i

PHILIPI COUTINHO DE SOUZA

CARCINOGÊNESE MAMÁRIA EXPERIMENTAL INDUZIDA

PELO 7,12,DIMETILBENZ(A)ANTRACENO (DMBA):

CARACTERIZAÇÃO HISTOPATOLÓGICA COMPARADA E

IDENTIFICAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE CÉLULAS-

TRONCO NEOPLÁSICAS (CTNs)

CAMPINAS

2013

ii

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Médicas

PHILIPI COUTINHO DE SOUZA

CARCINOGÊNESE MAMÁRIA EXPERIMENTAL INDUZIDA PELO 7,12,DIMETILBENZ(A)ANTRACENO (DMBA): CARACTERIZAÇÃO

HISTOPATOLÓGICA COMPARADA E IDENTIFICAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE CÉLULAS-TRONCO NEOPLÁSICAS (CTN)

ORIENTAÇÃO: Prof. Dr. ANDRE ALMEIDA SCHENKA

Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-Graduação da Faculdade de

Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP para obtenção de título de Mestre em Farmacologia.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR PHILIPI COUTINHO DE SOUZA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. ANDRE ALMEIDA SCHENKA. _______________________ Assinatura do Orientador

CAMPINAS 2013

iv

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA POR

MARISTELLA SOARES DOS SANTOS – CRB8/8402

BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

UNICAMP

Souza, Philipi Coutinho de, 1987-

So89c Carcinogênese mamária experimental induzida pelo

7, 12, dimetilbenz (A) antraceno (DMBA) : caracterização

histopatológica comparada e identificação

imunoistoquímica de células-tronco neoplásicas (CTNs) /

Philipi Coutinho de Souza. -- Campinas, SP : [s.n.], 2013.

Orientador : André Almeida Schenka.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de

Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.

1. Neoplasias da mama. 2. Células-tronco

neoplásicas. 3. Histologia comparada. 4. Ratos Sprague

Dawley. 5. 9,10-Dimetil-1,2-benzantraceno. I. Schenka,

André Almeida, 1976-. II. Universidade Estadual de

Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título

Informações para Biblioteca Digital

Título em inglês: Breast cancer neoplastic stem cells histology compared Sprague

Dawley rats 7, 12 dimetilbenz (A) antracene.

Palavras-chave em inglês:

Breast neoplasms

Neoplastic stem cells

Histology, Comparative

Sprague Dawley rats

9,10-Dimethyl-1,2-benzanthracene

Área de concentração: Farmacologia

Titulação: Mestre em Farmacologia

Banca examinadora:

André Almeida Schenka [Orientador]

Maria Salete Costa Gurgel

Maria Cristina Costa Resck.

Data da defesa: 18/01/2013

Programa de Pós-Graduação: Farmacologia

v

vi

Dedicatória

vii

Aos animais

Foste um instrumento de nosso aprendizado?

Foste apenas um objeto de experiência?

Não!

Foste para nós, vítimas solicitadas pela ciência, para beneficio da

humanidade, porém, apesar do teu olhar mudo e de não teres a permissão

da palavra, isso não nos impedirá de dizer-te sempre: muito obrigado.”

(Autor desconhecido)

Dedico este trabalho...

...a toda minha família pelo apoio incondicional, o carinho, a torcida e por

sempre acreditarem em mim...

viii

Agradecimentos

ix

À DEUS, inteligência suprema e causa primeira de todas as coisas.

Ao Professor André Almeida Schenka pelo exemplo de trabalho, pesquisa e ética, pelo

brilhante ensinamento da patologia mamária e excelente orientação.

À Professora Dra. Liliana A. Lucci de Ângelo Andrade pela sua experiente contribuição

nos dados anatomopatológicos do exame de qualificação.

À Professora Dra. Maria Salete Costa Gurgel pela discussão do aspecto clínico do trabalho.

Ao Professor Dr. Edson Antunes, pelo apoio como representante da comissão de pós-

graduação.

À toda equipe do Laboratório de Patologia investigativa do Hospital AC Camargo e a

Fundação Antônio Prudente em especial ao Dr. Rafael Malagoli Rocha e ao Dr. José

Vassallo por disponibilizarem inúmeras vezes os recursos metodológicos para realização

deste trabalho.

À amiga Valéria Barbosa de Souza pela ajuda incondicional neste trabalho, sem a sua

colaboração não chegaríamos até aqui.

Ao Professor Dr. Luiz Alberto Magna pelo auxílio e interpretação estatística de nossos

resultados.

Aos amigos da CEVEL em especial a Ricardo Coutinho e Michele Bione pela reconhecida

confiança em mim depositada e por entender os meus momentos de ausência.

Aos colegas do LHIAP pelas trocas de idéias, ensinamentos e discussões.

À Professora Dra. Maria Cristina Costa Resck pelo constante incentivo e apoio desde os

tempos da graduação.

Ao amigo Gilberto C Franchi Jr. pelo apoio inestimável.

À Jacqueline pelas estimáveis e valiosas dicas de imunoistoquímica.

Finalmente agradeço a todos aqueles que, longe ou perto, sempre me desejaram sorte e

sucesso e tornaram os caminhos mais alegres durante a eterna caminhada...obrigado!

x

Sumário

xi

PÁG

SÍMBOLOS, SIGLAS ABREVIATURAS................................................................ xvii

RESUMO................................................................................................................... ... xix

ABSTRACT.................................................................................................................. xxi

1- 1- INTRODUÇÃO........................................................................................................ 23

1.1- Câncer de mama......................................................................................... 23

1.2- Células tronco neoplásicas........................................................................ 38

1.3- Dimetilbenz-(a)-antraceno (DMBA) como modelo de carcinogênese mamária................................................................................................................

47

2- JUSTIFICATIVA.................................................................................................... 51

3- OBJETIVOS............................................................................................................ 53

4- MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 55

4.1- Aspectos éticos............................................................................................ 55

4.2- Locais de realização do experimento........................................................... 55

4.3- Animais........................................................................................................ 55

4.4- Indução tumoral e obtenção dos espécimes anatomopatológicos................ 55

4.5- Tissue microarray........................................................................................ 56

4.6- Colorações histológicas................................................................................ 57

4.7- Variáveis de análise morfológica.................................................................. 59

4.7.1- Formação ou diferenciação tubular glandular (acinar).................... 59

4.7.2- Pleomorfismo ou grau nuclear........................................................ 59

4.7.3- Índice mitótico................................................................................ 60

Sumário

xii

4.7.4.Grau histológico final............................................................... 60

4.8 – Variáveis de análise imunoistoquímica................................................ 60

4.8.1.Positividade para receptores hormonais (RE/RP)..................... 60

4.8.2.Positividade para C-erbB-2...................................................... 62

4.8.3. Critérios para a classificação alternativa em subtipos moleculares baseada no perfil molecular..............................

62

4.8.4. Positividade para marcadores de CTNs................................ 63

4.9- Análise estatística................................................................................ 63

5- RESULTADOS.................................................................................................. 65

6- DISCUSSÃO...................................................................................................... 105

7- CONCLUSÃO................................................................................................... 109

8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 111

9- ANEXOS........................................................................................................... 119

Lista de figuras

xiii

PÁG Figura 1. Incidência e mortalidade relacionadas ao câncer................................. 24

Figura 2. Principais neoplasias malignas da mama humana .............................. 27

Figura 3. Esquema ilustrativo do desenvolvimento de neoplasias mamárias

epiteliais a partir de UDLTs.................................................................................. 31

Figura 4. Padrão de expressão gênica do câncer de mama.................................. 34

Figura 5. Aspectos macroscópicos das neoplasias induzidas pelo DMBA......... 66

Figura 6. Aspectos macroscópicos das neoplasias induzidas pelo DMBA

(ulceração)............................................................................................................. 67

Figura 7. Superfície de corte das neoplasias induzidas pelo DMBA................... 68

Figura 8. Fotomicrografias ilustrativas de focos de carcinoma ductal in situ..... 71

Figura 9. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma ductal invasivo................ 72

Figura 10. Fotomicrografias ilustrativas de tumor filóide................................... 73

Figura 11. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma papilífero invasivo........ 74

Figura 12. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma mioepitelial invasivo..... 75

Figura 13. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma lobular invasivo............. 76 Figura 14. Frequência dos principais tipos histológicos encontrados na

amostra.................................................................................................................. 77

Figura 15. Composição histológica dos tumores mistos...................................... 78

Figura 16. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma ductal invasivo grau 1 e

grau 2.................................................................................................................... 82

Figura 17. Fotomicrografias ilustrando a variação na extensão da necrose........ 83 Figura 18. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de RE, RP e C-erbB-2.... 87

Figura 19. Diagrama de classificação de subtipos moleculares........................... 88 Figura 20. Fotomicrografias ilustrativas do subtipo molecular triplo

negativo/basal símile............................................................................................. 89

Figura 21. Freqüência de casos expressando cada um dos marcadores de

CT/CP...................................................................................................................

91

Lista de figuras

xiv

Figura 22. Número de células tumorais expressando cada um dos

marcadores de CT/CP....................................................................................... 92

Figura 23. Frequência de células positivas para marcadores de CT em tecidos neoplásicos e tecidos normais...............................................................

93

Figura 24. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de CD24, CD44 e ALDH1..............................................................................................................

95

Figura 25. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de CD133, CD34 e

CD117................................................................................................................ 96

Figura 26. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de Oct-4, EGFR e

p63..................................................................................................................... 97

Figura 27. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de CK14 e EpCAM... 98 Figura 28. Correlações significantes entre marcadores de CT/CP em

amostras de tumores......................................................................................... 103

Lista de tabelas

xv

PÁG

Tabela 1. Neoplasias malignas primárias da mama............................................ 25

Tabela 2. Sumário das características histológicas das principais neoplasias

mamárias............................................................................................................... 29

Tabela 3. Principais diferenças entre os constituintes celulares da UDLT.........

32

Tabela 4. Subtipos moleculares determinados pelo perfil de expressão gênica.. 36

Tabela 5. Classificação molecular substitutiva de neoplasias da mama humana 37

Tabela 6. Principais marcadores imunofenotípicos de CTNs.............................. 46

Tabela 7. Monomarcadores de CTNs, prognósticos e preditivos........................ 58

Tabela 8. Principais características diagnósticas dos tipos histológicos

encontrados e principais diferenças em relação ao correspondente humano....... 79

Tabela 9. Graduação histológica aplicada as neoplasias induzidas pelo DMBA 81

Tabela 10. Positividade para receptores hormonais (RE e RP)........................... 85

Tabela 11. Positividade para o produto do oncogene HER2/neu na amostra de

tumores induzidos pelo DMBA............................................................................ 86

Tabela 12. Correlação entre marcadores de CT/CP e fatores preditivos de

comportamento biológico dos tumores................................................................ 101

Tabela 13. Correlação entre marcadores de CT/CP entre si................................ 102

xvi

Símbolos, siglas e abreviaturas

xvii

INCA – Instituto nacional do Câncer

RE – Receptor de estrógeno

RP – Receptor de progesterona

CAAF – Citologia aspirativa por agulha fina

AFIP- Instituto de Patologia das Forças Armadas (Armed Forces Institute of Pathology)

OMS – Organização mundial de Saúde

CLI – Carcinoma lobular invasor

HER 2 – Fator de crescimento epidermal humano (Human Epidermal growth factor

Receptor)

CT – Célula-tronco

CTs – Células-tronco

CTN – Célula-tronco neoplásica

CTNs – Células-tronco neoplásicas

Pgp – Glicoproteína P

MDR1 – Fator de resistência a múltiplas drogas (Multidrug resistance gene1)

ALDH1 – Aldeído desidrogenase 1 (Aldehydedehydrogenase 1)

ESA – Antígeno epitelial específico (Epithelial specific antigen)

Oct-4 – Octâmero de ligação do fator de transcrição 4 (octamer-binding transcription

factor 4)

Sca-1 – Antígeno de célula tronco 1 (stem cell antigen-1)

HOECHST – Corante para identificação de DNA (ácido desoxirribonucléico )

Símbolos, siglas e abreviaturas

xviii

DMBA –Dimetilbenz(a)antraceno (Dimethylbenz(a)anthracene)

ASCO – Associação Americana de Oncologia Clínica

CAP – Colégio Americano de Patologistas

Resumo

xix

O câncer de mama é a neoplasia maligna mais prevalente e a principal causa de óbito entre

mulheres, no mundo. A despeito de avanços substanciais no entendimento da biologia da

doença, nos métodos de detecção precoce, e em sua farmacoterapia, a sobrevida geral não

se modificou significantemente nas últimas décadas. Portanto, pode se dizer que um dos

deveres primordiais das Universidades Públicas engajadas com pesquisa básica e aplicadas

consiste em contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento sistêmico

desta neoplasia. Nesse contexto, um dos alvos estratégicos mais promissores no

desenvolvimento de novos fármacos antineoplásicos é representado pela célula-tronco

neoplásica (CTN). As CTNs tem sido associadas em inúmeros estudos à capacidade de

algumas neoplasias malignas de resistir às principais modalidades terapêuticas anti-

neoplásicas, especialmente à: radio-, quimio-, hormônio- e imunoterapias. Em resumo, na

atualidade, a detecção de CTNs constitui uma ferramenta clínica bastante promissora

enquanto alvo terapêutico, fator prognóstico e preditivo de resposta terapêutica. O objetivo

deste trabalho foi descrever e discutir as potencialidades e limitações do modelo de

carcinogênese mamária pelo DMBA, após reclassificação das neoplasias mamárias segundo

os critérios diagnósticos da OMS (2003, 2012), subtipagem molecular e quantificação de

imunomarcadores prognósticos, preditivos e de CTN. Após a aplicação do protocolo

experimental de indução química pelo DMBA e a eutanásia dos animais controle e

experimental, suas linhas mamárias (contendo ou não tumores) foram ressecadas e

avaliadas quanto a morfologia e a imunoexpressão para marcadores de CTNs. Após 13

semanas, 100% dos animais desenvolveram neoplasias macroscópicas e histologicamente

compatíveis com os critérios de avaliação indicados pela OMS. Os tumores foram

classificados em carcinoma ductal, carcinoma papilífero, carcinoma lobular, carcinoma

mioepitelial e tumor filóide, sendo o tipo mais frequente, o ductal. Poucos marcadores

imunoistoquímicos mostraram correlação com variáveis de comportamento biológico.

Mesmo assim, o grau de correlação não foi elevado. A grande heterogeneidade morfológica

intratumoral e interanimal, associada à presença de subtipos histológicos bifásicos (tumor

filoide), tumores com diferenciação mioepitelial/basal e à grande positividade para

marcadores CTN clássicos (tanto em termos de frequência na amostra como em termos de

Resumo

xx

distribuição média nas neoplasias) demonstram a participação clara de CTNs no modelo, o

que o torna um importante referencial como modelo in vivo para o teste de drogas anti-CTN

específicas. O modelo reproduz os principais subtipos histológicos e moleculares de câncer

mamário, o que significa que poderá ser utilizado no estudo pormenorizado de drogas

indicadas especificamente para cada subcategoria molecular (e.g., agentes hormonais que

são indicados especificamente para os tipos luminais e trastuzumab, indicado nos tumores

do subtipo HER2), bem como no desenvolvimento de novas drogas com maior

especificidade para a classe molecular de interesse.

Palavras-chave: câncer de mama, células-tronco neoplásicas, imunoistoquímica, Sprague-

dawley, DMBA.

Abstract

xxi

Breast cancer is the most common malignancy and the leading cause of death from cancer

among females worldwide. Despite all the research and all the progress, methods of early

detection, and its pharmacotherapy, overall survival has not changed significantly in recent

decades. Therefore, the Public University has been engaged in basic and applied research is

to contributed to the development of new strategies for systemic treatment of this

malignancy. In this context, one of the most promising strategic target in the development

of the anticancer drugs is represented by neoplastic stem cell (NSC). Neoplastic stem cell

has been linked in various studies to the capacity of some malignancies to resist major anti-

neoplastic therapeutic modalities, especially: radio-, chemo-, hormone- and

immunotherapies. In summary, the detection of NSCs is a clinical tool very promising

while therapeutic target and prognostic factor predictive of therapeutic response. The aim

of this study was to describe and discuss the strengths and limitations of the model of

mammary carcinogenesis by DMBA, after reclassification of breast cancer according to the

diagnostic criteria of the WHO (2003, 2012), and quantification of molecular subtyping

prognostic immunomarkers, predictive and NSC. After application of the experimental

protocol of chemical induction by DMBA and euthanasia of experimental and control

animals, the mammary lines (with or without tumors) were resected and evaluated the

morphology and immunostaining for markers of NSCs. After 13 weeks, 100% of the

animals developed macroscopic neoplasms and histologically consistent with the evaluation

criteria of evaluation indicated by WHO. Tumors were classified as ductal carcinoma,

papillary carcinoma, lobular carcinoma, myoepithelial carcinoma and phyllodes tumor,

being the most common type, the ductal. Few immunohistochemical markers correlated

with variable behavior biological. Nevertheless, the degree of correlation was not high. The

morphological intratumoral heterogeneity and interanimal associated with the presence of

histological biphasic subtypes (phyllodes tumor), tumors with myoepithelial/basal

differentiation and the positivity for NSCs classic markers (both in terms of frequency in

the sample and in terms of the average distribution neoplasias) demonstrate a clear

involvement of NSCs in the model, making it an important reference as a model for in vivo

testing of anti-specific NSC. The model reproduces the main molecular and histological

Abstract

xxii

subtypes of breast cancer, which means that could be used in detailed study drug indicated

specifically for each subcategory molecular (eg, hormonal agents that are suitable

specifically for the luminal type and trastuzumab indicated in tumors HER2 subtype), as

well as to develop new drugs with higher specificity for the class of molecular interest.

Keywords: breast cancer, neoplastic stem cell, immunohistochemistry, Sprague-dawley,

DMBA.

1. Introdução

23

1. Câncer de mama

O câncer de mama é a neoplasia maligna mais prevalente e a principal causa de

óbito por neoplasia na população feminina, no mundo (1, 2) (Figura 1). A despeito de

avanços substanciais no entendimento da biologia da doença, nos métodos de detecção

precoce e em sua farmacoterapia (principalmente com a incorporação de anticorpos

monoclonais e nanomoléculas inibitórias de tirosina quinase), a sobrevida geral não se

modificou significantemente nas últimas décadas (3). No Brasil e em outros países em

desenvolvimento, espera-se não apenas um aumento importante na prevalência do câncer

de mama (em grande parte devido ao envelhecimento da população feminina), como

também no gasto com o financiamento da Saúde Pública, em função dos custos crescentes

com as novas modalidades terapêuticas (4, 5) e tratamentos de casos avançados, a maioria

não diagnosticados precocemente. Portanto, pode-se dizer que um dos deveres primordiais

das Universidades Públicas engajadas com a pesquisa básica e aplicada, consiste em

contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento sistêmico desta

neoplasia.

As neoplasias malignas da mama constituem um grupo bastante heterogêneo de

doenças, seja do ponto de vista clínico ou anatomopatológico. A Organização Mundial da

Saúde (OMS) contabiliza um pouco mais de 50 tipos histológicos diferentes (Tabela 1), o

que coloca o câncer mamário entre os de maior variabilidade morfológica intra- e

intertumoral do organismo humano. Tradicionalmente, a classificação histopatológica dos

tumores malignos da mama baseia-se no componente celular e/ou padrão arquitetural

predominante da neoplasia e na semelhança deste componente com constituintes normais

da mama (tais como células epiteliais, mioepiteliais, basais, bem como vários tipos de

células estromais, isto é, de origem mesenquimal). Desse modo, as malignidades primárias

da mama podem ser divididas em quatro grupos principais: os carcinomas (i.e., neoplasias

que se semelham a células epiteliais e/ou mioepiteliais), os sarcomas (semelhantes a células

mesenquimais), os tumores bifásicos com potencial maligno (tumores filóides e

carcinossarcomas) e as neoplasias de natureza linfóide e hemopoiética (6) (Figura 2).

1. Introdução

24

Figura 1. Incidência e mortalidade relacionadas ao câncer, por sítio primário, no mundo,

em ambos os sexos. Adaptado de: Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and

Parkin DM. GLOBOCAN 2008 v2.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC

CancerBase No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer;

2010. Disponível em: http://globocan.iarc.fr, último acesso em 04/01/2013.

1. Introdução

25

Tabela 1. Neoplasias malignas primárias da mama: principais entidades clínicopatológicas (e genéticas) reconhecidas pela

Organização Mundial da Saúde (6).

Tumores epiteliais malignos

Carcinomas Invasivos

Carcinoma ductal invasivo, sem outras especificações (SOE) e variantes Carcinoma de células acinares

Carcinoma lobular invasivo, clássicos e variantes Carcinoma mucoepidermóide (veja se tem acento no o)

Carcinoma tubular Carcinoma polimórfico

Carcinoma cribriforme Carcinoma oncocítico

Carcinoma mucinoso Carcinoma rico em lipídios

Carcinoma medular Carcinoma de células claras rico em glicogênio

Carcinoma apócrino Carcinoma sebáceo

Carcinoma com células em anel de sinete

Carcinoma micropapilífero invasivo Tumores epiteliais-mtioepiteliais malignos

Carcinoma metaplásico, SOE e variantes* Adenomioepitelioma com carcinoma

Tumores neuroendócrinos Carcinoma adenóide cístico

Carcinoma secretor

Carcinoma papilífero invasivo

*Inclui o carcinoma mioepitelial.

1. Introdução

26

(continuação da Tabela 1)

Tumores mesenquimais malignos Neoplasias linfoides e hemopoiéticas

Lipossarcoma Linfoma difuso de grandes células B

Angiossarcoma Linfoma de Burkitt

Rabdomiossarcoma Linfoma de células T (inclui o linfoma anaplásico ALK-negativo)

Osteossarcoma Linfoma B da zona marginal extranodal do tipo MALT

Leiomiossarcoma Linfoma Folicular

Tumores fibroepitelias malignos

Tumor filóide maligno

Tumor periductal estromal de baixo grau

1. Introdução

27

Figura 2. Principais neoplasias malignas da mama humana.

1. Introdução

28

Em geral, as neoplasias malignas da mama são graduadas quanto à semelhança com

o correlato celular/histológico (hipotético) normal, através de diferentes sistemas (6,7).

Esses sistemas de graduação histológica podem variar de acordo com o tipo histológico de

neoplasia em questão. Fala-se em correlato histológico “hipotético”, pois inicialmente

pensava-se que as neoplasias conservavam algumas características fenotípicas de sua célula

origem (i.e., a célula normal, alvo de sucessivas mutações carcinogênicas). Contudo, como

será discutido adiante, é possível que a maioria das neoplasias malignas não tenha origem

em células diferenciadas que sofreram mutação, e sim em células indiferenciadas, com

capacidade de diferenciação para múltiplas linhagens, chamadas variavelmente de células-

tronco ou células progenitoras. Nesse caso, a semelhança com estruturas tissulares normais

não apontaria para a origem da neoplasia, mas indicaria a capacidade da neoplasia em

“mimetizar” células ou estruturas teciduais normais (8).

Cumpre lembrar que tanto a subtipagem histológica (classificação diagnóstica

principal) como a graduação histológica são de grande importância na conduta clínica,

definindo vários aspectos da (1) propedêutica complementar (i.e., que exames

complementares devem ser solicitados), da (2) terapêutica (i.e., se algum tipo de

farmacoterapia será associado ao tratamento cirúrgico e em que momento da terapêutica

isso ocorrerá, etc.), bem como da (3) estratificação prognóstica (6). As características

histopatológicas mais típicas dos principais subtipos morfológicos reconhecidos pela OMS

(e pela maioria dos especialistas na área) encontram-se resumidas na Tabela 2 (6, 7, 9).

1. Introdução

29

Tabela 2. Sumário das características histológicas típicas das principais neoplasias mamárias, segundo a OMS (6).

Tipo histológico Principais características microscópicas

Carcinoma ductal invasivo

Estruturas tubulocinares infiltrativas

Citoplasma abundante e eosinófilo

Pleomorfismo nuclear variável

Estroma pouco celular

Índice mitótico variável

Carcinoma lobular invasivo (clássico) Células descoesas com núcleos homogêneos

Dispostas isoladamente ou em filas indianas

Invasão concêntrica, circundando ductos (aspecto em alvo)

Baixo grau nuclear

Carcinoma papilífero Estruturas papilares complexas revestindo estruturas císticas

Papilas delicadas revestidas por duas ou mais camadas de células neoplásicas

Citoplasma anfofílico

Pleomorfismo nuclear variável

Carcinoma mioepitelial Componente epitelial + componente mioepitelial (ambos malignos)

Depende de confirmação imunoistoquímica

Tumor filóide maligno Tumor bifásico (componente epitelial geralmente benigno + mesenquimal maligno)

Aspecto foliáceo

Estroma hipercelular, atípico e mixóide

1. Introdução

30

Divergências e controvérsias diagnósticas existem no estudo dos tumores mamários,

como em qualquer outro campo da Patologia; contudo, pode se dizer que as características

enumeradas na Tabela 2 constituem, na atualidade, verdadeiros critérios diagnósticos

através dos quais as malignidades mamárias humanas podem ser classificadas de forma

racional e reprodutível.

Dentre as neoplasias malignas da mama, cumpre destacar os carcinomas (neoplasias

malignas de natureza epitelial e/ou mioepitelial), uma vez que representam a grande

maioria dos tumores primários (6, 7) . Dentre os carcinomas, os subtipos histológicos mais

comuns são: o carcinoma mamário invasivo sem outras especificações (SOE) ou carcinoma

ductal invasivo (40-75% dos carcinomas) e o carcinoma lobular (5-15%) (6, 7, 9). Apesar

dos nomes (“ductal” e “lobular”), acredita-se que ambos se originem nas unidades

ductolobulares terminais (UDLTs) – as unidades funcionais da mama localizadas nas

extremidades distais da ramificação do sistema ductal mamário. No tecido mamário maduro

e funcional, as UDLTs são constituídas por três tipos celulares principais: (1) as células

epiteliais luminais, (2) as células mioepiteliais e (3) a células basais (Figura 3) (9, 10). Os

dois primeiros tipos celulares são considerados como células “diferenciadas”, isto é, no

extremo da maturidade funcional e com mínima capacidade de autorreplicação. A célula

basal, por outro lado, apresenta algumas características fenotípicas, funcionais e

topográficas que as tornam fortes candidatas ao título de célula-tronco ou célula progenitora

da mama. Um sumário das principais diferenças morfológicas, topográficas,

imunofenotípicas e funcionais pode ser observado na Tabela 3

Embora seja consenso que a maioria dos carcinomas mamários se origine nas

UDLTs, não se pode precisar qual dos três tipos celulares é o alvo das mutações sucessivas

que levam ao desenvolvimento do câncer. Isso porque as características típicas das células

epiteliais, mioepiteliais e basais se manifestam de forma variada e imprevisível nas

neoplasias malignas da mama (ou seja, ora encontram-se evidências de diferenciação para

um tipo único de célula [e.g., epitelial] ora observam-se fenótipos combinados [e.g.,

epitelial + mioepitelial]).

1. Introdução

31

Figura 3. Esquema ilustrativo do desenvolvimento de neoplasias mamárias epiteliais a

partir de UDLTs (10).

Expansão inicial de UDLTs por

CDIS

Unidade ductolobular terminal (UDLT)

Ducto segmentar

Papila

Seio lactífero

Expansão completa de UDLTs por CDIS

GLD não lactante GLD lactante

UDTL normal

1. Introdução

32

Tabela 3. Resumo das principais diferenças entre os constituintes celulares da unidade

ductolobular terminal (9).

Célula

Luminal

Células

Mioepitelial

Célula

Basal/ Tronco/

Progenitora

Topografia

Revestimento mais interno

(luminal)

Revestimento mais externo

(interface ácino-estroma)

Interface ácino-etroma

Morfologia Colunar/cuboidal,

citoplasma eosinófilo

Variável (desde

semelhante a linfócito até

epitelióide)

Indiferenciada (semelhante

a linfócito)

Imunofenótipo Citoqueratinas 7, 8, 18 e

19

S-100, actina muscular,

calponina, CD10, p63,

citoqueratinas 5/6, 14, 17

Citoqueratinas, 5/6, 14 e

vários marcadores

clássicos de célula-tronco

tecido-inespecíficos (vide

adiante).

1. Introdução

33

Além da tradicional classificação morfológica, recentemente, uma nova maneira de

subtipar as neoplasias mamárias vem ganhando importância clínica, particularmente,

devido ao seu valor preditivo de resposta terapêutica. Essa classificação, chamada

“classificação molecular dos carcinomas mamários”, baseia-se em estudos de perfil de

expressão gênica (isto é, trabalhos focados no uso de microarranjos de cDNA) e preconiza

a divisão dos casos em 4 subtipos principais: luminal A, luminal B, HER2 e basal-símile

(ou basal-like) (9, 11, 13, 14, 15). Esses novos tipos diferenciam-se não apenas em relação

ao padrão de expressão gênica (Figura 4), como também no que diz respeito a

características clínicas, prognósticas e de resposta ao tratamento farmacológico (9, 11, 13,

14, 15) (Tabela 4) .

Uma vez que a subtipagem molecular através do perfil de expressão gênica envolve

metodologia laboriosa, de alto custo e, portanto, ainda indisponível na maioria dos serviços

de saúde, tem se recorrido com frequência ao uso de uma subtipagem molecular

“alternativa”, que se baseia no uso de um painel imunoistoquímico bastante simples. Esse

método alternativo é apresentado na Tabela 5 (9, 13, 14, 15, 16). O método alternativo ou

aproximado de subtipagem molecular das neoplasias mamárias vem ganhando bastante

crédito entre mastologistas e patologistas especialistas na área, especialmente após o último

Consenso de St. Gallen que propõe esta classificação como base para a indicação dos

diferentes regimes de farmacoterapia disponíveis para o tratamento do câncer mamário

(16). É provável que muito em breve este sistema de subtipagem deverá ser incorporado à

padronização do laudo anatomopatológico do câncer de mama como item obrigatório,

devido à importância crescente do subtipo molecular no estabelecimento do prognóstico e

da conduta terapêutica frente a um carcinoma mamário.

1. Introdução

34

1. Introdução

35

Figura 4. Padrão de expressão gênica de 85 amostras experimentais representando 78

carcinomas, 3 tumores benignos e quatro tecidos normais, analisados por agrupamento

hierárquico utilizando um conjunto de 476 clones de cDNA intrínseco. (A) As amostras de

tumores foram divididas em cinco (ou seis) subtipos com base nas diferenças da expressão

dos genes. O dendograma mostra os cinco (seis) subtipos de tumores (coloridos) que são:

subtipo luminal A, azul escuro; subtipo luminal B, amarelo; subtipo luminal C, azul claro;

mama normal, verde; tipo basal, vermelho e ERBB2+, rosa. (B) As barras coloridas à

direita representam as inserções apresentadas no C-G. (C) Amplificação do ERBB2. (D)

Conjunto desconhecido. (E) Células epiteliais basais. (F) Mama normal. (G) Luminal

contendo receptor de estrógeno (15).

1. Introdução

36

Tabela 4. Subtipos moleculares do câncer de mama determinados pelo perfil de expressão

gênica: sumário das principais diferenças em termos de perfil de expressão gênica,

características clínicas e resposta ao tratamento (1).

Luminal HER2 Basal

Padrão de

expressão gênica

Elevada expressão de RE e

RP e genes associados

(luminal A>luminal B)

Elevada expressão de

HER2;

Baixa expressão de RE

Elevada expressão de genes

epiteliais basais,

citoqueratinas basais;

Baixa expressão de RE e

HER2.

Características

clínicas

~ 70% dos carcinomas

invasivos, RE/RP positivos.

Grau histológico: luminal B >

luminal A;

Alguns superexpressam

HER2 (luminal B2).

~15% dos carcinomas

invasivos;

RE/RP negativos

~15% dos carcinomas

invasivos;

A maioria triplo negativo

Resposta ao

tratamento

Responde ao tamoxifeno e

inibidores da aromatase, pode

ser diferente para luminal A e

luminal B;

Resposta variável a

quimioterapia (luminal

B>luminal A);

Prognostico luminal A>

luminal B.

Responde ao Trastuzumab

(Herceptina) e a

antraciclinas

Geralmente pior

prognóstico

Não responde ao

Trastuzumab (Herceptina);

Pode ser sensível as

platinas e inibidores da

enzima poli (ADP-ribose)

polimerase-1(PARP);

Geralmente pior

prognóstico

1. Introdução

37

Tabela 5. Classificação molecular substitutiva (alternativa aos métodos moleculares

validados: Mammaprint® e Oncotype Dx®) de neoplasias malignas da mama humana (9).

Luminal A Luminal B1 Luminal B2 HER2 Triplo

negativo/basal-

símile

RE/RP

+

+

+

-

-

C-erbB-2

-

-

+

+

-

Ki67

14%

Variável

Variável

Variável

1. Introdução

38

2. Células-tronco neoplásicas

As células-tronco (CT) podem ser definidas através de duas propriedades

fundamentais: a capacidade de (1) autorrenovação e de (2) diferenciação em múltiplas

linhagens celulares (17). Em geral, são classificadas segundo sua origem em: embrionárias,

fetais, umbilicais e adultas (18). Os três primeiros subtipos são representados por CTs mais

primitivas e com expressivo potencial de diferenciação, podendo originar qualquer tipo

celular de um organismo desenvolvido.

As CT adultas constituem uma pequena parcela de órgãos sistêmicos maduros, onde

podem originar alguns tipos celulares específicos como os que caracterizam a pele, a

glândula mamária, a próstata, o trato gastrintestinal e o sistema nervoso central (19). As

CTs adultas são células de vida longa, em geral, quiescentes ou de baixo índice

proliferativo. São capazes de gerar, através de divisões simétricas ou assimétricas, novas

células tronco (preservando assim o pool de reserva destas células) ou células

comprometidas com um fenótipo morfofuncional (que deverão proliferar, constituindo

desse modo a maior parte de um determinado órgão/tecido) (3, 20, 21).

O crescimento e a diferenciação da CT adulta mais primitiva (a CT toti- ou

pluripotente) e sua progênie mais imediata (as células precursoras imaturas ou

multipotentes) são modulados por sinais encontrados no microambiente local – o chamado

“nicho da célula tronco”. Essa sinalização inclui interações homotípicas de caderinas (do

nicho e das CTs), bem como interações entre integrinas das CTs e a matriz extracelular.

Em conjunto, a capacidade de autorrenovação e o potencial multilinhagem conferem

às CTs um papel fundamental tanto em processos fisiológicos quanto patológicos. Nos

1. Introdução

39

processos fisiológicos, incluem-se: a organogênese intra-útero, a renovação natural de

epitélios e outros tecidos com capacidade de proliferação, bem como processos de

reparação/cicatrização de tecidos lesados. Dentre os processos patológicos, destacam-se as

neoplasias malignas, onde as propriedades fundamentais das CTs parecem estar

desreguladas (17). Em várias neoplasias malignas (incluindo leucemias e a maioria dos

tumores sólidos), evidências recentes indicam que a célula alvo de mutações cumulativas

responsáveis pelo desenvolvimento e manutenção do fenótipo canceroso seja uma célula

normal com características fenotípicas de CT adulta (21). Neste contexto, as CTs seriam

responsáveis pela origem, manutenção (autorrenovação) e heterogeneidade morfológica das

neoplasias.

Cumpre ressaltar que essas hipóteses configuram um novo paradigma de

carcinogênese, que vem ganhando credibilidade na última década por meio de evidências

cumulativas, e que se contrapõe ao modelo clássico de carcinogênese no qual as neoplasias

se originariam a partir de mutações sucessivas em qualquer célula de um tecido

(independente do seu status de maturação/diferenciação) (22).

Independentemente da origem da neoplasia (seja em célula madura/diferenciada ou

em CT), é possível constatar in vitro e in vivo, em um grande número de tumores malignos,

uma subpopulação de células indiferenciadas, com características biológicas e fenotípicas

de célula tronco, que em geral corresponde a menos de 1% do total de células de uma

neoplasia (17). Essas células são designadas na maioria dos estudos como “células-tronco

cancerosas, tumorais ou neoplásicas (CTNs)”. Nesses estudos, demonstra-se que as CTNs

1. Introdução

40

são responsáveis pela variabilidade citoarquitetural e molecular de inúmeras neoplasias

malignas (tais como carcinomas mamários e ovarianos) (3, 21).

Embora representem, geralmente, uma pequena parcela da neoplasia total, as CTNs

têm sido associadas em vários estudos à capacidade de algumas malignidades de resistir às

principais modalidades terapêuticas anti-neoplásicas – especialmente, a quimio-, radio- e

imunoterapias (3, 17). Essas abordagens terapêuticas parecem atuar de forma eficaz apenas

sobre as células mais diferenciadas da neoplasia (principalmente, as que apresentam

elevados índices de proliferação), reduzindo essa subpopulação, sem comprometer

significantemente as CTNs. A preservação, mesmo que parcial, de CTNs, por sua vez,

poderia contribuir de forma decisiva para recidivas neoplásicas locais e à distância, em

médio ou longo prazo (3, 21, 22).

Os fatores que tornam as CTNs mais resistentes à terapêutica antineoplásica não

estão totalmente elucidados, mas parecem estar relacionados ao fato das CTNs (1) estarem

na maior parte do tempo em estado quiescente (sendo que a maioria das estratégias

terapêuticas são mais efetivas em células em ciclo) e (2) expressarem moléculas

transportadoras de xenobióticos (transportadores de efluxo), que impedem o acúmulo

citosólico de fármacos anti-neoplásicos (17). Dentre esses transportadores de efluxo, que

constituem o substrato molecular para o fenômeno de resistência a múltiplas drogas,

destacam-se a glicoproteína P (Pgp) - produto do gene MDR1 (“multidrug resistance

gene1” ou ABCG1) -, bem como a proteína codificada pelo gene ABCG2 (ATP-binding

cassette sub-family G member 2). A proliferação lenta das CTNs também explicaria porque

as recidivas de alguns tumores (como os carcinomas mamários, os osteossarcomas e os

1. Introdução

41

sinoviossarcomas) podem demorar mais de 10 anos para tornarem-se detectáveis pelos

métodos imagenológicos e laboratoriais disponíveis (23).

Além de estarem implicadas em resistência terapêutica, as CTNs parecem estar

associadas a outras variáveis biológicas relacionadas à agressividade dos processos

neoplásicos, influenciando negativamente, através de diferentes vias, o prognóstico das

neoplasias malignas (3, 24). Dentre as variáveis biológicas de agressividade onde a

presença e o número de CTNs podem ter papel significante, destacam-se: (a) a capacidade

de migração celular (deslocamento de células neoplásicas após separação espontânea do

tumor parental); (b) a invasividade em tecido conjuntivo (capacidade de se deslocar no

tecido conjuntivo, dissolvendo ou destruindo barreiras naturais, como fibras colágenas,

células estromais e células imunes, em geral através da produção de enzimas e/ou

substâncias citotóxicas); (c) a atividade pró-angiogênica (capacidade de estimular a

proliferação de novos vasos a partir de um leito capilar pré-existente, facilitando a nutrição

do tumor primário e o acesso de células invasoras ao sistema circulatório); e (d) a

tumorigenicidade (capacidade de estabelecer-se e de dar origem a um novo tecido

neoplásico, em um novo sítio anatômico do organismo de origem ou em um novo

organismo vivo, relacionada à expressão de moléculas de adesão, homing e à resistência a

mecanismos de defesa inatos e imunológicos locais) (3, 24). Essas características biológicas

estão diretamente associadas à capacidade metastatização, um evento que caracteriza o

estádio mais avançado de uma neoplasia maligna, onde a probabilidade de cura ou

sobrevivência com qualidade de vida é muito pequena. Desse modo, a presença e proporção

de CTNs em uma neoplasia maligna parecem estar associadas a comportamento biológico

1. Introdução

42

mais agressivo (i.e., maior capacidade de invasão local e metastatização) e, por

conseguinte, pior prognóstico (3, 24).

A prova definitiva de que uma determinada célula é de fato uma CT consiste na

demonstração da capacidade desta célula em reconstituir o seu tecido de origem (seja ele

normal ou neoplásico), quando implantada em uma nova topografia anatômica ou em um

novo organismo (19, 25, 26). Esse tipo de demonstração impõe algumas limitações éticas e

técnicas à realização de estudos sobre CTN, em particular, quando envolvem tecidos

humanos e geração de dados em larga escala, respectivamente. Por esses motivos,

historicamente, uma série de técnicas menos laboriosas/complexas e mais factíveis vem

sendo desenvolvidas com o intuito de substituir o método de demonstração considerado

como padrão ouro (17, 26).

No câncer de mama, a presença de CTNs foi estabelecida em linhagens celulares,

modelos experimentais murinos de carcinogênese induzida e em tecido humano, através de

diferentes técnicas como a formação de mamosferas em cultura, o teste de efluxo do

corante Hoechst, a imunofenotipagem por imunoistoquímica e por citometria de fluxo (26).

Na imunofenotipagem, as CTs e CTNs apresentam um perfil de expressão de moléculas, as

quais são representadas especialmente por proteínas e glicoproteínas encontradas na

superfície, no citoplasma ou no núcleo dessas células.

Esse perfil molecular pode ser definido tanto pela expressão típica de algumas

moléculas (CD34, CD133, CD44, ALDH, ESA, Sca-1, dentre outras) quanto pela ausência

de outras (17, 27). Assim, algumas moléculas como o ALDH1 (um marcador alternativo ao

teste do ALDEFLUOR), CD133, ESA/EPCAM e a combinação CD44/CD24 (sendo o perfil

1. Introdução

43

CD44+/CD24- indicativo de CTN) são consideradas os marcadores mais utilizados em

pesquisas científicas e os mais descritos na literatura para o estudo de CTNs (Tabela 6) (27,

28).

O perfil imunofenotípico típico de uma CTN pode variar de neoplasia para neoplasia,

entre espécies animais e modelos experimentais distintos, com a técnica de

imunofenotipagem utilizada (citometria de fluxo vs. imunoistoquímica), com a abordagem

experimental (in vitro vs. in vivo) e dentro de um mesmo tumor, sugerindo a coexistência

de clones diferentes de CTNs (17). Além disso, nem sempre o perfil imunofenotípico de

determinada CTN coincide perfeitamente com o perfil da CT normal correspondente, o que

pode indicar que algumas destas moléculas possam desempenhar uma função importante

para a manutenção do próprio fenótipo neoplásico ou maligno (3, 17).

Sugere-se que grande parte da variabilidade imunofenotípica acima possa estar

relacionada ao fato destes marcadores serem moléculas envolvidas na interação da CT

(normal ou neoplásica) com o seu nicho podendo esta ser uma interação dinâmica.

Portanto, se houver variação no microambiente celular ou no momento da dinâmica de

interação, padrões imunofenotípicos diferentes poderão ser encontrados. Da mesma forma,

as diferenças técnicas inerentes a cada método de imunofenotipagem podem favorecer ou

não a detecção de alguns marcadores.

É importante ressaltar que, independente dessa variabilidade imunofenotípica, a

existência de perfis imunofenotípicos específicos para CTs e CTNs permite a detecção

dessas células em diferentes contextos experimentais, o que por sua vez favorece e agiliza

muito a realização de estudos sobre essas células, voltados para o entendimento de aspectos

1. Introdução

44

fisiopatológicos e para o desenvolvimento de aplicações clínicas (testes diagnósticos,

ferramentas de avaliação prognóstica/preditiva de resposta terapêutica e estratégias de

tratamento, como as farmacológicas) (17, 29).

Nos últimos anos, o estudo da biologia de células tronco de tumores sólidos tornou-se

crescente na prática clínica oncológica devido, principalmente, a identificação de novos

marcadores de células progenitoras e/ou CTNs (3, 19). A identificação de CTNs mamárias

através das técnicas imunólogicas como a imunoistoquímica tem sido importante nas

pesquisas com o objetivo de estabelecer uma melhor conduta diagnóstica e avaliar fármacos

que atuem principalmente sobre as CTNs, sem causar danos às células tronco normais ou

mesmo as células normais diferenciadas do organismo. Esta abordagem baseia-se na

premissa de que as CTNs devem conservar pelo menos parcialmente a expressão de

antígenos característicos da célula de origem que pode ser uma CT ou progenitoras

primitivas normais, o que já foi demonstrado em estudos mais recentes (30, 31).

Assim, a técnica imunoistoquímica apresentaria ainda a vantagem de permitir o

estudo das CTN in situ, com correlação morfológica e topográfica, onde as células são

observadas em seu contexto histológico real. Nenhum marcador ainda é absolutamente

específico para o fenótipo CTN, portanto, essa correlação citomorfológica/topográfica

poderia não só reduzir as chances de falsos positivos, como poderia fornecer insights a

respeito do papel biológico específico das CTN em várias neoplasias (25). Além disso, o

recente advento dos scanners de lâminas histológicas que permitem a digitalização e a

análise automatizada de toda a superfície de um corte histológico, com agilidade e precisão

1. Introdução

45

e das técnicas aprimoradas de imunomarcação múltipla em material cito e histológico

também favorece a utilização da técnica de imunoistoquímica para detecção das CTNs.

1. Introdução

46

Tabela 6. Principais marcadores imunofenotípicos de CTN, em diferentes neoplasias malignas (17).

Marcador Sinonímia Órgão/tecido

CD24 Heat stable antigen Mama (CT e CTN)

CD29 Integrina beta-1 Mama (CT e CTN)

ESA/EPCAM Antígeno epitelial-específico Mama e pâncreas (CTN)

CD44 - Mama e próstata (CTN)

CD133 Prominina-1 Mama e próstata (CTN)

p63 - Mama e próstata (CT e CTN)

Stem cell antigen Sca-1 Mama, próstata, músculo, MO (CT e CTN)

CD34 - Intestino (CTN); fígado e pâncreas (CT)

c-Kit CD117 Intestino (CTN); fígado e pâncreas (CT)

Abrev.: CT= célula tronco normal, CTN= célula tronco neoplásica, MO= medula óssea (séries hemopoiéticas).

1. Introdução

47

3. Dimetilbenz-(a)-antraceno (DMBA) como modelo de carcinogênese mamária

Os modelos animais são utilizados em todos os campos da pesquisa biológica. Tais

modelos, obrigatoriamente, devem permitir a observação de fenômenos biológicos naturais,

induzidos ou comportamentais, que possam ser comparados aos fenômenos humanos

estudados (32, 33).

Um dos modelos mais utilizados para o estudo do câncer de mama baseia-se no uso

de 7,12-dimetilbenz-(a)-antraceno (DMBA) como indutor químico em ratas Sprague-

Dawley (SD). Para a obtenção de neoplasias mamárias, Russo e Russo (2000) e Barros et al

(2004) utilizaram o DMBA diluído em óleo de soja na dose de 20 mg por animal,

administrado por gavagem intragástrica, e após 13 semanas da indução 100% dos animais

apresentaram de 1 a 3 nódulos palpáveis. Os tumores assim obtidos parecem apresentar

certa similaridade histomorfológica e molecular com tumores humanos (34). A

suscetibilidade da glândula mamária destes roedores a este protocolo torna este órgão um

alvo importante para testar o potencial carcinogênico de compostos específicos. Os tumores

induzidos pela administração de produtos químicos cancerígenos como o DMBA

constituem uma ferramenta útil para investigar as várias etapas da carcinogênese que inclui

a iniciação, promoção e progressão da doença (35, 36, 37).

Dentre os mecanismos que explicam a carcinogênese pelo DMBA, a principal teoria

é a ativação do receptor/fator de transcrição AhR (aryl hidrocarbon receptor/transcription

fator), membro da família Per-ARNT-Sim (PAS) de fatores de transcrição, o que

influenciam no desenvolvimento, no ciclo circadiano e nas respostas da hipóxia (38).

De modo geral, a administração de DMBA leva ao aumento na atividade do AhR,

por intermediação da indução da CYP1A1, CYP1A2 e outras enzimas que também

participam no metabolismo de xenobióticos (38, 39). São estas enzimas que convertem o

DMBA em intermediários epóxido mutagênicos - o 7-hidroximetil-12-

dimetilbenzantraceno (7-HDMBA), o 12-hidroximetil-7-metilbenzantraceno (12-HMBA) e

o 7,12-dimetilbenzantraceno, que formam adutos de DNA (40). Estes metabólitos ativam

principalmente o AhR que se complexa com a proteína Heat-Shock 90 (hps90) e

provavelmente ainda com outras proteínas ainda não evidenciadas. Quando por algum

1. Introdução

48

motivo estas proteínas se dissociam, a AhR está livre para se translocar para o núcleo e se

dimerizar com o cofator ARNT (aryl hidrocarbon receptor nuclear translocator),

associando-se a sequencias regulatórias de transcrições específicas no DNA. Um vez no

núcleo induzem a expressão de genes que codificam para fatores de crescimento e proto-

oncogenes (38, 40).

Estudos em animais indicaram que o DMBA é rapidamente absorvido no trato

intestinal e tende a se acumular no tecido adiposo. Como a glândula mamária tem por

característica fisiológica o acúmulo de tecido adiposo isso a torna um importante local de

tropismo para o DMBA (40, 41).

A incidência de tumores induzidos quimicamente, o número de tumores por animal

e as características patológicas podem ser influenciadas pela idade do hospedeiro, no

momento da exposição cancerígena, o status hormonal, a dosagem do agente de indução e a

via de administração, dentre outros fatores (35, 36, 37, 42, 43, 44). As ratas SD são muito

sensíveis a carcinogênese pelo DMBA entre 35 e 55 dias de idade devido à intensa

atividade proliferativa do tecido mamário neste período (44, 45, 46). Além disso, há grande

sucesso na taxa de indução, sendo obtidos tumores macroscopicamente visíveis após 13

semanas em mais de 90% dos animais (45). Embora não totalmente demonstrado, é

possível que os tumores obtidos a partir deste modelo expressem receptores hormonais e

marcadores preditivo-prognósticos (e.g., C-erbB-2), o que o tornaria um modelo ainda mais

robusto, principalmente frente ao desenvolvimento da chamada medicina personalizada.

Apesar do DMBA ser um indutor dos modelos de carcinogênese mamária mais

utilizado na literatura, ou seja, tanto em estudos de fisiopatogênese como em estudos

farmacológicos, são raros os trabalhos focados na descrição histopatológica pormenorizada

das neoplasias induzidas pelo DMBA, na caracterização imunoistoquímica de marcadores

prognósticos/preditivos de resposta terapêutica e na correlação minuciosa com as

neoplasias humanas.

1. Introdução

49

Finalmente, até o momento, não foram relatados trabalhos voltados para a detecção da

expressão de marcadores de células-tronco neoplásicas neste modelo de carcinogênese.

50

2. Justificativa

51

A classificação das lesões induzidas pelo DMBA segundo os critérios diagnósticos da OMS

(2003; 2012) para neoplasias humanas e em subtipos moleculares, bem como a

caracterização imunoistoquímica dessas lesões quanto à expressão de marcadores

prognósticos, preditivos terapêuticos e de CTNs, além de inéditas, deverão contribuir

significantemente para definir as potencialidades e limitações do modelo. Em outras

palavras, é importante identificar que subgrupo de neoplasias mamárias o modelo de fato

mimetiza, e se o modelo é robusto o suficiente para o teste de drogas anti-CTN ou

direcionadas contra alvos moleculares específicos. Além disso, os marcadores avaliados

poderão ser investigados futuramente como possíveis alvos farmacológicos (i.e., para o

desenvolvimento de novos fármacos, em particular anticorpos monoclonais e

nanomoléculas).

52

3. Objetivos

53

3.1- Objetivo Geral

Descrever e discutir as potencialidades e limitações do modelo de carcinogênese mamária

pelo DMBA após classificação das neoplasias mamárias segundo os critérios da OMS

(2012), subtipagem molecular e quantificação de imunomarcadores prognósticos, preditivos

e de CTN.

3.2- Objetivos específicos

1. Reclassificar os tumores induzidos por DMBA, segundo os critérios da OMS

(2012). Determinar a frequência dos subtipos histológicos na amostra avaliada e a

composição histológica média dos tumores induzidos.

2. Descrever e quantificar as características histomorfológicas indicativas de

comportamento biológico (tais como graduação histológica, necrose e índice

proliferativo).

3. Quantificar a expressão imunoistoquímica de marcadores prognósticos/preditivos e

de CTN.

4. Classificar os tumores induzidos pelo DMBA segundo os principais tipos

moleculares estabelecidos (luminais, HER2 e triplo negativo/basal-símile).

5. Estabelecer o grau de correlação entre os marcadores imunoistoquímicos e as

características morfológicas avaliadas.

6. Estabelecer o grau de correlação entre diferentes marcadores de CTN.

7. Discutir as principais potencialidades e limitações do modelo.

54

4. Material e métodos

55

4.1- Aspectos éticos

O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética no uso de animais da

Universidade Estadual de Campinas (CEUA-IB-UNICAMP), protocolo nº 2390-1.

4.2- Locais de realização

A pesquisa foi realizada no Laboratório de Histomorfometria e Patologia Molecular

Aplicadas do Departamento de Farmacologia (LHIAP)/FCM (UNICAMP), em colaboração

como Laboratório de Patologia Experimental (LAPE)/CAISM (UNICAMP), o Centro de

Investigações em Pediatria (CIPED)/FCM (UNICAMP) e o Laboratório de Patologia

Experimental e Molecular do Hospital do Câncer A. C. Camargo/Fundação Antônio Prudente.

4.3- Animais

Para o experimento, quarenta (40) ratas Sprague-Dawley virgens, entre 45-55 dias de idade,

pesando entre 150-200 g, provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica-

CEMIB-Unicamp, foram adaptadas ao Biotério do Departamento de Farmacologia - Unicamp e

divididas em 2 grupos:

• Experimental (GE, n=20): ratas submetidas a protocolo de indução química de

neoplasias mamárias.

• Controle (GC, n= 20): animais não induzidos quimicamente.

4.4- Indução tumoral e obtenção dos espécimes anatomopatológicos

A neoplasia mamária foi induzido através de uma única dose de 7,12-

dimetilbenz(a)antraceno(DMBA) (100mg/Kg de peso vivo, diluída em 1mL de óleo de soja)

administrada intragastricamente por gavagem. Os animais foram eutanasiados 90 dias após a

indução química (grupo experimental). Foram também eutanasiados os animais que receberam

apenas dose única de 1 ml de óleo de soja (grupo controle).

Ao fim do protocolo de indução, as ratas experimentais e seus controles

correspondentes foram anestesiadas com diazepam (2 mg/kg), ketamina (60 mg/kg) e

4. Material e métodos

56

fentanila (0,04 mg/kg), em seguida, submetidas a aprofundamento anestésico em câmara de

isoflurano e deslocamento cervical (sendo todo o procedimento acompanhado por um

médico veterinário). Foram ressecadas ambas as linhas mamárias das ratas controle e

experimental. Todos os animais foram submetidos à necropsia completa para avaliação macro e

microscópica de doença metastática e neoplasias primárias sincrônicas (em sítios não mamários).

O produto das ressecções mamárias e da necropsia foi encaminhado para exame macroscópico

(com especial atenção à determinação das dimensões e alterações à superfície de corte das peças),

fixação em formalina 10% tamponada e processamento histológico automático para inclusão em

parafina.

4.5- Tissue microarray (TMA)

Os casos foram analisados e as áreas de interesse do corte foram marcadas com caneta

permanente sobre a lâmina, e sobrepostas aos seus respectivos blocos que também foram

marcados nos pontos a serem doados os cilindros de tecido. As identificações das lâminas foram

transferidas para planilha Excel® que foi utilizada como guia para a confecção do microarranjo.

Após a confecção do bloco receptor com o auxílio do aparelho de construção de array (Manual

Tissue Arrayer, MTA-1, Beecher Instruments Inc.) com agulha de 1mm, foram retirados

cilindros de tecido de cada bloco e sepultados no bloco receptor, tendo aí a matriz formada. Em

um micrótomo rotativo, o bloco foi cortado na espessura de 5µm em fita adesiva e aplicada em

lâminas especiais (Instrumedics Inc.); a fita adesiva foi retirada por exposição a luz ultravioleta

por 30 minutos, e após esse passo, as lâminas foram mergulhadas em solvente (TPC) e secas a

temperatura ambiente (validação metodológica: De Brot et. al., 2012 (49)).

4. Material e métodos

57

4.6- Colorações histológicas

Cortes histológicos entre 4-5 µm foram corados em hematoxilina-eosina (HE) com a

finalidade de avaliar os órgãos removidos durante a necropsia e as características morfológicas

dos tumores; quantificar necrose tumoral, índice mitótico e graduação histológica final. Para esta

análise foram excluídas as neoplasias bifásicas (tumor filoide).

Para a imunoistoquímica foram selecionados alguns marcadores para CTNs disponíveis

comercialmente e marcadores prognósticos/preditivos de resposta farmacológica de rotina, com

reatividade comprovada em tecidos murinos (Tabela 7). Resumidamente, após desparafinização e

hidratação, os cortes histológicos foram submetidos ao bloqueio da peroxidase endógena (três

banhos de H2O23%, de 5 minutos cada), recuperação antigênica por calor úmido (imersão em

solução tampão citrato de sódio pH 6.0, por 30 min, em panela de vapor, a 95ºC) e incubação

com o anticorpo primário “overnight”. Como método de detecção foi utilizado o Advance™

HRP Link (Dako cód. K4068, Carpinteria, CA, EUA) e para a revelação da reação foi

utilizado o substrato cromogênico (DAB-tetraidrocloreto de 3-3'-diaminobenzidina, Sigma

Chemical Co., St. Louis, MO, Estados Unidos da América). Os cortes foram então

contracorados com hematoxilina de Harris, desidratados e montados em lamínulas e resina

Entellan® (Merck, Dermstad, Alemanha).

A digitalização das lâminas foi realizada de modo automático em equipamento

constituído pelo scanner de lâminas Pannoramic MIDI (3DHistech), equipado com o

software dedicado Pannoramic Viewer para obtenção da lâmina virtual e das imagens TIFF

de análise (após seleção manual dos campos de interesse). Para determinação da frequência

de células neoplásicas positivas para marcadores de CTN foi utilizado o programa Image J

(programa de domínio público, fornecido pelo NIH, EUA, através do site:

http/imagej.nih.gov/ij/download). Os resultados de positividade foram expressos em

número de células positivas para cada marcador. Para as análises morfológicas dependentes

do exame direto da lâmina (e.g., graduação histológica), foi utilizado o fotomicroscópio de

co-observação (Nikon 50i + Moticam 5Mpx). Neste caso, as análises foram realizadas

levando-se em consideração toda a superfície de corte.

4. Material e métodos

58

Tabela 7. Monomarcadores (single markers) de CTNs, prognósticos e preditivos (de resposta ou

resistência terapêutica).

Marcador Fabricante Diluição Função

CD34 Santa Cruz 1:2000 Marcador CTN

p63 Dako 1:300 Marcador CTN

C-kit (CD 117) Dako 1:200 Marcador CTN

Oct-4 Abcam Pronto para uso

Marcador CTN

CD 44 Leica/Novocastra 1:40 Marcador CTN

CD 24 Neomarkers 1:50 Marcador CTN

CD 133 Abcam 1:100 Marcador CTN

EPCAM (Esa) Cell Marque 1:200 Marcador CTN

Ck14 Thermoscientific 1:500 Marcador CTN

EGFR Leica 1:50 Marcador CTN

ALDH 1A1 Abcam 1:250 Marcador CTN e preditivo de resistência terapêutica

RE Neomarkers 1:100 Marcador de bom prognóstico e preditivo de resposta terapêutica para agentes hormonais (e.g., Tamoxifeno).

RP Dako 1:400 Marcador de bom prognóstico e preditivo de resposta terapêutica para agentes hormonais (e.g., Tamoxifeno).

C-erbB-2 (HER2/neu) Dako 1:1000 Marcador de mau prognóstico e preditivo de resposta terapêutica para Trastuzumab

4. Material e métodos

59

4.7. Variáveis de análise morfológica

O tipo histológico foi estabelecido seguindo os critérios recomendados pela

Organização Mundial de Saúde (2012). A graduação histológica foi baseada no Sistema de

Nottingham (SBR modificado), o qual avalia: o grau de formação tubular, o grau de

pleomorfismo nuclear e o índice mitótico. Cada parâmetro recebe uma pontuação que varia

de 1 a 3 (vide itens 4.7.1 3). O somatório dos escores parciais permite o estabelecimento do

“grau histológico final” (vide subtópico 4.7.4) A porcentagem de necrose espontânea foi

estimada após exame de toda a superfície de corte ao microscópio.

4.7.1. Formação ou diferenciação tubular/glandular (acinar)

Percentual de formação tubular Pontuação >75 1

10-75 2

4. Material e métodos

60

4.7.3. Índice mitótico

Foram contadas apenas as figuras de mitose bem definidas (ignorando-se núcleos

hipercromáticos ou picnóticos), em 10 campos de maior aumento (objetiva de 40X) na

periferia do tumor, onde a atividade proliferativa foi mais intensa (hotspots). Dentro dos

hotspots, a seleção do campo foi aleatória:

¡ Os pontos de corte para atribuição de valores de pontuação para o fotomicroscópio

Nikon 50i foram:

▪ 0-8 figuras de mitose= 1 ponto;

▪ 8-11 FM= 2 pontos;

▪ > 11 FM= 3 pontos;

4.7.4. Grau histológico final

Os escores de cada parâmetro foram somados, resultando em um escore final de 3 a 9

pontos. A graduação final foi expressa da seguinte forma para os carcinomas:

1. 3-5 pontos: grau 1, bem diferenciado ou baixo grau

2. 6-7 pontos: grau 2, moderadamente diferenciado ou grau intermediário

3. 8-9 pontos: grau 3, pouco diferenciado ou alto grau.

4.8. Variáveis de análise IHQ

4.8.1. Positividade para receptores hormonais (RE/RP): Método Allred (1990)

Foram quantificadas (1) a distribuição de células positivas e a (2) intensidade de coloração

(vide atribuição de pontuação abaixo); posteriormente, foi realizada a soma dos escores

parciais obtidos, sendo que, valores acima de 3 foram considerados positivos.

4. Material e métodos

61

Distribuição

Proporção de células positivas Pontuação (escore)

1/100 0-1

1/10 2

1/3 3

2/3 4

>2/3 até 1 5

Intensidade

Intensidade Pontuação (escore)

Negativo 0

Fraco 1

Moderado 2

Forte/intenso 3

Fonte: Allred, 1990 (50).

4. Material e métodos

62

4.8.2. Positividade para C-erbB-2

Para avaliar a positividade para C-erbB-2 seguimos as recomendações da ASCO/CAP.

Escore de

positividade Característica Resultado

0 Ausência completa de marcação de membrana citoplasmática negativo

+1 Escassas marcações incompletas e sem continuidade da

membrana negativo

+2 Marcações fortes em menos de 10% das células neoplásicas indeterminado/equívoco

+3 Marcação forte e completa em todo o contorno da membrana

citoplasmática em mais de 10% das células neoplásicas positivo

4.8.3. Critérios para a classificação alternativa em subtipos moleculares baseada no

perfil molecular

Subtipo molecular Perfil de biomarcadores

Luminal A ER+ e/ou PR+

Luminal B

B1

B2

ER+ e/ou PR+,

Ki67>14% ou GHF 2/3

HER2+

HER2 ER- e/ou PR-, HER2+

Triplo negativo/basal símile ER-, PR- e HER2-, e CK14 ou EGFR+

Schnitt SJ, 2010 (50); Consenso de St. Gallen, 2011 (16).

4. Material e métodos

63

4.8.4.Positividade para marcadores de CTNs

Foram contadas as células com pelo menos marcação leve em 5 imagens TIFF obtidas das

lâminas virtuais, em campos aleatórios correspondentes a campos de grande aumento

(objetiva virtual de 40X).

4.9. Análise estatística

Este estudo foi experimental descritivo e exploratório. As comparações entre os grupos

(variáveis quantitativas contínuas) foram realizadas por meio do teste t de Student (para

amostras não pareadas). Na avaliação do grau de correlação entre as variáveis biológicas e

marcadores imunoistoquímicos, e diferentes marcadores de CTNs (marcadores entre si)

foram feitos gráficos de dispersão com curva ajustada e regressão linear com o cálculo do r

de Spearman.

64

5. Resultados

65

Aspectos macroscópicos

Noventa dias após a indução química com o DMBA, todos os animais do grupo

experimental desenvolveram entre 1 a 4 nódulos tumorais, macroscopicamente visíveis, com

diâmetro médio de 2,2 cm (mínimo:0,5 cm; máximo: 3,5 cm). Observou-se bilateralidade e

multicentricidade em 60% e 20% dos animais, respectivamente (Figura 5).

Ao exame macroscópico clínico, as neoplasias mamárias induzidas pelo DMBA neste

protocolo apresentaram evidências de ulceração cutânea (Figura 6) em 30% dos animais. Nem

sempre o fenômeno de ulceração estava associado ao atrito da neoplasia com o solo durante a

deambulação. Na maioria dos casos, erosão/ulceração foram detectadas no primeiro tumor de

cada animal (i.e., na neoplasia de maior velocidade de crescimento). Durante o desenvolvimento

das neoplasias, observou-se em todos os animais algum sinal de síndrome consumptiva (como

por exemplo, consumo de tecido adiposo periférico), por vezes acompanhado de perda do

comportamento de busca ativa de alimentos. Esse quadro foi mais perceptível nos animais com

tumores multicêntricos/ulcerados.

Apesar dos contornos arredondados/ovalados e dos limites precisos (boa delimitação em

relação aos tecidos normais adjacentes), as neoplasias apresentavam-se firmemente aderidas a

esses (i.e., não era possível a enucleação das neoplasias seja durante a remoção necroscópica,

seja durante o exame macroscópico da peça). Não foram observados sinais macroscópicos de

cápsula verdadeira ou pseudocápsula tumoral. Aos cortes, todos os tumores apresentaram

coloração creme/rosada, com áreas necro-hemorrágicas centrais e consistência friável (Figura 7).

Após a realização da necropsia dos animais avaliando cada órgão individualizado, bem

como na análise histológica, não fora detectada nenhuma evidência macro e/ou microscópica de

metástases.

5. Resultados

66

Figura 5. Aspectos macroscópicos das neoplasias induzidas pelo DMBA no D90 da indução:

multicentricidade e bilateralidade (vide círculos).

5. Resultados

67

Figura 6. Aspectos macroscópicos das neoplasias induzidas pelo DMBA no D90 da indução:

ulceração (seta).

5. Resultados

68

Figura 7. Superfície de corte das neoplasias induzidas pelo DMBA no D90 da indução: áreas

necro-hemorrágicas centrais (linha tracejada).

A

5. Resultados

69

Achados histomorfológicos (I): características indicativas de comportamento biológico e

tipos histológicos

Do ponto de vista histológico, todas as neoplasias obtidas com o presente protocolo

apresentaram simultaneamente pelo menos 2 características indicativas de malignidade (segundo

os critérios estabelecidos em “Material e Métodos”). Não foram observadas lesões benignas, seja

de natureza hiperplásica (e.g., adenose esclerosante) ou neoplásica (e.g., fibroadenoma). Em

apenas um único caso, foi detectada lesão precursora/pré-maligna (concomitante a lesão maligna,

perifericamente), classificado com um carcinoma ductal in situ dos tipos sólido e cribriforme,

com necrose, grau nuclear 2 (OMS, 2012) (Figura 8).

Quanto ao tipo histológico, foi observado que 68 % das neoplasias induzidas pelo DMBA

eram compostas por mais de uma variante histológica, sendo denominadas “tumores mistos” (de

acordo com os critérios da OMS, 2012). As neoplasias mistas eram caracterizadas por

combinações variadas dos seguintes tipos histológicos: (1) carcinoma ductal invasivo (CDI) sem

outras especificações, (2) tumor filoide (TF), (3) carcinoma papilífero invasivo (CPAP), (4)

carcinoma mioepitelial (CMIO) e (5) carcinoma lobular (CLI) (Figuras 9-13). As Figuras 14 e 15

representam, respectivamente, a frequência desses subtipos histológicos entre os animais do

grupo experimental (ou seja, em que percentagem dos animais cada um dos tipos histológicos

enumerados esteve presente) e a participação percentual de cada variante na composição da

maior neoplasia (i.e., que fração percentual da neoplasia em questão estava comprometida com

determinado tipo histológico). O subtipo histológico mais frequente na amostra foi o CDI.

Dentro dos tumores mistos, o componente predominante também foi representado por

CDI, com uma contribuição média de 70% do tumor misto principal. Cumpre relatar que a

delimitação entre subtipos histológicos de um mesmo tumor misto era quase sempre difícil (i.e.,

a mistura dos componentes histológicos era bastante intrincada, por vezes incluindo zonas

híbridas ou transicionais) e que, em geral, a composição histológica do tumor principal (maior

neoplasia) não diferia significantemente da composição das neoplasias secundárias. Portanto, o

que se descreve para a formação tumoral principal (tumor maior e mais precoce) vale também

para a carga tumoral total (somatório de todos os tumores induzidos).

5. Resultados

70

Cerca de 32% da amostra era representada por tumores constituídos de apenas um tipo

histológico (i.e., um componente histológico bem definido ocupando mais de 90% da neoplasia

principal), sendo designados de “tumores puros”. Neste estudo, duas formas principais de

tumores puros foram encontradas: (1) uma representada quase exclusivamente por CDI e (2)

constituída por um tumor bifásico, epitelial-estromal (sendo a porção estromal hipercelular,

atípica e por vezes dotada de focos de necrose). Em função das características do componente

estromal e da má delimitação da lesão, este segundo tipo histológico, foi classificado com um

tumor filóide, histologicamente borderline (Figura 10).

A Tabela 8 apresenta de forma sintética as principais características que permitiram o

diagnóstico das neoplasias dentro dos tipos preconizados pela OMS (2012), bem como os

principais achados que distinguem essas neoplasias murinas de seus correspondentes humanos.

5. Resultados

71

Figura 8. Fotomicrografias ilustrativas de focos de carcinoma ductal in situ, grau nuclear 1 (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de

escala= 100μm.

5. Resultados

72

Figura 9. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma ductal invasivo (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm.

5. Resultados

73

Figura 10. Fotomicrografias ilustrativas de tumor filoide (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm..

5. Resultados

74

Figura 11. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma papilífero invasivo (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm.

5. Resultados

75

Figura 12. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma mioepitelial invasivo (a e b); (a): aspectos morfológicos, (b) imunocoloração

anti-CK14. Hematoxilina-eosina (a) e imunoperoxidase (b), barras de escala= 100μm.

5. Resultados

76

Figura 13. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma lobular invasivo (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm.

5. Resultados

77

Figura 14. Frequência dos principais tipos histológicos nesta série de tumores induzidos pelo DMBA.

5. Resultados

78

Figura 15. Contribuição relativa dos principais tipos histológicos constituintes dos tumores mistos em sua composição histológica.

*Outros: tumor filoide, carcinoma mioepitelial e carcinoma lobular.

5. Resultados

79

Tabela 8. Principais características diagnósticas dos tipos histológicos encontrados e principais diferenças em relação ao

correspondente humano.

Tipo histológico Características diagnósticas essenciais Diferenças em relação ao correspondente

humano

Carcinoma ductal invasivo

Estruturas tubuloacinares de aspecto infiltrativo

com atipia citológica variável.

Em áreas, os tumores induzidos pelo DMBA

apresentam justaposição de estruturas tubulares,

resultando em aspecto cribriforme.

Tumor filoide Tumor bifásico, epitelial-estromal, no qual as

principais características atípicas/indicativas de malignidade se concentram no componente

estromal. Estroma hipercelular e mixoide. Aspecto

foliáceo.

Nesta série, foram evidenciados apenas tumores

com características limítrofes de malignidade (tumores borderline). O componente estromal não

apresenta diferenciação heteróloga.

Carcinoma papilífero invasivo Lesões císticas, revestidas internamente por papilas

constituídas por hastes fibrovasculares delgadas e 2

ou mais camadas de células epiteliais atípicas; associadas a componente invasivo papilífero ou do

tipo carcinoma ductal.

-

Carcinoma mioepitelial invasivo Tumor contendo dois componentes principais: um epitelial e um mioepitelial, ambos exibindo

características de malignidade. O componente

mioepitelial como confirmado através da realização de marcadores imunoistoquímicos.

Lesão muito rara na glândula mamária humana (mais frequentemente relatada em glândulas

salivares).

Carcinoma lobular invasivo Neoplasia maligna epitelial constituída por células pequenas, com leve atipia nuclear, exibindo

descoesividade (com células infiltrando de forma

isolada, por vezes, simulando um infiltrado

linfocítico). Presença de infiltração em padrão de fila indiana.

-

5. Resultados

80

Após a caracterização dos tipos histológicos, os carcinomas ductais (puros e os

constituintes de tumores mistos) foram graduados de acordo com sistema Nottingham. O sistema

de Nottingham (também referido como sistema de Bloom-Richardson modificado por Elston-

Ellis) visa definir de forma mais objetiva o grau de semelhança histológica entre a neoplasia e

seu correspondente histológico normal - o tecido mamário normal. Os dados referentes à

graduação histológica dos carcinomas ductais invasivos (CDI) induzidos pelo DMBA

encontram-se resumidos na Tabela 9 e ilustrados na Figura 16. De acordo com essa tabela, nota-

se que a grande maioria dos CDIs (83%) são representados por tumores de grau histológico final

1, isto é, neoplasias de bem diferenciadas ou de baixo grau histológico. Esta constatação associa-

se ao fato de que a maioria dos tumores recebeu pontuação baixa (escore 1-2) nos 3 critérios que

definem a graduação: formação tubular, pleomorfismo nuclear e índice mitótico.Assim, observa-

se que a maioria dos carcinomas apresenta-se constituído em mais de 75% de sua extensão por

estruturas tubulo-acinares (78%), apresenta núcleos com pleomorfismo moderado (61%) e baixo

índice mitótico (72%).

Os tumores ainda apresentaram em média 14% de necrose espontânea, conforme ilustrada

na Figura 17.

5. Resultados

81

Tabela 9. Graduação histológica aplicada às neoplasias mamárias induzidas pelo DMBA: escores

parciais e grau histológico final.

5. Resultados

82

Figura 16. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma ductal invasivo bem diferenciado/grau histológico final 1 (a) e

moderadamente diferenciados/grau histológico final 2 (b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm (a) ou 25 μm (b).

5. Resultados

83

Figura 17. Fotomicrografias ilustrando a variação na extensão da necrose em neoplasias induzidas pelo DMBA: (a) necrose restrita;

(b) necrose extensa. HE, barra de escala= 500 μm.

5. Resultados

84

Marcadores prognósticos/preditivos e subtipagem molecular substitutiva

Em relação aos marcadores prognósticos/preditivos (classsicamente utilizados na rotina

diagóstica humana), foram quantificados os seguintes: (1) receptor de estrógeno (RE), receptor

de progesterona (RP) (ambos quantificados segundo a normatização estabelecida p