Carla Sofia dos Santos Estudos e in vivo em peixes da Ria ... · Carla Sofia dos Santos Ferreira ... Ao Prof. Doutor Mário Pacheco agradeço o facto de ter aceite a co-orientação

Universidade de Aveiro 2007

Departamento de Biologia

Carla Sofia dos Santos Ferreira

Estudos in vitro e in vivo em peixes da Ria de Aveiro

Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Toxicologia e Ecotoxicologia, realizada sob a orientação científica da Professora Doutora Maria Ana Dias Monteiro Santos, Professora Catedrática do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

o júri

presidente Prof. Dr. Fernando José Mendes Gonçalves Professor Associado com Agregação do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

Prof. Dra. Maria Ana Dias Monteiro Santos Professora Catedrática do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

Prof. Dr. Mário Guilherme Garcês Pacheco Professor Auxiliar do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

Doutora Vera Lúcia de Almeida Maria Investigadora Auxiliar do Centro de Investigação Marinha e Ambiental (CIMA) da Universidade do Algarve

agradecimentos

Quero expressar o meu profundo agradecimento à minha orientadora Prof. Dra. Maria Ana Santos, não só pelo seu apoio científico e pessoal, mas principalmente pela sua amizade e companheirismo para com os alunos. O seu incentivo e acompanhamento permanente foram decisivos durante a realização deste trabalho científico. O seu ensinamento foi extremamente gratificante e enriquecedor, uma vez que me permitiu crescer e amadurecer cientificamente. Ao Prof. Doutor Mário Pacheco agradeço o facto de ter aceite a co-orientação da minha tese de Mestrado. Agradeço aos meus colegas de laboratório, nomeadamente ao Mestre Miguel Oliveira e aos Doutores Iqbal Ahmad e Vera Maria, a pronta colaboração, bem como a disponibilidade e apoio dispensados. Ao Mestre Miguel Oliveira quero ainda agradecer em especial, a sua amizade, incentivo e apoio científico, os quais foram extremamente importantes para mim durante a realização deste trabalho. Agradeço aos meus pais e avó tudo o que sou e tenho. Sem eles nada disto seria possível. À minha mãe, em particular, quero agradecer a força que sempre me transmitiu para ir mais além. O seu estímulo e a sua presença sempre foram, são e serão fundamentais para mim. Agradeço ao meu namorado, Ricardo, a sua paciência, compreensão e carinho ao longo deste ano. Sei que não foi fácil mas foi por uma boa razão. O seu apoio e ajuda foram fundamentais para levar a bom porto este objectivo pessoal.

palavras-chave

Contaminantes ambientais, biotransformação, biomarcadores, EROD, anomalias nucleares eritrocíticas, genotoxicidade, hormonas esteróides, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos.

resumo

Dado a importância e complementaridade existente entre estudos de campo e estudos de laboratório, o presente trabalho engloba ambos os tipos de estudo. Os peixes desempenham um papel ecológico bastante relevante ao nível das cadeias tróficas aquáticas, pelo que são frequentemente usados como organismos sentinela em estudos de biomonitorização. Assim, para o presente trabalho, foram adoptadas duas espécies representativas da ictiofauna da Ria de Aveiro: a tainha garrento (Liza aurata) e a enguia europeia (Anguilla anguilla L.). O estudo de campo consistiu na avaliação genotóxica sazonal de uma laguna poluída (Ria de Aveiro), através da detecção de anomalias nucleares eritrocíticas (ANEs) em espécimes juvenis de L. aurata, colhidos em seis locais da Ria. A investigação revelou um local crítico – Vagos – onde foi possível observar elevadas frequências de ANEs na Primavera, no Verão e no Inverno. Neste contexto, o teste de ANEs revelou ser um teste genotóxico relativamente rápido, fácil de executar e sensível. Para a realização da componente laboratorial e in vitro da presente tese, adoptou-se como modelo biológico A. anguilla L., a qual foi injectada intraperitonealmente com β-naftoflavona (4mg/kg). A β-naftoflavona é um composto flavonóide sintético reconhecido como um forte indutor das monooxigenases hepáticas, como por exemplo a etoxiresorufina O-desetilase (EROD). A EROD tem demonstrado ser muito sensível à indução causada por vários contaminantes, pelo que a sua actividade é frequentemente usada como biomarcador in vivo de exposição a poluentes químicos, nomeadamente hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) e compostos estruturalmente semelhantes. Apesar deste efeito causado, ao nível do fígado, pelos HAPs ou por compostos estruturalmente semelhantes, também pode ocorrer inibição sob diversas circunstâncias, tais como a presença de elevadas concentrações de HAPs ou de outros compostos orgânicos ou de metais pesados. Assim, os microsomas hepáticos foram isolados a partir do fígado de A. anguilla L. e posteriormente usados nos estudos in vitro da actividade EROD efectuados, Os HAPs são compostos toxicologicamente relevantes devido à sua dispersão e persistência nos meios aquáticos, bem como ao seu potencial genotóxico. Assim, procedeu-se ao estudo in vitro dos efeitos de dois HAPs -benzo[a]pireno (B[a]P) e fluoranteno (FL) - sobre a actividade EROD microsomal hepática. Uma vez que o sistema endócrino desempenha um papel extremamente relevante nos mecanismos de stress dos peixes, avaliou-se ainda o efeito de duas hormonas esteróides - cortisol (C) e 17β-estradiol (E2) sobre a referida actividade enzimática, isoladamente e em combinação com o B[a]P ou o FL. A concentração adoptada para as duas hormonas esteróides foi de 22.02 nM. O B[a]P revelou ser um forte inibidor in vitro da actividade hepática de EROD. O FL 0.1 e 0.3 µM induziu significativamente a actividade EROD microsomal hepática, enquanto que as concentrações maiselevadas (0.9 e 2.7 µM) levaram a uma forte inibição desta actividade enzimática, contudo inferior à induzida pelas mesmas concentrações de B[a]P. A exposição dos microsomas hepáticos de A. anguilla L. ao C causou uma indução significativa da actividade EROD hepática. A exposição in vitro ao E2

também levou ao aumento desta actividade enzimática.

O C e o E2, exerceram um efeito protector sobre a actividade EROD hepática, uma vez que, na sua presença, verificou-se uma significativa redução dos efeitos inibitórios causados pelo B[a]P e pelo FL 0.9 e 2.7 µM. Os resultados da avaliação in vitro da actividade EROD hepática obtidos, sob as condições em cima referidas, confirmam a importância da estrutura dos HAPs e respectiva concentração molar, assim como das condições fisiológicas do indivíduo, como por exemplo diferentes status hormonais para a indução in vivo da actividade EROD, i. e. em estudos de laboratório e em estudos de campo.

keywords

Environmental contaminants, biotransformation, biomarkers, EROD, erythrocityc nuclear abnormalities, genotoxicity, steroid hormones, polycyclic aromatic hydrocarbons.

abstract

The present research work has been focused on the importance and complementarity of field and laboratory in vivo and in vitro studies. Fish are often used as sentinel organisms in biomonitorization studies because they play a major ecological role in the aquatic food-webs. Thus, two representative species of the Aveiro Lagoon’s ichthyo fauna were adopted in the present work: the gold grey mullet (Liza aurata) and the european eel (Anguilla anguilla L.). The field study consisted in the seasonal genotoxic assessment of a polluted lagoon (Ria de Aveiro), using erythrocytic nuclear abnormalities (ENAs) of L. aurata juvenile specimens, collected at six stations of Ria de Aveiro. The ENAs survey revealed a critical site – Vagos – where an elevated ENA frequency was observed in Spring, Summer and Winter. In this context, the ENA assay revealed to be a relatively rapid, easy to perform and sensitive genotoxicity test. The laboratorial and in vitro component of the present thesis was carried out using A. anguilla L. as a biological model, which was intraperitoneally injected with β-naphthoflavone (4mg/kg). β-naphthoflavone is a synthetic flavonoid compound known as a strong hepatic monooxigenases inducer such as ethoxyresorufin O-deethylase (EROD). Liver EROD activity induction showed to be very sensitive to several contaminants, thus her activity is often used as an in vivo biomarker of exposure to chemical pollutants, namely polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and structural similar compounds. Despite this effect caused by PAHs or PAH like substances upon the liver, inhibition may also occur under different circumstances such as the presence of high PAH concentrations or other organic compounds or heavy metals. Therefore, A. anguilla L. hepatic microsomes were isolated and then used in EROD in vitro activity studies where those PAHs that are toxicologically relevant due to their dispersion and persistence in the aquatic environments were assayed. Thus, the in vitro effects of two PAHs - benzo[a]pyrene (B[a]P) and fluoranthene (FL) - on liver microsomal EROD activity were assessed. Since the endocrine system plays a major role in fish stress mechanisms, the effect of two steroid hormones such as cortisol (C) and 17β-estradiol (E2) - on liver microsomal EROD activity was also studied, individually and in combination with B[a]P or FL. The same concentration (22.02 nM) was adopted for both steroid hormones. B[a]P revealed to be a strong in vitro inhibitor of liver EROD activity. FL 0.1 e 0.3 µM significantly induced liver microsomal EROD activity, whereas the highest concentrations (0.9 e 2.7) µM caused a strong inhibition of the mentioned enzymatic activity, though lower than the inhibition induced by the same B[a]P concentrations. A. anguilla L. liver microsomes in vitro exposure to C significantly induced EROD activity. E2 in vitro exposure also caused an elevation of this enzymatic activity. Both C and E2 exerted a protective effect in liver EROD activity, since a significant reduction of the inhibitory effects caused by B[a]P and FL 0.9 e 2.7 µM, was observed in their presence. The data concerning the assessment of in vitro hepatic EROD activity under the above conditions confirm the importance of PAHs structure and molar concentration as well as the organism’s physiological conditions such as different hormonal status for EROD activity in vivo induction i.e. either laboratory or field surveys.

ÍNDICE

CAPÍTULO I – Introdução geral ……………………………………………….

1. Poluição aquática........................................................................................

1.1. Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos......................................

2. Biomarcadores............................................................................................

2.1. Organismos sentinela e biomarcadores de peixes......................

3. Respostas biológicas a poluentes..............................................................

3.1. Biotransformação……………………………………………………...

3.2. Etoxiresorufina O-desetilase.........................................................

3.3. Sistema endócrino…………………………………………………….

4. Avaliação da genotoxicidade......................................................................

5. Orientações e objectivos da tese…………………………………………….

6. Referências bibliográficas……………………………………………………...

CAPÍTULO II – Avaliação genotóxica sazonal de uma laguna poluída

(Ria de Aveiro, Portugal) através do estudo das anomalias nucleares

eritrocíticas de Liza aurata.............................................................................

CAPÍTULO III – Estudo in vitro do efeito do benzo[a]pireno, cortisol e

17ß-estradiol sobre a actividade microsomal hepática de EROD de

Anguilla anguilla L..........................................................................................

CAPÍTULO IV – Estudo in vitro do efeito do fluoranteno, cortisol e 17ß-

estradiol sobre a actividade EROD microsomal hepática, em Anguilla

anguilla L.. ………………………………………………………………………….

CAPÍTULO V – Discussão geral…………………………………………………

1. Avaliação genotóxica da Ria de Aveiro ……………………………………..

2. Efeitos in vitro de HAPs e esteróides, isoladamente ou em conjunto ….

2.1. Exposição in vitro ao benzo[a]pireno e ao fluoranteno…………

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2.2. Exposição in vitro ao cortisol e 17β-estradiol……………………

2.3. Exposição in vitro ao benzo[a]pireno e ao fluoranteno em

combinação com o cortisol ou 17β-estradiol…………………………………..

3. Considerações finais e perspectivas futuras.............................................

4. Referências bibliográficas..........................................................................

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CAPÍTULO I

Introdução geral

Introdução geral

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1. POLUIÇÃO AQUÁTICA

A libertação acidental e/ou deliberada de efluentes, contendo compostos

químicos nocivos para o meio ambiente, potencia distúrbios na estrutura e no

funcionamento dos ecossistemas (Cavas e Ergene-Gözükara, 2005a). Desde o

início dos anos 60 que a humanidade tem vindo a tomar consciência dos

potenciais efeitos adversos a longo prazo destes compostos e do seu potencial

risco para os ecossistemas aquáticos e terrestres (Van der Oost et al., 2003).

As indústrias erguem-se nas margens dos cursos de água, atraídas pela água

necessária aos processos industriais, descarregando frequentemente os

diversos tipos de efluentes directamente na massa de água (rios, lagos),

através da canalização dos esgotos. O desenvolvimento da tecnologia

industrial tem originado fontes de descarga industrial mais complexas, levando

a que a água usada nesses processos também apresente uma maior e mais

complexa toxicidade (Cavas e Ergene-Gözükara, 2005a). As cidades, também

por se localizarem nas margens dos cursos de água, resolvem o problema dos

resíduos por despejo simples dos esgotos nos rios, na maior parte dos casos,

sem qualquer tipo de tratamento prévio. Uma vez que o ambiente aquático é o

último receptor dos poluentes contidos nos efluentes industriais, a sua

acumulação e persistência neste ambiente constitui uma ameaça à vida

(Fleeger et al., 2003). Assim, existe a necessidade de se proceder a uma

avaliação efectiva do risco ecológico associado. A avaliação do risco ecológico

ou ambiental é definida como sendo o procedimento através do qual os efeitos

adversos prováveis ou reais dos poluentes e de outras actividades

antropogénicas, são estimados através de métodos científicos nos

ecossistemas e nos seus constituintes, com um certo grau de certeza

(Depledge e Fossi, 1994). A avaliação do risco ecológico apresenta várias

características vantajosas no que diz respeito a tomadas de decisão no

contexto ambiental, fornecendo uma base quantitativa para a comparação e o

estabelecimento de prioridades ao nível dos riscos existentes, assim como

formas sistemáticas de melhorar a compreensão e conhecimento dos riscos,

permitindo também estimar, de forma clara e consistente, quais os valores

ambientais a proteger (Suter, 1993).

Capítulo I

11

A Ria de Aveiro é um sistema lagunar costeiro que se encontra

permanentemente ligado ao mar, localizada no noroeste de Portugal, rodeada

de vários agregados urbanos e unidades industriais (Pacheco et al., 2005).

Este sistema lagunar tem sido, ao longo de vários anos, o principal receptor de

descargas antropogénicas, resultantes da actividade industrial, bem como de

efluentes domésticos e municipais que nem sempre são sujeitos a tratamento

nas estações de águas residuais, o que leva ao aumento dos níveis de

contaminação orgânica e inorgânica. A intensa actividade portuária também

tem contribuído para o aumento da poluição, uma vez que produtos

resultantes desta actividade, tal como restos de combustíveis e tintas usadas

para pintar pequenas embarcações e barcos de grande porte, acabam

frequentemente nas águas da ria. Atendendo aos factos anteriormente

referidos e à persistência de alguns contaminantes, existem algumas zonas

críticas onde é imperativo um programa efectivo de biomonitorização (Pacheco

et al., 2005). A presença destes compostos na água pode interferir com os

sistemas biológicos aí existentes. A absorção desses contaminantes pode

ocorrer a partir do sedimento, da coluna de água e/ou da fonte de alimento.

No entanto, as principais vias de absorção irão depender da dieta de cada

organismo em particular e da sua ecologia (Van Veld, 1990; Livingstone,

1998). Sendo virtualmente impossível monitorizar todos os contaminantes de

origem antropogénica e natural que constituem uma potencial ameaça à

qualidade ambiental, tem sido usada uma abordagem promissora que consiste

no uso de biomarcadores para se efectuar a avaliação do estado de saúde dos

organismos e para se obter sinais antecipados de aviso da existência de riscos

ambientais (Van der Oost et al., 2003). Neste contexto, os peixes são

frequentemente usados como organismos sentinela uma vez que intervêm a

vários níveis na cadeia trófica, acumulando substâncias tóxicas e respondendo

a baixas concentrações de mutagénicos (Cavas e Ergene-Gözükara, 2005). A

diversidade de espécies de peixes existente, aliada ao facto de ocuparem

diferentes tipos de habitats, torna-os particularmente úteis em estudos de

ecotoxicologia, permitindo avaliar os efeitos de vários tipos de contaminantes

sob variadas condições de exposição.

Introdução geral

12

1.1. Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são um grupo de

compostos ubíquos no meio ambiente, tanto sob a forma de produtos naturais

(como resultado, por exemplo, da actividade vulcânica) bem como

contaminantes ambientais (Oliveira et al., 2007) e que possuem, no mínimo,

dois anéis aromáticos fundidos (Menzie et al., 1992). Estes compostos

ocorrem na maioria das substâncias petrolíferas encontrando-se fortemente

dispersos nos ambientes aquáticos, principalmente como resultado de

descargas petroquímicas, derrames acidentais, resíduos domésticos (Connell,

1974), assim como da actividade portuária (Pacheco e Santos, 1997). Eisler

afirmou em 1987 que a nível mundial entravam anualmente no meio aquático,

cerca de duzentas e trinta mil toneladas de HAPs (Eisler, 1987). Desde então

tem-se assistido a um crescente aumento da industrialização e urbanização,

pelo que é expectável que estes valores tenham sofrido alterações no sentido

de um aumento significativo. A contaminação por este tipo de compostos

constitui uma preocupação generalizada devido à sua forte capacidade de

bioconcentração (Connell, 1990), à sua persistência no ambiente, potencial

mutagénico e cancerígeno anteriormente demonstrado em peixes (Gravato e

Santos, 2002; Pacheco e Santos, 2002; Maria et al., 2002; Busetti et al.,

2006). A relativa insolubilidade dos HAPs na água e a sua forte capacidade de

adsorção a partículas faz com que se acumulem facilmente nos sedimentos

(Seruto et al., 2005). Por outro lado a sua lipofilicidade faz com que

atravessem facilmente as membranas biológicas, podendo bioacumular-se em

diferentes tecidos (Billiard et al., 2002). Os organismos aquáticos,

nomeadamente peixes, que vivem em ambientes contaminados por HAPs

podem, por isso, absorver estes compostos, sobretudo através da água que

entra pela boca e atravessa as guelras, assim como pela ingestão de

sedimentos ou comida contaminados (Varasani et al., 1989). Contudo, a

concentração de HAPs nos tecidos dos peixes, pode ser significativamente

reduzida através do metabolismo e excreção (Billiard et al., 2002).

Capítulo I

13

Figura 1 – Representação da estrutura molecular de alguns HAPs. O composto

sublinhado é carcinogénico (modificado de Fent e Bätscher, 2000).

2. BIOMARCADORES

Os efeitos adversos nas populações resultantes da exposição a

contaminantes são frequentemente difíceis de detectar, uma vez que muitos

destes efeitos tendem a manifestar-se apenas a longo prazo (Van der Oost et

al., 2003). Quando o efeito adverso se torna finalmente visível, o processo

destrutivo pode já ter ido além do ponto onde ainda era possível reverter o

processo anteriormente mencionado, através de acções remediadoras ou

redução do risco (Van der Oost et al., 2003) (figura 2). Este tipo de cenário

levou a investigação a estabelecer sinais antecipados de aviso ou

biomarcadores, que reflectissem as respostas biológicas adversas perante a

existência de contaminação ambiental (Bucheli e Fent, 1995). Os

biomarcadores representam mudanças nos sistemas biológicos induzidas por

contaminantes, podendo servir como ligação entre a existência de

contaminação ambiental (causa) e os seus efeitos, fornecendo deste modo,

informação relevante sobre a saúde do ecossistema (Pacheco et al., 2005).

Naftaleno

Fenantreno

Fluoranteno

Benzo[a]pireno

Benzeno

Fluoreno

Pireno

Criseno

Antraceno

Introdução geral

14

Figura 2 – Representação esquemática da ordem sequencial de respostas de

um sistema biológico ao stress causado por exposição a um poluente (Adaptado de

Van der Oost et al., 2003 e modificado de Bayne et al., 1985).

As respostas dos biomarcadores são de extrema importância e utilidade

porque integram uma larga variedade de factores ambientais, toxicológicos e

ecológicos que controlam e modulam a exposição a xenobióticos e seus

efeitos, podendo mesmo ser idênticas numa larga variedade de organismos

(Van der Oost et al., 2003). Assim, os biomarcadores podem fornecer

informação sobre os efeitos biológicos dos poluentes para além da mera

quantificação dos seus níveis no ambiente (Van der Oost et al., 2003). Van

Gestel e Van Brummelen (1994) redefiniram os termos “biomarcador” e

“bioindicador” associando-os a diferentes níveis de organização biológica.

Nesta perspectiva, um biomarcador pode ser definido como qualquer resposta

biológica a um composto ambiental ao nível sub-individual, medida dentro do

organismo ou nos seus produtos (urina, fezes, pêlo, penas, etc.), indicando

um desvio do estado normal que não pode ser detectado no organismo como

um todo. Um bioindicador é definido como sendo um organismo que fornece

informação sobre as condições ambientais do seu habitat, através da sua

Capítulo I

15

presença ou ausência ou através do seu comportamento. Efeitos nos níveis

hierárquicos mais elevados são sempre precedidos por mudanças prévias nos

processos biológicos, pelo que, foi reconhecido que a resposta bioquímica

dever-se-ia tornar no primeiro aviso, sendo sinónimo da capacidade

integrativa dos seres vivos de responder a mudanças físicas e químicas da

qualidade do ambiente (Bayne et al., 1985). No contexto ambiental, os

biomarcadores apresentam-se como uma ferramenta promissora, já que são

indicadores sensíveis, demonstrando que os tóxicos que entram nos

organismos, se distribuem pelos tecidos e induzem efeitos tóxicos em alvos

críticos (McCarthy e Shugart, 1990).

Normalmente, uma situação de stress causada por exposição a

poluentes despoleta uma cascata de respostas biológicas, cada uma das quais,

em teoria, serve como biomarcador (McCarthy et al., 1991). A aplicação ou

interpretação imprópria das respostas de biomarcadores pode, contudo, levar

a falsas conclusões acerca do stress causado pelos poluentes ou contaminação

ambiental. Determinadas respostas estabelecidas para uma espécie não são

necessariamente válidas para outra espécie (Van der Oost et al., 2003). A

aplicação de biomarcadores em ambos os estudos de laboratório e de campo,

pode fornecer uma importante ligação entre a toxicidade observada no

laboratório e a avaliação no campo (Van der Oost et al., 2003).

De acordo com o Conselho Nacional de Investigação (NRC, 1987) e com

a Organização Mundial de Saúde (WHO, 1993), os biomarcadores podem ser

subdivididos em três classes:

- biomarcadores de exposição: englobam a detecção e quantificação de

uma substância exógena, ou do seu metabolito, ou o produto da interacção

entre um agente xenobiótico e uma determinada molécula ou célula alvo, que

é medida dentro do organismo;

- biomarcadores de efeito: incluem alterações bioquímicas, fisiológicas

ou outro tipo de alterações mensuráveis ao nível dos tecidos ou fluidos

corporais de um organismo que pode ser reconhecido como estando associado

com uma possível ou já estabelecida doença ou alteração do estado de saúde;

- biomarcadores de susceptibilidade: indicam a capacidade inerente ou

adquirida de um organismo responder ao desafio da exposição a uma

Introdução geral

16

substância xenobiótica específica, incluindo factores genéticos e alterações em

receptores que alteram a susceptibilidade de um organismo a essa exposição

(Van der Oost et al., 2003).

Com o propósito de avaliar, de forma objectiva a fiabilidade dos

biomarcadores de peixes, foi proposto por Van der Oost et al. (2003), com

base nos critérios formulados por Stegeman et al. (1992), seis critérios que

compreendem a informação mais importante que deve estar disponível ou que

tem de ser estabelecida para cada candidato a biomarcador:

1 - O ensaio usado para quantificar o biomarcador deve ser fiável (com

certificação de qualidade), relativamente barato e fácil de efectuar;

2 - A resposta do biomarcador deve ser sensível à exposição a

poluentes e/ou aos seus efeitos, de forma a poder ser usada como uma

informação antecipada;

3 - A actividade basal do biomarcador deve ser bem definida de forma a

se poder distinguir entre variabilidade natural (ruído de fundo) e o stress

induzido pela exposição a contaminantes (sinal);

4 - O impacto de factores que possam interferir com a resposta do

biomarcador devem ser bem estabelecidos;

5 - O mecanismo subjacente às relações existentes entre a resposta do

biomarcador e a exposição a poluentes (dosagem e tempo) devem igualmente

ser estabelecidas;

6 - A significância ecológica do biomarcador, isto é, as relações entre a

sua resposta e o impacto (a longo prazo) para o organismo, devem ser

estabelecidas.

Além destes critérios tem também sido sugerido que os biomarcadores

devem, preferencialmente, ser não-invasivos ou não destrutivos, de forma a

permitir ou a facilitar a monitorização ambiental dos efeitos de poluentes em

espécies protegidas ou em perigo de extinção (Fossi e Marsili, 1997).

Uma implementação bem sucedida dos biomarcadores em programas de

monitorização ambiental requer, portanto, uma boa compreensão dos

mecanismos subjacentes às respostas dos mesmos. Um dos maiores desafios

do desenvolvimento e aplicação dos biomarcadores, no que diz respeito à

Capítulo I

17

avaliação do risco ecológico, é definir a significância das respostas dos

biomarcadores em termos de efeitos ecológicos dos poluentes (Suter, 1990).

2.1. Organismos sentinela e biomarcadores de peixes

O uso de organismos sentinela para a monitorização biológica pode

constituir uma abordagem sensível na estimativa dos efeitos potenciais dos

poluentes (Cavas et al., 2005b). Os peixes podem ser, virtualmente,

encontrados em qualquer lado no ambiente aquático e desempenham um

papel ecológico bastante relevante ao nível das cadeias alimentares devido à

sua função de transportadores de energia dos níveis tróficos mais baixos para

os mais elevados (Beyer, 1996). O conhecimento da via de entrada do tóxico,

assim como do comportamento e respostas dos peixes, pode ter uma elevada

relevância ecológica. Os biomarcadores que têm sido mais extensivamente

estudados são as enzimas envolvidas na desintoxicação dos xenobióticos e

seus metabolitos (enzimas envolvidas na biotransformação) (Van der Oost et

al., 2003). Vários parâmetros bioquímicos têm sido testados, nos peixes, no

que diz respeito às suas respostas a substâncias tóxicas e à sua potencial

utilização como biomarcadores de exposição ou efeito. A maior parte dos

critérios gerais de biomarcadores parecem ser directamente aplicáveis a

determinados biomarcadores de peixes (Stegeman et al., 1992). Apesar das

suas limitações, como por exemplo o facto de terem uma mobilidade

relativamente elevada, os peixes são, geralmente, considerados os

organismos mais adequados para monitorizar a poluição nos sistemas

aquáticos (Van der Oost et al., 2003). Portanto, o uso de biomarcadores de

peixes como indicadores dos efeitos causados pela poluição, é de crescente

importância, podendo permitir a detecção antecipada de problemas nos

ecossistemas aquáticos (Van der Oost et al., 2003).

Teoricamente, a espécie ideal de peixe a ser usada na avaliação da

toxicidade de um determinado tipo de poluente deve obedecer aos seguintes

critérios: (1) disperso por diferentes ecossistemas, cosmopolita se possível, de

forma a poder ser usada em estudos in situ; (2) suficientemente sensível na

detecção da genotoxicidade de uma larga variedade de poluentes em doses

baixas; (3) adequada para condições de cultura de forma a se poder efectuar

Introdução geral

18

experiências laboratoriais (in vitro) (4) a sua abundância na natureza e a

existência de populações numerosas de forma a permitir a captura de

indivíduos sem que isso ponha em risco a sua conservação (Sanchez-Galan et

al., 1999).

3. RESPOSTAS BIOLÓGICAS A POLUENTES

3.1. Biotransformação

Vários xenobióticos são encontrados em ambientes aquáticos

antropogenicamente alterados, encontrando-se frequentemente disponíveis a

serem absorvidos pelos organismos aquáticos. Uma das questões mais

importantes da toxicologia aquática é a capacidade de prever a velocidade e a

extensão dessa absorção pelos organismos, bem como o destino e os efeitos

dos compostos absorvidos (James et al., 1994).

Várias vias de exposição são possíveis. Os compostos dissolvidos ou

suspensos na água podem entrar através das guelras, da pele ou do sistema

gastrointestinal. Os compostos presentes no sedimento podem ser absorvidos

por contacto directo com a derme e por ingestão, enquanto que os compostos

presentes nas plantas e em organismos pertencentes a baixos níveis tróficos,

podem ser ingeridos e absorvidos através do sistema gastrointestinal. A

importância relativa de cada via de entrada varia com as propriedades

químicas intrínsecas de cada xenobiótico e também com a possibilidade de o

composto em questão ser degradado no ambiente aquático ou

biotransformado por organismos de baixos níveis tróficos (James et al., 1994).

Os xenobióticos parecem ser mais rapidamente absorvidos pelos

organismos quando presentes na água. Este facto é, em grande parte, devido

às propriedades da água como solvente universal. Contudo, compostos que

são virtualmente insolúveis em água, são frequentemente “solúveis” na

matéria orgânica suspensa na coluna de água (James et al., 1994). As

propriedades físico-químicas do xenobiótico, como por exemplo lipofilicidade,

hidrofilicidade, presença de grupos acídicos ou básicos e o seu pKa, assim

como o tamanho da molécula, influenciarão separada e conjuntamente, o

processo de absorção dos compostos ao nível do sistema gastrointestinal. Uma

Capítulo I

19

vez que a difusão passiva é o processo mais comum e importante através do

qual estes compostos entram nos organismos, a solubilidade do xenobiótico

em água e nos lípidos é de grande importância (James et al., 1994).

Contudo, os organismos têm duas grandes formas de eliminar um

composto: ou é excretado na sua forma original ou é biotransformado pelo

organismo. A biotransformação leva, geralmente, à formação de um composto

mais hidrofílico, mais facilmente excretável que o composto original

(Vermeulen, 1996). O fígado é o órgão que mais activamente se encontra

envolvido na biotransformação de compostos estranhos ao organismo, devido

à sua função, posição e circulação sanguínea (Van der Oost et al., 2003). No

entanto, existem outros órgãos com capacidade biotransformadora, tais como

o rim, as guelras e o intestino, embora com menor capacidade que a do

fígado. A biotransformação também pode alterar a toxicidade de um

composto, o que pode ser benéfico ou prejudicial para o organismo (Van der

Oost et al., 2003). Caso haja uma reacção de desintoxicação, a toxicidade do

composto é reduzida enquanto a excreção é geralmente elevada (Van der Oost

et al., 2003). No caso de haver bioactivação o composto é, contudo,

transformado num metabolito reactivo que é mais tóxico que o composto

original (Van der Oost et al., 2003). Os efeitos tóxicos podem-se manifestar

quando o composto original ou os seus metabolitos se ligam a macromoléculas

celulares, o que pode, em última instância, levar à ruptura membranar, lesão

celular e/ou efeitos genotóxicos que, por sua vez, podem levar ao

desenvolvimento e progressão de doenças (por exemplo cancro) (Van der

Oost et al., 2003) (figura 3).

Introdução geral

20

Metabolito tóxico

(reactivo)

XENOBIÓTICO

Ligação a moléculas celulares

Metabolito estável

Metabolito estável

Efeito Tóxico

(lesão celular, ruptura

membranar, cancro)

Excreção

1 2 3 4

5 6

A B C

Figura 3 – Possíveis vias de desintoxicação e activação dos xenobióticos: (1)

efeito tóxico directo (A); (2) activação metabólica; (3) formação de um metabolito

estável passível de causar efeito tóxico (C); (4) desintoxicação. O metabolito reactivo

formado por bioactivação (2) pode causar efeito tóxico (B) através da reacção com

alvos críticos (5) ou ser eliminado através da reacção com um agente protector (6)

(Adaptado de Van der Oost et al., 2003).

A biotransformação é, portanto, determinante no que respeita à

actividade de um determinado composto, duração dessa mesma actividade,

envolvendo, frequentemente, enzimas com um elevado grau de especificidade

por um determinado substrato. A biotransformação dos xenobióticos no fígado

pode levar, como já foi referido, à desintoxicação ou bioactivação dos

mesmos, podendo-se subdividir este processo em três fases: Fase I, Fase II e

Fase III. A fase I consiste numa alteração não sintética (oxidação, redução, ou

hidrólise) da molécula original, que pode ser subsequentemente conjugada na

fase II e catabolizada na Fase III (Commandeur et al., 1995).

Capítulo I

21

Geralmente, os biomarcadores mais sensíveis de efeito são alterações

nos níveis e na actividade de enzimas envolvidas no processo de

biotransformação. Contudo, a actividade destas enzimas pode ser induzida ou

inibida em peixes, após exposição a xenobióticos (Bucheli e Fent, 1995). A

indução enzimática consiste num aumento da actividade das enzimas em

questão, enquanto que em caso de inibição, a actividade enzimática é

bloqueada, possivelmente devido a forte ligação ou formação de um complexo

entre a enzima e os inibidores. Duas grandes classes de enzimas estão

envolvidas na biotransformação de xenobióticos: as enzimas da fase I e as

enzimas e cofactores da fase II (Van der Oost et al., 2003). No que respeita, à

grande maioria dos compostos xenobióticos, as reacções da fase I são

catalizadas por monooxigenases (MO), existentes ao nível dos microsomas,

também designadas por oxidases multi-funções (MFOs), como por exemplo as

monooxigenases associadas ao complexo citocromo P450. Os citocromos P450

são proteínas membranares que estão, predominantemente, localizadas no

retículo endoplasmático do fígado, e que compreendem uma vasta, e ainda em

expansão, família de proteínas heme (Stegeman et al., 1992; Bucheli e Fent,

1995), as quais foram também encontradas noutros organelos e tecidos de

peixes mas em menor quantidade (Celander, 1993). A maioria das enzimas da

fase II catalizam reacções sintéticas de conjugação, facilitando, portanto, a

excreção dos compostos através da adição de grupos mais polares, podendo,

por isso, desempenhar um importante papel não só na manutenção da

homeostasia como também na desintoxicação e eliminação de muitos

compostos (Commandeur et al., 1995; Van der Oost et al., 2003). As reacções

catalisadas pelas MFOs resultam na inserção ou adição de um átomo de

oxigénio numa molécula substrato. Assim, a hidrossolubilidade e/ou

capacidade de conjugação da molécula substrato aumenta, o que facilita a sua

excreção (Masfaraud et al., 1990). Assim, a característica mais importante do

sistema MFO é a sua capacidade de facilitar a excreção de certos compostos,

na fase I de biotransformação, transformando compostos lipofilicos em

compostos mais hidrofílicos (Bucheli e Fent, 1995). Uma vez que o sistema

MFO é sensível a determinados poluentes ambientais, a sua actividade pode

Introdução geral

22

ser usada na monitorização biológica na exposição a determinadas classes de

xenobióticos (Bucheli e Fent, 1995).

3.2. Etoxiresorufina O-desetilase (EROD)

A etoxiresorufina O-desetilase (EROD) é uma MFO que tem

demonstrado ser muito sensível à indução causada por vários compostos

químicos, nomeadamente hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs).

Assim, a avaliação da actividade da EROD em peixes tem sido fortemente

usada como um biomarcador in vivo de exposição a HAPs, como por exemplo

o benzo[a]pireno (B[a]P), e a compostos estruturalmente semelhantes tal

como a ß-naftoflavona (BNF) (Buchelli e Fent, 1995). O mecanismo de indução

de CYP1A por alguns HAPs, parece estar relacionado com a sua capacidade em

se ligar ao receptor citosólico hidrocarboneto arilo (RAh) e activar a

transcrição do gene que codifica para CYP1A, iniciando-se assim a sua síntese.

Os HAPs são facilmente metabolizados pelas enzimas da fase I da

biotransformação (MFOs) em produtos mais hidrofílicos. Peixes apanhados em

águas predominantemente contaminadas por compostos orgânicos,

nomeadamente HAPs, ou por misturas complexas (Kosmala et al., 1998)

apresentam indução da actividade da EROD ao nível hepático (Pacheco et al.,

2005). A utilização da EROD como biomarcador aumentou nos últimos anos

devido, essencialmente à optimização de protocolos para a medição da sua

actividade catalítica de uma forma rápida e relativamente pouco dispendiosa

(Burke e Mayer, 1974). A actividade da EROD é medida através da

monitorização do aumento de fluorescência como consequência da formação

do produto da reacção – resorufina (Burke e Mayer, 1974).

Em várias espécies de peixe, os níveis de proteína de CYP1A no fígado

demonstraram ser um biomarcador muito sensível à exposição a HAPs, o que

certamente se enquadra nos procedimentos necessários a uma correcta

avaliação do risco ecológico (Van der Oost et al., 2003). A avaliação de CYP1A

pode ser usada em várias fases do processo de avaliação do risco ecológico,

nomeadamente, ao nível da quantificação do impacto e exposição a vários

poluentes orgânicos, monitorização ambiental da “sáude” dos organismos e

dos ecossistemas, identificação de efeitos tóxicos primários subtis,

Capítulo I

23

investigação dos mecanismos de toxicidade dos xenobióticos e identificação da

exposição a compostos específicos (Stegeman et al., 1992).

3.3. Sistema endócrino

O sistema endócrino desempenha um papel extremamente relevante

nos mecanismos de stress dos peixes, pelo que, alterações em funções

hormonais específicas e consequentes efeitos bioquímicos podem constituir

importantes biomarcadores de stress (Pacheco e Santos, 2001a), sendo ainda

particularmente importante devido à sua função crucial de manter a

homeostasia dos peixes. Neste contexto, o cortisol desempenha um papel

extremamente relevante, como produto final do eixo hipotálamo-pituitária-

tecido interrenal (HPI), em resposta a diferentes agentes causadores de

stress. O papel do cortisol no metabolismo intermediário é vital, mobilizando

reservas, como por exemplo aminoácidos, e convertendo-as em glucose e

lípidos, exercendo, portanto, efeitos directos e indirectos no referido

metabolismo (Teles et al., 2004a). Os níveis de cortisol no plasma são o

indicador de stress mais vulgarmente usado nos peixes. O aumento da

concentração de cortisol no plasma de peixes foi demonstrado após exposições

de curto prazo a uma vasta gama de contaminantes, desde metais pesados

(De Boeck et al., 2003), ácidos resínicos (Teles et al., 2003), HAPs (Pacheco e

Santos, 2001a) e pesticidas (Waring e Moore, 2004), até hormonas “naturais”

como o 17β-estradiol (E2) (Pottinger et al., 1996). A própria manipulação dos

animais, condicionamento dos mesmos, bem como a fraca qualidade da água,

também constituem factores de stress, podendo igualmente provocar uma

rápida elevação do cortisol plasmático. (Wendelaar-Bonga, 1997).

Vários estudos, maioritariamente in vivo, têm procedido à avaliação dos

níveis de cortisol plasmático em diferentes espécies de peixes, tais como

Anguilla anguilla L. (Pacheco e Santos, 2001a e 2001b; Teles et al., 2003,

2004b), Sparus aurata L. (Teles et al., 2005), Liza aurata (Oliveira et al.,

2007) e Dicentrarchus labrax L. (Teles et al., 2004a), sob diversas condições

ambientais. Todos eles demonstraram a inquestionável relevância do cortisol

como indicador biológico de stress nos peixes.

Introdução geral

24

De acordo com Hontela et al. (1997), peixes colhidos em locais poluídos

revelaram incapacidade de aumentar os seus níveis plasmáticos de cortisol

como consequência de stress agudo e longa exposição a poluentes.

Níveis reduzidos de esteróides sexuais, assim como uma performance

sexual diminuída foram igualmente observados em peixes provenientes de

áreas nos Grandes Lagos, afectadas pelo impacto dos efluentes da pasta de

papel (Hontela et al., 1997). As hormonas esteróides sexuais são produzidas

em grande quantidade nas gónadas, embora a sua síntese também ocorra no

córtex adrenal. Essas hormonas são produzidas a partir do colesterol, que

numa primeira fase é convertido em progesterona, a qual é em seguida

transformada em androgénios. Estes últimos são então convertidos em

estrogénios, dos quais o E2 é o mais potente, desempenhando um importante

papel em vários aspectos do crescimento, desenvolvimento e diferenciação

morfológica, assim como no desenvolvimento e regulação dos

comportamentos e ciclos reprodutivos e sexuais de ambos sexos (Randall et

al., 2001). Os efeitos do E2 nos peixes têm sido relatados sobretudo no que diz

respeito a aspectos endócrinos, nomeadamente sobre os seus efeitos na

reprodução. Contudo, há evidências recentes de que o E2 também pode

exercer disrupção sobre eventos endócrinos não-reprodutivos, nomeadamente

sobre respostas associadas ao stress, medidas através dos níveis plasmáticos

de cortisol (Hontela, 1997, Teles et al., 2005).

A detecção relativamente recente de concentrações significativas de E2

em efluentes domésticos, aliado à sua capacidade de causar alterações

endócrinas nos organismos, levou a que fosse considerado como contaminante

ambiental, e revelou a necessidade de uma avaliação efectiva da toxicidade

deste estrogénio natural como potencial contaminante do meio aquático

(Kramer et al., 1998). Assim, durante as últimas décadas tem-se verificado

um aumento significativo das concentrações de E2 no meio aquático,

principalmente em zonas urbanas, sendo os seus níveis na água na ordem das

ng/L, podendo atingir 200 ng/L (Bowman et al., 2000). Teles et al. (2007)

num estudo de campo in situ realizado numa lagoa de água doce (Pateira de

Fermentelos) sujeita a vários tipos de contaminantes antropogénicos,

relataram elevados níveis de E2 (na ordem das 150/180 ng/L) em dois dos

Capítulo I

25

cinco locais de exposição seleccionados para o referido estudo. Os elevados

níveis de E2 foram coincidentes com a medição de níveis elevados de nitritos,

os quais constituem um indício da existência de decomposição parcial de

matéria orgânica resultante de descargas antropogénicas.

Ao contrário das enzimas envolvidas no processo de biotransformação,

cuja resposta à exposição a xenobióticos orgânicos é bem conhecida, a ligação

entre este tipo de resposta e outras funções biológicas, nomeadamente a

regulação endócrina, é ainda um desafio para a toxicologia ambiental (Teles et

al., 2005).

4. AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE

A indução do CYP1A em peixes, associada com a existência de danos ao

nível do ADN, tem vindo a ser considerada como uma abordagem sensível e

adequada na avaliação da genotoxicidade causada por exposição a poluentes

(Maria et al., 2002).

Os intermediários reactivos dos HAPs têm potencial para, ao nível

celular, interagir com qualquer local nucleofílico, incluindo os que existem nas

proteínas e no DNA, induzindo lesões genéticas (Stegeman e Lech, 1991). O

estudo de danos no DNA, ao nível do cromossoma, é uma parte essencial da

toxicologia genética, uma vez que a mutação é um evento importante no

processo cancerígeno (Fenech, 2000). A constatação de que danos ao nível do

cromossoma podem ser causados por exposição a radiação ionizante ou

químicos carcinogénicos esteve entre as primeiras evidências plausíveis das

alterações relevantes que determinados agentes físicos e químicos podem

causar ao nível do material genético, em células eucarióticas (Evans, 1977).

Em 1970, Miller estabeleceu a relação entre a alteração do material genético e

a cancerogénese, defendendo a necessidade do desenvolvimento de um teste

que possibilitasse obter resultados a curto prazo, que servisse como um

indicador simples na avaliação do risco de cancro. Neste contexto, testes

genotóxicos como a detecção de anomalias nucleares em eritrócitos aliados ao

estudo das enzimas envolvidas na biotransformação, quando feitos em

espécimes juvenis, merecem especial atenção de um ponto de vista

Introdução geral

26

ecotoxicológico (Pacheco et al., 1997; Gravato e Santos, 2003). A prova que

compostos provenientes da actividade industrial podem induzir efeitos

genotóxicos, vem reforçar a urgente necessidade de se efectuar testes

sensíveis de forma a proceder à avaliação do potencial genotóxico destes

mesmos compostos (Kohlpoth et al., 1999).

Os micronúcleos são massas citoplasmáticas de cromatina com a

aparência de pequenos núcleos que têm origem em fragmentos de

cromossomas ou até em cromossomas inteiros que não são sujeitos à fase

anafásica da divisão celular. A presença de micronúcleos em células é reflexo

de aberrações (estruturais ou numéricas) cromossómicas que emergem

durante a mitose (Fenech et al., 1999). Nos últimos anos, vários estudos têm

descrito a presença de anomalias nucleares, para além dos micronúcleos, em

células de peixes expostos a substâncias genotóxicas (Cavas e Ergene-

Gözükara, 2003). Em geral, estas anomalias são consideradas indicadores de

danos genotóxicos e, como tal, podem complementar as contagens de

micronúcleos em estudos de genotoxicidade (Cavas e Ergene-Gözükara,

2005a). O teste de anomalias nucleares eritrocíticas, baseado na detecção de

micronúcleos e outras anomalias nucleares, é visto como sendo um teste

sensível, simples, rápido, de baixo custo, aplicado com sucesso em diferentes

espécies de peixes, tais como Anguilla anguilla (Pacheco e Santos, 1997,

1998, 1999, 2001a e b), Dicentrarchus labrax (Gravato e Santos, 2002),

Oncorhynchus mykiss (Ayllón and Garcia-Vasquez, 2001) e Liza aurata

(Oliveira et al., 2007), expostas a várias classes de genotoxinas, sendo por

isso, frequentemente usado como biomarcador de genotoxicidade (Pacheco et

al., 2005).

5. ORIENTAÇÕES E OBJECTIVOS DA TESE

Os testes toxicológicos in vitro têm vantagens sobre os sistemas

tradicionais in vivo pelo sacrifício de um menor número de organismos, o

melhor controlo das variáveis ambientais, a possibilidade de uma amostragem

simultânea ou repetida ao longo do tempo, o uso de menor quantidade de

compostos químicos (xenobióticos), permitindo estudar uma reacção de

Capítulo I

27

biotransformação específica sob condições estritamente controladas (Moore e

Simpson, 1992). Contudo, uma vez que tanto a sub-estimação como a sobre-

estimação dos efeitos pode acontecer, é importante validar os estudos

laboratoriais (nomeadamente in vitro) de biomarcadores com estudos de

campo (Van der Oost et al., 2003). Neste contexto, e atendendo à relevância

de ambos os tipos de estudo (in vivo e in vitro), a presente tese encontra-se

subdividida em cinco capítulos. No capítulo II foi efectuada a avaliação sazonal

da frequência de anomalias nucleares eritrocíticas (ANEs) numa espécie

de tainha - Liza aurata – colhida em diferentes locais de amostragem ao longo

de uma laguna poluída – Ria de Aveiro. Esta espécie foi escolhida como bio

indicadora neste estudo, tendo em conta a sua relevância ecológica,

abundância e distribuição geográfica, assim como a fácil captura e

manipulação.

Nos capítulos III e IV procedeu-se ao estudo dos efeitos in vitro de dois

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos - B[a]P e fluoranteno (FL) - e de

duas hormonas esteróides - cortisol e 17ß-estradiol -, separadamente e em

conjunto, sobre a actividade EROD microsomal hepática de Anguilla anguilla

L., previamente induzida in vivo por ß-naftoflavona (BNF). Uma das

metodologias frequentemente usada nos estudos in vitro em peixes é a

utilização de microsomas, já que a obtenção de um stock de microsomas

hepáticos com características homogéneas se torna fácil, a partir de um único

animal de grandes dimensões, por indução prévia através da injecção

intraperitoneal ou exposição em água contendo BNF. Esta metodologia, para

além de não ser dispendiosa, permite a preservação do stock microsomal

durante meses a -80 ºC tendo demonstrado a sua fiabilidade, no que respeita

à sensibilidade e reprodutibilidade da actividade da EROD (Yamazaki et al.,

1997). A escolha da enguia deve-se ao facto de ter sido anteriormente

comprovada a sua sensibilidade aos HAPs e BNF, após a sua administração por

via intraperitoneal ou exposição na água, através da elevada indução de EROD

hepática o que permitiu a obtenção de um stock concentrado de microsomas a

partir de um único animal, com uma elevada actividade enzimática. No

capítulo V realizou-se uma discussão geral dos resultados obtidos nos

capítulos II, III e IV.

Introdução geral

28

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CAPÍTULO II

Avaliação genotóxica sazonal de uma laguna poluída (Ria de

Aveiro) através do estudo das anomalias nucleares eritrocíticas de

Liza aurata

Capítulo II

37

RESUMO

A Ria de Aveiro é um sistema lagunar costeiro que se encontra

permanentemente ligado ao mar, tendo sido ao longo de vários anos, o

principal receptor de efluentes industriais e domésticos. Este estudo teve

como objectivo avaliar os efeitos genotóxicos dos poluentes existentes na Ria

de Aveiro, pelo que se usou Liza aurata como espécie bioindicadora. Liza

aurata é uma espécie de tainha bastante abundante na Ria de Aveiro,

apresentando uma larga distribuição geográfica e ocorrendo regularmente ao

longo do ano. A frequência de anomalias nucleares eritrocíticas (ANEs) foi

usada como biomarcador de genotoxicidade e avaliada em Liza aurata. Os

espécimes foram colhidos sazonalmente entre Maio de 2006 e Fevereiro de

2007, em seis locais distintos da Ria de Aveiro. A investigação revelou um

local crítico – Vagos – onde foi possível verificar uma elevada frequência de

ANEs na Primavera, Verão e Inverno, quando comparada com a referência

(Torreira) e com os restantes locais de amostragem. Estes resultados revelam

a existência de substâncias genotóxicas na Ria, muito provavelmente,

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), e confirmam os resultados

obtidos em anteriores estudos de campo efectuados nesta mesma espécie e

na referida área. Liza aurata revelou ser um bom bioindicador, uma vez que

demonstrou ser uma espécie sensível permitindo assim detectar diferenças

entre os diferentes locais de amostragem.

INTRODUÇÃO

A Ria de Aveiro é um sistema lagunar, com 47 Km2 de superfície,

permanente ligada ao mar, localizada na região noroeste de Portugal (Pacheco

et al., 2005). A existência de unidades industriais junto à Ria, bem como o

intenso tráfego naval, têm contribuído para o aumento da poluição, uma vez

que os produtos resultantes destas mesmas actividades acabam,

frequentemente, nas águas da Ria. Além dos efluentes industriais, há ainda os

efluentes de origem doméstica e agrícola, que também atingem a Ria e nem

sempre estão sujeitos a tratamento, o que leva ao aumento dos níveis de

contaminação orgânica. Em consequência dos factos anteriormente descritos e

Avaliação genotóxica sazonal da Ria de Aveiro

38

também devido à persistência de alguns desses contaminantes, existe a

necessidade urgente de um programa efectivo de biomonitorização (Pacheco

et al., 2005), o qual permita, por exemplo, avaliar os efeitos genotóxicos daí

resultantes. Os peixes são frequentemente usados como organismos teste em

estudos de genotoxicidade (Arkhipchuk e Garanko, 2005), uma vez que

intervêm a vários níveis na cadeia trófica, acumulando substâncias tóxicas e

respondendo a baixas concentrações de agentes mutagénicos (Cavas e

Ergene-Gözüraka, 2005). Liza aurata tem demonstrado ser uma boa espécie

bioindicadora na monitorização de águas contaminadas por xenobióticos

orgânicos (Pacheco et al., 2005; Oliveira et al., 2007). Num estudo de campo

efectuado por Pacheco et al. (2005), na mencionada Ria de Aveiro, foram

adoptadas três espécies de tainha - Liza ramada, Liza aurata e Liza saliens. L.

aurata revelou ser a mais abundante, apresentando uma maior distribuição

geográfica e ocorrendo mais regularmente ao longo do ano. Assim,

demonstrou ser a espécie mais apropriada para a biomonitorização de toda a

ria, revelando ser uma boa candidata como espécie bioindicadora (Pacheco et

al., 2005). Apesar das eventuais migrações sazonais, esta espécie de tainha

apresenta um raio de mobilidade reduzido, o que também constitui uma

característica favorável na sua escolha como bioindicadora, encontrando-se

bem adaptada a diferentes salinidades que vão desde 0 até 35 (‰), atributo

muito importante quando se pretende biomonitorizar ecossistemas costeiros

onde exista uma grande variação da salinidade da água (Pacheco et al.,

2005).

Os micronúcleos são usados como biomarcadores de danos estruturais

ao nível dos cromossomas (Arkhipchuk e Garanko, 2005). Durante os últimos

anos, vários estudos têm descrito a presença de anomalias nucleares, para

além dos referidos micronúcleos, em eritrócitos de peixes expostos a

substâncias genotóxicas (Ayllón e Garcia-Vazquez 2000; Cavas e Ergene-

Gözüraka, 2003b). Os micronúcleos têm origem em fragmentos de

cromossomas ou cromossomas inteiros que não foram sujeitos à fase

anafásica durante a divisão nuclear (Fenech e Crott, 2002). O teste das

anomalias nucleares (AN), que tem sido aplicado com sucesso em peixes e

usado como uma medida de genotoxicidade (Pacheco e Santos, 1997, 1998,

Capítulo II

39

1999, 2001a e 2001b; Oliveira et al., 2007), baseia-se na detecção de

micronúcleos e/ou estruturas nucleares anormais em eritrócitos maduros

(Pacheco et al., 1997). Este teste tem demonstrado ser um teste com um

elevado grau de sensibilidade, de fácil execução e grande eficiência, tanto em

estudos laboratoriais como em estudos de campo (Pacheco et al., 1999).

Este trabalho teve como objectivo avaliar, sazonalmente, a frequência

de anomalias nucleares eritrocíticas em espécimes de L. aurata. Os espécimes

foram colhidos em locais pré seleccionados da Ria de Aveiro, sujeitos a

diferentes tipos e fontes de contaminação, com o intuito de avaliar e comparar

a genotoxicidade existente nos referidos locais.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostragem – animais e locais de colheita

A amostragem decorreu, sazonalmente, entre Maio de 2006 e Fevereiro

de 2007, durante a maré baixa, tendo sido usada para o efeito uma rede

tradicional designada “chincha”. Foram colhidos espécimes juvenis de uma

espécie de tainha vulgarmente designada de tainha garrento (L. aurata).

Os locais de amostragem, na Ria de Aveiro (figura 1), foram

seleccionados com base numa distribuição geográfica ao longo dos canais

principais e na entrada da ria, tendo em consideração os vários tipos e fontes

de contaminação, bem como a selecção (teórica) de um ponto de referência

não poluído. Os locais de amostragem seleccionados foram os seguintes:

Torreira (TOR) como ponto de referência, uma vez que não se encontra

próximo das principais fontes de poluição; Barra (BAR) situado na parte inicial

do Canal de Mira, próximo da entrada da ria que dá para o mar e sujeita a um

tráfico naval considerável; Gafanha (GAF) localizado na proximidade de uma

zona portuária; Rio Novo do Príncipe (RIO) situado na parte terminal do rio

Vouga e principal fonte de água doce, a 6 Km de distância de uma fábrica de

pasta de papel; Laranjo (LAR) próximo de uma fábrica de soda cáustica, a

qual constitui uma importante fonte de contaminação de metais pesados,


40

nomeadamente mercúrio; Vagos (VAG) na parte terminal do canal de Ílhavo,

receptor de efluentes municipais e domésticos.

Os peixes foram seleccionados com base no seu tamanho e,

imediatamente após a sua captura, foram sacrificados, tendo sido preparados

os respectivos esfregaços sanguíneos.

Figura 1 – Mapa dos locais de colheita na Ria de Aveiro e respectivas posições

geográficas.

Longitude Latitude

Torreira 40º44'02N 008º41'44W

Barra 40º37'42N 008º44’35W

Gafanha 40º38'38N 008º41'42W

Rio 40º41’08N 008º39'41W

Laranjo 40º43’30N 008º37’43W

Vagos 40º33'59N 008º40'55W

Capítulo II

41

Contagem das Anomalias Nucleares Eritrocíticas

Os esfregaços sanguíneos foram fixados com metanol durante 10

minutos, corados com Giemsa (5%) durante 30 minutos e sujeitos a secagem

à temperatura ambiente, de forma a serem usados no teste das anomalias

nucleares eritrocíticas. A contagem das anomalias nucleares teve lugar em

seguida, numa amostra de 1000 eritrócitos maduros por peixe, de acordo com

os critérios de Schmid (1976), Carrasco et al. (1990) e Smith (1990),

adaptado por Pacheco e Santos (1996), com o objectivo de avaliar a

genotoxicidade. De acordo com estes autores, as lesões nucleares são

incluídas e contadas numa das seguintes categorias: micronúcleo, núcleo

lobulado, núcleo segmentado e núcleo reniforme. O resultado final foi

expresso como o valor médio (‰) da soma de todas a lesões observadas em

cada indivíduo.

Análise Estatística

Os resultados estão expressos em médias ± erro padrão,

correspondentes a grupos de cinco peixes capturados por cada local de

amostragem (n=5). O software SIGMASTAT 2.03 foi usado para efectuar a

análise estatística. Os dados experimentais foram inicialmente testados para

normalidade e homogeneidade da variância, de forma a obedecer a requisitos

estatísticos e, posteriormente, com o teste de Tukey (Zar, 1999). As

diferenças entre médias foram consideradas estatisticamente significativas

quando p <0.05.


42

RESULTADOS

Tabela I – Parâmetros físico-químicos da água do local de referência (Torreira)

e dos restantes locais de colheita na Ria de Aveiro.

PRIMAVERA 2006 (MAIO) Torreira Barra Gafanha Rio Laranjo Vagos Profundidade (m) 1.1 0.8 3 4.2 1.1 2.8 Turbidez (m) 0.3 0.4 1 0.8 0.6 0.65 O2 dissolvido (%) 41.2 40.3 45.7 20.9 38.3 32.1 Temperatura (ºC) 23.3 22.3 21.4 22.1 23.4 24.6 pH 8.351 8.351 8.207 7.765 7.742 7.655 Salinidade 19 30 28 0 17 11

VERÃO 2006 (SETEMBRO)

Torreira Barra Gafanha Rio Laranjo Vagos Profundidade (m) 1.2 2.7 5.6 0.9 1.2 3.6 Turbidez (m) 0.5 2.5 1 0.6 0.3 0.5 O2 dissolvido (%) 62.5 12.1 37.1 27.7 13.7 26.6 Temperatura (ºC) 25.1 22.4 20.1 24.1 22 24 pH 8.396 8.205 8.249 8.056 7.446 7.842 Salinidade 26 24 30 25 25 26

OUTONO 2006 (NOVEMBRO/DEZEMBRO)

Torreira Barra Gafanha Rio Laranjo Vagos Profundidade (m) 1 2.35 1.5 4.75 1.3 2.4 Turbidez (m) 0.5 0.3 0.15 0.7 0.3 0.4 O2 dissolvido (%) 23 158.6 122.9 44.1 36 62.9 Temperatura (ºC) 17.7 15.6 14.5 16.3 16.6 16.3 pH 8.122 8.022 7.865 7.947 7.511 7.441 Salinidade 23 4.5 8 0 6 0

INVERNO 2006/2007 (FEVEREIRO)

Torreira Barra Gafanha Rio Laranjo Vagos Profundidade (m) 1.1 2.55 4.1 1.5 1 2 Turbidez (m) 0.5 0.5 0.4 0.5 0.2 0.15 O2 dissolvido (%) 91.9 92.7 93.3 83 80.9 74.5 Temperatura (ºC) 14.5 15.9 14.9 14 12 14 pH 8.132 7.748 8.195 8.322 7.184 7.253 Salinidade 15 22 21 0 22 0

Capítulo II

43

Primavera

Figura 2 – Frequência de anomalias nucleares eritrocíticas (ANEs) em Liza

aurata, obtida para os diferentes locais da Ria de Aveiro, na Primavera. Os valores

encontram-se expressos em médias ± erro padrão (n=5). As diferenças significativas

(p<0.05) são: T vs Torreira (local de referência); B vs Barra; G vs Gafanha; R vs Rio.

A frequência de ANEs foi significativamente mais elevada em Vagos

quando comparada com o local de referência (Torreira) e com os restantes

locais de amostragem, com excepção do Laranjo. Também foi possível

observar uma forte elevação da frequência de ANEs no Laranjo, a qual é

significativa quando comparada com a Torreira e com o Rio. A frequência mais

baixa de ANEs ocorreu no Rio e foi significativamente mais baixa que a

frequência obtida para a Gafanha.

0

100

200

300

400

TOR BAR GAF RIO LAR VAG

Locais de Amostragem

Fre

quên

cia

de A

NE

(‰)

0

100

200

300

TOR BAR GAF LAR RIO VAG

T B G R T

R

G

400


44

Verão


aurata, obtida para os diferentes locais da Ria de Aveiro, no Verão. Os valores


(p<0.05) são: T vs Torreira (local de referência); B vs Barra; G vs Gafanha; R vs Rio.

A frequência de ANEs foi significativamente mais elevada em Vagos,

quando comparada com o local de referência (Torreira) e com a Barra, a

Gafanha e o Rio. A frequência mais baixa de ANEs foi obtida para a Barra e foi

significativamente diferente do local de referência (Torreira).

0

100

200

300

400

TOR BAR GAF RIO LAR VAG

0

100

200

300

400


Fre

quên

cia

de A

NE

(‰

)

T B G R

T


Capítulo II

45

Outono


aurata, obtida para os diferentes locais da Ria de Aveiro, no Outono. Os valores


(p<0.05) são: B vs Barra; G vs Gafanha; L vs Laranjo.

A frequência mais elevada de ANEs ocorreu na Gafanha, sendo

significativamente diferente da Barra, Rio e Laranjo. A frequência mais baixa

de ANEs foi obtida para o Rio e para o Laranjo.

A frequência de ANEs observada em Vagos foi significativamente mais

elevada que aquela obtida para o Laranjo.

0

100

200

300

400

1 2 3 4 5 6

0

100

200

300

400


Fre

quên

cia

de A

NE

(‰

)


L B

G G


46

Inverno


aurata, obtida para os diferentes locais da Ria de Aveiro, no Inverno. Os valores


(p<0.05) são: T vs Torreira (local de referência); B vs Barra; G vs Gafanha; R vs Rio;

L vs Laranjo.

A frequência de ANEs foi significativamente mais elevada em Vagos,

quando comparada, não só com o local de referência (Torreira), mas também

com os restantes locais de amostragem (Barra, Gafanha, Rio e Laranjo). Não

se observaram diferenças significativas entre a Barra, Gafanha Rio e Laranjo e

entre estes últimos e o local de referência.

DISCUSSÃO

De uma forma geral, e tendo em conta os resultados obtidos para as

quatro estações do ano, importa realçar que a presença de ANEs foi notória e

bastante expressiva num local – Vagos, o que é concordante com um estudo

de campo anteriormente feito nas mesmas condições (Pacheco et al., 2005).

Nesse mesmo estudo foram detectados elevados níveis de HAPs,

0

100

200

300

400

1 2 3 4 5 6

0

100

200

300

400


Fre

quên

cia

de A

NE

(‰

)


T B G R L

Capítulo II

47

nomeadamente B[a]P, em Vagos, na água, os quais foram apontados como

uma causa provável para a indução de ANEs. Este facto apoia os resultados

obtidos neste trabalho, uma vez que Vagos continua a ser um receptor de

efluentes domésticos e municipais. Alguns estudos têm demonstrado o

potencial genotóxico dos HAPs, nomeadamente através da sua capacidade de

indução de ANEs (Pacheco e Santos, 1997; Pacheco e Santos, 2001a; Oliveira

et al., 2007), já que as reacções envolvidas na biotransformação destes

compostos, podem levar à formação de metabolitos reactivos que, por sua

vez, podem ser mais tóxicos que o composto original e, como tal, interagir

com o ADN, e em última instância causar danos a este nível.

Contudo, de acordo com Pacheco e Santos (2002) o estudo de ANEs

pode revelar-se inadequado em situações de intensa contaminação, já que,

nestas situações, podem ocorrer interferências ao nível da expressão

genotóxica, como resultado do balanço entre o aumento do catabolismo

eritrocítico no baço e um decréscimo da velocidade da eritropoiese. De acordo

com Das e Nanda (1986), a indução de lesões nucleares poderá por vezes ser

mascarada através de uma acção citotóxica, havendo morte dos eritrócitos em

vez de ocorrer formação de lesões nucleares não-letais. Para além disso, as

células portadoras de danos/anomalias tendem a ser removidas do organismo

mais rapidamente que as normais (Das e Nanda, 1986). Estes factos poderão

explicar a ausência de expressão genotóxica, nomeadamente em Vagos, no

Outono. Parâmetros físico-químicos, tais como temperatura, pluviosidade, pH

e oxigénio dissolvido, influenciam a biodisponibilidade dos contaminantes,

constituindo por isso uma importante variável que também tem de ser tida em

conta. O Outono de 2006 (ao contrário das restantes estações) foi

extremamente chuvoso (Instituto de Meteorologia de Portugal, 2006) pelo

que, a pluviosidade intensa poderá ter originado um efeito de diluição das

substâncias genotóxicas presentes na água, o que poderá ter contribuído para

uma alteração dos níveis de contaminação. Contudo, os resultados obtidos

para cada estação do ano devem ser interpretados com precaução, atendendo

a que, como não se procedeu à análise da água e do sedimento, desconhece-

se qual a natureza e concentração dos compostos presentes nos mesmos à

data das amostragens.


48

A espécie adoptada neste trabalho – L. aurata – demonstrou, uma vez

mais, a sua utilidade como espécie bioindicadora, uma vez que permitiu

detectar diferenças entre os diferentes locais de amostragem.

CONCLUSÕES

O presente estudo revelou a existência de um local problemático –

Vagos - onde se verificou a existência de uma elevada frequência de ANEs em

todas as estações do ano, com excepção do Outono. Estes resultados indiciam

a existência de substâncias genotóxicas na água, muito provavelmente,

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), confirmando assim os

resultados obtidos em anteriores estudos de campo efectuados na referida

área (Pacheco et al., 2005).

L. aurata demonstrou a sua utilidade, enquanto espécie bioindicadora,

em estudos de monitorização dos efeitos biológicos de contaminantes

antropogénicos, nomeadamente na Ria de Aveiro.

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142.

CAPÍTULO III

Estudo in vitro do efeito do benzo[a]pireno, cortisol e 17ß-

estradiol sobre a actividade microsomal hepática de EROD de Anguilla

anguilla L..

Resposta in vitro de EROD ao benzo[a]pireno, cortisol e 17β-estradiol

52

RESUMO

Uma enguia adulta foi injectada intraperitonealmente com ß-

naftoflavona (BNF) 4mg/Kg. Após 24 horas de exposição, o respectivo fígado

foi extraído, tendo-se procedido ao isolamento dos seus microsomas. Os

microsomas hepáticos foram expostos numa cuvette – in vitro - a

benzo[a]pireno (B[a]P) 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM. O efeito protector de cortisol

(C) e 17ß-estradiol (E2) 22,02 nM sobre actividade microsomal hepática de

EROD, foi testado através da sua inclusão no tampão substrato previamente à

exposição às diferentes concentrações de B[a]P testadas. A exposição prévia

dos microsomas hepáticos ao tampão-substrato contendo C (22.02 nM) levou

a uma elevação acentuada da actividade de EROD. A exposição dos

microsomas hepáticos a B[a]P (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM) causou uma forte

inibição da actividade de EROD. Ambas as hormonas demonstraram um efeito

protector ao nível da inibição causada pelo B[a]P (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM),

efeito esse que se traduziu num aumento da actividade da EROD.

INTRODUÇÃO

A poluição dos recursos hídricos é um problema sério e crescente.

Apesar da existência de legislação relevante, a poluição do meio aquático por

poluentes químicos tóxicos continua a ocorrer, sendo os efluentes de origem

doméstica e industrial as principais fontes responsáveis pela contaminação do

meio aquático (Matsumoto et al., 2006). De entre os diferentes tipos de

poluentes tipicamente atribuíveis às actividades humanas, os produtos

derivados do petróleo, como por exemplo os hidrocarbonetos aromáticos

policíclicos (HAPs), são os mais ecotoxicologicamente relevantes (Pacheco e

Santos, 2001). O sistema endócrino dos peixes encontra-se, por isso, exposto

a uma larga variedade de compostos naturais e antropogénicos, os quais

podem causar danos ao nível do sistema reprodutor, bem como outros efeitos

adversos, incluindo alterações das enzimas envolvidas na metabolização

desses mesmos compostos (Vaccaro et al., 2005)

Capítulo III

53

Após absorção, o destino e efeitos da grande maioria dos xenobióticos,

incluindo os HAPs, são fortemente governados pela actividade catalítica de

várias enzimas envolvidas na metabolização dos xenobióticos. Estas enzimas

desempenham um papel central na biotransformação deste tipo de compostos

havendo, neste contexto, um interesse significativo na avaliação da actividade

da etoxiresorufina-O-desetilase (Pacheco et al., 2001), a qual é usada como

um biomarcador in vivo de exposição aos referidos HAPs, como por exemplo o

benzo[a]pireno (B[a]P), e a compostos estruturalmente semelhantes tal como

a ß-naftoflavona (BNF) (Buchelli e Fent, 1995). O BNF é reconhecido como um

forte indutor da actividade hepática da EROD (Pacheco e Santos, 1998). Neste

contexto, os bioensaios in vitro de rápida execução podem facilitar a avaliação

do risco, devido à facilidade que proporcionam a análise e identificação da

presença de compostos potencialmente tóxicos pertencentes à família dos

HAPs, individualmente e/ou em misturas complexas (Billiard, 2004). Contudo,

na natureza nem sempre existe uma relação directa entre a concentração de

um composto químico indutor e a resposta do sistema CYP1A, devido à

existência de uma série de factores que podem alterar a resposta indutora

(Sarasquete et al., 2000). A existência de parâmetros exógenos não químicos,

tais como a temperatura ambiental ou a estação do ano, e factores

endógenos, tais como os níveis hormonais ou a condição fisiológica do peixe,

podem de forma análoga, modular a resposta do sistema CYP1A (Sarasquete

et al., 2000). O fígado é, geralmente, referido como sendo o órgão mais

importante, envolvido na metabolização dos xenobióticos (Pacheco et al.,

2001).

Os indutores típicos do citocromo P4501A (CYP1A), tais como os HAPs,

são reconhecidos por exercerem disrupção endócrina nos peixes, avaliada

através dos baixos níveis de E2 no plasma (Casillas et al., 1991), maturação

sexual precoce (Collier et al., 1998) e fertilidade reduzida (Cheek et al.,

2001). O E2 é o mais potente dos estrogénios, desempenhando um importante

papel em ambos os sexos, em vários aspectos do crescimento,

desenvolvimento e diferenciação morfológica, assim como no desenvolvimento

e regulação dos comportamentos e ciclos reprodutivos e sexuais (Randall et

al., 2001). Vários estudos (maioritariamente de campo) têm demonstrado que


54

E2 afecta a actividade hepática de CYP1A nos peixes (Navas e Segner, 2001;

Vaccaro et al., 2005; Teles et al., 2005) levando, geralmente, ao decréscimo

da mesma.

O cortisol (C) é exemplo de outro esteróide, cuja síntese ocorre em

células do tecido interrenal, sendo o principal corticoesteróide em peixes assim

como o mais abundante e activo. Os principais órgãos-alvo do cortisol são as

brânquias, fígado e intestino, sendo também importante a sua acção sobre o

músculo esquelético (Hontela, 1997). O aumento da concentração de cortisol

no plasma, foi observado em peixes após exposição de curto prazo a uma

vasta gama de contaminantes, tais como metais pesados (De Boeck et al.,

2003), ácidos resínicos (Teles et al., 2003), HAPs (Pacheco e Santos, 2001) e

pesticidas (Waring e Moore, 2004). Assim, o nível de cortisol no plasma é

usado como um indicador de rotina da magnitude e duração da resposta ao

stress causado pela exposição a contaminantes (Ruane et al., 2001).

Apesar da existência de bastante informação científica acerca da

importância do sistema endócrino em peixes, nomeadamente a resposta de

hormonas esteróides a situações de stress, pouco se conhece sobre os níveis

fisiológicos celulares destas hormonas e da sua influência na actividade

microsomal hepática de EROD, in vitro. Este trabalho pretendeu avaliar in

vitro, o efeito de B[a]P isoladamente e também com exposição prévia a C e

E2, de forma a estudar o efeito protector destas duas hormonas sobre a

actividade EROD microsomal hepática de A. anguilla L.

MATERIAL E MÉTODOS

Compostos químicos

β-naftoflavona (BNF), dimetil sulfóxido (DMSO), resorufina e

benzo[a]pireno (B[a]P) (Sigma Chemical Co, EUA); 7-etoxiresorufina e NADPH

(Roche); 17ß-estradiol (Sigma-Aldrich, Alemanha); cortisol (Merck Sharp &

Dohme).

Capítulo III

55

Animais

Uma enguia adulta – Anguilla anguilla L. – com cerca de 500 gramas,

adquirida num mercado de peixe local, foi mantida no laboratório, num tanque

de água salobra com arejamento durante um período de aclimatização de 48

horas. A enguia foi injectada intraperitonealmente com ß-naftoflavona

4mg/Kg, após o referido período de aclimatização, e sacrificada após 24 horas.

O fígado foi então retirado, sendo imediatamente congelado em azoto líquido,

e armazenado a -80ºC até se proceder à respectiva homogeneização. O

animal não foi alimentado quer durante o período de recobro quer durante o

período experimental.

Isolamento dos microsomas

Procedeu-se à homogeneização do fígado previamente extraído em

tampão TRIS-HCL 0.1 M, pH 7.4 + KCL (0.15M) + Glicerol (20%). Os

microsomas hepáticos foram obtidos de acordo com os métodos de Lange et

al. (1993), Monod e Vindimian (1991), adaptados por Pacheco e Santos

(1998).

Actividade da EROD

A actividade da EROD foi determinada de acordo com o método de

Burke e Meyer (1974), a 25ºC, através do aumento progressivo de

fluorescência, resultante da formação de resorufina, durante 3 minutos

(comprimento de onda de excitação 530nm; comprimento de onda de emissão

585nm), num espectrofluorímetro Jasco FP 750, e expressa em

picomoles/min/mg de proteína. A reacção foi iniciada com a adição de 10 µl de

NADPH (10 mM).

Determinação da concentração de proteína

A concentração microsomal de proteína foi determinada de acordo com

o método de Biureto (Gornall et al., 1949), usando a albumina (proteína

bovina) como padrão.


56

Tabela 1 – Tampões, solventes e soluções usados durante o protocolo

experimental

Tampões

TS 0.5 µM etoxiresorufina em Tris-HCl 0,1 M pH 7.4 com KCl 0,15M e 20%

T Tris-HCl 0,1 M pH 7.4 com KCl 0,15M e 20% glicerol

TSC TS com cortisol (concentração final na cuvette = 22.02nM)

TSE2 TS com E2 (concentração final na cuvette = 22.02nM)

Solventes

DMSO Dimetil sulfóxido

Soluções

B[a]P Benzo[a]pireno (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7µM) em DMSO

Tabela 2 – Procedimento experimental para avaliação da actividade

microsomal hepática de EROD. A numeração (1, 2, 3 e 4) indica a ordem pela qual os

compostos intervenientes na reacção foram adicionados na cuvette.

Ensaio

5 µ

l m

icro

som

as

1090 µ

l T

S

1090 µ

l T

SC

1090 µ

l T

SE

2

5 µ

l T

5 µ

l D

MS

O

5 µ

l B

[a]P

(em

D

MSO

)

10 µ

l N

AD

PH

Controlo 1 2 3 4

Controlo DMSO 1 2 3 4 Efeitos do C in vitro

Controlo DMSO+C 1 2 3 4

Controlo 1 2 3 4

Controlo DMSO 1 2 3 4 Efeitos do E2 in vitro

Controlo DMSO+E2 1 2 3 4

Controlo 1 2 3 4

Controlo DMSO 1 2 3 4 Efeitos do B[a]P in vitro B[a]P (0.1, 0.3, 0.9 e

2.7 µM) 1 2 3 4

Controlo DMSO 1 2 3 4

Controlo DMSO+C 1 2 3 4 Efeitos in vitro do

B[a]P após exposição a C (22.02 nM) C+B[a]P (0.1, 0.3, 0.9 e

2.7 µM) 1 2 3 4


Controlo DMSO+E2 1 2 3 4 Efeitos in vitro do

B[a]P após exposição a E2 (22.02 nM) E2+B[a]P (0.1, 0.3, 0.9

e 2.7 µM) 1 2 3 4

Capítulo III

57

Os microsomas hepáticos foram expostos a B[a]P, C e E2, de acordo

com as seguintes condições: a uma suspensão de 5 µl de microsomas

hepáticos foi adicionado

(1) 1090 µl de solução tampão com substrato (TS) e 5 µl de solução

tampão sem substrato (T), e designado como Controlo;

(2) 1090 µl TS e 5 µl de dimetil sulfóxido (DMSO), e designado como

Controlo DMSO;

(3) 1090 µl TS e 5 µl de B[a]P 2.7, 0.9, 0.3 e 0.1 µM, diluídos em

DMSO, e designado como B[a]P;

(4) 1090 µl TS contendo 22,02 nM de C (TSC) e 5 µl de DMSO, e

designado como Controlo DMSO+C;

(5) 1090 µl de TSC mais 5 µl de B[a]P, e designado como C+B[a]P;

(6) 1090 µl TS contendo 22.02 nM de E2 (TSE2) e 5 µl de DMSO, e

desigando como Controlo DMSO+E2;

(7) 1090 µl de TSE2 mais 5 µl de B[a]P, e designado como E2+B[a]P;

A concentração final respectiva de C e E2, na cuvette, foi de 22.02 nM.



correspondentes a quatro réplicas de cada ensaio efectuado (n=4). O software

SIGMASTAT 2.03 foi usado para efectuar a análise estatística. Os dados

experimentais foram inicialmente testados para normalidade e homogeneidade

da variância, de forma a obedecer a requisitos estatísticos e, posteriormente,

com o teste de Tukey (Zar, 1999). As diferenças entre médias foram

consideradas estatisticamente significativas quando p <0.05.


58

RESULTADOS

Figura 1 – Efeitos in vitro de B[a]P 0.1, 0.3, 0.9, 2.7 µM. Os valores


(p<0.05) são: * vs Controlo; # vs Controlo DMSO; 0.1 vs B[a]P 0.1; 0.3 vs

B[a]P 0.3; 0.9 vs B[a]P 0.9.

Após exposição intraperitoneal durante 24 horas a BNF 4mg/Kg, a

actividade microsomal hepática de EROD de Anguilla anguilla L., foi de 9.65

pmol.min-1.mg de proteína-1. A adição de 5 µl de DMSO ao Controlo induziu

significativamente a actividade de EROD quando comparado com o Controlo

sem DMSO.

A inibição significativa da actividade microsomal hepática de EROD foi

observada após exposição ao B[a]P 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM quando comparada

com Controlo DMSO. A anteriormente referida inibição da actividade EROD

foi proporcional ao aumento da concentração de B[a]P.

Controlo Controlo DMSO

B[a]P 0.1 µM

B[a]P 0.3 µM

B[a]P 0.9 µM

B[a]P 2.7 µM

0,00

5,00

10,00

15,00

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

*

#

0.1 0.3 0.9 #

0.1 #

0.1 #

Capítulo III

59

Figura 2 – Efeitos in vitro de B[a]P 0.1, 0.3, 0.9, 2.7 µM, após exposição a C

(22.02 nM). Os valores encontram-se expressos em médias ± erro padrão (n=4). As

diferenças significativas (p<0.05) são: * vs Controlo; ** vs Controlo DMSO; ***

vs Controlo DMSO+C; 0.1 vs C+B[a]P 0.1; 0.3 vs C+B[a]P 0.3; 0.9 vs C+B[a]P

0.9.

Na figura 2 observa-se que actividade EROD hepática é

significativamente mais elevada no Controlo contendo DMSO quando

comparado com o Controlo sem DMSO.

A exposição prévia dos microsomas hepáticos ao C (22.02 nM) levou a

uma forte indução da actividade de EROD, quando comparada com Controlo

DMSO.

Após exposição prévia ao C, o efeito inibitório de B[a]P 0.1, 0.3, 0.9 e

2.7 µM sobre a actividade microsomal hepática de EROD foi significativo,

quando comparado com Controlo DMSO+C, pelo que, o C não foi capaz de

impedir a inibição da actividade EROD hepática pelo B[a]P.

Apesar da presença do C, o efeito inibitório das concentrações 0.1, 0.3,

0.9 e 2.7 µM de B[a]P sobre a actividade de EROD, foi também proporcional

ao aumento das referidas concentrações de B[a]P.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00 A

ctiv

idad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

Controlo Cont. DMSO

C+B[a]P 0.1 µM

C+B[a]P 0.3 µM

C+B[a]P 0.9 µM

C+B[a]P 2.7 µM

Cont. DMSO+C

**

*

***

0.1 0.3 0.9 ***

0.1 0.3 ***

*

0.1 ***


60

Figura 3 – Efeitos in vitro de B[a]P 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM sem (TS) e com

(TSC) inclusão de C (22.02 nM) no tampão substrato. Os valores encontram-se

expressos em médias ± erro padrão (n=4). As diferenças significativas (p<0.05) são:

* vs Controlo; ** vs Controlo DMSO; § entre a ausência e a presença de C, para

cada concentração de B[a]P.

Na figura 3 observa-se que a actividade EROD hepática é

significativamente mais elevada no Controlo DMSO quando comparado com

Controlo. O Controlo contendo DMSO e C tem também uma actividade

EROD significativamente mais elevada do que o Controlo contendo só DMSO.

A comparação da actividade EROD microsomal hepática por exposição

ao B[a]P (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM), sem e com exposição prévia ao C revela,

em ambos os casos, uma elevada inibição proporcional à respectiva

concentração de B[a]P. Contudo, a inibição causada pelas diferentes

concentrações de B[a]P, foi significativamente reduzida pela exposição prévia

ao C contido no tampão substrato.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00


B[a]P 0.1 µM

B[a]P 0.3 µM

B[a]P 0.9 µM

B[a]P 2.7 µM

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

TS TSC

§

§ § §

*

**

Capítulo III

61

Figura 4 – Efeitos in vitro de B[a]P 0.1, 0.3, 0.9, 2.7 µM. Os valores


(p<0.05) são: # vs Controlo DMSO; 0.1 vs B[a]P 0.1; 0.3 vs B[a]P 0.3; 0.9 vs

B[a]P 0.9.

A actividade EROD microsomal hepática de Anguilla anguilla L., após

exposição intraperitoneal durante 24 horas a BNF 4mg/Kg, foi de 13.36

pmol.min-1.mg de proteína-1. A adição de 5 µl de DMSO ao Controlo não

afectou significativamente a actividade de EROD, quando comparado com o

Controlo sem DMSO.

A exposição às diferentes concentrações de B[a]P testadas (0.1, 0.3,

0.9 e 2.7 µM) inibiu de forma significativa a actividade EROD microsomal

hepática, quando comparado com Controlo DMSO.

0,00

4,00

8,00

16,00 A

ctiv

idad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g

de p

rote

ína)

12,00


B[a]P 0.1 µM

B[a]P 0.3 µM

B[a]P 0.9 µM

B[a]P 2.7 µM

# 0.1 0.3 #

0.1 #

0.1 0.3 #


62

Figura 5 – Efeitos in vitro de B[a]P 0.1, 0.3, 0.9, 2.7 µM, após exposição a E2


diferenças significativas (p<0.05) são: *** vs Controlo+E2; 0.1 vs E2+B[a]P 0.1;

0.3 vs E2+B[a]P 0.3; 0.9 vs E2+B[a]P 0.9.

A adição de DMSO não afectou de forma significativa a actividade EROD

hepática, uma vez que não existe diferença significativa entre o Controlo e o

Controlo contendo DMSO.

A exposição ao E2 (22.02 nM) não afectou significativamente a

actividade EROD microsomal hepática, muito embora tenha havido um

aumento desta actividade enzimática. Contudo, a adição de E2 ao tampão

substrato, anteriormente à exposição ao B[a]P, não impediu a inibição da

actividade EROD microsomal hepática causada pelas diferentes concentrações

de B[a]P. Assim, mesmo na presença de E2, a actividade EROD hepática

resultante da exposição ao B[a]P é significativamente mais baixa quando

comparada com Controlo DMSO+ E2.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

Controlo Cont. DMSO

E2+B[a]P 0.1 µM

E2+B[a]P 0.3 µM

E2+B[a]P 0.9 µM

E2+B[a]P 2.7 µM

Cont. DMSO+E2

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

*** 0.1 0.3 0.9 ***

0.3 *** 0.1

***

Capítulo III

63

Figura 6 – Efeitos in vitro de B[a]P 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM, sem (TS) e com

(TSE2) inclusão de E2 (22.02 nM) no tampão substrato. Os valores encontram-se

expressos em médias ± erro padrão (n=4). As diferenças significativas (p<0.05) são:

§ entre a ausência e a presença de E2, para cada concentração de B[a]P.

Na figura 6 observa-se que a actividade EROD hepática não é

significativamente afectada pela adição de 5 µl de DMSO ao Controlo, uma

vez que não existe diferença significativa entre o Controlo contendo DMSO e

o Controlo sem DMSO. A adição de E2 ao Controlo contendo DMSO também

não afectou a actividade EROD significativamente uma vez que não existe

diferença significativa entre o Controlo DMSO contendo E2 e o Controlo só

com DMSO.

A comparação da actividade EROD microsomal hepática por exposição

ao B[a]P (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM), sem e com exposição prévia ao E2 revela,

em ambos os casos, uma inibição significativa. Contudo, a inibição causada

pelas diferentes concentrações de B[a]P, foi significativamente reduzida pela

exposição prévia ao E2 contido no tampão substrato.

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00


B[a]P 0.1 µM

B[a]P 0.3 µM

B[a]P 0.9 µM

B[a]P 2.7 µM

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

TS TSE2

§ §

§

§


64

DISCUSSÃO

O BNF é reconhecido como um forte indutor da actividade EROD

hepática em peixes, pelo que foi usado neste estudo, de modo a obter in vivo

um controlo positivo com elevada actividade de EROD (Pacheco e Santos,

1996; Gravato e Santos, 2002; Oliveira e Santos, 2003a; Oliveira et al.,

2003b; Oliveira et al., 2005; Santos e Maria, 2005) com o intuito de observar

a inibição (provavelmente) causada pelas diferentes concentrações de B[a]P

a serem testadas. As diferentes concentrações de B[a]P testadas (0.1, 0.3,

0.9 e 2.7 µM) demonstraram in vitro a inibição, de forma significativa, da

actividade EROD microsomal hepática, sendo estes resultados concordantes

com aqueles obtidos in vitro em Dicentrarchus labrax por Gravato e Santos

(2002), onde foi sugerido a possibilidade de tais resultados se deverem à

ocorrência de inibição enzimática.

A concentração de E2 usada baseou-se nos valores plasmáticos de E2

obtidos por Teles et al. (2005) em Sparus aurata L. após 4 horas deste

esteróide ter sido adicionado à água dos aquários que continham os

espécimes. A mesma concentração molar foi adoptada para o cortisol de forma

a permitir a comparação entre o efeito do mesmo número de moléculas das

duas hormonas, e de forma a assegurar a uniformidade e coerência das

condições testadas. Ao contrário dos estudos in vivo que têm vindo a ser feitos

neste âmbito (Teles et al., 2004a, 2005, 2006 e 2007; Vaccaro et al., 2005),

são escassos os estudos in vitro que relatam o papel de E2 no que diz respeito

ao seu efeito sobre a actividade EROD.

A exposição in vitro dos microsomas hepáticos a E2, não afectou

significativamente a actividade EROD microsomal hepática, o que é

concordante com os resultados obtidos em estudos anteriormente feitos, os

quais relatam inibição ou inalteração dessa mesma actividade (Teles et al.,

2004a; 2005; 2006; Vaccaro et al., 2005). O mecanismo subjacente à inibição

da actividade da EROD na presença de compostos estrogénicos não é

completamente conhecido (Andersson et al., 2007). Contudo existem estudos

que relatam que após exposição a E2, os níveis proteicos e mRNA associados a

CYP1A, são reduzidos, o que indicia que, de alguma forma, o E2 interfere ao

nível do gene (Navas e Segner, 2001). A exposição a E2 em combinação com

Capítulo III

65

um antagonista dos receptores de estrogénio, anulou o efeito inibitório de E2

na actividade de EROD em hepatócitos de Oncorhynchus mykiss (Navas e

Segner, 2001), o que sugere o envolvimento dos receptores de estrogénio

(Andersson et al., 2007).

No que diz respeito ao cortisol o cenário é idêntico; são muito poucos os

estudos in vitro realizados neste contexto. A maioria dos estudos de campo

efectuados tem demonstrado a elevação do nível plasmático de cortisol em

resposta à curta exposição a poluentes (Pacheco e Santos, 2001; Teles et al.,

2004b e 2007), nomeadamente HAPs (Oliveira et al., 2007). No presente

trabalho, verificou-se o aumento da actividade de EROD após exposição in

vitro dos microsomas hepáticos ao C, bem como a redução dos efeitos

inibitórios de B[a]P 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM após exposição prévia dos

microsomas hepáticos à referida hormona. Santos et al. (2000), num estudo

de cultura de orgãos em A. anguilla L., também observaram um aumento da

actividade hepática de EROD, quando o C foi adicionado ao meio de cultura.

Contudo, de acordo com o estudo efectuado por Hontela et al. (1997), peixes

colhidos numa área sujeita a contaminação por efluentes da pasta de papel,

demonstraram uma reduzida capacidade de elevar o nível plasmático de C,

como consequência de stress agudo e longa exposição aos referidos efluentes.

Por outro lado os peixes colhidos no local de referência revelaram possuir a

expectável e normal capacidade de elevar o C plasmático. Os resultados

obtidos in vitro, no presente estudo, demonstram que o C exerce um efeito

protector sobre a actividade microsomal hepática de EROD quando exposta a

contaminantes inibidores.

Verificou-se ainda que tanto na presença do C como do E2 (22.02 nM) a

inibição causada pelo B[a]P foi significativamente reduzida, revelando o efeito

protector destas duas hormonas esteróides sobre a actividade EROD

microsomal hepática. Gravato e Santos (2002), obtiveram resultados

semelhantes com naftaleno 2.7 µM; na presença deste composto, a inibição

causada por B[a]P 0.1 e 0.01 µM na actividade microsomal hepática de EROD

foi reduzida, indiciando que de alguma forma o naftaleno (tal como o C e o E2)

também atenua o efeito inibitório de B[a]P.


66

O efeito exercido pelas duas hormonas (C e E2), isoladamente ou em

combinação com o B[a]P, sobre a actividade EROD hepática foi idêntico.

Contudo, nem o C nem o E2 demonstraram um efeito preventivo no que diz

respeito à inibição causada pelo B[a]P, o que sugere que, muito

provavelmente, a concentração de C e E2 usada (22.02 nM) não foi a

adequada para que tal efeito fosse observável. Neste contexto seria, por isso,

interessante testar o efeito de outras concentrações de C e E2 sobre a

actividade EROD microsomal hepática, para as condições estabelecidas neste

trabalho.

CONCLUSÕES

- A exposição in vitro dos microsomas hepáticos de A. anguilla L. a

benzo(a)pireno, previamente induzidos pela β-naftoflavona, resultou numa

forte inibição da actividade de EROD.

- A exposição in vitro ao cortisol induziu significativamente a actividade

EROD microsomal hepática, enquanto que a exposição in vitro ao 17β-

estradiol resultou num aumento, embora não significativo, desta actividade

enzimática.

- Tanto na presença do cortisol como do 17β-estradiol (22.02 nM),

observou-se uma redução significativa dos efeitos inibitórios causados pela

exposição in vitro ao benzo(a)pireno, sobre a actividade EROD microsomal

hepática.

- O efeito exercido pelo cortisol e pelo 17β-estradiol sobre a actividade

EROD hepática, isoladamente ou em combinação com o B[a]P, foi idêntico.

Capítulo III

67


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CAPÍTULO IV

Estudo in vitro do efeito do fluoranteno, cortisol e

17ß-estradiol sobre a actividade EROD microsomal hepática, em

Anguilla anguilla L..

Resposta in vitro de EROD ao fluoranteno, cortisol e 17β-estradiol

72

RESUMO

Uma enguia adulta foi intraperitonealmente injectada com ß-

naftoflavona (BNF) 4mg/Kg. Após 24 horas de exposição, o respectivo fígado

foi extraído, tendo-se procedido ao isolamento dos seus microsomas. Os

microsomas hepáticos foram expostos numa cuvette - in vitro - ao fluoranteno

(FL) 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM. O efeito protector de cortisol (C) e 17β-estradiol

(E2) 22,02 nM sobre a actividade microsomal hepática de EROD, foi testado

através da sua adição ao tampão-substrato, previamente à exposição a

diferentes concentrações de FL anteriormente seleccionadas. A exposição

prévia dos microsomas hepáticos ao tampão-substrato contendo C e E2 levou a

uma indução significativa da actividade de EROD. A exposição dos microsomas

hepáticos de A. anguilla L. ao FL 0.1 e 0.3 µM, resultou numa indução

significativa da actividade de EROD, enquanto que a exposição a

concentrações mais elevadas do referido composto (0.9 e 2.7 µM) levou a uma

forte inibição da mesma. As hormonas demonstraram um efeito protector no

que respeita à inibição desta actividade enzimática causada pelas

concentrações mais elevadas de FL (0.9 e 2.7 µM).

INTRODUÇÃO

Os ambientes aquáticos têm sido usados, durante décadas, como o

maior depósito de descargas antropogénicas (Pacheco e Santos, 2001a), pelo

que são continuamente sobrecarregados com compostos químicos estranhos

(xenobióticos) resultantes da actividade das comunidades urbanas e

industriais (Van der Oost et al., 2003). Assim, durante o século XX foram

produzidos, e em parte libertados para o meio ambiente, milhares de

poluentes orgânicos tais como policlorobifenis (PCBs), hidrocarbonetos

aromáticos policíclicos (HAPs) e pesticidas organoclorados (Van der Oost et al.,

2003).

A indústria mundial da pasta de papel tem vindo a sofrer, durante os

últimos anos, uma rápida expansão no que diz respeito à utilização de

sofisticados processos mecânicos e químico-mecânicos (O´Connor et al.,

1992). Estes últimos produzem elevadas quantidades de efluente que são

libertadas para o ambiente aquático, causando sérios efeitos ecológicos e

Capítulo IV

73

toxicológicos nos ecossistemas receptores (Pacheco e Santos, 1999). Estes

efluentes são compostos por misturas complexas de substâncias

ambientalmente activas, que contêm cerca de 300 químicos actualmente

conhecidos (Nestmann et al., 1980), que pertencem a várias classes de

compostos orgânicos, nomeadamente ácidos gordos insaturados, ácidos

resínicos, HAPs, entre outros (Pacheco e Santos, 1999). De entre os diferentes

efeitos tóxicos induzidos por estes compostos, há um interesse significativo na

indução das monooxigenases associadas ao citocromo P450. A relação entre a

actividade da etoxiresorufina O-desetilase (EROD) hepática (Pacheco e Santos,

1998) e os níveis plasmáticos e celulares de determinadas hormonas

esteróides, tais como cortisol (C) e 17ß-estradiol (E2) em peixes é pouco

conhecida. Contudo, os níveis de cortisol plasmático foram amplamente

estudados in vivo em Anguilla anguilla L. (Santos e Pacheco, 1996; Pacheco e

Santos, 2001a e 2001b; Teles et al., 2004b), Sparus aurata L. (Teles et al.,

2005), Liza aurata (Oliveira et al., 2007) e em Dicentrarchus labrax L. (Teles

et al., 2004a) sob diversas condições ambientais, e in vitro (Santos et al.,

2000) mas de forma menos exaustiva. O nível plasmático de C é o indicador

de stress mais vulgarmente usado em peixes devido à rápida elevação que

ocorre em resposta a vários agentes stressantes, nomeadamente

contaminantes (Wendelar-Bonga, 1997). O E2 é o mais potente dos

estrogénios, desempenhando um papel preponderante em vários aspectos do

crescimento, desenvolvimento e diferenciação morfológica (Randall et al.,

2001). No entanto, este estrogénio natural também pode ser considerado um

contaminante aquático. A existência de elevados níveis de E2 na água,

principalmente como consequência de efluentes domésticos e industriais, pode

causar efeitos adversos nos peixes, nomeadamente indução de

intersexualidade em machos (Metcalfe et al., 2001). Vários estudos têm sido

realizados in vivo, neste âmbito, em Sparus aurata L. (Teles et al., 2005) e

Dicentrarchus labrax L. (Teles et al., 2004a; Teles et al., 2006).

O fígado é, geralmente, o órgão onde a maioria dos xenobióticos

absorvidos são sujeitos a um processo crítico de activação metabólica

(oxidação), mediado pelas referidas monooxigenases, e posterior inactivação

mediada pelas conjugases, permitindo a excreção e eliminação dos mesmos


74

(Buhler e Williams, 1988). A EROD tem demonstrado ser muito sensível à

indução causada por vários poluentes químicos, nomeadamente HAPs

(Pacheco e Santos, 1998). O fluoranteno (FL) é um HAP vulgarmente

encontrado no sedimento resultante dos efluentes da pasta de papel, sendo

constituído por quatro anéis, e com actividade mutagénica (Kinae et al., 1988)

e cancerígena relativamente baixa em mamíferos (Willett et al., 2001). A

informação acerca da toxicidade do FL em peixes é limitada, uma vez que

pouco se sabe acerca das consequências da exposição a este composto,

nomeadamente, efeitos ao nível da actividade de CYP1A, em particular na

actividade de EROD, e demais respostas de stress. Fent e Bätscher (2000),

num estudo in vitro, não obtiveram indução significativa da actividade EROD

microsomal hepática na presença de FL, enquanto que Willett et al., (2001),

relatou a inibição in vitro e in vivo em Fundulus heteroclitus da actividade de

EROD.

A escassez de informação científica, nos peixes, no que diz respeito aos

efeitos in vitro do FL, C e E2 isolados ou em conjunto, sobre a actividade

microsomal hepática de EROD, serviu de estímulo ao presente trabalho. Deste

modo, procedeu-se ao estudo dos efeitos in vitro de diferentes concentrações

de FL com e sem exposição prévia ao C e E2, de forma a tentar compreender

o papel destas duas hormonas esteróides sobre a actividade EROD microsomal

hepática de A. anguilla L..

MATERIAL E MÉTODOS

Compostos químicos

β-naftoflavona, dimetil sulfóxido (DMSO) e resorufina (Sigma Chemical

Co, EUA) 7-etoxiresorufina e NADPH (Roche); 17ß-estradiol e fluoranteno

(Sigma-Aldrich - Alemanha); cortisol (Merck Sharp & Dohme)

Animais

Uma enguia adulta – Anguilla anguilla L. – com cerca de 650 gramas,

adquirida num mercado de peixe local, foi mantida no laboratório, num tanque

Capítulo IV

75

de água salobra com arejamento durante um período de aclimatização de 48

horas. A enguia foi injectada intraperitonealmente com ß-naftoflavona

4mg/Kg, após o referido período de aclimatização, e sacrificada após 24 horas.

O fígado foi então retirado, sendo imediatamente congelado em azoto líquido,

e armazenado a -80ºC até se proceder à sua homogeneização. O animal não

foi alimentado nem durante o período de recobro nem durante o período

experimental.

Isolamento dos microsomas

Procedeu-se à homogeneização do fígado previamente extraído em

tampão TRIS-HCL 0.1 M pH 7.4 + KCL (0.15M) + Glicerol (20%). Os

microsomas hepáticos foram obtidos de acordo com os métodos de Lange et

al. (1993), Monod e Vindimian (1991), adaptados por Pacheco e Santos

(1998).

Actividade da EROD

A actividade da EROD foi determinada de acordo com o método de

Burke e Meyer (1974), a 25ºC, através do aumento progressivo de

fluorescência, resultante da formação de resorufina, durante 3 minutos

(comprimento de onda de excitação 530nm; comprimento de onda de emissão

585nm), num espectrofluorímetro Jasco FP 750, e expressa em

picomoles/min/mg de proteína. A reacção foi iniciada com a adição de 10 µl de

NADPH (10 mM).

Determinação da concentração de proteína

A concentração microsomal de proteína foi determinada de acordo com

o método de Biureto (Gornall et al., 1949), usando a albumina (proteína

bovina) como padrão.


76

Tabela 1 – Tampões, solventes e soluções usados durante o protocolo

experimental

Tampões

TS 0.5 µM etoxiresorufina em Tris-HCl 0,1 M pH 7.4 com KCl 0,15M e 20%

T Tris-HCl 0,1 M pH 7.4 com KCl 0,15M e 20% glicerol

TSC TS com cortisol (concentração final na cuvette = 22.02nM)

TSE2 TS com E2 (concentração final na cuvette = 22.02nM)

Solventes

DMSO Dimetil sulfóxido

Soluções

B[a]P Benzo[a]pireno (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7µM) em DMSO

Tabela 2 – Procedimento experimental para avaliação da actividade

microsomal hepática de EROD. A numeração (1, 2, 3 e 4) indica ordem pela qual os

intervenientes na reacção foram adicionados na cuvette.

Ensaio

5 µ

l m

icro

som

as

1090 µ

l T

S

1090 µ

l T

SC

1090 µ

l T

SE

2

5 µ

l T

5 µ

l D

MS

O

5 µ

l FL (

em D

MS

O)

10 µ

l N

AD

PH

Controlo 1 2 3 4

Controlo DMSO 1 2 3 4 Efeitos do C in vitro

Controlo DMSO+C 1 2 3 4

Controlo 1 2 3 4

Controlo DMSO 1 2 3 4 Efeitos de E2 in vitro

Controlo DMSO+E2 1 2 3 4

Controlo 1 2 3 4

Controlo DMSO 1 2 3 4 Efeitos do FL in vitro FL (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM) 1 2 3 4


Controlo DMSO+C 1 2 3 4 Efeitos in vitro do FL após exposição a C

(22.02 nM) C+FL (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM) 1 2 3 4


Controlo DMSO+E2 1 2 3 4 Efeitos in vitro do FL após exposição a E2

(22.02 nM) E2+FL (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM) 1 2 3 4

Capítulo IV

77

Os microsomas hepáticos foram expostos durante 3 minutos a FL, C e

E2, de acordo com as seguintes condições: a uma suspensão de 5 µl de

microsomas hepáticos foi adicionado

(1) 1090 µl de solução tampão com substrato (TS) e 5 µl de solução

tampão sem substrato (T), e designado como Controlo;

(2) 1090 µl TS e 5 µl de dimetil sulfóxido (DMSO), e designado como

Controlo DMSO;

(3) 1090 µl TS e 5 µl de FL 2.7, 0.9, 0.3 e 0.1 µM, diluídos em DMSO, e

designado como FL;

(4) 1090 µl TS contendo 22,02 nM de C (TSC) e 5 µl de DMSO, e

designado como Controlo DMSO+C;

(5) 1090 µl de TSC mais 5 µl de FL, e designado como C+FL;

(6) 1090 µl TS contendo 22.02 nM de E2 (TSE2) e 5 µl de DMSO, e

desigando como Controlo DMSO+E2;

(7) 1090 µl de TSE2 mais 5 µl de FL, e designado como E2+FL;

A concentração final respectiva de C e E2, na cuvette, foi de 22.02 nM.



correspondentes a quatro réplicas de cada ensaio efectuado (n=4). O software

SIGMASTAT 2.03 foi usado para efectuar a análise estatística. Os dados

experimentais foram inicialmente testados para normalidade e homogeneidade

da variância, de forma a obedecer a requisitos estatísticos e, posteriormente,

com o teste de Tukey (Zar, 1999). As diferenças entre médias foram

consideradas estatisticamente significativas quando p <0.05.


78

RESULTADOS

Figura 1 – Efeitos in vitro de FL 0.1, 0.3, 0.9, 2.7 µM. Os valores encontram-

se expressos em médias ± erro padrão (n=4). As diferenças significativas (p<0.05)

são: # vs Controlo DMSO; 0.1 vs FL 0.1; 0.3 vs FL 0.3; 0.9 vs FL 0.9.

A actividade microsomal hepática de EROD de Anguilla anguilla L.

determinada, após exposição intraperitoneal ao BNF 4mg/Kg, foi de 7.46

pmol.min-1.mg de proteína-1. A actividade da EROD não foi significativamente

afectada pela adição de 5 µl de DMSO ao respectivo meio de reacção.

A exposição in vitro dos microsomas hepáticos de A. anguilla L. às

concentrações mais baixas de FL (0.1 e 0.3 µM) levou a uma forte indução da

actividade de EROD. No entanto, a exposição às concentrações mais elevadas

do referido composto (0.9 e 2.7 µM), resultou na inibição significativa desta

actividade enzimática, quando comparada com Controlo DMSO.


FL 0.1 µM FL 0.3 µM FL 0.9 µM FL 2.7 µM

5,00

10,00

15,00

0,00

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

#

0.1 0.3 0.9 #

0.1 0.3 #

0.1 #

Capítulo IV

79

Figura 2 – Efeitos in vitro de FL 0.1, 0.3, 0.9, 2.7 µM, após exposição a C


diferenças significativas (p<0.05) são: ** vs Controlo DMSO; *** vs Controlo

DMSO+C; 0.1 vs C+FL 0.1; 0.3 vs C+FL 0.3; 0.9 vs C+FL 0.9.

A exposição ao C (22.02 nM), na presença de DMSO, induziu

significativamente a actividade microsomal hepática de EROD, quando

comparado com Controlo DMSO.

A presença de C aumentou de forma significativa a actividade EROD

microsomal hepática no caso da exposição à concentração FL 0.1 µM, em

relação ao Controlo DMSO+C.

A adição de C ao tampão substrato previamente à exposição ao FL 0.3 e

0.9 µM, levou a uma actividade EROD hepática idêntica à que se obteve para

Controlo DMSO+C. Contudo, no que diz respeito à exposição à concentração

mais elevada de FL testada (2.7 µM), a adição de C não evitou a inibição

causada pela referida exposição.

0,00

4,00

8,00

12,00

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

Controlo Cont. DMSO

C+FL 0.1 µM

C+FL 0.3 µM

C+FL 0.9 µM

C+FL 2.7 µM

Cont. DMSO+C

**

***

0.1 0.3 0.9 ***

0.1


80

Figura 3 – Efeitos in vitro de FL 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM sem (TS) e com (TSC)

inclusão de C (22.02 nM) no tampão substrato. Os valores encontram-se expressos

em médias ± erro padrão (n=4). As diferenças significativas (p<0.05) são: ** vs

Controlo DMSO; § entre a ausência e a presença de C, para cada concentração de

FL.

Na figura 3 observa-se que a actividade EROD hepática é

significativamente mais elevada no Controlo contendo DMSO e C quando

comparado com o Controlo contendo só DMSO. Assim, apesar do aumento

significativo da actividade EROD microsomal hepática induzido pelo FL,

verifica-se que esse aumento é significativamente maior para as

concentrações 0.1 e 0.3 de FL sempre que o C é previamente adicionado. A

actividade EROD microsomal hepática começa a ser inibida pela concentração

0.9 de FL a qual se estende à concentração 2.7 de FL. Contudo, o C contido no

TS consegue impedir a acção inibidora dessa concentração 0.9 de FL, o qual é

comprovado pelo facto de não existirem diferenças significativas entre C+FL

0.9 e C+FL 0.3. Apesar da concentração 2.7 de FL inibir substancialmente a

actividade EROD, a acção protectora do C é ainda manifesta mas não tão

potente quanto para a concentração 0.9 de FL.

A medição da actividade EROD microsomal hepática, com (TSC) e sem

(TS) a adição de C ao referido tampão, após exposição ao FL 0.1, 0.3, 0.9 e

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0,00 Controlo Controlo

DMSO FL 0.1 µM FL 0.3 µM FL 0.9 µM FL 2.7 µM

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

TS TSC

§

§

§

§

**

Capítulo IV

81

2.7 µM, demonstra que a inclusão de C no tampão-substrato estimula e

impede significativamente o decréscimo dessa mesma actividade.

Figura 4 – Efeitos in vitro de FL 0.1, 0.3, 0.9, 2.7 µM. Os valores encontram-

se expressos em médias ± erro padrão (n=4). As diferenças significativas (p<0.05)

são: # vs Controlo DMSO; 0.1 vs FL 0.1; 0.3 vs FL 0.3; 0.9 vs FL 0.9.

A actividade microsomal hepática de EROD determinada em Anguilla

anguilla L., foi de 6.85 pmol.min-1.mg de proteína-1, após exposição

intraperitoneal a BNF 4mg/Kg durante 24 horas. A adição de 5 µl de DMSO à

reacção não afectou significativamente a actividade EROD hepática.

A exposição ao FL 0.1 e 0.3 µM, levou a uma indução significativa da

actividade microsomal hepática de EROD quando comparada com Controlo

DMSO. Contudo, a inibição significativa da actividade microsomal hepática de

EROD foi observada após a exposição às concentrações mais elevadas de FL

(0.9 e 2.7 µM), quando comparada com Controlo DMSO.



5,00

10,00

15,00

0,00

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

#

0.1 0.3 0.9 #

0.1 0.3 #

0.1 #


82

Figura 5 – Efeitos in vitro de FL 0.1, 0.3, 0.9, 2.7 µM, após exposição a E2


diferenças significativas (p<0.05) são: ** vs Controlo DMSO; *** vs Controlo+E2;

0.1 vs E2+FL 0.1; 0.3 vs E2+FL 0.3; 0.9 vs E2+FL 0.9.

A actividade EROD microsomal hepática, aumentou significativamente

após exposição in vitro ao E2 (22.02 nM) quando comparada com Controlo

DMSO.

A actividade EROD microsomal hepática na presença de E2 e exposição à

concentração FL 0.1 aumenta significativamente em relação ao Controlo

DMSO+E2. Contudo, as concentrações de 0.3, 0.9 e 2.7 µM de FL, apesar da

exposição prévia ao E2, inibem significativamente a actividade EROD

proporcionalmente ao aumento da concentração de FL, pelo que a inclusão de

E2 no tampão-substrato não evitou a inibição causada pela exposição às

concentrações mais elevadas de FL (0.9 e 2.7 µM).

5,00

10,00

15,00

0,00

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

Controlo Cont. DMSO

E2+FL 0.1 µM

E2+FL 0.3 µM

E2 +FL 0.9 µM

E2 +FL 2.7 µM

Cont. DMSO+E2

**

***

0.1 0.3 0.9 ***

0.1 0.3 ***

0.1 ***

Capítulo IV

83

Figura 6 – Efeitos in vitro de FL 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM sem (TS) e com (TSE2)

inclusão de E2 (22,02 nM) no tampão substrato. Os valores encontram-se expressos

em médias ± erro padrão (n=4). As diferenças significativas (p<0.05) são: ** vs

Controlo DMSO; § entre a ausência e a presença de E2, para cada concentração de

FL.

A actividade EROD aumentou significativamente nos microsomas

hepáticos expostos a DMSO+E2 quando comparado com o Controlo DMSO. A

presença de E2 não afectou de forma significativa a actividade EROD

microsomal hepática após exposição ao FL 0.1 e 0.3 µM. No entanto, a inibição

causada por FL 0.9 e 2.7 µM foi significativamente reduzida sempre que

previamente se administrou E2 à solução tampão-substrato, para uma

concentração final (na cuvette) de 22.02 nM. A inclusão de E2 no tampão-

substrato (TSE2) aumentou significativamente a actividade EROD microsomal

hepática quando comparada com a exposição apenas ao FL 0.9 e 2.7 µM, isto

é, sem a adição prévia de E2 ao referido tampão (TS).



5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

0,00

Act

ivid

ad

e E

RO

D

(pm

ol/

min

/m

g d

e

pro

teín

a)

TS TSE2

§ §

**


84

DISCUSSÃO

Os resultados obtidos neste trabalho mostram que a actividade EROD

microsomal hepática vai aumentando à medida que as concentrações de FL

diminuem. A exposição às concentrações mais baixas (0.1 e 0.3 µM) causou

uma forte indução da actividade EROD microsomal hepática, enquanto que a

exposição às concentrações mais elevadas de FL (0.9 e 2.7 µM) teve o efeito

oposto, levando a uma forte inibição desta actividade enzimática.

Fent e Bätscher (2000), num estudo in vitro, não obtiveram indução

significativa da actividade da EROD na presença de FL, enquanto que Willett

et al., (2001), relatou a inibição in vitro e in vivo em Fundulus heteroclitus da

actividade de EROD, tendo sido sugerido por estes autores que o mecanismo

in vitro de acção parece ocorrer através de inibição enzimática não-

competitiva, enquanto que os resultados in vivo sugerem incapacidade do FL

em se ligar ao RAh e iniciar a transcrição. Já os resultados obtidos por Oliveira

et al. (2007), demonstram que a actividade da EROD foi induzida, em Liza

aurata, após rápida exposição dos microsomas hepáticos a fenantreno 0.3, 0.9

e 2.7 µM, cuja estrutura e peso molecular é similar ao FL. Importa referir que

os dados disponíveis acerca da indução de CYP1A nos peixes, por HAPs de

pequeno tamanho, com 4 ou menos anéis aromáticos fundidos,

disponibilizaram resultados não consensuais, sendo essas respostas

dependentes da espécie testada (Shailaja e D’Silva, 2003). Contudo, é sabido

que vários indutores da síntese de CYP1A (sub família do gene P450) também

podem inibir a actividade catalítica de EROD (Stegeman e Hahn, 1994),

quando presentes em elevadas doses (Haasch et al., 1993).

A concentração de E2 usada baseou-se nos valores plasmáticos de E2

obtidos por Teles et al. (2005) em Sparus aurata L. após 4 horas desta ter

sido adicionada à água dos aquários que continham os espécimes. A mesma

concentração molar foi adoptada para o cortisol de forma a permitir a

comparação entre o efeito do mesmo número de moléculas das duas

hormonas, e de forma a assegurar a uniformidade e coerência das condições

testadas. É reconhecido que as hormonas esteróides fazem parte dos factores

endógenos que têm a capacidade de regular a expressão de CYP1A, contudo

os mecanismos de interacção subjacentes não estão completamente

Capítulo IV

85

estabelecidos (Navas e Segner, 2000). Vários estudos têm demonstrado, in

vivo um efeito inibidor do E2 sobre a actividade de EROD (Vaccaro et al.,

2005; Teles et al., 2005), o que poderá ser explicado pela interferência do E2

ao nível do gene, tendo-se observado da redução da quantidade de proteína e

mRNA associados a CYP1A, após exposição ao referido esteróide (Navas e

Segner, 2001). Contudo, o mecanismo subjacente à inibição da actividade da

EROD na presença de compostos estrogénicos não é completamente conhecido

(Andersson et al., 2007). O aumento significativo da actividade da EROD, após

exposição in vitro dos microsomas hepáticos ao E2, não é pois concordante

com os resultados obtidos em estudos in vivo anteriormente feitos, o que

justifica a necessidade de estudos comparativos adicionais, de forma a se

obter uma melhor compreensão dos efeitos de E2 na expressão de CYP1A,

mais particularmente ao nível da actividade de EROD.

No que diz respeito ao C, a maioria dos estudos tem relatado a rápida

elevação, do nível plasmático de cortisol após breve exposição in vivo a

diferentes contaminantes (Pacheco e Santos, 2001b; Teles et al., 2004),

nomeadamente HAPs (Oliveira et al., 2007), pelo que o nível plasmático de

cortisol pode ser usado como um indicador antecipado da existência de

contaminação aquática (Pacheco e Santos, 2001b). O aumento significativo da

actividade da EROD, após exposição in vitro dos microsomas hepáticos ao C, é

concordante com os resultados anteriormente obtidos em estudos in vivo.

Uma vez que não se obtiveram diferenças significativas entre o Controlo

DMSO e o Controlo sem DMSO, os resultados obtidos in vitro neste

trabalho, sugerem uma acção estimulante/estabilizadora no que se refere ao

papel do C e do E2 no aumento significativo da actividade EROD hepática.

Verificou-se ainda que tanto na presença do C como do E2 (22.02 nM) a

inibição causada pelo FL 0.9 e 2.7 µM, foi significativamente reduzida,

revelando o efeito protector destas duas hormonas esteróides ao nível da

actividade de EROD. Contudo, nem o C nem o E2 demonstraram um efeito

preventivo no que diz respeito à inibição causada pelo FL o que sugere que,

muito provavelmente, a concentração de C e E2 usada (22.02 nM) não foi

suficiente para que tal efeito fosse observável.


86

CONCLUSÕES

- A exposição in vitro dos microsomas às concentrações mais baixas de

fluoranteno - 0.1 e 0.3 µM - levou à indução significativa da actividade EROD

hepática, enquanto que a exposição às concentrações mais elevadas de

fluoranteno - 0.9 e 2.7 µM -, resultou numa forte inibição desta actividade

enzimática. Os resultados sugerem que o fluoranteno apesar de

eventualmente ser um indutor da actividade EROD hepática, quando presente

em elevadas doses, também pode exercer um efeito inibidor sobre esta

actividade enzimática.

- A exposição in vitro ao cortisol e ao 17β-estradiol induziu

significativamente a actividade EROD microsomal hepática, pelo que ambas as

hormonas tiveram um efeito idêntico sobre esta actividade enzimática.

- Tanto na presença do cortisol como do 17β-estradiol (22.02 nM),

verificou-se uma redução significativa dos efeitos inibitórios causados pela

exposição ao fluoranteno 0.9 e 2.7 µM. O cortisol evitou a inibição causada

pelo fluoranteno 0.9 µM. Contudo esta hormona não foi capaz de evitar a

inibição causada pelo fluoranteno 2.7 µM.

- O efeito exercido pelas duas hormonas quando em combinação com o

FL, sobre a actividade EROD hepática, foi distinto. A exposição prévia ao C

aumentou significativamente a actividade EROD microsomal hepática após

exposição ao fluoranteno 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM, enquanto que o E2 só exerceu

efeito idêntico para as concentrações de FL inibidoras (0.9 e 2.7 µM).

Capítulo IV

87


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CAPÍTULO V

Discussão geral

Discussão geral

93

A discussão geral pretende ser uma análise crítica global da tese, uma

vez que cada capítulo inclui uma discussão específica do seu conteúdo.

1. Avaliação genotóxica da Ria de Aveiro

Verificou-se uma elevada frequência de ANEs em espécimes colhidos em

Vagos em todas as estações do ano, à excepção do Outono. De acordo com

um estudo efectuado na mesma área e nas mesmas condições (Pacheco et al.,

2005), foram obtidos resultados similares nas colheitas então efectuadas em

Julho e Setembro de 2000, os quais foram correlacionados com a existência de

elevados níveis de HAPs existentes na água do referido local. A

biotransformação da maior parte dos compostos químicos actua como um

mecanismo de desintoxicação. Contudo, a metabolização dos HAPs origina,

frequentemente, intermediários reactivos altamente tóxicos, mutagénicos, ou

cancerígenos para os peixes (Van der Oost et al., 1994). Assim, após

absorção, os HAPs poderão ser biotransformados no fígado, tornando-se

genotóxicos, o que justificaria o aparecimento de ANEs (Pacheco e Santos,

2001b), como resultado das lesões causadas ao nível do DNA.

A ausência de expressão genotóxica em Vagos no Outono, poderá estar

relacionada com a existência de acções inibitórias resultantes de elevados

níveis de contaminação. Resultados similares foram obtidos por Pacheco et al.

(2005) no mês de Maio, no qual, apesar da existência de elevadas

concentrações de HAPs na água, em Vagos, não se verificou expressão

genotóxica, ao contrário do que seria previsível. A indução de lesões nucleares

pode ser mascarada através de uma acção citotóxica, havendo morte dos

eritrócitos em vez de ocorrer formação de lesões nucleares não-letais (Das e

Nanda, 1986). Das e Nanda (1986) relataram um decréscimo gradual da

frequência de micronúcleos em função do aumento da concentração do

xenobiótico, como consequência, provavelmente, de um efeito inibitório ao

nível da divisão celular, o qual, por sua vez, poderá resultar de uma inibição

da síntese de DNA ou inibição directa da eritropoiese. Para além disso, as

células portadoras de danos/anomalias tendem a ser removidas do organismo

mais rapidamente que as normais (Das e Nanda, 1986).

Capítulo V

94

No seguimento do que anteriormente foi exposto e, com o objectivo de

evitar interpretações erróneas, principalmente resultantes de acções inibitórias

da eritropoiese, recomenda-se fortemente a contagem do número de

eritrócitos adultos e imaturos, assim como a medição da hemoglobina no

sangue por cada eritrócito e a análise complementar dos contaminantes

presentes na água, sedimento e tecidos dos peixes (Pacheco et al., 2005).

Portanto, muito embora os resultados obtidos e o estudo anteriormente

efectuado por Pacheco et al. (2005) sugiram uma relação entre a existência de

HAPs e a elevada expressão genotóxica obtida em Vagos, há que fazer uma

interpretação cautelosa, uma vez que não se efectuou análise à água e ao

sedimento (em 2006/2007).

2. Efeitos in vitro de HAPs e esteróides, isoladamente ou em

conjunto

O BNF é reconhecido como um forte indutor da EROD hepática (Pacheco

e Santos, 1996), pelo que foi usado, neste estudo, como controlo in vivo

positivo da actividade de EROD. A exposição ao referido composto foi feita por

injecção intraperitoneal. Pretendeu-se assim obter uma elevada actividade

EROD microsomal hepática, de forma a observar in vitro possíveis alterações

desta actividade enzimática quando exposta a:

1) diferentes concentrações de benzo[a]pireno (B[a]P) e fluoranteno

(FL);

2) cortisol (C) e 17β-estradiol (E2) (22.02 nM);

3) diferentes concentrações de B[a]P e FL após exposição prévia ao C

ou ao E2.

Verificou-se que o contacto dos microsomas, na cuvette, com os

referidos HAPs e esteróides, isoladamente ou em combinação, pode resultar

em alterações significativas da actividade de EROD.

2.1. Exposição in vitro ao benzo[a]pireno e ao fluoranteno

As concentrações dos HAPs testados in vitro (0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM)

podem ser considerados, de uma forma geral, ecotoxicologicamente

Discussão geral

95

relevantes, atendendo às concentrações que podem ser encontradas em

ecossistemas poluídos (Anyakora et al., 2005).

A exposição in vitro dos microsomas de A. anguilla L. ao B[a]P 0.1, 0.3,

0.9 e 2.7 µM causou uma forte inibição da actividade EROD hepática, o que é

concordante com os resultados obtidos in vitro por Gravato e Santos (2002)

em Dicentrarchus labrax L., tendo sido sugerido por estes autores a

possibilidade de tais resultados se deverem à ocorrência de inibição

enzimática. A inibição da actividade EROD microsomal hepática, em A. anguilla

L., também foi demonstrada após exposição in vitro ao reteno e ácido abiético

(Santos e Maria, 2005), assim como a metais, nomeadamente cobre, zinco e

crómio (Oliveira et al., 2005).

A exposição in vitro ao FL 0.1 e 0.3 µM induziu de forma significativa a

actividade EROD microsomal hepática. Vários estudos têm relatado a indução

da actividade EROD hepática em A. anguilla L., após exposição in vivo a outros

HAPs, tais como reteno (Maria et al., 2002 e 2005) e naftaleno (Maria et al.,

2002; Pacheco e Santos, 2002) assim como ao BNF (Maria et al., 2002;

Pacheco e Santos, 2002) e ácidos resínicos (Maria et al., 2004a e 2004 b;

Pacheco e Santos, 1997). Oliveira et al. (2007) demonstraram igualmente a

indução da actividade EROD hepática, em L. aurata, após exposição in vivo ao

fenantreno.

Santos e Maria (2005) também descreveram a indução da actividade

EROD após exposição in vitro dos microsomas hepáticos de A. anguilla L. ao

ácido desidroabiético.

A exposição in vitro dos microsomas ao FL 0.9 e 2.7 µM inibiu

significativamente a actividade EROD hepática. Contudo, a inibição causada

pelo FL 0.9 e 2.7 µM foi inferior à inibição causada pelas mesmas

concentrações de B[a]P. É sabido que vários indutores da síntese de CYP1A

(sub família do gene P450) também podem inibir a actividade catalítica de

EROD, dependendo essa inibição da concentração utilizada na exposição

(Stegeman e Hahn, 1994). Este tipo de inibição é evidente através da

Capítulo V

96

diminuição da actividade catalítica de CYP1A em microsomas hepáticos de

peixes ou células de peixe expostas a elevadas doses de xenobióticos, tais

como os HAPs (Haasch et al., 1993). Assim, os factos anteriormente

mencionados poderão explicar a indução de EROD observada para as

concentrações mais baixas de FL (0.1 e 0.3 µM) e a inibição verificada para as

concentrações mais elevadas (0.9 e 2.7 µM).

Os resultados obtidos por Fent e Bätscher (2000) demonstraram que a

resposta indutora da EROD mostrou ser fortemente dependente da estrutura

do composto ao qual é exposta. Os resultados obtidos, na presente

dissertação, para o B[a]P e o FL também evidenciam esta dependência. Assim,

a exposição microsomal hepática ao B[a]P e ao FL, não se traduziu no mesmo

tipo de resposta no que respeita à actividade EROD. Os dados disponíveis

referentes à indução de CYP1A em peixes, por HAPs de pequeno tamanho,

com 4 ou menos anéis aromáticos, correspondem a resultados não

consensuais, sendo essas respostas dependentes da espécie animal testada

(Shailaja e D’Silva, 2003). Como tal, e tendo em consideração que os referidos

resultados se referem a estudos in vitro com a Anguilla anguilla L., torna-se

necessário estudos adicionais com outras espécies de forma a validar os

mesmos.

No caso do FL os resultados obtidos incentivam a exploração, em

estudos futuros, de concentrações compreendidas entre 0.3 e 0.9 µM, uma

vez que para 0.9 µM observa-se uma inibição significativa da actividade de

EROD enquanto que para 0.3 µM se observa o oposto, ou seja, um forte

indução.

2.2. Exposição in vitro ao cortisol e 17β-estradiol

É sabido que o sistema endócrino desempenha um papel extremamente

relevante no mecanismo de stress dos peixes, havendo bastante informação

científica acerca da resposta de hormonas esteróides, nomeadamente cortisol

e 17β-estradiol, a situações de stress em diferentes espécies de peixes tais

como Anguilla anguilla L. (Pacheco e Santos, 2001a e 2001b; Santos e

Pacheco, 1996; Santos et al., 2000; Teles et al., 2004b), Dicentrarchus labrax

L. (Teles et al., 2004a e 2006), Sparus aurata L. (Teles et al., 2005) e Liza

Discussão geral

97

aurata (Oliveira et al., 2007). Contudo, pouco é sabido acerca da ligação entre

a resposta de enzimas envolvidas no processo de biotransformação (como por

exemplo a EROD) e a influência deste tipo de hormonas sobre esta actividade

enzimática, in vivo e in vitro. De forma análoga, pouco é sabido acerca dos

níveis fisiológicos celulares destas hormonas e de que forma a sua

biodisponibilidade interfere/influencia a resposta/actividade deste tipo de

enzimas.

A concentração adoptada durante os ensaios in vitro para as duas

hormonas esteróides foi de 22.02 nM e baseou-se no nível plasmático de E2

obtido por Teles et al. (2005) em Sparus aurata L., 4 horas após a adição

deste esteróide à água dos aquários que continham os espécimes. Assim, este

valor foi usado como referência do nível fisiológico celular provável desta

hormona, tendo-se adoptado a mesma concentração para o C de forma a

assegurar a uniformidade e coerência das concentrações testadas e a

possibilitar comparações entre os efeitos produzidos pelos dois esteróides.

A exposição in vitro dos microsomas hepáticos da enguia ao C 22.02 nM

induziu significativamente a actividade de EROD. A maioria dos estudos

laboratoriais (Santos e Pacheco, 1996) e de campo (Pacheco e Santos, 2001b;

Teles et al., 2004, Oliveira et al., 2007) tem descrito a elevação do nível de C

plasmático como uma resposta característica à exposição a compostos

químicos stressantes isolados ou em misturas complexas (Teles et al., 2004),

incluindo HAPs e efluentes da fábrica de pasta de papel, razão pela qual o C é

frequentemente usado como indicador de stress. Os resultados obtidos

sugerem que o C é capaz de regular a expressão de CYP1A. É reconhecido que

as hormonas esteróides fazem parte dos factores endógenos que têm a

capacidade de regular a expressão de CYP1A, contudo os mecanismos de

interacção subjacentes não estão completamente estabelecidos (Navas e

Segner, 2000). Santos et al. (2000), num estudo de cultura de orgãos em A.

anguilla L., também observaram um aumento da actividade hepática de EROD,

quando o cortisol foi adicionado ao meio de cultura.

De acordo com Hontela (1997) nos estudos in vivo, os níveis

plasmáticos de C podem ser afectados por algumas variáveis bióticas (sexo,

Capítulo V

98

predação, confinação, e manuseamento) e abióticas (fotoperíodo, temperatura

e saturação de oxigénio na água). Assim, nos presentes estudos in vitro, as

condições de controlo laboratoriais adoptadas foram cuidadosamente definidas

de forma a evitar interferências significativas nos resultados obtidos.

A exposição in vitro dos microsomas hepáticos de A. anguilla L. ao E2

também se traduziu num aumento da actividade EROD hepática. Vários

estudos têm demonstrado que a exposição in vivo ao E2 afecta a actividade

hepática de CYP1A nos peixes (Navas e Segner, 2001; Vaccaro et al., 2005;

Teles et al., 2005). Contudo, Vaccaro et al. (2005) e Teles et al. (2005)

demonstraram, respectivamente, em Dicentrarchus labrax L. e Sparus aurata

L, in vivo um efeito inibidor do E2 sobre a actividade EROD hepática. De

acordo com Navas e Segner (2001) este efeito inibidor poderá estar

relacionado com a interferência do E2 ao nível do gene, uma vez que estes

autores observaram uma redução da quantidade de proteína e mRNA

associados ao CYP1A, após exposição de hepatócitos de Oncorhynchus mykiss

ao referido esteróide (Navas e Segner, 2001). No entanto, o mecanismo

subjacente ao alegado efeito inbitório de compostos esteróides sobre a

actividade da EROD não é completamente conhecido (Andersson et al., 2007;

Navas e Segner, 2001).

Contudo, este estrogénio natural (E2) pode também, ser considerado um

contaminante aquático. Durante as últimas décadas tem-se verificado um

aumento significativo das concentrações de E2 no meio aquático,

principalmente em zonas urbanas, sendo os seus níveis na água na ordem das

ng/L, podendo atingir 200 ng/L (Bowman et al., 2000). Este facto aliado à sua

capacidade de causar alterações endócrinas nos organismos, revelou a

necessidade de uma avaliação efectiva da toxicidade deste estrogénio natural

como potencial contaminante do meio aquático (Kramer et al., 1998). Assim,

vários estudos têm sido realizados in vivo, neste âmbito, em Sparus aurata L.

(Teles et al., 2005) e Dicentrarchus labrax L. (Teles et al., 2004a; Teles et al.,

2006). Teles et al. (2007) num estudo in situ realizado numa lagoa de água

doce (Pateira de Fermentelos) sujeita a vários tipos de contaminantes

antropogénicos, encontrou elevados níveis de E2 (na ordem das 150/180 ng/L)

no plasma de Anguilla anguilla L., em dois dos cinco locais de exposição

Discussão geral

99

seleccionados para o referido estudo. Apesar de não ter sido levada a cabo a

determinação de E2 na água dos locais de exposição de Anguilla anguilla L. na

Pateira, os elevados níveis de E2 encontrados no plasma desta espécie, foram

coincidentes com a medição de níveis elevados de nitritos, os quais constituem

um indício da existência de decomposição parcial de matéria orgânica

resultante de descargas antropogénicas.

A exposição in vitro dos microsomas hepáticos da enguia ao C e ao E2

levou, portanto, a um aumento da actividade EROD microsomal hepática, pelo

que o efeito dos dois esteróides sobre esta actividade enzimática foi idêntico.

2.3. Exposição in vitro ao benzo[a]pireno e ao fluoranteno em

combinação com o cortisol ou 17β-estradiol.

A exposição in vitro ao C e ao E2, quando combinados com B[a]P,

levou ao aumento significativo da actividade EROD microsomal hepática

quando comparada com a exposição in vitro apenas ao B[a]P. Assim, foi

possível verificar uma redução significativa dos efeitos inibitórios causados

pelo B[a]P como consequência da exposição prévia, na cuvette, dos

microsomas hepáticos aos referidos esteróides. O efeito sequencial exercido

pelo C e/ou E2 com o B[a]P, sobre a actividade EROD hepática, foi idêntico.

Contudo, nem o C nem o E2 foram capazes de evitar a inibição causada pelas

diferentes concentrações de B[a]P.

O contacto dos microsomas hepáticos com o C, previamente à exposição

ao FL 0.1, 0.3, 0.9 e 2.7 µM, levou à elevação significativa da actividade

EROD quando comparado com a exposição apenas ao FL. No caso do E2

apenas se verificou o aumento significativo da actividade EROD microsomal

hepática aquando da exposição in vitro ao referido esteróide em combinação

com FL 0.9 e 2.7 µM, uma vez que presença de E2 não afectou de forma

significativa a actividade EROD microsomal hepática após exposição ao FL 0.1

e 0.3 µM. Assim, o efeito exercido pelo C e pelo E2 quando em combinação

com o FL, sobre a actividade EROD hepática, foi distinto. No entanto, foi

Capítulo V

100

possível observar uma redução significativa dos efeitos inibitórios causados

pelo FL 0.9 e 2.7 µM, como consequência da exposição prévia, na cuvette, dos

microsomas hepáticos aos referidos esteróides. Os dois esteróides (C e E2)

demonstraram, portanto, exercer um efeito protector sobre a actividade EROD

hepática, o que demonstra a capacidade que os mesmos têm de regular a

expressão de CYP1A, nomeadamente a sua actividade catalítica. Contudo, os

mecanismos subjacentes a esta interacção ainda não foram completamente

estabelecidos (Navas e Segner, 2000).

O C foi mesmo capaz de evitar a inibição da actividade EROD hepática

causada pelo FL 0.9 µM ao contrário do E2, que não evitou a inibição desta

actividade enzimática quando exposta ao FL 0.9 e 2.7 µM.

Gravato e Santos (2002), num estudo in vitro obtiveram resultados

semelhantes com naftaleno 2.7 µM, uma vez que, na presença deste

composto, a inibição causada por B[a]P 0.1 e 0.01 µM na actividade

microsomal hepática de EROD também decresceu, o que indicia que de

alguma forma o naftaleno tal como o C e o E2, também atenua o efeito

inibitório de B[a]P. O naftaleno, tal como o C foi mesmo capaz de evitar a

inibição causada pelo B[a]P 0.01 µM.

3. Considerações finais e perspectivas futuras

Os ensaios efectuados com base nos microsomas hepáticos isolados a

partir do fígado de Anguilla anguilla L. demonstraram grande utilidade, no que

respeita ao fornecimento de informação relevante sobre o efeito in vitro de

dois HAPs ubíquos nos ambientes aquáticos sobre a actividade EROD hepática,

assim como acerca da protecção desta actividade enzimática conferida pelo

cortisol e pelo 17β-estradiol. Os resultados da avaliação da actividade EROD

hepática obtidos confirmam a importância da estrutura dos HAPs, da

respectiva concentração molar e ainda das condições fisiológicas do indivíduo

ao longo da sua vida e/ou das condições do respectivo ensaio, vindo ainda

reforçar a necessidade de estudos adicionais in vitro que possibilitem uma

melhor compreensão acerca da influência e efeito protector que as hormonas

esteróides poderão exercer sobre este tipo de enzimas, de forma a permitir

Discussão geral

101

estabelecer uma ligação entre a regulação endócrina e a resposta de

determinadas enzimas envolvidas no processo de biotransformação,

nomeadamente a EROD.

Os resultados obtidos incentivam ainda à realização de estudos adicionais

que avaliem a influência do C e do E2, sobre a actividade EROD microsomal

hepática, quando exposta a outros HAPs (individualmente e/ou em misturas) e

a metais pesados. Para as mesmas condições estabelecidas e descritas nos

capítulos III e IV, é igualmente interessante e pertinente proceder a estudos

adicionais que contemplem outras concentrações de C e de E2.


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Carla Sofia dos Santos Estudos e in vivo em peixes da Ria ... · Carla Sofia dos Santos Ferreira ... Ao Prof. Doutor Mário Pacheco agradeço o facto de ter aceite a co-orientação