CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA DE …repositorio.roca.utfpr.edu.br/jspui/bitstream/1/8589/1/PG_COALM_20… · LEVEDURAS SUBMETIDAS A PRESERVAÇÃO PROLONGADA TRABALHO

UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

DIRETORIA DE GRADUAÇÃO E ENSINO PROFISSIONAL

COORDENAÇÃO DO CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS

LAURA NEVES FACCO

MONIQUE DE PAULA

MURILO HAS

CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA DE

LEVEDURAS SUBMETIDAS A PRESERVAÇÃO PROLONGADA

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

PONTA GROSSA

2016

LAURA NEVES FACCO

MONIQUE DE PAULA ROSA

MURILO HAS

CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA DE

LEVEDURAS SUBMETIDAS A PRESERVAÇÃO PROLONGADA

Trabalho de Conclusão de Curso de graduação apresentado á disciplina de Trabalho de Diplomação, do Curso Superior de Tecnologia em Alimentos, Coordenação do Curso Superior de Tecnologia em Alimentos – da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR, como requisito parcial à obtenção do título de Tecnólogo.

Orientadora: Profª. Drª Giovana A. Moura Pietrowski

PONTA GROSSA

2016

TERMO DE APROVAÇÃO

CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA DE LEVEDURAS SUBETIDAS À PRESERVAÇÃO PROLONGADA

por

LAURA NEVES FACCO

MONIQUE DE PAULA

MURILO HAS

Este Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) foi apresentado no dia 7 de dezembro

de 2016 como requisito parcial para a obtenção do título de Tecnólogo em Alimentos.

Os candidatos foram arguidos pela Banca Examinadora composta pelos professores

abaixo assinados. Após deliberação, a Banca Examinadora considerou o trabalho

aprovado.

_______________________________________ Profa. Dra. Giovana de Arruda Moura Pietrowski

Professora Orientadora

_______________________________________ Profa. Dra. Denise Milléo Almeida

Membro titular

_______________________________________ Profa. Dra. Maria Carolina de Oliveira Ribeiro

Membro titular

- O Termo de Aprovação assinado encontra-se arquivado na Secretaria Acadêmica -

Ministério da Educação Universidade Tecnológica Federal do Paraná

Câmpus Ponta Grossa

Diretoria de Graduação e Educação Profissional Curso Superior de Tecnologia em Alimentos

AGRADECIMENTOS

Agradecemos em primeiro lugar a Deus, pelo dom da vida e por nos dar forças para

nunca desistir de nossos sonhos, mostrando que a perseverança e dedicação são essenciais

para a concretização de nossos objetivos.

Um agradecimento de maneira especial, a nossa Professora e orientadora Giovana de

Arruda Moura Pietrowski, pela oportunidade de participarmos dos projetos de Iniciação

Científica e Estágio, que resultaram no desenvolvimento do presente trabalho, pelo imenso

apoio e dedicação e por nos proporcionar o conhecimento, não apenas racional, mas a

manifestação de caráter e afetividade da educação no processo de formação profissional,

fazendo-nos crescer como profissionais e como pessoas.

A nossa gratidão a professora Juliana V. M. Bittencourt, pelo auxílio na

caracterização molecular das leveduras utilizadas. Agradecemos também as suas orientandas

do mestrado e iniciação científica, de maneira especial a Cláudia e Maryeli, pela

disponibilidade e apoio durante a realização das análises.

Aos amigos que conquistamos durante toda a vivência no laboratório de

microbiologia Andréia, Crislaine, Fran, Jean, Kahtlyn, Lilian, Luciane, Mariane e Valdinéia,

pelo carinho e pelas inúmeras conversas que resultaram em bons risos, mas também em

aprendizagem. Em especial aos amigos e companheiros na realização desse trabalho, que

sempre estiveram presentes nos momentos difíceis e nos momentos de glória.

A professora Denise Milléo, pela assistência e paciência em esclarecer dúvidas e pelo

conhecimento emitido sobre microbiologia.

A esta universidade, sеu corpo docente, direção е administração quе oportunizaram а

janela quе hoje avistamos um horizonte superior, constituído pеlа acendrada confiança nо

mérito е ética aqui presentes.

A nossos pais e nossas famílias, que em mesmo às dificuldades, fizeram a diferença,

pelo amor, incentivo e apoio incondicional, acreditando na conclusão de mais essa etapa de

nossas vidas.

A todos que direta ou indiretamente fizeram parte de nossa formação, o nosso muito

obrigado.

O conhecimento torna a alma jovem e diminui

a amargura da velhice. Colhe, pois, a

sabedoria. Armazena suavidade para o

amanhã.

(Leonardo da Vinci)

RESUMO

FACCO, Laura Neves; ROSA, Monique de Paula; HAS, Murilo. Caracterização

morfológica e fisiológica de leveduras submetidas a preservação prolongada. 2016. 33f.

Trabalho de Conclusão de Curso de Tecnologia em Alimentos - Universidade Tecnológica

Federal do Paraná. Ponta Grossa, 2016.

Leveduras do gênero Hanseniaspora são reconhecidas por sua contribuição aromática para

sidras, fermentados de frutos e vinhos. Para uma boa preservação das culturas de leveduras é

essencial manter as propriedades morfológicas e fisiológicas das estirpes, independentemente

do método de armazenamento escolhido. O congelamento a -80ºC e a liofilização são

métodos muito utilizados para preservação de micro-organismos a longo prazo. O presente

trabalho teve como objetivo avaliar as características fisiológicas e morfológicas de leveduras

utilizadas na indústria de bebidas fermentadas (Hanseniaspora uvarum e Hanseniaspora

guilliermondii), submetidas à conservação por congelamento a -80°C e liofililzação. Foi

realizado teste ecométrico, avaliações morfológicas de crescimento em meio sólido e líquido,

avaliações bioquímicas envolvendo fermentações de carboidratos e testes de assimilação de

diversos compostos e caracterização molecular. Os resultados evidenciaram a seletividade do

meio de cultura Ágar Malte Extrato de Levedura – YMA para as cepas estudadas. No perfil

bioquímico a avaliação das cepas evidenciou diferenças na capacidade de fermentar a glicose

e outros açúcares como também na assimilação de citrato, nitrato e hidrólise do amido,

entretanto todos os demais testes bioquímicos não sofreram variações. Portanto, as

características morfológicas e fisiológicas das cepas de leveduras estudadas, mesmo com

pequenas variações, foram mantidas, garantindo a viabilidade destes micro-organismos para a

produção de compostos aromáticos em bebidas fermentadas, tanto por congelamento a -80ºC,

quanto por liofilização.

Palavras-chave: Hanseniaspora uvarum. Hanseniaspora guilliermondii. Congelamento.

Liofilização.

ABSTRACT

FACCO, Laura Neves; ROSA, Monique de Paula; HAS, Murilo.

Morphological and physiological characterization of yeasts subjected to prolonged

preservation. 2016. 33f. Completion Work of Course of Food Technology - Federal

Technology University Paraná. Ponta Grossa, 2016.

Yeasts of the genus Hanseniaspora are recognized for their aromatic contribution to ciders,

fermented fruits and wines. For good preservation of yeast cultures it is essential to maintain

the morphological and physiological properties of the strains regardless of the storage method

chosen. Freezing at -80 ° C and lyophilization are widely used methods for the long-term

preservation of microorganisms. The objective of the present work was to evaluate the

physiological and morphological characteristics of yeasts used in the fermented beverage

industry (Hanseniaspora uvarum and Hanseniaspora guilliermondii), preserved by freezing at

-80 ° C and lyophilization. Ecometric test, morphological growth assays in solid and liquid

medium, biochemical evaluations involving carbohydrate fermentations and tests of

assimilation of several compounds and molecular characterization were performed. The

results evidenced the selectivity of the culture medium Malt Agar Extract - YMA for the

studied strains. In the biochemical profile the evaluation of the strains showed differences in

the capacity to ferment glucose and other sugars as well as in the assimilation of citrate,

nitrate and starch hydrolysis, however all other biochemical tests did not change. Therefore,

the morphological and physiological characteristics of the strains of yeasts studied, even with

small variations, were maintained, guaranteeing the viability of these microorganisms for the

production of aromatic compounds in fermented beverages, both by freezing at -80ºC and by

freeze-drying.

Key words: Hanseniaspora uvarum. Hanseniaspora guilliermondii. Freezing.

Lyophilization.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Colônias típicas das leveduras em meio Ágar Malte Extrato de Levedura

(YMA)………………………………………………………………………………………..21

Quadro 1- Características morfológicas das colônias de leveduras em Ágar Malte Extrato de

Levedura (YMA), em placas de Petri.......................................................................................22

Quadro 2 - Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização, em tubos

de ensaio com ágar inclinado....................................................................................................23

Quadro 3 - Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização em Caldo

Glucose – Peptona – Extrato de levedura (GPBY). .......................................................... 24

Quadro 4 - Perfil Bioquímico das leveduras preservadas por congelamento e liofilização ... 26

Quadro 5 - Resultados da fermentação de carboidratos........................................................28

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 13

2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 15

2.1 RECUPERAÇÃO DAS CEPAS ............................................................................15

2.2 TESTE ECOMÉTRICO .......................................................................................15

2.3 AVALIAÇÕES MORFOLÓGICAS ......................................................................16

2.4 AVALIAÇÕES FISIOLÓGICAS ..........................................................................17

2.4.1Teste de catalase .................................................................................................17

2.4.2 Teste da utilização do citrato ...............................................................................17

2.4.3 Coloração de gram .............................................................................................17

2.4.5 Hidrólise da gelatina ..........................................................................................18

2.4.6 Teste do indol ....................................................................................................18

2.4.7 Análise da motilidade .........................................................................................19

2.4.8 Teste de redução do nitrato .................................................................................19

2.4.9 Teste da urease ..................................................................................................19

2.4.10 Teste vermelho de metila e voges - proskauer .....................................................20

2.4.11 Fermentação de carboidratos (frutose, glicose, lactose, manitol, sacarose e xilose) ..20

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................... 21

3.1 RECUPERAÇÃO E AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DAS CEPAS .......................21

3.2 TESTE ECOMÉTRICO .......................................................................................25

3.3 AVALIAÇÃO FISIOLÓGICA (PERFIL BIOQUÍMICO) DAS CEPAS ...................26

CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 30

REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 31

13

1 INTRODUÇÃO

A descoberta de que as leveduras possuem um papel fundamental na fermentação foi

o primeiro elo entre a atividade dos micro-organismos e as modificações físicas e químicas

nos materiais orgânicos. Estudos bibliográficos citam que várias leveduras produzem uma

infinidade de aromas que melhoram a qualidade sensorial dos produtos. Embora existam

muitos métodos para a síntese química de bioaromas, uma série de esforços tem sido realizada

para desenvolver a produção natural dos aromas, utilizando diversas vias biotecnológicas,

dentre elas, a via fermentativa e a via enzimática, métodos que são ecologicamente corretos e

menos poluentes, atendendo a exigência de uma gama de consumidores que preferem

produtos naturais, em vez de seus correspondentes químicos (FAITH et al 1991 ; XIÃO &

XU, 2007).

Segundo Viana et al, 2009; Moreira et al ,2005, Xu et al., 2006 ; Xufre et al, 2006

(apud Pietrowski et al, 2015) o gênero Hanseniaspora mostra uma contribuição aromática

para sidras, fermentados de frutos e vinhos, devido à produção de ésteres que fornecem estas

bebidas notas sensoriais como frutado e / ou floral. De acordo com Girão et al. (2004) , uma

boa preservação das culturas de leveduras se torna essencial para estudos futuros sendo

necessário manter as mesmas propriedades morfológicas e fisiológicas das estirpes,

independentemente do método de armazenamento escolhido.

Para tanto, a manutenção e preservação das culturas deve ser realizada garantindo a

sobrevivência do micro-organismo, bem como conservando propriedades morfológicas,

fisiológicas, características genéticas e pureza dos isolados por longos períodos de tempo

(CANHOS et al, 2004).

A escolha da forma mais adequada de conservação deve levar em conta à finalidade

desta manutenção, o custo, a disponibilidade de material e espaço, além da eficácia de tal

método na manutenção (KIRSOP & SNELL, 1984; HAWKSWOTH, 1985; ABADIAS et al,

2006).

Como uma forma bastante utilizada para preservação de micro-organismos está o

congelamento em nitrogênio líquido ou em ultra-freezer. O preparo das culturas para o

congelamento apresenta procedimentos simples e fáceis (KURTZMAN et al, 2003). A

liofilização também se apresenta como uma das técnicas mais eficientes para a manutenção de

micro-organismos, justamente por garantir a viabilidade dos agentes por longos períodos

(SOLA et al, 2012).

14

Tanto o congelamento quanto a liofilização são técnicas frequentemente utilizadas

para preservação e estocagem de material biológico, não somente pela qualidade

microbiológica dos materiais armazenados, mas também porque permitem uma redução

drástica do tempo gasto em transferência de culturas (ROBERT et al, 2006).

A escolha do método de manutenção mais adequado deve ser baseada nas

características do agente em estudo, assim como, pelas vantagens e desvantagens de cada

técnica disponível. O alvo de qualquer método de manutenção está em preservar a viabilidade

e principalmente proporcionar estabilidade genética do microrganismo, pelo maior tempo

possível, evitando assim a formação excessiva de mutações que alterem suas características

(SOLA et al, 2012).

Assim, o presente trabalho tem como objetivo realizar a caracterização fisiológica e

morfológica de leveduras utilizadas na indústria de bebidas fermentadas (Hanseniaspora

uvarum e Hanseniaspora guilliermondii), submetidas a conservação por congelamento a -

80°C e liofililzação.

15

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 RECUPERAÇÃO DAS CEPAS

Foram coletadas cepas congeladas e liofilizadas do Banco de Cepas no Laboratório

de Microbiologia da UTFPR-PG, armazenadas há sete anos. As cepas de H. uvarum e H.

guilliermondii tanto congeladas quanto liofilizadas, foram recuperadas em dois momentos:

setembro de 2015 e em junho de 2016, para a realização das avaliações propostas.

Para a recuperação das cepas congeladas, foram coletadas assepticamente 0,5 mL do

criotubo depois de descongelado, e adicionadas em tubos de ensaio contendo 8,5 mL de água

peptonada 0,1% e 1 mL de glicose. As cepas congeladas foram homogeneizadas em

equipamento Vórtex Mixer (MODEL KMC – 1300V) e deixadas em repouso por 30 minutos.

Decorridos os 30 minutos, foi transferido 1 mL da solução obtida para tubos de ensaio

contendo 9mL de caldo Glucose – peptona – extrato de levedura (GPBY), e incubados à 30ºC

em Estufa Bacteriológica (Quimis Pat. 34200022) por 24 horas (PIETROWSKI et al, 2015).

Para as cepas liofilizadas, foram pesadas 0,007 mg das mesmas, e colocadas em

tubos de ensaio contendo 9 mL de água peptonada 0,1% e 1 mL de glicose. As cepas

liofilizadas foram homogeneizadas e incubadas seguindo o mesmo procedimento realizado

com as cepas congeladas a -80ºC (PIETROWSKI et al, 2015).

Após a recuperação das cepas em caldo GPBY, foi realizada semeadura em Ágar

Malte e Extrato de Levedura (YMA), por meio do método de estriamento descontínuo, e

incubação em estufa bacteriológica à 30ºC por 24 horas, para a obtenção de colônias típicas e

isoladas (PIETROWSKI et al, 2015).

2.2 TESTE ECOMÉTRICO

Para o teste ecométrico, foi utilizado o meio de cultura Àgar Malte Extrato de

Levedura (YMA) e Ágar Cetrimide com as respectivas cepas: Hanseniaspora uvarum e

Hanseniaspora guilhermondii (cepas desejadas), Staphylococcus aureus, Salmonella thyphi e

Pseudomonas aeruginosa (cepas não desejadas).

Foram preparadas 8 placas de Petri estéreis, sendo 4 placas com aproximadamente 20

mL de YMA e 4 placas com aproximadamente 20 mL de Ágar Cetrimide. Após a

solidificação dos meios foi realizado a inoculação a partir de uma alçada de 0,001 mL de cada

16

cepa em seu caldo específico. Para as cepas não desejadas foi utilizado Caldo Nutriente e para

as cepas desejadas foi utilizado Caldo Glucose – peptona – extrato de levedura (GPBY).

Cada placa foi divida em 4 quadrantes e foram feitas 5 estrias em cada quadrante e uma estria

no centro da placa. As placas foram incubadas a 30ºC por 48 horas (MOSSEL et al, 1983).

Para a interpretação dos resultados, foi calculado o Índice de Crescimento Absoluto

(ICA). O cálculo foi realizado atribuindo um valor de 0,2 (precisão do método) a cada estria, e

multiplicado pelo número de estrias onde foi observado crescimento. Para o ICA, foram

considerados como critérios de avaliação a produtividade e a seletividade. Para a

produtividade, as cepas desejadas em meio de cultivo não seletivo deveriam ter ICA pelo

menos igual a 3,5. Para a seletividade, as cepas não desejadas em meio seletivo não deveriam

ter ICA maior que 2; e para as cepas desejadas o ICA não deveria ser menor que 2 (MOSSEL

et al, 1983).

2.3 AVALIAÇÕES MORFOLÓGICAS

As cepas de leveduras obtidas em caldo Glucose – peptona – extrato de levedura

(GPBY) foram inoculadas por estriamento descontínuo em placas de Petri contendo Ágar

Malte e Extrato de Levedura (YMA) e incubadas a 30°C por 48 horas. As colônias isoladas

foram observadas em contador de colônia (Phoenix, CP 600 plus) e analisadas quanto ao

tamanho (grande – 5mm, média – 2 a 5mm e pequena – 2mm), forma (circular, irregular,

rizoide, filamentosa ou puntiforme), elevação (côncava, elevada, ondulada, protuberante,

achatada ou convexa) bordos (lisos, lacerados, lobados, filamentosos ou ondulados), estrutura

(lisa, granulosa, filamentosa ou rugosa), brilho (transparente, translúcida ou opaca) cor

(incolor, branca ou pigmentada) (MADIGAN et al, 2010).

As leveduras presentes em caldo Glucose – peptona – extrato de levedura (GPBY)

foram inoculadas por estriamento contínuo em tubos de ensaio contendo Ágar Malte e Extrato

de Levedura (YMA) inclinado, com bisel longo, sendo incubados a 30°C por 48 horas. O

crescimento foi analisado quanto à forma (difusa, espalhada ou equinulado), quantidade

(escasso, abundante ou moderado), brilho (brilhante e sem brilho), cor (colorido ou sem cor).

Os inóculos obtidos em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram

observados quanto ao aspecto (turvo ou não turvo), sedimento (com ou sem sedimento), tipo

de sedimento (granulado, feculento ou mucoide), película (com ou sem película na

17

superfície), tipo da película (resistente, frágil, lisa, rugosa, aderente as paredes do tubo) e com

ou sem anel nas paredes do tubo (MADIGAN et al, 2010).

2.4 AVALIAÇÕES FISIOLÓGICAS

2.4.1 Teste de catalase

As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram

inoculadas por estriamento descontínuo em placas de Petri contendo Ágar Malte Extrato e

Levedura (YMA) e incubadas a 30°C por 48 horas. Em seguida, foi transferida uma colônia

pura em lâmina de vidro e adicionado 3 gotas de peróxido de hidrogênio 3%. O resultado

positivo mostra borbulhamento imediato e o resultado negativo não apresenta borbulhamento

(SILVA et al, 2010).

2.4.2 Teste da utilização do citrato

As cepas presentes no caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram

inoculadas em tubos de ensaio contendo Ágar Citrato de Simmons, em forma de bisel longo, e

incubadas a 35ºC por 48 horas. O resultado positivo mostra o crescimento na rampa do meio

de cultivo com viragem alcalina do indicador, com alteração da cor verde para azul e o

negativo sem crescimento e sem alteração de cor (SILVA, 1996).

2.4.3 Coloração de Gram


inoculadas por estriamento descontínuo em placas de Petri contendo Ágar Malte Extrato e

Levedura (YMA) e incubadas a 30°C por 48 horas. A partir das colônias isoladas foi realizada

a coloração. Micro-organismos Gram positivos apresentam coloração roxa e Gram negativos

são vermelhos (SILVA et al, 2010).

18

2.4.4 Hidrólise do Amido


inoculadas por picada, com auxílio de fios de platina em placas de Petri contendo o Meio

Ágar Amido adicionado de 1% de Iodo e 2% de Iodeto de potássio, sendo incubadas a 37°C

por 48 horas. O resultado positivo mostra a hidrólise do amido pela formação de halo

transparente ao redor da colônia e o resultado negativo não há formação de halo (SILVA et al,

2010).

2.4.5 Hidrólise da Gelatina


inoculadas por picada, com auxílio de fios de platina, em tubos de ensaio com Ágar Gelatina a

12%, até a profundidade de 1 cm e incubados a 37ºC por 24 horas. Após incubação foram

retirados e colocados em banho de gelo por 10 minutos. O resultado positivo mostra a

liquefação do meio de cultura e no resultado negativo o meio se mantém sólido (MADIGAN

et al, 2010).

2.4.6 Teste do Indol


inoculadas com uma alçada em tubos de ensaio com caldo triptona e incubados a 35°C por 24

horas. Após a incubação, foi transferido uma alíquota de 5 mL da cultura para um tubo estéril

vazio e adicionado 5 gotas do reagente de Kovacs, e em seguida, agitado levemente. O

resultado positivo mostra o desenvolvimento de anel vermelho – violeta na superfície do

meio. A permanência do anel na cor amarela indica resultado negativo. (MADIGAN et al,

2010).

19

2.4.7 Análise da Motilidade


inoculadas em tubo de ensaio com Ágar Motilidade, por picada no centro do meio até a

profundidade de 1 cm e incubados a 30°C por 24 horas. O resultado positivo mostra o

crescimento fora da linha de inoculação e o negativo se restringe a linha da picada

(MADIGAN et al, 2010).

2.4.8 Teste de redução do nitrato


inoculadas com uma alçada em tubos de ensaio com caldo nitrato e tubo de Durhan

invertidos, sendo incubados a 35°C por 48 horas. O resultado positivo apresenta a formação

de gás nos tubos de Durhan. Não ocorrendo a produção de gás, foi adicionado 5 gotas da

solução de 0,6% de α-naftol e 5 gotas da solução de 0,8% de ácido sulfanílico e agitado

delicadamente os tubos. O desenvolvimento da cor vermelha entre 1 a 2 minutos indicava

resultado positivo (presença de nitrito), se não era adicionado 20 mg de pó de zinco aos tubos

contendo as soluções de α-naftol e ácido sulfanílico. O desenvolvimento da cor vermelha

entre 5 a 10 minutos indica redução de nitrato a nitrito pelo zinco resultando em negativo. O

não desenvolvimento da cor vermelha indica ausência de nitrato no meio, resultando em

positivo (SILVA, 1996).

2.4.9 Teste da Urease


inoculadas com uma alçada em tubo de ensaio com caldo uréia de Christensen, sendo

incubados a 37 ºC por 24 horas. O resultado positivo mostra a viragem alcalina do indicador,

com alteração da cor do meio de alaranjado para cor rosa escuro, o que indica que o micro-

organismo produz a enzima urease, responsável pela decomposição da uréia em amônia. No

resultado negativo há permanência da cor original (SILVA et al, 2010).

20

2.4.10 Teste Vermelho de metila e Voges - Proskauer


inoculadas com uma alçada leve em tubos de ensaio com Caldo Vermelho de Metila e Voges-

Proskauer (VM-VP) e incubados a 35°C por 48 horas, com tampas levemente desrosqueadas.

Para teste de Voges Proskauer (VP) foi adicionado 2,5 mL da cultura, 6 gotas de

solução alcoólica de 5% de α -naftol e 2 gotas de solução 40% de hidróxido de potássio,

sendo o tubo agitado por 30 segundos a 1 minuto, para introduzir oxigênio atmosférico e

promover a oxidação da acetoína. O resultado positivo, após 15 minutos, há o aparecimento

de cor vermelha ou rosa escuro na superfície do meio e a permanência da cor amarela indica

resultado negativo.

O teste de Vermelho de Metila foi realizado após 96 horas de incubação, sendo

adicionado 2,5 mL da cultura e 5 gotas de solução vermelho de metila. O resultado positivo

mostra alteração do meio para a cor vermelha e o resultado negativo há permanência da cor

amarela. O surgimento de uma cor alaranjada indica reação lenta (SILVA, 1996).

2.4.11 Fermentação de Carboidratos (frutose, glicose, lactose, manitol, sacarose e xilose)


inoculadas em tubos de ensaio com Ágar Vermelho de Fenol suplementado com os

carboidratos testados (frutose, glicose, lactose, manitol, sacarose e xilose), sendo incubados a

35°C por 48 horas. O resultado positivo mostra a viragem ácida do indicador da cor de

vermelho alaranjado para amarelo e o negativo há a viragem alcalina para a cor rosa escura

(SILVA, 1996).

21

3 RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.1 RECUPERAÇÃO E AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DAS CEPAS

Foram recuperadas cepas congeladas e liofilizadas, até a obtenção de colônias típicas

(Figura 1).

(A) (B)

(C) (D) Nota - Colônia A – Hanseniaspora uvarum congelada a -80ºC; Colônia B - Hanseniaspora uvarum liofilizada;

Colônia C - Hanseniaspora guilliermondii congelada a -80ºC; Colônia D - Hanseniaspora guilliermondii

liofilizada.

Figura 1 – Colônias típicas das leveduras em meio Ágar Malte Extrato de Levedura (YMA).

Fonte: Autoria própria, 2016.

Foi observado o crescimento em placas e verificado que as quatro cepas em estudo,

apesar de serem preservadas por métodos distintos, apresentaram aspectos semelhantes, como

coloração das colônias, tamanho e forma.

22

As avaliações morfológicas mostram que todas as leveduras recuperadas nos dois

momentos (setembro de 2015 e em junho de 2016), tanto congeladas quanto liofilizadas,

apresentam características brancas, opacas e com bordos lisos (Quadro1).

Leveduras

Morfologia das colônias de leveduras preservadas

por congelamento e liofilização

Tamanho Forma Elevação Bordos Estrutura Brilho Cor

H.

uva

rum

Cong. (1) Pequena Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca


Liof. (1) Pequena Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca

Liof. (2) Pequena Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca

H.

guil

lier

mondii


Cong. (2) Pequena Circular Convexa Lisos Lisa Opaca Branca

Liof. (1) Média Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca

Liof. (2) Pequena Circular Convexa Lisos Lisa Opaca Branca

Nota: (1) – cepas recuperadas em set/2015; (2) – cepas recuperadas em jun/2016; (Cong.) – cepas congeladas;

(Liof.) – cepas liofilizadas; Pequena (2 mm); Média (3mm a 5 mm); Grande (maior que 5 mm).

Quadro 1- Características morfológicas das colônias de leveduras em Ágar Malte Extrato de Levedura

(YMA), em placas de Petri.

Fonte: autoria própria, 2016.

Todas as cepas de leveduras congeladas e liofilizadas apresentaram crescimento em

ágar inclinado com características filiforme e branca (Quadro 2).

23

Leveduras

Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e

liofilização, em tubos de ensaio com ágar inclinado.

Forma Quantidade Brilho Cor

H.

uva

rum

Cong. (1) Filiforme Moderado Brilhante Branca

Cong. (2) Filiforme Moderado Brilhante Branca

Liof. (1) Filiforme Moderado Brilhante Branca

Liof. (2) Filiforme Moderado Brilhante Branca

H.

gu

illi

erm

on

dii

Cong. (1) Filiforme Escasso Brilhante Branca

Cong. (2) Filiforme Escasso Brilhante Branca

Liof. (1) Filiforme Escasso Brilhante Branca

Liof. (2) Filiforme Escasso Brilhante Branca


(Liof.) – cepas liofilizadas

Quadro 2 - Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização, em tubos de ensaio

com ágar inclinado.


Todas as cepas de leveduras tanto liofilizadas quanto congeladas apresentaram as

mesmas características em crescimento em Caldo GPBY (Glucose – peptona – extrato de

levedura) sendo, turbidez, com sedimento feculento, sem película na superfície e sem

desenvolvimento de anel na parede do tubo. (Quadro 3).

24

Leveduras

Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização

em Caldo Glucose – Peptona – Extrato de levedura (GPBY)

Aspecto Sedimento Película Anel

H.

uva

rum

Cong. (1) Turvo Feculento Sem película Sem anel


Liof. (1) Turvo Feculento Sem película Sem anel


H.

gu

illi

erm

on

dii






(Liof.) – cepas liofilizadas

Quadro 3 - Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização em Caldo Glucose –

Peptona – Extrato de levedura (GPBY).


Pietrowski et al (2015) em seu trabalho verificou que as leveduras do gênero

Hanseniaspora uvarum conservadas por liofilização, se apresentam como esbranquiçadas,

com bordos lisos e brilhantes. No presente estudo, foi possível a identificação dessas

características relacionadas a este gênero de levedura, porém, houve distinção com o autor, na

característica de brilhante para opaca.

Segundo dados da Viticulture and Enology (2016), as leveduras do gênero

Hanseniaspora guilliermondii apresentam suas colônias cremosas, lisas brilhantes e

convexas. Com relação a característica colonial, as cepas de leveduras apresentaram

resultados semelhantes aos dados da literatura para o aspecto “lisa e convexa”. De acordo com

Kurtzman & Fell (1998), o aspecto colonial das cepas pertencentes ao gênero Hanseniaspora

guilliermondii, coincidem com os resultados obtidos, diferenciando apenas a característica de

opaca para brilhante.

As cepas de leveduras analisadas apresentaram características morfológicas

semelhantes revelando que não houve alterações nestas características dentro de um prazo de

nove meses sob conservação por congelamento a -80ºC e liofilização.

25

3.2 TESTE ECOMÉTRICO

O teste ecométrico foi realizado e foi observado que o meio de cultura Àgar Malte

Extrato de Levedura (YMA) se mostrou como seletivo e produtivo como pode ser observado

com os dados da tabela 1.

Tabela 1. Índice de Crescimento Absoluto (ICA) considerando a

Produtividade e Seletividade por meio do Teste Ecométrico

Nota: A - H. uvarum congelada; B – H. uvarum liofilizada; C – H. guilliermondii congelada; D – H.

guilliermondii liofilizada.

Conforme apresenta a tabela 1, o meio (YMA) quanto a sua produtividade e sua

seletividade, se mostrou eficiente pois as cepas desejadas (A, B, C e D) tiveram ICA com

valores iguais a 5, enquanto que as cepas não desejadas (Salmonella thypi, S.aureus e P.

aeruginosa) tiveram ICA de valor 0. Segundo Gelli et al (2003), para um meio ser

considerado produtivo, o ICA deve ser ao menos 3,5 e para ser considerado seletivo, as cepas

desejadas devem ter ICA maior que 3,0 e cepas não desejadas, menor que 2,0.

Gelli et al (2003) ao realizar o controle de qualidade em laboratório de microbiologia

de alimentos e avaliação de desempenho de meios de cultura no isolamento de Salmonella

spp. utilizou como método o teste ecométrico e verificou que testes ecométricos, de

seletividade e produtividade e de recuperação demonstraram a adequacidade geral dos meios

de cultura usados nas diferentes etapas analíticas de seu estudo, enfatizando assim, a

Seletividade e Produtividade

Meio Ágar Malte

Extrato de Levedura (YMA)

Meio Ágar Cetrimide

Micro-organismo ICA Micro-organismo ICA

A 5 A 0

B 5 B 0

C 5 C 0

D 5 D 0

Salmonella thypi 0 Salmonella thypi 0

S. aureus 0 S. aureus 0

P. aeruginosa 0 P. aeruginosa 1

26

importância e confiabilidade do teste. Neste sentido, o teste ecométrico realizado no presente

estudo mostrou a eficiência do Ágar Malte Extrato de Levedura para H. uvarum e H.

guilliermondii.

3.3 AVALIAÇÃO FISIOLÓGICA (PERFIL BIOQUÍMICO) DAS CEPAS

Todas as cepas de leveduras apresentaram coloração de Gram negativa e resultados

positivos para produção de catalase, indicando que são capazes de converter o H2O2 em água

e oxigênio gasoso. (Quadro 4)

Nota: 1 – cepas recuperadas em set/2015; 2 – cepas recuperadas em jun/2016; (+) positivo; (-) negativo.

Quadro 4 - Perfil Bioquímico das leveduras preservadas por congelamento e liofilização


As leveduras são tradicionalmente caracterizadas, classificadas e identificadas

utilizando características morfológicas e fisiológicas. Para a identificação específica, estudos

bioquímicos e de exigências nutricionais são mais relevantes que traços morfológicos e

sexuais, os quais são importantes na determinação genérica (PHAFF, 1990).

Perfil Bioquímico das Leveduras

Leveduras

H. uvarum H. guilliermondii

Cong.

(1)

Cong.

(2)

Liof.

(1)

Liof.

(2)

Cong

(1)

Cong

(2)

Liof.

(1)

Liof.

(2)

Coloração de Gram - - - - - - - -

Citrato - + + + - - + +

Nitrato + + + + - - - -

V. Proskauer + - - - - - + -

V. Metila - - - - - - - -

Indol - - - - - - - -

Motilidade - - - - - - - -

Hid. Amido + - + + + - + -

Hid. Gelatina - - - - - - - -

Catalase + + + + + + + +

Urease - - - - - - - -

27

Para os testes de Vermelho de Metila, Indol, Motilidade, Hidrólise da Gelatina,

Catalase e Urease, as leveduras apresentaram resultados semelhantes, não evidenciando

alterações em relação aos testes mencionados e à diferença de métodos de conservação e de

espécies.

No teste do Citrato, as cepas H. uvarum congelada (1) e H. guilliermondii congelada

(1 e 2) apresentaram resultado negativo, enquanto que as demais foram positivas para

utilização do citrato, demonstrando que são capazes de utilizar o citrato como única fonte de

carbono para seu crescimento. Assis et al (2012), ao realizar uma série de testes fisiológicos

em leveduras isoladas uvas Vitis vinifera L. verificou que leveduras do gênero

Hanseniaspora, não assimilam o citrato. Essa afirmação mostra-se divergente com os

resultados obtidos no presente estudo.

A capacidade de reduzir o nitrato em nitrito foi verificada apenas pelas cepas de H.

uvarum tanto congeladas quanto liofilizadas (Quadro 4). Neste processo, o micro-organismo

consegue suprir a ausência do oxigênio atmosférico derivando-o do nitrato (SILVA, 1996).

Segundo dados da Viticulture & Enology, as leveduras Hanseniaspora uvarum e

Hanseniaspora guilliermondii não assimilam o nitrato, sendo consideradas como aeróbicas.

Tal afirmação não condiz com os resultados apresentados pelas cepas do gênero

Hanseniaspora uvarum neste trabalho.

No teste de Voges-Proskauer apenas as leveduras H. uvarum congelada (1) e H.

guilliermondii liofilizada (1); mostraram capacidade de produzir butilenoglicol, como

resultado do produto final da fermentação da glicose. O que se confirma pela capacidade de

fermentar a glicose pelas leveduras H. uvarum congelada (1 e 2), H. uvarum liofilizada (2) e

H. guilliermondii liofilizada (1 e 2) (Quadro 5).

A hidrólise do amido foi verificada apenas pelas cepas H. uvarum congelada (1), H.

uvarum liofilizada (1 e 2), H. guilliermondii congelada e liofilizada (1), portanto, capazes de

hidrolisar o amido em carboidratos menores (Quadro 4). Este aspecto também foi observado

por Crestani (2007), que ao isolar e caracterizar leveduras de uma madeireira verificou que as

pertencentes ao gênero Hanseniaspora sp. não são capazes de utilizar o amido como única

fonte de carbono. Contudo, o crescimento dessas cepas foi variável, indicando como causa a

diferença na atividade amilolítica, seja pela especificidade das enzimas ao substrato amiláceo

ou pela acessibilidade das enzimas aos grânulos de amido.

Todas as leveduras apresentaram a capacidade de hidrolisar a uréia formando duas

moléculas de amônia pela ação da enzima urease, mas não hidrolisaram a gelatina em

aminoácidos, ou seja, não possuem a enzima gelatinase (Quadro 4). As cepas de leveduras por

28

meio da ação enzimática, fizeram a decomposição da uréia em fontes de nitrogênio, sendo de

grande importância para o crescimento microbiano.

No quadro 5, são apresentados os resultados da fermentação de carboidratos pelas

leveduras.

Nota: 1 – cepas recuperadas em set/2015; 2 – cepas recuperadas em jun/2016; (+) positivo; (-) negativo.

Quadro 5. Resultados da fermentação de carboidratos

Fonte: Autoria própria, 2016.

Todas as leveduras apresentaram diferenças nos resultados referentes à fermentação de

carboidratos quando comparadas entre si. Assis et al (2012) evidencia que as leveduras

Hanseniaspora fermentam a glicose. Essa afirmação relatada pelo autor não apresenta

concordância com os resultados obtidos com as cepas H. uvarum liofilizada (1) e H.

guilliermondii congelada (1 e 2) (Quadro 5). No entanto, a capacidade de fermentar a glicose

referente à cepa H. uvarum liofilizada, sugere erro operacional, uma vez que a cepa passa a

“ganhar” esta capacidade fermentativa, evidenciando uma incoerência de resultado. Com

relação à fermentação do manitol, sacarose e xilose, para a cepa H. guilliermondii recuperada

nos dois momentos, se observa o mesmo fato.

A capacidade fermentativa da frutose e lactose foi observada em todas as cepas, com

exceção das leveduras H. guilliermondii congeladas (1 e 2). Com base nos dados descritos por

Kurtzman e Fell (1998), as leveduras Hanseniaspora uvarum fermentam glicose e não

Fermentação de Carboidratos

Leveduras

H. uvarum H. guilliermondii

Cong.

(1)

Cong.

(2)

Liof.

(1)

Liof.

(2)

Cong.

(1)

Cong.

(2)

Liof.

(1)

Liof.

(2)

Frutose + + + + - - + +

Glicose + + - + - - + +

Lactose + + + + - - + +

Manitol - - - + - - - +

Sacarose - - - + - - - +

Xilose - - - + - - - +

29

fermentam a lactose. Os resultados apresentados mostram concordância para a fermentação da

glicose, porém diferem na fermentação da lactose.

Crestani (2007) apresenta em seu trabalho as características bioquímicas de leveduras

Hanseniaspora sp. e demonstra que essas leveduras fermentam a glicose e não fermentam a

xilose e o manitol. No presente estudo, todas as cepas apresentam anuência com os dados

apresentados pelo autor em relação a fermentação da xilose e manitol, com ressalva para as

cepas H. uvarum liofilizada (2) e H. guilliermondii liofilizada (2).

Diferenças na assimilação e na fermentação de compostos de carbono são critérios

importantes na taxonomia e identificação de leveduras, pois estes microrganismos apresentam

uma variação diversificada na habilidade de fermentação de açúcares (GUIMARÃES, 2005).

Portanto o perfil bioquímico das leveduras em estudo apresenta variâncias quando

comparado com dados da literatura e de vários autores, sugerindo que a causa das diferenças

fisiológicas seja devido à agressividade que os métodos de conservação empregados

causaram, uma vez que essas leveduras foram conservadas por congelamento a -80ºC e por

liofilização.

Segundo Sola et al (2012) a criopreservação (congelamento a -80ºC) requer alguns

cuidados para que seja realmente eficiente e que apesar da liofilização ser amplamente

empregada na manutenção de diferentes micro-organismos e ser considerada uma técnica de

conservação a longo prazo, as etapas que compõem o processo são capazes de causar injúrias

ou danos celulares. Esses fatores podem afetar a viabilidade e estabilidade celular, sendo

decorrentes principalmente do comportamento da água sob condições de baixas temperaturas,

tendo como exemplo mais frequente, a crioinjúria (lesão celular causada durante os processos

de congelamento e descongelamento), ocasionando alterações nas estruturas da membrana

plasmática dos micro-organismos preservados.

Os resultados apresentados na literatura foram comparados com os resultados obtidos

não considerando a linhagem das cepas utilizadas. Sugerindo que as características

morfológicas e fisiológicas sofrem variações advindas também da diferença de linhagem

dessas cepas.

Comparando os métodos de conservação em que as leveduras estavam submetidas, se

observa que ambos foram eficientes para a preservação da viabilidade das estirpes estudadas,

assim para a escolha do método seria necessário pensar no custo de armazenamento, que para

liofilização não existe, enquanto para o congelamento a -80ºC resulta no custo com energia

elétrica. Por outro lado, o pesquisador nem sempre dispõe do liofilizador, tornando o

congelamento a -80ºC, mais viável neste caso. Entretanto, pensar em manter, estocar e

30

preservar coleções significa assegurar um patrimônio de culturas e bancos genéticos com

atenção à morfologia, fisiologia, respostas celulares e teciduais. A variabilidade das

populações microbianas determina a comparação experimental quanto ao melhor método,

melhor temperatura e período de tempo para condições específicas, ou a combinação de dois

ou mais métodos (SOLA et al, 2012).

CONCLUSÃO

Foi observada a seletividade do meio de cultura Ágar Malte Extrato de Levedura –

YMA para as cepas H. uvarum e H. guilliermondii tanto congeladas quanto liofilizadas.

A avaliação morfológica das cepas, não mostrou distinção das características

apresentadas com dados descritos na literatura, apresentando suas colônias brancas, opacas e

com bordos lisos.

A avaliação fisiológica das cepas evidenciou diferenças na capacidade de fermentar a

glicose e outros açúcares, como também na assimilação de citrato, nitrato e hidrólise do

amido. Entretanto, todos os demais testes bioquímicos não sofreram variações, mostrando que

o congelamento a -80ºC e a liofilização em que as cepas foram submetidas foram eficientes

preservando suas características por um período de nove meses.

As características morfológicas e fisiológicas das cepas de leveduras estudadas

mesmo com pequenas variações, foram mantidas, garantindo a viabilidade destes micro-

organismos para a produção de compostos aromáticos em bebidas fermentadas, tanto por

congelamento a -80ºC, quanto por liofilização, mostrando que os dois métodos foram

eficientes para garantir a viabilidade e características das leveduras H. uvarum e H.

guilliermondii.

31

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CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA DE …repositorio.roca.utfpr.edu.br/jspui/bitstream/1/8589/1/PG_COALM_20… · LEVEDURAS SUBMETIDAS A PRESERVAÇÃO PROLONGADA TRABALHO