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FURG Tese de Doutorado Impacto do uso de fungicidas na produção de Ocratoxina A por Aspergillus carbonarius e na fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae. ___________________________________ Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil 2019

Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

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FURG

Tese de Doutorado

Impacto do uso de fungicidas na produção de Ocratoxina A por

Aspergillus carbonarius e na fermentação alcoólica por

Saccharomyces cerevisiae.

___________________________________

Carmen Luiza de Azevedo Costa

PPGQTA

Rio Grande, RS - Brasil

2019

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Impacto do uso de fungicidas na produção de Ocratoxina A por

Aspergillus carbonarius e na fermentação alcoólica por

Saccharomyces cerevisiae.

por

Carmen Luiza de Azevedo Costa

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Química Tecnológica e Ambiental da Universidade Federal

do Rio Grande (RS), como requisito parcial para obtenção

do título de DOUTOR EM QUÍMICA.

PPGQTA

Rio Grande, RS - Brasil

2019

Rio Grande, Dezembro de 2019.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente, a Deus por ter me dado forças para que eu conseguisse chegar

até aqui e por me proporcionar a alegria de realizar os meus sonhos.

Aos meus pais, Fátima e Luiz, por constituírem minha base me ensinando o

caminho do bem e também a sempre lutar pelos meus objetivos e sonhos. Essa vitória

também é de vocês.

Ao meu companheiro de vida Cleiton, te agradeço imensamente por tudo, por

estar sempre ao meu lado nos momentos bons e ruins, me apoiando e me fazendo

acreditar que é possível realizar os nossos sonhos, aturando todo o estresse que é

essa vida acadêmica. Sempre dizendo “Vai dar tudo certo”. Te Amo Muito!!!

A todos os meus familiares amados, meus irmãos Marcelo e Luizy, minha

madrasta Paula, meu padrasto Claudio, minha cunhada Tati e meus sobrinhos que

amo muito, Marina e Lorenzo. Muito obrigada por todo apoio e pelas palavras de

incentivo sempre me desejando o bem!!

Aos meus queridos amigos Daia, Diego, Giselle e Rita obrigada por todo apoio e

por fazerem parte da minha vida!!!

À minha orientadora Jaqueline, por ter aceitado me orientar mesmo sem me

conhecer. Agradeço pela orientação, pelos conselhos, incentivo e ensinamentos ao

longo dessa jornada. Te agradeço também pelos momentos de descontração e pela

confiança em mim depositada.

À professora Eliana te agradeço pela receptividade, dedicação e empenho

depositado no seu trabalho no laboratório, sempre pronta para solucionar nossas

dúvidas.

A Maristela por todo ensinamento e coleguismo ao longo dessa trajetória, te

agradeço por tudo.

Aos colegas de laboratório agradeço ao Maicon por toda a amizade

desenvolvida ao longo desses quatro anos, pelos momentos de alegria e descontração

vividos no laboratório. A minha amiga Elisa parceira de disciplinas, laboratório e

estudos, sempre pronta para ajudar, te agradeço muito. A Eliza e a Carol que estavam

sempre dispostas para ajudar nos experimentos e também por todos os momentos

alegres vividos no laboratório. A Ane te agradeço muito, pelas nossas conversas,

conselhos e por estar sempre pronta para me ouvir.

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Aos demais colegas, agradeço a Kelly, Sabrina, Karen, Ana, Marcy, Verônica,

Fran, Cíntia, Rafa, Wesclen, Diean e Chicão por toda parceria no laboratório, pelos

momentos de aprendizagem e também nos momentos de descontração.

Aos professores, funcionários e colegas do Programa de Pós Graduação em

Química Tecnológica e Ambiental – FURG, pela convivência e ensinamentos ao longo

dessa caminhada.

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS......................................................................................................vii

LISTA DE TABELAS........................................................................................................ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ................................................................. xivii

RESUMO..................................................................................................................... xviv

ABSTRACT.....................................................................................................................xv

ii

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................1

2. OBJETIVOS..................................................................................................................4

2.1 OBJETIVO GERAL.....................................................................................................4

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................................4

3. REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................5

3.1 UVAS E VINHOS NO BRASIL....................................................................................5

3.2 MICOTOXINAS ..........................................................................................................8

3.3 OCRATOXINA A.......................................................................................................10

3.3.1 Ocorrência de ocratoxina A em uvas e vinhos......................................................11

3.4 TÉCNICAS PARA O CONTROLE DE OTA EM UVAS E VINHOS..........................13

3.5 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E DETECÇÃO DE OTA..............................................16

3.6 FUNGICIDAS............................................................................................................20

3.6.1 Modo de ação dos fungicidas................................................................................23

4. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................25

4.1 Reagentes, solventes e Material..............................................................................25

4.1.1 Equipamentos.......................................................................................................26

4.2 MÉTODOS...............................................................................................................26

4.2.1 Preparo das soluções............................................................................................26

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4.2.2 Ocorrência de OTA no vinho.................................................................................28

4.2.2.1 Amostragem.......................................................................................................28

4.2.2.2 Extração Quantificação de Micotoxina no vinho.................................................28

4.2.2.3 Validação do Método..........................................................................................29

4.2.2.4 Estimativa de ingestão de OTA pelo consumo de vinho....................................31

4.2.3 Crescimento fúngico de Aspergillus carbonarius e manifestação toxigênica........31

4.2.3.1 Avaliação do crescimento fúngico......................................................................32

4.2.3.2 Produção de OTA no meio de cultura PDA........................................................33

4.2.4 Efeito da micotoxina OTA e dos fungicidas cresoxim metílico e famoxadona na

fermentação alcoólica.....................................................................................................34

4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo............................................................................34

4.2.4.2 Condições de cultivo...........................................................................................34

4.2.4.3 Determinações tecnológicas no fermentado: acidez, etanol, açúcar redutor,

proteínas e MEV.............................................................................................................35

4.2.4.4 Determinações bioquímicas no fermentado: concentração celular, atividade

enzimática da peroxidase, produção de glutationa e concentração de OTA ................36

4.2.4.5 Parâmetros cinéticos..........................................................................................37

4.2.5 Limpeza de vidraria e tratamento de resíduos......................................................38

4.2.6 Análise Estatística.................................................................................................39

5. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS..........................................40

5.1 ESTUDO DA OCORRÊNCIA DE OTA EM VINHO..................................................40

5.2 ESTUDO DO POTENCIAL TOXIGÊNICO EM PRESENÇA DOS FUNGICIDAS...43

5.2.1 Crescimento micelial e conteúdo de glicosamina..................................................43

5.2.2 Produção de ocratoxina A pelo fungo Aspergillus carbonarius.............................47

5.3 EFEITO DA MICOTOXINA OTA E DOS FUNGICIDAS CRESOXIM METÍLICO E

FAMOXADONA NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA .....................................................52

5.3.1 Alterações bioquímicas: produção de biomassa, atividade enzimática da

peroxidase, produção de glutationa e concentração de OTA.........................................52

5.3.2 Alterações tecnológicas: acidez, etanol, açúcar redutor, proteínas e MEV...........57

6.CONCLUSÕES............................................................................................................65

7.SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS..........................................................66

8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................67

9. ANEXOS.....................................................................................................................98

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mapa da distribuição da produção de uva no Brasil.......................................5

Figura 2: Processo de fabricação do vinho tinto .............................................................6

Figura 3:Estrutura química das principais Ocratoxinas.................................................11

Figura 4:Estrutura química do fungicida cresoxim-metílico...........................................21

Figura 5: Estrutura química do fungicida famoxadona..................................................22

Figura 6: Célula fúngica com o local de atuação dos fungicidas no complexo III da

cadeia transportadora de elétrons, localizada nas cristas mitocondriais........................24

Figura 7: Dados do crescimento micelial durante 7 dias de tratamento........................43

Figura 8: Crescimento micelial durante 7 dias de tratamento.......................................44

Figura 9: Inibição do crescimento micelial nos tratamentos com os fungicidas durante 7

dias de tratamento.......................................................................................................44

Figura 10: Crescimento micelial (cm) e o conteúdo de glicosamina (mg g-1) no grupo

controle sem fungicida (A), e nos grupos de tratamento cresoxim-metílico

(1000 µg mL -1) (B) e famoxadona (600 µg mL -1) (C)..................................................47

Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA no meio

BDA, no grupo controle..................................................................................................47

Figura 12: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA no meio

BDA, no grupo tratado com famoxadona.......................................................................48

Figura 13: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA no meio

BDA, no grupo tratado com cresoxim-metílico...............................................................48

Figura 14: Crescimento do halo fúngico, produção de Ocratoxina A pelo fungo

Aspergillus carbonarius e relação entre produção de OTA e crescimento fúngico no

grupo controle sem fungicida (A), e nos grupos de tratamento cresoxim-metílico

(1000 µg mL -1) (B) e famoxadona (600 µg mL -1) (C)...................................................49

Figura 15: Imagens obtidas por MEV das células de Sacharomices cerevisiae em 96h

de fermentação alcoólica em todos os cultivos..............................................................63

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Toxinas fúngicas de maior ocorrência em alimentos.....................................10

Tabela 2. Ocorrência de ocratoxina A em vinho............................................................12

Tabela 3. Curvas de calibração de OTA no solvente e na matriz, LOD e LOD de OTA

em vinho e recuperação em três níveis de OTA em vinho.............................................40

Tabela 4. Dados da ocorrência de OTA em 50 amostras de vinho tinto, 31 do tipo seco

e 19 do tipo suave, obtidos no estado do Rio Grande do Sul........................................41

Tabela 5: Crescimento do halo (cm) e conteúdo de glicosamina no grupo controle sem

a presença de fungicida e nos grupos de tratados com os fungicidas cresoxim-metílico

e famoxadona.................................................................................................................46

Tabela 6: Produção de Ocratoxina A pelo fungo Aspergillus carbonarius no grupo

controle sem a presença de fungicida e nos grupos de tratamento com a presença dos

fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona...................................................................49

Tabela 7: Dados de inibição da produção de micotoxinas (IMM), dados de inibição do

crescimento micelial (IMG) e os dados de inibição específica da produção de

micotoxinas por grama de fungicida na placa de cultura (IMM Esp./Fungicida)............50

Tabela 8: Concentração celular (mg mL-1) de cultivos realizados com Saccharomyces

cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos fungicidas

cresoxim-metílico e famoxadona e no controle sem contaminantes..............................53

Tabela 9: Relação entre a concentração de ocratoxina A (OTA) e a produção de

glutationa (GSH) e a atividade da enzima peroxidase (PO) nos cultivos realizados com

Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de contaminantes

orgânicos........................................................................................................................54

Tabela 10: Valores da produção de glutationa (GSH) e a atividade da enzima

peroxidase (PO) nos cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de

cultura sintético na presença de contaminantes orgânicos e grupo controle sem

contaminantes................................................................................................................57

Tabela 11: Monitoramento do pH no meio de cultivo na presença de OTA e dos

fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona e controle sem contaminantes, ao longo de

96h de fermentação alcoólica submersa pela levedura Saccharomyces cerevisiae......58

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Tabela 12: Concentração de açúcar redutor (mg mL-1) de cultivos realizados com

Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de cresoxim-

metílico, famoxadona, OTA e controle sem contaminantes...........................................58

Tabela 13: Velocidade específica máxima de crescimento (µ max) dos cultivos

realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de

OTA e dos fungicidas cresoxim-metílico, famoxadona e controle sem contaminantes..59

Tabela 14: Concentração de proteínas (mg mL-1) nos cultivos realizados com

Saccharomyces cerevisae em meio de cultura sintético na presença de contaminantes

orgânicos e grupo controle sem contaminantes.............................................................60

Tabela 15: Produção de etanol obtido durante o cultivo submerso com a

Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de contaminantes

orgânicos e grupo controle sem contaminantes.............................................................61

Tabela 16: Fatores de conversão obtidos durante o cultivo de Saccharomyces

cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de contaminantes orgânicos e

grupo controle sem contaminantes.................................................................................62

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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ε-Absortividade molar

ACN –Acetonitrila

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AOAC – Association of Official Analytical Chemists

ATP -Adenosina Trifosfato

BOD- câmara germinativa

DTNB- 5,5`-dithiobis-2-nitrobenzoic acid

GC- Cromatografia Gasosa

GSH- glutationa

HPLC- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de Fluorescência, do

inglês High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detection

IARC – Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer, do inglês International

Agency for Research on Cancer

IMM- Inibição da Produção de Micotoxinas

IMG- Inibição do Crescimento Micelial

IMM esp.- Inibição específica da Produção de Micotoxinas por grama de fungicida na

placa de cultura

LLE – Extração Líquido-Líquido, do inglês Liquid-Liquid Extraction

LMT – Limite Máximo Tolerado

LOD – Limite de Detecção, do ingês Limit of Detection

LOQ – Limite de Quantificação, do inglês Limit of Quantification

OTA – Ocratoxina A

OTB- Ocratoxina B

OTC- Ocratoxina C

OTα- Ocratoxina α

OTβ- Ocratoxina β

pH – Potencial hidrogeniônico

PDA- Agar Potato Dextrose

PO- Peroxidase

Qol- inibidores da quinona oxidase

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Qo - Quinona oxidase

QuEChERS – Rápido, Fácil, Barato, Eficiente, Robusto e Seguro, do ingês Quick,

Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe

R – Recuperação

RPM- Rotações Por Minuto

RSD – Desvio Padrão Relativo, do inglês Relative Standard Deviation

SPE- Extração em Fase Sólida, do inglês Solid-Liquid Extraction

tR – Tempo de Retenção

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RESUMO

Título: Impacto do uso de fungicidas na produção de Ocratoxina A por

Aspergillus carbonarius e na fermentação alcoólica por Saccharomyces

cerevisiae.

Autor: Carmen Luiza de Azevedo Costa

Orientador: Prof. Dra. Jaqueline Garda Buffon

A contaminação por fungos do gênero Aspergillus é frequente em uvas, apresentando espécies produtoras de micotoxinas, que são metabólitos secundários que apresentam amplo espectro de toxicidade, baixa massa molar, termoestabilidade e atuam em baixas concentrações. Dentre as principais espécies toxigênicas encontradas em uvas está o Aspergillus carbonarius que pode produzir Ocratoxina A (OTA). Para limitar a contaminação fúngica em uvas são empregados os fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona, que por sua vez, podem afetar a produção de micotoxinas pelas espécies toxigênicas, além da sua ação residual nas frutas e derivados. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de cresoxim-metílico e famoxadona na manifestação toxigênica do Aspergillus carbonarius, além do efeito destes fungicidas e da OTA na ação da levedura Saccharomyces cerevisiae durante a fermentação alcoólica. Primeiramente foi validado o método QuEChERS para a extração e HPLC-FL para determinar OTA em 50 amostras comerciais de vinho tinto do Rio Grande do Sul. Depois foi avaliado, in vitro, o efeito do uso dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona nas concentrações de 1000 µg mL-1 e 600 µg mL-1, respectivamente, sobre o potencial toxigênico de Aspergillus carbonarius. Por fim foi determinada a influência da ocorrência destes fungicidas e da OTA nas concentrações de 2 e 4 µg L-1, durante a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae em meio sintético. A OTA foi detectada em 86% das amostras em uma faixa de concentração entre 0,45 e 4,65 µg L-1, cuja média foi de 1,63 µg L-1. Os fungicidas foram eficazes para reduzir o crescimento fúngico em até 70%, embora tenham desencadeado o potencial toxigênico. Durante a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae, na presença dos fungicidas e OTA, foram observadas alterações às 48 h de fermentação, ocorrendo a maior redução de micotoxina nos cultivos expostos a OTA. Os cultivos coexpostos a micotoxina e aos fungicidas apresentaram redução de OTA ao longo das 96 h de fermentação, estando diretamente relacionada ao aumento da atividade da enzima peroxidase, produção de glutationa e da síntese proteica. Todos os cultivos na presença de fungicidas e OTA apresentaram menor produção de etanol e alterações morfológicas na parede celular da levedura. Portanto, o uso de fungicidas pode contribuir com o controle fúngico, no entanto, afeta o potencial toxigênico do fungo aumentando sua produção de OTA em uvas, alterando o metabolismo da levedura durante a fermentação alcoólica. Palavras-chave: Uva, micotoxina, fungicida, estrobilurinas e oxazolidinones.

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ABSTRACT

Title: Impact of fungicide use on Ochratoxin A production by Aspergillus

carbonarius and alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae.

Author: Carmen Luiza de Azevedo Costa

Advisor: Prof. Dra. Jaqueline Garda Buffon

Contamination by Aspergillus fungi is frequent in grapes with mycotoxin producing species, which are secondary metabolites that have a broad spectrum of toxicity, low molar mass, thermostability and act at low concentrations. Among the main toxigenic species found in grapes is Aspergillus carbonarius which can produce Ocratoxin A (OTA). To limit fungal contamination in grapes, cresoxim-methyl and famoxadone fungicides are used, which in turn can affect the production of mycotoxins by toxigenic species, as well as their residual action on fruits and derivatives. The objective of this study was to evaluate the effect of cresoxim-methyl and famoxadone fungicides on the toxigenic manifestation of Aspergillus carbonarius, as well as their effect and OTA on the action of Saccharomyces cerevisiae yeast during alcoholic fermentation. Firstly, a QuEChERS method for extraction and HPLC-FL to validate OTA in 50 commercial samples of Rio Grande do Sul red wine was validated. Then, in vitro, the effect of the use of cresoxim-methyl and famoxadone on the concentrations of 1000 µg mL-1 and 600 µg mL-1, respectively, on the toxigenic potential of Aspergillus carbonarius. Finally, the influence of the occurrence of these fungicides and OTA at concentrations of 2 and 4 µg L-1 was determined during alcoholic fermentation. Saccharomyces cerevisiae in synthetic medium. OTA was detected in 86% of the samples in a concentration range between 0.45 and 4,65 µg L-1, with a mean of 1,63 µg L-1. Fungicides were effective in reducing fungal growth by up to 70%, although they triggered the toxigenic potential. During alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae, in the presence of fungicides and OTA, changes were observed at 48h of fermentation, with the largest reduction of mycotoxin in crops exposed to OTA. Cultures coexposed with mycotoxin and fungicides showed reduction of OTA throughout the 96h of fermentation. All reductions were directly related to increased peroxidase enzyme activity, glutathione production and protein synthesis. All crops presented lower ethanol production and morphological changes in the yeast cell wall. Therefore, the use of fungicides may contribute to fungal control; however, it affects the fungal toxigenic potential by increasing its OTA production in grapes, altering yeast metabolism during alcoholic fermentation. Keywords: Grape, mycotoxin, fungicide, strobilurins and oxazolidinones.

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1. INTRODUÇÃO

A contaminação fúngica é uma das principais causas de perda econômica no

setor de viticultura, causada principalmente por fungos do gênero Aspergillus, que

possuem algumas espécies produtoras de micotoxinas (ABARCA et al., 2019). Este

setor destaca-se no estado do Rio Grande do Sul que, neste ano de 2019 atingiu a

produção de 614,3 milhões de kg de uvas (IBRAVIN, 2019). O consumo de uvas se dá

na forma in natura e processada (WANG et al., 2017) e sua qualidade é afetada por

diferentes variáveis nas fases de amadurecimento e pós a colheita (POZZAN et al.,

2015).

A contaminação fúngica e por micotoxinas pode ocorrer da pré-colheita ao

armazenamento (SHI et al., 2018). As micotoxinas apresentam amplo espectro de

toxicidade, baixa massa molar, termoestabilidade e atuação em baixas concentrações

(ZAIN, 2011). O consumo de alimentos contaminados diminui a expectativa média de

vida da população gerando um problema global (MARTINS et al., 2012). Dentre as

micotoxinas as aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos, zearalenona, fumonisinas e os

alcaloides de ergot destacam-se como as de maior importância na saúde pública e na

agroeconomia (KÖPPEN et al., 2010).

As ocratoxinas correspondem a um grupo de metabólitos secundários

produzidos principalmente por fungos de dois gêneros: Penicillium e Aspergillus.

Aspergillus carbonarius é uma das principais espécies de fungos toxigênicos que

produzem Ocratoxina A (OTA) em uvas (ZHANG et al., 2017). Esta toxina é

considerada nefrotóxica, hepatotóxica, genotóxica, teratogênica e imunotóxica a

animais (PATHARAJAN et al., 2011) e classificada de acordo com a Agência

Internacional de Pesquisa sobre o Câncer, como um possível carcinógeno humano

(grupo 2B) (IARC, 1993).

Devido a sua estabilidade térmica, estudos relatam a ocorrência de OTA em

diversos gêneros alimentícios e bebidas, como: cereais, café, vinho, frutos secos,

cervejas e suco de uva (ZHU et al., 2015). A primeira ocorrência de OTA em vinhos foi

descrita por Zimmerli e Dick (1996), seguindo-se por outros autores (LEE et al., 2012;

TERRA et al., 2012; CAO et al., 2013; DI STEFANO et al., 2015; DE JESUS et al.,

2017; ARRÚA et al., 2019; SILVA et al., 2019; ZURGA et al., 2019).

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Com o elevado índice de ocorrência de OTA em matrizes alimentares a ANVISA

(2011) por meio da RDC n.° 7/2011, estabeleceu o limite máximo de 2 µg OTA Kg-1

para vinhos, sucos e polpa de uva. Esse mesmo limite é adotado em países da União

Europeia (COMISSION EUROPEAN, 2006).

O estabelecimento dos limites máximos toleráveis contribui para o conhecimento

da qualidade dos alimentos ingeridos pela população. Entretanto, devido à

complexidade das micotoxinas, a determinação destes analitos não é fácil e consiste

em três etapas principais: a extração do analito; a limpeza (“clean up”) e a detecção e

quantificação por instrumentos analíticos de alta sensibilidade. Para a limpeza

destacam-se a utilização de extração em fase sólida (SPE) e a extração líquido-líquido

(LLE). Para a separação destacam-se a cromatografia gasosa (GC) e também a

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detector de fluorescência quando

relacionado à OTA (BADIALE-FURLONG, 2008; TURNER, SUBRAHMANYAM,

PILETSKY, 2009).

Com o objetivo de prevenir a contaminação fúngica e a possível ocorrência de

micotoxinas em matrizes alimentares os fungicidas são utilizados durante a

produtividade agrícola. Entre os fungicidas utilizados na viticultura estão o cresoxim-

metílico e famoxadona, os quais afetam processos fermentativos, modificando a ação

das leveduras, causando desde lentas fermentações até a alteração na concentração

de compostos fenólicos e na produção de álcoois (GONZALEZ-ALVAREZ et al., 2012;

DORNELLAS et al., 2013; BRIZ-CID et al., 2014; NOGUEROL-PATO et al., 2014;

MULERO et al., 2015).

Assim, além da possibilidade das uvas estarem contaminadas com fungicidas e

micotoxinas, representando um risco ao consumidor, a ocorrência destes

contaminantes, também podem afetar a ação microbiana durante processos

fermentativos, resultando em produtos com a qualidade alterada (GONZÁLEZ-

ÀLVAREZ et al., 2012).

Portanto, devido à importância do conhecimento da qualidade do vinho ingerido

pela população e também a carência de estudos sobre os efeitos desses fungicidas na

viticultura e durante o processo de fabricação do vinho, considerou-se, neste estudo,

que o uso dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona podem afetar a manifestação

toxigênica do fungo Aspergillus carbonarius, que contaminam as culturas de uva, com

consequente ocorrência de vinhos contaminados com OTA. Além disso, a presença de

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resíduos dos fungicidas e da OTA podem alterar o processo fermentativo por

Saccharomyces cerevisiae e consequentemente a qualidade do produto fermentado.

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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar os efeitos do uso de cresoxim-metílico e famoxadona sobre o potencial

toxigênico de Aspergillus carbonarius, assim como a influência destes fungicidas e

da OTA na ação da levedura Saccharomyces cerevisiae durante a fermentação

alcoólica.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar a ocorrência de OTA em vinho tinto empregando método

validado para esta matriz;

Avaliar o potencial toxigênico de Aspergillus carbonarius em presença

dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona;

Caracterizar a fermentação alcoólica quanto à influência de cresoxim-

metil, famoxadona e OTA nos parâmetros cinéticos da levedura

Saccharomyces cerevisiae.

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3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1 UVAS E VINHOS NO BRASIL

A viticultura no Brasil teve início no ano de 1532, mas apenas no ano de

1875, devido à imigração italiana, teve seu início no estado do Rio Grande do Sul.

Os imigrantes trouxeram mudas de videiras europeias que se adaptaram muito

bem a região, porém devido a doenças fúngicas foram extintas. Então outras

variedades de uvas já cultivadas no país predominaram nos parreirais da região sul

(NIEDERLE, VITROLLES, 2010).

O cultivo de uvas no Brasil ocupa uma área aproximada de 78 mil hectares,

desde o extremo sul até regiões próximas ao equador, estabelecendo à base da

sustentação agroindustrial de algumas regiões do país (Figura 1) (IBRAVIN, 2019);

devido ao clima temperado, a produção é mais expressiva na região sul e sudeste.

As uvas estão entre as frutas de maior consumo sob a forma in natura ou

processada como vinhos, sucos, geleias entre outros. No entanto, as fases de

amadurecimento e pós-colheita são afetadas pelo elevado índice de perecibilidade,

o que afeta a qualidade sensorial e nutricional da uva e seus derivados (VANZELA,

BAFFI e SILVA, 2015).

Figura 1- Mapa da distribuição da produção de uva no Brasil.

Fonte: IBRAVIN, 2019.

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Metade da produção de uvas no Brasil é destinada a produção do vinho

(EMBRAPA, 2017). No estado do Rio Grande do Sul concentra-se 90% da

produção nacional de vinhos, com uma pequena porcentagem sendo produzida em

Santa Catarina, Pernambuco, Minas Gerais e Bahia, atingindo no ano de 2018 a

produção de 664.205.024 kg de uvas e 257.082.856 L de vinho (UVIBRA, 2018). A

ampla variedade disponível no mercado, juntamente com a divulgação dos

benefícios do vinho a saúde, faz com que a procura pelo vinho seja elevada;

apresentando no ano de 2018 um aumento 15,9% em seu consumo (IBRAVIN,

2019).

O vinho segundo a regulamentação brasileira é resultante do processo de

fermentação alcoólica da uva fresca ou do mosto, gerando um produto com um

conteúdo médio de 12% (v.v-1 a 20 °C) grau alcoólico. O processo de fermentação

alcoólica é catalisado por um conjunto de reações que determinam as

características aromáticas do vinho (LASRAM et al., 2012) e que são classificados

de acordo com seu processo de fermentação como vinho tinto, vinho rosado e

vinho branco (MAPA, 1988).

Na Figura 2 estão esquematizadas as etapas de fabricação do vinho, com

ênfase para o esmagamento, fermentação, decantação e engarrafamento.

Figura 2- Processo de fabricação do vinho tinto

Fonte: IVDP, 2018.

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Após a colheita e o recebimento, as uvas são higienizadas e ocorre o

desengace para separar o engaço do recipiente de fermentação. A presença dos

engaces resulta em grande liberação de tanino, gerando sensação adstringente e

herbácea ao vinho (MANFROI et al., 2010).

Logo após é realizado o esmagamento das uvas com o objetivo de romper a

película da baga para liberar o suco contido, neste momento se dá o início da

fermentação alcoólica. Esse procedimento promove a extração de antocianinas

presentes nas cascas das uvas gerando a coloração do vinho tinto. Após as uvas

com suas partes líquidas e sólidas são encaminhadas para o tanque de

fermentação (DALL et al.,2014).

Nesta etapa ocorre a adição de ácido sulforoso que possui ação bactericida,

antioxidante e conservante, evitando a proliferação de micro-organismos

responsáveis pela oxidação do vinho. Grande parte do dióxido de enxofre gerado é

liberado durante a fermentação alcoólica (EMBRAPA,2007).

Embora a fermentação possa ser realizada pela flora levuriana nativa,

recomenda-se a utilização de levedura selecionada, para garantir a uniformidade

da fermentação alcoólica (DUARTE et al., 2010). Na Equação 1 esta apresentada a

reação que ocorre durante a fermentação alcoólica, nesse período a levedura

Saccharomyces cerevisiae é responsável pela transformação dos açúcares do

mosto em etanol, gás carbônico, energia e outros compostos como: glicerol, ácido

succínico, ácido acético, ácido lático e ésteres, os quais são importantes na

qualidade sensorial do vinho (VANZELA, BAFFI e SILVA, 2015).

C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + Energia (1)

O processo de vinificação em vinho tinto ocorre em temperaturas entre 26 °C

a 30 °C, ocorrendo liberação de calor em média de 1 °C a cada 17 g L-1 de açúcar.

Temperaturas elevadas ocasionam a proliferação de micro-organismos

contaminantes, gerando danos ao produto final. A manutenção da faixa de

temperatura ideal é importante para o rendimento alcoólico, reduzindo as perdas de

etanol por evaporação, o que interfere diretamente nas propriedades sensoriais e

formação de componentes aromáticos (EMBRAPA, 2007).

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A fermentação alcoólica é encerrada quando ocorre o consumo de todo

açúcar disponível para ser fermentado ou também em temperaturas acima de

33° C impedindo a ação das leveduras. Ao final da fermentação alcoólica é

realizada a descuba, que é a separação das cascas do vinho líquido (DALL et

al.,2014).

Após a descuba ocorre a fermentação malolática que pode ser espontânea

ou artificial pela introdução de bactérias. Nesta etapa, ocorre a redução da acidez

do vinho pela transformação do ácido málico em ácido lático e a formação de

dióxido de carbono (DAUDT et al., 2008).

Por fim o vinho é filtrado para assegurar sua estabilidade físico-química e

microbiológica e também para sua clarificação, pela remoção de partículas

suspensas, tornando a bebida límpida e cristalina. Após a filtragem o vinho é

engarrafado e rotulado (LIMA et al., 2019).

A qualidade do produto final é resultado da efetividade de cada fase do

processo e também da qualidade das uvas utilizadas. Quando o vinho é produzido

com uvas contaminadas por fungos toxigênicos, micotoxinas podem estar

presentes no produto final (CLOUVEL et al., 2008).

3.2 MICOTOXINAS

Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos

filamentosos, principalmente dos gêneros Penicillium, Aspergillus e Fusarium

(QUILES et al., 2016). Esses compostos atuam em baixas concentrações,

possuem baixa massa molar, são termo-estáveis e possuem um amplo espectro de

toxicidade (TURNER et al., 2009), contaminando grande parte dos produtos

agrícolas e dos alimentos produzidos, provocando danos à saúde humana e animal

(HEIDTMANN-BEMVENUTI et al., 2012).

A biossíntese de micotoxinas ocorre sob condições específicas, dependendo

principalmente da temperatura, teor de umidade, atividade de água e pH (PLEADIN

et al., 2015). A contaminação por fungos pode ocorrer em qualquer estágio da

cadeia produtiva: pré-colheita, entre a colheita, secagem e durante o

armazenamento (KOPPEN et al., 2010). A ocorrência de alimentos contaminados

por fungos não garante que a micotoxina esteja presente, por outro lado a ausência

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do fungo no alimento não garante a ausência de micotoxinas que podem estar

presentes por longo tempo em situações diversas, mesmo que o fungo tenha

perdido a sua viabilidade (PLEADIN et al., 2019).

Quando ingeridos, os metabólitos secundários são capazes de causar

depressão no sistema imunológico, podendo ocasionar efeitos carcinogênicos,

teratogênicos e estrogênicos em animais e humanos (ROCHA et al., 2014). A

ingestão pode ser de forma direta pelo consumo de grãos, frutas e de produtos

derivados dessas matérias-primas, como vinho, cerveja, frutas secas entre outros

(CASTELLARI et al., 2001; CAST, 2003; BULLERMAN e BIANCHINI, 2007; ALGÜL

e KARA, 2014) ou de forma indireta, quando ingerido leite, ovos e carnes gerados

de animais que se alimentaram com rações contaminadas e acabam por excretar

essas toxinas (SHUNDO et al., 2006; IMPERATO et al., 2011; KUMAR et al., 2012;

MAJEED et al., 2013; WASKIEWICZ et al., 2013).

Devido à falta de especificidade do efeito danoso, as micotoxinas ocasionam

doenças que são chamadas de micotoxicoses, que muitas vezes não são

diagnosticadas (PLEADIN et al., 2015). Os efeitos dependem da dose e da

frequência com que são ingeridas, podendo ocasionar efeitos agudos, subagudos e

crônicos. O efeito agudo é a rápida manifestação, sendo caracterizados por

diarreias, hemorragias, distúrbios gastrointestinais, podendo levar a morte. Os

efeitos subagudos ocorrem com doses menores ao longo de um intervalo maior de

exposição, causando alterações em órgãos humanos e animais. Os efeitos

crônicos ocorrem pela exposição mínima de seis meses ao contaminante e os

danos podem ser carcinogênicos, genotóxicos, hepatotóxicos, teratogênicos,

nefrotóxico e imunotóxico (RAWAL et al., 2010).

Aproximadamente 500 compostos já foram reconhecidos como micotoxinas,

dos quais 300 já foram detectados em alimentos (BROOW et al., 2015). Segundo a

organização das nações unidas para a alimentação e a agricultura (FAO), 25% dos

alimentos produzidos no mundo estão contaminados com micotoxinas (FAO, 2018).

As toxinas fúngicas de maior ocorrência em alimentos estão citadas na Tabela 1:

Aflatoxinas, Ocratoxinas, Tricotecenos, Zearalenona, Fumonisinas, Patulinas e

Alcaloides de Ergot (PEREIRA, SANTOS, 2015).

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Tabela 1- Toxinas fúngicas de maior ocorrência em alimentos

3.3 OCRATOXINA A

Ocratoxina A (OTA) foi identificada pela primeira vez na África do Sul como

um metabólito fúngico tóxico para animais produzido pela cepa de Aspergillus

ochraceus (VAN DER MERVE, STEYN, FOURRIE, 1965). Os principais fungos que

metabolizam esta toxina são Penicillium verrucosum, Aspergillus ochraceus,

Aspergillus carbonarius e Aspergillus niger (MAGNOLI et al., 2007). Aspergillus

carbonarius é o principal contaminante produtor de OTA em uvas especialmente na

fase de maturação em regiões tropicais e subtropicais, apresentando a capacidade

de contaminar uvas saudáveis (BORDINI et al., 2013).

Micotoxina Produtos Afetados Referência

Aflatoxina Amendoim, nozes, milho, trigo e

leite

MARTINS et al., (2017)

LIVERPOOL-TASIE et al., (2019)

MARIMÓN et al., (2019)

Ocratoxinas

Grãos, Leguminosas, frutas

secas, café, cacau, salame e

ovos

OUETHRANI et al., (2013)

ALTAFINI et al., (2019)

PIRES et al., (2019)

KABAK, 2019

Tricotecenos Trigo, milho, cevada, aveia, arroz

ARRACHÉ et al., (2018)

MUNKVOLD et al., (2019)

HANVI et al., (2019)

Zearelenona Milho, trigo HAN et al., (2019)

JIANG et al., (2019)

Fumonisinas Milho, trigo, cevada, arroz

ABDALLAH et al., (2018)

CENDOYA et al., (2018)

SULTANA et al., (2019)

UDOVICKI et al., (2019)

Patulinas Maçã, morango, tomate, azeitona,

carne e ovos

YANG et al., (2014)

TOROVIC et al., (2018)

PRZYBYLSKA et al., (2019)

SAJID et al., (2019)

Alcaloides de Ergot Cereais ROMERA-TORRES et al., (2018)

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OTA é derivado de policetídio com a porção dihidroisocumarina ligada por

uma ligação amida com a porção carboxila da fenilalanina. Seu nome químico é (R)

–N- [(5- cloro- 3,4 -di-hidro- 8- hidroxi- 3- metil- 1- oxo- 1H- 2-benzonpiran-7-il)

carbonil]- L- fenilalanina, com fórmula molecular de C20H18ClNO6, massa molecular

de 408,3 g mol-1, apresentando uma estrutura cristalina que fluoresce emitindo

comprimento de onda correspondente ao verde. Ela é solúvel em solventes polares

orgânicos quando em meio ácido, apresenta estabilidade a acidez e a altas

temperaturas (KHOURY, ATOUI, 2010). Além da Ocratoxina A (OTA) existem a

Ocratoxina B (OTB), Ocratoxina C (OTC), Ocratoxina α (OT α) e Ocratoxina β

(OTβ) (Figura 2) (GIL-SERNA et al., 2018). A Ocratoxina A é a mais tóxica devido à

presença do átomo de cloro em sua composição e também, entre as ocratoxinas, é

a micotoxina de maior ocorrência em matrizes alimentares (AMÉZQUETA et al.,

2012).

Figura 2- Estrutura química das principais Ocratoxinas

Fonte: GIL-SERNA et al., 2018.

A ocorrência de OTA está relacionada com a inibição da fertilidade e com a

Nefropatia Endêmica dos Balcãs, uma doença renal crônica encontrada no Sudeste

da Europa (SCHMIDT-HEYDT et al., 2013), relacionada também com a indução de

formação de tumores no trato urinário em humanos (MARIN-KUAN, 2011). Em

estudos com animais apresenta efeitos carcinogênicos (BROWN et al., 2007),

genotóxicos (TOZLOVANU et al., 2006), neurotóxicos (SAVA et al., 2006),

teratogênicos (BALASAHEB et al., 2007), imunossupressores (ROSSIELLO et al.,

2008) e mutagênicos (PALMA et al., 2007). Classificada pela IARC (International

Agency for Research on Cancer) como possível carcinógeno para humanos (grupo

2B) (IARC, 1993).

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Estudos demonstram que a via de produção da OTA envolve a fenilalanina e

a diidroisocumarina os quais são derivados da via do chiquimato e da via

pentacetida, respectivamente. Na primeira etapa ocorre a formação de uma cadeia

policetida isocumarínica através da condensação de uma molécula de acetato com

quatro moléculas de malonato. Na segunda etapa a cadeia policetida sofre uma

modificação com a formação do anel lactona e a adição de um grupo carboxil

derivado de S-metilmetionina. Na terceira etapa ocorre a incorporação de um

átomo de cloro pela ação da cloroperoxidase e finalmente ocorre a ligação a

fenilalanina a ocratoxina α formando a ocratoxina A (HARRIS, MANTLE, 2001).

Seus efeitos tóxicos são atribuídos principalmente à redução do

metabolismo proteico, competindo com a fenilalanina pelos sítios de ligação de

enzimas específicas, causando a inibição da síntese protéica. Essas alterações no

metabolismo das proteínas podem ocasionar a ocorrência de várias infecções

(DUARTE, LINO, PENA, 2011).

Devido à presença do aminoácido fenilalanina em uma fração na sua

estrutura, a OTA quando atinge a corrente sanguínea se liga a proteínas

plasmáticas, o que torna a micotoxina presente no sangue por mais tempo, sendo

mais tóxica ao organismo. Uma parte sofre excreção biliar sendo reabsorvida pelo

intestino e túbulos renais retornando dessa forma a circulação sanguínea sendo

distribuída a diferentes tecidos. Sua nefrotoxicidade está possivelmente

relacionada com a disfunção mitocondrial que causa a falta de energia gerando

espécies reativas de oxigênio (AMÉZQUETA et al., 2012).

Esta toxina apresenta moderada termoestabilidade, permitindo sua

ocorrência durante o processamento dos alimentos, sendo consumida através de

cereais, vinhos, café, leite, especiaria, cacau entre outros (AMÉZQUETA et al.,

2009). Em virtude da ocorrência de micotoxinas em diferentes matrizes

alimentares, foi implementada no Brasil a RDC n°7 de 18 de fevereiro de 2011

(ANVISA, 2011) que estabelece limites máximos tolerados (LMT) de micotoxinas

em alimentos, estabelecendo o limite máximo para OTA de 2 µg L-1 para polpa de

uva, suco de uva, vinho e seus derivados. O mesmo limite é estabelecido para

países da Comunidade Europeia por meio da resolução EC n.º 123 de janeiro de

2006 (EC, 2006). A dose semanal máxima tolerável de 0,12 µg kg-1 de peso

corporal, para o consumo de OTA, definida pelo Comitê Especialista em Aditivos

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Alimentares das Nações Unidas/Organização Mundial da Saúde (JECFA, 2001) e

também pela Autoridade Europeia para a Segurança Alimentar (EFSA, 2006).

3.3.1 Ocorrência de ocratoxina A em uvas e vinhos

Os fungos da espécie Aspergillus carbonarius são os principais

colonizadores e produtores de OTA em uvas (VISCONTI et al., 2008). A

contaminação pode ocorrer durante o período de maturação, devido à irrigação

excessiva e pelos danos causados por insetos e aves, o que reduz a qualidade das

uvas, afetando diretamente a qualidade organoléptica dos vinhos (WELKE et al.,

2009).

OTA foi identificada e quantificada pela primeira vez em 1996, em vinhos

originados do sul da Europa, apresentando a maior concentração de 0,4 µg mL-1

(ZIMMERLI e DICK, 1996). No Brasil, o primeiro relato de ocorrência de OTA em

vinhos foi em 2004, apresentando concentrações entre 0,02 a 0,07 µg L-1 (ROSA et

al., 2004). Na Tabela 2 estão apresentados registros da literatura evidenciando a

ocorrência mundial de OTA em vinhos.

Em 42% dos estudos citados a concentração de OTA está acima da

concentração de 2 µg L-1 permitida pela legislação (ANVISA, 2017; EC, 2006).

3.4 TÉCNICAS PARA O CONTROLE DE OTA EM UVAS E VINHOS

Devido à frequente ocorrência e a toxicidade desta micotoxina técnicas para

descontaminação vêm sendo estudadas. As técnicas mais utilizadas incluem

estratégias de pré-colheita (preventivas) e pós-colheita (corretivas) e envolvem

métodos físicos, químicos e microbiológicos (SOLFRIZZO et al., 2009).

O uso de fungicidas destaca-se na estratégia de pré-colheita e entres as

estratégias de pós-colheita, destacam-se os métodos químicos com a utilização de

peróxidos, hipocloritos e amonização (RUBERT et al., 2013) e entre os métodos

físicos destacam-se a redução da concentração de micotoxina pela remoção dos

sólidos por precipitação e filtragem durante o processo de vinificação (NUNEZ et

al., 2008; FLORES FLORES et al., 2015; BAURER, et al., 2016). Além disto, os

tratamentos químicos e físicos apresentam como desvantagem interferir no valor

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nutricional e na palatabilidade das bebidas e alimentos, não sendo aceitos para o

uso prático (VARGA et al., 2005).

Tabela 2- Ocorrência de ocratoxina A em vinhos.

País N° de amostras positivas / Total

Faixa de

Ocorrência (µg L

-1)

Referência

África 95/96 0,08 - 0,4 REMIRO et al., (2013)

Argentina 8/94 0,02- 4,82 PONSONE et al., (2010)

Brasil 12/16 0,03-0,62 TERRA et al., (2012)

Brasil 1/34 nd*- 4,50 WELKE et al., (2010)

China 44/77 <0,1- 5,65 ZHANG et al.,(2013)

China 183/223 0,01- 0,98 ZHONG et al., (2014)

China 18/63 0,02- 1,18 WU et al., (2011)

Chile 1/5 nd* - 2,42 ARRUÁ et al., (2019)

Croácia 85/110 0,003 - 0,16 ZURGA et al., (2019)

Estados Unidos 28/31 0,3 - 2,0 DE JESUS et al., (2017)

Grécia 34/44 0,1 - 0,71 SARIGIANNIS et al., (2014)

Itália 90/96 <1- 3,86 PIETRI et al., (2010)

Itália 695/1002 0,1 -2,63 SPADARO et al., (2010)

Itália 2/30 0,35 - 2,34 PRELLE et al., (2013)

Itália 41/57 nd* - 0,73 DI STEFANO et al., (2015)

Portugal 9/12 <1 - 1,23 PENA et al., (2011)

Portugal 4/59 0,23 -1,18 SILVA et al., (2019)

Tunísia 14/18 0,09 - 1,5 LASRAM et al., (2013)

nd*: não detectado.

Entre os métodos microbiológicos destacam-se a utilização de bactérias,

fungos e leveduras. As leveduras são fungos unicelulares com forma arredondada,

a grande maioria pertence ao filo Ascomiceto e reproduzem-se da forma sexuada

ou assexuada. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais

aproveitado em processos bioquímicos, utilizando açúcar para produzir à energia

necessária a sobrevivência, gerando etanol como produto desse processo

(BANERJEE, 2009). A parede celular externa é formada por manoproteínas e β-

glucanos, os quais apresentam a propriedade de adsorção física, troca iônica e

complexação, podendo adsorver micotoxinas reduzindo a contaminação em

alimentos (FAUCET-MARQUIS et al., 2014).

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Meca, Blaiotta e Ritieni (2010) descreveram a redução de 50% na

concentração de OTA em vinho tinto, devido à adsorção celular durante a

fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae. O mesmo mecanismo foi

descrito por Bejaoui et al., (2006) e Piotrowska et al., (2013) ocorrendo um

decréscimo linear da concentração de OTA durante o processo de fermentação do

vinho.

Durante o processo cervejeiro a levedura Saccharomyces cerevisiae,

também reduziu a concentração das micotoxinas desoxinivalenol (DON) e

zearalenona, em 16 e 31%, respectivamente, durante 96 h de fermentação (WALL-

MARTÍNEZ et al., 2019). No processo de fabricação de suco de maçã a mesma

levedura reduziu em 89% a concentração da micotoxina patulina (OPORTO et al.,

2019) e também há relatos de redução de até 81% da aflatoxina M1 durante o

processo de fermentação em produtos lácteos (FOROUGHI et al., 2018). Portanto,

as leveduras são ótimos agentes de controle biológico, em função da sua biologia e

por apresentarem propriedades não tóxicas (PONSONE et al., 2012).

A redução da concentração de micotoxinas também é observada pela

degradação por fungos não toxigênicos, ocorrendo a clivagem da molécula pela

hidrólise da ligação amida que une a porção isocumarina, com a ação de enzimas

proteolíticas intra ou extracelulares, gerando fenilalanina e a molécula de

ocratoxina α (ABRUNHOSA et al., 2011), que não apresenta efeito tóxico (KUPSKI

et al., 2016). Abrunhosa, Serra e Venâncio, (2002) relatam 80% de redução da

concentração de OTA no meio de cultura na presença do fungo Aspergillus.

Mesmo com vários estudos relatando formas eficazes em reduzir os níveis

de micotoxinas em diferentes matrizes alimentares, o controle químico é a técnica

mais utilizada para a prevenção do crescimento fúngico e a produção de

micotoxinas por fungos toxigênicos.

O controle químico pode ser realizado com a utilização de produtos

popularmente denominados de agrotóxicos (CARPINTEIRO et al., 2010). De

acordo com o Decreto Federal n° 4.074 de 4 de Janeiro de 2002, os agrotóxicos

são produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos utilizados para

prevenir, destruir, repelir ou mitigar qualquer praga, classificados em: inseticidas,

acaricidas, bactericidas, nematicidas, herbicidas e fungicidas (JARDIM et al., 2009).

O recurso de proteção mais utilizado em viticulturas até o momento é a prevenção

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da colonização fúngica com o uso de fungicidas, os quais têm sido extensivamente

utilizados, na tentativa de proteger as videiras, tornando-os cada vez mais

dependentes do uso destes produtos químicos (CARPINTEIRO et al., 2010).

Devido à relevância socioeconômica do setor vitivinícola no estado do Rio

Grande do Sul e ao elevado índice de estudos relatando a ocorrência de OTA,

torna-se imprescindível o conhecimento da qualidade de vinhos consumidos pela

população. Para isso métodos analíticos de extração e detecção de micotoxinas

em amostras de alimentos são muito importantes. A análise de contaminantes no

vinho é um desafio, por se tratar de uma matriz complexa que contém água,

açúcar, álcool e uma variedade de substâncias orgânicas e inorgânicas

(NASCIMENTO, 2005; RUBERT et al., 2013).

3.5 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E DETECÇÃO DE OCRATOXINA A

Devido a frequente ocorrência de micotoxinas em diferentes matrizes

alimentares métodos analíticos que possibilitem a identificação e quantificação em

baixos níveis de concentração são necessários. As amostras de alimentos

geralmente não podem ser analisadas sem o preparo da amostra, devido a baixa

concentração dos analitos. A etapa de extração e a fase de limpeza chamada de

“clean up” são determinantes durante o procedimento (MARTINS et al., 2012).

O método de Tanaka é um método utilizado para a determinação de

micotoxinas em distintas matrizes alimentares apresentando eficiência analítica

(TANAKA et al., 2000). Consiste na extração sólido-líquido, utilizando a proporção

1:10 de amostra e solvente extrator, respectivamente. O elevado volume de

solvente utilizado torna o método inviável, em função do volume de resíduos

gerado e também ao elevado custo dos solventes (HACKBART et al., 2012). A

técnica de Microextração Dispersiva Líquido-Líquido baseia-se na utilização de um

solvente extrator que seja imiscível em água, um solvente dispersor que seja

miscível em água e também a presença de uma solução aquosa que permita a

interação entre o solvente extrator e o solvente dispersor (REZZAE et al., 2006).

Esse tipo de extração apresenta vantagens em utilizar pouco volume de solventes,

ser rápido, simples e compatível com equipamentos analíticos como cromatógrafo

gasoso e cromatógrafo líquido (WEI, LI, WANG, 2007; MELWANKI, FUH, 2008). A

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17

técnica de Extração Sólido-Líquido consiste na separação de componentes de uma

matriz em fase sólida, com a utilização de um solvente líquido (LEDOUX, 2011). A

técnica de Dispersão da Matriz em Fase Sólida consiste na dispersão da amostra

sobre um suporte sólido, seguido de eluição (DÓREA, LANÇAS, 1999).

O método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Ruged and Safe)

(ANASTASSIADES et al., 2003) é o método mais utilizado, devido as suas

vantagens em ser rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e seguro para a análise

de matrizes complexas. A extração do analito é feita com a utilização de um

solvente com diferentes polaridades, sendo comumente utilizado: acetonitrila,

acetona ou acetato de etila. Após é realizada a etapa de partição com a utilização

de sulfato de magnésio, que pode ser empregado de forma isolada ou com outros

sais. Com agitação e centrifugação da amostra se obtém uma alíquota da fase

orgânica que é submetida à limpeza “clean up”. Essa etapa é muito importante no

processo de extração de micotoxina no vinho, pois em virtude da sua cor, essa

matriz apresenta muitos interferentes, tornando-a uma matriz complexa. Essa

etapa aumenta a pureza do extrato, auxiliando que interferentes não apresentem o

mesmo tempo de retenção que o analito. Após essa etapa o sobrenadante

resultante pode ser determinado diretamente ou concentrado caso seja necessário

(MARTINS et al., 2012).

O método QuEChERS modificado (FERNANDES et al., 2013) foi utilizado

para a extração de ocratoxina A no vinho. O analito foi extraído com acetonitrila

acidificada (1% de ácido acético) e a partição realizada com a adição de uma

mistura de sais contendo sulfato de magnésio, resultando em uma reação

exotérmica.

Para a eliminação dos interferentes presentes na matriz utilizou-se sílica

como adsorvente. Assim o analito ficou retido na fase orgânica. Após o processo

de extração e limpeza, uma alíquota do sobrenadante foi seco sob corrente de

nitrogênio, ressuspenso em fase móvel para posterior análise em cromatógrafo.

Entre as técnicas analíticas de detecção de micotoxinas a cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE) é a mais utilizada, devido a sua alta sensibilidade,

sendo aplicável em diferentes tipos de matrizes (PAN et al., 2014). O detector

ultravioleta é utilizado em uma das seguintes formas: fluorescência, condutividade

elétrica, espectro de massas ou índice de refração. O detector padrão de UV utiliza

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18

comprimentos de onda entre 195 a 375 nm sendo regulado de acordo com o

analito. O DAD é formado por arranjos de diodos, sendo um dos mais eficientes na

detecção de tricotecenos (FU et al., 2009).

O detector de fluorescência baseia-se na radiação recebida pela molécula

através de uma emissão de curta duração. A fluorescência pode ser medida

através da excitação da amostra no comprimento de onda de absorção medindo o

comprimento de onda de fluorescência (GALARCE- BUSTOS et al; 2014). A

velocidade de relaxação influencia na análise por fluorescência, portanto apenas

moléculas com estrutura rígidas podem ser analisadas dessa forma. Micotoxinas

do tipo OTA, ZEA e Aflatoxinas apresentam duplas ligações o que tornam suas

estruturas rígidas, ocorrendo também o efeito de ressonância, permitindo serem

analisadas por fluorescência apresentando baixos limites de detecção e

quantificação (CHEN et al., 2017).

É necessário que os dados gerados apresentem precisão e exatidão

adequadas para que o método seja validado (LANÇAS, 2004). A verificação da

eficiência metodológica é um processo contínuo que se dá desde o início do

desenvolvimento do método analítico, sendo necessário que os resultados obtidos

garantam confiabilidade sobre a amostra analisada (SANTE, 2017), através da

curva analítica e lineariedade, limite de detecção e limite de quantificação, precisão

e exatidão (ANVISA, 2003).

A curva analítica é realizada através da análise de diferentes concentrações

do analito em estudo, utilizando soluções padrão. Com os resultados é obtida uma

relação matemática que possibilita a obtenção da equação da reta (LANÇAS et al.,

2004; RIBANI et al., 2004). O gráfico de calibração é realizado com o mínimo de

cinco níveis de concentração da solução-padrão, sendo necessário que as

concentrações escolhidas preencham uma faixa de 50 a 150% do analito que se

quer analisar (SANTE, 2017). A equação da reta é considerada adequada quando

o coeficiente de correlação linear “r” apresenta um valor acima de 0,90 (INMETRO)

ou um valor igual ou acima de 0,99 (ANVISA) (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003).

Quando a amostra em estudo apresenta interferentes que possam dificultar

a análise, os quais podem eluir no mesmo tempo que o analito, torna-se necessário

elaborar uma curva na matriz, com o objetivo de evitar falsos resultados durante a

análise (RODRIGUES, 2010).

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19

Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) indicam se o método

utilizado é capaz de detectar e quantificar o analito em baixas concentrações. O

LOD corresponde a menor concentração detectável do analito, capaz de distinguir

com segurança do ruído do equipamento e o LOQ corresponde a menor

concentração quantificada do analito, com exatidão e precisão aceitáveis (SANTE,

2017; LANÇAS, 2004). A relação sinal/ruído é utilizada para a determinação dos

LODs e LOQs, sendo realizada através da comparação entre a medição de

amostras em baixas concentrações conhecidas do analito na matriz e também da

matriz sem o analito (branco), desta forma estima-se o valor aceitável da razão

sinal/ruído de 3 para LOD e 10 para LOQ (RIBANI et al., 2004; CASSIANO et al.,

2009).

Com os valores de exatidão é possível saber quanto os dados obtidos se

assemelham com os valores de referência aceitos como verdadeiro (LANÇAS,

2004). A exatidão é expressa em porcentagem e pode ser analisada de acordo

com o uso de materiais de referência, adição de padrão, ensaios de recuperação e

comparação de métodos (SANTE, 2017). Os ensaios de recuperação são

usualmente utilizados para determinar os valores de exatidão e necessitam

apresentar valores entre 70 e 120% de recuperação na análise de micotoxinas,

calculados pela comparação da resposta obtida do analito adicionado na matriz em

estudo com a reposta obtida do analito adicionado ao solvente (BRITO et al., 2003;

CASSIANO et al., 2009; SANTE, 2017). A precisão de um método é obtida pelos

resultados repetidos de uma mesma amostra entre ensaios independentes

(SANTE, 2017). São aceitos valores de até 20% de precisão para a análise de

elementos traços, podendo ser avaliada através da reprodutibilidade, repetibilidade

e precisão intermediária (BRITO et al., 2003).

A reprodutibilidade refere-se ao grau de concordância entre os resultados

obtidos de uma mesma amostra, realizado com alterações de operador,

equipamento, local, etc. A repetibilidade representa a concordância entre os

resultados de análises sucessivas utilizando um mesmo método, efetuadas sob as

mesmas condições em um pequeno intervalo de tempo com o mesmo

procedimento, mesmo instrumento, mesmo analista e mesmas condições de

análise (INMETRO, 2003).

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20

3.6 FUNGICIDAS

Os fungicidas são extensivamente utilizados na área da viticultura, com o

objetivo de amenizar as perdas decorrentes da contaminação por fungos

toxigênicos, insetos e outros patógenos (CARPINTEIRO et al., 2010). Entre os

fungicidas mais utilizados na viticultura estão o cresoxim-metílico e famoxadona

(MULERO et al., 2015), os quais podem ser classificados de acordo com a fase da

aplicação como: preventivos, que são aplicados na fase de pré-infecção; curativos,

que são aplicados após a infecção; e erradicativos, que são aplicados após o

sintoma. Cada ingrediente ativo presente no fungicida age em um sítio específico

do fungo desencadeando processos bioquímicos que levam o organismo a morte,

podendo afetar a parede celular, membrana plasmática, mitocôndrias, retículo

endoplasmático, ribossomos ou núcleo (ANGELOTTI et al., 2012).

A utilização de fungicidas é mais intensa em regiões de clima quente e

úmido na tentativa de prevenir e controlar os ataques fúngicos, pois essas

condições favorecem a ocorrência de doenças em vinhas, as quais causam

importantes perdas econômicas no setor de viticultura (FONTANA et al., 2011).

Entre os fungicidas detectados em vinho tinto, destaca-se a ocorrência de

cresoxim-metílico e famoxadona (LIU et al., 2010; AGUILERA et al., 2014;

RAHMAN et al., 2014; CHEN et al., 2017). Estes contaminantes pertencem a

classe III de risco toxicológico e podem promover alterações bioquímicas durante o

processo de fermentação do vinho devido a modificações nas membranas

celulares da levedura Saccharomyces cerevisiae, afetando sua função específica,

com consequente redução na velocidade das fermentações, redução na

concentração de compostos fenólicos, diminuição na atividade antioxidante e até a

alteração na concentração de etanol (HÝSEK et al., 2005; MULERO et al., 2015;

OLIVA et al., 2015; APONTE, BLAIOTTA, 2016).

Durante o processo de fermentação alcoólica a concentração destes

contaminantes pode ser reduzida (BORTOLETTO et al., 2015). Gonzalez-

Rodríguez et al., (2009) relatam uma redução de 50% na concentração de

fungicidas detectada na uva em relação à concentração detectada no vinho,

indicando a possibilidade de ocorrer degradação ou adsorção deles durante a

fabricação do vinho.

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21

Mesmo que as concentrações de fungicidas e micotoxinas estejam menores

no vinho do que nas uvas, há preocupação com a contaminação do produto final

(MARTINS et al., 2012). Portanto, o consumo destes contaminantes pode afetar a

saúde humana, uma vez que a sua ingestão é concomitante a outros alimentos

com este mesmo perfil de contaminação, reforça a preocupação com a segurança

da população (GARBI et al., 2010).

O fungicida cresoxim-metílico (Figura 4) pertence à classe das estrobilurinas

e apresenta o nome químico Methyl (E)-2-methoxyimino [2-(o-tolyloxymethyl)

phenyl] acetate e a seguinte fórmula molecular C18H19NO4 (LEE et al., 2018).

Figura 4- Estrutura química do fungicida cresoxim-metílico

As estrobilurinas compreendem uma classe de fungicidas sintéticos que

apresentam excelente ação antifúngica, sendo extensivamente utilizados para

prevenir doenças fúngicas foliares em uma ampla gama de culturas em todo o

mundo (JERNBERG et al., 2003; DORNELLAS et al., 2013). Atuam prevenindo a

germinação dos esporos, com ação curativa inibindo o desenvolvimento dos fungos

nos estágios de pós-germinação (VENÂNCIO et al., 1999). Seu ingrediente ativo

age em um sítio específico do fungo ocasionando a inibição da respiração

mitocondrial (LIKAS et al., 2007).

De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), é

aceitável a ingestão diária de até 0,40 mg kg-1 (ANVISA, 2009). A concentração

para uso no campo recomendada pelo fabricante é de 0,1 kg ha-1 (MAPA-03198) e

o limite máximo de resíduo de cresoxim-metílico em uvas é de 0,5 mg kg-1

(ANVISA, 2009).

O fungicida famoxadona (Figura 5) pertence à família das oxazolidinones e

apresenta o nome químico Famoxadona [3-anilino-5-metil -5- (4-fenoxifenil) - 1,3-

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oxazolidine-2,4-diona], utilizado para o controle de doenças fúngicas foliares,

apresentando eficiência contra o míldio da videira (NEUBURGER et al., 2003). Ele

inibe a respiração mitocondrial, apresentando ação bioquimicamente similar à

classe das estrobilurinas (ABREU et al., 2006), atuando na proteção e erradicação

da doença fúngica, pela rápida absorção e distribuição na planta (LIKAS et al.,

2007).

Figura 5- Estrutura química do fungicida famoxadona

De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é

aceitável, a ingestão diária de até 0,006 mg kg-1 (ANVISA, 2018). A concentração

para uso no campo recomendada pelo fabricante é de 0,06 kg ha-1 (MAPA-01499)

e o limite máximo de resíduo de famoxadona permitido em uvas é de 2 mg kg-1

(ANVISA, 2018).

3.6.1 Modo de ação dos fungicidas

Os fungicidas podem ser classificados de acordo com seu modo de ação: os

fungicidas de contato que formam uma película protetora na superfície da planta,

impedindo a penetração do patógeno; os fungicidas mesostêmicos que apresentam

elevada afinidade com a camada cerosa das folhas; os fungicidas sistêmicos que

se movem na planta pelos vasos condutores atingindo locais distantes do local

aplicado; e os fungicidas translaminares que se distribuem de forma limitada nos

tecidos (KOLOSOVA et al., 2017).

Os fungicidas da classe das estrobilurinas e da classe oxazolidinones são

eficazes no combate ao crescimento fúngico, conhecidos como inibidores da

quinona oxidase (Qol), devido a presença de grupos químicos que se ligam ao sítio

específico na mitocôndria, onde ocorre a respiração celular. A transferência de

elétrons é bloqueada no nível do complexo III (citocromo BC1), impedindo a síntese

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23

de ATP (adenosina trifosfato), interrompendo a produção de energia (Figura 6).

Esses fungicidas são considerados de ação rápida, pois interrompem o primeiro

ciclo de vida dos fungos, no estágio de esporos, o qual requer elevado nível

energético (BALBA et al., 2007).

Os fungicidas do tipo estrobilurinas e oxazolidinones pertencem a uma das

classes mais importantes de compostos utilizados no controle de doenças em

cereais, frutas e vegetais (KOLOSOVA et al., 2017). Apresentando relevância nas

lavouras em virtude dos seus efeitos benéficos a planta, pois apresenta a

capacidade de ativar a enzima NADH- nitrato redutase, o que proporciona o

aumento do aproveitamento de nitrato e sua incorporação na planta pelas

moléculas de clorofila (DOURADO NETO et al., 2005).

Figura 6- Célula fúngica com o local de atuação dos fungicidas no complexo

III da cadeia transportadora de elétrons, localizada nas cristas mitocondriais.

Fonte: Adaptado de PARREIRA et al., 2009.

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24

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Reagentes, solventes e material

- Saccharomyces cerevisiae (Biolievito cerevisiae), BIOTEC SUL (Brasil);

- Aspergillus carbonarius, Coleção de Culturas da Fundação André Tosello (Brasil);

- Ocratoxina A (pureza > 98%), SIGMA ALDRICH (Brasil);

- Cresoxim-metílico, BASF S.A. (Brasil);

- Famoxadona, DUPONT™ (Brasil);

- Acetonitrila grau HPLC, PANREAC (Espanha);

- Acetonitrila P.A., VETEC (Brasil);

- Água destilada, QUIMIS 341-25 (Brasil);

- Água purificada em sistema Direct-Q UV3, MILLIPORE (resistividade de 18,2 MΩ

cm) (EUA);

- Sílica Gel 60, MACHEREY-NAGEL (Alemanha);

- Cloreto de sódio, SYNTH (Brasil);

- Sulfato de magnésio, SYNTH (Brasil);

- Citrato de sódio tribásico dihidratado, SYNTH (Brasil);

- Citrato de sódio dibásico sesquihidratado, SYNTH (Brasil);

- Glicose anidra, SYNTH (Brasil);

- Guaiacol P.A., VETEC (Brasil);

- Fosfato de sódio monobásico, VETEC (Brasil);

- Fosfato de sódio dibásico, VETEC (Brasil);

- Extrato de levedura, ACUMEDIA (Brasil);

- Agar potato dextrose, ACUMEDIA (Brasil);

- Clorofórmio P.A., SYNTH (Brasil);

- Peróxido de hidrogênio 30%, ÊXODO CIENTÍFICA (Brasil);

- Gás nitrogênio;

- Hexano P.A., SYNTH (Brasil);

- Etanol P.A., SYNTH (Brasil);

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25

- Membrana de acetato de celulose de 47 mm de diâmetro e 0,45 μm de diâmetro

de poro MILLIPORE (Brasil);

- Frascos de vidro âmbar;

- Vidraria comum de rotina (béquer, erlenmeyer, pipetas volumétricas, balões

volumétricos, etc...).

4.1.1 Equipamentos

- Balança analítica de precisão FA2104N, BIOPRECISA (Brasil);

- Banho ultrassônico 25 mHz, UNIQUE (Brasil);

- Banho ultrassônico, UNIQUE Ultra Cleaner 700 (Brasil);

- Banho maria, BIOPAR COEL TLK 48 (Brasil);

- Bomba de vácuo, PRISMATEC (Brasil);

- Microcentrífuga, MINISPIN (Brasil);

- Centrífuga refrigerada, CIENTEC CT-5000R (Brasil);

- Coluna analítica, Gemini C18 (250 x 4,5 mm, 5 μm) PHENOMENEX (EUA);

- Concentrador, TECNAL TE-019 (Brasil);

- Cromatógrafo Líquido, SHIMADZU (Japão) equipado por um sistema de bombas

26 (modelo LC- 20AT), desgaseificador da fase móvel (modelo DGU20A5),

controlador (modelo CBM-20A), injetor manual com alça de amostragem de 20 μL

(modelo 7725i) e detector de fluorescência (modelo FL – 10AXL);

- Espectrofotômetro modelo Cary 100 – UV-VISABLE, VARIAN (EUA);

- Micropipetadores automáticos com capacidade variável de 10 – 5000 μL;

- Shaker incubadora, TECNAL TE-420 (Brasil);

- Vórtex Mixer, VIXAR (Coreia).

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Preparo das soluções

A solução estoque de Ocratoxina A foi preparada a partir de recipiente

comercial com 1 mg da micotoxina que foi dissolvida em benzeno: acetonitrila (98:2

v/v) até uma concentração de 100 µg mL-1. Após a solução estoque foi diluída para

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26

se obter uma solução padrão com concentração de 50 µg mL -1 segundo relação

massa/volume e confirmada em espectrofotômetro. A concentração da solução

trabalho foi verificada utilizando os valores de absortividade molar (ɛ= 5550 L mol-1

cm-1) e comprimento de onda de máxima absorbância (333 nm) em benzeno: ácido

acético (99:1) (Equação 2). A pureza do composto foi confirmada com a

quantificação em espectrofotômetro de ultravioleta (AOAC, 2007).

µg mL-1= Abs. x M M x 1000 x F C x ɛ -1x C-1 (2)

Onde:

Abs = valor da absorbância da solução padrão

M.M. = massa molecular da micotoxina

FC = fator de correção do instrumento

ɛ = absortividade molar da micotoxina no comprimento de onda de máxima

absorbância em acetonitrila

C = largura da cubeta (1 cm).

Os fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona foram preparados em água

destilada para a obtenção da solução estoque e armazenados em refrigerador

(4°C) até o uso.

O volume de 1 mL da solução trabalho de famoxadona na concentração de

18 mg mL-1 foi adicionado nas placas de Petri com posterior adição de 29 mL de

meio PDA resultando em uma concentração de 600 µg mL-1 recomendada pelo

fabricante para o uso no campo. O volume de 1 mL da solução de famoxadona na

concentração 0,60 mg L-1 foi adicionado ao reator tipo erlenmeyer com posterior

adição de 199 mL de meio de cultura sintético resultando em uma concentração de

3 mg L-1 .

O volume de 1 mL da solução trabalho de cresoxim-metílico na

concentração de 30 mg mL-1 foi adicionado nas placas de Petri com posterior

adição de 29 mL de meio PDA resultando em uma concentração de 1000 µg mL-1

recomendada pelo fabricante para o uso no campo. O volume de 1 mL da solução

de cresoxim-metílico na concentração 0,15 mg mL-1 foi adicionado ao reator tipo

erlenmeyer com posterior adição de 199 mL de meio de cultura sintético resultando

em uma concentração de 0,75 mg L-1.

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27

4.2.2 Ocorrência de OTA no vinho

4.2.2.1 Amostragem

As amostras de vinho tinto (N= 50) foram coletadas aleatoriamente com

diferentes lotes entre janeiro e dezembro de 2018, em estabelecimentos

comerciais, na cidade do Rio Grande- Rio Grande do Sul. As amostras foram

divididas de acordo com o tipo: 31 amostras de vinho tinto seco e 19 amostras de

vinho tinto suave, variando entre os tipos Carbenet Sauvignon, Malbec, Merlot,

Pinot noir. As uvas utilizadas para a elaboração dos vinhos variaram entre os tipos:

Americana, Carbenet Sauvignon, Bordo, Tannat, Isabel, Concord, Couderc, Merlot

e Niágara. O grau alcoólico variou entre 12% a 13% (v v-1) e o pH na faixa de 3,1 a

3,8. Todas as amostras foram armazenadas a 4 °C.

4.2.2.2 Extração e Quantificação de Micotoxina no vinho

A extração da micotoxina no vinho foi realizada pelo método de QuEChERS

(FERNANDES et al., 2013) com modificações. Em tubos falcon foram adicionados

4 mL de vinho e 4 mL de acetonitrila acidificada com 1% de ácido acético, após a

homogeneização em vórtex foi adicionado 2,6 g de sais (sulfato de magnésio

anidro, cloreto de sódio, citrato de sódio tribásico di-hidratado, citrato de sódio

dibásico sesquihidratado, na proporção 4: 1: 1: 0,5) os tubos foram

homogeneizados em vórtex durante 1 min e centrifugados durante 5 min a 1489 g.

A etapa de limpeza foi realizada com 2,5 mL do sobrenadante adicionando

125 mg de sílica e 375 mg de sulfato de magnésio anidro, após homogeneizado em

vórtex durante 1 min e centrifugado durante 5 min a 1489 g.

O volume de 1,5 mL do sobrenadante foi transferido para um frasco e o

solvente evaporado sob corrente de N2. O extrato seco foi ressuspenso em 1 mL

de fase móvel (60% de acetonitrila, 40% de água Mili-Q acidificada com 1% de

ácido acético) seguido da centrifugação e injeção cromatográfica.

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28

A OTA foi quantificada em cromatógrafo líquido de alta eficiência com

detector de fluorescência (HPLC-FL) de acordo com Kupski e Badiale-Furlong,

(2015) com modificações. Para a separação foi utilizada a coluna cromatográfica

analítica Gemini C18 (250 x 4,5 mm, 5 μm) PHENOMENEX (EUA) em um

Cromatógrafo Líquido SHIMADZU (Quito, Japão) equipado por um sistema de

bombas (modelo LC- 20AT), desgaseificador de fase móvel (modelo DGU20A5),

controlador (modelo CBM-20A), injetor automático com amostragem de 20 μL

(modelo 7725i) e com detector de fluorescência (modelo FL- 10AXL). A fase móvel

empregada foi constituída de acetonitrila e água Mili-Q acidificada (1% de ácido

acético) 60:40 (v.v-1), respectivamente, com o volume de vazão de 0,8 mL min-1 e

temperatura de 25 ºC. Os comprimentos de onda utilizados para a detecção de

OTA foram de 333 nm e 460 nm, para excitação e emissão, respectivamente.

4.2.2.3 Validação do Método

A validação da técnica cromatográfica para a extração e detecção de OTA

seguiu as figuras de mérito descritas a seguir (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003;

EUROPA COMISSION REGULATION (EC), 2006).

As curvas analíticas foram construídas com padronização externa no

solvente e na matriz, com o objetivo de avaliar a lineariedade do método.

Concentrações a partir de 0,5 µg L-1 até 5,0 µg L-1 das soluções padrões analíticas

foram utilizadas para a construção da curva de ocratoxina A.

A diluição da solução trabalho foi realizada em acetonitrila, para a obtenção

da padronização externa no solvente. A padronização externa por superposição da

matriz foi realizada a partir da diluição da solução trabalho, com o extrato da matriz.

O branco foi composto pela matriz isenta da micotoxina.

As determinações foram realizadas em triplicata, para a obtenção dos dados

de regressão linear através do software do equipamento. Dessa forma, o

coeficiente de correlação linear foi avaliado, obtendo-se a lineariedade do método.

A relação sinal/ruído foi empregada para estimar os LOD e LOQ,

considerando que o sinal gerado foi no mínimo de 3 a 10 vezes maior que a razão

do sinal da linha de base (ruído), respectivamente. Os limites do método (LOQm e

LODm) QuEChERS modificado foram obtidos pela determinação em soluções

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29

analíticas com diferentes concentrações preparadas pelas diluições da solução

padrão trabalho com o extrato da matriz, branco, extraído por QuEChERS

modificado (KUPSKI e BADIALE-FURLONG, 2015).

Os ensaios de recuperação definiram a exatidão do método. Amostras de

vinho (isentas de micotoxina) foram fortificadas com OTA nas concentrações de

1,0 µg L-1; 2,0 µg L-1 e 5,0 µg L-1 e para a extração foi utilizado o método de

QuEChERS modificado.

Para a quantificação de OTA foi utilizado à padronização por superposição

na matriz e os cálculos para expressar a porcentagem de recuperação foram

realizados de acordo com a Equação 3.

R (%)= [C1-C2/ C3] x 100 (3)

Onde:

C1= Concentração determinada após a fortificação

C2= Concentração determinada na amostra não fortificada (branco)

C3= Concentração esperada para o nível de fortificação

Para avaliar a precisão instrumental foram feitas análises sucessivas da

solução padrão na concentração de 2,0 µg L-1 (n = 10) e estimada pelo erro puro

relativo (RSD%) com relação a média das áreas de todas as análises. A precisão

do método foi avaliada em função da repetibilidade e da precisão intermediária.

Para o estudo da repetibilidade foi realizada a extração por QuEChERS,

modificado, em três níveis de fortificação, em triplicata, e estes níveis foram

analisados também em triplicata. A partir de nove determinações realizadas foi

calculado o RSD% para a repetibilidade. Para o estudo da precisão intermediária,

as nove determinações foram avaliadas em função de diferentes dias e, após,

também foi calculado o RSD%.

A sensibilidade foi determinada com a inclinação da reta da curva analítica,

correspondendo ao coeficiente angular da equação linear.

A seletividade foi determinada pelo do sinal do analito gerado em HPLC-FL e

pelo espectro de absorção do sinal do analito comparado ao do padrão.

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30

O efeito de matriz foi determinado com curva analítica no solvente e curva

analítica na matriz, em que foram analisadas as inclinações das retas, conforme

Equação 4:

EFM(%)= [X1-X2/X2]X 100 (4)

Onde:

X1=inclinação da curva obtida pela injeção da solução analítica de OTA,

preparada no extrato da matriz (vinho);

X2= inclinação da curva obtida pela injeção da solução analíticas de OTA,

preparada no solvente ((60:40) / (ACN: Ág.Acid)).

4.2.2.4 Estimativa de ingestão de OTA pelo consumo de vinho

A estimativa foi realizada de acordo com a Equação 5 (ZHONG et al., 2014).

Y= X.C/ W (5)

Onde:

Y= dose diária (µg kg-1 corpóreo)

X= vinho consumido (µg L-1)

C= nível de concentração de OTA no vinho (µg L-1)

W= peso corpóreo (kg)

4.2.3 Crescimento fúngico de Aspergillus carbonarius e manifestação toxigênica

Aspergillus carbonarius foi mantido em câmara germinativa (BOD) em meio

agar potato dextrose (PDA) com foto período de 12 h durante 7 dias a 26 °C (QIAN

et al., 2016) para a obtenção dos discos miceliais. Para a avaliação toxigênica de

Aspergillus carbonarius foi utilizado o método analítico “in vitro”. Ao tratamento

denominado controle foi adicionado 30 mL de meio PDA as placas de petri com

10 cm de diâmetro. Aos tratamentos com os fungicidas cresoxim-metílico e

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famoxadona foi adicionado 1 mL da solução trabalho e 29 mL de meio PDA. Logo

após a solidificação do meio, discos de micélio (1,0 cm de diâmetro) foram

inoculados ao centro da placa de petri. As culturas foram incubadas com foto

período de 12 h durante 7 dias a 26 °C. Diariamente foram removidas, em triplicata,

da BOD os cultivos tratados e o cultivo controle para o acompanhamento do

crescimento e manifestação toxigênica de Aspergillus carbonarius.

4.2.3.1 Avaliação do crescimento fúngico

O diâmetro das colônias foi medido diariamente e os valores foram

expressos em cm, em quintuplicada. O efeito do tratamento foi avaliado pela

medida dos diâmetros das colônias expressos em centímetro e também pelo

conteúdo de glicosamina (mg mL-1). Os testes foram realizados em triplicata.

O crescimento fúngico foi estimado tendo como referência o grupo controle.

A porcentagem de inibição fúngica foi calculada de acordo com Lappa et al., (2017)

(Equação 6).

Inibição (%)= (1-T/C) x100 (6)

onde T é o diâmetro do micélio fúngico tratado com fungicida e C é o diâmetro do

controle fúngico.

A taxa de crescimento fúngico em meio PDA foi determinada medindo-se o

diâmetro (em cm) das colônias, com régua em duas direções perpendiculares

durante os sete dias de experimento, calculando-se os valores médios e o desvio

padrão. Para obter a taxa máxima de crescimento do fungo Aspergillus

carbonarius, foi realizada a linearização da fase exponencial do crescimento em

função do tempo (HAMIDI- ESFAHANI et al., 2007). A linearização foi obtida com a

Equação 7:

Ln X/X0=µmax.T (7)

onde x é o cm final, x0 é o cm inicial, T é o tempo (horas), µmax é a velocidade

máxima.

O crescimento fúngico também foi avaliado pelo conteúdo de glicosamina, a

cada 1 g de biomassa seca a 60 °C durante 4 h foram adicionados 5 mL de HCl 6

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32

M seguido por aquecimento a 100 °C durante 40 min. Após o hidrolisado foi

neutralizado com uma solução de NaOH 3 M e titulado com KHSO4 (1% m/v). A

reação colorimétrica foi realizada com o reagente de Erlish (DAB- p-

dimetilaminobenzaldeído) dissolvido em 15 mL de etanol absoluto e 15 mL de HCl

concentrado. O conteúdo de n-acetilglucosamina foi medido com a curva padrão de

glicosamina (0,01 a 0,2 g L-1) utilizando a unidade de absorbância

espectofotométrica de 530 nm (PAGNUSSAT et al., 2013).

4.2.3.2 Produção de OTA no meio de cultura PDA

A extração de micotoxinas do meio de cultura foi realizada de acordo com

Kupski et al., (2018). A cada 10 g de amostra foram adicionados 2 mL de HCl 2 M e

10 mL de clorofórmio. Em seguida os tubos foram homogeneizados em vórtex

durante 1 min e centrifugados (10 min/3220 xg), a partição com clorofórmio foi

repetida três vezes e após centrifugação (10 min/3220 xg) a fração de clorofórmio

foi evaporada sob corrente de nitrogênio para posterior análise em HPLC-FL. Os

extratos foram ressuspensos em 1 mL de fase móvel (60% Acetonitrila, 40% água

Mili-Q acidificada com 1% de ácido acético) e realizada a injeção no sistema

cromatográfico. A eluição realizada na coluna cromatográfica Kromasil C18 (5 mm

150X4,6 mm) a 25 °C com vazão de 0,8 mL min-1 e com detector de fluorescência

com comprimento de onda de excitação e emissão de 333 nm e 460 nm,

respectivamente.

A inibição da produção de micotoxinas (IMM), a inibição do crescimento

micelial (IMG), a inibição específica da produção de micotoxinas por grama de

fungicida na placa de cultura (IMM esp.), foram calculados de acordo com as

Equações 8, 9,10 (Nguefack et al., 2004).

IMM= (OTA C – OTA T) / OTA C (8)

IMG= (cd C- cd T) / cd C (9)

IMM Esp = ((OTA Control – OTA T) / OTA C) Fung (10)

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33

onde OTA C é a concentração de OTA (ng g-1meio) no controle, OTA T é a

concentração de OTA (ng g-1meio) no tratamento, cd C é o diâmetro (cm) da colônia

de micélio sem tratamento com fungicida, cd T é o diâmetro (cm) da colônia de

micélio tratado com fungicida e Fung é a concentração (mg mL-1) de fungicida

utilizado.

4.2.4 Efeito da micotoxina OTA e dos fungicidas cresoxim metílico e famoxadona

na fermentação alcoólica

4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo

O meio de cultura sintético, utilizado para a fermentação alcoólica, foi

composto por glicose (200 g L-1), ácido tartárico (4 g L-1), extrato de levedura

(10 g L-1), peptona (20 g L-1) e o pH ajustado em 3,5 utilizando carbonato de

potássio (ZHANG et al., 2007). A levedura liofilizada de Saccharomyces cerevisiae

(200 µg mL-1) foi diluída em 12 mL de água mili-Q e incubada em agitador rotatório

a 200 rpm durante 10 min a 26 °C, para sua homogeneização.

4.2.4.2 Condições de cultivo

O cultivo submerso foi realizado em reatores de vidro cônicos com volume

útil de 250 mL contendo 188 mL de meio de cultura sintético e 12 mL do meio

contendo a levedura na concentração de 200 µg mL-1 correspondendo a adição de

6% do volume de meio fermentativo. A fermentação foi realizada a 26 °C durante

96 h. O efeito da micotoxina e fungicidas na fermentação alcoólica foi avaliado

adicionando ao reator um volume de solução padrão de Ocratoxina A

correspondente a concentração final no meio de cultivo de 2 e 4 µg L-1

(denominado OTA 2 e OTA 4, respectivamente). A adição da solução de

micotoxina foi realizada previamente a adição do meio de cultivo, sendo o solvente

evaporado sob corrente de nitrogênio. O mesmo procedimento foi empregado para

os fungicidas famoxadona (3 mg L-1) e cresoxim-metílico (0,75 mg L-1)

denominados de F e CM, respectivamente. Os contaminantes também foram

avaliados de forma concomitante, com adição simultânea de OTA em 2 µg L-1 e

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famoxadona em 3 mg L -1 (OTA 2+ F), OTA em 2 µg L-1 e cresoxim-metílico em

0,75 mg L-1 (OTA 2 + CM), OTA em 4 µg L-1 e famoxadona em 3 mg L-1 (OTA 4+

F), OTA em 4 µg L-1 e cresoxim-metílico em 0,75 mg L-1 (OTA 4 +CM).

Posteriormente, o meio de cultura foi adicionado aos reatores e homogeneizado em

agitador rotatório a 100 rpm durante 10 min para solubilização dos contaminantes,

seguida da adição do inóculo. O cultivo controle foi realizado sem a adição dos

contaminantes. Alíquotas foram retiradas assepticamente a cada 24 h de cultivo

para o acompanhamento da concentração celular, pH, concentração de açúcares

redutores, atividade enzimática da peroxidase, produção de glutationa, proteínas

solúveis totais, etanol e extração e quantificação da ocratoxina A. Ao final de 96 h

da fermentação foi realizada a microscopia nas células da levedura.

4.2.4.3 Determinações tecnológicas no fermentado: acidez, etanol, açúcar redutor,

proteínas e MEV

O pH foi medido potenciometricamente com pHmetro calibrado com as

soluções tampões de pH 4 e 7, conforme AOAC (2000).

Os açúcares redutores foram determinados pelo método ácido 3,5-

dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959), usando glicose para a curva padrão. A cada

1 mL de meio fermentado, foi adicionado 1 mL de NaOH (0,1 M) e 1 mL de DNS.

Incubados a 100 °C, durante 5 min e resfriados em banho de gelo. O volume de

7 mL de água destilada foi adicionado e a absorbância medida a 540 nm em

espectrofotômetro (Cary UV-VIS 100, Walnut Creek, EUA).

Para a quantificação das proteínas solúveis totais foi utilizado o método

adaptado de Lowry et al.,(1951). A cada 0,5 mL de amostra foi adicionado, 0,5 mL

NaOH (1 mol L-1), 4 mL de solução alcalina (Anexo 1), deixando reagir por 10 min,

e posteriormente, 1 mL do reagente de Folin-Ciocalteau 2 mol L-1 (diluído 1:2 com

água destilada). Após 30 min as absorbâncias foram medidas em

espectrofotômetro a 660 nm (Cary UV-VIS 100, Walnut Creek, EUA).

O etanol foi quantificado de acordo com Klarić et al., (2014) em cromatógrafo

a gás (CG-2010 Shimadzu) equipado com injetor Split / Splitless e detector de

ionização de chama, coluna Crossbond (diphenil dimethil polysiloxane) de 30 m,

0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de espessura de 75% de película-fenil-

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metilpolisiloxano. O volume de injeção manual empregado foi de 1 µL, a

temperatura de entrada 230 °C, a pressão da coluna de 2,33 psi e a vazão do gás

de arraste de nitrogênio 0,5 mL min-1. A velocidade média do gás de nitrogênio de

10 cm s-1. A temperatura do forno foi mantida a 26 °C durante 7 min e em seguida

aumentou de 26 °C para 50 °C a uma taxa de 1 °C min-1 e finalizando com 200 °C

(taxa de 15 °C min-1) durante 4 min. A temperatura do detector por ionização de

chama (FID) foi de 250 °C e o fluxo do gás transportador de nitrogênio foi

de 25 mL min -1. O etanol foi identificado através da elaboração de uma curva com

o padrão do etanol diluído em água ultrapura e os resultados foram expressos em

porcentagem.

Ao final da fermentação (96 h) alíquotas do precipitado celular foram

mantidas durante 48 h a 4 °C em 1 mL de solução de glutaraldeído (3%) em

tampão fosfato 0,05 M (pH 6,8). As amostras foram lavadas com água destilada e

desidratadas com lavagens sucessivas de etanol (30, 50, 70 e 95%),

permanecendo 20 min em cada concentração e 45 min em etanol absoluto. Após,

foram secas em estufa a 30°C, colocadas em stubs e cobertas com ouro paládio

para visualização em microscópio eletrônico de varredura com espectro de energia

dispersiva a 25 kV e com magnitude de 1000 a 5000 X (TAO; JIA; ZHOU, 2014).

4.2.4.4 Determinações bioquímicas no fermentado: concentração celular,

atividade enzimática da peroxidase, produção de glutationa e concentração de OTA

A concentração celular foi avaliada em espectrofotômetro (Cary UV-VIS 100,

Walnut Creek, EUA) pela medida da densidade óptica de OD600nm. Para obter a

concentração celular foi feita uma curva padrão a partir da levedura cultivada nas

mesmas condições do inóculo. Após 24 h parte do meio foi centrifugado a 1894 g

durante 10 min e o sobrenadante descartado. A massa celular foi lavada com água

destilada seguido de secagem em estufa a 60 °C até atingir massa constante. No

meio fermentado restante foram feitas diferentes diluições com água destilada e

determinada a absorbância. De acordo com o resultado de massa celular seca foi

determinada a concentração celular para cada diluição. Com os dados obtidos foi

realizada a regressão linear obtendo a curva padrão para o cálculo da

concentração celular (mg mL-1) (Chang et al., 2018).

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A glutationa intracelular foi extraída com 1,5 mL de etanol 40%, adicionado a

1,5 mL de meio fermentado, seguido de banho a 30 °C por 2 h e centrifugado a

1804 g, por 10 min. Para a reação colorimétrica foi adicionado 1,5 mL de tampão

fosfato de potássio 0,5 mol L-1 (pH 8,0), 0,03 mL de ácido 5,5-ditiobis-2-

nitrobenzóico a 0,5 mL do sobrenadante. Após 3 min a absorbância foi medida em

espectrofotômetro a 412 nm (Cary UV-VIS 100, Walnut Creek, EUA). A solução de

etanol 40% substituiu o sobrenadante configurado como branco (Owens e Belcher,

1965). A concentração de GSH (mg mL-1) foi calculada usando a curva padrão, de

L-glutationa reduzida. A solução de GSH foi preparada em 100 mL, dissolvendo

0,01 g em HCl 0,01 mol L-1 (resfriado) sendo mantida congelada. Para o preparo da

solução de DTNB, 0,396 g deste reagente e 0,15 g de NaHCO3 foram dissolvidos

em tampão fosfato de sódio (0,1 mol L-1, pH 7,0). O volume foi ajustado para

100 mL e a solução mantida congelada até o momento do uso.

A atividade enzimática da peroxidase (PO) foi realizada de acordo com

Garda-Buffon; Kupski; Furlong (2011). A cada 1 mL de meio fermentado, foi

adicionado: 1,5 mL de tampão fosfato 5 mmol L-1 (pH 6,0), 2 mL de água destilada,

0,5 mL do substrato guaiacol (0,5%) e 1 mL de peróxido de hidrogênio (0,08%). A

mistura foi incubada durante 30 min em banho-maria a temperatura de 30 ºC e a

absorbância dos compostos oxidados determinadas em espectrofotômetro a

470 nm (Cary UV-VIS 100, Walnut Creek, EUA). A unidade de atividade específica

da enzima PO é definida como a massa de proteína capaz de aumentar a unidade

de absorbância em 0,001/min-1 mgproteína-1.

A extração e quantificação de OTA do meio de cultura fermentado foram

realizadas conforme descrito no item 4.2.2.2.

4.2.4.5 Parâmetros cinéticos

A velocidade máxima de crescimento (µmax) foi obtida pela regressão

exponencial aplicada à fase logarítmica de crescimento (HAMIDI-ESFAHANI et al.,

2007).

Os fatores de relação* (GSH) e relação** (PO) foram estimados empregando

as Equações 11 e 12 respectivamente:

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relação* (GSH) = OTA ng/ml / GSHmg/ml (11)

relação** (PO) = OTA ng/ml / POU/ml (12)

Onde:

OTA ng/ml= concentração de ocratoxina A (ng mL-1).

GSHmg/ml = produção de glutationa.

POU/ml = atividade da peroxidase.

Os fatores de conversão YP/S (substrato em produto), YX/S (substrato em

biomassa) e YP/X (biomassa em produto) foram estimados empregando as

equações 13, 14 e 15 respectivamente: (SCHMIDELL et al., 2001).

YP/S = P - P0 / S0 - S (13)

YX/S = X - X0 / S0- S (14)

YP/X = P-P0 / X0-X (15)

Onde:

P = produto (GSH) ou (etanol); S = substrato (glicose); X = biomassa (células).

4.2.6 Limpeza de vidraria e tratamento de resíduos

A limpeza da vidraria utilizada nos experimentos e os resíduos dos ensaios

foram tratados através da imersão do material em hipoclorito de sódio na

concentração de 1%. Esta solução degrada a estrutura química dos compostos,

permitindo o descarte do material. Os resíduos de solventes orgânicos foram

rotulados e armazenados de acordo com a sua classificação, seguindo

regulamento para tratamento de resíduos estabelecidos na Escola de Química e

Alimentos.

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38

4.2.7 Análise Estatística

Todos os ensaios foram realizados em triplicata. A análise estatística dos

dados foi realizada utilizando o programa “Statistica” (versão 7.0, Statsoft, Inc.,

Tulsa, EUA) usando análise de variância (ANOVA), considerando a média das

triplicatas dos ensaios por teste de Tuckey a 5% (p < 0.050).

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39

5. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

5.1 ESTUDO DA OCORRÊNCIA DE OTA EM VINHO

A validação do método analítico de acordo com as figuras de mérito indicado por

órgão regulamentadores (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003; EUROPA COMISSION

REGULATION (EC), 2006) apresentado na Tabela 3. Devido a presença de

interferentes, a curva de calibração foi realizada na matriz, com coeficiente de

correlação linear acima de 0,99 e o método apresentou exatidão com recuperações

entre 80 e 99% (Sante, 2017).

Tabela 3- Parâmetros de validação do método QuECHeRS

Parâmetros Curva na matriz

Equação da curva y= 4248,2x- 2796,8

Lineariedade 0,5- 5,0 μg L-1

Coeficiente de correlação 0,99

LODM 0,34 μg L-1

LOQM 0,5 μg L-1

OTA no vinho Recuperação (%)

1,0 μg L-1

99

Níveis 2,0 μg L-1

80

5,0 μg L-1

85

LODM – Limite de detecção do método; LOQM- Limite de quantificação do método.

Após a validação do método, a avaliação da ocorrência de OTA foi realizada em

50 amostras de vinho tinto de marcas variadas e diferentes lotes produzidos no estado

do Rio Grande do Sul. As determinações foram realizadas em triplicata, apresentando

concentrações detectáveis de OTA em 43 amostras, estando 28 amostras com

concentrações abaixo de 2 µg L-1, limite máximo tolerado (LMT) pela legislação

brasileira (ANVISA, 2017). Na Tabela 4 esta apresentada a média de OTA nas

amostras de vinho e também a faixa de ocorrência. Em 7 amostras de vinho OTA não

foi detectada mas em15 amostras de vinho as concentrações estavam acima do LMT,

estabelecido pela RDC n.° 7/2011 (ANVISA, 2017). Os dados de ocorrência de OTA

nas amostras de vinho tinto esta apresentado no Anexo 2.

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40

Tabela 4- Dados de OTA em 50 amostras de vinho tinto, 31 do tipo seco e 19 do tipo suave, obtidos no estado do Rio Grande do Sul.

Vinho Tinto Seco Suave

Número de Amostras

50

31

19

Positivas (%)

43 (86%)

28 (93%)

15 (75%)

Não detectada (%) 7 (14%) 3 (10%) 4 (20%)

Acima do LMT* (%) 15 (30%) 9 (18%) 6(12%)

Média detectada (µg L-1

) 1,63

2,08

1,07

Mínimo (µg L-1

) 0,71 0,71 0,75

Máximo (µg L

-1)

4,65

4,65

2,78

Carbenet Sauvignon - 12 8

Merlot - 5 2

Pinot noir - 3 5

Malbec - 8 -

Acima do LMT*: Limite máximo tolerado 2 µg L-1

(ANVISA, 2017).

Os resultados obtidos estão de acordo com outros autores que relatam a

ocorrência de OTA em vinhos proveniente de países como Argentina, entre 0,02-

4,82 µg L-1 (PONSONE et al., 2010), Brasil 4,50 µg L-1 (WELKE et al., 2010), China

entre <0,1- 5,65 µg L-1 (ZHANG et al., 2013) e Itália entre <1- 3,86 µg L-1 (PIETRI

et al., 2010). Em outros estudos a faixa detectada foi menor, como nos vinhos

provenientes da África, entre 0,08 - 0,4 µg L-1 (REMIRO et al., 2013), Brasil entre

0,03-0,62 µg L-1 (TERRA et al., 2012), China entre 0,01- 0,98 µg L-1 (ZHONG et al.,

2014), Grécia entre 0,1 - 0,71 µg L-1 (SARIGIANNIS et al., 2014), Itália entre

0,35 - 2,34 µg L-1 (PRELLE et al., 2013), Portugal entre 1 - 1,23 µg L-1 (PENA et al.,

2011) e Tunísia entre 0,09 - 1,50 µg L-1 (LASRAM et al., 2013).

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41

A ocorrência mundial de contaminação com ocratoxina A em vinhos tinto

está relacionada ao processo de vinificação, pois durante a maceração das uvas, a

micotoxina presente é transferida para o vinho aumentando a concentração de

OTA no produto final (WELKE et al., 2009). É necessário salientar que a ocorrência

da micotoxina além de causar alterações das propriedades sensoriais do vinho,

gera preocupação quanto à saúde dos consumidores (SERRATOSA et al., 2010).

O consumo de vinho no Brasil cresceu 15,8% no ano de 2018, ocupando a

17° posição no ranking do consumo mundial, sendo ingerido 330 milhões de litros

anualmente, equivalentes a 2 L per capita ( WURZ et al., 2019). Este fato deve ser

considerado relevante quando relacionado à ocorrência de OTA em vinhos.

A verificação do risco à saúde da população consumidora de vinho tinto foi

realizada de acordo com a estimativa quantitativa da ingestão da ocratoxina A

(Equação 5). (ZHONG et al.,2014), levando-se em consideração o consumo médio

per capita anual de 2 L de vinho na concentração média de OTA de 1,63 µg L-1, o

peso corpóreo médio no Brasil de 70 e 60 kg para homens e mulheres,

respectivamente (IBGE, 2008), resultando na estimativa da concentração de OTA

ingerida anualmente de 0,046 µg kg-1 para os homens e 0,054 µg kg-1 para as

mulheres. Considerando o consumo diário de uma taça de 200 mL de vinho

(PRADO et al., 2013), durante 7 dias o consumo seria de 0,032 µg kg-1 para os

homens e 0,038 µg kg-1 para as mulheres. Considerando a concentração máxima

encontrada de 4,65 µg de OTA por litro de vinho, teríamos o consumo de 0,093 µg

kg-1 para os homens e 0,108 µg kg-1 para as mulheres.

Estas concentrações são consideradas seguras em relação à exposição de

OTA definida pela Autoridade Européia para a Segurança Alimentar (EFSA, 2006)

e também pelo Comitê Especialista em Aditivos Alimentares das Nações

Unidas/Organização Mundial da Saúde (JECFA, 2001), que estabelecem à dose

semanal máxima tolerável de 0,120 µg kg-1 de peso corporal. No entanto, foi

estimado o risco consumo diário relativo somente ao vinho, sem considerar o

consumo em conjunto a outros alimentos como arroz (GOMES et al., 2015), cereais

(PINOTTI et al., 2016) e frutas (OUF et al., 2015) que são descritos pelos altos

níveis de contaminação por OTA. Este dado é importante para ser considerado na

dieta brasileira e assim estimar o risco de exposição à OTA a que brasileiros estão

submetidos.

Page 60: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

42

De acordo com os dados obtidos na ocorrência de OTA em vinho tinto,

percebe-se que um elevado índice de amostras apresentou quantidades

detectáveis de micotoxina. O que torna importante o estudo do potencial toxigênico

de Aspergillus carbonarius na presença dos fungicidas, cresoxim-metílico e

famoxadona, utilizados no cultivo de uvas.

5.2 ESTUDO DO POTENCIAL TOXIGÊNICO EM PRESENÇA DOS FUNGICIDAS

5.2.1 Crescimento micelial e conteúdo de glicosamina

Os dados de crescimento micelial de Aspergillus carbonarius ao longo dos 7

dias de tratamento, para o grupo controle e os expostos aos fungicidas cresoxim-

metílico na concentração 1000 µg mL-1 e famoxadona na concentração de 600 µg

mL-1 são apresentados na Figura 7.

Figura 7- Dados do crescimento micelial durante 7 dias de tratamento, para o grupo controle e os expostos aos fungicidas cresoxim-metílico na concentração

1000 µg mL-1 e famoxadona na concentração de 600 µg mL -1.

As imagens do crescimento micelial referente ao último dia de tratamento

podem ser observadas na Figura 8. O grupo controle (A) sem o tratamento com

fungicida e os grupos tratados com os fungicidas cresoxim-metílico 1000 µg mL-1

(B) e famoxadona 600 µg mL-1 (C).

Page 61: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

43

Figura 8- Crescimento micelial durante 7 dias de tratamento. (A) grupo controle, (B) grupo tratado com cresoxim-metílico 1000 µg mL-1, (C) grupo tratado com

famoxadona 600 µg mL-1.

Os grupos tratados com os fungicidas cresoxim-metílico (B) e famoxadona

(C) apresentaram uma redução de 70 e 60%, respectivamente, no crescimento

micelial. Os dados de percentual de inibição de crescimento estão relacionados ao

grupo controle sem a presença do fungicida (A). Após o 5° dia de incubação, não

houve diferença significativa na inibição do crescimento micelial em ambos os

grupos tratados com os fungicidas demonstrando a eficácia do fungicida (Figura 9).

Figura 9- Inibição do crescimento micelial nos tratamentos com os fungicidas durante 7 dias de tratamento em relação ao grupo controle.

Dados do gráfico obtido por ANOVA seguida de Tukey, Letras idênticas, representa ausência de diferença significativa.

Page 62: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

44

Os fungicidas das classes das estrobilurinas e oxazolidinone são eficazes

para combater o crescimento micelial e são conhecidos como inibidores de

quinona, por possuírem grupos químicos que se ligam ao sítio específico na

mitocôndria, onde ocorre à respiração celular, esse local é chamado de sítio de

oxidação quinol (Qo). Essa ligação impede a transferência de elétrons entre o

citocromo B e o citocromo C, interrompendo a síntese de ATP e a produção de

energia. Uma ação rápida que interrompe o primeiro ciclo de vida dos fungos, no

estágio de esporos (BALBA et al., 2007). Essas classes de fungicidas são muito

utilizadas em todo o mundo para o controle de doenças em cereais, frutas e

vegetais (ABREU et al., 2006; LIKAS et al., 2007, KOSOLOVA et al., 2017).

Durante os 7 dias de incubação a diferença entre os grupos tratados e o

grupo controle pode ser enfatizada pela velocidade máxima de crescimento. O

grupo controle sem o tratamento com os fungicidas apresentou uma velocidade

máxima de crescimento de 1,68 µ (h-1), o grupo tratado com o fungicida cresoxim-

metílico apresentou uma menor taxa de crescimento, possuindo um período de

latência entre o terceiro e quarto dia de acompanhamento de formação do micélio,

apresentando uma velocidade máxima de crescimento de 0,19 µ (h-1). O grupo

tratado com o fungicida famoxadona, apresentou um maior crescimento

exponencial que o grupo tratado com cresoxim-metílico, embora mais lento do que

no grupo controle, apresentando a velocidade máxima de crescimento de

0,44 µ (h-1). Pela avaliação de velocidade máxima de crescimento, observa-se que

os grupos tratados com os fungicidas tiveram uma redução na velocidade de

crescimento. O grupo tratado com o fungicida cresoxim-metílico apresentou uma

menor velocidade de crescimento, apresentando ao final dos 7 dias de incubação

um halo fúngico em torno 2 cm. O grupo tratado com o fungicida famoxadona

apresentou uma velocidade de crescimento superior chegando ao final do período

de 7 dias de incubação com um halo em torno de 4 cm. Os resultados obtidos

comprovam a eficácia dos fungicidas em reduzir significativamente o crescimento

de Aspergillus carbonarius em relação ao grupo controle, sendo o fungicida

cresoxim-metílico o mais eficaz (Figura 9).

O crescimento micelial também foi acompanhado, pela determinação do

conteúdo de glicosamina (Tabela 5). A parede celular fúngica é composta

principalmente de quitina, um polímero linear e insolúvel que consiste em ligações

Page 63: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

45

α-1,4-n-acetilglicosamina, portanto um bom indicador do desenvolvimento fúngico

(AIDOO et al., 1981; SCOTTI et al., 2001).

A medida do crescimento dos fungos pelo conteúdo de glicosamina foi,

neste caso, um indicador confiável de crescimento, pois está diretamente

relacionado com os dados de crescimento micelial em todos os grupos. O grupo

controle apresentou um significativo crescimento ao longo dos 7 dias de incubação,

principalmente no quarto e sétimo dia, também apresentando os maiores

conteúdos de glicosamina. O grupo tratado com cresoxim- metílico que apresentou

uma taxa de crescimento mais lenta durante os 7 dias de incubação também

apresentou uma menor concentração de glicosamina. O grupo tratado com

famoxadona obteve uma maior taxa de crescimento e também um maior conteúdo

de glicosamina.

Tabela 5- Crescimento do halo (cm) e conteúdo de glicosamina no grupo controle sem a presença de fungicida e nos grupos de tratados com os fungicidas

cresoxim-metílico e famoxadona.

Tempo

(dias)

Controle Cresoxim-metílico Famoxadona

Halo

(cm-1

)

Glicosamina

(mg g-1

)

Halo

(cm-1

)

Glicosamina

(mg g-1

)

Halo

(cm-1

)

Glicosamina

(mg g-1

)

1 1,00a

1,2 a

1,00a

1,2 a

1,00a

1,2 a

2 1,40ab

3,2 b

1,36ab

2,7 b

1,70bc

3,1 b

3 3,03f

7,8fg

2,00bcd

5,2 c

2,03bcd

5,2 c

4 4,10h

8,4g

2,00bcd

5,3 cd

2,63def

5,3 cd

5 7,03i

15,4h

2,00bcd

5,3 cd

2,76ef

5,9d

6 8,20j

19,6 i

2,13cde

5,5 cd

3,23fg

6,8e

7 9,46k

23,8 j

2,26cde

5,7 d

3,86gh

7,6f

Valores médios de ensaios realizados em triplicata ± desvio padrão. Letras iguais indicam que não há diferenças estatisticamente significativas (p> 0,05).

Na Figura 10 observa-se a relação direta entre o crescimento micelial e o

conteúdo de glicosamina. Os resultados encontrados estão de acordo com

PAGNUSSATT et al., (2013) que também constataram que a medida de

crescimento pelo conteúdo de glicosamina em Fusarium graminearum também foi

um bom indicativo de crescimento fúngico.

Page 64: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

46

5.2.2 Produção de OTA pelo fungo Aspergillus carbonarius

Aspergillus carbonarius tem seu destaque por ser um dos mais importantes

patógenos encontrados em uvas (LAPPA et al., 2017). Sua produção de micotoxina

foi quantificada pela determinação de OTA do meio de cultura dos grupos tratados

e do grupo controle. Os cromatogramas gerados, em HPLC-FL, estão

apresentados nas Figuras 11, 12 e 13.

Altas concentrações de OTA (Tabela 6) foram produzidas pelo fungo

Aspergillus carbonarius, evidenciando que os fungicidas utilizados foram eficazes

em inibir o crescimento, mas também elevaram o potencial toxigênico dos fungos

resistentes.

Figura 10- Crescimento micelial (cm) e o conteúdo de glicosamina (mg g-1) no grupo controle sem fungicida (A), e nos grupos de tratamento cresoxim-metílico

(1000 µg mL- 1) (B) e famoxadona (600 µg mL-1) (C).

Page 65: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

47

Figura 11- Cromatograma obtido em HPLC-FL de OTA produzida no meio BDA no grupo controle.

Figura 12- Cromatograma obtido em HPLC-FL de OTA produzida no meio BDA no grupo tratado com famoxadona.

Figura 13- Cromatograma obtido em HPLC-FL de OTA produzida no meio BDA no grupo tratado com cresoxim-metílico.

Os grupos tratados com os fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona

tiveram um menor crescimento micelial. No entanto, possivelmente devido ao

estresse químico causado na presença dos fungicidas, houve um aumento

significativo da produção de micotoxina. O grupo controle no último dia de

incubação produziu 199,3 ng g-1 de OTA, estando de acordo com estudos descritos

na literatura, os quais evidenciam a produção de OTA por Aspergillus carbonarius

(Tabela 6) (CHEONG et al., 2017; ZHANG et al., 2017; TRYFINOPOULOU et al.,

2019; KAPETANAKOU et al., 2018).

Quando comparado com o grupo controle, os fungos tratados com

famoxadona produziram o dobro de concentração de OTA, mas com um

Page 66: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

48

crescimento fúngico 40% menor, enquanto para os fungos tratados com cresoxim-

metílico a concentração de OTA foi semelhante ao grupo controle e o crescimento

fúngico foi 30% menor.

Tabela 6- Produção de Ocratoxina A pelo fungo Aspergillus carbonarius no grupo controle sem a presença de fungicida e nos grupos de tratamento com os

fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona.

Tempo

(dias)

Controle Cresoxim-metílico Famoxadona

Halo

(cm-1

)

OTA

(ng g-1

)

Halo

(cm-1

)

OTA

(ng g-1

)

Halo

(cm-1

)

OTA

(ng g-1

)

1 1,00a

0a

1,00a

0a

1,00a

0a

2 1,40ab

11,95abc

1,36ab

2,47ab

1,70bc

2,98ab

3 3,03f

31,25bcd

2,00bcd

4,29ab

2,03bcd

37,69cd

4 4,10h

55,75de

2,00bcd

94,3fg

2,63def

128,4hi

5 7,03i

70,3ef

2,00bcd

120,5gh

2,76ef

141,3hi

6 8,20j

133,6hi

2,13cde

135,0hi

3,23fg

206,7j

7 9,46k

199,3j

2,26cde

151,3i

3,86gh

408,3k

Letras idênticas significam ausência de diferenças estatísticas (p> 0,05)

O potencial toxigênico do fungo Aspergillus carbonarius foi determinado de

acordo com a relação entre a produção de OTA e o tamanho do halo fúngico

(Figura 14). Com base na relação, observa-se que no quinto dia de tratamento com

cresoxim-metílico o potencial toxigênico do fungo foi maior do que o potencial

toxigênico quando tratado com famoxadona, não apresentando diferença

significativa no segundo, quarto e sexto dia de tratamento.

Figura 14- Crescimento do halo fúngico, produção de Ocratoxina A pelo fungo Aspergillus carbonarius e relação entre produção de OTA e crescimento fúngico no

grupo controle sem fungicida (A), e nos grupos de tratamento cresoxim-metílico (1000 µg mL- 1) (B) e famoxadona (600 µg mL-1) (C).

Page 67: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

49

Para uma melhor compreensão da eficácia dos fungicidas e o seu potencial

toxigênico sobre o fungo Aspergillus carbonarius, torna-se necessária a análise do

índice de inibição da produção de micotoxinas (IMM), do índice de inibição do

crescimento micelial (IMG) e o índice de inibição específico da produção de

micotoxina (IMM esp/fung). O índice de inibição específico da produção de

micotoxina é a estimativa da inibição por grama de fungicida utilizado durante os

tratamentos. Os dados de inibição estão na Tabela 7.

Tabela 7- Inibição da produção de micotoxinas (IMM), de inibição do crescimento micelial (IMG) e de inibição específica da produção de micotoxinas por grama de

fungicida na placa de cultura (IMM Esp. / Fungicida).

Tempo (dias)

IMM IMG IMM

esp. fung.

Cresoxim-

metílico* Famoxadona**

Cresoxim-

metílico* Famoxadona**

Cresoxim-

metílico* Famoxadona**

1 0h

0h 0

h 0

h 0

h 0

h

2 0,78l

0,74k

0,02c

-0,21a

2,6E-0,2k

4,1E-0,2m

3 0,87m

-0,16g

0,34d

0,33d

2,9E-0,2l

-8,7E-0,3g

4 -0,6d

-1,27a

0,51f

0,36e

-2,0E-0,2e

-7,1E-0,2a

5 -0,58e

-0,81c

0,72i

0,61h

-1,9E-0,2f

-4,5E-0,2c

6 0,05i

-0,45f

0,74j

0,61h

1,7E-0,3i

-2,5E-0,2d

7 0,27j

-.0,96b

0,76k

0,59g

9,03E-0,3j

-5,3E-0,2b

* 1000 µg mL-1

, ** 600 µg mL-1

O emprego da concentração de fungicida recomendada pelos fabricantes

mostrou que o fungicida cresoxim-metílico foi o mais efetivo na inibição do

crescimento micelial, apresentando também uma menor produção de micotoxina

quando comparado ao fungicida famoxadona. Cresoxim-metílico inibiu até 76% o

crescimento micelial, principalmente entre os dias 5 e 7 de tratamento e o

famoxadona inibiu 61%.

A partir do terceiro dia de incubação pode-se observar que o grupo tratado

com famoxadona apresentou maior produção de micotoxina em relação ao grupo

controle. O fungicida cresoxim-metílico inibiu a produção de micotoxina até o

terceiro dia de incubação e apresentou no sétimo dia cerca de 76% de IMG e 27%

de IMM em relação ao grupo controle e 41% e 62% da produção, respectivamente,

quando comparado ao grupo tratado com famoxadona. Em relação à inibição

Page 68: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

50

específica, o fungicida famoxadona apresentou eficiência apenas no segundo dia

de tratamento e o fungicida cresoxim-metílico apresentou uma melhor eficiência na

inibição específica por todo período de ensaio, observado na Tabela 7.

Fato semelhante foi descrito por Elnner (2005) para fungicidas pertencentes

à classe das estrobilurinas, os quais potencializaram a produção de micotoxina por

fungos do gênero Fusarium, demonstrando que a presença do fungicida aumentou

o potencial toxigênico do fungo. Feska et al., (2019) também relataram que o uso

de fungicidas contendo estrobilurinas foi eficiente na redução da contaminação

fúngica por Fusarium em grãos, mas o uso destes fungicidas causaram aumento

na produção da micotoxina desoxinivalenol. Andrieu et al., (2001) verificaram a

potente eficácia de famoxadona na inibição do crescimento de esporos de

Plasmopara vitícola e Phytophthora infestans, usando concentrações abaixo de

1 mg L-1. A inibição do crescimento fúngico acompanhado pelo aumento da síntese

de metabólitos secundários pelas cepas resistentes também é observada em

outras classes de fungicida (SCHMIDT et al., 2008). Corio-Costet (2011) também

relata que inicialmente a utilização de fungicidas do grupo QoI foram bem

sucedidos contra Plasmopara viticola, uma das doenças economicamente mais

importantes no cultivo de uvas em todo o mundo, mas estudos contraditórios

comprovam que vem ocorrendo uma diminuição significativa na eficácia

antifúngica, devido ao aparecimento de cepas resistentes.

A utilização de fungicidas embora possa ser eficaz na prevenção do

crescimento de fungos, pode não apresentar a mesma eficiência na prevenção da

produção de micotoxina. Outro fato importante é que o uso de fungicidas na

agricultura pode levar ao surgimento de resistência fúngica entre espécies

toxigênica, além disso, estes isolados resistentes são capazes de permanecer no

ambiente na ausência do fungicida (CORIO-COSTET et al., 2012).

É importante ressaltar a eficiência antifúngica de alguns compostos

químicos, obtidos de fontes naturais, entre eles: compostos fenólicos, óleos

essenciais e peptídeos (HEIDTAMANN-BEMVENUTI et al., 2012, PAGNUSSAT et

al., 2012). A taxa de crescimento fúngico de 12 cepas toxigênicas de Fusarium

graminearum, foi reduzida com a utilização de compostos fenólicos obtidos da

Spirulina (PAGNUSSAT et al., 2013). No estudo de Gabaston et al., (2017), a

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51

utilização de estilbenos, uma classe de compostos polifenólicos, demonstraram

potencial como fungicida natural contra o míldio P. vitícola.

O uso de óleos essenciais vegetais também atraiu a atenção dos

pesquisadores Wang et al., (2018), os quais investigaram as ações antifúngicas de

11 óleos essenciais contra três tipos de fungos toxigênicos: Aspergillus flavus,

Penicillium viridicatum e Aspergillus carbonarius. Eles identificaram que 4 dos 11

óleos essenciais analisados apresentaram capacidade antifúngica, promovendo

forte inibição do crescimento fúngico, os quais foram medidos pelo diâmetro das

colônias formadas.

A utilização de produtos naturais com ação antifúngica é uma boa alternativa

na tentativa de reduzir o uso de fungicidas químicos na agricultura. Além disto, a

utilização de fungicidas não tem sido totalmente eficaz na proteção das plantações,

principalmente quando relacionado ao desenvolvimento da resistência fúngica.

Sendo assim, o uso desses compostos naturais poderia ser uma maneira

eficaz e segura de proteger as culturas contra fungos toxigênicos, pois além dos

fungicidas não estarem sendo completamente eficaz no combate ao crescimento

fúngico, a sua utilização acentua a produção de micotoxinas pelas espécies

toxigênicas resistentes.

5.3 EFEITO DA MICOTOXINA OTA E DOS FUNGICIDAS CRESOXIM METÍLICO

E FAMOXADONA NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

5.3.1 Alterações bioquímicas: produção de biomassa, atividade enzimática da

peroxidase, produção de glutationa e concentração de OTA

A concentração celular foi monitorada diariamente durante 96 h de

fermentação (Tabela 8), apresentando crescimento exponencial em todos os

cultivos até 48 h. O mesmo comportamento foi relatado por Li et al., (2018) durante

a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae exposta a concentrações

de 100 µg L-1 a 1000 µg L-1 da micotoxina patulina.

A partir de 72 h de fermentação no grupo controle e nos grupos expostos

apenas aos fungicidas foi observado à fase de declínio do desenvolvimento da

levedura, apresentando uma concentração celular em torno de 16% menor.

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52

Enquanto nos grupos expostos a micotoxina nas concentrações de 2 µg L-1 e

4 µg L-1 e nos grupos coexpostos aos fungicidas e micotoxinas a partir da 72h de

fermentação foi observado a manutenção da fase estacionária do desenvolvimento

da levedura, apresentando uma menor concentração celular.

Tabela 8- Concentração celular (mg mL-1) de cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos

fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona e no controle sem contaminantes.

Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1

: S.c. em MCS + OTA 2 µg L

-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L

-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico

(0,75 mg L-1

); CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1

) + OTA 2µg L-1

, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1) + OTA 4 µg L

-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1), F+

OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L-1

) + OTA 2 µg L-1

, F+ OTA 4 µg L-1

: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 4 µg L

-1.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor

que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).

OTA nas concentrações de 2 e 4 µg L-1 reduziu em torno de 45% o

crescimento celular. Resultado semelhante foi encontrado no estudo de Abolmaali

et al., (2008), quando a levedura Saccharomyces cerevisiae em presença da

micotoxina deoxinivalenol na concentração de 5 µg mL-1, apresentou uma redução

de 50% em seu crescimento, quando comparado ao grupo controle. A inibição do

crescimento celular em presença da micotoxina ocorre pelo elevado gasto

energético na ativação das rotas metabólicas de detoxificação reduzindo a sua taxa

de crescimento (FRANCESCA et al., 2010).

Entre as rotas metabólicas de detoxificação destaca-se a atividade

enzimática da peroxidase (PO) e a produção de glutationa (GSH) que estão

relacionadas a processos redox. A redução de OTA do meio foi calculada pelas

Equações 11 e 12, respectivamente (Tabela 9).

Tempo

(h) Controle

OTA

2 µg

OTA

4 µg CM

CM +

OTA

2 µg

CM +

OTA

4 µg

F

F+

OTA

2 µg

F+

OTA

4 µg

0 0,30a

0,29a

0,28a

0,27a

0,26a

0,28a

0,25a

0,26a

0,28a

Conc. 24 2,16b

1,07b

1,12b

1,79b

1,81b

2,13b

1,45b

1,93b

1,95c

Celular 48 5,84d

2,82c

2,81c

5,28d

3,10d

3,12d

5,41d

3,28d

2,75d

(mg mL-1) 72 5,75

d 2,24

d 2,29

d 4,65

d 2,50

c 2,79

c 4,16

d 2,53

c 1,40

b

96 4,83c

2,18d

2,16d

3,95c

2,44c

2,69c

3,48c

2,47c

1,34b

Page 71: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

53

Tabela 9- Relação entre a concentração de ocratoxina A (OTA) e a produção de glutationa (GSH) e a atividade da enzima peroxidase (PO) nos cultivos realizados com

Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona.

Cultivo Tempo

(h)

OTA

(µg L-1

)

OTA

(%)

GSH

(mg mL-1

)

Relação*

(OTA/GSH)

PO

(U mL-1

)

Relação**

(OTA/PO)

0 1,97a 100 0,11

a 19 0,004

a 510

24 0,78b 40 0,40

b 2,0 0,044

b 18

OTA 48 0,45c 23 0,50

b 0,9 0,048

b 9,5

(2 µg L-1

) 72 1,03d 52 0,76

c 1,4 0,009

a 115

96 1,06d 54 1,10

d 1,0 0,022

c 48

0 3,97a

100 0,13a

30 0,005a

817

OTA 24 2,82b

71 0,43b

6,6 0,052b

55

(4 µg L-1

) 48 1,43e

36 0,75c

1,9 0,080c

18

72 2,22d

56 0,86d

2,6 0,055b

41

96 2,51e

63 1,17e

2,1 0,017a

153

0 1,97a

100 0,12a

17 0,008ab

253

CM 24 1,34b

68 0,29b

4,7 0,068c

19

+ 48 1,22b

62 0,57c

2,2 0,018b

67

(2 µg L-1

) 72 1,06c

54 0,64d

1,5 0,006a

186

96 0,85d

43 1,11e

0,8 0,011ab

76

0 3,95a

100 0,10b

40 0,005a

753

CM 24 2,82b

71 0,54a

5,3 0,068c

37

+ 48 2,60d

66 0,58a

4,5 0,015a

181

(4 µg L-1

) 72 2,52d

64 0,71a

3,6 0,008a

307

96 1,57c

40 1,21c

1,3 0,033b

47

0 1,98a 100 0,15

b 13 0,008

a 241

F 24 1,50d

76 0,44a

3,4 0,087c

17

+ 48 1,39d

70 0,43a

3,1 0,018a

76

(2 µg L-1

) 72 1,23b

62 0,71c

1,7 0,097a

127

96 0,67c

34 1,47d

0,4 0,035b

19

0 3,96a

100 0,15b

26 0,007a

564

F 24 2,77b

70 0,41a

6,7 0,085d

32

+ 48 2,52c

64 0,46a

5,5 0,037c

68

(4 µg L-1

) 72 2,16d

55 0,73c

2,9 0,011a

187

96 1,75e

44 1,30d

1,4 0,023b

80

Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1: S.c. em MCS + OTA

2 µg L-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L

-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1); CM + OTA 2 µg: S.c.

em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L

-1, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1) +

OTA 4 µg L-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 2 µg L

-1,

F+ OTA 4 µg L-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 4 µg L

-1.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de

variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).

Page 72: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

54

A elevação da atividade enzimática da PO e o aumento da produção de

GSH, no intervalo de 48 h de fermentação nos cultivos expostos a OTA nas

concentrações 2 µg L-1 e 4 µg L-1, estão relacionadas a redução na concentração

da micotoxina observado em 77% e 64%, respectivamente.

Os cultivos co-expostos a micotoxina e fungicidas apresentaram

comportamentos diferentes. A concentração de OTA foi diminuindo ao longo das

96h de fermentação. Os cultivos expostos à OTA e ao cresoxim-metílico

apresentaram no tempo de 24 h uma redução em torno de 30% de OTA,

finalizando em 96h de fermentação com uma redução de 60%. Os cultivos

expostos à OTA e co-expostos a famoxadona, apresentaram em torno de 30% de

redução de OTA no tempo de 24 h e no tempo de 96 h de fermentação

apresentaram 66% de redução na concentração de 2 µg L-1 e 56% de redução na

concentração de 4 µg L-1. As reduções estão diretamente relacionadas à atividade

enzimática da PO no tempo de 24 h e a produção de GSH a partir deste tempo de

cultivo, apresentando maior concentração no tempo de 96 h de fermentação.

A presença dos contaminantes no cultivo, a partir das 24 h de fermentação,

a levedura ativa as rotas metabólicas para reduzir a toxicidade no meio de cultura,

preservando a célula durante o processo fermentativo (GARDA-BUFFON;

BADIALE-FURLONG, 2010). A redução na concentração de micotoxina nos

cultivos expostos a OTA, pode estar relacionado a capacidade adsortiva da

levedura Saccharomyces cerevisiae (MECA; BLAIOTTA; RITIENE, 2010). Este

processo de adsorção na parede da levedura está relacionado à presença de

manoproteínas com a capacidade de se ligar a micotoxina (COSTA et al., 2012). A

capacidade de adsorção também esta ligada a dessorção, fenômeno que pode

estar vinculado aos cultivos com a adição somente de OTA, que após 48 h

apresentaram o aumento da concentração da micotoxina (SHETTY et al., 2007).

Para verificar possíveis interferências entre a micotoxina e o meio de cultura

sintético foi realizada a quantificação de OTA ao longo das 96 h em meio de cultura

sintético, sem a adição do inóculo. Não apresentando variação na concentração de

OTA ao longo das 96 h de cultivo em nenhum dos tratamentos realizados, sem a

adição da levedura. Evidenciando que a redução na concentração de OTA

apresentada na Tabela 2 deve-se ao aumento da atividade da enzima oxidativa PO

Page 73: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

55

e também aumento da produção de GSH, além da capacidade adsortiva da

levedura.

Os resultados observados nesse estudo estão de acordo com os descritos

por Garda-Buffon et al., (2011), que mostrou que a atividade de enzimas

oxidoredutases estão relacionadas com a velocidade de degradação de DON no

meio de cultivo contaminado com 50 µg.mL-1 da micotoxina, observando em 48 h

de fermentação a maior velocidade de degradação relacionada com a maior

atividade da enzima peroxidase (PO). A redução nos níveis de micotoxina pela

atividade da PO foi descrita por Saião Nora et al., (2019), onde a utilização desta

enzima está relacionada a redução de 17% nos níveis de OTA em suco de uva. A

redução de 70% nos níveis de zearalenona foi relatado por Garcia et al., (2019),

com o uso de PO comercial em solução modelo. Feltrin et al., (2017), também

relatam que a enzima PO na sua forma pura obtida do farelo de soja, reduziu 80%

a concentração de DON.

Neste estudo a atividade enzimática da peroxidase e a produção de

glutationa foram elevadas em 48 h e 72 h de fermentação, respectivamente, para

os cultivos contaminados com os fungicidas (Tabela 10). Resultado da ativação das

rotas metabólicas da levedura relacionado à presença dos contaminantes no meio

de cultura. A produção de glutationa variou de 0,10 a 0,72 mg mL-1 no controle e de

0,12 a 1,22 mg mL-1 para os cultivos com os fungicidas, apresentando um pico em

72 h de fermentação em todos os cultivos.

A diferença entre o cultivo controle e os demais, pode ter sido promovida

pelo estresse ocasionado pela presença dos contaminantes, gerando aumento no

consumo de energia das leveduras, levando a mudanças no metabolismo e o

aumento da geração de moléculas protetoras, como a glutationa (DONG et al.,

2007). A presença de contaminantes resulta na geração de espécies reativas de

oxigênio (ROS), convertendo a glutationa reduzida (GSH), que é a molécula

protetora antioxidante mais abundante no meio intracelular, a glutationa oxidada

(GSSG), reduzindo a toxicidade do meio (LOIZZO et al., 2011).

Page 74: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

56

Tabela 10- Valores da produção de glutationa (GSH) e a atividade da enzima peroxidase (PO) nos cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio

de cultura sintético na presença de cresoxim-metílico e famoxadona e controle sem contaminantes.

Cultivo Tempo

(h)

GSH

(mg mL-1

)

PO

(U mL-1

)

0 0,10a 0,002

a

24 0,12b 0,030

c

Controle 48 0,30d 0,010

b

72 0,72e 0,001

d

96 0,23c 0,001

d

0 0,12c 0,006

a

Cresoxim- metílico 24 0,50a 0,175

c

48 1,03b 0,041

b

72 1,11b 0,010

a

96 0,52a 0,009

a

0 0,12a 0,008

a

Famoxadona 24 0,47b 0,113

b

48 1,60d 0,021

a

72 1,22c 0,010

a

96 0,59b 0,011

a

Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS), sem contaminantes. Cresoxim- metílico: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1), Famoxadona:

S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L-1

). Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre

os dias (p < 0,05).

5.3.2 Alterações tecnológicas: acidez, etanol, açúcar redutor, proteínas e MEV

Todos os cultivos apresentaram até 48 h de fermentação uma redução em

torno de 5% no valor de pH (Tabela 11). A acidez é uma das características mais

importantes em escala industrial, devido ao controle a contaminação bacteriana e

por influenciar na qualidade da fermentação, interferindo diretamente na formação

de subprodutos, alterando a cor e o sabor do vinho (RIZZON et al., 2010;

MORALES et al., 2013; RYU et al., 2018). Embora seja uma das características

mais importantes, a legislação não estabelece faixa ideal para valores de pH, em

qualquer tipo de vinho, mas de acordo com registros na literatura durante a

fermentação alcoólica os valores de pH devem permanecer abaixo de 3,6 para

evitar o início da fermentação malolática (BAMFORTH, 2007; RIZZON et al., 2010).

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57

Tabela 11- Monitoramento do pH no meio de cultivo na presença de OTA e dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadone e controle sem contaminantes, ao longo

de 96 h de fermentação alcoólica submersa pela levedura Saccharomyces cerevisiae.

Tempo

(h)

Cont. OTA

2µg

OTA

4µg CM

CM +

OTA

2µg

CM +

OTA

4µg

F

F+

OTA

2µg

F+

OTA

4µg

0 3,63a 3,54

a 3,56

a 3,64

a 3,50

a 3,53

a 3,61

a 3,50

a 3,52

a

24 3,50c 3,30

b 3,31

b 3,43

b 3,41

c 3,44

c 3,40

c 3,43

c 3,40

c

48 3,55b 3,28

b 3,28

b 3,41

b 3,36

b 3,35

b 3,33

b 3,37

b 3,36

b

72 3,56b 3,29

b 3,29

b 3,41

b 3,37

b 3,37

b 3,42

c 3,37

b 3,34

b

96 3,65a 3,30

b 3,31

b 3,43

b 3,40

c 3,42

c 3,43

c 3,41

c 3,40

c

Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1

: S.c. em MCS + OTA 2 µg L

-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L

-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1); CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS

+ cresoxim-metilico (0,75 mg L-1

) + OTA 2µg L-1

, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1

) + OTA 4 µg L-1

, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 2 µg L

-1, F+ OTA 4 µg L

-1 :

S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L-1

) + OTA 4 µg L-1

.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).

O período da redução do pH coincide com o período de aumento da

biomassa, o que esta relacionado à manutenção das rotas metabólicas envolvidas

na geração energética das células da levedura e também na produção de ácidos

orgânicos como ácido cítrico, acético e pirúvico, gerados durante o processo de

fermentação alcoólica (LUO et al., 2016). O crescimento celular está relacionado ao

consumo de substrato (Tabela 12).

Tabela 12- Concentração de açúcar redutor (mg mL-1) de cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de cresoxim-

metílico, famoxadona, OTA e controle sem contaminantes.

Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1: S.c. em MCS +

OTA 2 µg L-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L

-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1); CM + OTA

2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L

-1, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico

(0,75 mg L-1) + OTA 4 µg L

-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg

L-1) + OTA 2 µg L

-1, F+ OTA 4 µg L

-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 4 µg L

-1.Todos os experimentos

apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).

Tempo

(h) Controle

OTA

2 µg

OTA

4 µg CM

CM +

OTA

2 µg

CM +

OTA

4 µg

F

F+

OTA

2 µg

F+

OTA

4 µg

Conc.

açúcar

redutor

(mg mL-1

)

0 195,0c

193,8d

197,8d

195,7d

194,2d 197,4

d 199,0

d 194,4

d 197,9

d

24 110,2b

128,9c

124,7c

129,9c

99,6c

81,8c

89,7c

94,9c

134,8c

48 5,41a

50,4b

33,2b

4,43b

42,7b

36,6b

3,94b

46,9b

35,9b

72 1,24a

1,81a

1,34a

2,29a

0,93a

0,57a

2,37a

0,58a

0,83a

96 1,18a

1,28a

1,22a

2,12a

0,72a

0,53a

2,17a

0,53a

0,77a

Page 76: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

58

Em 48 h de fermentação houve o consumo 95% dos açucares redutores

no cultivo controle e nos cultivos com cresoxim-metílico e famoxadona. Enquanto

os cultivos com a adição da micotoxina em ambas as concentrações e nos cultivos

coexpostos aos fungicidas e micotoxinas foi observado o menor consumo, 75% do

substrato.

O menor consumo do substrato está relacionado à velocidade de

crescimento celular da levedura (Tabela 13), onde no cultivo controle e nos cultivos

com cresoxim-metílico e famoxadona apresentaram as maiores velocidades de

crescimento em relação aos demais.

Tabela 13- Velocidade específica máxima de crescimento (µ max) dos cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na

presença de OTA e dos fungicidas cresoxim-metílico, famoxadona e controle sem contaminantes.

Cultivo µ max (h-1

) Intervalo da fase

exponencial (h)

Redução do µ max

(%)

Controle 2,70 0-48

OTA 2 µg L-1

1,31 0-48 51

OTA 4 µg L-1

1,30 0-48 52

CM 2,50 0-48 7

CM+ OTA 2 µg L-1

1,42 0-48 47

CM + OTA 4 µg L-1

1,47 0-48 46

F 2,18 0-48 19

F + OTA 2 µg L-1

1,51 0-48 44

F + OTA 4 µg L-1

1,23 0-48 54

Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1: S.c. em MCS + OTA

2 µg L-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L

-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1); CM + OTA 2 µg: S.c.

em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L

-1, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1) +

OTA 4 µg L-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 2 µg L

-1,

F+ OTA 4 µg L-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 4 µg L

-1.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de

variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).

Estudos relatam que a exaustão de nutrientes pode elevar a síntese

proteica, em virtude da ação protetora contra o estresse oxidativo gerado

(FRANCESCA et al., 2010). Neste estudo a elevação da síntese protéica (Tabela

14) ocorreu concomitante a atividade enzimática da peroxidase, apresentando 20%

de aumento para os grupos expostos a OTA em ambas as concentrações 133%

para cresoxim-metílico e OTA, em ambas as concentrações, 35% para famoxadona

e OTA, em ambas as concentrações, 148% para cresoxim-metílico e 184% para

Page 77: Carmen Luiza de Azevedo Costa PPGQTA Rio Grande, RS - Brasil€¦ · 4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo ... Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA

59

famoxadona. A elevação da síntese protéica também ocorreu concomitante ao

aumento da produção de glutationa, apresentando 16% de aumento para os grupos

expostos a OTA, em ambas as concentrações, e para cresoxim-metílico e

famoxadona coexpostos a OTA, em ambas as concentrações, no tempo de 96 h de

fermentação.

Tabela 14- Concentração protéica (mg mL-1) nos cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos

fungicidas cresoxim-metílico, famoxadona e controle sem contaminantes. Temp

o

(h)

Controle OTA

2 µg

OTA

4 µg CM

CM +

OTA

2 µg

CM +

OTA

4 µg

F

F+

OTA

2 µg

F+

OTA

4 µg

0 3,03c

3,37b

3,15a

3,65a

3,34c

3,24c

3,43a

3,57a

3,49a

24 6,59d

8,28a

8,52d

9,08d

7,86a

7,58a

9,75e

4,62b

4,65b

48 5,21b

10,34d

10,62e

6,64c

2,28b

2,12b

7,50d

3,28a

3,22a

72 4,41ab

6,41c

6,61b

5,18b

5,80d

5,62d

6,71c

6,44c

6,02c

96 3,87a

7,47a

7,37c

4,29a

7,25a

7,18a

5,33b

7,49d

7,27d

Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1

: S.c. em MCS + OTA 2 µg L-1

. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L

-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1); CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-

metilico (0,75 mg L-1

) + OTA 2µg L-1

, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1

) + OTA 4 µg L-1

, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 2 µg L

-1, F+ OTA 4 µg L

-1 : S.c. em MCS +

famoxadona (3 mg L-1

) + OTA 4 µg L-1

.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).

A elevação da síntese protéica frente à toxicidade do meio de cultivo

também está relacionada à detoxificação dos fungicidas e da micotoxina presentes

no meio de cultivo (BADIALE-FURLONG et al., 2008; PHAM et al., 2008; GARDA-

BUFFON, BADIALE-FURLONG, 2010).

A presença de OTA e dos fungicidas no meio de cultura afetou a produção

de etanol % (v v-1) pela levedura Saccharomyces cerevisiae (Tabela 15) O grupo

controle apresentou em 72 h de fermentação a sua maior produção de etanol,

enquanto que todos os grupos expostos a micotoxina apresentaram a maior

produção de etanol no tempo de 96 h de fermentação e os grupos expostos

somente ao fungicida no tempo de 48 h de fermentação.

O aumento da concentração de etanol está relacionado com a elevação da

produção de glutationa (Tabela 9 e 10). Durante o processo de fermentação a

produção de glutationa pode ser dividida em três etapas. Na primeira etapa os

níveis de glicose diminuem e a produção de etanol e glutationa aumentam. Na

segunda etapa o etanol é consumido como fonte de carbono para o crescimento

celular e para a síntese de glutationa, evidenciado na Tabela 16, os valores de

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60

conversão de etanol em glutationa apresentando os maiores valores nos cultivos

expostos a micotoxina. E na terceira etapa a glicose e o etanol são consumidos e

as células param de crescer (WEN, ZHANG e TAN, 2006).

Tabela 15- Produção de etanol (%) obtido durante o cultivo submerso com a Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos

fungicidas cresoxim-metílico, famoxadona e controle sem contaminantes.

Tempo

(h) Controle

OTA

2 µg

OTA

4 µg CM

CM +

OTA

2 µg

CM +

OTA

4 µg

F

F+

OTA

2 µg

F+

OTA

4 µg

0 0a

0a

0a

0a

0a

0a

0a

0a

0a

24 4,3b

4,8b

5,6b

4,9b

3,7b

3,8b

4,6b

4,5b

4,8b

48 12,1d

10,9c

10,8c

12,2e

7,5d

7,6d

12,9d

10,7d

7,1d

72 13,2c

11,8d

11,2d

11,6d

7,0d

7,6d

11,6d

11,0d

9,5d

96 12,4d

12,1d

11,9e

9,2c

10,8c

10,7c

8,9c

12,3c

12,2c

Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1

: S.c. em MCS + OTA 2 µg L

-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L

-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-

metilico (0,75 mg L-1

); CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1

) + OTA 2µg L-1

, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1) + OTA 4 µg L

-1, F: S.c. em MCS +

famoxadona (3 mg L-1

), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L-1

) + OTA 2 µg L-1

, F+ OTA 4 µg L

-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 4 µg L

-1.Todos os experimentos apresentaram

coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).

A GSH é um tipo de defesa não enzimática que desempenha importante

papel no metabolismo atuando como um agente redutor para que a enzima

glutationa peroxidase (GPx) catálise as espécies reativas de oxigênio (ROS)

geradas na presença de contaminantes (BRIGELIUS-FLOHÉ e MAIORINO, 2013).

Quando a levedura se encontra em sua fase exponencial, ocorre o consumo da

glicose como substrato energético, produzindo etanol, o que desencadeia a

ativação das rotas metabólicas com a produção de GSH como molécula protetora

(LOIZZO et al.,2011). Na fase estacionária, devido à escassez de substrato

energético, o etanol gerado é utilizado como fonte de carbono para a manutenção

celular e produção de GSH. Durante a fermentação quando os níveis de etanol

estavam elevados e a concentração de glicose estava baixa, não houve redução

significativa do crescimento celular, demonstrando a utilização do etanol como

fonte energética. O etanol em elevadas concentrações causa mudanças

morfológicas na levedura e também impede seu crescimento, portanto o consumo

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61

do etanol como fonte de carbono é também uma forma de defesa (WEN, ZHANG e

TAN, 2006; DONG et al., 2007).

Para avaliar os parâmetros estudados, a Tabela 16 apresenta os fatores de

conversão de substrato em produto (Y P/S), substrato em biomassa (Y X/S), e

biomassa em produto (Y P/X), obtidos durante o cultivo e calculados de acordo com

as Equações 13, 14 e 15.

Tabela 16- Fatores de conversão obtidos durante o cultivo de Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos fungicidas

cresoxim-metílico e famoxadone e grupo controle sem contaminantes.

Cultivo

Y P/S

(mgGSH/

gglicose)

Y X/S

(mgcélulas/

mgglicose)

Y P/X

(mgGSH/

mgcélulas)

Y P/S

(mgetanol/

gglicose)

Y P/X

(mgGSH/

mgetanol)

Controle 0,69 0,023 0,01 0,64 0,01

OTA 2 µg 5,18 0,010 0,50 0,62 0,08

OTA 4 µg 5,30 0,009 0,55 0,60 0,08

Cresoxim-metílico 2,05 0,019 0,10 0,40 0,04

CM + OTA 2 µg 5,10 0,011 0,45 0,55 0,09

CM + OTA 4 µg 5,59 0,012 0,45 0,54 0,10

Famoxadona 2,42 0,016 0,14 0,45 0,05

Famoxadona + OTA 2 µg 6,84 0,011 0,59 0,63 0,10

Famoxadona + OTA 4 µg 5,82 0,005 1,07 0,61 0,09

Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L

-1: S.c. em

MCS + OTA 2 µg L-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L

-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1);

CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L

-1, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS +

cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 4 µg L

-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em

MCS + famoxadona (3 mg L-1) + OTA 2 µg L

-1, F+ OTA 4 µg L

-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA

4 µg L -1.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma

coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).

A produção de GSH quando relacionada à concentração de glicose e a

concentração celular, apresenta maior conversão em todos os cultivos com OTA,

isso confirma que a presença da micotoxina ativa as rotas da levedura para a

detoxificação e metabolização da micotoxina presente no meio de cultura. O

mesmo é observado na conversão de glicose em células, pois todos os cultivos

expostos a OTA apresentaram uma menor conversão, devido ao excessivo gasto

energético na ativação de rotas metabólicas para a detoxificação, com a finalidade

de reduzir o estresse oxidativo ocasionado pela presença de micotoxina, reduzindo

seu crescimento celular devido ao déficit energético. Os cultivos somente com os

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fungicidas apresentaram maior conversão de glicose e também de células em GSH

do que o controle, demonstrando que a presença do fungicida ativa as rotas

metabólicas para a detoxificação celular. Em relação à conversão de glicose em

etanol, observa-se que o grupo controle e os grupos expostos a micotoxina nas

duas concentrações apresentaram semelhantes fatores de conversão, enquanto os

cultivos somente com os fungicidas apresentaram menor produção de etanol (LI et

al., 2004).

A presença de etanol e contaminantes no meio de cultura podem promover

alterações morfológicas nas células da levedura Saccharomyces cerevisiae. Para

verificar sua morfologia, foram avaliadas as imagens das células do cultivo no

tempo de 96 h de fermentação, com a utilização de um microscópio eletrônico de

varredura (MEV) (Figura 15).

Figura 15- Imagens obtidas por MEV das células de Saccharomyces cerevisiae em 96h de fermentação alcoólica em todos os cultivos.

Legenda: A:Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). B: OTA 2 µg L-1: S.c. em MCS +

OTA 2 µg L-1. C: OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L

-1.D: CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L

-1); E:

CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L

-1, F: CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-

metilico (0,75 mg L-1) + OTA 4 µg L

-1, G: F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1), H: F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS +

famoxadona (3 mg L-1) + OTA 2 µg L

-1, I: F+ OTA 4 µg L

-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L

-1) + OTA 4 µg L

-1.Todos os

experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).

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A contaminação do meio com OTA em ambas as concentrações,

promoveram deformações morfológicas na parede da levedura (B e C) e algumas

células com ruptura. Os cultivos expostos ao cresoxim-metílico coexpostos a OTA

nas duas concentrações (E e F) além da deformação morfológica apresentaram

alto nível de ruptura da parede celular.

As células dos cultivos expostos ao famoxadona e a micotoxina nas duas

concentrações (H e I) também apresentaram deformações morfológicas e ruptura

celular, nos cultivos expostos apenas aos fungicidas (D e G) apresentaram uma

rugosidade na parede celular, no cultivo controle (A) a célula mostrou sua

morfologia normal.

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6.CONCLUSÕES

O método QuEChERS apresentou eficiência para extração de OTA, de

acordo com as figuras de mérito, apresentando boa linearidade, recuperação e

exatidão. OTA ocorreu em 43 amostras de vinhos tinto originados do Estado do Rio

Grande do Sul, com média de 1,63 ng mL-1. De acordo com o consumo per capita a

ingestão de baixos volumes de vinho não oferece risco ao consumidor.

Os fungicidas cresoxim-metílico (1000 µg mL-1) e famoxadona (600 µg mL-1),

nas concentrações recomendadas pelos fabricantes, foram eficazes em reduzir o

crescimento fúngico de Aspergillus carbonarius; CM reduziu 76% e F reduziu 61%.

No entanto, o potencial toxigênico do fungo foi afetado na presença dos fungicidas,

aumentando significativamente a produção de OTA pelo fungo.

A presença dos fungicidas e da micotoxina na fermentação por

Saccharomyces cerevisiae afetou bioquimicamente o cultivo. O crescimento celular

foi 45 % menor em todos os cultivos com a presença de OTA, possivelmente

devido ao gasto energético na ativação das rotas metabólicas para a detoxificação.

A redução de micotoxina, nos cultivos expostos a OTA nas concentrações de 2 e 4

µg L-1, ocorreu em 48 h de fermentação. Os cultivos coexpostos a micotoxina e aos

fungicidas apresentaram redução em torno de 60 % de OTA ao longo da

fermentação. Todas as reduções estão relacionadas às elevações da atividade

enzimática da peroxidase e da produção de GSH, concomitantemente com a

elevação da síntese proteica. Em relação ao grupo controle, todos os grupos

tratados apresentaram menor produção de etanol e alterações morfológicas na

parede celular da levedura.

Os resultados obtidos nesse estudo contribuem com um método adequado e

validado para a análise de OTA em amostras de vinho tinto, gerando informações

sobre o potencial toxigênico do fungo Aspergillus carbonarius, quando exposto a

fungicidas. Bem como informações sobre as alterações bioquímicas e cinéticas

durante a fermentação alcoólica do vinho, na presença de contaminantes,

proporcionando subsídios para órgãos reguladores e setor industrial.

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65

7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

- Determinar o perfil de álcoois em amostras de vinho tinto, concomitante a

concentração de ocratoxina A;

-Quantificar a concentração de fungicidas: cresoxim-metílico e famoxadona durante

a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae;

-Verificar as alterações morfológicas no fungo Aspergillus carbonarius na presença

dos fungicidas;

-Fazer a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae utilizando o mosto

de uva como meio de cultivo;

- Verificar o efeito da fortificação de moléculas oxirredutoras, como a glutationa, na

fermentação alcoólica na presença de contaminantes.

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9. ANEXOS

Anexo 1: Solução Alcalina

- Solução 1:

0,0625 g CuSO4 avolumar para 100 mL com água destilada;

- Solução 2:

1,65g Tartarato duplo de Na e K, avolumar para 100 mL com água destilada;

- Solução 3:

26,1 g NaCO3 e solubilizar em 1,044 litros da água destilada fervida e resfriada;

Homogeneizar 3 mL da solução 1 + 3 mL da Solução 2 + 1,044 L da solução 3.

Armazenar refrigerada em frasco âmbar.

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Anexo 2- Dados da ocorrência de OTA em 50 amostras de vinho tinto, obtidos no estado do Rio Grande do Sul.

Vinho Ocorrência (µg L-1)

Tinto Seco

Carbenet Sauvignon

Amostra 1 2,00

Amostra 2 1,34

Amostra 3 1,30

Amostra 4 2,08

Amostra 5 3,96

Amostra 6 1,54

Amostra 7 2,05

Amostra 8 1,57

Amostra 9 1,92

Amostra 10 1,08

Amostra 11 1,39

Amostra 12 1,02

Amostra 13 nd*

Merlot

Amostra 1 2,00

Amostra 2 0,71

Amostra 3 1,60

Amostra 4 3,56

Amostra 5 2,00

Amostra 6 nd*

Amostra 7 nd*

Pinot noir

Amostra 1 4,65

Amostra 2 2,93

Amostra 3 2,04

Malbec

Amostra 1 3,56

Amostra 2 2,56

Amostra 3 1,90

Amostra 4 4,39

Amostra 5 1,20

Amostra 6 1,96

Amostra 7 1,92

Amostra 8 1,32

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100

Tinto Suave

Carbenet Sauvignon

Amostra 1 2,78

Amostra 2 0,56

Amostra 3 0,75

Amostra 4 0,81

Amostra 5 0,82

Amostra 6 2,61

Amostra 7 0,87

Amostra 8 0,76

Amostra 9 nd*

Merlot

Amostra 1 1,09

Amostra 2 2,27

Amostra 3 nd*

Amostra 4 nd*

Pinot noir

Amostra 1 2,78

Amostra 2 1,71

Amostra 3 2,09

Amostra 4 2,30

Amostra 5 1,32

Amostra 6 nd*

nd*: não detectado