrana basal. Outra evidência do

papel dos sulfatídeos foi relatada em 2005, quando fibroblastos de pulmão de

comundongo embrionário, que não possuíam membrana basal, passaram a

apresentar uma, após serem carregados com sulfatídeos em sua membrana

plasmática (Li et al., 2005).

Além disso, já foram identificadas várias outras proteínas ligantes de

laminina, mas as funções biológicas resultantes destas interações não foram

identificadas. Isto inclui uma proteína de 67 Kda, que liga elastina e moléculas

relacionadas (Mecham et al., 1989), a galactosil transferase (Runyan et al., 1986),

galactosidases (Hinek et al., 1993), a glicoproteína receptora de eritrócito

LUTHERAN (El Nemer et al., 1998).

33

3.2 Papel da laminina:

3.2.1 Durante o período embrionário

A subunidade γ1 da laminina é comum à maioria das isoformas desta

proteína. Mutações provocadas no gene desta subunidade em camundongos,

resultaram em letalidade no dia 5,5 embrionário por interrupção da diferenciação do

blastocisto (Smyth et al., 1999). Um outro exemplo do papel da laminina na

embriogênese são mutações que geram deficiência nos níveis da subunidade α5 da

laminina. Esta subunidade está presente nas isoformas da laminina-511 e laminina-

521 encontradas em membranas basais neuromusculares, epiteliais, vasculares e

outras. Em camundongos, a deficiência para a subunidade α5 é letal em estágios

embrionários avançados (Miner et al., 1998). Os embriões mutantes apresentam

defeitos no fechamento do tubo neural, anormalidades na vascularização

placentária e falha na separação dos dedos. A membrana basal do animal α5-nulo

embora seja formada, contém severas descontinuidades.

3.2.2. No Período Pós-Natal

A subunidade α2 da laminina é predominante em membranas basais do

sistema neuromuscular, incluindo o endoneuro dos nervos periféricos, o sarcolema

das miofibrilas, a junção neuromuscular e a junção miotendinosa. Mutações no

gene da subunidade α2 são a causa primária da distrofia muscular congênita

humana (CMD), caracterizada por uma degeneração muscular precoce associada a

uma neuropatia de desmielinização periférica e anormalidades cerebrais (Mercuri et

al., 1996; Minetti et al., 1996; Shorer, 1995).

34

A laminina 332 é o principal componente das membranas basais epiteliais.

Estudos mostram que esta isoforma se liga à integrina α6β4 associada ao

hemidesmossoma e a queratina, a integrina α3β1e ao colágeno tipo VII, formando

adesões resistentes entre a célula e as fibrilas de ancoramento (Rousselle et al.,

1997). Mutações afetando a expressão de uma das três subunidades desta

isoforma são as causas da epidermólise bulosa juncional não-letal (JEB) ou letal

(Herlitz), onde uma separação surge entre a membrana basal epidérmica-dérmica

seguida de formação de bolhas (Nakano et al., 2002; Ryan et al., 1996)

4 A laminina no Sistema Nervoso Central (SNC)

4.1 Desenvolvimento do SNC:

A laminina é encontrada ao longo das rotas dos neuroblastos em migração

(Hunter et al., 1992; Liesi, 1985) e nos tratos de fibras em crescimento no cérebro

embrionário (Letourneau et al., 1988; Liesi e Silver, 1988). Diversos estudos

descrevem as interações gliais e neuronais com a laminina, como importantes para

o desenvolvimento adequado do cérebro (Miner e Yurchenco, 2004). A organização

supramolecular da laminina encontrada no sistema nervoso em desenvolvimento é

diferente da laminina no cérebro adulto. No cérebro em desenvolvimento a laminina

aparece como depósitos pontuais na MEC, assim como associada às membranas

basais em desenvolvimento dos capilares, plexo coróide e a membrana limitante

glial que recobre toda a superfície externa do SNC. Estes depósitos pontuais

secretados pelas células da glia estão associados à migração neuronal e

crescimento axonal e consistem apenas das cadeias β1 e γ1 (Liesi, 1985; Liesi e

Risteli, 1989). Podem ser encontrados depósitos puntiformes de tamanhos diversos,

35

associados às membranas dos neurônios ou em forma de lamina. Como estes

padrões de organização apresentam uma distribuição temporal, acredita-se que

eles possam ter funções diferentes no desenvolvimento (Zhou, 1990) (Figura 11).

Figura 11. Aparecimento dos vários padrões de laminina no cérebro do rato em desenvolvimento. Extraído de Zhou, 1990.

4.2 Regeneração do SNC:

O SNC possui baixa capacidade de regeneração após uma injúria tecidual.

Ao contrário dos nervos periféricos que se regeneram naturalmente após uma

lesão, as fibras do SNC, quando seccionadas ou danificadas por esmagamento,

degeneram e não voltam a crescer. Inicialmente, pensava-se que a falta de

capacidade regenerativa do SNC fosse uma característica intrínseca das células

deste tecido, que perderiam definitivamente a capacidade de se dividir, migrar e

emitir prolongamentos finda a etapa de desenvolvimento. Este conceito tem sido

36

revisto nos últimos anos a partir de descobertas que o contrariaram frontalmente, as

mais importantes delas tendo sido: 1) a descoberta de áreas onde ocorre

neurogênese e migração no cérebro adulto (Reynolds e Weiss, 1992; Morshead et

al., 1994) e 2) a demonstração de que neurônios de SNC, em contato com enxertos

de nervos periféricos, readquiriam a plasticidade e eram capazes de estender

neuritos, utilizando os nervos periféricos como guia (David e Aguayo, 1981). Assim,

o conceito estabelecido nos últimos anos é o de que a falta de regeneração no SNC

ocorre em função do ambiente tecidual ser desfavorável, ou, mais precisamente, ao

ambiente tecidual não ser permissivo.

No caso da injúria à medula nervosa, a extensão do dano é determinada não

apenas pela destruição tecidual promovida pelo impacto mecânico da lesão, mas

também, por uma sucessão de danos secundários orquestrados por uma extensa

reação inflamatória, da qual participam macrófagos que invadem o local da lesão e

células da microglia residente. Em condições normais as células do sistema imune

não têm acesso ao SNC porque a barreira hematoencefálica, constituída pelo

endotélio contínuo dos capilares e pela presença dos astrócitos, impede que células

circulantes deixem o sangue e penetrem no tecido nervoso. No entanto, quando

ocorre uma lesão, a hemorragia, o dano vascular e necrose celular contribuem para

que haja um aumento da permeabilidade dos vasos sanguíneos, permitindo a

invasão da área lesada por células inflamatórias. Os neutrófilos chegam ao local da

injúria já nas primeiras 12 horas e lá permanecem por 24 horas. No terceiro dia

chegam linfócitos T e em seguida, macrófagos e monócitos. Estes, juntamente com

as células da microglia residente, irão promover a “limpeza” dos restos celulares,

37

levando à liberação de uma série de mediadores inflamatórios capazes de aumentar

ainda mais a extensão do dano tecidual pós-lesão através da indução de morte

celular de neurônios e células da glia predominantemente por apoptose. Além disso,

estas células liberam NO e radicais livres que contribuem para aumentar a

destruição do tecido. Finalmente, um outro tipo de dano secundário é promovido

pelo fenômeno de excitotoxicidade, onde a liberação excessiva de

neurotransmissores pelos neurônios lesados promove a excitação exagerada dos

neurônios remanescentes e a sua conseqüente destruição.

As lesões raqui-medulares danificam os corpos celulares dos neurônios na

região da injúria, mas a perda funcional mais importante ocorre devido à ruptura das

fibras axonais ascendentes e descendentes que transitam pelo sítio lesado. A

interrupção axonal pode ser causada pela própria lesão primária, quando essa

envolve secção das fibras, ou pode ocorrer como uma resposta secundária a

alterações no citoesqueleto provocadas pela tensão do esmagamento. Nesse caso,

o transporte axonal é interrompido, a fibra se incha e proteases intracelulares são

ativadas. A injúria axonal leva à degeneração Walleriana, que destrói a porção distal

do neurônio, e também pode levar à degeneração anterógrada, que promove a

destruição do corpo celular do neurônio, inviabilizando a posterior regeneração da

fibra.

Tanto a destruição tecidual promovida pelo trauma em si quanto aquela

promovida pela reação inflamatória associada irão determinar a morte dos

oligodendrócitos, as células da glia do SNC responsáveis pela formação da bainha

de mielina. Além disso, a sobrevivência destas células parece depender do contato

38

com os axônios, de forma que a degradação da fibra axonal induz como resposta

secundária a morte dos oligodendrócitos, também contribuindo para dificultar uma

regeneração funcional posterior. Apesar do SNC ter a capacidade de repor

oligodendrócitos em reposta à injúrias, o volume de reposição espontânea não é

suficiente para prover uma recuperação funcional significativa (Smith et al., 1979;

Jeffery e Blakemore, 1997).

Em substituição ao tecido destruído em consequência direta da lesão ou a

fenômenos secundários de degeneração, ocorre a formação de um tecido de

cicatrização denominado cicatriz glial (Fawcett e Asher, 1999; Fitch et al., 1999).

Esta é produzida majoritariamente por astrócitos ativados e composta por

proteoglicanos e proteínas, como laminina, fibronectina, colágeno IV e tenascina

(McKeon et al., 1991; Liesi e Kauppila, 2002). Algumas destas proteínas são

semelhantes àquelas que compõe a matriz do sistema nervoso durante o

desenvolvimento e, portanto, deveriam suportar o crescimento de prolongamentos

axonais através do sítio da lesão. No entanto, a presença simultânea no ambiente

da lesão de abundantes proteínas inibitórias derivadas da degradação da mielina

como a MAG e a Nogo A (Nieto-Sampedro, 1999; Chen et al., 2000; GrandPré et

al., 2000), bem como de proteoglicanos contendo condroitin sulfato, um substrato

inibitório do crescimento axonal (Morgenstern et al., 2002) impede que as fibras

possam crescer através do ambiente lesionado. Contribui ainda para dificultar a

navegação axonal a formação de barreiras mecânicas no local da lesão. Estas são

representadas pelo próprio tecido fibroso ali secretado e pela tendência à formação

de cavidades contendo líquido no centro da lesão.

39

4.3 Lesões do SNC:

As lesões medulares são uma das principais causas de incapacitação física

em indivíduos jovens. No Brasil, cerca de 80% dos casos correspondem a lesões

traumáticas provocadas por armas de fogo, acidentes de trânsito, quedas de altura

ou mergulho em águas rasas, em ordem decrescente de prevalência. A perda dos

movimentos depende da gravidade do trauma e da região da coluna onde este

ocorre. As lesões de consequências mais devastadoras são aquelas denominadas

completas e que atingem a medula ao nível das vértebras cervicais (Figura 12).

Tais lesões levam ao quadro de tetraplegia, caracterizado pela perda do controle

dos movimentos e da sensibilidade nos membros superiores e inferiores, havendo

ainda a possibilidade de comprometimento de funções orgânicas como o controle

dos esfíncteres anal e uretral e da própria capacidade respiratória. Uma das

características mais marcantes deste tipo de injúria é que não há possibilidade de

evolução natural no sentido da regeneração do tecido lesado. Além disso, a

despeito do enorme esforço em pesquisa científica e dos avanços na compreensão

dos mecanismos que regulam o processo de regeneração, não existe até o

momento nenhum tratamento clínico ou cirúrgico que possa garantir uma

recuperação funcional significativa dos pacientes.

40

Figura 14. Os níveis de lesão e a extensão da paralisia. Extraído do site www.mydr.com.br.

Muitos esforços têm sido investidos no sentido de encontrar acessos

terapêuticos alternativos, no entanto poucos foram os procedimentos a confirmar

eficácia em etapas de teste clínico controlado. O tratamento convencional hoje

oferecido a pacientes recém-acidentados é a aplicação, preferencialmente nas

primeiras 3 horas após o trauma, de metilprednisolona, uma droga esteróide que

parece reduzir o dano celular e a resposta inflamatória associadas à lesão. A

metilprednisolona apresentou eficácia considerável em estudos clínicos, tendo

aumentado significativamente a recuperação de movimentos em pacientes

paralisados (Bracken et al., 1992; Bracken et al., 1998). Entretanto, estudos mais

recentes indicam que as altas doses necessárias para a eficácia da

metilprednisolona são potencialmente tóxicas, o que já levou a suspensão de sua

41

administração como procedimento padrão em alguns países como o Canadá (Kwon

et al., 2004).

Além da injeção de metilprednisolona, procura-se minimizar as

consequências da lesão através de intervenção cirúrgica no sentido de reduzir a

compressão sobre a medula e de estabilizar a coluna pela colocação de próteses

de contenção. É importante aqui notar que o SNC está sempre protegido por

estruturas ósseas que, em condições normais conferem-lhe proteção contra dano

mecânico. No entanto, esta proteção óssea representa um grande problema em

situações de injúria tecidual, uma vez que qualquer edema será acompanhado de

compressão e conseqüente destruição do tecido nervoso contra os limites impostos

pela caixa craniana, no caso do cérebro, ou pelas vértebras, no caso da medula

espinhal. (As informações contidas nas seções descritas aqui foram retiradas dos

seguintes artigos de revisão: Schwab e Bartholdi, 1996; Giménez y Ribotta e Privat,

1998; David e Lacroix, 2003; Ramer et al., 2005).

42

Objetivos

1- O primeiro objetivo deste projeto é investigar a base molecular das

diferenças estruturais encontradas entre as matrizes ácida e neutra de laminina

através da avaliação da ultraestrutura dos polímeros formados.

2- O segundo objetivo deste projeto é investigar a resposta celular à

geometria da matriz de laminina, simulando-se com substratos artificiais as texturas

encontradas nas superfícies das matrizes nos pHs 4,0 e 7,0.

3- O terceiro objetivo, considerando que a matriz ácida de laminina é um

eficiente indutor de crescimento neurítico in vitro, é verificar se ela seria um bom

substrato para promover a regeneração axonal no sistema nervoso central in vivo

em um modelo de lesão raquimedular.

43

Metodologia

Microscopia Eletrônica. A Laminina 111 (Invitrogen, Carlsbad, CA), isolada

do tumor Engelbreth-Holm-Swarm, foi diluída para uma concentração final de 50

µg/ml em tampão acetato de sódio 20 mM, pH 4,0, contendo 1 mM de CaCl2. Para o

freeze-etching, 10 µL da solução foram colocados sobre um suporte Balzers. A

solução foi congelada rapidamente por impacto com um bloco de cobre e resfriada

em nitrogênio líquido. Depois disso, a amostra recebeu sombreamento rotatório

com platina a 15º e carbono a 90º, foi lavada com hipoclorito de sódio e coletada

numa grade de cobre. Para a contrastação negativa, 5 µL da solução de laminina 50

µg/ml foram colocados sobre uma grade de cobre coberta com Formvar. O excesso

de solução foi removido e 5 µL de acetato de uranila (2%) foram adicionados. Após

1 minuto, o excesso de uranila foi retirado com papel de filtro. As amostras foram

observadas num microscópio eletrônico Zeiss 900 operado a 80kV.

Microscopia de Força Atômica. A laminina foi diluída em tampão acetato,

pH 4,0 (50 µg/ml) e 50 µL desta solução foi pipetada na superfície da mica. Após

fixação por duas horas em solução fixadora Karnosky (Karnosky, 1965) composta

de paraformaldeído 4% e glutaraldeído 0,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1M

(pH 7,2), a mica foi lavada três vezes com tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH

7,2), desidratada através de concentrações crescentes de etanol e secas no ponto

crítico (Balzers CPD 050). A obtenção de imagens da mica recoberta com laminina,

da lamínula de vidro e da membrana de celulose foi feita utilizando um microscópio

44

de força atômica (AFM) modelo MFP-3D SA Atomic Force Microscope (Asylum

Research, Santa Barbara, CA) operando em modo contato intermitente (tapping

mode) à temperatura ambiente, onde os cantiléveres utilizados foram o tetraédrico,

modelo AC240TS (Olympus, Tokyo, Japan), com constante de mola nominal de 2

N/m, com método de calibração utilizado por ruído térmico. As imagens foram

adquiridas a partir de duas análises feitas simultaneamente. A imagem de altura foi

utilizada para ambos estudos, laminina de vidro de 13 mm e os pedaços de

membrana de éster de celulose com 8 µm de poro adquirida da Millipore (Millipore

Corporation, Billerica, MA). Para os estudos de laminina, resolvemos analisar não

somente a superfície da laminina por altura, mas também utilizando o modo de fase.

O modo de fase é uma poderosa ferramenta associada ao modo contato

intermitente. Durante a varredura no modo contato intermitente, com o cantiléver

oscilando sobre a amostra, além da análise da topografia, o modo fase permite a

detecção e o discernimento de variações na composição, adesividade, fricção,

viscoelasticidade, dentre outras. Com o intuito de diminuir danos na amostra e

também redução de ruídos, as imagens foram adquiridas utilizando uma baixa

freqüência de varredura na ordem de 0.6 Hz, com resolução de 512 X 512 pixels. O

processamento de imagem (planificação em linha apenas) foi feito em uma linha de

comandos desenvolvida pela Asylum Research utilizando como plataforma o

programa IGOR-PRO (Wavemetrics, Portland, OR, USA). Para auxiliar nas

análises, a matriz de dados, que gera as imagens planificadas, será transformada

em uma visualização tridimensional, possibilitando um maior discernimento dos

dados obtidos pelo AFM.

45

Medidas de Espalhamento de luz. O espalhamento de luz foi medido num

Espectrofotômetro QuantaMaster (Photon Technology International, Lawrenceville,

NJ) a 37ºC. O comprimento de onda da luz incidente foi fixado em 400 nm e a luz

espalhada foi coletada a 90º entre 350 e 450 nm. A polimerização da laminina foi

iniciada pela diluição da proteína de uma solução estoque recém descongelada

para uma concentração final de 10 µg/mL em tampão acetato 20 mM (pH 4,0) ou

para uma concentração final de 200 µg/mL em Tris-HCl (pH 7,0), ambos contendo 1

mM de CaCl2 (volume final de 800 µL). A cubeta de fluorescência foi previamente

tratada com Repel silane (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden) para

evitar a ligação da proteína às paredes de quartzo. O ensaio foi executado na

presença e na ausência dos fragementos de laminina E1’ou E3 (150 nM). Os

fragmentos de laminina E1’e E3 foram doados gentilmente por Dr. Peter Yurchenco

(Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, NJ). As soluções estoque de

laminina (~ 1,0 mg/mL) foram mantidas a 4ºC até a diluição no meio de ensaio,

previamente aquecido para 37 ºC, no compartimento de amostra do aparelho.

Nestas condições, i.e. a 4ºC, a formação de agregados não é esperada na solução

estoque até a diluição no tampão pré-aquecido (Yurchenco 1985). Após a adição da

laminina, as amostras foram suavemente misturadas e as medidas foram tiradas

num intervalo de aproximadamente 1 min. Os dados foram corrigidos pela

subtração dos brancos contendo apenas tampão.

Imunomarcação. A Laminina foi diluída para uma concentração final de 50

µg/ml em tampão acetato de sódio 20 mM, pH 4,0 ou tampão Tris-HCl 20 mM, pH

46

7,0, ambos contendo 1 mM de CaCl2. Alíquotas de 100 µl foram imediatamente

pipetadas em lamínulas de vidro (13 mm de diâmetro) e incubadas a temperatura

ambiente por 12 horas. Para a imunomarcação, as lamínulas foram fixadas com

paraformaldeído 4% por três minutos e lavadas três vezes com tampão fosfato

salina 0,1 M, 0,9% NaCl pH 7,2 (PBS). Após bloqueio com BSA 5% por 30 minutos,

as amostras foram incubadas com anticorpo primário anti-laminina (Sigma-Aldrich

Co., St. Louis, MO) diluído 1:30, por 12 horas a 4º C. As matrizes foram lavadas três

vezes com PBS e incubadas a temperatura ambiente com anticorpo secundário

anti-coelho, conjugado com Cy3 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) diluído 1:800,

por 2 horas. Após lavagem com PBS por três vezes e lavagem com água destilada

uma vez, as lamínulas foram montadas com N-propil-galato em tampão fosfato 0,1

M e glicerol 80%, pH 8,0 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) e visualizadas com

microscópio de epifluorescência (Zeiss Axioplan).

Análise do Potencial Eletrostático da superfície. O potencial eletrostático

da superfície dos domínios LG4-5 nas lamininas α1 e α2 foi calculado usando o

software Adaptative Poisson-Boltzmann Solver (Baker et al., 2001) e as imagens

foram geradas utilizando Pymol 0.97 (Delano, 2002). As coordenadas atômicas para

as cadeias α1 e α2 da laminina foram obtidas do Protein Data Bank, entrada 2JD4

para α1 e 1DYK para α2 (Harrison et al., 2007; Tisi et al., 2000). Os cálculos foram

efetuados pela designação de cargas neutras ou positivas para as histidinas. Uma

sonda esférica de 1,4 Å de raio foi usada para gerar a superfície acessível ao

solvente. A constante dielétrica usada para proteína e solvente foram 20 e 80,

respectivamente e a temperatura do sistema foi fixada para 310K.

47

Análise morfológica das superfícies através de Microscopia Confocal.

As lamínulas de vidro (13 mm) e os pedaços de membrana de éster de celulose

com 8 µm de poro adquirida da Millipore (Millipore Corporation, Billerica, MA) foram

incubados por 12 horas com laminina na presença de EDTA. O EDTA

(ethylenediaminetetraacetic acid) seqüestra os íons cálcio do meio, impedindo a

polimerização da laminina e isso faz com que a superfície fique recoberta com

moléculas de laminina não polimerizada. Em seguida, foi realizada uma

imunomarcação com anticorpo policlonal para laminina (protocolo descrito

anteriormente). Estas amostras e as matrizes artificiais de laminina, preparadas em

pH 7,0 e pH 4,0 e imunomarcadas com protocolo descrito anteriormente, foram

visualizadas através de microscopia ótica confocal. No microscópio confocal, foram

realizadas fatias óticas destas amostras e estas fatias foram então sobrepostas

(reconstruídas), gerando uma imagem tridimensional. Uma das funções do

microscópio confocal permite observar as amostras lateralmente (em outro plano

ortogonal), o que nos permitiu visualizar a topografia da superfície.

Cultura Primária de Neurônios. As culturas foram preparadas a partir do

córtex cerebral de ratos no 14º dia da fase embrionária. Após a dissociação de

células corticais em DMEM/F12 (Invitrogen) suplementado com glicose 33 mM,

glutamina 2 mM e bicarbonato de sódio 3 mM, 100.000 células foram plaqueadas

nas lamínulas ou nas membranas de éster de celulose, previamente recobertas, ou

com poli-l-ornitina (SIGMA-Aldrich), ou laminina na presença de EDTA 10 mM (que

inibe a polimerização da proteína). As culturas de neurônio foram mantidas por 24

horas a 37 ºC e fixadas para posterior imunocitoquímica com anticorpos contra

48

laminina (SIGMA-Aldrich), diluída 1:30 e contra β tubulina III (SIGMA-Aldrich),

diluída 1:400. A β tubulina III é uma proteína do citoesqueleto específica de

neurônios.

Microscopia Eletrônica de Varredura. As culturas de neurônios sobre as

superfícies de vidro e sobre a membrana de celulose, foram fixadas por duas horas

em fixador Karnosky (paraformaldeído 4% e glutaraldeído 0,5%, em tampão

cacodilato 0,1M, pH 7,2) lavadas três vezes com tampão cacodilato de sódio 0,1M,

pH 7,2, desidratadas através de concentrações crescentes de etanol e secas no

ponto crítico Balzers CPD 050. As amostras foram então recobertas com uma fina

camada de ouro no metalizador (Bal-Tec SCD 050) e visualizadas em microscópio

Jeol 5310. As imagens digitais foram obtidas através do programa Sem Afore ® Jeol

3.0 Pro na resolução de 1024x768 pixels.

Animais. Todos os experimentos in vivo aqui apresentados foram realizados

no laboratório do Prof. Dr. Martin Oudega na Universidade de Miami (Miami – FL) e

na Johns Hopkins University (Baltimore – MD). Os animais, 151 ratas adultas do

tipo Spraguey-Dawley com peso de ~200 g (Charles River Laboratories, Wilmington,

MA), foram alojados de acordo com as regras do NIH e do USDA. O Comitê

Instucional da Universidade de Miami aprovou todos os procedimentos. O número

de animais usados neste experimento, assim como seu sofrimento, foi minimizado.

Antes de cada cirurgia, os ratos foram anestesiados através de uma injeção

intramuscular com uma mistura de ketamina (62,5 mg/kg), xilasina (3,2 mg/kg) e

acepromazina (0,625 mg/kg). A pele dos animais foi raspada e limpa com álcool

70%. Foi aplicado sobre os olhos, pomada Lacrilube Oftalmic (Allergen

49

Pharmaceuticals, Irvine, CA) para evitar o ressecamento. Durante a cirurgia, os

animais foram mantidos numa manta aquecedora para manter a temperatura do

corpo em 39±0,5ºC.

Purificação das Células de Schwann. As células de Schwann altamente

purificadas (98%) foram obtidas do nervo ciático de ratas adultas Sprague-Dawley

de acordo com protocolo já descrito (Xu et al., 1995; Morrissey et al., 1991).

Brevemente, explantes de nervo ciático com 1 mm2 de onde foram retirados

epineuro e tecido conjuntivo, foram mantidos em Dulbecco’s Modified Eagle Medium

(DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY) com 10% de de soro fetal de cabra (FCS,

Hyclone, Logan, UT), penicilina (50 U/mL), e estreptomicina (50 µg/mL). Após os

fibroblastos migrarem para fora do tecido nervoso, os explantes foram dissociados.

Para eliminar os fibroblastos remanescentes, as células dissociadas foram tratadas

com anticorpo contra Thy1.1 (Brockes et al., 1979). No caso de fibroblastos ainda

estarem presentes durante a primeira passagem, um tratamento adicional de

Thy1.1 foi aplicado entre a primeira e segunda passagem. As células de Schwann

foram estimuladas a proliferar em meio-D10 (DMEM/10% FBS, penicilina (50 U/mL),

estreptomicina (50 µg/mL) com a mistura mitogênica de forscolina (2 µM; Sigma, St.

Louis, MO) e extrato bovino de pituitária (2 µg/mL; SIGMA). As células de Schwann

foram mantidas em placas de cultura de 100 mm recobertas com poli-L-lisina e

passadas toda vez que estivessem confluentes. A cada passagem 2x106 eram

replaqueadas para expansão.

Lesão medular por contusão. Os animais foram anestesiados e sem

romper a dura mater, foi realizada a laminectomia dos segmentos T8-T9 da medula,

50

que ficaram expostos através da retirada da região dorsal da vértebra. A medula

exposta sofreu contusão induzida através do NYU Impactor, aparelho desenvolvido

na Universidade de Nova York (Gruner, 1992). A lesão moderada provocada pelo

NYU Impactor, é gerada pela queda de um peso de 10 g de uma altura de 12,5 mm.

A velocidade do impacto e a compressão foram monitoradas para garantir

consistência entre os animais. Após a lesão, os músculos foram suturados em

camadas e a pele foi fechada. Os ratos retornaram para as gaiolas aquecidas e com

a água e comida ad libitum. Os ratos foram mantidos por um total de 10 semanas

após a injeção dos tratamentos sendo os tempos de sobrevivência após a injeção

de 1, 2, 4 ou 10 semanas.

Procedimento cirúrgico para injeção dos tratamentos. Dez dias após a

contusão, o sítio da lesão foi re-exposto e 5 µL de DMEM contendo somente

laminina (100 µg/mL) polimerizada em pH ácido (LM) ou somente células de

Schwann (2x106células) (SC) ou contendo ambos (LM+SC) foram injetados na área

da contusão. Para evitar que os animais fossem injetados com solução em pH

ácido, a laminina foi polimerizada em tampão acetato, os polímeros de laminina

formados nesse tampão foram precipitados através de centrifugação (15.000

rpm/10 min a 4ºC) e ressuspendidos em DMEM com pH neutro antes de serem

injetados nos animais. A injeção foi feita com uma seringa Hamilton de 10 µL presa

a um microinjetor ajustado para apertar o êmbolo da seringa numa velocidade de 5

µL/15 min. Nos animais controle foram injetados 5 µL de somente DMEM (M) ou

nenhum tratamento foi injetado (N). Após a injeção, as camadas de músculos e a

51

pele foram fechadas separadamente. Aproximadamente 30 animais foram operados

para cada grupo.

Marcação neuronal com traçador retrógrado. Oito semanas após a

implantação, a área da lesão foi re-exposta. O traçador fluorescente Fluorogold

(hydroxystibamidine) (FG, Fluorochrome, Denver, CO) foi injetado na medula 6-7

mm caudal ao limite da lesão na medula (entre as vértebras T10 e T11). O

Fluorogold 4% foi injetado usando uma agulha de vidro (diâmetro de

aproximadamente 150 µm) acoplada a uma seringa Hamilton de 1 µL. No total, seis

pontos na medula a nível de T10-T11 receberam 0,5 µL de FG cada, um volume

final de 3 µL. Cada injeção durou 5 minutos e a agulha foi mantida no lugar por mais

três minutos e então retirada vagarosamente para evitar extravasamento do

traçador. Após as injeções, os músculos e a pele foram suturados e o animal

retornou para a gaiola. Após duas semanas o animal foi sacrificado através de

perfusão transcardíaca.

Procedimentos Histológicos. Completados os tempos de sobrevivência,

isto é, com 1, 2, 4 e 8 semanas, os animais foram anestesiados profundamente e

perfundidos transcardialmente primeiramente com PBS 0,1M gelado e em seguida

com paraformaldeido 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 também gelado. As

medulas dissecadas foram pós-fixadas no mesmo fixador a 4 ºC por 12 horas.

Segmentos torácicos da medula (15 mm), contendo o sítio da lesão, foram

dissecados e transferidos para uma solução de sacarose 30% em tampão fosfato

0,1 M onde ficaram incubados por mais 12 horas. Após serem emblocados em meio

de inclusao Tissue-Tek O.C.T. (Miles Laboratories), os segmentos foram cortados

52

no criostato em fatias longitudinais de 20 µm. Estas secções, coletadas em lâminas

de vidro, foram armazenadas a 4ºC e posteriormente coradas com cresil violeta

para quantificação da preservação tecidual ou observadas através de luz

ultravioleta para quantificação dos neurônios marcados com Fluorogold. As análises

foram realizadas utilizando o software StereoInvestigator (MicroBrightfield, Inc.,

Colchester, VT) em microscópio Olympus IX 70 invertido.

Teste de locomoção em campo aberto (BBB). O movimento das patas

traseiras foi avaliado usando o teste de locomoção em campo aberto descrito por

Basso, Beattie e Brasnahan (BBB) (Basso et al., 1995). Dois observadores, que

desconheciam os dados experimentais, executaram o teste uma vez por semana

durante nove semanas. Neste teste, os animais são colocados sobre uma área

cercada e, enquanto caminham por 4 minutos, são classificados recebendo notas

com valores entre 0 a 21, de acordo com seu desempenho. A nota zero é dada

quando o animal não apresenta movimento espontâneo e a nota 21 indica

locomoção normal. O teste da primeira semana é realizado quatro dias após a

contusão e antes da injeção do tratamento.

Teste de BBB subscore. Os elementos de função motora mais avançados

(etapas da passada, posicionamento da pata, instabilidade do tronco e

posicionamento da cauda) são avaliados pelo BBB score apenas quando os

animais apresentam coordenação consistente entre as patas traseiras e dianteiras,

ou seja, acima da nota 13. Por isso, foi desenvolvido um subscore de 7 pontos

derivado do BBB score. O subscore foi descrito por Lankhors et al., (1999) para

53

medir esses elementos locomotores finos mesmo antes de haver coordenação entre

as patas traseiras e dianteiras.

Teste de Footprint. A análise de Footprint foi modificada de De Medinaceli

et al. (1982). As patas traseiras do animal foram pintadas e, após uma caminhada

por um corredor de acrílico de 1 m de comprimento e 7 cm de largura, suas

pegadas foram marcadas num papel que cobre o piso do corredor. A base de

suporte foi determinada através da medida da distância entre os centros das

pegadas das patas traseiras.

Teste de Gridwalk. Os déficits no controle motor descendente foram

examinados através da habilidade do animal de atravessar um corredor com

espaços vazios irregularmente distribuídos entre barras de metal (Z’Graggen et al.,

1998). Para atravessar o corredor o animal necessita colocar suas patas

precisamente sobre as barras. O número de erros (deslizes) que ele comete a cada

travessia foi contado e uma taxa média de erros foi calculada.

Analise estatística. O teste estatístico utilizado nas análises funcionais BBB

score e BBB subscore foi o two way ANOVA (Analysis of Variance) seguido do teste

Pos Hoc Tukey para análise da diferença significativa. Os dois fatores avaliados

foram os grupos de animais (n=5) e as semanas de avaliação (8 sessões). Para a

comparação entre os grupos na análise do Gridwalk e na quantificação de

neurônios marcados com o traçador Fluorogold, o teste utilizado para foi o one way

ANOVA. Em todas as análises estatísticas, o software utilizado foi SigmaStat 3.5

(Systat, Inc.).

54

Resultados

1 Investigação da estrutura supramolecular das matrizes de

laminina formadas a partir da polimerização a pH ácido.

A morfologia dos polímeros de laminina obtidos em pH ácido foi analisada

anteriormente por nosso grupo (Freire et al., 2002, 2004). A matriz ácida

imunomarcada e observada através de microscopia óptica, apresentou uma

organização regular plana com formato semelhante ao de uma colméia (Freire et

al., 2002). Para que pudéssemos investigar a ultraestrutura desses polímeros,

utilizamos a técnica do “freeze-etching” associada à microscopia eletrônica. A

análise da arquitetura da matriz de laminina revelou uma estrutura plana composta

por polígonos repetitivos (Figura 13A). O primeiro terço da imagem (seta) parece

corresponder a uma camada simples de proteína enquanto os outros dois terços

sugerem uma superposição de mais de uma camada poligonal. Os lados dos

polígonos visualizados com a técnica de freeze-etching, apesar de apresentarem

uma relativa homogeneidade, eram muito espessos para permitir as mensurações

necessárias a uma descrição precisa dos polímeros formados. Sendo assim, não foi

possível inferir quais as interações moleculares presentes no polímero ácido

utilizando tal abordagem.

Em seguida, analisamos a ultra-estrutura dos polímeros ácidos por contraste

negativo. A observação da imagem (Figura 13B) revelou uma rede bem organizada

55

composta de polígonos com um formato hexagonal. Os lados dos hexágonos, que

correspondem as “struts” da rede, foram quantificados e o tamanho médio

encontrado foi de 21 ± 5 nm, o que é compatível com o tamanho estimado para o

braço curto do laminina, que é de aproximadamente 30 nm. É interessante notar

que nenhum tipo de arranjo estrutural foi identificado quando a laminina era

polimerizada em pH 7,0.

Posteriormente, os polímeros ácido-induzidos foram avaliados através de

microscopia de força atômica. A análise inicial de uma região com 0,25µm2

utilizando a varredura convencional de topografia mostrou uma imagem regular mas

sem contraste, indicando uma superfície plana (Figura 14A). Uma segunda imagem

foi gerada pela análise do atraso de fase ocorrido no cantilever (Figura 14C). A

imagem de fase é extremamente sensível às propriedades elásticas e adesivas das

amostras presentes na superfície (Morris et al., 1999), levando a um pronunciado

aumento do contraste. Uma imagem homogênea contendo polígonos semelhantes

àqueles encontrados na microscopia eletrônica foi visualizada utilizando o modo de

fase.

Para obter informações sobre a altura da camada de laminina, introduzimos o

cantilever em regiões onde havia interrupções na matriz, medindo a distância até a

superfície abaixo. A média das distâncias obtidas com três medidas foi de 86 ± 3

nm (Figura 14B). Este tamanho corresponde ao comprimento do braço longo da

laminina, que desta forma, não estaria participando da rede hexagonal, mas se

projetando num plano ortogonal relativo à rede.

56

Figura 13. Análise ultraestrutural dos polímeros de laminina obtida em tampão ácido revela sua organização poligonal. A laminina foi diluída (50 µg/mL) em tampão acetato, pH 4.0 e as amostras foram então preparadas para o freeze-etching (A) e para a contrastação negativa (B). As fotomicrografias estão com contraste invertido para melhor visualização da estrutura tridimensional dos polímeros. A seta indica a passagem de uma região com uma camada (esquerda) para uma região com duas camadas do polímero (direita). A barra representa 100 nm no painel A e 200 nm no painel B.

57

Figura 14. Análise da matriz ácida de laminina através de microscopia de força atômica. As imagens obtidas através de microscopia de força atômica revelam uma estrutura poligonal irregular com altura que corresponde ao braço longo da molécula. (A) Varredura topográfica de uma área de 0,25 µm por 0,25 µm. (B) Avaliação da profundidade da camada de laminina obtida pela introdução do cantilever em áreas onde havia rompimento da matriz (C) Imagem gerada por fase. Barra, 100nm.

58

Com o objetivo de confirmar a ausência de contribuição do braço longo da

laminina na formação da rede de laminina ácido-induzida, fomos verificar se a

adição do fragmento E3, que contém os dois últimos domínios globulares do braço

longo, iria interferir com a polimerização da laminina em solução. O experimento foi

realizado com uma concentração de laminina de 10 µg/mL, uma concentração na

qual não foi observada polimerização na laminina (Yurchenco et al., 1985). A Figura

15A mostra as intensidades de luz obtidas quando a laminina foi diluída em pH

ácido na ausência e na presença de excesso molar de 20 vezes dos fragmentos. Na

presença do fragmento E1’, que contém os domínios globulares de dois dos braços

curtos, a polimerização foi bloqueada. Por outro lado, a adição do fragmento E3 não

afetou a polimerização em solução, o que confirma que interações com o braço

longo não estão envolvidas na polimerização das matrizes ácidas.

A polimerização em solução também foi investigada em tampão neutro

(Figura 15B). Com 10 µg/mL, nenhum aumento no espalhamento de luz foi

observado. Quando a concentração de laminina foi aumentada para 200 µg/mL, o

espalhamento de luz aumentou progressivamente, alcançando um aumento máximo

de 4,5 vezes num intervalo de 2 horas. A adição de EDTA (que desfaz os

agregados de laminina por seqüestrar os íons cálcio, importantes para a

polimerização) desfez os polímeros e levou a uma queda no espalhamento de luz

para a intensidade inicial no tempo zero. Quando o ensaio de polimerização foi

realizado na presença do fragmento E3 em excesso molar de 20 vezes, o aumento

observado foi de apenas 50%, indicando que embora a polimerização ainda ocorra

na presença de E3, o nível máximo de agregação foi afetado pelo fragmento.

59

Embora classicamente os agregados de laminina não sejam detectados em

solução a pH neutro, numa concentração de 50 µg/mL, nosso grupo havia mostrado

anteriormente que depósitos da proteína poderiam ser observados quando a

solução era incubada sobre a superfície de lamínulas de vidro (Freire et al., 2002;

2004). Estes depósitos foram visualizados através de imunomarcação e se

mostraram morfologicamente diferentes dos obtidos em pH ácido. Os fragmentos

E1’ e E3 (Figura 16A) foram testados para sua habilidade de interferir com a

formação das matrizes adsorvidas a lamínulas em cada pH. Na ausência dos

fragmentos, a laminina formou polímeros planos e organizados em pH ácido

enquanto que em pH neutro, os polímeros se mostraram tridimensionais e

descontínuos (Figura 16B). O fragmento E1’ claramente desfez os polímeros, mas

o fragmento E3 afetou apenas os depósitos obtidos em pH neutro. É importante

notar que embora o fragmento E3 impeça a polimerização dos agregados grandes,

típicos dos depósitos de laminina em pH neutro, pequenos agregados continuaram

visíveis indicando que, provavelmente E3 interfere no estado de polimerização final,

mas ainda preservando algum nível de agregação.

60

Figura 15. Os fragmentos E1’ e E3 interferem seletivamente na polimerização da laminina em solução. (A) Espalhamento de luz (12 nM) em tampão acetato pH 4,0 foi medido na ausência e na presença de 240 nm dos fragmentos E1’ e E3 imediatamente após a diluição. Enquanto E1’ inibiu a polimerização, E3 não afetou o nível máximo de intensidade de espalhamento de luz. As intensidades continuaram sem alterações por até 12 horas. (B) Espalhamento de luz da laminina (240 nM) foi observado após a diluição em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 7,0) por 6 horas na ausência (símbolos fechados) ou na presença de 4 µM do fragmento E3 (símbolos abertos). Os valores do espalhamento de luz foram normalizados para compensar o aumento de intensidade devido ao aumento da massa total de proteína na presença dos fragmentos. Adição de EDTA na curva controle (círculo fechado) reverteu a polimerização abaixo dos níveis encontrados na presença dos fragmentos indicando que, embora E3 interfira na polimerização da laminina, polímeros continuam em solução na presença do fragmento.

61

Figura 16. Os framentos E1’ e E3 interferem com a formação das matrizes de laminina adsorvidas. À direita, as matrizes foram formadas pela adsorção da laminina (60 nM) à superficie de lamínulas de vidro na ausência (painéis de cima) ou na presença dos fragmentos E1’ ou E3 (1,2 µM) (painéis do meio e de baixo respectivamente). Enquanto E1’ desfez os agregados completamente, E3 não interferiu na polimerização em tampão ácido mas diminui os agregados formados em tampão neutro. À esquerda, um esquema mostrando a molécula de laminina e seus fragmentos E1’(em verde) e E3 (em vermelho). A barra de escala corresponde a 50 µm.

Control

+ E1’

+ E3

Control

+ E1’

+ E3

pH 4 pH 7

62

O fragmento E3, que está contido no braço longo, inibiu a polimerização da

laminina em pH neutro, mas não em pH ácido. Esse efeito indica que o braço longo

não está envolvido na polimerização ácida, sendo assim, a única parte da molécula

que estaria efetuando ligações nos polímeros ácidos seria a dos domínios

globulares dos braços curtos (Figura 17A). Em pH neutro, temos os braços longos

e curtos da molécula interagindo entre si, uma vez que os fragmentos E1’ e E3

impediram a formação das duas matrizes (Figura 17B). Como os braços curtos da

molécula estão organizados em um único plano enquanto o longo projeta-se em um

plano ortogonal, nossas inferências sobre as interações moleculares de cada

polímero estão de acordo com a observação de que as matrizes em pH 4,0 são

planas e organizadas enquanto as matrizes de pH 7,0 são desorganizadas e

tridimensionais.

Recentemente foi descrita a estrutura cristalográfica dos domínios LG4-5, os

dois domínios mais distais no braço longo da cadeia α1, presente na laminina 111

(Harrison et al., 2007). Com este dado, utilizamos o software PyMol para analisar a

superfície eletrostática dos domínios LG4-5 da proteína nos pHs 4,0 e 7,0. A Figura

18 mostra que em pH neutro, grupos negativamente carregados (vermelho) estão

presentes numa superfície predominantemente positiva (azul). Isso permitiria algum

nível de interações eletrostáticas entre dois desses domínios. De fato, uma

proporção significativa de dímeros formados pela associação entre esses dois

domínios foi observada entre dímeros espontaneamente formados detectados por

63

sombreamento rotatório e microscopia eletrônica (Yurchenco et al., 1985). Por outro

lado, quando o pH é diminuído para 4,0, a superfície se torna totalmente positiva, o

que iria prevenir completamente interações entre os dois domínios distais do braço

longo da laminina 111. De forma interessante, este não é o caso da laminina 211,

onde os domínios LG4-5 são parte da cadeia α2. No caso dessa isoforma, cargas

negativas e positivas alternadas são vistas tanto em pH ácido quanto em pH neutro

(Figura 18).

64

Figura 17. Esquema explicando a polimerização da laminina nos pHs 4,0 e 7,0. Em pH ácido, as moléculas de laminina interagem somente através dos braços curtos pra formar o polímero (A). Em pH neutro, braços curtos e longos estão envolvidos na polimerização (B).

A

B

65

Figura 18. A acidificação torna o domínio α1 LG4-5 completamente positivo impedindo sua interação homofílica. O mapa do potencial de superfície eletrostática do domínio LG4-5 da cadeia α1 e α2 da laminina foi obtido como descrito na metodologia. A barra mostra o código para a variação das cores do negativo (vermelho) para o positivo (azul) na faixa de -3 a 3 kT/e.

66

2 Estudo da resposta de células neurais embrionárias à

geometria da superfície

A laminina, assim como o colágeno e a fibronectina, forma agregados in vivo.

Formulamos a hipótese de que a geometria da estrutura supramolecular destes

agregados, ou seja, a morfologia que tais agregados assumem, pudesse funcionar

modulando o espaçamento entre os epítopos reconhecidos pelos receptores

celulares.

Utilizando microscopia óptica confocal, observamos uma diferença de

dimensionalidade entre as duas matrizes de laminina. A análise das imagens

produzidas pela superposição de secções óticas transversais das duas amostras

(“renderização”) revelou que, enquanto matrizes ácidas são finas e homogêneas

como numa estrutura bidimensional (Figura 19A e B), as matrizes neutras são

espessas e pouco organizadas, tendendo mais a uma estrutura tridimensional

(Figura 19C e D).

Enquanto a matriz neutra de laminina favorece a proliferação de precursores

neurais, a matriz ácida, de característica planar, favorece a migração e o

crescimento neurítico (Freire et al., 2002). Para avaliar o efeito destas duas

diferentes topologias no comportamento das células neuronais, foram escolhidos

dois materiais diferentes com geometrias semelhantes às das matrizes. Para

mimetizar a superfície plana bidimensional do polímero ácido de laminina, foram

67

utilizadas lamínulas de vidro, e para o polímero neutro tridimensional, uma

membrana rugosa de éster de celulose com poro médio de 8 µm. A análise dos

materiais foi feita também através de microscopia confocal, onde as superfícies

foram recobertas com laminina na presença de EDTA (para evitar a polimerização

da proteína) e depois imunomarcadas com anticorpo contra laminina. A superfície

lisa da lamínula de vidro (Figura 20A e B) e rugosa da membrana de celulose se

mostraram bem semelhantes às topologias das matrizes de laminina, inclusive nas

imagens das seções ópticas transversais.

Após a análise por microscopia óptica confocal, uma varredura das duas

superfícies foi feita através da microscopia de força atômica. As superfícies da

lamínula de vidro e da membrana de celulose apresentaram topologias semelhantes

a das matrizes artificiais de laminina. Com as medidas feitas pelo cantilever,

verificamos que a lamínula de vidro possui rugosidade mínima (Figura 21A e B) e a

membrana de filtro, uma rugosidade com amplitude de 10,7 µm (Figura 22A e B),

compatível com a rugosidade da matriz de pH 7,0.

68

Figura 19. Matrizes de laminina imunomarcadas e observadas através de microscopia confocal. Reconstruções tridimensionais das matrizes artificiais de laminina polimerizadas sobre lamínulas de vidro em pH ácido (A) ou pH neutro (C). As reconstruções são observadas em perfil (B) e (D).

A

10µm

B

C D

10µm

69

Figura 20. Visualização das superfícies da lamínula de vidro e da membrana de éster celulose através de microscopia óptica confocal. A superfície lisa do vidro (A) e rugosa da membrana (C) foram recobertas com laminina na presença de EDTA (que inibe a polimerização desta proteína) e imunomarcadas utilizando anticorpo especifico para laminina. A reconstrução tridimensional (A) e (C) é também visualizada em perfil (B) e (D).

C

A B

D

70

Figura 21. Análise da superfície da lamínula de vidro através de microscopia de força atômica. (A) Análise topográfica de uma área de 50 µm x 50 µm. (B) A varredura realizada na lamínula permitiu avaliação da geometria plana da superfície do vidro, com impurezas de tamanho desprezível. A amplitude verificada foi de 5 nm.

A

B

71

Figura 22. Análise da superfície da membrana de éster de celulose através de microscopia de força atômica. (A) Análise topográfica de uma área de 50 µm x 50 µm. (B) A varredura realizada na membrana permitiu a avaliação da geometria irregular desta superfície. A amplitude verificada neste relevo foi de 10,7 µm.

A

B

72

Uma vez que os dois materiais se mostraram adequados para mimetizar as

geometrias das matrizes de laminina, neurônios do córtex cerebral de ratos

embrionários com 14 dias de nascidos foram cultivados sobre estas superfícies. As

superfícies foram recobertas previamente com laminina na presença de EDTA.

Dessa forma, as moléculas não polimerizadas de laminina podem ser reconhecidas

pelos receptores celulares, de forma que a resposta celular a cada superfície não

irá depender dos epítopos para laminina disponíveis para a ligação, mas apenas da

sua distribuição espacial. As células neuronais responderam diferentemente às

duas topologias sobre as quais elas foram cultivadas. Enquanto na lamínula de

vidro, a superfície lisa induziu neuritogênese acentuada nos neurônios corticais

(Figura 23B e D), na membrana de celulose, a rugosidade não provocou este efeito

(Figura 23A e C), indicando uma sinalização promovida pela geometria do

substrato. A visualização foi realizada através de duas técnicas, primeiro através de

imunomarcação com anticorpo contra a proteína β tubulina III, marcador específico

de neurônio (Figura 23A e B). Na segunda técnica, as superfícies com as células

foram fixadas, desidratadas e recobertas com ouro para visualização através de

microscopia eletrônica de varredura (Figura 23C e D).

Um experimento controle foi realizado em seguida, onde as duas superfícies,

da lamínula e da membrana, foram recobertas com poli-l-ornitina, aminoácido de

carga positiva muito usado para aumentar a aderência das células em cultura. Ao

visualizar a superfície lisa da lamínula através de microscopia ótica (Figura 24A) e

eletrônica (Figura 24B), não foi verificada neuritogênese acentuada nos neurônios

73

observados. Já na superfície rugosa, a membrana de celulose recoberta com poli-l-

ornitina, não houve adesão dos neurônios (dado não mostrado). O resultado

observado indica que a presença da molécula da laminina é importante para que a

sinalização do meio externo seja percebida pela célula, ou seja, uma indução

mecânica/física, mediada pela ligação da laminina com os receptores celulares.

74

Figura 23. Resposta de neurônios corticais à topologia da superfície. Neurônios de córtex cerebral de ratos E14 foram cultivados sobre a superfície lisa da lamínula (A) ou rugosa da membrana (B) e imunomarcadas para β tubulina III. Os dois substratos foram recobertos com laminina na presença de EDTA (que inibe a polimerização da laminina). Apesar da molécula de adesão ser a mesma, a geometria do substrato alterou completamente o comportamento celular. O mesmo efeito pode ser visto através de microscopia eletrônica de varredura (C) e (D). Barra em A, B e D, 50 µm. Barra em C e inset, 10 µm.

75

Figura 24. Neurônios corticais embrionários não respondem à topologia da superfície lisa recoberta com poli-l-ornitina. Neurônios de córtex cerebral de ratos E14 foram cultivados sobre a superfície lisa da lamínula de vidro e imunomarcadas para β tubulina III (A) ou precessadas para microscopia eletrônica de varredura (B). A lamínula foi recoberta previamente com poli-l-ornitina (homopolímero básico utilizado para aumentar a adesão das células à superfície). Na ausência da molécula de laminina, a geometria do substrato não induziu qualquer alteração no comportamento da célula. Barra, 10 µm.

B

A

76

3 A utilização de laminina ácida como terapia em lesão

medular experimental

Um dos principais impedimentos para a regeneração de lesões de medula

espinhal é a impossibilidade dos neurônios danificados voltarem a estender neuritos

através da área lesada. Como, a matriz ácida de laminina se mostrou um excelente

substrato indutor de crescimento neurítico in vitro, decidimos testá-la como uma

possível terapia em lesões experimentais do SNC. Após estabelecer colaboração

com o Dr. Martin Oudega, do International Center for Spinal Cord Injury, iniciamos

os experimentos de injeção da laminina ácida em medulas espinhais de ratos

adultos após indução de contusão moderada (ver Métodos). Nestes experimentos,

ratos adultos após serem submetidos a uma contusão moderada, receberam dois

tipos de tratamento, laminina ácido-induzida (100 µg/mL) e laminina ácido-induzida

somada a células de Schwann (SC). As células de Schwann já foram descritas

como indutoras de regeneração axonal, mielinizacao e recuperação motora na

lesão medular por contusão em ratos (Takami et al., 2002).

O primeiro teste funcional realizado com os animais lesionados foi o teste

conhecido como BBB score, descrito por Basso et al., em 1995. Neste teste, os

animais avaliados recebem uma nota que varia de 0 a 21 indicando o nível de

recuperação dos movimentos das patas traseiras após a lesão medular. Após as

nove semanas de testes, verificamos melhora na recuperação dos animais tratados

77

com laminina e laminina acrescida de células de Schwann (Figura 25). É importante

notar que esta melhora se compara as melhores terapias já descritas na literatura.

O segundo teste funcional realizado, o BBB subscore, é derivado do BBB

score (Lankhorst et al., 1999). No BBB score elementos de função motora mais

avançada como o posicionamento da pata, instabilidade do tronco e posicionamento

da cauda, são avaliados apenas quando os animais apresentam passadas traseiras

e dianteiras coordenadas (alcançado por volta da nota 13). Por esse motivo, foi

desenvolvido um subscore derivado do BBB score para avaliação somente dos

elementos locomotores finos. O resultado deste teste também mostrou uma melhor

recuperação dos animais tratados com laminina somente e laminina e células de

Schwann (Figura 26).

Um outro teste funcional realizado, o Footprint, consiste da análise das

marcas das patas traseiras do animal. As pegadas ficam impressas numa folha de

papel colocada no piso de um corredor de acrílico por onde o animal caminha. Este

teste nos permite avaliar alguns parâmetros como, por exemplo, a base de suporte,

um indicativo da capacidade do animal de sustentação e equilíbrio do corpo (Figura

27). Após a analise, não foi verificada diferença significativa entre os animais

tratados e controles.

78

Figura 25. Teste de locomoção em campo aberto (BBB). Após a injuria medular experimental, o movimento das patas traseiras foi avaliado por dois observadores que desconhecem completamente a identificação dos animais e que executam o teste uma vez por semana durante nove semanas. Durante o teste, os animais são classificados com valores entre 0 e 21, de acordo com seu desempenho. O teste da primeira semana é realizado quatro dias após a contusão e antes da injeção do tratamento. N, nenhum tratamento; M, Meio de Cultura; SC, Células de Schwann; LM+SC, laminina e células de Schwann, LM, laminina. P< 0,05.

BBB score

8

9

10

11

12

13

14

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Semanas após contusão

BB

B s

co

re ±

SE

M

LM

LM+SC

SC

M

N

* * * *

79

BBB subscore

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Semanas após contusão

BB

B s

ub

sc

ore

± S

EM LM

LM+SC

SC

M

N

Figura 26. BBB subscore. O BBB subscore, teste derivado de BBB score, é direcionado para os elementos de função motora mais avançada (posicionamento da pata, instabilidade do tronco e posicionamento da cauda). O teste é realizado da mesma forma que o BBB score e a classificação dos animais é feita por uma tabela com valores entre 0 e 7 pontos. N, nenhum tratamento; M, Meio de Cultura; SC, Células de Schwann; LM+SC, laminina e células de Schwann, LM, laminina. P< 0,05.

80

Base de Suporte

0

1

2

3

4

5

6

Tratamentos

Base d

e s

up

ort

e (

cm

)

N

M

SC

LM+SC

LM

Figura 27. Análise do teste “Footprint”. As patas do animal são cobertas com tinta e ele é induzido a atravessar um corredor estreito. Suas pegadas ficam marcadas numa folha de papel que cobre o piso do corredor. A base de suporte é determinada pela medida da distância dos centros das patas traseiras. N, nenhum tratamento; M, Meio de Cultura; SC, Células de Schwann; LM+SC, laminina e células de Schwann, LM, laminina.

81

Um teste funcional que avalia déficits de controle motor descendente também

foi realizado. No Gridwalk, os animais percorrem um corredor onde existem barras

de metal dispostas irregularmente. Ao atravessar o corredor, o animal precisa

colocar suas patas precisamente sobre as barras. Após a contagem do numero de

erros cometidos pelos animais a cada travessia, observamos uma melhora

pronunciada dos animais tratados tanto nos erros completos, quanto nos deslizes

grandes e no número total de erros (Figura 28). Na execução deste teste, o animal

precisa de coordenação das patas traseiras e dianteiras, que é mediada pelos tratos

ventro-laterais, um sistema retículo espinhal ativo para iniciar o ritmo das passadas,

assim como o controle dos movimentos voluntários, que é mediado principalmente

pelos sistemas córtico-espinhal e rubro-espinhal em ratos. A avaliação mais

complexa realizada pelo Gridwalk é capaz de perceber melhora ou déficits não

aparentes durante a caminhada normal.

Com o objetivo de entender a atuação da laminina na melhora funcional dos

animais, utilizamos o traçador retrógrado Fluorogold. O Fluorogold foi injetado na

região caudal ao epicentro da lesão e os neurônios marcados foram contados na

região rostral à lesão (como é um traçador retrógrado, o Flurogold transportado

pelos axônios chega ao corpo celular). Com o uso deste traçador são marcados os

neurônios regenerados ou neurônios que resistiram à lesão medular, uma vez que

não é possível separar estes dois grupos. O resultado da contagem das células

marcadas (Figura 29) mostrou um aumento no número de neurônios

regenerados/resistentes nos animais tratados nos dando um indício de que a

laminina pode estar atuando positivamente na lesão medular estimulando a

82

regeneração axonal ou atuando como molécula neuroprotetora salvando neurônios

de apoptose.

O efeito da laminina também foi testado através da quantificação do tecido

preservado da lesão. Nesta técnica uma lâmina contendo cortes longitudinais da

medula espinhal do animal é corada com cresil violeta e, as cavidades que

aparecem no tecido, resultantes da lesão, são medidas. Neste tipo de análise não

observamos diferença significativa entre os animais controle, ou seja, que sofreram

lesão, mas não receberam qualquer tratamento, e os tratados com laminina (dado

não mostrado).

O mecanismo pelo qual a laminina promove a melhora dos movimentos dos

animais ainda é desconhecido, mas técnicas como de imunomarcação para

neurônios, astrócitos, macrófagos, estão em andamento para desvendar como se

dá esse efeito.

83

Gridwalk

0

10

20

30

40

50

60

ErroCompleto

DeslizeGrande

DeslizePequeno

Total deerros

Tipos de erros

% d

e e

rro

s

LM

LM+SC

SC

M

N

Figura 28. Análise do teste “Gridwalk”. Os déficits de controle motor descendente foram examinados através da habilidade do animal em percorrer um corredor com barras de metal dispostas irregularmente. Para atravessar o corredor, o animal precisa colocar suas patas precisamente sobre as barras. O número de erros foi contado em cada travessia e um erro médio foi calculado. N, nenhum tratamento; M, Meio de Cultura; SC, Células de Schwann; LM+SC, laminina e células de Schwann, LM, laminina. P< 0,05.

84

Traçador Neuronal (Fluorogold)

0

50

100

150

200

250

300

350

Tratamentos

Nú

mero

de c

élu

las

N

LM+SC

LM

Figura 29. Marcação com o traçador retrógrado Fluorogold. O Fluorogold foi injetado na região caudal a 7 mm do epicentro da contusão, duas semanas antes da perfusão. Sendo o Fluorogold um traçador retrógrado, foram contados os neurônios marcados na região rostral ao epicentro da contusão. N, nenhum tratamento; LM+SC, laminina e células de Schwann, LM, laminina. P< 0,05.

*

85

Discussão

A partir do trabalho de Yurchenco et al., em 1985, demonstrando que a

laminina poderia se auto-polimerizar na ausência da membrana celular ou de

qualquer outro componente da membrana basal, ficou estabelecido que toda a

informação necessária para a formação de polímeros de laminina estava contida na

proteína isolada. Nos anos seguintes, o mesmo grupo descreveu como os

polímeros eram formados na superfície celular, determinando os sulfatídeos como

receptores importantes na iniciação da auto-polimerização em membranas

biológicas (Li et al., 2005). Nas redes de laminina naturalmente construídas apenas

os braços curtos interagem, formando uma folha contínua e hexagonal, enquanto o

braço longo permanece em contato com os receptores de laminina, ou seja,

conectando o polímero à superfície celular.

O fato da laminina poder se auto-polimerizar num sistema livre de células,

abriu a possibilidade de usar polímeros artificiais como substratos para estudar a

resposta celular à matriz subjacente. Neste contexto, tem sido assumido que os

polímeros artificiais descritos em 1985 correspondem exatamente aos polímeros

produzidos pela célula in vivo. Enquanto os polímeros naturais têm sido

morfologicamente caracterizados, a estrutura dos polímeros formados por uma

auto-polimerização in vitro não está disponível para comparação. Além disso,

estudos através de sombreamento rotatório mostraram que as extremidades finais

do braço longo interagem entre si, enquanto tal interação não acontece na rede

natural de laminina. Neste trabalho nós mostramos que a laminina polimerizada em

86

tampão ácido numa concentração baixa de 60 nM (50 µg/mL) produz uma rede

contínua poligonal, formada pela interação apenas dos braços curtos. Nós também

mostramos que com a acidificação do pH do meio, a interação entre as

extremidades dos braços longos fica impedida, uma vez que a carga da superfície

dos domínios LG4-5 se torna completamente positiva. Nossa interpretação é que a

acidificação inibe a ligação dos braços longos estabilizando a interação entre os

braços curtos apenas. Um bloqueio dos braços longos equivalente a este não é

necessário numa situação fisiológica já que a molécula de laminina se liga ao

receptor celular que reconhece sua extremidade distal, como as integrinas α3β1,

α6β1 e α7β1, o distroglican ou os sulfatídeos. Neste caso, a interação com o

receptor irá ocupar o braço longo e impedi-lo de participar na formação do polímero.

Por outro lado, no pH neutro, os braços longos estariam livres para interagir uns

com os outros e desta forma, perturbar a formação do polímero homogêneo que

envolve os braços curtos apenas.

Neste trabalho, nos utilizamos diversas metodologias diretas e indiretas para

demonstrar que os polímeros de laminina formados em tampão ácido são

estruturalmente semelhantes aos polímeros naturais produzidos in vivo pelas

células. Tanto o contraste negativo e o freeze etching seguidos de microscopia

eletrônica, quanto a microscopia de força atômica mostraram uma nítida

correspondência entre a morfologia das matrizes produzidas pelos tumores EHS e

tumores ECC e os induzidos por tampão ácido. Além disso, o uso de fragmentos de

laminina confirmou que, no polímero ácido e no natural, o fragmento E3 não

interfere com a polimerização nem em solução, nem nas matrizes artificiais que são

87

normalmente utilizadas para cultivo de células. Curiosamente, os dados descritos

aqui usando medidas de espalhamento de luz revelaram que E3 desagrega

parcialmente polímeros em pH neutro numa concentração alta de proteína. Outro

fato interessante é que a presença do E3 levou ao rompimento de grandes

agregados observados nas matrizes adsorvidas em pH neutro (Figura 16). Estes

resultados indicam que as interações entre as extremidades dos braços longos que

parecem ocorrer em tampão neutro funcionam na verdade como pontes, ligando

pequenos agregados do polímero poligonal. Estas interações estariam impedindo a

formação de uma rede contínua que pode ser distinguida de polímeros menores

pela técnica do espalhamento de luz, que permite discriminar entre agregados de

proteínas de tamanhos diferentes.

O fato de que os polímeros de laminina obtidos em pH ácido, ao contrário

dos polímeros obtidos em pH neutro, reproduzem in vitro as propriedades

estruturais da matriz natural de laminina, abre novas perspectivas e sugere que

dados obtidos anteriormente em estudos funcionais utilizando laminina polimerizada

em tampão neutro, precisam ser reinterpretados com cuidado. Os polímeros ácidos

podem agora ser utilizados in vitro para estudar suas propriedades de sinalização

para as células sobrejacentes, assim como in vivo, para estudar o papel da laminina

em fenômenos biológicos relacionados ao desenvolvimento embrionário e a

regeneração tecidual.

A diferente organização das moléculas de laminina nos polímeros

preparados em pH ácido e neutro gerou estruturas distintas das matrizes

observadas por microscopia ótica. A matriz polimerizada em pH ácido é

88

bidimensional e, por ser plana, pode ser facilmente observada no microscópio ótico

em um único plano focal. Já a matriz neutra é tridimensional e irregular, o que

dificulta sua visualização, fazendo com que a imagem pareça desfocada (Figura 7).

Utilizando a microscopia confocal, foi possível observar as lamínulas contendo as

matrizes em diferentes fatias óticas que, quando superpostas e observadas

lateralmente, nos permitiram analisar melhor esta suposta diferença de

dimensionalidade. Verificamos então que existe uma rugosidade acentuada na

matriz neutra que não existe na matriz ácida. Já foi mostrado por nosso grupo

(Freire et al., 2004) que as matrizes ácida e neutra induzem respostas distintas em

precursores neurais cultivados sobre elas, sendo que a matriz ácida promove uma

acentuada neuritogênese, muito mais eficiente do que aquela observada na matriz

neutra. Para avaliar a influência das topologias das duas matrizes na resposta

destas células, utilizamos dois substratos com rugosidade semelhante à das

matrizes neutra e ácida com o objetivo de mimetizar estas organizações

bidimensional e tridimensional. As superfícies da lamínula de vidro e da membrana

de celulose foram recobertas com laminina não polimerizada para permitir a ligação

da proteína com seus receptores celulares. Após 24 horas de cultura, os neurônios

corticais cultivados sobre o substrato plano, escolhido para mimetizar a matriz

ácida, emitiram diversos neuritos, o que não aconteceu no substrato rugoso,

indicando uma ligação entre a topologia e a resposta celular.

Existem evidências de que a arquitetura celular possa responder de forma

integrada aos sinais vindos do meio exterior. Ingber propôs em 1997, o modelo de

“tensegrity”, no qual as células respondem a estresse e alterações no ambiente

89

físico através da mobilização de uma superestrutura unificada, que envolve as

proteínas da matriz, seus receptores e o citoesqueleto.

De fato, as informações provenientes da matriz extracelular podem ser

transferidas para o interior da célula através dos chamados pontos de adesão

focais. Nestes sítios na membrana plasmática, distorções na MEC são percebidas

pela célula através de receptores transmembrana, como as integrinas. As integrinas

por sua vez, estão conectadas ao citoesqueleto e à inúmeras proteínas associadas

à actina como talina, vinculina, paxilina e zyxina. O citoesqueleto, desta forma, pode

responder mecanicamente com um rearranjo de microfilamentos de actina,

microtúbulos e filamentos intermediários (Ingber, 2006).

Corroborando este modelo está o fato de que em células musculares, a

polimerização da laminina na face externa da membrana plasmática induz uma

reorganização de seus receptores transmembrana, a integrina e o distroglican, e de

elementos do citoesqueleto, a vinculina e a distrofina (Colognato et al., 1999).

Além disso, nas células endoteliais, que se localizam entre a matriz

extracelular e a corrente sanguínea, alterações detectadas na velocidade do fluxo

sanguíneo podem ser traduzidas em sinais celulares. Mudanças na velocidade do

fluxo sanguíneo, por exemplo, são detectadas nos sítios de adesão focal das

células endoteliais. Nestes sítios, a ligação da laminina à integrina e à proteína

ligante de laminina (LBP), promove a expressão aumentada da oxido nítrico sintase

endotelial (eNOS) (Gloe e Pohl, 2002).

Em células não neuronais, as integrinas agregadas nos contatos focais se

ligam à vinculina, talina e tirosina kinase no interior da célula. Nos neurônios,

90

entretanto, existem os chamados pontos de contato que são sítios de adesão

estruturalmente distintos dos contatos focais. Arregui et al., em 1994, utilizaram o

detergente não-iônico Triton-X100 para solubilizar a membrana plasmática de

células neuronais PC12, e analisaram a distribuição das integrinas nos pontos de

contato e sua associação com o citoesqueleto. Nos pontos de contato das células

cultivadas sobre laminina ou sobre colágeno, as integrinas estavam associadas

firmemente ao citoesqueleto da célula. Entretanto, nas células cultivadas sobre poli-

lisina não houve esta associação indicando a importância do substrato estar

recoberto por proteínas da matriz extracelular. Desta forma, a interação com o

ligante dispara uma associação com o citoesqueleto e induz a interação do cone de

crescimento com o substrato (Arregui et al., 1994).

Os cones de crescimento, as extremidades mais distais dos neuritos, têm a

capacidade de reconhecer fatores físicos e químicos do ambiente que apresentem

papel indutor ou inibitório do crescimento axonal. Esta função é mediada pelos

filopódios presentes no cone de crescimento. Quando os filopódios encontram uma

superfície favorável ao crescimento neurítico, eles se estabilizam e recrutam

microtúbulos e filamentos de actina, induzindo desta forma, o crescimento do

neurito numa determinada direção (Rajnicek e McCaig. 1997). O recrutamento dos

filamentos de actina pode estar sendo desencadeado pela ligação das integrinas

presentes nos filopódios (Arregui et al., 1994).

Esta capacidade investigativa/exploratória do cone de crescimento pode

levar a um atraso no crescimento neurítico quando as superfícies são muito

irregulares. De fato, experimentos realizados em superfícies frisadas ou lisas,

91

recobertas com laminina, mostraram uma taxa maior de crescimento neurítico nas

superfícies lisas (Miller et al., 2002). A hipótese de que o crescimento neurítico em

nossos experimentos esteja sendo bloqueado por um impedimento físico imposto

pela rugosidade do meio, não poderia explicar a ausência total de neuritogênese

observada na Figura 23, e sim um atraso na velocidade do crescimento.

Os neurônios de córtex cerebral foram cultivados sobre a superfície lisa da

lamínula de vidro e rugosa da membrana de celulose, ambas recobertas com poli-L-

ornitina. Não foi verificada indução acentuada de neuritogênese na superfície lisa e

não foram visualizadas células neuronais sobre a superficie rugosa. A necessidade

da presença da molécula da laminina para que haja uma resposta celular indica o

envolvimento dos receptores de laminina na sinalização intracelular na

neuritogênese.

Tem sido proposto que o crescimento neurítico mediado por laminina envolva

a sinalização por proteína kinase C (PKC) (Bixby, 1989, Ari-Pires e Linden, 2000).

Ao investigar a via de sinalização envolvida no crescimento axonal sobre as

matrizes ácida e neutra, nosso grupo verificou que enquanto nos neurônios do

córtex cerebral cultivados sobre a matriz neutra, o crescimento neurítico é mediado

pela PKC, na matriz ácida a neuritogênese depende de sinalização envolvendo a

proteína kinase A (PKA) (Freire et al., 2002). Experimentos em andamento no nosso

laboratório, utilizando inibidores para a PKA e PKC, irão responder em breve qual a

via de sinalização envolvida na neuritogênese observada na lamínula de vidro

recoberta com laminina não polimerizada.

92

É interessante notar que embora a laminina tenha sido nitidamente apontada

como um substrato instrutivo tanto para o desenvolvimento quanto para a

regeneração do sistema nervoso, pouco benefício tem sido associado ao uso da

laminina na regeneração da lesão medular. Considerando isso, nós resolvemos

avaliar o polímero de laminina ácida e seu papel indutor de neuritogenese in vitro,

como terapia para regeneração axonal nas lesões medulares experimentais.

Os experimentos de injeção de laminina ácida em ratos submetidos a injúria

experimental, foram realizados no laboratório do Dr. Martin Oudega na University of

Miami, em Miami e na Johns Hopkins University, em Baltimore. Nestes

experimentos 151 ratas divididas em 5 grupos (3 controles e 2 tratados) foram

submetidas a uma contusão moderada induzida por aparelho desenvolvido na New

York University, o NYU Impactor. Um intervalo de 10 dias foi dado entre o dia que

os animais sofreram a contusão e o dia em que os animais receberam a injeção do

tratamento. Este intervalo teve o objetivo de evitar o processo inflamatório

exacerbado que se inicia logo após a lesão, evitando desta forma que macrófagos

pudessem endocitar a laminina e impedir sua atuação na regeneração.

Os resultados preliminares envolvem principalmente testes funcionais que

avaliam a recuperação dos movimentos das patas traseiras dos animais. Nos quatro

testes realizados, foi observada uma melhora discreta nos animais quando

avaliados através de BBB score e uma melhora acentuada nas análises de BBB

subscore e de gridwalk . Sendo que estes últimos envolvem uma avaliação de

movimentos mais complexos.

93

O mecanismo pelo qual a laminina promoveu a melhora dos movimentos dos

animais ainda é desconhecido, mas técnicas como imunohistoquímica para

neurônios, astrócitos e macrófagos estão em andamento para descobrir de que

forma a laminina ácida está atuando neste modelo de lesão. A imunomarcação com

anticorpos contra a proteína GAP- 43 (growth associated protein-43), vai nos dar

informações sobre a regeneração neuronal, uma vez que a proteína GAP-43 é

encontrada em neurônios em crescimento. Já a visualização dos astrócitos através

de imunomarcão para GFAP (glial fibrillary acidic protein) permitirá a observação de

alterações na extensão da cicatriz glial formada por estas células. A utilização do

anticorpo ED-1, utilizado para visualização dos macrófagos, possibilitará a

verificação de alterações no nível de inflamação dos animais tratados ou não.

O fato de que a melhora induzida pela laminina ácida ocorreu com maior

intensidade nos tempos iniciais após a lesão, leva à interpretação de que a laminina

poderia estar protegendo o tecido do processo degenerativo que se segue à lesão,

seja através de uma redução do dano secundário orquestrado pela reação

inflamatória, seja por um efeito neuroprotetor.

A injeção do traçador retrógrado Fluorogold avalia a regeneração ou

sobrevivência dos neurônios após a contusão. Os neurônios marcados com

Fluorogold apresentam vesículas e grânulos com cor dourada em seu citoplasma

mas não no núcleo. Durante esta análise, são contadas as células marcadas com o

traçador e, como não foi possível distinguir as células regeneradas das resistentes,

a análise é feita em conjunto (Toshihiro et al., 2002). Vale lembrar que o modelo de

contusão medular aqui utilizado foi gerado pelo sistema NYU Impactor. Este

94

sistema, acoplado a um computador, permite calcular a curva de impacto e desta

forma promover lesões altamente reprodutíveis e controladas. Parâmetros como

velocidade do impacto, distância da compressão e níveis de compressão são

obtidos a cada animal lesionado e descrevem em detalhes a severidade do trauma

(Chadi et al., 2001).

Os resultados da marcação com Fluorogold mostraram também aumento

discreto, mas significativo dos neurônios regenerados/resistentes nos animais

tratados, indicando que esta poderia ser uma das razões para o melhor

desempenho destes animais nos testes funcionais.

Outra possibilidade para o mecanismo de atuação da laminina ácida poderia

ser a redução de processos inflamatórios. Células inflamatórias como os

macrófagos/microglia são capazes de aumentar ainda mais a extensão do dano

tecidual pós-lesão num processo conhecido como dano secundário. De fato,

experimentos realizados em nosso laboratório utilizando ratos submetidos à

transecção total da medula espinhal, mostraram que a laminina ácida injetada na

medula minutos após a lesão medular possui um potente efeito anti-inflamatório.

Nestes experimentos, a laminina ácida foi injetada na região da medula logo acima

da área da transecção (no chamado coto proximal) e induziu uma melhora funcional

nos ratos, verificada através do aumento de quase 50% no BBB score dos animais

tratados (Menezes et al., manuscrito em preparação). O nível de inflamação foi

medido através de três metodologias diferentes: a dosagem proteína C reativa,

imunomarcacao para macrófagos utilizando o anticorpo ED1 e técnica histológica

hematoxilina e eosina (HE). Foi verificada uma diminuição da inflamação para os

95

níveis séricos logo na primeira semana após a injeção do tratamento. Nas análises

realizadas nesta tese o intervalo de dez dias antes da injeção do tratamento pode

ter impedido a verificação dos efeitos antiinflamatórios da laminina ácida.

A adição das células de Schwann ao tratamento com laminina ácida não

induziu qualquer melhora nos testes funcionais além da melhora que já tinha sido

observada com a injeção de laminina ácida apenas. Este dado indica que as células

não tiveram efeito benéfico, o que é compatível com a observação de que células

de Schwann isoladas não promovem melhora funcional (essa tese e Pearce et al.

2004).

A injeção de laminina ácida 10 dias após injúria da medula espinhal por

contusão moderada é capaz de aumentar o número de fibras remanescentes 8

semanas após a lesão, o que é acompanhado por uma significativa recuperação da

função locomotora, sugerindo que a laminina ácidas possa ser uma candidata

promissora no tratamento de lesões de SNC 4.

4 Patente submetida ao Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI).

96

Conclusão

A análise da ultraestrutura da molécula de laminina polimerizada em pH ácido

mostrou uma organização semelhante à observada nas matrizes encontradas in vivo.

Esta estrutura é resultado de uma polimerização envolvendo apenas os braços curtos

desta proteína, como foi verificado através dos ensaios de polimerização na presença

de fragmentos de laminina. O impedimento para a ligação entre os braços longos da

laminina em pH ácido pode ser a presença acentuada de cargas positivas na

extremidade do braço longo. In vivo, os receptores na superfície da célula é que se

ligam ao braço longo e impedem o envolvimento desta região na formação da matriz.

As matrizes de laminina formadas em pH ácido são capazes de induzir

neuritogênese acentuada em neurônios do córtex de ratos embrionários. Esta resposta

das células neuronais também foi observada em células cultivadas sobre superfícies

lisas recobertas com laminina não-polimerizada. As superfícies rugosas recobertas

com laminina não-polimerizada não foram capazes de induzir neuritogênese, indicando

que existe um reconhecimento pelas células da textura do substrato em que elas se

encontram.

A capacidade da laminina ácida de induzir neuritogênese em explantes de

córtex de ratos nascidos foi testada in vivo através da injeção de laminina polimerizada

em pH ácido em ratos submetidos à lesão medular experimental. Os testes funcionais

realizados nos animais mostraram uma melhora na movimentação das patas dos

animais. O efeito benéfico da laminina ácida na lesão medular pode estar associado

ao aumento na regeneração/proteção dos neurônios localizados acima da área da

lesão.

97

1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Walter, P., Em: Biologia Molecular da Célula. 4º ed. (2002) Garland Science, New York. 1106- 1111.

2. Arregui, C. O., Carbonetto, S. & McKerracher, L. Characterization of

neural cell adhesion sites: point contacts are the sites of interaction between integrins and the cytoskeleton in PC12 cells. J Neurosci 14, 6967-77 (1994).

3. Aumailley, M., Wiedemann, H., Mann, K. & Timpl, R. Binding of nidogen

and the laminin-nidogen complex to basement membrane collagen type IV. Eur J Biochem 184, 241-8 (1989).

4. Aumailley, M., Timpl, R. & Sonnenberg, A. Antibody to integrin alpha 6

subunit specifically inhibits cell-binding to laminin fragment 8. Exp Cell Res 188, 55-60 (1990).

5. Aumailley, M. & Krieg, T. Laminins: a family of diverse multifunctional

molecules of basement membranes. J Invest Dermatol 106, 209-214 (1996).

6. Aumailley, M. et al. A simplified laminin nomenclature. Matrix Biol 24, 326-

32 (2005).

7. Baker, N. A., Sept, D., Joseph, S., Holst, M. J. & McCammon, J. A.

Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 10037-41 (2001).

8. Basso, D. M., Beattie, M. S. & Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable

locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995).

9. Beck, K., Hunter, I. & Engel, J. Structure and function of laminin: anatomy

of a multidomain glycoprotein. Faseb J 4, 148-60 (1990). 10. Bixby, J. L. Protein kinase C is involved in laminin stimulation of neurite

outgrowth. Neuron 3, 287-97 (1989).

98

11. Bloch, R. J., Bezakova, G., Ursitti, J. A., Zhou, D. & Pumplin, D. W. A membrane skeleton that clusters nicotinic acetylcholine receptors in muscle. Soc Gen Physiol Ser 52, 177-95 (1997).

12. Boot-Handford, R. P., Kurkinen, M. & Prockop, D. J. Steady-state levels of

mRNAs coding for the type IV collagen and laminin polypeptide chains of basement membranes exhibit marked tissue-specific stoichiometric variations in the rat. J Biol Chem 262, 12475-8 (1987).

13. Bracken, M. B. et al. Methylprednisolone or naloxone treatment after acute

spinal cord injury: 1-year follow-up data. Results of the second National Acute Spinal Cord Injury Study. J Neurosurg 76, 23-31 (1992).

14. Bracken, M. B. et al. Methylprednisolone or tirilazad mesylate

administration after acute spinal cord injury: 1-year follow up. Results of the third National Acute Spinal Cord Injury randomized controlled trial. J Neurosurg 89, 699-706 (1998).

15. Brancaccio, A., Schulthess, T., Gesemann, M. & Engel, J. Electron

microscopic evidence for a mucin-like region in chick muscle alpha-dystroglycan. FEBS Lett 368, 139-42 (1995).

16. Brauer, P. R. & Keller, J. M. Ultrastructure of a model basement

membrane lacking type IV collagen. Anat Rec 223, 376-83 (1989).

17. Brockes, J. P., Fields, K. L. & Raff, M. C. Studies on cultured rat Schwann

cells. I. Establishment of purified populations from cultures of peripheral nerve. Brain Res 165, 105-18 (1979).

18. Bruch, M., Landwehr, R. & Engel, J. Dissection of laminin by cathepsin G

into its long-arm and short-arm structures and localization of regions involved in calcium dependent stabilization and self-association. Eur J Biochem 185, 271-9 (1989).

19. Burgeson, R. E. et al. A new nomenclature for the laminins. Matrix Biol 14,

209-11 (1994). 20. Chadi, D., Andrade, M. S., Leme, R. J. & Gomide, V. C. Int. J. Neurosci.

111 (3-4), 137-165 (2001).

99

21. Charonis, A. S., Tsilibary, E. C., Yurchenco, P. D. & Furthmayr, H. Binding of laminin to type IV collagen: a morphological study. J Cell Biol 100, 1848-53 (1985).

22. Charonis, A. S., Tsilibary, E. C., Saku, T. & Furthmayr, H. Inhibition of

laminin self-assembly and interaction with type IV collagen by antibodies to the terminal domain of the long arm. J Cell Biol 103, 1689-97 (1986).

23. Chen, M. S. et al. Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth

inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1. Nature 403, 434-9 (2000).

24. Chiba, A. et al. Structures of sialylated O-linked oligosaccharides of

bovine peripheral nerve alpha-dystroglycan. The role of a novel O-mannosyl-type oligosaccharide in the binding of alpha-dystroglycan with laminin. J Biol Chem 272, 2156-62 (1997).

25. Colognato, H., Winkelmann, D. A. & Yurchenco, P. D. Laminin

polymerization induces a receptor-cytoskeleton network. J Cell Biol 145, 619-31 (1999).

26. Colognato, H. & Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of

heterotrimers. Dev Dyn 218, 213-34 (2000).

27. Colognato-Pyke, H. et al. Mapping of network-forming, heparin-binding,

and alpha 1 beta 1 integrin-recognition sites within the alpha-chain short arm of laminin-1. J Biol Chem 270, 9398-406 (1995).

28. David, S. & Aguayo, A. J. Axonal elongation into peripheral nervous

system "bridges" after central nervous system injury in adult rats. Science 214, 931-3 (1981).

29. David, S. & Lacroix, S. Molecular approaches to spinal cord repair. Annu

Rev Neurosci 26, 411-40 (2003).

30. de Ary-Pires, R. & Linden, R. Laminin modulates neuritogenesis of

developing rat retinal ganglion cells through a protein kinase C-dependent pathway. J Neurosci Res 60, 291-301 (2000).

100

31. de Medinaceli, L., Freed, W. J. & Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Exp Neurol 77, 634-43 (1982).

32. Dean, J. W., 3rd, Chandrasekaran, S. & Tanzer, M. L. A biological role of

the carbohydrate moieties of laminin. J Biol Chem 265, 12553-62 (1990). 33. DiPersio, C. M., Hodivala-Dilke, K. M., Jaenisch, R., Kreidberg, J. A. &

Hynes, R. O. alpha3beta1 Integrin is required for normal development of the epidermal basement membrane. J Cell Biol 137, 729-42 (1997).

34. Durbeej, M. et al. Non-muscle alpha-dystroglycan is involved in epithelial

development. J Cell Biol 130, 79-91 (1995). 35. Durbeej, M. et al. Expression of laminin alpha 1, alpha 5 and beta 2 chains

during embryogenesis of the kidney and vasculature. Matrix Biol 15, 397-413 (1996).

36. Durbeej, M. & Ekblom, P. Dystroglycan and laminins: glycoconjugates

involved in branching epithelial morphogenesis. Exp Lung Res 23, 109-18 (1997).

37. El Nemer, W. et al. The Lutheran blood group glycoproteins, the erythroid

receptors for laminin, are adhesion molecules. J Biol Chem 273, 16686-93 (1998).

38. Elchebly, M. et al. Neuroendocrine dysplasia in mice lacking protein

tyrosine phosphatase sigma. Nat Genet 21, 330-3 (1999). 39. Engel, J. et al. Shapes, domain organizations and flexibility of laminin and

fibronectin, two multifunctional proteins of the extracellular matrix. J Mol Biol 150, 97-120 (1981).

40. Engel, J. EGF-like domains in extracellular matrix proteins: localized

signals for growth and differentiation? FEBS Lett 251, 1-7 (1989). 41. Farquhar, M. G., The glomerular basement membrane. In: Cell Biology of

the Extracelular Matrix. E. D. Hay, Editor. Plenum Press, New York. 335-378.

101

42. Fawcett, J. W. & Asher, R. A. The glial scar and central nervous system

repair. Brain Res Bull 49, 377-91 (1999). 43. Fitch, M. T., Doller, C., Combs, C. K., Landreth, G. E. & Silver, J. Cellular

and molecular mechanisms of glial scarring and progressive cavitation: in vivo and in vitro analysis of inflammation-induced secondary injury after CNS trauma. J Neurosci 19, 8182-98 (1999).

44. Fox, J. W. et al. Recombinant nidogen consists of three globular domains

and mediates binding of laminin to collagen type IV. Embo J 10, 3137-46 (1991).

45. Freire, E. & Coelho-Sampaio, T. Self-assembly of laminin induced by

acidic pH. J Biol Chem 275, 817-22 (2000).

46. Freire, E., Gomes, F. C., Linden, R., Neto, V. M. & Coelho-Sampaio, T.

Structure of laminin substrate modulates cellular signaling for neuritogenesis. J Cell Sci 115, 4867-76 (2002).

47. Freire, E. et al. Sialic acid residues on astrocytes regulate neuritogenesis

by controlling the assembly of laminin matrices. J Cell Sci 117, 4067-76 (2004).

48. Garcia-Abreu, J., Cavalcante, L. A. & Moura Neto, V. Differential patterns

of laminin expression in lateral and medial midbrain glia. Neuroreport 6, 761-4 (1995).

49. Garcia-Abreu, J., Moura Neto, V., Carvalho, S. L. & Cavalcante, L. A.

Regionally specific properties of midbrain glia: I. Interactions with midbrain neurons. J Neurosci Res 40, 471-7 (1995).

50. Gee, S. H. et al. Laminin-binding protein 120 from brain is closely related

to the dystrophin-associated glycoprotein, dystroglycan, and binds with high affinity to the major heparin binding domain of laminin. J Biol Chem 268, 14972-80 (1993).

51. Gershon, T. R., Baker, M. W., Nitabach, M. & Macagno, E. R. The leech

receptor protein tyrosine phosphatase HmLAR2 is concentrated in growth cones and is involved in process outgrowth. Development 125, 1183-90 (1998).

102

52. Gimenez y Ribotta, M. & Privat, A. Biological interventions for spinal cord

injury. Curr Opin Neurol 11, 647-54 (1998). 53. Gloe, T. & Pohl, U. Laminin binding conveys mechanosensing in

endothelial cells. News Physiol Sci 17, 166-9 (2002).

54. GrandPre, T., Nakamura, F., Vartanian, T. & Strittmatter, S. M.

Identification of the Nogo inhibitor of axon regeneration as a Reticulon protein. Nature 403, 439-44 (2000).

55. Gruner, J. A. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat.

J Neurotrauma 9, 123-6; discussion 126-8 (1992).

56. Hall, H., Liu, L., Schachner, M. & Schmitz, B. The L2/HNK-1 carbohydrate

mediates adhesion of neural cells to laminin. Eur J Neurosci 5, 34-42 (1993).

57. Hall, H., Carbonetto, S. & Schachner, M. L1/HNK-1 carbohydrate- and

beta 1 integrin-dependent neural cell adhesion to laminin-1. J Neurochem 68, 544-53 (1997).

58. Harrison, D. et al. Crystal structure and cell surface anchorage sites of

laminin alpha1LG4-5. J Biol Chem 282, 11573-81 (2007). 59. Henry, M. D. & Campbell, K. P. A role for dystroglycan in basement

membrane assembly. Cell 95, 859-70 (1998).

60. Hinek, A., Rabinovitch, M., Keeley, F., Okamura-Oho, Y. & Callahan, J.

The 67-kD elastin/laminin-binding protein is related to an enzymatically inactive, alternatively spliced form of beta-galactosidase. J Clin Invest 91, 1198-205 (1993).

61. Hunter, D. D., Llinas, R., Ard, M., Merlie, J. P. & Sanes, J. R. Expression

of s-laminin and laminin in the developing rat central nervous system. J Comp Neurol 323, 238-51 (1992).

103

62. Ibraghimov-Beskrovnaya, O. et al. Human dystroglycan: skeletal muscle cDNA, genomic structure, origin of tissue specific isoforms and chromosomal localization. Hum Mol Genet 2, 1651-7 (1993).

63. Ingber, D. E. Tensegrity: the architectural basis of cellular

mechanotransduction. Annu Rev Physiol 59, 575-99 (1997).

64. Inger, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together

again. FASEB J. 20, 811-827 (2006). 65. Jeffery, N. D. & Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by

experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain 120 ( Pt 1), 27-37 (1997).

66. Kalb, E. & Engel, J. Binding and calcium-induced aggregation of laminin

onto lipid bilayers. J Biol Chem 266, 19047-52 (1991). 67. Karnovsky, J. M. (1965). A formaldehyde / glutaraldehyde fixative of high

molality for use in electron microscopy. Abst. Of the 5th Annual Meeting of Cell Biology. J. Cell. Biol., 27: 137.

68. Kibbey, M. C. et al. beta-Amyloid precursor protein binds to the neurite-

promoting IKVAV site of laminin. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 10150-3 (1993).

69. Kleinman, H. K. et al. Isolation and characterization of type IV procollagen,

laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry 21, 6188-93 (1982).

70. Kleinman, H. K. et al. Genes for basement membrane proteins are

coordinately expressed in differentiating F9 cells but not in normal adult murine tissues. Dev Biol 122, 373-8 (1987).

71. Kleinman, H. K. et al. Identification of a 110-kDa nonintegrin cell surface

laminin-binding protein which recognizes an A chain neurite-promoting peptide. Arch Biochem Biophys 290, 320-5 (1991).

72. Knibbs, R. N., Perini, F. & Goldstein, I. J. Structure of the major

concanavalin A reactive oligosaccharides of the extracellular matrix component laminin. Biochemistry 28, 6379-92 (1989).

104

73. Kramer, R. H. et al. Laminin-binding integrin alpha 7 beta 1: functional

characterization and expression in normal and malignant melanocytes. Cell Regul 2, 805-17 (1991).

74. Krueger, N. X. et al. The transmembrane tyrosine phosphatase DLAR

controls motor axon guidance in Drosophila. Cell 84, 611-22 (1996). 75. Kwon, B. K., Tetzlaff, W., Grauer, J. N., Beiner, J. & Vaccaro, A. R.

Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury. Spine J 4, 451-64 (2004).

76. Lallier, T. & Bronner-Fraser, M. Avian neural crest cell attachment to

laminin: involvement of divalent cation dependent and independent integrins. Development 113, 1069-84 (1991).

77. Lankhorst, A. J. et al. Functional recovery after central infusion of alpha-

melanocyte-stimulating hormone in rats with spinal cord contusion injury. J Neurotrauma 16, 323-31 (1999).

78. Letourneau, P. C., Madsen, A. M., Palm, S. L. & Furcht, L. T.

Immunoreactivity for laminin in the developing ventral longitudinal pathway of the brain. Dev Biol 125, 135-44 (1988).

79. Li, S. et al. Matrix assembly, regulation, and survival functions of laminin

and its receptors in embryonic stem cell differentiation. J Cell Biol 157, 1279-90 (2002).

80. Li, S. et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane

assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. J Cell Biol 169, 179-89 (2005).

81. Liesi, P. Do neurons in the vertebrate CNS migrate on laminin? Embo J 4,

1163-70 (1985).

82. Liesi, P. & Silver, J. Is astrocyte laminin involved in axon guidance in the

mammalian CNS? Dev Biol 130, 774-85 (1988). 83. Liesi, P. & Risteli, L. Glial cells of mammalian brain produce a variant form

of laminin. Exp Neurol 105, 86-92 (1989).

105

84. Liesi, P. & Kauppila, T. Induction of type IV collagen and other basement-

membrane-associated proteins after spinal cord injury of the adult rat may participate in formation of the glial scar. Exp Neurol 173, 31-45 (2002).

85. Luckenbill-Edds, L. Laminin and the mechanism of neuronal outgrowth.

Brain Res Brain Res Rev 23, 1-27 (1997).

86. Malinda, K. M. & Kleinman, H. K. The laminins. Int J Biochem Cell Biol 28,

957-9 (1996). 87. Mann, K., Deutzmann, R. & Timpl, R. Characterization of proteolytic

fragments of the laminin-nidogen complex and their activity in ligand-binding assays. Eur J Biochem 178, 71-80 (1988).

88. McKee, K. K., Harrison, D., Capizzi, S. & Yurchenco, P. D. Role of laminin

terminal globular domains in basement membrane assembly. J Biol Chem 282, 21437-47 (2007).

89. McKeon, R. J., Schreiber, R. C., Rudge, J. S. & Silver, J. Reduction of

neurite outgrowth in a model of glial scarring following CNS injury is correlated with the expression of inhibitory molecules on reactive astrocytes. J Neurosci 11, 3398-411 (1991).

90. Mecham, R. P., Hinek, A., Griffin, G. L., Senior, R. M. & Liotta, L. A. The

elastin receptor shows structural and functional similarities to the 67-kDa tumor cell laminin receptor. J Biol Chem 264, 16652-7 (1989).

91. Mercuri, E. et al. Sequential study of central and peripheral nervous

system involvement in an infant with merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 6, 425-9 (1996).

92. Miller, C., Jeftinija, S. & Mallapragada, S. Synergistic effects of physical

and chemical guidance cues on neurite alignment and outgrowth on biodegradable polymer substrates. Tissue Eng 8, 367-78 (2002).

93. Miner, J. H. et al. The laminin alpha chains: expression, developmental

transitions, and chromosomal locations of alpha1-5, identification of heterotrimeric laminins 8-11, and cloning of a novel alpha3 isoform. J Cell Biol 137, 685-701 (1997).

106

94. Miner, J. H., Cunningham, J. & Sanes, J. R. Roles for laminin in

embryogenesis: exencephaly, syndactyly, and placentopathy in mice lacking the laminin alpha5 chain. J Cell Biol 143, 1713-23 (1998).

95. Miner, J. H. & Yurchenco, P. D. Laminin functions in tissue

morphogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 255-84 (2004).

96. Minetti, C., Bado, M., Morreale, G., Pedemonte, M. & Cordone, G.

Disruption of muscle basal lamina in congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Neurology 46, 1354-8 (1996).

97. Morgenstern, D. A., Asher, R. A. & Fawcett, J. W. Chondroitin sulphate

proteoglycans in the CNS injury response. Prog Brain Res 137, 313-32 (2002).

98. Morrissey, T. K., Kleitman, N. & Bunge, R. P. Isolation and functional

characterization of Schwann cells derived from adult peripheral nerve. J Neurosci 11, 2433-42 (1991).

99. Morshead, C. M. et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain:

a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron 13, 1071-82 (1994).

100. Murray, P. & Edgar, D. Regulation of programmed cell death by basement

membranes in embryonic development. J Cell Biol 150, 1215-21 (2000). 101. Nakano, A. et al. Laminin 5 mutations in junctional epidermolysis bullosa:

molecular basis of Herlitz vs. non-Herlitz phenotypes. Hum Genet 110, 41-51 (2002).

102. Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth inhibitors in gliotic tissue. Adv Exp

Med Biol 468, 207-24 (1999). 103. O'Grady, P., Thai, T. C. & Saito, H. The laminin-nidogen complex is a

ligand for a specific splice isoform of the transmembrane protein tyrosine phosphatase LAR. J Cell Biol 141, 1675-84 (1998).

107

104. Paulsson, M. et al. Laminin-nidogen complex. Extraction with chelating agents and structural characterization. Eur J Biochem 166, 11-9 (1987).

105. Pearse, D. D. et al. cAMP and Schwann cells promote axonal growth and

functional recovery after spinal cord injury. Nat Med 10, 610-6 (2004).

106. Rajnicek, A. M. & McCaig, C. D. Guidance of CNS growth cones by

substratum grooves and ridges: effects of inhibitors of the cytoskeleton, calcium channels and signal transduction pathways. J. Cell Sci. 110, 2915-2924 (1997).

107. Ramer, L. M., Ramer, M. S. & Steeves, J. D. Setting the stage for

functional repair of spinal cord injuries: a cast of thousands. Spinal Cord 43, 134-61 (2005).

108. Reynolds, B. A. & Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from

isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 255, 1707-10 (1992).

109. Roberts, D. D. et al. Laminin binds specifically to sulfated glycolipids. Proc

Natl Acad Sci U S A 82, 1306-10 (1985).

110. Roberts, D. D. Sulfatide-binding proteins. Chem Phys Lipids 42, 173-83

(1986). 111. Roberts, D. D., Wewer, U. M., Liotta, L. A. & Ginsburg, V. Laminin-

dependent and laminin-independent adhesion of human melanoma cells to sulfatides. Cancer Res 48, 3367-73 (1988).

112. Rousselle, P. et al. Laminin 5 binds the NC-1 domain of type VII collagen.

J Cell Biol 138, 719-28 (1997). 113. Runyan, R. B., Maxwell, G. D. & Shur, B. D. Evidence for a novel

enzymatic mechanism of neural crest cell migration on extracellular glycoconjugate matrices. J Cell Biol 102, 432-41 (1986).

114. Ryan, M. C. et al. The functions of laminins: lessons from in vivo studies.

Matrix Biol 15, 369-81 (1996).

108

115. Sasaki, M., Kato, S., Kohno, K., Martin, G. R. & Yamada, Y. Sequence of the cDNA encoding the laminin B1 chain reveals a multidomain protein containing cysteine-rich repeats. Proc Natl Acad Sci U S A 84, 935-9 (1987).

116. Sasaki, M. & Yamada, Y. The laminin B2 chain has a multidomain

structure homologous to the B1 chain. J Biol Chem 262, 17111-7 (1987). 117. Sasaki, M., Kleinman, H. K., Huber, H., Deutzmann, R. & Yamada, Y.

Laminin, a multidomain protein. The A chain has a unique globular domain and homology with the basement membrane proteoglycan and the laminin B chains. J Biol Chem 263, 16536-44 (1988).

118. Sasaki, Y. et al. Abnormalities of basal cell keratin in epidermolysis

bullosa simplex do not affect the expression patterns of suprabasal keratins and cornified cell envelope proteins. Arch Dermatol Res 290, 591-7 (1998).

119. Schaapveld, R. Q. et al. Impaired mammary gland development and

function in mice lacking LAR receptor-like tyrosine phosphatase activity. Dev Biol 188, 134-46 (1997).

120. Schittny, J. C. & Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of

basement membrane laminin are critical for its self-assembly. J Cell Biol 110, 825-32 (1990).

121. Schwab, M. E. & Bartholdi, D. Degeneration and regeneration of axons in

the lesioned spinal cord. Physiol Rev 76, 319-70 (1996).

122. Shorer, Z., Philpot, J., Muntoni, F., Sewry, C. & Dubowitz, V.

Demyelinating peripheral neuropathy in merosin-deficient congenital muscular dystrophy. J Child Neurol 10, 472-5 (1995).

123. Smalheiser, N. R. & Collins, B. J. Characterization of a novel set of

membrane antigens associated with axonal growth. I. Biochemical and functional studies. Brain Res Dev Brain Res 69, 215-23 (1992).

124. Smalheiser, N. R. & Kim, E. Purification of cranin, a laminin binding

membrane protein. Identity with dystroglycan and reassessment of its carbohydrate moieties. J Biol Chem 270, 15425-33 (1995).

109

125. Smith, E. J., Blakemore, W. F. & McDonald, W. I. Central remyelination

restores secure conduction. Nature 280, 395-6 (1979).

126. Smyth, N. et al. Absence of basement membranes after targeting the

LAMC1 gene results in embryonic lethality due to failure of endoderm differentiation. J Cell Biol 144, 151-60 (1999).

127. Sonnenberg, A. et al. Integrin recognition of different cell-binding

fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. J Cell Biol 110, 2145-55 (1990).

128. Sorokin, L. M. et al. Monoclonal antibodies against laminin A chain

fragment E3 and their effects on binding to cells and proteoglycan and on kidney development. Exp Cell Res 201, 137-44 (1992).

129. Sorokin, L. M. et al. Developmental regulation of the laminin alpha5 chain

suggests a role in epithelial and endothelial cell maturation. Dev Biol 189, 285-300 (1997).

130. Sung, U., O'Rear, J. J. & Yurchenco, P. D. Cell and heparin binding in the

distal long arm of laminin: identification of active and cryptic sites with recombinant and hybrid glycoprotein. J Cell Biol 123, 1255-68 (1993).

131. Sung, U. Heparin binding of laminin: contribution of the triple helix in the

rod domain to the formation of cryptic and active sites in the globular domain. Mol Cells 7, 272-7 (1997).

132. Takami, T. et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia

transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci 22, 6670-81 (2002).

133. Timpl, R. et al. Laminin--a glycoprotein from basement membranes. J Biol

Chem 254, 9933-7 (1979).

134. Timpl, R. Structure and biological activity of basement membrane

proteins. Eur J Biochem 180, 487-502 (1989).

110

135. Timpl, R. et al. Structure and function of laminin LG modules. Matrix Biol 19, 309-17 (2000).

136. Tisi, D., Talts, J. F., Timpl, R. & Hohenester, E. Structure of the C-terminal

laminin G-like domain pair of the laminin alpha2 chain harbouring binding sites for alpha-dystroglycan and heparin. Embo J 19, 1432-40 (2000).

137. Tomaselli, K. J., Damsky, C. H. & Reichardt, L. F. Purification and

characterization of mammalian integrins expressed by a rat neuronal cell line (PC12): evidence that they function as alpha/beta heterodimeric receptors for laminin and type IV collagen. J Cell Biol 107, 1241-52 (1988).

138. Utani, A., Nomizu, M., Timpl, R., Roller, P. P. & Yamada, Y. Laminin chain

assembly. Specific sequences at the C terminus of the long arm are required for the formation of specific double- and triple-stranded coiled-coil structures. J Biol Chem 269, 19167-75 (1994).

139. Venstrom, K. & Reichardt, L. Beta 8 integrins mediate interactions of chick

sensory neurons with laminin-1, collagen IV, and fibronectin. Mol Biol Cell 6, 419-31 (1995).

140. von der Mark, H. et al. Skeletal myoblasts utilize a novel beta 1-series

integrin and not alpha 6 beta 1 for binding to the E8 and T8 fragments of laminin. J Biol Chem 266, 23593-601 (1991).

141. Wizemann, H. et al. Distinct requirements for heparin and alpha-

dystroglycan binding revealed by structure-based mutagenesis of the laminin alpha2 LG4-LG5 domain pair. J Mol Biol 332, 635-42 (2003).

142. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N. & Bunge, M. B. Axonal regeneration

into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol 351, 145-60 (1995).

143. Yurchenco, P. D., Tsilibary, E. C., Charonis, A. S. & Furthmayr, H.

Laminin polymerization in vitro. Evidence for a two-step assembly with domain specificity. J Biol Chem 260, 7636-44 (1985).

144. Yurchenco, P. D. & Schittny, J. C. Molecular architecture of basement

membranes. Faseb J 4, 1577-90 (1990).

111

145. Yurchenco, P. D., Cheng, Y. S. & Colognato, H. Laminin forms an

independent network in basement membranes. J Cell Biol 117, 1119-33 (1992).

146. Yurchenco, P. D. & Cheng, Y. S. Self-assembly and calcium-binding sites

in laminin. A three-arm interaction model. J Biol Chem 268, 17286-99 (1993).

147. Yurchenco, P. D. & Cheng, Y. S. Laminin self-assembly: a three-arm

interaction hypothesis for the formation of a network in basement membranes. Contrib Nephrol 107, 47-56 (1994).

148. Yurchenco, P. D., Amenta, P. S. & Patton, B. L. Basement membrane

assembly, stability and activities observed through a developmental lens. Matrix Biol 22, 521-38 (2004).

149. Z'Graggen, W. J., Metz, G. A., Kartje, G. L., Thallmair, M. & Schwab, M. E.

Functional recovery and enhanced corticofugal plasticity after unilateral pyramidal tract lesion and blockade of myelin-associated neurite growth inhibitors in adult rats. J Neurosci 18, 4744-57 (1998).

150. Zhou, F. C. Four patterns of laminin-immunoreactive structure in

developing rat brain. Brain Res Dev Brain Res 55, 191-201 (1990).

ARTIFICIAL LAMININ POLYMERS ASSEMBLED IN

ACIDIC pH MIMIC BASEMENT MEMBRANE

ORGANIZATION

Madalena Martins Sant’Ana Barroso1, Elisabete Freire1*, Gabriel S. C. S. Limaverde2,

Gustavo Miranda Rocha2, Evander J. Batista2†, Gilberto Weissmüller2, Leonardo Rodrigues Andrade1 and Tatiana Coelho-Sampaio1‡.

1Institute of Biomedical Sciences and 2Intitute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ 21941-590, Brazil. Running title: acidic laminin matrices

*Present address: Faculdade de Tecnologia e Ciências, Ave. Luís Viana Filho 8812, Salvador, BA 41741-590, Brazil † Present address: Universidde Federal do Pará, Rua Augusto Côrrea 1, Belém, PA 66075-110, Brazil ‡Corresponding author: tcsampaio@histo.ufrj.br, phone (+5521)2562-6476, fax (+5521)2562-6483

Natural laminin matrices are formed

on cell membranes by a cooperative

process involving laminin self-

polymerization and binding to

cognate cellular receptors. In a cell-

free system, laminin can self

polymerize, given that a minimal

critical concentration is achieved. We

have previously described that pH

acidification renders self-

polymerization independent of

protein concentration. Here we

studied the ultrastructure of acid-

induced laminin polymers using

electron and atomic force

microscopies. Polymers presented the

overall appearance of natural

matrices and could be described as

homogeneous polygonal sheets,

presenting struts of 21 ±±±± 5 nm and 86

± 3 nm of height, which

approximately correspond to the sizes

of the short and the long arms of the

molecule, respectively. Addition of

fragment E3 (the distal two domains

of the long arm) did not affect the

polymerization in solution nor the

formation of adsorbed matrices. On

the other hand, addition of fragment

E1’, which contains two intact short

arms, completely disrupted

polymerization. These results indicate

that acid-induced polymers, as

natural ones, involve only

interactions between the short arms.

The electrostatic surface map of

laminin αααα1 LG4-5 shows that

acidification renders the distal end in

the long arms exclusively positive,

precluding homophylic interactions

between them. Therefore,

acidification reproduces in vitro, and

at a physiological protein

concentration, what receptor

interaction does in the cellular

context, namely, it prevents the long

arm from disturbing formation of the

homogeneous matrix involving the

short arms only. We propose that

acid-induced polymers are the best

tool to study cellular response to

laminin in the future.

http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.M709301200The latest version is at JBC Papers in Press. Published on February 13, 2008 as Manuscript M709301200

Copyright 2008 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

2

INTRODUCTION

Laminin is a self-polymerizing extracellular matrix protein implicated in survival, proliferation, migration, differentiation and apoptosis of a variety of cell types (Miner and Yurchenco, 2004; Aumailley et al., 2005). In particular, laminin plays a pivotal role in the instruction of neural cells during both tissue development and regeneration (Stichel and Muller, 1994; Luckenbill-Edds, 1997). It is well accepted that laminin signaling depends on its self-polymerization (Miner and Yurchenco, 2004), which naturally occurs on cell membranes given that its longest arm interacts with a membrane receptor being it a protein, such as a β1-containing integrin or dystroglycan, or sulfatides (Li et al., 2005). Laminin polymerization and its anchorage have been proposed to cooperate for the formation of a supramolecular network, which have unequivocally been demonstrated to involve only interactions between the LN-domains at the distal ends of each short arm (Li et al., 2005; McKee et al., 2007). Such network consists of a regular lattice, whose struts correspond to the size of laminin short arms (Yurchenco et al., 1992), both in matrices assembled in vivo by tumors, as well as in artificial matrices thermally gelled at 3.5 mg/ml. Because laminin has an important role in determining cell fate, it is of major scientific and biotechnological interest to produce artificial laminin matrices that can mimic the polymers produced by cells in vivo. Artificial self-polymerization of laminin has been obtained in vitro either by maintaining the protein above a critical concentration (Yurchenco et al., 1985) or by providing a surface of negative lipids to assist polymerization (Kalb and Engel., 1991). More recently, we have

found that diluting laminin in acidic pH led to instantaneous solution polymerization, whereas such polymers adsorbed on coverslips could induce neuritogenesis and cell migration out of explants of newborn rat brains (Freire and Coelho-Sampaio, 2000; Freire et

al., 2002). When such explants were platted onto laminin adsorbed in neutral pH, laminin in EDTA or poly-lysine, there was absolutely no migration or axonal growth. Immunolabeling of the matrices produced at each pH with anti-laminin antibodies revealed major morphological differences between them, whereas the acidic one seemed more flat and organized, which could account for its particular signaling properties to neural cells (Freire et al., 2002). Although the molecular organization of the flat laminin mesh in basement membranes seems to be stable, there is a plenty of evidences supporting the notion that the supramolecular organization of laminin can change throughout development and among tissues. In the nervous system, for instance, it has been demonstrated that laminin goes from cell-associated to scattered extracellular matrix deposits or from a punctated pattern to small or large sheet-like aggregates in developing brain (Zhou, 1990; Luckenbill-Edds, 1997). Cells in culture can also assemble different networks as demonstrated for midbrain and cortical neural cells (Garcia-Abreu et al., 1995; Freire et al., 2004) or Schwann cells (Tsiper and Yurchenco, 2002). In addition, we have previously described that the laminin matrix synthesized by embryonic astrocytes (which efficiently support neurite outgrowth) resembles the artificial matrix assembled upon laminin acidification as it is flat, organized and closely associated to the cell surface (Freire et al., 2004).

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

3

Here we investigated at the molecular level the structural properties of acidic laminin polymers obtained in vitro at low protein concentration (10-50 µg/ml). We evaluated their ultrastructure and stability towards laminin fragments and concluded that such polymers are sheet-like matrices formed by interactions among the terminal ends of the short arms, whereas the long ones are left free at an orthogonal plane. Such polymers better correspond to the natural matrices characterized so far and should be considered as a model of artificial laminin substrate in further cell biology studies, as well as in possible therapeutic usage of the protein. EXPERIMENTAL PROCEDURES

Materials. Natural mouse laminin 111 isolated from Engelbreth-Holm-Swarm tumor was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) and Repel Silane was from Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). N-propyl gallate, the antibodies rabbit anti-laminin (diluted 1:30) and sheep anti-rabbit IgG, Cy3 conjugated (diluted 1:800) were from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Laminin fragments E1’and E3 were a generous gift of Dr. Peter Yurchenco (Robert Wood Johnson Medical School, Piscataway, NJ). Electron Microscopy. Laminin was diluted to a final concentration of 50 µg/ml in 20 mM sodium acetate, pH 4.0, containing 1 mM CaCl2. For freeze etching method the solution was pipetted on a Balzers support disk, rapidly frozen by impact against a copper block, cooled by liquid nitrogen to – 196°C, fractured and etched for 20 min by raising the temperature to – 100°C. After this, the specimens were rotary shadowed with platinum at 15° and further coated with carbon at 90°,

digested in sodium hypochlorite (NaClO3) for 30 minutes and collected on 200-mesh copper grids. For negative staining 5 µL of the laminin solution (50 µg/ml) was deposited on a formvar-coated copper grid. The solution was partially removed with a filter paper and 5 µL of uranyl acetate (2%) was added. After 1 minute, the solution was completely dried with a filter paper. Specimens were examined in a Zeiss EM 900 transmission electron microscope operated at 80 kV. Atomic Force Microscopy. Laminin was diluted to 50 µg/ml in acetate buffer and pipetted onto the surface of a newly cleaved mica, fixed for 2 hours with 4% paraformaldehyde,0.5% glutaraldehyde in 0.1M sodium cacodyate buffer (pH 7.2) for 2 hours, rinsed 3 times in acetate buffer, dehydrated through an ethanol series and critical point dried (Balzers CPD 050). Samples were examined in a MFP-3D Atomic Force Microscopy (Asylum Research, Santa Barbara, CA). Images were acquired in air using intermittent contact mode. Cantilevers elastic constants were obtained by the thermal noise method. For intermittent contact mode, tetrahedral shaped cantilevers (AC240TS, Olympus, Tokyo, Japan; nominal spring constant 2 N/m) were used at a low scan rate (0.5 Hz). Phase images were acquired with 512 X 512 pixels of resolution and image processing was performed in IGOR-PRO (Wavemetrics, Portland, OR, USA) using a MFP-3D template developed by Asylum Research.

Light-scattering Measurements. Light Scattering was measured in a QuantaMaster spectrofluorometer (Photon Technology International, Lawrenceville, NJ) at 37°C. The wavelength of the incident light was fixed at 400 nm, and scattered light was colleted at 90° between 350 and 450

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

4

nm. Laminin self-polymerization was initiated by diluting the protein from a stock solution either to a final concentration of 10 µg/ml in 20 mM sodium acetate (pH 4.0) or to a final concentration of 200 µg/ml in 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), both containing 1mM CaCl2 (final volume of 800 µl). The fluorescence cuvette was previously treated with Repel silane to avoid protein binding to the quartz walls. The assay was performed in the presence or in the absence of the laminin E1’or E3 fragments (150 nM). Laminin stock solutions (~1 mg/ml) were kept at 4°C until dilution into assay media previously warmed to 37°C in the sample compartment of the instrument. Under these conditions, i.e. at 4°C, aggregates are not expected to form in stock solutions until the exact time when dilution in pre-warmed buffer takes place (Yurchenco et al., 1985). After laminin addition, samples were gently mixed and measurements were taken within approximately 1 min. Data were corrected by subtracting appropriate blanks containing buffer only.

Immunostaining. Laminin matrices were obtained by diluting the stock solution to 50 µg/ml in pre-warmed (37°C) 0.1 M either acetate (pH 4.0) or Tris (pH 7.0) buffers with 1 mM CaCl2. One hundred microliters of the diluted solutions were dropped onto glass coverslips and incubated for 12 hours at room temperature. For immunostaining, coverslips were fixed with 4% paraformaldehyde for 3 minutes and rinsed 3 times with 0.1 M phosphate buffered saline (PBS). Matrices were blocked with 5% bovine serum albumin in PBS for 30 min and subsequently incubated overnight at 4 °C with rabbit anti-laminin antibody diluted in blocking solution. Matrices were then washed 3 times with PBS and incubated with anti-rabbit, Cy3 conjugated

antibody for 2 hours, at room temperature. After washed 3 times with PBS and 1 in water, coverslips were mounted in N-propyl-gallate and visualized using a fluorescence microscope (Zeiss Axioplan). Electrostatic Surface Potential of the

LG4-5 Domains of laminins α1 and α2.

The surface potential was calculated by using the Adaptive Poisson-Boltzmann Solver software package (Baker et al., 2001) and images were generated using PyMol 0.97 (Delano, 2002). The atomic coordinates for laminin α-chains 1 and 2 were obtained from the Protein Data Bank entry 2JD4 for α1 and 1DYK for α2 (Harrison et al., 2007; Tisi et al., 2000). Calculations were performed assigning either a neutral or a positive charge for His residues. A probe sphere of 1.4 Å radius was used to generate the solvent accessible surface. The dielectric constants used for protein and solvent were 20 and 80, respectively and the system temperature was set to 310K. RESULTS Analysis of the acidic laminin matrix by

electron microscopy: To gain information about the architecture of the polymeric matrix obtained in acidic pH, we studied its ultrastructure by the freeze-etching technique. The protein was diluted to a final concentration of 50 µg/ml in acetate buffer (pH 4.0) and immediately dropped onto a support disk. It is important to note that acid-induced laminin polymerization occurs instantaneously upon dilution (Freire and Coelho-Sampaio, 2000) therefore, in this experimental set up, the polymers are formed in solution and are decanted already in the associated state. Analysis of the polymeric matrix revealed a planar structure displaying irregular polygons as shown in Fig. 1A. The left third (see arrow) of the image

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

5

seems to correspond to a single layer of the sheet-like polymer while the right two thirds, where the polygons are smaller, suggest the superposition of more than one polygonal sheet. The size of the struts in the hexagonal-shaped matrix previously characterized in basement membrane extracts and in heat-gelled pure laminin was between 30 and 40 nm (Yurchenco and Schittny, 1990; Yurchenco et al., 1992). This exactly corresponds to the size of the short arms in the laminin molecule, known to interact to form the hexagons observed in natural matrices (McKee et

al., 2007). Although the sizes of the struts in Fig. 1A were in this same range, their thickness prevented precise measurements using this technique. We next analyzed the ultrastructure of the acidic polymers by negative staining. Observation of Figure 1B reveals a very organized mesh-like array, composed of polygons of an approximate hexagonal shape. Given the three-dimensional nature of the polymeric matrix the superposed struts, instead of excluding the dye, actually worked as substrates for the uranyl as it percolated down through the mesh. This resulted in the protein appearing as the stained structure (white in the contrast reversed electronmicrograph). The sides of the hexagons corresponding to the struts of the mesh were quantitatively analyzed by measuring 100 struts randomly chosen. The average size found was 21 ± 5 nm, which approximately corresponds to the size of laminin short arm, similarly to previously described for natural and heat-gelled laminin matrices (Yurchenco and Schittny, 1990; Yurchenco et al., 1992). Together freeze-etching and negative staining indicate that acid-induced polymers are planar and present a repetitive structure compatible with a model where all

intermolecular interactions are restricted to the single plane defined by the short arms. Analysis of acidic laminin matrices by

atomic force microscopy: Acid-induced laminin polymers were further evaluated by atomic force microscopy. The initial analysis of a squared window of 0.25 µm2 using conventional topography scanning showed a regular but poorly-contrasted image, indicative of a flat surface (Fig. 2A). A second image was generated by analyzing the phase delay undergone by the cantilever (Fig. 2C). Phase imaging is extremely sensitive to the elastic and adhesive properties of the specimens present on the surface (Morris et al., 1999), leading to a pronounced increase in contrast. A homogenous image containing polygons similar to those found in electron microscopy was seen using phase mode. Since laminin is much more adhesive and elastic than the mica substrate, the delay in phase amplified the subtle changes in heights probed by the topographic image (compare Fig. 2A and C). In order to gain information on the height of the laminin layer, we have intentionally searched for random interruptions of the matrix in which the cantilever could be introduced to probe the distance to the underlying surface. Three of such regions were analyzed providing an average depth of 86 ± 3 nm. This corresponds to the size of the laminin long arm, which therefore would not participate in the hexagonal mesh, but instead would be projected to an orthogonal plane relative to it. Effect of laminin fragments on laminin

polymerization in solution: In order to confirm the lack of contribution of the long arm to the formation of the acid-induced laminin network, we have investigated if addition of the E3

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

6

fragment, which contains the distal two domains of the long arm, would interfere with laminin polymerization in solution. The experiment was carried out at 10 µg/ml, a concentration at which no polymerization is observed at neutral pH (Yurchenco et al., 1985). Polymerization was monitored as the increase in light scattering in solution at 400 nm. Figure 3A shows the intensities of light scattering obtained upon laminin dilution in acidic pH in the absence or in the presence of a 20-fold molar excess of the fragments. In the presence of fragment E1’, which contains the globular distal ends of 2 short arms, polymerization was blocked. On the other hand, addition of fragment E3 did not affect solution polymerization, which confirms that interactions with the long arm are not involved in the acidic polymers. Solution polymerization was also investigated in neutral buffer (Fig. 3B). At 10 µg/ml no increase in light scattering was observed even after 2 hours of incubation and addition of EDTA did not lead to decrease of the initial intensity (data not shown). When the concentration of laminin was changed to 200 µg/ml light scattering was progressively increased, reaching a maximal enhancement of 4.5 fold in within 2 hours. Ten millimolar EDTA were added to disrupt aggregates, which led to an instantaneous drop in light-scattering down to the initial intensity at time zero. When polymerization was essayed in a 20-fold molar excess of fragment E3, only 50% increase in light scattering was observed, which indicates that, although polymerization was still seen in the presence of E3, the maximal level of aggregation was affected by the fragment. The latter result is in contrast with previously reported data in the literature showing that the E3 fragment did not interfere with laminin polymerization in neutral

pH (Colognato-Pyke et al., 1995). This can be explained by the fact that we followed aggregation by measuring light scattering which takes into account not only the aggregated state but will also respond to the final sizes of the aggregates formed. On the other hand, sedimentation of the polymers by centrifugation, as used before, establishes a cut-off between aggregated and non-aggregated states and could be not sufficiently sensitive to detect eventual changes in specific aggregated species. Effect of laminin fragments on laminin

matrices deposited on coverslip: Although laminin aggregates could not be detected in neutral pH at 50 µg/ml, we have previously demonstrated that deposits of the aggregated protein became visible when the laminin solution was incubated over the surface of a glass coverslip (Freire et al., 2002; 2004). Such deposits were characterized by immunostaining and shown to be morphologically different from others obtained in acidic pH. An analogous comparison between laminin aggregates obtained in distinct pHs could not be performed at the ultrastructural level because polymers obtained in neutral pH were visible as amorphous aggregates in electron microscopy, both using negative staining or freeze etching (data not shown). A visible network of laminin under neutral pH has only been reported at an extremely high protein concentration (3.5 mg/ml) (Yurchenco et al, 1991). Fragments E1’ and E3 were tested for their ability of interfering with the formation of laminin matrices adsorbed on coverslips at each pH (Fig. 4). Laminin alone formed flat and organized polymers in acidic pH whereas in neutral pH the polymers were bulky and discontinuous. Fragment E1’ clearly disrupted both

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

7

polymers, while E3 affected only the deposits obtained in neutral pH. It is interesting to note that although E3 clearly disrupts the large aggregates typical of laminin deposited in neutral pH, small aggregates remained on the matrix, which indicates that, although E3 interferes with the final polymerized state, it still preserved some level of protein aggregation. Comparison between the electrostatic

surface potentials of the LG4-5 domains

of laminin at neutral and acidic pH: We finally asked the question about why acidic buffer would stabilize sheet-like polymers. A recent paper has described the crystallographic structure of LG4-5, the two most distal domains in the long arm of laminin α1. We have used the PyMol software to analyze the electrostatic surface of the protein at pHs 7 and 4. Figure 5 shows that in neutral pH negatively charged groups (red) are clustered in a predominantly positive (blue) surface. This would allow for some degree of electrostatic interaction between two of these domains. Indeed, a significant proportion of dimers formed by the association between the distal ends of 2 long arms have been observed among spontaneously-formed laminin dimers detected using rotatory shadowing (Yurchenco et al., 1985). On the other hand, when the pH is decreased to 4, the surface becomes totally positive, which would completely prevent interactions between the 2 distal ends of the long arm of laminin 111. Interestingly, this would not be the case for laminin 211, where the long arm is contributed by the α2 chain. In this case, alternated negative and positively- charged clusters are seen in both neutral and acidic pH (Fig. 5). Accordingly, acidification of pH produced only a modest increase in light scattering of laminin 211 (not shown).

DISCUSSION

Since the seminal work of Yurchenco and co-workers in 1985, demonstrating that laminin could self-polymerize in the absence of a cell membrane or any other cellular component, it became established that all information necessary for the formation of laminin polymers was contained within the isolated protein. In the following years, the same group additionally described how exactly polymers were formed on the cell surface, establishing sulfatides as important receptors for the initiation of self-assembly on biological membrane (Li et al., 2005). In the naturally-assembled laminin network only the short arms interact, giving rise to a continuous hexagonal sheet, whereas the long arm remains in contact with a laminin receptor, i.e. connecting the polymer to the cell surface. The fact that laminin could self-polymerize in a cell-free system, opened the possibility of using artificial polymers as substrates to study the cellular response to the underlying matrix. In this context, it has been assumed that the artificial polymers described back in 1985, properly corresponded to the polymers produced by cells in vivo. Natural polymers however had been morphologically characterized while the structure of the polymers produced by in vitro self-polymerization was not available for comparison. Moreover, rotatory shadowing studies had shown that the distal ends of the long arms interacted with each other, while such interaction did not occur in the natural laminin mesh. Here we showed that laminin polymerized in acidic buffer in a concentration as low as 60 nM (50 µg/ml) produced a continuous polygonal network, contributed only by the short arms. We also showed that upon acidification the interaction

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

8

between the distal ends of the long arms is hampered, given that the surface charge of the LG4-5 domains becomes completely positive. Our interpretation is that acidification impairs bridging of two long arms, stabilizing the interaction among short arms only. An equivalent blockage of the long arm is not necessary in a natural situation when the laminin molecule binds to a cell receptor that recognizes its distal end such as α3β1, α6β1 and α7β1 integrins, dystroglycan or sulfatides. In this case, the interaction with the receptor will occupy the long arm and impair it from participating in the laminin polymer. On the other hand, in neutral pH, the long arms would be free to interact with each other and would disturb the formation of the homogeneous polymer involving the three short arms only. In this work, we used several direct and indirect methodological tools to demonstrate that acid-induced laminin polymers are structurally similar to natural polymers produced in vivo by cells. Negative staining and freeze etching followed by electron microscopy or by atomic force microscopy showed a clear correspondence between the morphology of matrices produced by EHS and ECC tumors and acid-induced ones. Additionally, the use of laminin fragments confirmed that, in the acid-induced polymer, as in the natural one, fragment E3 does not interfere with polymerization neither in solution nor in large aggregates used for cell cultivation. Curiously, data reported here using light-scattering measurements revealed that E3 partially disassembles polymers formed in neutral pH at high protein concentration. Moreover, the presence of E3 led to the disruption of the very large aggregates observed in the matrices adsorbed in neutral pH (Fig.

4). These results taken as a whole point to the interpretation that the interactions between the distal ends of the long arms that seem to occur in neutral buffer actually work as bridges, cross-linking small stretches of the sheet-like polygonal polymer. Such interactions would impair the formation of a continuous mesh that can be distinguished from smaller polymers by the light-scattering technique, which can discriminate between protein aggregates of different sizes. The fact that acid-induced laminin polymers, as opposed to laminin polymers obtained in neutral pH, reproduce in vitro the structural properties of the natural laminin matrix opens new research perspectives and suggests that previous data obtained in functional studies using laminin polymerized in neutral buffer need to be interpreted with more care and indeed may require revision. Acid-induced polymers can now be used in vitro to study their signaling properties to overlaying cells, as well as in vivo to study the role of laminin in biological phenomena related to the embryonic development and in tissue regeneration. It is interesting to note that although laminin has clearly been pointed as an instructive substrate for both the development and regeneration of the nervous system, little benefit has been associated to the use of laminin in spinal cord regeneration. In this regard, we have recently demonstrated that, contrary to laminin in neutral buffer, treatment with laminin polymerized in pH 4 significantly improves open field locomotion of rats submitted to experimental spinal cord injury1

1 Patent submitted to the Brazilian National Institute for Industrial Patent (INPI).

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

9

ACKNOWLEDGMENTS: The authors thank the technical assistance of Juliana Lourenço Abrantes. This work was supported by the Brazilian agencies CNPq (552301/2005-1) and FAPERJ (E-26/170952/2004). MMSB is a recipient of a PhD fellowship from CNPq.

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

10

REFERENCES:

1. Aumailley, M., Bruckner-Tuderman, L., Carter, W. G., Deutzman, R., Edgar,

D., Ekblom, P., Engel, J., Engvall, E., Hohenester, E., Jones, J. C., Kleinman, H. K., Marinkovich, M. P., Martin, G. R., Mayer, U., Meneguzzi, G., Miner, J. H., Miyazaki, K., Patarroyo, M., Paulsson, M., Quaranta, V., Sanes, J. R., Sasaki, T., Sekiguchi, K., Sorokin, L. M., Talts, J. F., Tryggvason, K., Uitto, J., Virtanen, I., von der Mark, K., Wewer, U. M., Yamada, Y., and Yurchenco, P. D. (2005) Matrix Biol. 24 (5), 326-332.

2. Baker, N. A., Sept, D., Joseph, S., Holst, M. J., and McCammon, J. A. (2001)

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 10037-10041

3. DeLano, W. L. (2002) The PyMOL Molecular Graphics System, DeLano Scientific, San Carlos, CA

4. Freire, E., Gomes, F.C., Linden, R., Neto, V.M., and Coelho-Sampaio, T. (2002)

J Cell Sci. 115, 4867-4876.

5. Freire, E., Gomes, F. C., Jotha-Mattos, T., Neto, V. M., Silva Filho, F. C. and Coelho- Sampaio, T. (2004) J Cell Sci. 117, 4067- 4076.

6. Freire, E. and Coelho-Sampaio, T. (2000) J. Bio. Chem. 275, 817-822.

7. Garcia-Abreu, J., Moura-Neto, V. and Cavalcante, L. A. (1995a) J. Neurosci.

Res. 40, 471- 477.

8. Gomes, F. C. A., Garcia-Abreu, J., Galou, M., Paulin, D. and Moura-Neto, V. (1999) Glia 26, 97-108.

9. Harrison, D., Hussain, S.A., Combs, A.C., Ervasti, J.M., Yurchenco, P.D., and

Hohenester, E. (2007) J Biol Chem. 282:11573-11581.

10. Kalb, E. and Engel, J. (1991) J. Biol. Chem. 266, 19047-19052.

11. Li, S., Liquari, P., McKee, K.K., Harrison, D., Patel, R., Lee, S. and Yurchenco, P. D.(2005) JCB 169 (1), 179-189.

12. Luckenbill-Edds, L. (1997) Brain Res. Rev. 23, 1-27.

13. McKee, K.K., Harrison, D., Capizzi, S. and Yurchenco, P. D. (2007) J. Biol.

Chem. 282 (29), 21437- 21447.

14. Miner, J.H. and Yurchenco, P. (2004) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 255-284.

15. Morris, V. J., Kirby, A. R., and Gunning, A. P. (1999) Imperial College Press, London

16. Stichel, C. C. and Muller, H. W. (1994) J. Neurocytol. 23 (10), 615-630.

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

11

17. Tisi, D., Talts, J. F., Timpl, R., and Hohenester, E. (2000) EMBO J. 19, 1432-

1440

18. Tsiper, M. V. and Yurchenco, P. D. (2002) J. Cell Science 115, 1005-1015.

19. Yurchenco, P. D. & Schittny, J. C. (1990) FASEB J. 4, 1577-1590.

20. Yurchenco, P. D., Tsilibary, E.C., Charonis, A.S. and Furthmayr, H. (1985) J.

Biol. Chem. 260, 7636-7644.

21. Yurchenco, P.D., Cheng, Y.S., and Colognato, H. (1992) J. Cell Biol 117, 1119-1133.

22. Zhou, F. C. (1990). Brain Res. Dev. Brain Res. 55, 191-201.

FIGURE LEGENDS:

Figure 1. Analysis of the acid-induced laminin polymers by electron microscopy reveals

organized polygonal arrays. Laminin was diluted to 50 µg/ml in acetate buffer (pH 4) and immediately processed for freeze etching (A) or for negative staining (B). Electronmicrographs are contrast reversed in order to provide the sensation of depth necessary for better visualization of the three-dimensional nature of the polymers. The arrow indicates the apparent transition between a single (left) to a double-layered (right) polymer. Scale bars represent 100 nm in panel A and 200 nm in panel B.. Figure 2. Atomic force microscopy of acidic laminin polymers showing a polygonal

array whose height corresponds to the length of the long arm. (A) Topography image of an area of 500 x 500 nm. (B) Sampling of the depth of the matrix obtained by deliberately introducing the cantilever into areas of the matrix occasionally disrupted. (C) Image generated by phase mode. Figure 3. Fragments E3 and E1’ selectively interferes with laminin polymerization in

solution. (A) Light scattering of laminin (12 nM) in acetate buffer pH 4 was measured in the absence or in the presence of 240 nM of fragments E1’or E3 immediately after dilution. While E1’ inhibited polymerization, E3 did not affect the maximal level of light-scattering intensity. Intensities remained unchanged for up to 12 hours. (B) Light scattering of laminin (240 nM) was followed after dilution in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7) for 6 hours in the absence (closed symbols) or in the presence of 4 µM of fragment E3 (open symbols). Values of light scattering were normalized to compensate for the increase in intensity due to the enhancement the total protein mass in the presence of the fragment. Addition of EDTA in the control curve (closed circle) reversed polymerization down to levels below those found in the presence of the fragment, indicating that, although E3 interferes with laminin polymerization, polymers remain in solution in the presence of the fragment. Figure 4. Fragments E1’and E3 selectively interfere with the formation of adsorbed

laminin matrices. Laminin matrices were formed by adsorption of the protein (60 nM) on the surface of glass coverslips in the absence (top panel) or in the presence of

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

12

fragments E1’ or E3 (1.2 µM) middle and bottom panels, respectively. While E1’ completely disrupted aggregates, E3 did not interfere with acid-induced polymerization but decreases the sizes of aggregates formed in neutral buffer. The scale bar corresponds to 50 µm. Figure 5. Acidification renders α1 LG4-5 completely positive and not suitable for

homophilic interaction. Electrostatic surface potential maps of the LG4-5 domains of the laminin chains α1 and α2 were obtained as described in Experimental Procedures. The bar shows the color code ranging from negative (red) to positive (blue) in the range of -3 to 3 kT/e.

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

13

Barroso et al, 2007 Fig. 1

A

B

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

14

Barroso et al., 2007

Fig. 2

A

C

B

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

15

Normalized

lightscattering

Control + E1’ + E30

5

10

15

20

25

Lightscatteringat400 nm

(a.u.)

Time (min)

A B

0 50 100 150 200 2500

1

2

3

4

5

Barroso et al., 2007

Fig. 3

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

16

Control

+ E1’

+ E3

Control

+ E1’

+ E3

pH 4 pH 7

Barroso et al., 2007 Fig. 4

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

17

Barroso et al., 2007

Fig. 5

by on March 12, 2008

ww

w.jbc.org

Dow

nloaded from

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas

Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo