CAROLINA BUENO

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CAROLINA BUENO WANDSCHEER

BIOATIVIDADE COMPARATIVA ENTRE Melia azedarach (Cinamomo) e Azadirachta indica (Nim): LETALIDADE PARA LARVAS DE Aedes aegypti

Dissertao apresentada como requisito parcial obteno do grau de Mestre, pelo Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas -rea de Insumos, Medicamentos e Correlatos, do Setor de Cincias da Sade da Universidade Federal do Paran.

Orientador: Prof. Tit. Jos Domingos Fontana

CURITIBA 2004

TERMO DE APROVAAO

I P f : ! B l i t e 9rQU ? U n i v e r s i a a d e ^ e d l t i p p sWrn+jB Banca E p j B a o r a :

ProfrTit.Cid^Aiffi^p de Moraes Santos Deprfmnto de Farmcia

Universidade Federal do Paran

Curitiba, 16 de fevereiro de 2004

Dedico este trabalho aos meus pais, Edgar e Tirza, aos meus irmos, Clarissa e Edgar.

ui

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Dr. Jos Domingos Fontana, pela ateno, confiana, apoio e

orientao durante todo o trabalho.

Ao Professor Dr. Mrio Antnio Navarro da Silva por toda a sua orientao e

importante colaborao para realizao desta dissertao.

Ao Dr. Maurcio Passos pela orientao, colaborao e amizade em todo o

perodo desta pesquisa.

Ao Dr. Rodrigo Rocha Latado pela orientao, colaborao e disponibilidade

para realizao do trabalho.

Aos meus amigos Juliana Adelmann, Tnia Regina Bendlin e Jonathan Lus

Wohlke, do LQBB - Laboratrio de Quimio/Biotecnologia de Biomassa, e do Jonny

Edward Duque Luna, do LEMV - Laboratrio de Entomologia Mdica e Veterinria, por

toda a ajuda e amizade.

Aos meus amigos e colegas de turma por todas as experincias compartilhadas,

em especial a Lilian, Giovanna, Cludia, Waldemar, Danilo e Elisa.

Aos funcionrios da biblioteca do Setor da Sade, a funcionria do xerox Sandra.

Aos colegas do departamento de Farmcia e de Entomologia do LEMV -

Laboratrio de Entomologia Mdica e Veterinria, que de alguma maneira contriburam

para este trabalho.

Coordenao do Curso de Ps Graduao em Cincias Farmacuticas pelo

apoio, aos seus professores, pelos ensinamentos ministrados e a Regina por toda a

ajuda prestada.

E especialmente, aos meus pais e meus irmos, por toda a colaborao,

pacincia, incentivo e muito apoio nos momentos difceis.

"De tudo, ficaram trs coisas A certeza de que estamos sempre comeando...

A certeza de que preciso continuar... A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar.

Portanto, devemos

Fazer da interrupo um caminho novo... Da queda, um passo de dana...

Do medo, uma escada... Do sonho, uma ponte...

Da procura, um encontro..."

Fernando Pessoa

SUMRIO

LISTA DE TABELAS ix LISTA DE ILUSTRAES xi LISTA DE ABREVIATURAS xiii RESUMO xiv ABSTRACT xv

1. INTRODUO 01 2. OBJETIVOS 03 3. REVISO DE LITERATURA 04 3.1. Melia azedarach L. e Azadirachta indica A. Juss 04 3.1.1 Origem 04 3.1.2 Classificao taxonmica 06 3.1.3 Constituintes qumicos 07 3.1.4 Reao da cadeia polimerase (PCR) 10 3.1.5 Atividade biolgica 12 3.2 DENGUE 19 3.2.1 Aedes (Stegomya) aegypti 21 3.2.1.1 Caractersticas das formas e ciclo biolgico 22 3.3 ASTAXANTINA 24 3.3.1 Ocorrncia 24 3.3.2 Propriedades qumicas 25 3.3.3 Emprego da astaxantina 26 3.3.4 Caractersticas gerais 27 3.3.5 Cultivo 28 3.3.6 Aplicaes da levedura Xanthophyllomyces dendrorhous 29 4. MATERIAL E MTODOS 31 4.1 MATERIAL 31 4.1.1 Coleta de Melia azedarach L 31 4.1.2 Caroos de Azadirachta indica A. Juss 31 4.2 MTODOS 31 4.2.1 Preparao de extrato de Melia azedarach L 31 4.2.2 Preparao de extrato de Azadirachta indica A. Juss 32 4.2.3 Concentrao dos extratos 32 4.2.4 Cromatografia em camada delgada (CCD) dos diferentes extratos de

Melia azedarach L. e Azadirachta indica A Juss 32 4.2.5 Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) para os diferentes

extratos de Melia azedarach L. e Azadirachta indica A Juss 33 4.2.6 Ensaio de bioatividade/citotoxicidade (BST - Brine Shrimp Lethality

Test) 33 4.2.7 Ensaio de bioatividade em larvas de Aedes aegypti 34 4.2.7.1 Condies de manuteno da colnia de Aedes aegypti 34 4.2.7.2 Bioensaios sob condies de laboratrio com espcime de Aedes

aegypti para determinao da suscetibilidade larval aos diferentes extratos de Melia azedarach L. e Azadirachta indica A Juss 35

4.2.7.3 Anlise dos resultados dos bioensaios 37 4.2.8 Diferenciao das espcies de Meliceas por PCR - Polymerase

Chain Reaction 37 4.2.8.1 Extrao de DNA de plantas 37 4.2.8.2 RAPD (Randon Amplified Polymorphic DNA): procedimento 37 4.2.9 Produo de astaxantina utilizando a levedura Xanthophyllomyces

dendrorhous em extratos de polpas dos frutos maduros de Melia azedarach L 38

4.2.9.1 Meio para manuteno de cepa 38 4.2.9.2 Preparo do inoculo 39 4.2.9.3 Preparo dos extratos de polpa de frutos de Melia azedarach L 39

4.2.9.4 Cromatografia em camada delgada (CCD) 39 4.2.9.5 Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) 40 4.2.9.6 Cultivo da levedura de Xanthophyllomyces dendrorhous 40 4.2.9.7 Carboidratos redutores 41 4.2.9.8 Doseamento de astaxantina 41 5. RESULTADOS E DISCUSSO 43 5.1 Cromatografia em camada delgada de diferentes extratos de Melia

azedarach L. e Azadirachta indica A Juss 43 5.2 Anlise em cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) dos

diferentes extratos de Meliceas 45 5.3 Resultados do ensaio preliminar de bioatividade/ citotoxicidade 48 5.4 Resultados de bioatividade testados contra larvas de Aedes

aegypti 48 5.5 Diferenciao de espcimes por PCR 69 5.6 Determinao de carboidratos redutores 72 5.7 Anlise em cromatografia lquida de alta eficincia(CLAE) 72 5.8 Resultado do crescimento de Xanthophyllomyces dendrorhous em 69

polpas de frutos de Melia azedarach L 74 6. CONCLUSO 78 REFERNCIAS 79

TABELA 5.1 -TABELA 5.2 -

TABELA 5.3 -

TABELA 5.4 -

TABELA 5.5 -

TABELA 5.6 -

TABELA 5.7 -

TABELA 5.8 -

TABELA 5 . 9 -

TABELA 5.10 -

LISTA DE TABELAS Concentrao letal 50% dos diversos extratos totais em pg/ml. 48 Representao em porcentagem das partes dos caroos de nim e cinamomo 53 Concentrao letal 50 e 95% dos bioativos de sementes (caroos integral de frutos) de M. azedarach L. e de A. indica A. Juss em extratos etanlicos para larvas de A. aegypti (colnia Rockefeller) sem alimento; temperatura; X2; intervalo de confiana (IC) 54 Concentrao letal 50 e 95% dos bioativos de sementes (caroos integral de frutos) de M. azedarach L. e de A. indica A. Juss em extratos etanlicos para larvas de A. aegypti (colnia Rockefeller) com alimento; temperatura; X2; intervalo de confiana (IC) 55 Concentrao diagnstico (CL99) dos bioativos de sementes (caroos integral de frutos) de M. azedarach L. e de A. indica A. Juss para larvas de A. aegypti (colnia Rockefeller) sem e com alimento, temperaturas 25C e 30C quando em presena de extratos MaEtOH e MEtOH 56 Concentrao letal 50 e 95% dos bioativos de sementes (caroos integral de frutos) de M. azedarach L. e de A. indica A. Juss extratos clorofrmio:metanol para larvas de A. aegypti (colnia Rockefeller) sem alimento; temperatura; X2; intervalo de confiana (IC) 58 Concentrao letal 50 e 95% dos bioativos de sementes (caroos integral de frutos) de M. azedarach L. e de A. indica A. Juss extratos clorofrmio:metanol para larvas de A. aegypti (colnia Rockefeller) com alimento; temperatura; X2; intervalo de confiana (IC) 59 Concentrao diagnstico (CL99), dos bioativos de sementes (caroos integral de frutos) de M. azedarach L. e de A. indica A. Juss extratos clorofrmio:metanol para larvas de A. aegypti (colnia Rockefeller) sem e com alimento, temperaturas de 25C e 30C 61 Concentrao letal 50 e 95% dos bioativos de sementes (caroos integral de frutos) de M. azedarach L. e de A. indica A. Juss extratos metanlicos para larvas de A. aegypti (colnia Rockefeller) sem alimento; temperatura; X2; intervalo de confiana (IC) 63 Concentrao letal 50 e 95% dos bioativos de sementes (caroos integral de frutos) de M. azedarach L. e de A. indica A. Juss extratos metanlicos para larvas de A. aegypti (colnia Rockefeller) com alimento; temperatura; X2;; intervalo de confiana (IC) 64

TABELA 5.11 - Concentrao diagnstico (CL99) dos bioativos de sementes (caroos integral de frutos) de M. azedarach L. e de A. indica A. Juss extratos metanlicos para larvas de A. aegypti (Colnia Rockefeller) sem e com alimento, temperaturas 25C e 30C 66

TABELA 5 . 1 2 - Experimento A 74

LISTA DE ILUSTRAESFIGURA 3 .1 - Melia azedarach L...................................................................... 04FIGURA 3.2 - Partes botnicas de M. azedarach.......................................... 05FIGURA 3.3 - Partes botnicas de A. indica.................................................... 06FIGURA 3.4 - Reinfestao de A. aegypti no continente Americano 20FIGURA 3.5 - Ciclo morfogentico de A. aegypti........................................... 23FIGURA 3.6 - Esquema do ciclo morfogentico de A. aegypti...................... 24FIGURA 4 .1 - Preparo dos biensaios............................................................... 36FIGURA 4 .2 - Incubadora onde foram realizados os bioensaios a

temperatura e luminosidade controlada.................................. 36FIGURA 5 .1 - Cromatagrafia em camada delgada......................................... 43FIGURA 5.2 - Cromatografia em camada delgada, visualizao - UV

365nm......................................................................................... 44FIGURA 5.3 - Cromatograma de extrato etanlico de M. azedarach L.1:50 46 FIGURA 5 .4 - Cromatograma de extrato metanlico de M. azedarach L.

1:50..................................................................