0

Caracterizaes bioqumica e hemosttica de

pacientes com diabetes mellitus tipo 2 em

insulinizao

Nadmy Arrivabene Zavaris Gonalves

Dissertao de Mestrado em Bioqumica e Farmacologia

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO

Vitria, Julho de 2014

1

Caracterizaes bioqumica e hemosttica de

pacientes com diabetes mellitus tipo 2 em

insulinizao

Nadmy Arrivabene Zavaris Gonalves

Dissertao submetida ao Programa de Ps-Graduao em Bioqumica e

Farmacologia da Universidade Federal do Esprito Santo como requisito parcial para

a obteno do grau de Mestre em Bioqumica e Farmacologia.

_________________________________________________

Profa. Dra. Daniela Amorim Melgao Guimares do Bem Orientadora, UFES

_________________________________________________

Profa. Dra. Isabele Beserra Santos Gomes, UFES

_________________________________________________

Prof. Dr. Breno Valentim Vassalo, UFES

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO

Vitria, Julho de 2014

2

Dados Internacionais de Catalogao-na-publicao (CIP) (Biblioteca Central da Universidade Federal do Esprito Santo, ES, Brasil)

Gonalves, Nadmy Arrivabene Zavaris, 1983- G635p Prevalncia e fatores associados infeco pelo M.

tuberculosis entre agentes comunitrios de sade / Nadmy Arrivabene Zavaris Gonalves. 2014.

116 f. : il. Orientador: Daniela Amorim Melgao Guimares do Bem.

Dissertao (Mestrado em Farmcia) Universidade Federal

do Esprito Santo, Centro de Cincias da Sade. 1. Diabetes Mellitus tipo 2. 2. Insulina. 3. Hemostasia.

4. Inflamao. I. Guimares do Bem, Daniela Amorim Melgao. II. Universidade Federal do Esprito Santo. Centro de Cincias da Sade. III. Ttulo.

CDU: 61

3

A tarefa no tanto ver aquilo que ningum viu, mas pensar

o que ningum ainda pensou sobre aquilo que todo mundo v.

Arthur Schopenhauer

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4

minha orientadora por ter confiado em mim e por ter conduzido todo o processo

com doura, dedicao e carinho.

Ao meu marido, meu eterno incentivador, meu companheiro, meu grande amor.

Aos meus pais e meu irmo pelo amor incondicional e por terem sempre sido minha

base e meu suporte.

Megg, pela companhia em todas as horas de estudo, sobretudo nas noites e

madrugadas.

5

AGRADECIMENTOS

Agradeo a Deus por me permitir viver e realizar mais esta conquista.

toda minha famlia e a todos os meus verdadeiros amigos, que sempre estiverem

comigo, torcendo por mim e entendendo minha ausncia nestes dois anos to

atribulados.

professora do departamento de farmcia e querida amiga Rita de Cssia Ribeiro

Gonalves, pelo imprescindvel auxlio na elaborao do projeto e por ser um

verdadeiro anjo no meu caminho, sempre com palavras confiantes e incentivadoras.

todos os pacientes e voluntrios que aceitaram participar deste estudo, permitindo

a sua realizao.

Prefeitura Municipal de Vitria, pela aceitao do projeto, pela confiana e

estrutura concedidas.

todos funcionrios e colegas da Unidade Bsica de Sade de Consolao, que

tornaram-se uma grande famlia para mim, em especial aos meus queridos tcnicos

em farmcia, Geceara e Adilson, por serem fiis e sempre dispostos a ajudar todas

as vezes em que precisei, s queridas Sandra, Analice e agentes comunitrias de

sade, pela ajuda na identificao dos pacientes, aos diretores antigos e atual pela

confiana, ao Welington, pelo start e Sirlene e Daniela, pela amizade e pela ajuda

primordial na coleta de sangue.

Ao laboratrio de anlises clnicas do Hospital Universitrio Cassiano Antnio

Moraes, pela parceria no projeto e permisso para utilizao do laboratrio;

minha super e eterna amiga Renata Tonani de Matos Petri que, para alm de

todas as horas de amizade sempre mim dedicadas, ainda muito contribuiu como

bioqumica, auxiliando-me na dosagem de parmetros.

6

Aos meus queridos colegas de turma, que se tornaram amigos e fizeram tudo ter

sido mais divertido, de maneira especial, Lorena pelo treinamento nas prticas

experimentais e Lorraine, minha fiel companheira de laboratrio.

A todos os alunos e estagirios que estiveram envolvidos na etapa inicial de seleo

dos pacientes, com destaque para a Tamara e Gabriela que me ajudaram a

organizar grande parte do processo.

s estagirias Suellen e Llian, pela contribuio e zelo com nosso laboratrio;

professora Carolina Sales, do programa de ps graduao em sade coletiva da

UFES, pela ajuda na elaborao inicial do projeto;

todos os professores da ps graduao, pelos ensinamentos e em especial s

professoras Rita G. W. Pires e Cristina Martins, por gentilmente cederem seu

laboratrio para que eu realizasse parte de meus experimentos.

querida professora Elenice Moreira Lemos, que embora seja de outro programa de

ps graduao da UFES, sempre mostrou-se disponvel e nunca mediu esforos

para me ajudar, sempre permitindo que eu usufrusse da estrutura de seu laboratrio

e do ncleo de doenas infecciosas.

doutoranda da professora Elenice, Juliana, pela gentileza em me ajudar e

assessorar em parte dos experimentos.

competente e querida professora Eliane Zandonade e seu aluno Wharley Borges,

do laboratrio de estatstica da UFES, pelo belo exemplo de profissionalismo e pela

clareza e autonomia com que me assessorou na anlise estatstica.

7

SUMRIO

1 INTRODUO ....................................................................................................... 17

2 REFERENCIAL TERICO .................................................................................... 20

2.1 DIABETES MELLITUS ........................................................................................ 21

2.1.1 CLASSIFICAO E DIAGNSTICO ........................................................... 22

2.1.2 TRATAMENTO ............................................................................................. 25

2.1.3 MANIFESTAES CLNICAS DO DM2 E COMPLICAES ..................... 28

2.1.4 HIPERGLICEMIA E ENDOTLIO VASCULAR ............................................ 29

2.1.4.1 Ativao da protena quinase C (PKC) .................................................. 31

2.1.4.2 Aumento da produo de produtos de avanada glicao (AGEs) ....... 32

2.1.4.3 Ativao da via dos poliis..................................................................... 33

2.1.4.4 Ativao da via das hexosaminas .......................................................... 34

2.2 HEMOSTASIA, HIPERCOAGULABILIDADE E HIPOFIBRINLISE .................. 35

2.3 DIABETES MELLITUS E INFLAMAO ............................................................ 38

3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 42

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 43

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................... 43

4. METODOLOGIA ................................................................................................... 44

4.1 CASUSTICA ...................................................................................................... 45

4.1.1 POPULAO DO ESTUDO ......................................................................... 45

4.1.2 CRITRIOS DE INCLUSO......................................................................... 46

4.1.3 CRITRIOS DE EXCLUSO ....................................................................... 46

4.2 MTODOS .......................................................................................................... 47

4.2.1 AMOSTRA BIOLGICA ............................................................................... 47

4.2.2 AVALIAO DOS PARMETROS CLNICOS E ANTROPOMTRICOS ... 48

4.2.3 AVALIAO DOS PARMETROS BIOQUMICOS ..................................... 48

8

4.2.3.1 Perfil Glicmico ...................................................................................... 48

4.2.3.1.1 Determinao de hemoglobina glicada ........................................... 48

4.2.3.1.2 Determinao de glicose ................................................................. 48

4.4.3.2 Perfil Lipdico ......................................................................................... 49

4.2.3.2.1 Determinao de Triglicerdio ......................................................... 49

4.2.3.2.2 Determinao de Colesterol total .................................................... 49

4.2.3.2.3 Determinao de Colesterol LDL .................................................... 50

4.2.3.2.4 Determinao de Colesterol HDL .................................................... 50

4.2.3.2.5 Determinao de Colesterol VLDL .................................................. 50

4.2.3.3 Marcadores Renais ................................................................................ 51

4.2.3.3.1 Determinao de Uria ................................................................... 51

4.2.3.3.2 Determinao de Creatinina ............................................................ 51

4.2.3.4 Marcador de inflamao ........................................................................ 51

4.2.3.4.1 Determinao de Protena C Reativa ultra sensvel (PCRus) ......... 51

4.2.4 AVALIAO DOS PARMETROS GENTICOS ........................................ 52

4.2.4.1 Extrao do DNA genmico ................................................................... 52

4.2.4.2 Deteco do polimorfismo - 675 4G/5G ................................................. 52

4.2.5 AVALIAO DOS PARMETROS HEMOSTTICOS ................................. 55

4.2.5.1 Determinao dos nveis plasmticos de PAI1 ...................................... 55

4.2.5.2 Determinao dos nveis plasmticos de d-dmero (D-di) ..................... 55

4.2.5.3 Determinao dos nveis plasmticos de fibrinognio ........................... 55

4.2.6 ANLISE ESTATSTICA .............................................................................. 56

5 RESULTADOS ...................................................................................................... 58

5.1 CARACTERIZAES CLNICA E ANTROPOMTRICA ................................... 59

5.2 CARACTERIZAO BIOQUMICA .................................................................... 63

5.3 CARACTERIZAO HEMOSTTICA DOS PARTICIPANTES .......................... 65

5.4 CARACTERIZAO GENTICA DOS PARTICIPANTES ................................. 70

5.5 ANLISE DA INFLUNCIA DAS COVARIVEIS NA PREDIO DE DM2

EVOLUDA PARA INSULINIZAO......................................................................... 73

9

6 DISCUSSO .......................................................................................................... 75

7 CONCLUSES ...................................................................................................... 87

8 REFERNCIAS ..................................................................................................... 89

APNDICE 1 .......................................................................................................... 111

APNDICE 2 .......................................................................................................... 113

ANEXO 1 ................................................................................................................ 115

10

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1 - Oligonucleotdeos sintticos utilizados na PCR para deteco do

polimorfismo (-675 4G/5G) na regio promotora do gene do PAI-1 ............ 53

Quadro 2 - Concentraes de reagentes utilizados nas PCRs para deteco do

polimorfismo (-675 4G/5G) na regio promotora do gene do PAI-1 ............ 53

Quadro 3- Programa de PCR para deteco do polimorfismo (-675 4G/5G) na regio

promotora do gene do PAI-1 utilizado no termociclador ............................. 54

Quadro 4 - Perfil de bandas (PCR alelo especfica PAI-1 4G5G) ................................. 54

Tabela 1 - Caractersticas sociodemogrficas, clnicas e antropomtricas dos

participantes dos grupos controle e DM2 em insulinizao ........................ 61

Tabela 2 - Tipo e frequncia de medicamentos em uso pelos participantes dos

grupos controle e DM2 em insulinizao .................................................... 62

Tabela 3 - Parmetros bioqumicos dos participantes dos grupos controle e DM2 em

insulinizao expressos como mediana, intervalo interquartil e valor p ...... 63

Tabela 4 - Parmetros bioqumicos dos participantes dos grupos controle e DM2 em

insulinizao, categorizados por seus valores de referncia, e valor p ...... 65

Tabela 5 - Nveis plasmticos de fibrinognio, D-Di e PAI-1 nos grupos controle e

DM2 em insulinizao, expressos como mdias, desvio padro, mediana,

intervalo interquartil e valor p ...................................................................... 66

Tabela 6 - Parmetros hemostticos dos participantes dos grupos controle e DM2

em insulinizao, categorizados por seus valores de referncia, e valor p 66

Tabela 7 - Coeficiente de correlao (r) de Sperman e valor p para os marcadores

Fibrinognio, D-Di e PAI-1 nos participantes dos grupos controle e DM2

em insulinizao .......................................................................................... 67

11

Tabela 8 - Parmetros genticos dos participantes dos grupos controle e DM2 em

insulinizao ................................................................................................

71

Tabela 9 - Nveis plasmticos de PAI-1 dos participantes dos grupos controle e DM2

em insulinizao, estratificados por gentipo .............................................. 72

Tabela 10 Odd Radio bruto e ajustado das variveis que apresentaram significncia

estatstica no estudo de caso-controle entre indivduos dos grupos

controle e DM2 em insulinizao ................................................................ 74

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Grficos de disperso correspondentes s correlaes do grupo

controle estatisticamente significantes para p < 0,05: fibrinognio e

glicemia, fibrinognio e PCRus, PAI-1 e glicemia, PAI-1 e IMC .............. 68

Figura 2 - Grficos de disperso corerpondentes s correlaes do grupo DM2

em insulinizao estatisticamente significantes para p < 0,05:

fibrinognio e D-Di, Fifrinognio e PCRus, D-Di e glicemia (negativa),

PAI-1 e triglicerdeo, PAI-1 e IMC ........................................................... 69

Figura 3 - Eletroforese em gel de poliacrilamida para deteco do polimorfismo

(-675 4G/5G) na regio promotora do gene do PAI-1, atravs da

tcnica de PCR alelo especfico ............................................................. 70

Figura 4 - Frequncias genotpica e allica do polimorfismo (-675 4G/5G) na

regio promotora do gene do PAI-1 ........................................................ 71

Figura 5 - Grficos Blox-plot correspondentes aos nveis plasmticos de PAI-1

(ng/mL) dos participantes do grupo controle estratificado por gentipo

e diferena estatstica para p < 0,05 ....................................................... 72

13

LISTA DE ABREVIATURAS

ADA Associao Americana de Diabetes ADP Adenosina difostato AGE Produtos de avanada glicao ANOVA Anlise de varincia AT Antitrombina AVC Acidente Vascular Cerebral CIVD Coagulao intravascular disseminda CT Colesterol total DAC Doena arterial coronariana DAG Diacilglicerol DCV Doena cardiovascular DCCT Diabetes Control and Complications Trial DDi D-dmero DM Diabetes Mellitus DM2 Diabetes Mellitus tipo 2 DNA cido desoxirribonucleico EDCF Fator de constrio derivado do endotlio EDRF Fator de relaxamento derivado do endotlio dNTP desoxirribonucleosideos trifosfatos EDTA cido etilenodiaminotetractico ELISA Enzyme linked imune assay eNOS xido ntrico sintetase endotelial ESF Estratgia Sade da Famlia FT Fator tecidual GJ Glicemia de jejum HAS Hipertenso arterial sistmica HbA1c Hemoglobina glicada HDLc Lipoprotena de alta densidade IMC ndice da Massa Corporal NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotdeo Fosfato NFK Fator nuclear kapa NO xido ntrico NPH Neutral Protamine Hagedorn PCRus Protena C reativa ultra sensvel LDLc Lipoprotena de baixa densidade OMS Organizao Mundial da Sade OR Odds ratio PAI-1 Inibidor do ativador do plasminognio tipo 1 Pb Pares de base PC Protena C PGI2 Prostaglandina I2 PCR Reao em Cadeia da Polimerase PKC Protena quinase C PDF PS PT q.s.p

Produtos de degradao da fibrina Protena S Protrombina Quantidade suficiente para

PMV Prefeitura Municipal de Vitria

14

RAGE Receptor de produtos de avanada glicao RI Resistncia insulina ROS Espcies reativas de oxignio RPM Rotaes por minuto SBC Sociedade Brasileira de Cardiologia SBD Sociedade Brasileira de Diabetes TE Tromboembolismo TGC Triglicrides TVP Trombose venosa profunda t-PA Ativador tecidual do plasminognio TRH Terapia de Reposio Hormonal TXA2 Tromboxano A2 UBS Unidade Bsica de Sade UFES Universidade Federal do Esprito santo UKPDS United Kingtom Prospective Diabetes Study VCAM1 Molcula de adeso celular-vascular 1 VLDLc Lipoprotena de densidade muito baixa WHO World Health Organization

2

Teste de qui-quadrado

15

RESUMO

O estudo objetivou caracterizar hemosttica e bioquimicamente pacientes com

diabetes mellitos tipo 2 (DM2) que evoluram para insulinizao. Compuseram o

grupo em anlise, 40 pacientes atendidos pela Unidade Bsica de Sade de

Consolao, Vitria/ES, com idade entre 25 e 80 anos, diagnstico de DM2 em

utilizao de insulina. Para o controle, foram selecionados 40 pacientes na mesma

faixa etria, sem diagnstico laboratorial e/ou clnico de DM. Foram dosados

marcadores de inflamao, hipercoagulabilidade e fibrinlise: fibrinognio, dmero-D

(D-Di) e inibidor do ativador do plasminognio tipo 1 (PAI-1). O polimorfismo (-675

4G/5G) na regio promotora do gene do PAI-1 foi correlacionado com seus nveis

plasmticos. Foram medidos os parmetros bioqumicos: glicemia de jejum (GJ),

hemoglobina glicada (HbA1C), colesterol total (CT), colesterol HDL (HDLc),

colesterol LDL (LDLc), triglicerdeo (TGC), protena C reativa ultra sensvel (PCRus),

ureia e creatinina plasmticas. Houve ainda a verificao do IMC, obesidade,

tabagismo, hipotireoidismo, hipertenso, dislipidemia e resistncia insulina. A

anlise estatstica mostrou diferena (p < 0,05) entre os grupos em relao aos

valores mdios de HDLc, VLDLc, TGC, ureia, PCRus e fibrinognio. Houve diferena

entre os grupos para VLDLc, TGC, creatinina e fibrinognio alterados. No controle

foram observadas as correlaes: fibrinognio e glicemia, fibrinognio e PCRus,

PAI-1 e glicemia, PAI-1 e IMC. No grupo DM2 em insulinizao houve correlao

para fibrinognio e D-di, fibrinognio e PCRus, D-Di e glicemia (negativa), PAI-1 e

triglicerdeo, PAI-1 e IMC. Nveis de PAI-1 foram estatisticamente maiores no grupo

controle em indivduos com gentipo 5G5G, seguido de 4G5G e 4G4G. A Regresso

Logstica Binria confirmou que as variveis hipertenso e fibrinognio foram

significantes ao p-valor (0.009) e (0.049) e ODDS Ratio ajustado (4,184; 1,426-

12,276) e (3,293; 1,006-10,775) respectivamente, mostrando que hipertensos tm

um risco 4,18 vezes maior de terem DM2 insulinizada e que indivduos com

hiperfibrinogenemia possuem um risco 3,29 vezes maior. Com o estudo espera-se

contribuir para melhor entendimento das complexas alteraes que acompanham o

paciente diabtico tipo 2 usurio de insulina numa expectativa de buscar adequado

tratamento e preveno para as complicaes macrovasculares do diabetes.

Palavras chave: Diabetes mellitus tipo 2, insulinizao, hemostasia, inflamao.

16

ABSTRACT

The study aims to characterize biochemically and hemostatic mellitos patients with

diabetes mellitus type 2 (DM2) who developed insulin regimen. Composed group

under analysis, 40 patients attended the Basic Health Unit of Consolation, Vitria /

ES, aged 25 to 80 years, diagnosed with DM2 and that were already evoluted to

insulinization. As controls, 40 patients were selected in the same age group without

laboratory and / or clinical diagnosis of DM. Markers of inflammation,

hypercoagulability and fibrinolysis were measured: Fibrinogen, D-dimer (D-Di) and

plasminogen activator type 1 inhibitor (PAI-1). The polymorphism (-675 4G/5G) in the

promoter region of the PAI-1 gene was correlated with their serum levels.

Biochemical parameters were measured: plasma glucose (PG), glycated hemoglobin

(A1C), total cholesterol (TC), HDL cholesterol (HDL-C), LDL (LDLc) cholesterol,

triglycerides (TGC), ultrasensitive C reactive protein (hsCRP), urea and serum

creatinine. There was still checking BMI, obesity, smoking, hypothyroidism,

hypertension, dyslipidemia and insulin resistance. Statistical analysis showed

significant differences (p

1 INTRODUO

18

O diabetes mellitus (DM) uma doena multifatorial associada ao aumento de

risco cardiovascular quando comparado a indivduos que no possuem a doena.

Dentre os tipos de DM, o diabetes mellitus tipo 2 (DM2) corresponde a cerca de 90%

dos casos de diabetes no mundo sendo que a epidemia de diabetes est

particularmente relacionada a este subtipo, que se manifesta pela resistncia e/ou

secreo reduzida de insulina. (WHO, 2013)

O DM representa um considervel encargo econmico tanto para o indivduo

quanto para a sociedade, especialmente quando mal controlado. A maior parte dos

custos diretos de seu tratamento est relacionada s suas complicaes que

comprometem a produtividade, a qualidade de vida e a sobrevida dos indivduos.

(PORTERO et al., 2003; MCLELLAN et al., 2006; IDF, 2013).

Os resultados de grandes estudos como The Diabetes Control and

Complications Trial Research Group (DCCT) e UK Prospective Diabetes Study

(UKPDS) demonstraram relao direta entre hiperglicemia cronicamente mantida e

as complicaes micro e macrovasculares (DCCT, 1993; UKPDS, 1998). Assim,

indivduos com diabetes representam cerca de 30% dos pacientes que se internam

em unidades coronarianas intensivas (SILVA et al., 2006). Cerca de 80% dos

indivduos diabticos morrem em decorrncia de eventos trombticos e 75% dessas

mortes resultam de eventos cardiovasculares (WHO, 2013).

Isso ocorre uma vez que as alteraes no endotlio provocadas pela

hiperglicemia promovem ativao do processo inflamatrio, que, juntamente com

hipertenso e dislipidemia, proporcionam a formao de placas aterosclerticas.

Estudos mostraram que a insulina possui efeitos seletivos na sntese de protenas

hepticas em pessoas normais, e que a resistncia aos seus efeitos levaria

sntese aumentada de protenas de fase aguda, como o fibrinognio e a protena C

reativa, caracterizando o processo inflamatrio (GRANT et al., 2007).

Assim, embora os parmetros da sndrome metablica como hiperglicemia,

dislipidemia e hipertenso possam causar leso vascular, a disfuno endotelial

pode ser intrnseca ao DM2 e esse quadro pode conduzir a um estado ativado

caracterizado, em parte, pela adeso e agregao plaquetria e aumento da

coagulabilidade (OUVINA et al., 2001).

19

A hiperglicemia tambm interfere no sistema fibrinoltico, uma vez que

estimula a produo do inibidor do ativador de plasminognio tipo 1 (PAI-1). Assim,

estudos tm mostrado que pacientes com DM2 possuem nveis aumentados de

marcadores de ativao da cascata da coagulao (D-di) e fibrinlise (PAI-1),

evidenciando estados pr-trombticos (VAUGHAN et al., 2005; NWOSE et al., 2007;

WAKABAYASHI et al., 2009). Assim, uma avaliao dos nveis desses marcadores

hemostticos pode ser fundamental na avaliao do risco trombtico de pacientes

com DM2. (DAWSON et al., 1993; ZORIO et al., 2008).

Os nveis de PAI-1 tambm so modulados geneticamente, uma vez que a

concentrao plasmtica de PAI-1 est correlacionada com o polimosfismo -675

4G/5G na regio promotora do gene do PAI-1. Indivduos que apresentam o

gentipo 4G/4G esto associados a uma maior produo de PAI-1, situao que

pode corroborar para estados pr-trombticos, devido uma maior inibio da

fibrinlise (DAWSON et al., 1993; ZORIO et al., 2008).

Muitas pesquisas mostram a associao positiva entre diabetes e marcadores

hemostticos e as evidncias apontam para desfechos que sugerem que o indivduo

com DM2 apresente um estado de hipercoagulabilidade e hipofibrinlise (YAMADA

et al., 2000; SOARES et al., 2010). No entanto, as correlaes entre as

complicaes vasculares no diabetes, hiperglicemia cronicamente mantida e o grau

de anormalidade da hemostasia ainda no foram completamente elucidados.

Neste contexto e dado o carter multifatorial do DM2, os estudos necessitam

de detalhamento no que diz respeito ao grau de comprometimento do organismo, s

comorbidades e s medidas teraputicas adotadas, uma vez que estes parmetros

refletem diretamente na progresso da doena e nos resultados dos marcadores

laboratoriais avaliados nesses indivduos.

Em consonncia ao grande impacto sobre as complicaes de DM2

determinadas pelos estados de inflamao, hipercoagulabilidade e hipofibrinlise

importante e justificvel investigar tais alteraes em um grupo de pacientes

diabticos tipo 2 que evoluram para insulinoterapia a fim de mapear a situao da

populao afetada. Vale, contudo, ressaltar que estudos dessa natureza ainda no

foram conduzidos na populao de estudo.

20

2 REFERENCIAL TERICO

21

2.1 DIABETES MELLITUS

O diabetes Mellitus (DM), segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS),

uma sndrome de etiologia mltipla, decorrente da falta de insulina e/ou

incapacidade da insulina de exercer adequadamente suas aes, caracterizada pela

hiperglicemia crnica e alteraes no metabolismo dos carboidratos, dos lipdeos e

das protenas (WHO, 2013).

O diabetes mellitus (DM) representa, atualmente, um dos problemas mais

significativos de sade pblica tanto nos pases desenvolvidos como tambm

naqueles em desenvolvimento. Em 1985, o nmero de indivduos diabticos na

populao mundial era de aproximadamente 30 milhes e em 1995, o nmero

chegou a 135 milhes. Em ltima nota, a Organizao Mundial de Sade (OMS), em

outubro de 2013, mostrou que 347 milhes de indivduos possuem diabetes mellitus

no mundo, estando, 25,1 milhes na Amrica Central e do Sul e 12,4 milhes no

Brasil. Estima-se que em 2004 3,4 milhes de pessoas morreram em consequncia

do diabetes, sendo as complicaes cardiovasculares responsveis por cerca de

50% da mortalidade (WHO, 2013; SBD, 2014).

Segundo a Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD) estamos vivendo uma

epidemia de diabetes. No Brasil, na dcada de 80, a prevalncia de diabetes era

estimada em 7,6%, sendo que hoje, as taxas apontam para 12,1 a 13,5%. Este

aumento pode ser explicado pelo crescente envelhecimento populacional,

urbanizao e principalmente pelo aumento do sedentarismo e obesidade (SBD,

2009; SBD, 2014).

Por ser o diabetes mellitus uma doena de natureza crnica, as complicaes

advindas da doena so geralmente graves e requerem meios onerosos para seu

controle, gerando altos gastos tanto para o paciente como para o sistema pblico de

sade. Acredita-se que o custo desta doena para o Brasil seja de aproximadamente

3,9 bilhes de dlares por ano (SBD, 2014).

No diabetes mellitus a hiperglicemia crnica culmina com o desenvolvimento

de patologia microvascular nos glomrulos renais, retina, e nervos perifricos.

Assim, devido a patologia microvascular, o diabetes mellitus a principal causa de

doena renal crnica, cegueira, doena e neuropatias debilitantes (BROWNLEE,

2001; 2005).

22

Alm da patologia microvascular, o diabetes mellitus associa-se tambm

doena aterosclertica macrovascular, afetando artrias que irrigam crebro,

corao e extremidades inferiores. Neste contexto, pacientes com diabetes tambm

possuem maior risco de acidente vascular cerebral, infarto agudo do miocrdio e

amputao de membros inferiores (BROWNLEE, 2001; BROWNLEE, 2005).

2.1.1 CLASSIFICAO E DIAGNSTICO

O diabetes mellitus representado por vrios distrbios metablicos

heterognios que possuem em comum a hiperglicemia, que pode advir de

perturbaes na ao e/ou secreo da insulina (SBD, 2014).

Atualmente, a classificao do DM baseada na etiologia da doena. A

Organizao Mundial da Sade (OMS), Associao Americana de Diabetes (ADA) e

a Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD) classificam o diabetes mellitus em:

DM1: ocorre destruio autimune ou idiopticas das clulas betapancreticas,

culminando na deficincia de insulina. Corresponde de 5 a 10% dos casos;

DM2: caracterizado por anormalidades na ao e secreo da insulina.

Geralmente ambos ocorrem, no entanto pode ocorrer predomnio de um dos

dois. A maior parte apresenta obesidade. Corresponde de 90 a 95% dos

casos;

Outros tipos especficos de DM: so as formas menos comuns da doena e

cujas causas podem ser observadas, como doenas pancreticas e

endcrinas, sndromes genticas e infeces;

DM gestacional: a alterao da glicemia que inicia-se ou diagnosticada

durante a gestao. Tambm relaciona-se resistncia a insulina e perda de

clula beta. Acontece em 1 a 14% das gestaes;

Pr diabetes: Caracterizado como um estado intermedirio entre homeostase

normal da glicose e o DM. Os pacientes nesta categoria possuem risco

aumentado de diabetes.

Segundo a Associao Americana de Diabetes (ADA), Organizao Mundial

da Sade (OMS) e Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD), os critrios para

23

diagnstico do DM2 atualmente aceitos so os abaixo descritos. Caso haja

positividade em qualquer um dos parmetros, pode ser confirmado o diagnstico de

diabetes (ADA, 2013; SBD, 2014).

Sintomas de poliria, polidipsia e perda ponderal acrescidos de glicemia

casual (a qualquer hora do dia) acima de 200 mg/dL;

Glicemia de jejum (ausncia de ingesto calrica por no mnimo 8hs) igual ou

superior a 126 mg/dL;

Glicemia de duas horas ps sobrecarga de 75 g de glicose acima de 200

mg/dL;

Hemoglobina glicada maior ou igual a 6,5%.

A evoluo at o DM2 ocorre em um perodo de tempo varivel, iniciando-se

em estgios intermedirios de glicemia de jejum alterada e tolerncia glicose

diminuda, decorrentes de uma combinao de resistncia ao da insulina e

disfuno de clulas beta (REPORTS, 1997; SBD, 2014; ADA, 2013).

Assim, a glicemia de jejum alterada e a tolerncia diminuda glicose so

condies clnicas que no caracterizam o DM2, mas que podem ser consideradas

como risco aumentado para diabetes, representando um estado intermedirio entre

a normalidade e o DM2. Segundo a Associao Americana de Diabetes (ADA) e

Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD), os critrios para definio do estado de

pr-diabetes so:

Glicemia de jejum (ausncia de ingesto calrica por no mnimo 8hs) 100 e

125 mg/dL;

Glicemia de duas horas ps sobrecarga de 75 g de glicose 140 e 199

mg/dL;

Hemoglobina glicada 5,7 e 6,4 mg/dL

A utilizao de hemoglobina glicada (HbA1C) como critrio de diagnostico

para o diabetes mellitus foi inicialmente proposta em 2009 / 2010 pela Sociedade

Brasileira de Diabetes e pela Associao Americana de Diabetes e tem sido mantida

conforme ltima publicao de ambas em 2014 (SBD, 2014; ADA, 2013). No

entanto, hemoglobinopatias, anemias hemolitica e ferropriva so situaes que

24

podem comprometer a aplicao deste parmetro como critrio de diagnstico. Alm

disso, recentemente tem sido relatado que a etnia pode ser outro fator de

discordncia entre os resultados de HbA1C, onde evidncias sugerem que os

afrodescendentes e asiticos possuem maiores nveis de HbA1c que caucasianos

para valores iguais de glicemia (ZIEMER, et al., 2010; JOHN, et al., 2012; ADA,

2014; SBD, 2014).

importante ressaltar que os critrios de diagnstico de DM por glicemia

plasmtica possuem nvel A de evidncia, no entanto, embora a hemoglobina

glicada ainda seja considerada critrio de diagnstico, pertinente a realizao de

estudos mais conclusivos, conforme reconhece a prpria SBD (SBD, 2014).

A resistncia insulina (RI) um estado caracterizado pela resposta

subnormal do organismo insulina e est presente em mais de 80% dos pacientes

com DM2. Ela acarreta o aumento da sntese de triglicerdeos, aumento do LDL-

colesterol e reduo do HDL-colesterol. Nos rins, a ao moduladora da insulina na

excreo de uratos, potssio e sdio modificada, com maior efeito poupador de

sdio, favorecendo a manuteno ou agravamento da hipertenso arterial sistmica.

Dessa forma, a resistncia ao da insulina est associada a uma srie de

anormalidades metablicas como hipertenso, dislipidemia, obesidade,

hiperglicemia, hiperinsulinemia, disfuno endotelial, hipercoagulao, hipofibrinlise

e inflamao (FESTA et al., 2000; TEMELKOVA-KURKTSCHIEV et al., 2003; SDB,

2014).

Assim, a resistncia insulina uma condio fisiopatolgica de importante

investigao clnica sendo considerada um fator de risco independente para doena

cardiovascular. Segundo a SBD, pode-se definir que um paciente tem resistncia a

insulina, na prtica clnica, quando se enquadra nos critrios de um dos modelos

propostos por Stern e colaboradores (2005) , aps estudos de grande porte que

avaliou 2.321 pacientes (STERN et al., 2005; SBD, 2014).

Neste estudo, adotaremos o modelo 3 proposto por Stern et al, que possui

81,3% de sensibilidade, 76,3% de especificidade e define os seguintes critrios para

resistncia insulina como sendo:

IMC > 28,7 Km/m2, ou

IMC > 27,5 Km/m2 + histria familiar de DM, ou

25

Histria familiar de DM negativa, mas triglicerdeo > 2,44 mmol/L (216 mg/dL)

(STERN et al., 2005; SBD, 2009; SBD, 2014).

Importante ressaltar que modificaes no estilo de vida podem definir o

desenvolvimento ou no do DM2 e tornam-se decisivas na sua preveno. Assim,

hbitos de vida mais saudveis como dieta balanceada e rica em fibras, controle do

peso e realizao de atividade fsica so capazes de reduzir em 58% o risco de um

indivduo com tolerncia a glicose reduzida e resistncia insulina tornar-se

diabtico (SBD, 2014).

2.1.2 TRATAMENTO

O tratamento do DM2 visa manuteno do controle metablico e

compreende terapias no medicamentosa e medicamentosa (BRASIL, 2001; SBD,

2014). Os recursos medicamentosos so empregados, geralmente, em um segundo

momento da teraputica, diante da incapacidade de controlar os nveis glicmicos

pela prtica da dieta e de exerccios fsicos (MALERBI & FRANCO, 1997; FOSTER

et al., 1998; ALAD et al, 2000; ADA, 2013). O tratamento no medicamentoso

consiste em adotar hbitos saudveis de vida, sobretudo em relao alimentao

adequada e prtica de atividades fsicas regulares (MODESTO et al., 2003),

contribuindo para reduo do ndice de massa corporal, melhora da sensibilidade

insulina, diminuio de glicemia e triglicerdeos e aumento do HDLc, importantes

para retardar a doena cardiovascular e outras complicaes do DM2 (SBH, 2005).

A Associao Americana de Diabetes e a Sociedade Brasileira de Diabetes

estabelecem metas para caracterizar o bom controle glicmico de pacientes com

DM2 e para isto definem os nveis desejveis e os nveis tolerveis para os

parmetros laboratoriais do controle glicmico (SBD, 2014; ADA; 2013).

Em relao glicemia de jejum, a meta

26

adolescentes de 13 a 19 e

27

Com o decorrer do DM2, a fase 4 marcada pelo predomnio claro da

insulinopenia ou insulinizao plena. Agora importante que o paciente receba

quantidades de insulina que satisfaam todas as suas necessidades diria,

geralmente 1 ou 2 aplicaes de insulina de depsito, acompanhada de insulina de

ao rpida, antes das refeies. Importante ressaltar que a associao com o

sensibilizador de insulina (metformina) pode ser mantida (BARRET et al 1998;

COUTINHO et al., 1999; SBD, 2009; SBD, 2014).

A medicao mais efetiva no que diz respeito reduo da hemoglobina

glicada em pacientes com DM2 a insulina. No entanto e de modo geral, a

utilizao da insulina muito aqum do que deveria e isso acontece pelo

desconhecimento. Assim h o receio de prescrio pelos mdicos e de utilizao

pelos pacientes e seus familiares, que encaram a utilizao da insulina como uma

punio, uma vez que a via de administrao mais invasiva e incmoda (SBD,

2009; 2014).

A conduta teraputica feita conforme a condio inicial do paciente e entre

os agentes medicamentosos disponveis para a terapia do diabetes incluem-se os

antidiabticos orais e a insulina. H evidncias de que o controle intensivo da

glicemia nos pacientes com diabetes tipo 2, tanto por meio de antidiabticos orais ou

insulina, substancialmente diminui o risco de complicaes microvasculares

(UKPDS, 1998).

A insulinoterapia no DM2 est indicada sempre que as metas laboratoriais

no se mantm adequadas com os agentes orais, no caso de hiperglicemia

sintomtica e de emagrecimento, como forma de reposio progressiva baseada na

evoluo de HbA1C. Assim, importante destacar que a insulinoterapia oportuna

pode ser necessria a qualquer tempo durante a evoluo natural do DM2 (SBD,

2014).

Existem insulinas de ao curta, intermediria e longa e os tipos de insulina e

seus anlogos disponveis no Brasil so a insulina regular, aspart e lispro (curta

ao), a insulina Protamina Neutra de Hagedorn (NPH) que uma suspenso de

insulina num complexo de zinco / protamina (ao intermediria) e a glargina (ao

longa). Elas permitem diferentes esquemas de administrao como forma de

mimetizar a secreo fisiolgica (FUCHS, et al. 2006).

28

A insulina um hormnio relacionado ao metabolismo, mas tambm funo

vascular e hemostasia. Estudos tm demonstrado que a insulina estimula a

produo de PAI-1, assim, um excesso deste hormnio capaz de promover

anormalidades em suas concentraes, aumentando o risco de eventos trombtico

(COSTA et al., 2006).

2.1.3 MANIFESTAES CLNICAS DO DM2 E COMPLICAES

O DM2 est associado ao aumento do risco de complicaes

microvasculares, sendo as mais prevalentes a nefropatia, retinopatia e neuropatia e

de complicaes macrovasculares, com destaque para doena arterial coronariana

(DAC), o acidente vascular cerebral (AVC) e a doena arterial obstrutiva perifrica

(DAOP) (BROWNLEE, 2001; NAZIMEK-SIEWNIAK et al., 2002). O DM2 uma

doena multifatorial que associa hiperglicemia a um conjunto de fatores de risco

cardiovasculares, incluindo hipertenso, obesidade visceral, dislipidemia,

microalbuminria e hipercoagulabilidade. A hipertenso arterial sistmica (HAS)

acomete cerca de 70% dos indivduos com DM2 e esses, geralmente, apresentam

controle glicmico ineficaz e dislipidemia (ZIMMET, 2001).

Cerca de 80% dos indivduos diabticos morrem em decorrncia de eventos

trombticos e 75% a 80% dessas mortes resultam de eventos cardiovasculares

(CARR, 2001). A presena de sobrepeso e obesidade exerce uma influncia

considervel na elevada morbidade e mortalidade da doena decorrente

principalmente da associao com a doena cardiovascular (ERBERLY et al., 2003).

Um estudo na populao brasileira revelou que 75% dos indivduos com DM2 no

estava na faixa de peso ideal, sendo que um tero tinha obesidade (GOMES et al.,

2006). Atualmente temos evidncias suficientes de que o melhor controle da

glicemia no incio da doena (STRATTON et al., 2000), da presso arterial (UKPDS,

1998) e da dislipidemia (HEART, 2003) resulta em uma reduo significativa nas

complicaes microvasculares e macrovasculares do paciente diabtico.

As complicaes macrovasculares do diabetes se devem principalmente

formao de placas aterosclerticas. A insulina est envolvida no metabolismo de

lipdeos, uma vez que ela regula a transcrio da lipase lipoproteica endotelial,

29

enzima que hidrolisa os triglicerdeos presentes nas VLDL e nos quilomicrons.

Assim, alteraes na concentrao e na funcionalidade da insulina promovem

alteraes no metabolismo lipdico favorecendo as complicaes macrovasculares

no diabetes (DAVIS & GRANNER, 1996). Alm da regulao exercida pela insulina,

a disfuno endotelial tambm favorece a hipertrigliceridemia, uma vez que a

enzima lipase lipoproteica endotelial, encontra-se reduzida tambm nessa situao.

Dessa forma, h um favorecimento da formao de placas aterosclerticas

(KASHIWAZAKI et al., 1998) e a manuteno dos nveis plasmticos ideais dos

lipdeos constitui um dos objetivos do tratamento dos indivduos diabticos para

evitar a progresso das complicaes macrovasculares secundrias ao diabetes

(WHO, 2013).

A hiperglicemia causa anormalidades no fluxo sanguneo e aumenta a

permeabilidade vascular. A presena de hiperglicemia persistente durante a

evoluo da doena pode levar a alteraes estruturais permanentes de tecidos e

funes celulares e, por isso, to importante monitorar a glicemia dos pacientes,

principalmente ao primeiro sinal de hiperglicemia (UKPDS, 1998; GROSS &

MASTROTOTARO, 2000; BROWLEE, 2005; BECKMAN, et al., 2013).

2.1.4 HIPERGLICEMIA E ENDOTLIO VASCULAR

A parede dos vasos sanguneos coberta internamente por uma fina camada

celular chamada endotlio. As clulas endoteliais possuem um papel primordial na

manuteno da fluidez sangunea, tnus e permeabilidade vasculares. Este cumpre

sua funo de manuteno do tnus vascular pela liberao de subtncias

vasoconstritoras e vasodilatadoras (PANENI, et al. 2013). Alm disso, so

responsveis por controlar funes vasculares, respostas expresso gnica e

sinalizao de processos celulares, como crescimento, apoptose, migrao e

remodelamento da matriz extracelular (BROWNLEE, 2001; BROWNLEE, 2005).

Uma das substncias liberadas pelas clulas endoteliais o fator de

relaxamento derivado do endotlio (EDRF) / xido ntrico (NO) capaz de dilatar os

vasos em resposta liberao de acetilcolina. Igualmente, estas clulas sintetisam e

liberam prostaciclinas (PGI2) e fatores hiperpolarizantes derivados do endotlio

30

(EDHFs), que tambm so considerados EDRFs por reduzir o tnus vascular

(vasodilatadores). Alm dos EDRFs, que so benficos funo vascular e

garantem a fluidez sangunea, o endotlio produz os fatores de constrio derivados

do endotlio (EDCFs) (WONG et al., 2010). Embora as substncias qumicas que

representem os EDCFs ainda no estejam bem elucidadas, nos ltimos anos, muitas

pesquisas tm apontado a prostaglandina H2, o tromboxano A2 (TXA2), os

leucotrienos, os anions de endotelina e o superxido como exemplos sugeridos de

EDCFs (VANHOUTTE et al., 2009).

A produo equilibrada destes fatores primordial para manter a homeostase

vascular, no entanto, algumas doenas, como o diabetes, prejudicam a liberao e

funo dos EDRFs, reduzindo as dilataes endotlio dependentes e aumentam a

liberao de EDCFs, contribuindo para vasoconstrico e complicaes vasculares

(VANHOUTTE et al., 2009; THOMAS et al., 2008). Este desequilbrio leva

disfuno endotelial e esta contribui para o desenvolvimento da aterosclerose por

gerar inflamao, rigidez arterial e alterao do tnus e fluxo arteriais. Assim, a

disfuno endotelial tem sido apontada como a principal responsvel pela leso

inicial da aterosclerose e um marcador precoce de doena cardiovascular (PANENI

et al., 2013; BECKMAN, et al., 2013).

Evidncias sugerem que a hiperglicemia causa excesso de produo de ROS

gerando um quadro de estresse oxidativo capaz de induzir disfuno endotelial e

inflamao, desempenhando um papel importante no desencadeamento de doena

vascular no diabetes (BROWNLEE, 2001; BROWNLEE, 2005; CREAGER, et al.,

2003; WILD et al., 2004; PANENI, et al. 2013).

O estresse oxidativo causado por um desequilbrio entre enzimas oxidantes

e antioxidantes, com consequente aumento da produo de espcies reativas de

oxignio (ROS) e um determinante crtico da disfuno endotelial no DM2.

(MEZZETTI, et al. 2000; HAJDARA, et al. 2006) A gerao de nion superxido

(O2-), induzida pela hiperglicemia, inativa NO ao formar peroxinitrito (ONOO2), um

oxidante poderoso que penetra facilmente atravs das membranas de fosfolipdios e

induz a nitrosilao de substratos. (CREAGER et al., 2003). As proteinas nitrosiladas

diminuem a atividade de enzimas endoteliais antioxidantes e da NO sintetase,

31

reduzindo a produo de NO e retroalimentando o estresse oxidativo (PANENI et al.,

2013).

Os superxidos diminuem a quantidade e inibem a funo de NO,

prostaciclina e outros EDHF e mediam a resposta EDCF por ativar COXs

aumentando a produo de prostaglandinas vasoconstritoras. Alm disso, as ROS

podem aumentar a expresso de citocinas pr-inflamatrias e de aderncia celular

(YANG et al., 2004), uma vez que, levam a um aumento de NF-kB e transcrio de

genes pr-inflamatrios que codificam selectinas, molculas de adeso celular

vascular-1 (VCAM-1) e de adeso intracelular-1 (ICAM-1). Isso facilita a adeso de

moncitos ao endotlio vascular, diapedese no sub-endotlio e subsequente

formao de clulas espumosas, o que caracteriza as placas aterosclerticas

(PANENI, et al. 2013; BECKMAN, et al., 2013).

Para explicar a produo de ROS induzia pela hiperglicemia, complexos

mecanismos bioqumicos tm sido propostos no sentido de associar a

anormalidades estruturais e funcionais dos tecidos vasculares hiperglicemia.

(BROWNLEE, 2001; BROWNLEE, 2005; SANTINI, 1997) So eles, a via dos poliis,

o fluxo das hexosaminas, a formao de produtos de glicao avanada (AGEs) e a

ativao da protena quinase C (PKC). (GIACCO & BROWNLEE, 2010; NISHIKAWA

et al., 2000)

2.1.4.1 Ativao da protena quinase C (PKC)

Estudos sugerem que PKC a molcula que mais afeta a homeostase

vascular em virtude da hiperglicemia. A PKC uma quinase serinatreonina envolvida

em eventos de transduo de sinais e que atua catalisando a transferncia de um

grupo fosfato do ATP a vrias protenas. Para ser ativada, a PKC tambm deve

sofrer fosforilao e esta ocorre em resposta ao aumento do mensageiro lipdico

diacilglicerol (DAG), seu principal ativador (IDRIS et al., 2001; BROWLEE, 2001;

BROWLEE, 2005)

Estados de hiperglicemia aumentam os nveis DAG, que ativa a PKC. Uma

conseqncia importante desta ativao a gerao de mais ROS, sendo esta, uma

das principais fontes de ROS atravs da hiperglicemia. Uma vez ativada, a PKC

responsvel por diversas alteraes estruturais e funcionais da vasculatura,

32

incluindo aumento da permeabilidade celular, angiognese, crescimento celular,

expanso da matriz extracelular, apoptose, inflamao e estados prtrombticos

(KOYA, et al.,1997; GERALDES, et al. 2010).

A enzima NADPH oxidase do tipo fagoctica a maior fonte de produo de

ROS em muitas clulas no-fagocticas, como fibroblastos, clulas musculares lisas

e endoteliais (GREENE, et al., 1999; BROWLEE, 2001; BROWLEE, 2005). Em

pequenas quantidades, a produo de ROS pela oxidase, primordial para a

sinalizao metablica, no entanto, em grandes quantidades pode gerar dano

oxidativo. A NADPH oxidase formada por subunidades que podem ser fosforiladas

por quinases, como a PKC, formando uma oxidase ativa cataliticamente. (KITADA et

al., 2003; EL-BENNA et al., 2005) Assim, em clulas endoteliais vasculares, a

ativao da PKC induzida pela hiperglicemia aumenta a produo de superxido por

meio de NADPH oxidase (INOGUCHI, et al. 2000; PANENI, et al. 2013; BECKMAN,

et al.2013).

A PKC pode afetar o endotlio no s pelo acumlo intracelular de ROS, mas

tambm por diminuir a atividade da enzima xido ntrico sintetase endotelial (eNOS)

(ALP, 2004; CONSENTINO, 1997). Alm disso, a PKC tambm promove aumento

da produo de endotelina-1 (ET-1), favorecendo a vasoconstrio e agregao

plaquetria (GERALDES et al., 2010). A produo de ROS dependente de PKC

tambm participa do processo aterosclertico, desencadeando inflamao vascular

e propiciando estados prtrombticos pelo aumento de PAI-1. (GIACCO, et al.,

2010).

A disfuno endotelial no diabetes no apenas o resultado

da no disponibilidade de NO, mas tambm do aumento da sntese de

vasocontritores e prostanides (PANENI et al., 2013; HINK et al., 2001). O aumento

dos nveis da ciclo-oxigenase - 2 (COX2) mediada pela PKC associa-se a um

aumento de tromboxano A2 e uma reduo da prostaciclina (PGI2) (PANENI, et al.

2013; BECKMAN, et al., 2013).

2.1.4.2 Aumento da produo de produtos de avanada glicao (AGEs)

Os AGEs so protenas ou lipdios que se tornam glicados aps a exposio a

acares oxidados e contribuem para o desenvolvimento de aterosclerose. Eles

33

podem ser gerados por auto-oxidao da glicose paraglioxal, decomposio de

produtos de amadori em 3-deoxiglucosona ou fragmentao do gliceraldeido-3-

fosfato em metilglioxal (WELLS-KNECHT et al,. 1995). As ROS mitocondriais

tambm aumentam a sntese de AGEs (PANENI et al,. 2013; BECKMAN et al.,

2013).

A gerao de AGEs leva disfuno celular, provocando a ativao de seus

receptores (RAGEs) em clulas endoteliais, mesangiais e macrfagos. (YAN et al,.

2010; BIERHAUS et al,. 2005) Acredita-se que os AGEs ao interagirem com seus

receptores, estimulam a produo de ROS com consequente ativao de citocinas

inflamatrias como as interleucinas 1 e 6, fator de crescimento I, fator de necrose

tumoral alfa (TNF), prostaglandinas e fator estimulador de colnias de granulcitos

(BROWNLEE, 2001; BROWNLEE, 2005).

Os AGEs se acumulam na maioria dos rgos-alvo que podem ser

acometidos no diabetes, como rim, retina e placas aterosclerticas. (HAMMES et al,.

1999) A glicao irreversvel do colgeno subendotelial e de outras protenas

estruturais do vaso forma produtos que acumulam no subendotlio em funo do

tempo e dos nveis glicmicos e esto diretamente relacionados aterosclerose e

insuficincia renal ( MEIGS et al., 2000; TAKEUCHI et al., 2001; TAN et al., 2002;).

Os AGEs promovem mudanas na estrutura e nas propriedades biofsicas da

membrana basal causando alteraes na permeabilidade e na capacidade

vasodilatadora dos vasos (TOOKE et al., 1995; PANENI et al. 2013; BECKMAN et

al., 2013). Alm disso, a glicao de fatores de transcrio provoca maior expresso

de genes pr-trombticos (PAI-1) e pr-inflamatrios (TGF, TGF1) pelas clulas

endoteliais (DOI et al., 1992; FULOP et al., 2007; BUSE et al., 2006).

A sinalizao AGE- RAGE ativa ainda outras vias bioqumicas sensveis a

ROS, como o fluxo das hexosaminas e fluxo da via dos poliis (PANENI et al., 2013;

BECKMAN et al., 2013).

2.1.4.3 Ativao da via dos poliis

A produo de ROS induzida pela glicose tambm ativa o fluxo da via dos

poliis envolvida em alteraes vasculares (NISHIKAWA et al., 2000; BECKMAN et

34

al., 2013; PANENI et al., 2013). A aldose redutase a primeira enzima da via dos

poliis e utiliza o NADPH como cofator para reduzir aldedos txicos a lcoois

inativos e, em menor quantidade, a glicose a sorbitol (BROWNLEE, 2001;

BROWNLEE, 2005).

A hiperglicemia regula positivamente a via dos poliis, atravs da atividade

elevada da aldose redutase e sorbitol desidrogenase, resultando numa diminuio

da proporo NADPH/NAD+ associada a um aumento da proporo

NADHcitosolico/NAD+. Subsequentemente ocorre a supresso da atividade das

enzimas antioxidantes superxido dismutase (SOD) e catalase, culminando no

aumento de ROS (MEZZETTI et al., 2000; HAIDARA et al., 2006). Assim, a

ativao da aldose redutase promove maior converso de glicose a sorbitol, reduz o

NAPH e a glutationa (antioxidantes intracelulares) e gera ainda mais estresse

oxidativo (BROWNLEE, 2001; BROWNLEE, 2005; PANENI et al., 2013; BECKMAN

et al., 2013).

2.1.4.4 Ativao da via das hexosaminas

Em um ambiente hiperglicmico, um aumento do fluxo de frutose 6 fosfato

ativa uma cascata de eventos que resulta em diferentes padres de glicosilao e

que so responsveis pela desregulao de enzimas envolvidas na homeostase

vascular, como a reduo da atividade e disfuno da xido ntrico sintetase

endotelial (eNOS) (FULOP et al., 2007; GIACCO et al., 2010). A ativao da via

hexosamina resulta em maior oxidao de eNOS, aumento da produo de citocinas

inflamatrias e aumento da transcrio de PAI-1 (BROWNLEE, 2001; BROWNLEE,

2005).

Diante do exposto, o estresse oxidativo o mecanismo que, como

consequncia da hiperglicemia, parece ser capaz de unificar todas as vias descritas.

Assim alterao central de todos estes processos parece ser a produo aumentada

de superxido pela cadeia de transporte de eltrons mitocondrial induzida pela

hiperglicemia (BROWLEE, 2001; BROWNLEE, 2005; PANENI et al., 2013;

BECKMAN et al., 2013).

35

2.2 HEMOSTASIA, HIPERCOAGULABILIDADE E HIPOFIBRINLISE

Alm do endotlio vascular, o processo hemosttico depende da interao

complexa e harmnica entre os componentes intravasculares que incluem as

plaquetas, as protenas plasmticas da coagulao, da anticoagulao e da

fibrinlise (JOBE, 1992; LOTSPEICH-STEININGER et al., 1992).

A integridade endotelial primordial para a manuteno da fluidez sangunea

uma vez que previne agregao plaquetria, apresenta propriedades

anticoagulantes e estimula o sistema fibrinoltico. Assim, para que a coagulao seja

iniciada, preciso que acontea a exposio de componentes que, em estados

normais, esto localizados no interior dos vasos sanguneos (VAM HINSBERG et al.,

2001).

As leses vasculares e as alteraes bioqumicas, como a liberao de

endotoxinas e citocinas, podem precipitar a expresso do fator tecidual (FT) pelas

clulas endoteliais e moncitos no espao intravascular. Aps a exposio do FT, a

coagulao ocorre por meio de ativao proteoltica seqencial de pr-enzimas por

proteases do plasma, resultando na formao de trombina, que converte por

protelise o fibrinognio solvel em fibrina insolvel. , portanto, uma cadeia de

reaes composta pelos fatores da coagulao, ons clcio (Ca2+) e fosfolipdios

presentes nas membranas e nos tecidos (FRANCO et al., 2001; LORENZI et al.,

2003) .

O processo de coagulao regulado por sistemas anticoagulantes

endgenos como a antitrombina (AT), a protena C (PC) e a protena S (PS) que

permitem que a formao de fibrina seja limitada ao local da leso endotelial

(DAHLBACK et al., 2005).

O sistema fibrinoltico tem por funo a degradao da fibrina resultante do

processo de coagulao. O mecanismo pelo qual isto ocorre consiste na converso

do plasminognio, pela ao do ativador do plasminognio (t-PA), em plasmina, uma

potente enzima proteoltica que atua sobre a fibrina levando formao de produtos

de degradaoque possuem diferentes pesos moleculares. O menor fragmento

desta degradao o dmero-D (D-Di), que possui uma meia vida plasmtica de 8

horas, com taxa urinria de eliminao (LIJNERT et al., 2003) .

36

Quando os nveis plasmticos de D-Dmero esto aumentados, h indicao

tanto de maior formao de fibrina como de ao aumentada da plasmina, sendo

considerado um marcador sanguneo tanto de fibrinlise como de

hipercoagulabilidade. Na prtica clnica, valores plasmticos superiores a 500 ng/dL

podem estar relacionados principalmente a trombose venosa profunda (TVP) e/ou

embolia pulmonar, infarto agudo de miocrdio (IAM) e/ou angina instvel,

coagulao intravascular disseminada (CIVD) aguda ou crnica e cirurgia recente.

Existe, portanto, a associao entre os nveis de dmero-D e a presena de doenas

trombticas, mas clinicamente, sua maior relevncia para excluso de

tromboembolismo pulmonar em servios de emergncia (NWOSE et al., 2007;

WAKABAYASHI et al., 2009; Mc BANE et al., 2010; SOARES et al., 2010).

A fibrinlise pode ainda sofrer a ao de ativadores e de inibidores. Um

inibidor o inibidor do ativador do plasminognio do tipo 1 (PAI-1) que promove a

inibio dos ativadores do plasminognio tipo tecidual (t-PA) e tipo uroquinase (u-

PA) resultando em menor formao de plasmina (RIJKEN et al., 2005).

O PAI-1 uma protena produzida por clulas endoteliais, tecido heptico e

adiposo. Sua expresso regulada por fatores de transcrio nucleares chamados

PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) e que tambm esto envolvidos

no metabolismo da glicose e dos lipdios (COSTA et al., 2006). Sua sntese

estimulada pela interleucina 1 (IL-1), fator de necrose tumoral (TNF), fatores de

crescimento e hormnios como estrgeno e insulina. (SOARES et al., 2010) Assim,

como insulina estimula a produo de PAI-1 (COSTA et al., 2006), um excesso

deste hormnio capaz de promover anormalidades em suas concentraes,

aumentando o risco de eventos trombticos.

A literatura tem sugerido que pacientes com diabetes apresentam,

geralmente, estados de hipercoagulabilidade e hipofibrinlise, com a presena de

nveis elevados dos marcadores hemostticos (YAMADA et al., 2000; ASO et al.,

2000; MEIGS et al., 2000; CARR et al., 2001; MCBANE et al., 2010).

A hiperglicemia e a hiperinsulinemia atuam sobre o sistema fibrinoltico

estimulando a produo de PAI-1. Dessa forma, ambos os estados associam-se

hipofibrinlise de forma independente (DU, et al., 2000). Tal condio favorece a

37

permanncia do cogulo de fibrina e, consequentemente, o desenvolvimento de

trombos (YUDKIN et al., 1999; DU et al., 2000).

Estudos tm evidenciado uma reduo na capacidade fibrinoltica e nveis

elevados de PAI-1 em pacientes com doena coronariana estabelecida e tambm

em indivduos saudveis que desenvolveram doena coronariana durante o

acompanhamento (THOGERSEN et al., 1998; FALCO et al., 2001). No entanto,

outros estudos questionam o papel do PAI-1 neste cenrio, uma vez que a

associao desapareceu aps ajuste para fatores confundidores como DM2,

hipertenso arterial, IMC e triglicerdeos (FOLSOM et al., 2001).

O inibidor do ativador do plasminognio do tipo 1 (PAI-1) parece ser mais que

um simples marcador de sndrome metablica, podendo ser considerado um

verdadeiro componente desta, e ser, inclusive, um atraente alvo para o

desenvolvimento de drogas futuras (WESTRICK et al., 2007; ZORIO et al., 2008).

Os nveis de PAI-1 foram aumentados em pacientes com sndrome

metablica e com DM2 com sndrome metablica. H indcios de que os nveis de

PAI-1 esto associados com parmetros da sndrome metablica como IMC, HDL-c

e resistncia insulina, que so parmetros considerados como risco para o

desenvolvimento de diabetes tipo 2 e doenas cardiovasculares (MEIGS et al., 2006;

AL-HAMODI et al., 2011).

Assim, nvel elevado de PAI- 1 parece ser um fator de risco independente

para o desenvolvimento do DM2 em indivduos saudveis, ou seja, o aumento de

PAI-1, provavelmente, precede o desenvolvimento de DM2 (GRANT et al., 2007).

Outros distrbios do sistema hemosttico como aumento da formao de

trombina e altos nveis de fibrinognio foram encontrados em pacientes diabticos

com risco cardiovascular (JUHAN-VAGUE et al., 1996; DEGUCHI et al., 2000; VAN

et al., 2003). Alm disso, o estado de hiperglicemia de pacientes com diabetes

determina que a fibrina formada seja mais rgida, resultante do fibrinognio glicado,

o que tambm dificulta a degradao do cogulo (SOARES et al., 2010; UNDAS et

al., 2014).

Sabe-se que D-Di e PAI-1 so marcadores hemostticos aumentados em

pacientes com DM2, no entanto, como a etiologia da complicao vascular no

diabtico multifatorial, no se sabe se o estado de hipercoagulabilidade causa ou

38

conseqncia da leso vascular. Alguns estudos, inclusive, mostram que o nvel

sanguneo elevado de PAI-1 tambm um fator de risco independente para o

desenvolvimento do DM2 em indivduos saudveis (GRANT et al., 2007).

Os eventos trombticos so causados por vrios fatores hereditrios e

adquiridos, que agem isoladamente ou em conjunto, resultando em uma situao de

desequilbrio hemosttico e induzindo uma condio pr-trombtica (GEMMATI et

al., 1998). Dentre os fatores genticos tm sido descritos dois polimorfismos no gene

do inibidor do ativador do plasminognio-1 (PAI-1), que pode estar relacionado com

a patognese da trombose venosa e da doena coronariana. A insero ou deleo

de um nucleotdeo na regio promotora do gene do PAI-1 (-675 4G/5G) foi

identificada a 675 pb antes do incio da transcrio. Este polimorfismo produz dois

alelos contendo quatro ou cinco sequncias de guaninas (G). Estudos in vitro tm

mostrado aumento da transcrio do gene associado presena do alelo 4G, o que

explica, provavelmente, o mecanismo pelo qual observado o aumento dos nveis

plasmticos de PAI-1 em indivduos portadores desse alelo. Recentemente, foi

descrita a associao do polimorfismo 4G/5G com parmetros da sndrome

metablica, indicando que este pode aumentar o risco de DM2 e doena

cardiovascular (AL-HAMODI et al., 2012). Portanto, a genotipagem deste

polimorfismo pode ser relevante para avaliar o risco de trombose ou doena

coronariana (NAUCK et al., 1999). O gentipo 4G/4G tem sido associado

retinopatia diabtica em pacientes com DM2 (FUNK et al., 2005; EZZIDI et al.,

2009).

2.3 DIABETES MELLITUS E INFLAMAO

A aterosclerose uma doena inflamatria originada por multifatores e de

evoluo crnica que acontece devido agresso ao endotlio vascular (SBD, 2013)

A disfuno endotelial faz com que lipoprotenas plamticas, como a LDLc,

tornem-se mais permeveis, atravessem o endotlio e cheguem camada ntima,

favorecendo seu acmulo no espao subendotelial. As partculas de LDLc sofrem

oxidao e favorecem o surgimento de molculas de adeso leucocitrias na

superfcie endotelial que so responsveis por atrair moncitos e linfcitos para a

ntima. No espao subendotelial os moncitos se diferenciam e macrfagos que

39

fagocitam as LDLc oxidadas formando as clulas espumosas, principal componente

da leso aterosclertica inicial. A progresso da placa ocorre mediante secreo

pelos macrfagos, de citocinas inflamatrias e de enzimas proteolticas

degradadoras de colgeno e outros componentes teciduais. Mesmo que em menor

quantidade, os linfcitos T no interior do ateroma tambm produzem citocinas

inflamatrias e contribuem para evoluo do processo inflamatrio (HANSSON,

2005).

As clulas musculares lisas da camada arterial mdia so estimuladas por

mediadores da inflamao a proliferarem e migrarem para a camada ntima,

passando a produzir citocias, fatores de crescimento e matriz extracelular. Assim,

so componentes da placa aterosclertica, elementos celulares, ncleo lipdico e

necrtico e componentes da matriz extracelular. Quando estveis, possuem maior

quantidade de colgeno apresentados em espessas capas fibrosas, poucas clulas

inflamatrias e pequenos ncleos lipdicos e necrticos. No entanto, as placas

instveis possuem acentuada atividade inflamatria e proteoltica, proeminentes

ncleos lipdicos e necrticos e uma fina capa fibrtica (LIBBY et al., 2005). So as

instveis que mais determinam as manifestaes clnicas da aterosclerose, uma vez

que a ruptura dessa capa libera material lipdico altamente trombognico,

culminando na formao sobrejacente de trombos (aterotrombose) (CUCHEL et al.,

2007).

As clulas hepticas produzem protenas inflamatrias, sendo as mais

relevantes da prtica clnica, a protena C reativa (PCR) e o fibrinognio, que tm

sido consideradas marcadores de inflamao sistmica.

A PCR uma protena sintetizada por hepatcitos, clulas endoteliais e

adipcitos, e cuja regulao feita por citocinas inflamatrias (WU et al., 2006;

ABDELLAOUI et al., 2007). Alm dos estados inflamatrios agudos, os nveis de

PCR esto ligeiramente aumentados em estados inflamatrios crnicos, como a

aterosclerose. Assim, a inflamao extremamente relevante no desenvolvimento e

na progresso da aterosclerose, uma vez que o aumento dos marcadores de

inflamao ocorre anos antes do evento coronariano (HERNNDEZ et al., 2006).

Estudos tm evidenciado que a PCR inibe a xido ntrico sintetase endotelial

e consequentemente a liberao de NO, induz a expresso de molculas de adeso,

40

estimula produo de fator tecidual e a captao de colesterol pelos macrfagos, e

promove ativao plaquetria e aumenta a produo de citocinas pr-inflamatrias

pelos moncitos (PRADHAM et al., 2001; MOJIMINIYI et al., 2002; DARVALL et al.,

2007; DANDONA et al., 2007).

O fibrinognio uma glicoprotena de alto peso molecular composta por dois

pares de trs cadeias polipeptdicas no idnticas, que so ligadas por pontes de

hidrognio (SAITO et al., 1996).

A trombose arterial pode ser definida como um acmulo crnico de ateroma,

seguido de ruptura da placa, agregao plaquetria e falncia do sistema fibrinoltico

em lisar o trombo (BAUER, 1998). O fibrinognio capaz de promover trombose

arterial por meio da formao de fibrina, agregao plaquetria e aumento da

viscosidade plasmtica. Alm disso, ele induz a proliferao de clulas do endotlio,

corroborando para o desenvolvimento da aterosclerose (DARVALL et al., 2007).

Assim, a inflamao que acompanha a aterosclerose pode colaborar para os

nveis elevados de fibrinognio e este pode contribuir para trombose arterial na

medida em que aumenta a formao de fibrina, a viscosidade plasmtica, a

agregao plaquetria e proliferao muscular lisa (ERNST et al., 1997).

O aumento dos nveis plasmticos de fibrinognio tambm considerado um

fator de risco independente para a doena cardiovascular (JUHAN-VAGUE, 1996;

DEGUCHI, et al., 2000; VAN & ROSENDAAL, 2003) e este se encontra aumentado

nos pacientes com DM2. (DUNCAN et al., 1999; YUDKIN et al., 1999; MEIGS et al.,

2000).

Os indivduos que apresentam sndrome metablica, estado que geralmente

antecede o DM2, possuem um quadro subclnico de inflamao crnica. A insulina

um hormnio que promove o aumento da sntese heptica de albumina e diminuio

de fibrinognio e PCR. Assim, indivduos com a reduo dos efeitos fisiolgicos da

insulina ou resistncia insulina, perdem esta funo e podem ter os nveis desses

marcadores inflamatrios aumentados. (DARVALL et al., 2007; DANDONA et al.,

2007; FESTA et al., 2000; SCHIMIDT et al., 1999).

Um estudo prospectivo de fatores de risco para doena cardiovascular em

adultos com idade igual ou superior a 65 anos avaliou 5.888 pessoas que tinham

glicemia de jejum normal e o papel dos marcadores inflamatrios, PCR e

41

fibrinognio, no desenvolvimento do DM2. Os pacientes que desenvolveram DM2

apresentaram nveis basais mais elevados de PCR do que aqueles que se

mantiveram normoglicmicos. Pacientes com nveis elevados de PCR tiveram 2,03

vezes mais chance de desenvolver diabetes durante o acompanhamento

(BARZILARY et al., 2001).

No Insulin Resistance Atherosclerosis Study (IRAS), foi observado um

aumento linear dos nveis de PCR com o aumento do nmero de desordens

metablicas. Posteriormente, nesse mesmo estudo, foram analisados os nveis de

PCR e fibrinognio em pacientes que desenvolveram diabetes em cinco anos de

acompanhamento. Os pacientes apresentavam valores basais significativamente

mais elevados de fibrinognio e PCR quando comparados aos que no

desenvolveram diabetes (FESTA et al., 2000).

Neste nterim, evidncias tm sugerido que a inflamao crnica pode

preceder o desenvolvimento do DM2 e valores elevados dos marcadores

inflamatrios como PCR e fibrinognio podem identificar uma populao de alto risco

entre pessoas com tolerncia normal glicose, com o potencial de prevenir doena

aterosclertica e DM2 (BARZILARY et al., 2001; FESTA et al., 2002).

42

3 OBJETIVOS

43

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliao de marcadores bioqumicos, hemostticos e inflamatrios em

pacientes com diabetes mellitus tipo 2 em insulinizao do territrio de Consolao,

Vitria / ES.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Caracterizao bioqumica de pacientes com diabetes tipo 2 em insulinizao,

atravs da avaliao de: hemoglobina glicada, glicemia de jejum, colesterol

total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicerdeos, protena C reativa ultra-

sensvel, ureia e creatinina;

Determinar os nveis plasmticos de inibidor do ativador do plasminognio

tipo 1 (PAI-1), D-Dmero (D-Di) e fibrinognio para caracterizaes

hemosttica e inflamatria de pacientes com diabetes mellitus tipo 2 em

insulinizao;

Correlacionar os marcadores inflamatrios e hemostticos (PAI-1, fibrinognio

e D-dmero) entre si e com parmetros clnicos, bioqumicos e

antropomtricos em pacientes com DM2 em insulinizao;

Correlacionar a presena de polimorfismo (-675 4G/5G) na regio promotora

do gene do PAI-1 com seus nveis plasmticos em pacientes com DM2 em

insulinizao;

Estudarmos a razo de ocorrncia das covariveis e sua influncia nos

indivduos afetados para predizer, independentemente, a ocorrncia de DM2

em insulinizao.

44

4. METODOLOGIA

45

Trata-se de um estudo de caso-controle, onde as observaes e estudo de

resultados foram referentes a indivduos com diagnstico de diabetes mellitus tipo 2

(DM2), especificamente os que utilizam insulina, e indivduos sem diabetes mellitus

(controles). Ao todo foi tomada uma amostra de 80 pessoas, sendo dessas 40

portadoras de DM2 em insulinizao e as outras 40, indivduos sem DM.

O projeto foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa (CEP) da

Universidade Federal do Esprito Santo (UFES) (anexo 1) e os indivduos que

participaram do estudo, aps serem convidados e receberem explicaes sobre o

projeto, responderam ao questionrio de pesquisa (Apndice 1) e assinaram o

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TCLE (Apndice 2).

4.1 CASUSTICA

4.1.1 POPULAO DO ESTUDO

A Ateno Bsica (AB) caracterizada por um conjunto de aes de

promoo, preveno, recuperao e reabilitao de sade nos mbitos individual e

coletivo que so realizadas atravs do trabalho em equipe e dirigidas a populaes

de territrios delimitados Como forma de implementar a AB, o Governo Federal

props aos municpios a Estratgia de Sade da Famlia (ESF), que direcionada

para a comunidade com foco nas famlias, para as quais promove suas principais

aes (MS, 2006).

Os participantes deste estudo pertencem ao territrio de sade composto

pelos bairros Horto, Consolao, So Benedito e Gurigica (Floresta e Jaburu) do

municpio de Vitria / ES. Este territrio conta com um total de 11.645 habitantes que

so atendidos pela equipe de ESF da Unidade Bsica de Sade de Consolao

(PMV/IBGE, 2011). A principal causa de mortalidade devido s doenas

cardiovasculares que contabilizam 32,6% das mortes no local, sendo maior que a

mdia nacional de 31,9% (PMV, 2012).

o territrio do municpio com o maior nmero de famlias cadastradas no

programa bolsa famlia do governo nacional, sendo que sua populao caracteriza-

se pelo alto ndice de analfabetismo, baixa escolaridade e baixa renda familiar, o que

pode refletir negativamente no estilo de vida bem como dificultar a compreenso e

46

conscientizao de seus processos nosolgicos. O territrio possui ainda um alto

ndice de violncia, sendo classificado como de alto risco socioeconmico. Alm

disso, apresenta-se como morros, becos e escadarias, fruto de sua ocupao

desordenada, o que pode prejudicar o acesso dos usurios aos servios oferecidos

pela Unidade Bsica de Sade de Consolao bem como influenciar na qualidade

de vida e acesso s necessidades bsicas (PMV, 20012).

4.1.2 CRITRIOS DE INCLUSO

Foram includos 40 indivduos adultos, de ambos os sexos, na faixa etria de

25 a 80 anos, cadastrados e atendidos pela Estratgia Sade da Famlia (ESF) de

uma Unidade Bsica de Sade (UBS) do municpio de Vitria, com diagnstico

clnico e laboratorial de diabetes mellitus tipo 2 h pelo menos um ano e que

tivessem evoludo para insulinoterapia. Para o grupo controle, foram includos 40

indivduos adultos com idade entre 25 e 80 anos sem histrico de diabetes mellitus.

Assim, os pacientes selecionados compuseram os seguintes grupos:

Grupo controle: 40 indivduos que no possuam diabetes mellitus.

Grupo com DM2: 40 indivduos dom diagnstico clnico e laboratorial de DM2

e j evoludos para insulinoterapia.

4.1.3 CRITRIOS DE EXCLUSO

Foram excludos de ambos os grupos, indivduos que apresentavam

qualquer uma das seguintes condies:

Cncer;

Doena infecciosa aguda ou processo infeccioso em desenvolvimento;

Doena heptica crnica;

Gravidez;

Alcoolismo;

Distrbios da coagulao;

47

Uso de antiagregante plaquetrio e/ou anticoagulantes;

Terapia de reposio hormonal;

Incio do uso de anticoncepcional contendo derivados de estrognio nos trs

meses antecedentes ao estudo;

Submisso cirurgia nos trs meses antecedentes ao estudo.

4.2 MTODOS

4.2.1 AMOSTRA BIOLGICA

A coleta de sangue foi realizada entre maro e novembro de 2013. Foi

solicitado aos participantes que respeitassem um perodo de 12 horas de jejum

antes da coleta que foi feita por puno venosa utilizando um sistema de tubos sob

vcuo (Vacuette).

Para as dosagens bioqumicas, glicemia de jejum (GJ), hemoglobina glicada

(HbGA1c), ureia, creatinina, colesterol total (CT), HDLc, LDLc, VLDLc e protena C

reativa ultra sensvel (PCRus), foram coletados de cada paciente 4,0 mL de sangue

venoso em tubos do sistema Vacuette com anticoagulante EDTA e 4,0 mL de

sangue venoso em tubos do sistema Vacuette sem anticoagulante. Estas amostras

seguiram para as dosagens que foram realizadas pelo Laboratrio Central da

Prefeitura Municipal de Vitria.

Para a extrao do DNA, foram coletados 4mL de sangue venoso em tubos

do sistema Vacuette com anticoagulante EDTA. As amostras obtidas foram

aliquotadas, identificadas e armazenadas a -20C at o momento da extrao do

DNA no laboratrio de Bioqumica Clnica da UFES.

Para as dosagens dos marcadores hemostticos, foram coletados 4,0 mL de

sangue venoso em tubos com citrato de sdio 3,8%. As amostras obtidas em citrato

foram centrifugadas a 3.000 rpm durante 20 minutos, para obteno das amostras

de plasma pobre em plaquetas, e foram aliquotadas, identificadas e armazenadas a

- 80 C at o momento das dosagens de PAI-1, d-dmero e fibrinognio na UFES.

48

4.2.2 AVALIAO DOS PARMETROS CLNICOS E ANTROPOMTRICOS

Os parmetros sexo, idade, tabagismo, ndice de massa corporal (IMC),

tempo de diagnstico, tempo de incio da insulinoterapia, presena de histria

familiar de diabetes, resistncia insulina (RI), hipertenso arterial sistmica (HAS),

hipotireoidismo, e medicamentos em uso foram medidos e/ou obtidos no momento

da realizao do questionrio respondido pelos pacientes e por meio das

informaes contidas no pronturio eletrnico de cada paciente.

4.2.3 AVALIAO DOS PARMETROS BIOQUMICOS

Os parmetros bioqumicos foram analisados pelo Laboratrio Central da

Prefeitura Municipal de Vitria (PMV) e permitiram traar os perfis glicmico e

lipdico, alm de evidenciar os marcadores renal e inflamatrio dos participantes.

4.2.3.1 Perfil Glicmico

4.2.3.1.1 Determinao de hemoglobina glicada (HbA1C)

A determinao da hemoglobina glicada foi feita por cromatografia lquida de

alta performance (HPLC) em coluna de troca inica, utilizando o sistema VARIANT II

HbA1C (Bio-Rad), seguindo rigorosamente as instrues dos fabricantes. Valor de

referncia conforme citado em tpico anterior (SBD, 2014 e ADA, 2013).

4.2.3.1.2 Determinao de glicose (glicemia de jejum)

As concentraes de glicose foram determinadas por ensaio colorimtrico

enzimtico com hexoquinase, utilizando os sistemas automatizados Roche/Hitachi

cobas, seguindo rigorosamente as instrues dos fabricantes. Valor de referncia

conforme citado em tpico anterior (SBD, 2014 e ADA, 2013).

4.2.3.1.3 Determinao da resistncia insulina (RI)

Neste estudo, adotaremos para determinao da resistncia insulina o

modelo 3 proposto por Stern et al, que define os seguintes critrios:

49

IMC > 28,7 Km/m2, ou

IMC > 27,5 Km/m2 + histria familiar de DM, ou

Histria familiar de DM negativa, mas triglicerdeo > 2,44 mmol/L (216 mg/dL)

(STERN et al., 2005; SBD, 2009; SBD, 2014).

4.4.3.2 Perfil Lipdico

4.2.3.2.1 Determinao de Triglicerdio

As concentraes de triglicerdio foram determinadas por ensaio colorimtrico

enzimtico com lipase lipoproteica, utilizando os sistemas automatizados

Roche/Hitachi cobas, seguindo rigorosamente as instrues dos fabricantes.

Valor de referncia (SBC, 2013):

Adultos acima de 20 anos:

timo: < 150 mg/dL

Limtrofe: 150 a 200 mg/dL

Elevado: 200 a 499mg/dL

Muito elevado 500 mg/dL

4.2.3.2.2 Determinao de Colesterol total

As concentraes de colesterol total foram determinadas por ensaio

colorimtrico enzimtico com colesterol oxidase, utilizando os sistemas

automatizados Roche/Hitachi cobas, seguindo rigorosamente as instrues dos

fabricantes.

Valor de referncia (SBC, 2013):

Adultos acima de 20 anos:

Desejvel: < 200 mg/dL

Limtrofe: 200 a 239 mg/dL

Elevado: 240 mg/dL

50

4.2.3.2.3 Determinao de Colesterol LDL

Os nveis plasmticos de colesterol LDL foram determinados atravs da

equao do Friedwald, sabendo da dificuldade de dosar os valores de LDLc quando

os nveis de triglicerdios so superiores a 400 mg/dL, na presena de quilomcrons

e hiperproteinemia tipo 3 (Fredrickson).

Equao de Friedewald: LDLc = CT (HDLc + VLDLc)

Valor de referncia (SBC, 2013):

Adultos acima de 20 anos:

timo: < 100 mg/dL

Desejvel: 100 a 129 mg/dL

Limtrofe: 130 a 159 mg/dL

Elevado: 160 a 189 mg/dL

Muito elevado 190 mg/dL

4.2.3.2.4 Determinao de Colesterol HDL

As dosagens de colesterol HDL foram feitas por teste colorimtrico enzimtico

na presena de ons de magnsio e sulfato de dextrano, utilizando os sistemas

automatizados Roche/Hitachi cobas, seguindo rigorosamente as instrues dos

fabricantes.

Valor de referncia (SBC, 2013):

Adultos acima de 20 anos:

Baixo: < 40 mg/dL

Elevado: > 60 mg/dL

4.2.3.2.5 Determinao de Colesterol VLDL

Os nveis plasmticos de colesterol VLDL foram determinados atravs da

equao do Friedwald.

VLDLc = TG/5 (para TG< 400 mg/dL)

51

Valor de referncia (SBC, 2013):

Inferior a 30 mg/Dl

4.2.3.3 Marcadores Renais

4.2.3.3.1 Determinao de Uria

As concentraes de ureia foram determinadas por ensaio colorimtrico

enzimtico com urease / glutamato desidrogenase, utilizando os sistemas

Roche/Hitachi cobas

Valor de referncia (SBC, 2013):

65 anos: < 50 mg/dL

> 65 anos: < 71 mg/dL

4.2.3.3.2 Determinao de Creatinina

A creatinina plasmtica foi determinada por ensaio colorimtrico cintico

baseado no mtodo de Jaff com picrato alcalino, utilizando os sistemas

automatizados Roche/Hitachi cobas, seguindo rigorosamente as instrues dos

fabricantes.

Valor de referncia (SBC, 2013):

Homens: 0,7 a 1,2 mg/dL

Mulheres: 0,5 a 0,9 mg/dL

4.2.3.4 Marcador de inflamao

4.2.3.4.1 Determinao de Protena C Reativa ultra sensvel (PCRus)

Os nveis plasmticos totais de protena C reativa foram determinados pelo

ensaio imunoturbidimtrico com intensificao da reao por partculas de ltex

revestidas com anticorpos monoclonais anti-PCR, utilizando os sistemas

automatizados Roche/Hitachi cobas, seguindo rigorosamente as instrues dos

fabricantes.

52

Valor de referncia (SBC, 2013):

Adulto: < 0,5 mg/dL

4.2.4 AVALIAO DOS PARMETROS GENTICOS

4.2.4.1 Extrao do DNA genmico

O DNA genmico dos pacientes foi extrado com o kit Wizard Genomic DNA

Purification (Promega), seguindo-se rigorosamente as instrues do fabricante.

Uma alquota de 300 L da amostra de sangue total de cada paciente foi transferida

para um tubo eppendorf de 1,5 mL estril e incubada com uma soluo de lise de

hemcias por dez minutos, temperatura ambiente. Aps, a amostra foi

centrifugada a 14.000 rpm, durante um minuto em microcentrfuga. A etapa foi

repetida. Houve o descarte do sobrenadante e ao sedimento foi adicionada soluo

de lise celular. Foi adicionada soluo de precipitao de protenas e a amostra foi

agitada em vrtex durante trinta segundos. A amostra foi centrifugada a 14.000 rpm

durante trs minutos. Para um tubo contendo isopropanol, foi transferido o

sobrenadante contendo DNA e a amostra foi invertida cerca de trinta vezes para

precipitao do DNA. A amostra foi centrifugada a 14.000 rpm por trs minuto. O

isopropanol foi descartado e, em seguida, adicionado etanol a 70%. Os tubos foram

invertidos por cerca de trinta vezes, a amostra foi centrifugada a 14.000 rpm por trs

minutos. O sobrenadante foi descartado e as amostras permaneceram secando por

doze horas. Foi adicionado 30L de soluo de hidratao (Tris 10 mM/ EDTA 0,1

mM) e houve incubao em banho seco 65C por 1 hora.

O DNA de cada amostra foi quantificado usando-se um espectrofotmetro

(NanoDrop ND-2000 UV-vis). Aps este procedimento, as amostras foram

armazenadas em geladeira para posterior pesquisa do polimorfismo.

4.2.4.2 Deteco do polimorfismo - 675 4G/5G

O polimorfismo - 675 4G/5G na regio promotora do gene do PAI-1 foi

detectado utilizando a tcnica de PCR alelo especfica. Esta foi padronizada de

acordo com condies previamente descritas, utilizando-se os oligonucleotdeos

descritos na literatura (MANSFIELD et al., 1995) (Quadro 1).

53

Quadro 1 - Oligonucleotdeos sintticos utilizados na PCR para deteco do

polimorfismo (- 675 4G/5G) na regio promotora do gene do PAI-1

Mutao ligo senso ligo antisenso

PAI-1 4G

5 GTC TGG ACA CGT GGG GA 3

PAI-1 5G 5 GTC TGG ACA CGT GGG GG 3

PAI-1 4G/5G 5 AAG CTT TTA CCA TGG TAA CCC CTG GT 3

5 TGC AGC CAG CCA CGT GAT TGT CTA G 3

Polimorfismo 4G/5G no gene do PAI-1 (MANSFIELD, et al., 1995).

Para a PCR, foi utilizado o termociclador modelo S1000 ThermalCycler da

marca BIO-RAD, e os reagentes foram oligonucleotdeos (Invitrogen),

desoxirribonucleotdeos (Promega), tampo (15 mM de MgCl2, 500 mM de KCl, 100

mM de Tris HCl pH 8,4 e 1% de TritonX-100) e Taq polimerase (Promega). As

misturas foram preparadas para um volume final de 20 L.

As condies de amplificao, como o nmero de ciclos, concentrao de

reagentes e temperatura de anelamento foram padronizados para cada segmento

genmico a ser amplificado com o objetivo de se obter um bom sinal de amplificao

com o mnimo de inespecificidade (Quadros 2 e 3). Em todos os conjuntos de

reaes de amplificao foi utilizado um tubo sem DNA (branco), que funciona como

controle dos reagentes.

Quadro 2 - Concentraes de reagentes utilizados nas PCRs para deteco do polimorfismo (- 675 4G/5G) na regio promotora do gene do PAI-1

Concentrao

Concentraes de uso

Reagentes Estoque PAI-1 4G

PAI-1 5G

Tampo

5X (7,5mM MgCl2)

1X (1,5mM MgCl2)

1X (1,5mM MgCl2)

Dntp

2mM

0,2 Mm

0,2 mM

ligo senso

100 M

10 M (4G)

10 M (5G)

ligo antisenso

100 M

10,0 M

10,0 M

Taq polimerase

5 U/L

1U

1U

DNA

53 ng/L (mdia)

212 ng

212 ng

gua qsp *

20L

20L

qsp: quantidade suficiente para

54

Quadro 3 - Programa de PCR, para deteco do polimorfismo (- 675 4G/5G) na

regio promotora do gene do PAI-1, utilizado no termociclador

Etapas

Gene a ser amplificado

PAI-1 (4G/5G)

Desnaturao prvia 95 - 5 min

Desnaturao 95 - 1 min

Anelamento 58 - 1 min

Extenso 72 - 1 min

N de ciclos 25 ciclos

Extenso final 72 - 5 min

Aps amplificao do segmento especfico para os gene