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CAROLINA MANGANELI POLONIO
AVALIAO DA CAPACIDADE REGULADORA DE CLULAS
TRONCO MESENQUIMAIS ENDOMETRIAIS NO MODELO DE ENCEFALOMIELITE
EXPERIMENTAL AUTOIMUNE
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Imunologia do
Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo, para
obteno do Ttulo de Mestre em Cincias.
So Paulo
2017
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CAROLINA MANGANELI POLONIO
AVALIAO DA CAPACIDADE REGULADORA DE CLULAS
TRONCO MESENQUIMAIS ENDOMETRIAIS NO MODELO DE ENCEFALOMIELITE
EXPERIMENTAL AUTOIMUNE
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Imunologia do
Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo, para
obteno do Ttulo de Mestre em Cincias. rea de concentrao: Imunologia
Orientador: Prof. Dr. Jean Pierre Schatzmann Peron Verso
Original
So Paulo
2017
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UNIVERSIDADE DE SO PAULO
INSTITUTO DE CINCIAS BIOMDICAS
Candidato(a): Carolina Manganeli Polonio Titulo da
Dissertao/Tese: Avaliao da Capacidade Reguladoras de Clulas Tronco
Mesenquimais Endometriais no Modelo de Encefalomielite Experimental
Autoimune. Orientador: Prof. Dr. Jean Pierre Schatzmann Peron A
Comisso Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertao de
Mestrado/Tese de
Doutorado, em sesso publica realizada a
........./......../.........., considerou o(a) candidato(a):
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a) Examinador(a): Assinatura:
...............................................................................
Nome:
......................................................................................
Instituio:
................................................................................
Examinador(a): Assinatura:
...............................................................................
Nome:
......................................................................................
Instituio:
................................................................................
Examinador(a): Assinatura:
...............................................................................
Nome:
......................................................................................
Instituio:
................................................................................
Presidente: Assinatura:
...............................................................................
Nome:
......................................................................................
Instituio:
................................................................................
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Aos meus pais Pedro e Marisa, e minha
irm Tamires, com todo amor e gratido.
Por proporcionarem a realizao de
sonhos e sempre acreditarem em mim.
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Pedro e Marisa, e minha irm Tamires, que so meus
maiores exemplos de
conduta, que me moldaram para ser algum que me orgulho. Por me
alicerarem todos os
dias e me proporcionarem a oportunidade de seguir meus
sonhos.
Ao Prof. Dr. Jean Pierre Schatzmann Peron, meu orientador,
companheiro e amigo, por todo
apoio cientfico e psicolgico, pela confiana, pela liberdade e
principalmente pela parceria.
Meu sincero agradecimento por tornar todos os dias difceis mais
leves e pela dedicao
diria em tentar nos tornar cada vez mais sbios;
tia Marta, por dar todo seu amor e afeto e por me passar todos
os seus princpios,
auxiliando na formao do meu carter;
av Ida, pelo simples fato de no existir colo mais aconchegante
que o seu. Eternas
saudades;
Ao av Manuel, por dedicao total e imenso carinho famlia;
Aos meus primos Amanda, Joice, Clayton, Guilherme e Talita
agradeo por todos os anos
juntos e todo amor e gratido que sentimos;
Larissa e Laura que so as pessoas mais importantes em nossas
vidas, um amor
imensurvel por essas duas riquezas;
Ao meu cunhado Rafael, por fazer minha irm e toda famlia muito
feliz;
Aos tios Adail e Eliana, que apesar de no sermos de sangue, me
acolheram com tanto
afeto e auxiliaram meus pais em minha formao e carter;
minha amiga Tuany, por sermos to diferentes, por sempre
caminharmos juntas e nunca
desistirmos uma da outra;
Andrea e Drielly, por caminharem junto a mim em todos os
momentos. Somos o maior
exemplo que amizade verdadeira no esmorece com o tempo;
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8
Nayane e Tais, por termos alicerado uma a outra em um dos
momentos mais difceis de
nossas vidas. Obrigada pelo respeito, pelas alegrias e pela
fora, que venham muitos anos de
parceria pela frente;
Evilin e Liliane, por terem me ajudado a dar os primeiros passos
na cincia, por toda
pacincia, e principalmente por acreditarem em mim, quando nem eu
mesma acreditava.
Aos colegas de laboratrio, Carla, Nagela, Lilian, Cristiano e
Wesley, por todo auxlio
cientfico, convvio excepcionalmente agradvel, uma vez que nos
tornamos amigos. Esse
trabalho tambm fruto do nosso trabalho em equipe;
Apurwa, nossa indiana, por ter pacincia e nos auxiliar muito no
aprendizado do ingls.
Por nos trazer uma cultura diferente.
Aos colegas ps-graduandos do ICB, por nos ajudarmos todos os
dias, seja na discusso de
experimentos, ou no auxlio com reagentes. Estamos cada vez mais
unidos.
minha banca de qualificao: Prof. Dr. Alexandre Basso, Prof. Dr.
Gustavo Mendes-
Amarantes e Dr. Danilo Candido, por todas as sugestes;
Aos funcionrios Maria Eni, Claudia, Aurea e Sandra, obrigada por
nos aturarem diariamente
e nos proporcionarem condies melhores de trabalho;
Ao Departamento de Imunologia da Universidade de So Paulo e
todos os funcionrios, por
me proporcionarem uma experincia nica durante o mestrado;
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9
Agradecimento ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico
e Tecnolgico (CNPq)
pelo financiamento durante o mestrado de Carolina Manganeli
Polonio, n USP 9565150.
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10
Para ter sucesso, necessrio amar de verdade o
que se faz. Caso contrrio, levando em conta apenas
o lado racional, voc simplesmente desiste. o que
acontece com a maioria das pessoas.
(Steve Jobs)
Um bicho conhece sua floresta; e mesmo que se
perca perder-se tambm caminho.
(Clarice Lispector)
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11
RESUMO
POLONIO, C. M. Avaliao da Capacidade Reguladora de Clulas Tronco
Mesenquimais Endometriais no Modelo de Encefalomielite Experimental
Autoimune. 2017. 90 f. Dissertao (Mestrado em Imunologia) -
Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, 2017.
A esclerose mltipla (EM) uma doena inflamatria crnica
desencadeada por clulas T autorreativas contra antgenos proteicos
da mielina produzida por oligodendrcitos no sistema nervoso central
(SNC). Aps ativao na periferia, estas migram ao SNC promovendo o
rompimento da barreira hematoenceflica, o infiltrado inflamatrio e
a destruio da bainha de mielina que envolve os axnios neuronais. A
encefalomielite experimental autoimune (EAE) o modelo murino mais
utilizado para o estudo da EM. As clulas-tronco estromais (MSC) so
clulas multipotentes, no diferenciadas e imunomoduladoras, que vm
sendo estudadas nos ltimos anos como medida teraputica em diversos
modelos inflamatrios, incluindo a EM. As tubas uterinas e o tero de
camundongos fmeas so rgos ricos em clulas mesenquimais (meMSC) que
so pouco utilizadas em estudos, e cuja capacidade imunomoduladora
pouco conhecida. Dessa forma, no presente projeto, caracterizamos a
obteno dessa populao e avaliamos sua capacidade imunossupressora
utilizando o modelo de EAE. Observamos que o tratamento capaz de
modular o perfil de linfcitos T CD4+ durante sua ativao nos
linfonodos, induzindo o direcionamento para a subpopulao Tr1 e
atenuando as Th1 e Th17. Consequentemente, houve uma diminuio do
nmero de clulas infiltrantes no SNC associado a uma menor ativao de
clulas da microglia. Em conjunto, nossos resultados demostraram que
as meMSC utilizadas como tratamento so capazes de atrasar o
desenvolvimento da EAE e, portanto, evidenciando o carter
imunomodulador das MSCs derivadas do endomtrio, chamando a ateno
para seu potencial teraputico.
Palavras-chave: Encefalomielite Experimental Autoimune. Clulas
Tronco Mesenquimais Endometriais. Imunomodulao.
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12
ABSTRACT
POLONIO, C. M. Evaluation of the Regulatory Capacity of
Endometrial Mesenchymal Stem Cells in the Experimental Autoimmune
Encephalomyelitis Model. 2017. 90 f. Master thesis (Immunology) -
Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, 2017.
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease
triggered by autoreactive T cells against myelin protein antigens
produced by oligodendrocytes in the central nervous system (CNS).
After activation in the periphery, these cells migrate to the CNS
promoting the rupture of the blood-brain barrier (BBB), the
inflammatory infiltrate and the destruction of the myelin sheath
that surrounds the neuronal axons. Experimental Autoimmune
Encephalomyelitis (EAE) is the most commonly used murine model for
the study of MS. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) are multipotent,
undifferentiated and immunomodulatory cells that have been studied
in recent years as a therapeutic measure in several inflammatory
models, including MS. The uterine tubes and uterus of female mice
are organs rich in mesenchymal cells (meMSC) which are rarely used
and whose immunomodulatory capacity is unknown. Thus, in the
present work, we characterized the extraction of this population
and evaluated its immunosuppressive capacity using the EAE model.
We observed that the meMSC treatment is capable of modulating the
CD4 T lymphocyte profile during its activation in the lymph nodes,
inducing the expansion of the Tr1 subpopulation and attenuating Th1
and Th17. Consequently, there was a decrease in the number of
infiltrating cells in the CNS associated with a reduction of
microglial activation. Taken together, our results demonstrated
that the meMSCs used as treatment are capable of delaying the
development of EAE, therefore, evidencing its immunomodulatory
features drawing attention to its therapeutic potential.
Keywords: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Endometrium
Mesenchymal Stem Cells. Immunomodulation.
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13
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 - Distribuio geogrfica da endemicidade da EM no
mundo.
Figura 2 Antgenos alvo durante o desenvolvimento da EAE.
Figura 3 Esquema representativo da fisiopatologia da EM e
EAE.
Figura 4 - Efeitos imunomodulatrios das MSCs conhecidos.
Figura 5 Estratgia de gate para anlise de diferentes populaes de
linfcitos.
Figura 6 Estratgia de gate para anlise de molculas de ativao de
clulas dendrticas,
macrfagos e microglia.
Figura 7 - Histologia da Tuba Uterina e tero.
Figura 8 - Ensaios Imunohistoqumicos da Tuba Uterina e tero.
Figura 9 - Caracterizao das Fases Estrais.
Figura 10 - Rendimento de meMSC nas Fases Estrais.
Figura 11 - Diferenciao de multilinhagens in vitro.
Figura 12 - Caracterizao fenotpica das meMSC.
Figura 13 - Escore clnico de animais com EAE tratados ou no com
meMSC.
Figura 14 - As meMSC no so capazes de modular a expresso de
molculas de ativao em
clulas dendrticas dos linfonodos no modelo de EAE na monta da
resposta imune.
Figura 15 - As meMSC no so capazes de modular a expresso de
molculas de ativao em
macrfagos dos linfonodos no modelo de EAE na monta da resposta
imune.
Figura 16 - As meMSC so capazes de modular o perfil de linfcitos
T CD4+
dos linfonodos
durante o incio da resposta imune no modelo de EAE.
Figura 17 - Anlise do perfil de citocinas dos linfonodos de
animais com EAE tratados ou no
com meMSC durante a monta da resposta imune.
Figura 18 - Expresso gnica dos linfonodos de animais com EAE
tratados ou no com
meMSC na monta da resposta imune.
-
14
Figura 19 - Proliferao dos linfcitos T CD4+ e T CD8
+ dos linfonodos de animais com EAE
tratados ou no com meMSC durante monta da resposta imune.
Figura 20 - As meMSC so capazes de reduzir a neuroinflamao e
dano histopatolgico.
Figura 21 - As meMSC so capazes diminuir a infiltrao de
macrfagos e ativao da
microglia no SNC no modelo de EAE.
Figura 22 - As meMSC so capazes de modular o perfil de linfcitos
T CD4+
infiltrantes do SNC
no modelo de EAE.
Figura 23 - As meMSC so capazes de modular o perfil de linfcitos
T CD8+
infiltrantes do SNC
no modelo de EAE.
Figura 24 - Anlise do perfil de citocinas de clulas
mononucleares do SNC de animais com
EAE tratados ou no com meMSC durante a resposta efetora da
doena.
Figura 25 - Expresso gnica da medula espinhal de animais com EAE
tratados ou no com
meMSC durante a fase efetora da doena.
Figura 26 - Anlise do perfil de citocinas do bao de animais com
EAE tratados ou no com
meMSC durante a fase efetora da doena.
Figura 27 - Expresso gnica do bao de animais com EAE tratados ou
no com meMSC
durante a fase efetora da doena.
Figura 28 - Anlise da produo de citocinas dos linfcitos T
CD4+
em co-cultura com as
meMSC.
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15
LISTA DE ABRAVIATURAS
ABEM Associao Brasileira de Esclerose Mltipla
Ac anticorpo
Actb Beta actina
AD-MSC do ingls, Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cell
APCs Clulas apresentadoras de antgeno
BBB do ingls, blood-brain barrier
BCR do ingls, B Cells Receptor
BDNF do ingls, Brain-derived neurotrophic factor
BHE Barreira Hemato Enceflica
BM-MSC do ingls, Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell
BSLCR Barreira Sangue Lquido Cefalorraquidiano
CBA do ingls, Cytometric bead array
cDNA DNA complementar
CFA do ingls, Complet Freund's Adjuvant
CNS do ingls, Central Nervous System
CTLs do ingls, Cytotoxic T Lymphocytes
DC do ingls, Dendritic Cells
DNA cido desoxirribonucleico
EAE Encefalomielite Experimental Autoimune
EAU - do ingls, Experimental Autoimmune Uveitis
EM Esclerose Mltipla
Fig. Figura
Foxp3 do ingls, Forkhead box P3
GDNF do ingls, Glial cell-derived neurotrophic factor
GMSC do ingls, Gingiva Mesenchymal Stem Cell
HE Hematoxilina e eosina
hedMSC do ingls, Human Endometrial Mesenchymal Stem Cell
HLA do ingls, Human Leukocyte Antigen
i.p. intraperitoneal
-
16
ICAM-1 do ingls, Intercellular Adhesion Molecule 1
ICB Instituto de Cincias Biomdicas
IDO Indoleamina-2,3- dioxigenase
IFN interferon
IL interleucina
kg Quilogramas
KO do ingls, knockout
MAG - do ingls, Myelin-associated Glycoprotein
MBP - do ingls, Myelin Basic Protein
MCSF do ingls, Macrophage Colony-stimulating Factor
meMSC - do ingls, Murine Endometrial Mesenchymal Stem Cell
mg Miligramas
MHC I do ingls, Major Histocompatibility Complex I
MHC II do ingls, Major Histocompatibility Complex II
mL Mililitros
MMP-9 metaloproteinase 9
MOG35-55 do ingls, Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein
MS do ingls, Multiple Sclerosis
MSC do ingls, Mesenchymal Stem Cell
MSIF - do ingls, Multiple Sclerosis International Federation
NGF do ingls, Nerve growth factor
NK do ingls, Natural Killer
PBMC do ingls, Peripheral Blood Mononuclear Cell
PBS Tampo fosfato-salino
PCR Reao da polimerase em cadeia
PFA Paraformaldedo
PGE2 Prostaglandina E2
pH Concentrao hidrogeninica
PLP do ingls, Proteolipid Protein
RNA cido ribonucleico
-
17
Rorc do ingls, RAR-relatedorphan receptor C
ROS do ingls, Reactive Oxygen Species
RPMI meio Roswell Park Memorial Institute
RT-PCR Reao da polimerase em cadeia em tempo real
SFB Soro fetal bovino
SNC Sistema nervoso central
SP1R1 do ingls, sphingosine-1-phosphate receptor 1
STAT do ingls, Signal Transducer and Activator of
Transcription
STAT sinal ativador e transdutor de transcrio
Tbx21 do ingls, T-box transcription factor
TCR do ingls, T Cells Receptor
TGF- Fator de transformao do crescimento
Th Linfcitos T auxiliares, ou do ingls, T helper
TNF- do ingls, Tumor necrosis fator-
Tr1 T reguladora do tipo 1
Treg Clula T reguladora
USP Universidade de So Paulo
VCAM do ingls, Vascular cell adhesion protein 1
WHO - do ingls, World Health Organization
WT do ingls, Wild tipe
g Microgramas
L Microlitros
-
18
SUMRIO
1 INTRODUO
...............................................................................................................
20
1.1 Esclerose Mltipla (EM)...
...................................................................................................
20
1.2 Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE)
................................................................
22
1.3 Clulas-Tronco Mesenquimais (MSC)
.................................................................................
26
2 OBJETIVOS
....................................................................................................................
30
2.1 Objetivos
Gerais..................................................................................................................
30
2.2 Objetivos Especficos
..........................................................................................................
30
3 MATERIAL E MTODOS
.................................................................................................
31
3.1 Animais
...............................................................................................................................
31
3.2 Histologia
............................................................................................................................
31
3.2.1 Colorao por Hematoxilina e Eosina
..............................................................................
31
3.2.2 Imunohistoqumica
..........................................................................................................
32
3.2.3 Colorao por Luxol Fast
.................................................................................................
33
3.3 Identificao das fases do ciclo estral
................................................................................
33
3.4 Obteno e cultura de meMSC
...........................................................................................
33
3.5 Diferenciao das meMSC
..................................................................................................
34
3.5.1 Diferenciao adipognica
..............................................................................................
34
3.5.2 Diferenciao condrognica
............................................................................................
34
3.5.3 Diferenciao osteognica
..............................................................................................
35
3.6 Extraes de RNA e sntese de DNA complementar (cDNA)
.............................................. 35
3.7 Quantificao por PCR em Tempo Real
..............................................................................
36
3.8 Induo de EAE e tratamento com as meMSC
...................................................................
37
3.9 Obteno de clulas do Sistema Nervoso Central
.............................................................
37
3.10 Obteno de clulas do bao e dos linfonodos
................................................................
38
3.11 Co-cultura de meMSC e linfcitos TCD4+
.........................................................................
38
-
19
3.12 Anlises por citometria de fluxo
.......................................................................................
38
3.12.1 Dosagem de citocinas
....................................................................................................
38
3.12.2 Avaliao de clulas Th1, Th17 e Tr1
............................................................................
39
3.12.3 Anlise fenotpica das meMSC
......................................................................................
39
3.12.4 Resposta proliferativa in vitro
.......................................................................................
40
3.12.5 Anlise de molculas de ativao em clulas dendrticas,
macrfagos e migrolia....... 41
3.13 Anlises estatsticas
..........................................................................................................
43
4 RESULTADOS
................................................................................................................
44
4.1 Obteno e caracterizao das meMSC
.............................................................................
44
4.2 O tratamento com as meMSC capaz de atrasar o aparecimento
dos sinais clnicos da
EAE
............................................................................................................................................
52
4.3 Modulao desencadeada por meMSC na ativao da resposta imune
adaptativa nos
linfonodos
.................................................................................................................................
53
4.3.1 Efeitos das meMSC sobre apresentao de antgenos
.................................................... 53
4.3.2 Papel das meMSC nas subpopulaes de linfcitos T
..................................................... 56
4.4 Avaliao dos efeitos do tratamento com as meMSC em clulas
residentes e infiltrantes
do SNC
......................................................................................................................................
61
4.4.1 Papel das meMSC na infiltrao de macrfagos e ativao da
microglia ...................... 62
4.4.2 Papel das meMSC na infiltrao das subpopulaes de linfcitos
T ............................... 64
4.5 Avaliao das clulas recirculantes no bao perante o tratamento
com as meMSC ........ 69
4.6 Anlise da capacidade das meMSC modularem a produo de
citocinas in vitro ............. 71
5 DISCUSSO
...................................................................................................................
72
6 CONCLUSES
................................................................................................................
78
REFERNCIAS
...................................................................................................................
79
ANEXOS
..........................................................................................................................
88
A - The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in
experimental models ..................... 89
B - Zika Virus Congenital Syndrome: Experimental Models and
Clinical Aspects .................... 90
-
20
1 INTRODUO
1.1 Esclerose Mltipla (EM)
As doenas auto-imunes do sistema nervoso central so descritas
por ocasionar a
perda progressiva das funes deste, provocada pela inflamao local
e subsequente morte
neuronal. A Organizao Mundial de Sade (WHO World Health
Organization) (WHO,
2016) relatou que as doenas neurolgicas em geral afetam mais de
um bilho de pessoas
no mundo e estima-se que 6,8 milhes morrem por ano por conta de
doenas relacionadas
ao crebro. O tratamento dessas doenas complexo, uma vez que as
causas e
biomarcadores so pouco conhecidos. Hoje em dia, muitos grupos tm
se dedicado aos
estudos envolvidos com medidas teraputicas para essas desordens
do SNC, principalmente
com o objetivo de diminuir sua progresso clnica (FERRARA, 2016;
HANAMSAGAR; BILBO,
2016).
A esclerose mltipla (EM) a doena inflamatria crnica mais comum
do sistema
nervoso central (SNC), caracterizada por constantes episdios de
desmielinizao provocada
por respostas das clulas T e B autorreativas contra antgenos
proteicos derivados de
mielina. uma enfermidade que acomete principalmente jovens
adultos, em mdia de 20-
40 anos de idade, com maior incidncia em mulheres do que em
homens (3:1); de etnia
branca, afetando 0,05-0,15% dos caucasianos e predominante na
Amrica do Norte e na
Europa (1 a 3/500 habitantes). O Brasil considerado um pas de
baixa incidncia (5/100.000
habitantes), com exceo de So Paulo, Belo Horizonte e Botucatu,
que so cidades com
maior incidncia mdia (5 a 30/100.000 habitantes), devido
provavelmente diversidade
gentica e miscigenao dessas cidades brasileiras (Fig. 1)
(GRZESIUK, 2006; MOREIRA et al.,
2000; NOSEWORTHY et al., 2000).
-
21
Figura 5 - Distribuio geogrfica da endemicidade da EM no
mundo.
Fonte: Atlas da EM 2013. Multiple Sclerosis International
Federation (MSIF). Disponvel em: http://www.atlasofms.org/. Traduo:
Associao Brasileira de Esclerose Mltipla (Abem).
Na patogenia da EM existe uma pr-disposio gentica associada a
fatores
ambientais que provocam uma disfuno do sistema imune, promovendo
a apresentao de
protenas da bainha de mielina pelas clulas apresentadoras de
antgenos (APC - antigen-
presenting cells) s clulas T autorreativas. Tal fato leva quebra
da tolerncia e
subsequente infiltrao de clulas do sistema imune, culminando na
desmielinizao, dano
axonal e o desenvolvimento de leses no crebro e na medula
espinal, conhecidas como
scleras ou cicatrizes. Consequentemente, os pacientes que
desenvolvem EM apresentam
sinais como ataxia, fadiga, perda da coordenao motora,
dificuldades cognitivas, danos
visuais e sensoriais com diferentes graus de frequncia e
severidade entre os doentes
(GOVERMAN, 2009). Dentre os genes envolvidos, os do HLA (Human
Leukocyte Antigen) so
conhecidos por influenciar a atividade dos linfcitos T, sendo
que alguns hapltipos se
relacionam claramente com uma maior susceptibilidade doena,
como: HLA-DRB5*0101,
HLADRB1*1501, HLA-DQB1*0602, HLA-DQA1*0102. Alm destes, genes de
citocinas,
molculas coestimuladoras e de vias de transduo de sinais tambm
podem estar
envolvidos (OKSERNBERG; HAUSER, 2005).
-
22
Os trs padres mais comuns de evoluo clnica observados so o
recorrente-
remitente, primariamente progressiva e secundariamente
progressiva. A recorrente-
remitente o padro mais comum, acometendo 85% dos pacientes com
EM, sendo
caracterizada por ataques agudos, ou seja, episdios em que os
sintomas se agravam
abruptamente, seguidos de uma remisso total ou parcial. Durante
a remisso, os pacientes
ficam estveis, sem deteriorao (VARATHARAY; GALEA, 2016).
Infelizmente, cerca de 90%
dos pacientes com esse padro se agravam para secundariamente
progressiva, onde
apresentam uma deteriorao gradual e essa evoluo clnica tem relao
com sexo e com a
idade do aparecimento dos sintomas motores (YOUNG et al., 2012).
A primariamente
progressiva afeta de 10-15% dos pacientes e definida por
provocar danos funcionais
irreversveis de maneira estvel, lenta e progressiva
(KREMENCHUTZKY et al., 1999).
Como no se sabe ao certo qual o ponto chave na etiologia e na
patognese da
doena e pelo sistema imune ser muito dinmico, seu tratamento se
torna complicado. Essas
so algumas das abordagens teraputicas utilizadas na EM: i) o
IFN-a e o IFN-b que
suprimem as respostas Th1 e intensificam as respostas Th2; ii) o
acetato glatiramer
(Copaxone) que modula linfcitos T autorreativos e levam
tolerncia utilizando antgenos
semelhantes mielina; iii) a mitoxantrona que inibe a proliferao
de linfcitos T, B e
macrfagos (PALMER, 2013; PALMERAND; ALAVIJEH, 2012); iv) o
Natalizumab, um anticorpo
monoclonal integrina anti-4-1, que previne a migrao de leuccitos
para o SNC (TUBRIDY
et al., 1999; YEDNOCK et al., 1992), o v) rituximab e o
ocrlizumab, anticorpos monoclonais
anti-CD20 utilizados para a depleo de linfcitos B, o vi)
Fingolimode, capaz de reduzir o
nmero de linfcitos circulantes prevenindo a sada dos mesmos do
linfonodo atravs da
modulao de SP1R1 (sphingosine-1-phosphate receptor 1)
(PELLETIERAND; HAFLER, 2012), e
a vii) teriflunomida um imunomodulador que possui propriedades
anti-inflamatrias
(PALMER, 2010). Todas essas abordagens visam ao impedimento da
ativao dos clones
autoreativos, assim como de seu alcance ao SNC.
1.2 Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE)
A encefalomielite autoimune experimental (EAE experimental
autoimune
encephalomyelitis) o principal modelo animal para o estudo da
EM, estabelecido h mais
-
23
de 80 anos, e utilizado at hoje. A induo da EAE (Fig. 2) feita
atravs da inoculao
subcutnea em diversas linhagens de camundongos de antgenos
proteicos da bainha de
mielina produzida por oligodendrcitos como o MOG35-55 (Myelin
Oligodendrocyte
Glycoprotein), MBP (Myelin Basic Protein), PLP
(Proteolipoprotein) ou MAG (Myelin-
associated glycoprotein) emulsificados em CFA (Complete Freund
Adjuvant) (MILLER; LEARY,
2007; RIVERS; SPRUNT; GERRY, 1933).
Figura 6 Antgenos alvo durante o desenvolvimento da EAE.
Protenas da bainha de mielina usadas como alvo para o
desenvolvimento da resposta autoimune e induo da EAE.
Fonte: (HEMMER; ARCHELOS; HARTUNG, 2002).
Uma vez que as APCs, como as clulas dendrticas macrfagos ou
mesmo linfcitos B,
apresentam esses antgenos de mielina para clulas T autorreativas
na periferia, h ativao
e diferenciao de linfcitos T CD4+ e T CD8+. Essas clulas sofrem
expanso clonal,
diferenciao em subpopulaes como linfcitos Th1 e Th17 que
posteriormente migra para
o SNC, secretando muitos mediadores que iniciam o processo
inflamatrio local,
principalmente ativando as clulas da glia e, posteriormente,
recrutando mais clulas
infiltrantes da periferia (MILLER; LEARY, 2007; RIVERS; SPRUNT;
GERRY, 1933).
A barreira hematoenceflica (BHE) que circunda as vnulas do
parnquima cerebral e
a barreira sangue-lquido cefalorraquidiano (BSLCR) que circunda
o plexo coride e vnulas
-
24
das meninges limitam o acesso de clulas circulantes ao SNC. As
junes oclusivas (Tight
junctions) presentes entre as clulas endoteliais da BHE e entre
as clulas epiteliais da BSLCR
so as responsveis por essa inacessibilidade de clulas
circulantes (HEMMER; ARCHELOS;
HARTUNG, 2002). Porm, o processo inflamatrio gerado provoca a
ruptura dessas
barreiras, que pode acontecer por mudanas nas junes oclusivas,
desnudao do
glicoclice, aumento de trfego vesicular e astrocitopatias em
combinao com mudanas e
danos endoteliais (RANSOHOFF; KIVISAKK; KIDD, 2003; WEKERLE et
al., 1994). Assim, os
linfcitos T autorreativos, como os Th17 por exemplo, passam a
expressar receptores de
quimiocinas como CCR6, cuja quimiocinas ligante, o CCL20,
constitutivamente presente em
clulas epiteliais da BSLCR (REBOLDI et al., 2009).
Concomitantemente, linfcitos Th1
expressam a integrina alfa4-Beta7, importante no endereamento
destes ao SNC
(HOTHHAMMER et al., 2011)
Com a entrada no SNC, as clulas T especficas para antgenos da
mielina so
reativadas por clulas dendrticas (BAILEY; MACMAHON, 2007) ou
macrfagos residentes
(PONOMAREV et al., 2005). As clulas Th1 so clulas induzidas pela
citocina IL-12 ativando
STAT-4 e o fator de transcrio T-bet culminando a produo da
citocina IFN-, que capaz
de aumentar a capacidade da micrglia em apresentar antgenos para
outras clulas T, por
aumentar a expresso de molculas de MHC de classe I e II e
molculas coestimuladoras.
Embora, IFN- tenha um importante papel na patognese de EAE,
clulas Th17 que secretam
IL-17 so descritas por serem mais relevantes do que as clulas
Th1, uma vez que
camundongos IL-17 KO (knockouts) so altamente resistentes induo
da EAE, enquanto
camundongos IFN- KO so mais susceptveis (KOMIYAMA et al., 2006).
As clulas T CD4+
que expressam o fator de transcrio RORT (IVANOV et al., 2006)
produzem IL-17A, IL-17F e
IL-22 (KORN et al., 2009) e dependente da sinalizao gerada por
TGF-, IL-6 e IL-1 (CHUNG,
2009). A importncia de IL-17 na induo de EAE baseia-se no fato
de que clulas residentes
do SNC, como astrcitos e micrglia expressam IL-17R
constitutivamente (DAS SARMA et al,
2009), provocando a ativao dessas clulas, levando secreo MMP-9,
de citocinas como
IL-6, quimiocinas como CXCL2 e CXCL9, molculas de adeso como
ICAM-1 e VCAM (KANG et
al., 2010). Com isso, h o recrutamento de outras clulas do
sistema imune, como
-
25
neutrfilos e macrfagos para o SNC que iro provocar a
retroalimentao positiva do
processo inflamatrio.
Alm destes, os linfcitos T CD8+ tambm participam ativamente do
processo lesivo,
uma vez que estes reconhecem os antgenos via MHC de classe I.
Com isso, h a liberao
deseus grnulos contendo perforinas, que so responsveis por
permeabilizar a membrana
dos oligondendrcitos, e as granzimas que iro induzir a morte dos
mesmos (GOVERMAN;
PERCHELLET; HUSEBY, 2005; PERON et al., 2010). Alm disso, os
linfcitos B reencontram os
antgenos no SNC via BCR (ARCHELOS; STORCH; HARTUNG, 2000),
liberam citocinas pr-
inflamatrias e se maturam em plasmcitos secretores de
auto-anticorpos principalmente
do istipo IgG (IgG1 e IgG3) (GREVE et al., 2001; LOSY; MEHTA;
WISNIEWSKI, 1990).
As clulas residentes do SNC tambm esto amplamente envolvidas na
patognese
da EAE e da EM, como as clulas da micrglia, que so as menores
clulas da neuroglia e
possuem corpos celulares alongados com muitos prolongamentos
curtos e extremamente
ramificados. Essas clulas fazem a vigilncia ativa do parnquima
cerebral e da medula
espinal, porm com o processo inflamatrio iniciado, as micrglias
ativadas se proliferam,
sofrem mudanas na expresso de molculas de ativao (CD80, CD86 e
MHC II) e migram
para o local de leso, agindo em conjunto com os macrfagos
infiltrantes. Assim, essas
clulas assumem um fentipo conhecido por M1, caracterizados pela
alta produo de ROS
e citocinas inflamatrias. Essas clulas auxiliam no dano
oxidativo de clulas do SNC, na
abertura da BHE e extravasamento de leuccitos, bem como na
polarizao de linfcitos Th1
(STAKOVIC et al., 2016). Com isso, o processo inflamatrio
mantido, promovendo a
degradao gradativa da bainha de mielina e a degenerao axonal,
prejudicando o impulso
nervoso, responsvel por todos os sinais e sintomas da doena.
(Fig. 3)
-
26
Figura 7 Esquema representativo da fisiopatologia da EM e EAE.
Os oligodendrcitos so clulas do SNC produtoras da mielina, que
responsvel pelo isolamento eltrico dos axnios. Na EM ou EAE, as
clulas dendrticas apresentam antgenos de mielina para linfcitos T e
linfcitos B infiltrantes. Os linfcitos T CD4
+
reativados por micrglia produzem citocinas que iro favorecer o
processo inflamatrio e os T CD8+
atuam diretamente nos oligodendrcitos e na bainha de mielina do
neurnio.
Fonte: (HEMMER; ARCHELOS; HARTUNG, 2002).
1.3 Clulas-tronco mesenquimais (MSC)
As clulas-tronco mesenquimais (MSCs Mesenchymal Stromal Cells)
so clulas no
diferenciadas, multipotentes, com propriedades imunomodulatrias
e regenerativas,
tornando-as atraentes para o tratamento de doenas autoimunes e
inflamatrias (DOMINICI
et al., 2006; LE BLANC; MOUGIAKAKOS, 2012). Essas clulas so
caracterizadas por ter
habilidade de aderir ao plstico de placas de cultura, por serem
capazes de se diferenciar em
diversas linhagens in vivo e in vitro como, condrcitos,
ostecitos e adipcitos e por
apresentam o fentipo CD90+, CD73+, CD105+/CD34-, CD45-, CD14-,
CD19-, HLADR- e CD115-
(DOMINICI et al., 2006). Foram primeiramente isoladas da medula
ssea variando entre
0,001% a 0,01% das clulas nucleadas (FRIEDENSTEIN et al., 1974).
Hoje sabe-se que tal
populao est amplamente presente pelo corpo, sento tambm
encontrada na pele (TOMA
-
27
et al., 2005), tecido adiposo (KIM et al., 2007), corao (BI et
al., 2007), placenta (CHANG et
al., 2006), no sangue menstrual, no endomtrio e nas tubas de
falpio (JAZEDJE et al., 2009).
As MSCs vm sendo utilizadas como alternativa teraputica em
diversos modelos
inflamatrios, inclusive durante a neuroinflamao, uma vez que so
capazes de modular o
sistema imune nas leses do SNC e aumentar a remielinizao e o
reparo (AULETTA et al.,
2012). Todavia, os mecanismos precisos da imunomodulao na EM
ainda permanecem
obscuros. Em um artigo anterior, demonstramos que fatores
anti-inflamatrios importantes
podem estar envolvidos, como IL-10, IL-27, IDO e T reguladores
(Tregs) (PERON et al., 2012).
De fato, so vrios os mecanismos inibitrios das MSCs, os quais
podem agir sobre
diferentes tipos de clulas imunes, como linfcitos B e T, NK e
clulas dendrticas (Fig. 4).
Os linfcitos T so as clulas principais nas autoimunidades e,
neste contexto, j se
demonstrou que as MSCs atuam inibindo a proliferao destas na
fase G0/G1 (DI NICOLA et
al., 2002). As clulas-tronco mesenquimais da medula ssea
(BM-MSCs Bone Marrow
Mesenchymal Stem Cells) suprimem as citocinas produzidas por
linfcitos Th1 (IFN- e TNF-
) e Th17 (IL-17), mudando o perfil da resposta para o tipo Th2
aumentando a produo de
IL-4 (AGGARWAL; PITTENGER, 2005). Alm disso, as MSCs podem
afetar a produo de
Tregs, uma vez que a co-cultura de MSCs com clulas mononucleares
do sangue perifrico
(PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells) induz a gerao desta
populao. Essas podem
tambm suprimir a proliferao e funo citotxica dos linfcitos CTLs
(Cytotoxic T
Lymphocytes) (GHANNAM et al., 2010), e principalmente atravs de
mediadores solveis
como IL-10, TGF-, prostaglandina E2 (PGE2). Alm disso, so
capazes de expressar
indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), uma enzima conhecida por
catalisar a oxidao do
triptofano N-formil-quinurenina (NFK), resultando a inibio da
linfoproliferao (ENGLISH
et al., 2009; GIESEKE et al., 2007). De forma interessante,
trabalhos em in vitro e in vivo
demonstraram que a IDO tem capacidade de diferenciar linfcitos T
naive para Tregs
(FALLARINO et al., 2006).
As MSCs tambm exercem efeito atravs da modulao de clulas
dendrticas,
induzindo a diferenciao de Tregs secretoras de IL-10 ou
induzindo anergia de linfcitos T
(MENGES et al., 2002). Alm disso, a presena de fatores solveis
como PGE2, IL-6 e fator
-
28
estimulador de colnia de moncitos (M-CSF Monocyte Colony
Stimulating Factor) podem
inibir a secreo de IL-12 pelas clulas dendrticas, uma citocina
essencial para a sobrevida
de linfcitos Th1 (SPAGGIARI et al., 2009). Quanto s NKs (Natural
Killer), as MSCs inibem
sua proliferao e produo de citocinas (POGGI et al., 2005), assim
como de linfcitos B
(GLENNIE et al., 2005). J quanto aos macrfagos, as MSCs podem
aumentar a produo de
IL-10 e diminuir IL-12 e TNF- (GHARIBI et al., 2015). Quanto s
clulas residentes do SNC,
demonstrou-se que as MSCs podem agir em progenitores estimulando
ou inibindo a
produo de neurnios, astrcitos e oligodendrcitos (ZHANG et al.,
2009).
Figura 8- Efeitos imunomodulatrios das MSCs conhecidos. As MSCs
possuem efeitos imunomodulatrios em diferentes clulas do sistema
imune, entre elas, linfcitos T CD4
+, T CD8
+ e T regs, clulas dendrticas,
macrfagos, linfcitos B, clulas NK e progenitores de clulas do
SNC.
Fonte: (GLENNIE et al., 2005).
Alm dos estudos in vitro, a capacidade supressora das MSCs tem
sido tambm
amplamente estudada em modelos experimentais in vivo.
Clulas-tronco mesenquimais
-
29
derivadas da gengiva (GMSC - Gingiva-Derived Mesenchymal Stem
Cell) retiradas da
cavidade oral so capazes, por exemplo, de suprimir o infiltrado
inflamatrio, a produo de
citocinas inflamatrias, alm de aumentar a infiltrao de clulas
Tregs e induzir a expresso
de IDO e IL-10 no modelo experimental de colite (GHARIBI et al.,
2015) . J as clulas-tronco
mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AD-MSCs
Adipose-Derived Mesenchymal Stem
Cells) so capazes de diminuir a gravidade da artrite em animais
experimentais por tambm
aumentar a produo de IL-10 no local da inflamao e favorecendo a
infiltrao de Tregs
(GONZALES et al., 2009). Alm disso, as AD-MSCs tambm diminuem a
gravidade da sepsis
suprimindo o infiltrado inflamatrio e a produo de mediadores
inflamatrios em diversos
rgos-alvo (GONZALES-REY et al., 2009). Ademais, a infuso
intravenosa de MSCs bloqueia
o desenvolvimento da uvete experimental autoimune (EAU
Experimental Autoimmune
Uveitis) aumentando clulas MHC classe IIlow Ly6G- Ly6Chigh
CD11b+ que suprimem a
proliferao de T CD4+ uveitognicos e a diferenciao de clulas Th1
e Th17, alm de
induzir a apoptose de linfcitos T CD4+. De forma interessante,
demonstrou-se que isso
ocorre de forma dependente do recrutamento de MDSC
(Myeloid-Derived Suppressor Cells)
aos stios inflamatrios de maneira dependente de CCL-2 (LEE et
al., 2015).
Nosso grupo tambm j demonstrou anteriormente que as
clulas-tronco
mesenquimais derivadas do endomtrio humano (hedMSC Human
Endometrial-Derived
Mesenchymal Stem Cells) so capazes de suprimir os sintomas da
EAE, diminuindo o
infiltrado de clulas mononucleares no SNC, incluindo clulas Th1
e Th17.
Sendo assim, sabendo que o tero tem a mesma origem embrionria
que as tubas
uterinas e que ambos so ricos em clulas-tronco mesenquimais
(meMSCs Murine
Endometrial Mesenchymal Stromal Cells) caracterizadas pelos
mesmos marcadores de
superfcie, tivemos como objetivo no presente trabalho avaliar a
capacidade
imunomoduladora das meMSCs utilizando o modelo de EAE.
-
30
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
O presente estudo teve como objetivo caracterizar as
clulas-tronco mesenquimais
endometriais murinas (meMSCs) alm de investigar sua capacidade
reguladora utilizando-a
como tratamento no modelo de encefalomielite experimental
autoimune.
2.2 Objetivos especficos
Padronizar a obteno e caracterizar fenotipicamente as meMSC;
Avaliar sua capacidade de diferenciao em outros tecidos;
Avaliar a progresso da EAE em animais tratados ou no com
meMSCs;
Caracterizar a celularidade em bao e linfonodos de animais com
EAE tratados com
meMSCs;
Avaliar o estado funcional de macrfagos e clulas dendrticas de
bao e linfonodos de
animais com EAE tratados com meMSCs;
Avaliar o estado funcional de linfcitos T CD4 e CD8 de no bao,
linfonodos e SNC de
animais com EAE tratados com meMSCs.
Caracterizar o perfil de citocinas produzidas no SNC de animais
com EAE tratados com
meMSCs;
Avaliar o estado de ativao de clulas da micrglia e macrfagos
infiltrantes no SNC de
animais com EAE e tratados com meMSCs.
-
31
3 MATERIAL E MTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos fmea da linhagem C57BL/6 selvagens
(WT), de 2-3
meses de idade mantidos no Biotrio do Departamento de Imunologia
do Instituto de
Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo (ICB-USP). Os
animais foram mantidos em
estantes ventiladas sob condies controladas de temperatura,
umidade e iluminao (ciclo
claro/escuro de 12 horas). Todos os protocolos foram submetidos
aprovao pelo Comit
de tica em Pesquisa Animal desta mesma instituio.
3.2 Histologia
Para caracterizao histolgica das tubas uterinas e do tero foram
utilizados animais
C57BL/6 WT (n=2). Alm disso, realizamos a anlise histologia nas
medulas espinhais dos
animais com EAE tratados ou no com as meMSCs (n=10). Os rgos
foram fixados em
paraformaldedo 4% (Sigma - Aldrich) durante 72 horas a 4 C. Em
seguida, foram lavados em
gua corrente por 10 minutos e a desidratao foi realizada pela
imerso dos rgos em
concentraes crescentes de lcool etanol durante 1 hora cada,
iniciando pela concentrao
de 70%, 80%, 90% e por ltimo, duas vezes em etanol 100%. A
partir disso, os rgos foram
imersos em xilol duas vezes durante 1 hora cada e os tecidos
foram includos em parafina
lquida a 60 C (Histotec Merck Chemicals) durante 16 horas. Aps
polimerizao da
parafina, os rgos foram cortados em aproximadamente 5 m em
micrtomo automtico
Leica RM2165 (leica, Welzear, Alemanha). Os cortes foram
assentados em lminas
histolgicas e deixadas a 60 C por 16 horas para melhor fixao das
amostras e evaporao
da parafina.
3.2.1 Colorao por Hematoxilina e Eosina
As lminas histolgicas foram desparafinizadas com imerso em xilol
duas vezes
durante 1 hora cada, seguido da hidratao do tecido, iniciando
pela imerso em lcool
etanol 100%, 95% e 70% por 10 minutos cada e por uma imerso em
gua destilada durante
5 minutos. A colorao iniciou-se com a Hematoxilina de Harris
(Sigma - Aldrich) por 1
-
32
minuto seguido de 10 minutos de gua corrente, assim removendo o
excesso de corante. Em
seguida, as lminas foram coradas com Eosina (Sigma - Aldrich)
por 3 minutos e desidratadas
com etanol 95% e duas imerses de 5 minutos cada de etanol 100%.
As fotos foram tiradas
em aumento de 4 x, 10 x, e 20 x em microscpio de varredura (Leo
435 VP Zeiss,
Oberkochen, Germany).
3.2.2 Imunohistoqumica
As lminas foram desparafinizadas com imerso em xilol duas vezes
durante 10
minutos cada, etanol-xilol (1:1), seguido da hidratao do tecido,
iniciando pela imerso em
lcool etanol 100%, 90% e 70% por 3 minutos cada e por uma imerso
em gua destilada
durante 3 minutos. O desmascaramento dos stios antignicos foi
realizado em forno micro-
ondas com o tampo citrato a 10% diludo em PBS (pH 6,0) 3 vezes
de 5 minutos. O bloqueio
da peroxidase endgena foi realizado utilizando gua oxigenada 3%
(Merck) diluda em
metanol (Merck) durante 5 minutos, com proteo da luz. Logo aps,
realizou-se a lavagem
em soluo PBS 0,1M contendo 0,05% de Tween, durante 5 minutos.
Para evitar ligao
inespecfica, as lminas foram incubadas com PBS contendo 2% de
soro albumina bovina
(BSA) a 60 C por 30 minutos. Em seguida, foi incubado com
anticorpos primrios anti-PCNA3
e anti-vimentina na concentrao de 200 g/mL (Santa Cruz
Biotecnologia, CA, USA)
utilizados na diluio de 1:50 em PBS 0,1 M a 4 C. Aps 16 horas de
incubao, as lminas
foram lavadas 3 vezes com PBS 0,1M contendo 0,05% de Tween por 5
minutos cada e
incubadas com Advanced HRP Link (DAKO, CA, USA) por 30 minutos
em temperatura
ambiente e lavadas novamente 3 vezes. Posteriormente foram
incubadas com Advanced
HRP Enzyme (DAKO, CA, USA) por 30 minutos em temperatura
ambiente e novamente
lavadas 3 vezes. A identificao das amostras marcadas com os
anticorpos primrios foi
realizada utilizando o cromgeno diaminobenzina 3,3 (DAB DAKO) na
ausncia de luz, em
temperatura ambiente durante 2 minutos e lavadas por mais 3
vezes. Para melhor
visualizao, as lminas foram coradas com Hematoxilina de Harris
por 5 segundos e em
seguida imersas em gua destilada por 5 minutos. Aps, os cortes
histolgicos foram imersos
3 vezes de 5 segundos em gua amonical a 0,5% (Merck) e 1 vez em
gua destilada por 5
segundos. Para finalizar, as amostras foram desidratadas, usando
uma concentrao
-
33
crescente de lcool etanol, iniciando com 70%, 90% e 100% durante
30 segundos cada
imerso, seguido de xilol-etanol (1:1) por 5 segundos e de xilol
por 10 minutos. As fotos
foram tiradas em aumento de 4 x, 10 x e 20 x em microscpio de
varredura (Leo 435 VP
Zeiss, Oberkochen, Germany).
3.2.3 Colorao por Luxol Fast Blue
As lminas foram desparafinizadas com imerso em xilol duas vezes
durante 1 hora
cada, seguido da hidratao do tecido, iniciando pela imerso em
lcool etanol 100%, 95% e
70% por 10 minutos cada e por uma imerso em gua destilada
durante 5 minutos. A
colorao iniciou-se com soluo Luxol Fast Blue (MBS - 0,1 g em
etanol 95%) overnight em
estufa a 56 C. O excesso de corante foi retirado com lcool 95%
no dia seguinte e,
posteriormente, as lminas foram lavadas em gua destilada e
diferenciadas em soluo de
carbonato de ltio a 0,05 % por 30 segundos. As fotos foram
tiradas em aumento de 4 x, 10 x,
e 20 x em microscpio de varredura (Leo 435 VP Zeiss, Oberkochen,
Germany).
3.3 Identificao das fases do ciclo estral
A identificao das fases do ciclo estral de camundongos fmea
C57BL/6 WT
realizada atravs da anlise visual da abertura vaginal. Alm
disso, a vagina foi lavada com
20 L de PBS (1 x) estril, dos quais 10 L foram diludos (1:20)
para anlise por citometria
de fluxo e com os 10 L restantes foi realizada a citologia do
lavado vaginal, corada com o
corante pantico, para avaliarmos diferenas entre as fases
estrais de acordo com a
morfologia das populaes celulares presentes em cada fase.
3.4 Obteno e cultura de meMSC
As tubas uterinas e o tero foram extrados de animais C57BL/6 WT
e o protocolo de
obteno dessas clulas foi adaptado (JAZEDJE et al., 2009). Esses
rgos foram lavados
quatro vezes com PBS estril 1 x acrescido de 3% penicilina (100
IU/mL, Invitrogen) e
estreptomicina (100 IU/mL, Invitrogen) e em seguida, cortados
com bisturi estril e
incubados em tubo de 15 mL com 5 mL de tripsina (1 x, LGC)
durante 45 minutos 37 C em
banho-maria. Aps o perodo de incubao, o sobrenadante foi
coletado com uma pipeta
-
34
Pasteur, lavado com 7 mL de DMEM/F-12 suplementado com 10% de
SFB em um tubo de 15
mL e centrifugado a 400 g por 5 minutos a temperatura ambiente.
O pellet foi ressuspendido
em 5 mL de DMEM/F-12 suplementado com 10% de SFB e 1% de
penicilina/estreptomicina e
mantidas em garrafas de cultura (25 cm2) em um ambiente de 5% de
CO2 e a 37 C. O meio
de cultura usado para a expanso foi trocado aps 72 horas de
cultivo e duas vezes por
semana subsequentemente. Aps expanso, as meMSCs obtidas foram
cultivadas e
utilizadas como desejado.
3.5 Diferenciao das meMSCs
Para avaliar as propriedades de diferenciao das meMSCs, as
clulas aderidas foram
submetidas a diferenciao adipognica, condrognica e osteognica
usando o kit Invitrogen
Stem Pro Differentiation (A1007101, A1007001 e A1007201)
conforme protocolo descrito
pelo fabricante.
3.5.1 Diferenciao Adipognica
Clulas foram mantidas em cultura com o meio de diferenciao por
duas semanas.
Aps a utilizao do kit para diferenciao em adipcitos, as clulas
no dia 14 foram obtidas
e avaliadas quanto a acumulao intracelular de vacolos ricos em
lipdios corados com oil
red O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para a colorao com oil red
O, as clulas foram fixadas
com paraformaldedo 4%, por 30 minutos, lavadas e coradas com a
soluo de oil red 0,16%
por 20 minutos.
3.5.2 Diferenciao Condrognica
Aps duas semanas de cultivo em meio de diferenciao as clulas em
monocamada
foram fixadas com paraformaldedo 4% por 10 minutos e coradas com
Toluidine Blue para
deteco de mucopolissacardeos da matriz extracelular. O corante
foi preparado pela
adio de 1% de Toluidine Blue dissolvido em gua destilada,
contendo 1% de borato de
sdio, e em seguida foi filtrado. O corante foi adicionado em
cada poo da cultura por 2
minutos, lavados com gua destilada e deixados para secagem
natural.
-
35
3.5.3 Diferenciao Osteognica
A diferenciao osteognica foi mostrada pela formao de reas
positivas para
hidroxiapatita de clcio no dia 21. Depois de duas lavagens com
PBS e uma lavagem com
gua destilada, as clulas foram incubadas com 1% nitrato de prata
(Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO) sobre a luz ultravioleta (UV) por 45 minutos. As clulas
foram incubadas com 3%
tiossulfato de sdio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) por 5
minutos. A colorao foi finalizada
com o corante Van Gieson. A acumulao de clcio indicada pela cor
preta.
3.6 Extraes de RNA e sntese de DNA complementar (cDNA)
A medula espinhal de animais com EAE tratados ou no com as meMSC
foi dissociada
(GentleMACS Dissociator, Myltenyi Biotec) e o mRNA da medula
espinhal e das meMSC
estimuladas in vitro foi extrado pela adio de 1 mL do reagente
Trizol (Invitrogen, EUA)
durante 5 minutos a temperatura ambiente. A essa soluo foram
adicionados 500 L de
clorofrmio que promoveu a separao de RNA, DNA e protenas, aps
centrifugao a
12000 rcf por 15 minutos. A poro superior (transparente, que
contm RNA) foi
cuidadosamente retirada e transferida para outro tubo onde foi
adicionado 500 L de
isopropanol. A mistura foi mantida a temperatura ambiente por 10
minutos. Em seguida,
centrifugada a 12000 rcf por 10 minutos e sobrenadante foi
retirado cuidadosamente. Ao
pellet obtido (nem sempre visvel), foi adicionado 1 mL etanol
75% e centrifugado a 7600 rcf
por 5 minutos a 4 C e repetiu esse processo 3 vezes. Aps a ltima
lavagem, o etanol foi
retirado e o tubo mantido invertido sobre a bancada at a secagem
total do pellet.
Finalmente, 25 L de gua ultrapura foram adicionados. A
concentrao do RNA total
purificado foi determinada em espectrofotmetro a 260/280nm
(NanoDrop 2000,
ThermoFisher). Para a sntese de cDNA, foi realizada uma reao de
transcrio reversa a
partir do RNA total purificado. Para tanto, 2 g de RNA diludos
em 5 L foram adicionados a
5 L de mix (2 L RT buffer, 2 L de RT random primers, 1 L de
multscribe e 0,8 L de dNTPs
e 4,2 L de gua ultrapura). A mistura foi levada ao termociclador
(QuantStudio3, Applied
Biosystems) e submetida a trs ciclos (25 C por 10 minutos; 37 C
por 120 minutos; e 85 C
por 5 minutos). Decorridos os ciclos, foram adicionados 80 L de
gua ultrapura.
-
36
3.7 Quantificao por PCR em Tempo Real
A partir do cDNA obtido, foi avaliada a expresso de mRNA de
molculas envolvidas
na inflamao e de clulas Th1, Th17 e Tr1 por PCR em tempo real
(qPCR). A cada reao de
PCR, foi adicionado 0,5 L de 20 x TaqMan gene expression assay,
4,5 L de 2 x TaqMan
gene expression assay master mix, 5 L de amostra de cDNA. As
solues foram levadas ao
aparelho QuantStudio3 (Applied Biosystems) e submetidas a
diferentes estgios (50 C por 2
minutos; 95 C por 2 minutos; 95 C por segundos e 60 C por 1
minutos x 40 repeties). As
curvas foram normalizadas pela expresso da -actina. A expresso
gnica foi dada pela
frmula 2Ct, onde Ct = Ct (amostra) Ct (calibrador), e Ct o Ct do
gene alvo
subtrado do Ct do gene constitutivo. Abaixo segue a lista dos
primers TaqMan, que foram
utilizados nos experimentos de PCR em tempo real:
Ido1 Mm01218005_g1
Il6 Mm00446190_m1
Bdnf Mm00446190_m1
Tgfb1 Mm01178820_m1
Foxp3 Mm00475162_m1
Il10 Mm00475162_m1
Rorc Mm01261022_m1
Il17a Mm00439618_m1
Tbx21 Mm00450960_m1
Ifng Mm01168134_m1
Ifnb Mm01168134_m1
Il27 Mm00461162_m1
Actb Mm0073933_m1
-
37
3.8 Induo de EAE e tratamento com as meMSCs
Os animais C57BL/6 WT foram imunizados por via subcutnea com 150
g de MOG35-
55 emulsificados em CFA (Complete Freund Adjuvant) (v/v) em 100
g de M. tuberculosis
H37. Adicionalmente, foram dadas nos perodos 0 e 48 horas aps
imunizao, 0,2 g de
toxina de Bordetella pertussis via intraperitoneal. Os animais
foram acompanhados
diariamente e o grau de doena foi atribudo da seguinte forma: 0
sem doena, 1 perda
do tnus da cauda, 2 patas traseiras parcialmente paralisadas, 3
paralisia total das patas
traseiras, 4 paralisia total das patas traseiras com paralisia
parcial das patas dianteiras, 5
paralisia completa ou morte. As meMSCs foram removidas das
garrafas de culturas por
tripsinizao, lavadas e contadas. Em seguida, foram injetadas em
uma dose de 1 x 106
clulas via intra-peritoneal um dia antes da imunizao ou em duas
doses de 1 x 106 clulas
via intra-peritoneal aos dias 0 e 10 ps-imunizao. Os animais
foram ento acompanhados
diariamente.
3.9 Obteno de clulas do sistema nervoso central
Os animais foram sacrificados em cmara de CO2 no pico da doena.
O crebro e a
medula espinhal foram extrados e colocados em tubo cnico de 50
mL estreis e incubados
com 2,5 mg/mL colagenase D em HBSS com clcio e magnsio durante
45 minutos a 37 C.
Aps esse perodo, a reao da enzimtica foi parada com a 15 mL de
HBSS 1 x sem clcio e
magnsio acrescido de 0,5 mM de EDTA e ento as amostras foram
processadas em cell
strainers e centrifugadas a 400 g por 5 minutos a 4 C. O pellet
foi ressuspendido em 6 mL de
Percoll a 25%. Essa suspenso foi adicionada lentamente sobre 2
mL de Percoll 75% em
tubos de 15 mL e centrifugada por 20 minutos a 900 g 22 C com
freio desligado. O
sobrenadante foi descartado e o anel contendo clulas
mononucleares foi armazenado e
lavado com 15 mL de HBSS 1x sem clcio e sem magnsio e
centrifugado por 5 minutos, 400
g a 4 C. O pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio RPMI com 10%
SBF e 1% de
penicilina/estreptomicina, contado e semeado para CBA,
citometria de fluxo com marcao
de superfcie e marcao intracelular.
-
38
3.10 Obteno de clulas do bao e dos linfonodos
Os animais foram sacrificados em cmara de CO2. O bao foi extrado
no 7 dia ps-
imunizao e no pico da doena e os linfonodos inguinais,
subaxilares e periarticos foram
extrados no 7 dia ps-imunizao, ambos processados em cell
strainers e centrifugados a
400 g por 5 minutos a 4 C. O pellet dos linfonodos foi
ressuspendido em meio RPMI com
10% SBF e 1% de penicilina/estreptomicina e semeado para CBA,
citometria de fluxo com
marcao intracelular e marcao de superfcie. Ao pellet dos
esplencitos totais foi
adicionado 1 mL de tampo de lise de hemcias por 2 minutos e em
seguida adicionado 15
mL de meio RPMI e centrifugados a 400 g por 5 minutos a 4 C. Por
fim, o pellet foi
ressuspendido em meio RPMI com 10% SBF e 1% de
penicilina/estreptomicina e semeado
para CBA, citometria de fluxo com marcao intracelular e marcao
de superfcie.
3.11 Co-cultura de meMSC e linfcitos T CD4+
Os animais 2D2 KI foram sacrificados por deslocamento da
cervical e o bao e os
linfonodos inguinais, subaxilares e periarticos foram extrados e
ambos processados em cell
strainers e centrifugados a 400 g por 5 minutos a 4 C. O pellet
dos linfonodos foi
ressuspendido em meio RPMI com 3% SBF e 3% de
penicilina/estreptomicina. Os linfcitos T
CD4+ foram isolados por cell sorting no citmetro de fluxo FACS
ARIA II (BD Bioseciences). Em
seguida, foram cultivados na presena ou ausncia de meMSC
(proporo 1 meMSC para 10
linfcitos). As clulas foram estimuladas ou no com -CD3/-CD28 (2
g/mL) ou MOG35-55
(50 g/mL). Todas as condies foram realizadas em triplicata. Aps
5 dias o sobrenadante
foi coletado.
3.12 Anlises por citometria de fluxo
3.12.1 Dosagem de citocinas
Com sobrenadante das meMSC estimuladas in vitro, como dito
anteriormente, foi
para anlise do perfil de citocinas atravs da tcnica de CBA.. As
clulas mononucleadas do
SNC, os esplencitos totais e as clulas dos linfonodos foram
plaqueadas 1 x 106
clulas/poo e estimuladas ou no com MOG35-55 (1 g/mL); -CD3 (1
g/mL) + -CD28 (1
-
39
g/mL). Aps 72 horas de cultivo o sobrenadante foi coletado para
anlise do perfil de
citocinas atravs da tcnica de CBA. Para a quantificao das
citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IFN-,
TNF-, IL-17A e IL-10 foi utilizado o CBA Mouse Th1/Th2/Th17
Cytokine Kit da (BD
Pharmingen) conforme instrues do fabricante. As amostras foram
adquiridas no aparelho
de citometria de fluxo FACS Accuri BD sendo adquiridos 2100
eventos.
3.12.2 Avaliao de clulas Th1, Th17 e Tr1
As clulas dos linfonodos extradas no 7 dia ps-imunizao, os
esplencitos totais
extrados no 7 dia ps-imunizao e no pico da doena e as clulas
mononucleadas do SNC
extradas no pico da doena foram plaqueadas 1 x 106 clulas/poo e
estimuladas ou no
com MOG35-55 (1 g/mL) overnight. Aps esse perodo, as clulas
foram estimuladas ou no
PMA (50 ng/mL) + Ionomicina (1 g/mL) e todas as clulas foram
acrescidas de brefeldina
(1000 x). Posteriormente aos estmulos, as clulas foram
bloqueadas com anticorpos
monoclonais anti-CD16/32 da eBiocience (Fc block). Aps, as
clulas foram incubadas com
anti-mouse CD4 FITC e CD8 PE-Cy7 durante 30 minutos a 4 C. Para
a avaliao das citocinas
intracelulares com o objetivo de caracterizar as populaes de
linfcitos T, as clulas foram
ressuspendidas em 100 L de Cytofix/Cytoperm kit (eBiocience) e
incubadas por 20
minutos a 4 C. Em seguida, foram lavadas com 100 L de BD
Perm/WashTM e centrifugadas
a 450 g a 4 C por 5 minutos. Aps este processo, as clulas foram
incubadas com o coquetel
de anticorpos desejados (anti-IFN- PercP-Cy5.5, anti-IL-17 PE,
anti-IL-10 APC) por 20
minutos. Em seguida, as clulas foram novamente lavadas,
centrifugadas a 450 g 4 C por 5
minutos e ressuspendidas em 200 L de MACS buffer. A aquisio
dessas clulas foi atravs
do citmetro de fluxo BD LSRFortessa (BD Bioseciences) e
analisadas no software FlowJo 10.
Como estratgia de gate na marcao intracelular para anlise de
linfcitos, iniciamos
demarcando os singlets, e em seguida escolhendo as clulas
mononucleadas (Fig. 5A) para o
SNC e linfcitos (Fig. 5B) para bao e linfonodos pelos parmetros
de tamanho por
granulosidade. Dentro das clulas mononucleadas ou dos linfcitos
visualizamos as clulas
positivas para CD4 e CD8 e dentro de cada uma dessas populaes,
observamos a produo
de IFN-, IL-17A e IL-10, caracterizando os linfcitos.
3.12.3 Anlise fenotpica das meMSC
-
40
As meMSC foram removidas das placas por tripsinizao, lavadas e
bloqueadas
durante 20 minutos com anticorpos monoclonais anti-CD16/32 da
eBiocience (Fc block) a 4
C. Em seguida, foram lavadas e incubadas durante 20 minutos a 4
C com anticorpos anti-
mouse conjugados especficos para CD14, CD29, CD31, CD44, CD45,
CD73, CD90, MHC II (I-
A/I-E) e MHC I (H-2Hd/H-2Dd). Em seguida, as clulas foram
novamente lavadas,
centrifugadas a 450 g 4 C por 5 minutos e ressuspendidas em 200
L de MACS buffer. A
aquisio dessas clulas foi atravs do citmetro de fluxo BD Canto
II (BD Bioseciences) e
analisadas no software FlowJo 10.
3.12.4 Resposta proliferativa in vitro
Os linfonodos foram extrados no 7 dia ps-imunizao, processadas
em cell strainer
e lavadas com HBSS 1 x sem clcio e magnsio sem suplemento. Em
seguida, foram
ressuspendidas em 1 mL de HBSS 1x sem clcio e magnsio sem
suplemento na presena de
CFSE durante 15 minutos em banho-maria a 37 C. Foram adicionadas
9 mL meio de cultura
suplementado com 10% de SBF e incubado mais 5 minutos em
banho-maria a 37 C. As
clulas (1 x 106) marcadas foram plaqueadas e estimuladas com
estimuladas ou no com
MOG35-55 (50 g/mL) ou -CD3/-CD28 (2 g/mL). Aps 96 horas as
clulas foram coletadas
e marcadas com CD4 PE e CD8 PercP para anlise por citometria de
fluxo. A aquisio dessas
clulas foi atravs do citmetro de fluxo BD Canto II (BD
Bioseciences) e analisadas no
software FlowJo 10.
-
41
3.12.5 Avaliao de molculas de ativao em clulas dendrticas,
macrfagos e microglia.
As clulas dos linfonodos extradas no 7 dia ps-imunizao e as
clulas
mononucleadas do SNC extradas no pico da doena foram plaqueadas
1 x 106 clulas/poo.
Posteriormente, as clulas foram bloqueadas com anticorpos
monoclonais anti-CD16/32 da
eBiocience (Fc block). Aps, as clulas foram incubadas com
anti-mouse CD11b APC, F4/80
-
42
Brilliant Violet 421, CD11c APC-Cy7 , MHC II PE, CD80
PercP-Cy5.5, CD86 FITC durante 30
minutos a 4C. Em seguida, as clulas foram lavadas, centrifugadas
a 450 g 4 C por 5
minutos e ressuspendidas em 200 L de paraformaldedo 1%. A
aquisio dessas clulas foi
atravs do citmetro de fluxo BD LSRFortessa (BD Bioseciences) e
analisadas no software
FlowJo 10. Como estratgia de gate para anlise de molculas de
ativao, iniciamos
demarcando os singlets, e em seguida escolhendo as clulas
mononucleadas (Fig. 6A) para o
SNC e linfcitos (Fig. 6B) para bao e linfonodos pelos parmetros
de tamanho por
granulosidade. Dentro linfcitos visualizamos as clulas positivas
para CD11c (clulas
dendrticas) e CD11b e F4/80, e dentro de cada uma dessas
populaes, observamos a
expresso das molculas CD86, CD80 e MHC II (Fig. 6B). Dentro das
clulas mononucleadas
visualizamos as clulas positivas para CD11b e com expresso baixa
(microglia ativada) e alta
(macrfagos infiltrantes) de CD45, e dentro de cada uma dessas
populaes, observamos a
expresso das molculas CD86 e MHC II (Fig. 6A).
-
43
3.13 Anlises estatsticas.
Todas as anlises estatsticas foram realizadas com o auxlio do
software Graphpad
Prism (Graphpad Software Incorporation) verso 6. As diferenas
entre as mdias dos
resultados que foram obtidos nos experimentos foram determinadas
pelo Unpaired t test
Student ou anlise de varincia (ANOVA), dependendo do nmero de
variveis. T test ou
ANOVA * p
-
44
4 RESULTADOS
4.1 Obteno e caracterizao das meMSC
Inicialmente realizamos a histologia da tuba uterina (Fig. 7A) e
do tero (Fig. 7B),
rgos dos quais isolamos as meMSC, a fim de conhecer melhor suas
estruturas. Podemos
observar que ambos os rgos so formados pelo perimtrio, miomtrio
e endomtrio. A
camada mais externa formada pelo mesotlio, constituda por uma
camada serosa e tecido
conjuntivo, conhecida como perimtrio. O miomtrio, por sua vez, a
camada subjacente de
musculatura lisa, responsvel pelas contraes do msculo no parto e
na menstruao. E,
por fim, o endomtrio a camada mais interna, rica em glndulas
secretoras de muco e
onde ocorre a implantao embrionria. Alm disso, essa camada
divida em camada basal
e funcional, sendo a basal encontrada em contato com o miomtrio
e a funcional voltada
para o lmen (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Tambm realizamos
imunohistoqumica de
ambos, sendo observadas clulas positivas para vimentina e PCNA3,
marcadores de
citoesqueleto e de ciclo celular, respectivamente, (Fig. 8A e
8B), e descritos por caracterizar
as clulas tronco mesenquimais.
Aps conseguirmos caracterizar e conhecer as estruturas da tuba
uterina e do tero
de camundongos fmea e sabendo que esses animais tambm possuem
fases em seu ciclo
estral, identificamos essas fases a fim de observar possveis
diferenas na celularidade e
facilitar a obteno das meMSC. O ciclo estral de camundongos fmea
consiste em:
proestro, estro, metaestro e diestro, sendo que o ciclo completo
leva em torno de 4-5 dias
(BYERS et al, 2012). Assim, reparamos que em cada fase estral a
vagina se encontra em
formas distintas (Fig. 9A). Na fase proestro observamos a vagina
com hiperemia e edema,
enquanto que na fase estro h um aumento do edema e presena de
muco copioso que
propicia a monta com complacncia. Na fase metaestro h presena de
pouco muco e
palidez, e para finalizar o ciclo, durante a diestro podemos
observ-la plida e seca. Para
distinguirmos melhor cada fase do ciclo estral, realizamos o
lavado vaginal e posterior
anlise por citologia (Fig. 9B) e citometria de fluxo (Fig. 9D).
Pudemos identificar diferenas
significativas na celularidade entre elas, sendo a fase proestro
caracterizada pela grande
quantidade de clulas epiteliais nucleadas e algumas clulas
epiteliais cornificadas. J a fase
-
45
estro apresentou clulas epiteliais cornificadas em menor
quantidade. A fase metaestro,
caracterizou-se por clulas epiteliais cornificadas juntamente
com alguns leuccitos,
enquanto a fase diestro, por sua vez, apresentou uma
predominncia destes leuccitos.
Aps a caracterizao das fases estrais, obtivemos as meMSC em cada
uma delas (Fig.
9C e 10), com o objetivo de observar diferenas em rendimento e
viabilidade. Ao avaliarmos
o rendimento total de clulas aps o processamento dos rgos, a
fase estro apresentou o
maior nmero de clulas em comparao com as outras fases (Fig.
10B). Nossos resultados
tambm mostraram que as amostras obtidas em proestro, metaestro e
diestro, tiveram um
crescimento mais lento, tornando-se confluentes somente entre o
20 e 24 dia de cultivo.
Porm, as meMSC obtidas na fase estro tiveram um crescimento mais
rpido, tornando-se
confluentes j ao 13 dia de cultivo (Fig. 10A). Portanto,
escolhemos trabalhar com as
meMSC retiradas na fase estro.
As clulas-tronco mesenquimais so conhecidas por serem
multipotentes com
morfologia alongada, possurem capacidade de se diferenciar nas
linhagens condrognica,
adipognica e osteognica e por apresentarem um fentipo bem
estabelecido. Sabendo
disso, o prximo passo foi comprovar que as clulas que obtivemos
eram as de nosso
interesse. Para isso, primeiramente vimos que as clulas quando
cultivadas se apresentavam
alongadas, e em seguida realizamos a diferenciao das meMSC
obtidas na fase estro nas
linhagens citadas (Fig. 11). Ns constatamos que, embora as
clulas diferenciadas em
adipcitos no estivessem confluentes, houve um acmulo
intracelular de vacolos ricos em
lipdeos que so indicados pela cor vermelha (Fig. 11C e 11D), no
observado na cultura
controle (Fig. 11A e 11B). Para mais, notamos a presena de
matriz extracelular de
mucopolissacardeo, caracterizando a diferenciao em condrcitos
(Fig. 11G e 11H),
diferentemente da cultura controle (Fig. 11E e 11F). E ao
realizamos a diferenciao
osteognica, verificamos um acmulo de clcio nas clulas
diferenciadas indicado pela cor
preta (Fig. 11K e 11L) no sendo indicado nas clulas no
diferenciadas (Fig. 11I e 11J).
Por ltimo, realizamos a caracterizao fenotpica dessas culturas.
Podemos observar
que, de acordo com a literatura, as mesmas apresentaram uma alta
expresso de CD29,
-
46
CD73, CD90 e MHC de classe I, sendo negativas para CD14, CD31,
CD45 e MHC de classe II
(Fig 12).
Figura 7 - Histologia da Tuba Uterina e tero. Identificao das
estruturas perimtrio, miomtrio e endomtrio da tuba uterina (A) e
tero (B) de camundongos fmea C57BL/6 WT (n=2) atravs de corte
histolgico com colorao de Hematoxilina e Eosina. Imagens esquerda
esto em aumento de 20 x; Imagens direita esto em aumento de 10
x.
-
47
Figura 8 - Ensaios Imunohistoqumicos da Tuba Uterina e tero. A
Tuba Uterina (A) e o tero (B) (n=2) apresentaram marcao positiva
para Vimentina, um marcador de citoesqueleto e PCNA3, um marcador
de ciclo celular e no apresentaram marcao no controle negativo.
Imagens esquerda esto em aumento de 4 x; Imagens ao meio esto em
aumento de 10 x; Imagens direita esto em aumento de 20 x.
-
48
Figura 9 - Caracterizao das Fases Estrais. A caracterizao foi
realizada atravs da A) abertura vaginal de camundongos fmeas
C57BL/6 WT e atravs do lavado vaginal posteriormente analisados por
D) citometria de fluxo e B) citologia com o corante pantico.
Identificamos as fases Proestro; Estro; Metaestro; Diestro. CEC =
clulas epiteliais; M = clulas mortas; L = leuccitos; Seta preta =
clulas epiteliais cornificadas; Seta branca = clulas epiteliais
nucleadas; Crculo = leuccitos. C) As meMSC foram cultivadas em cada
fase estral at o 20 dia de cultivo, onde tornarem-se confluentes. *
= meMSC obtidas na fase estro tornam-se confluentes no 13 dia de
cultivo. B) Imagens aumento de 10 x. C) Imagens em aumento de 4 x;
n=5.
-
49
Figura 10 - Rendimento de meMSC nas Fases Estrais. As tubas
uterinas e o tero de animais C57BL/6 WT (n=2) foram extrados na
fase proestro; estro; metaestro; e diestro. Os rgos extrados foram
processados para obteno de meMSC e as clulas cultivadas em garrafas
de 25 cm nas mesmas condies, afim de avaliar o seu rendimento em
cada uma das fases estrais. As meMSC obtidas nas fases proestro,
metaestro e diestro tiveram um crescimento mais lento, tornando-se
confluentes ao 20 dia de cultivo. Porm durante a fase estro,
tornam-se confluentes no 13 dia de cultivo. A) Imagens do
crescimento da cultura em diferentes dias. * = meMSC fase estro no
13 dia de cultivo. Imagens em aumento de 10 x. # = Imagens em
aumento de 4 x. B) Contagem do nmero de clulas obtidas no
processamento dos rgos.
-
50
Figura 11 - Diferenciao de multilinhagens in vitro. A-D)
diferenciao adipognica colorao com Oil Red. A) e B) representam o
controle; C) e D) a diferenciao adipognica caracterizada pela
acumulao intracelular de vacolos ricos em lipdeo visualizados em
vermelho. E-H) diferenciao condrognica colorao com Toluidine Blue.
E) e F) representam o controle; G) e H) a diferenciao condrognica
caracterizada pela matriz extracelular mucopolissacardeo.
I-L)diferenciao osteognica colorao com Alizarin Red. I) e J)
representam o controle; K) e L) a diferenciao osteognica
caracterizada pelo acmulo de clcio indicado pela cor preta. Imagens
em aumento de 10 x; n=4.
-
51
Figura 12 - Caracterizao fenotpica das meMSC. As meMSC obtidas
na fase proestro de camundongos fmeas C57BL/6 WT entre as passagens
2 e 4, foram submetidas a anlise por citometria de fluxo para
verificar a expresso dos marcadores CD29, CD31, MHC II (I-A/I-E),
CD14, CD90, MHC I (H-2Hd/H-2Dd), CD45, CD44 e CD73 representados em
histograma vermelho . O controle istipo mostrado em histograma
azul.
CD29 CD31 MHC II
MHC I CD90 CD14
CD73 CD44 CD45
-
52
4.2 O tratamento com as meMSC capaz de atrasar o aparecimento
dos sinais clnicos da EAE
A fim de descobrir se as meMSC possuem potencial no tratamento
de animais com
EAE, optamos realiz-los ao dia da imunizao, com o objetivo de
agirem na monta da
resposta imune nos rgos linfoides secundrio e, tambm, ao 10 dia
aps a imunizao,
uma vez que possam rumar ao SNC e, assim, agir in situ (Fig.
13A). Ao acompanhar
diariamente os animais com EAE tratados ou no, podemos notar que
o escore clnico, entre
os dias 11 e 17 ps-imunizao, foi menor nos animais tratados com
meMSCs (Fig. 13B).
Figura 13 - Escore clnico de animais com EAE tratados ou no com
meMSC. Camundongos fmea C57BL/6 WT foram imunizados com 150 g de
MOG
35-55 de acordo com os materiais e mtodos e no mesmo dia
tratados
com tratados com 1 x 106
clulas/animal. No 10 dia receberam uma segunda dose de meMSC (1
x 106
clulas/animal). n=5 para animais sacrificados no 7 dia ps
imunizao e n=10 para os animais sacrificados no pico da doena (A).
O escore da doena foi avaliado diariamente (B). Dados
representativos de dois
experimentos independentes. T test *p < 0,05; **p < 0,01;
****p < 0,001.
-
53
4.3 Modulao desencadeada por meMSC na ativao da resposta imune
adaptativa nos linfonodos
Uma vez que o desenvolvimento da EAE dependente da ativao de
clones
autorreativos especficos para MOG35-55, principalmente
subpopulaes Th1 e Th17, e pela
resposta imune adaptativa ser iniciada nos linfonodos, fomos
verificar se as meMSC teriam a
capacidade de agir sobre as clulas apresentadoras de antgenos ou
diretamente em
linfcitos T nos linfonodos de animais tratados ou no no 7 dia
aps imunizao.
4.3.1 Efeitos das meMSC sobre a apresentao de antgenos.
Primeiramente avaliamos a expresso de molculas de
coestimuladoras em clulas
dendrticas e macrfagos de linfonodos drenantes. No observamos
diferena em sua
frequncia e nmero absoluto entre os grupos (Fig 14A). Em
seguida, observamos que no
h diferena no nmero absoluto e frequncia de clulas que expressam
as molculas
coestimuladoras CD80 e CD86, tampouco na expresso dessas
molculas quando avaliamos
o MFI (Fig 14B).
Quanto aos macrfagos, que so clulas caracterizadas por serem
positivas para a
molcula de superfcie CD11b, observamos o mesmo. No h diferena
quanto frequncia,
nmero absoluto de macrfagos (Fig 15A) tampouco quanto expresso
de molculas
coestimuladoras e de MHC de classe II (Fig. 15B).
-
54
Figura 14 - As meMSC no so capazes de modular a expresso de
molculas de ativao em clulas
dendrticas dos linfonodos no modelo de EAE na monta da resposta
imune. As clulas dos linfonodos (1x106
clulas/poo) de camundongos fmeas C57BL/6 WT (n=5) com EAE
tratados ou no com meMSC no 7 dia aps imunizao foram analisados
quanto a frequncia e o nmero absoluto de clulas dendrticas (A) e a
expresso de molculas de ativao CD86 e CD80 (B) por citometria de
fluxo. MFI = Intensidade Mediana de Fluorescncia. Dados
representativos de dois experimentos independentes. T test * p
-
55
Figura 15 - As meMSC no so capazes de modular a expresso de
molculas de ativao em macrfagos dos
linfonodos no modelo de EAE na monta da resposta imune. As
clulas dos linfonodos (1 x 106
clulas/poo) de camundongos fmeas C57BL/6 WT (n=5) com EAE
tratados ou no com meMSC no 7 dia aps imunizao foram analisados
quanto a frequncia e o nmero absoluto de macrfagos (A) e a expresso
de molculas de ativao MHC II, CD86 e CD80 (B) por citometria de
fluxo. MFI = Intensidade Mediana de Fluorescncia. Dados
representativos de dois experimentos independentes. T test * p
-
56
4.3.2 Papel das meMSC nas subpopulaes de linfcitos T.
Sabendo da importncia de linfcitos T na imunopatognese da EAE,
nos atentamos
em verificar as diferentes subpopulaes geradas nos linfonodos.
Pudemos perceber que h
diminuio de linfcitos T CD4+ nos animais tratados com as meMSC
(Fig. 16A), sendo que o
perfil desses tambm modulado, uma vez que o tratamento diminuiu
os linfcitos Th1,
caracterizados por produzir a citocina IFN-, assim como os
linfcitos Th17 produtores de IL-
17A. De forma interessante, observamos o aumento dos clones
secretores de IL-10 apenas
nas clulas no estimuladas in vitro, apesar de haver uma tendncia
a aumentar essa
populao em resposta ao antgeno especfico no tratamento com as
meMSC (Fig. 16B; 16C).
Dando continuidade, analisamos as citocinas secretadas pelas
clulas totais dos
linfonodos, o que ratificou os resultados acima, pois h um
aumento na secreo de IL-10 e
diminuio na IL-17A e IFN- no grupo tratado (Fig. 17). Ao
avaliarmos a expresso gnica
dos fatores de transcrio e citocinas caractersticas de algumas
subpopulaes de linfcitos
T, no observamos diferena entre os grupos, entretanto, pode-se
observar o aumento na
expresso gnica da citocina IL-27 (Fig. 18).
Alm disso, a citocina pr-inflamatria IL-6 pareceu diminuda e a
IL-4, uma citocina
caracterstica da populao Th2, aumentou com o tratamento (Fig.
17). Observamos
tambm o aumento da secreo de IL-2 pelas clulas totais dos
linfonodos tratados (Fig. 17),
a despeito de no haver diferena na proliferao de linfcitos T
CD4+ e T CD8+ entre os
grupos (Fig. 19).
-
57
Figura 16 - As meMSC so capazes de modular o perfil de linfcitos
T CD4+
dos linfonodos durante o incio da
resposta imune no modelo de EAE. As clulas dos linfonodos
inguinais, axilares e periarticos (1 x 106
clulas/poo) de camundongos fmeas C57BL/6 WT (n=5) com EAE
tratados ou no com meMSC no 7 dia aps imunizao foram estimulados ou
no com MOG
35-55 (50 g/mL) durante 12 horas e PMA (50 ng/mL) +
Ionomicina (1 g/mL) nas ltimas 4 horas. Alm disso, todos os
grupos receberam brefeldina 1000 x nas
ltimas 4 horas. Aps a incubao, foi analisada a frequncia e o
nmero absoluto de linfcitos T CD4+
(A) e sua produo das citocinas IFN-, IL-17A e IL-10 (B) por
citometria de fluxo representado pelo grupo estimulado com MOG
35-55, seguido dos grficos representativos (C). Dados
representativos de dois experimentos
independentes. T test * p
-
58
Figura 17 - Anlise do perfil de citocinas dos linfonodos de
animais com EAE tratados ou no com meMSC durante a monta da
resposta imune. Os linfonodos inguinais, axilares e periarticos de
camundongos fmeas
C57BL/6 WT (n=5) com EAE tratados ou no com meMSC 7 dias aps
imunizao foram processados e 1 x 106
de clulas/poo foram estimulados ou no com MOG
35-55 (50 g/mL). Aps 96 horas o sobrenadante foi
coletado para anlise do perfil de citocinas atravs da tcnica de
CBA. Dados representativos de dois experimentos independentes. T
test * p
-
59
Figura 18 - Expresso gnica dos linfonodos de animais com EAE
tratados ou no com meMSC na monta da resposta imune. Camundongos
fmeas C57BL/6 WT (n=5) foram imunizados com 150 g de MOG
35-55 de
acordo com os materiais e mtodos e no mesmo dia tratados com
tratados com 1 x 106
meMSC/animal. No 7 dia aps imunizao os linfonodos inguinais,
axilares e periarticos foram retirados e o mRNA extrado para
posterior anlise de expresso gnica. Os dados foram normalizados com
o gene da -actina e comparados com o grupo controle. Dados
representativos de dois experimentos independentes. Anlise
Estatstica T test * p < 0,05.
Foxp3
Fo
ld C
ha
ng
e
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
Il10
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Rorc
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Il17a
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Tbx21
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
Ifng
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Ido1
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
ifnb1
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 p=0,09
Tgfb1
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
Il27
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0
2
4
6
*
Il6
Fo
ld C
han
ge
Controle meMSC0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
-
60
Figura 19 - Proliferao dos linfcitos T CD4+
e T CD8+
dos linfonodos de animais com EAE tratados ou no com meMSC
durante monta da resposta imune. Os linfonodos inguinais, axilares
e periarticos de camundongos fmeas C57BL/6 WT (n=5) com EAE
tratados ou no com meMSC 7 dias aps imunizao foram
processados, marcados com CFSE e 1 x 106
de clulas/poo foram estimuladas ou no com MOG35-55
(50 g/mL)
ou -CD3/-CD28 (2 g/mL). Aps 96 horas as clulas foram coletadas e
marcadas com CD4 e CD8 para anlise por citometria de fluxo. Dados
representativos de dois experimentos independentes. A anlise
estatstica T test foi empregada.
-
61
4.4 Avaliao dos efeitos do tratamento com as meMSC em clulas
residentes e
infiltrantes do SNC
Aps avaliarmos o perfil das clulas envolvidas na imunopatognese
da EAE no local
e no perodo em que a resposta imune est sendo formada, fomos
investigar a ativao de
clulas residentes e as clulas autorreativas infiltrantes do SNC,
responsveis por provocar
os sinais clnicos. Primeiramente, observamos que o tratamento
com as meMSC foi capaz
amenizar a desmielinizao da medula espinhal (Fig. 20B), haja
vista que tambm diminuiu o
nmero total de clulas infiltrantes no SNC (Fig. 20A; 20C).
Figura 20 - As meMSC so capazes de reduzir a neuroinflamao e
dano histopatolgico. Camundongos fmeas C57BL/6 WT (n=10) foram
imunizados com 150 g de MOG
35-55 de acordo com os
materiais e mtodos e no mesmo dia tratados com tratados com 1 x
106
meMSC/animal. No pico da doena, o SNC foi processado e o nmero
total de clulas infiltrantes foram contadas (C). Alm disso, a poro
distal da medula espinhal de cada animal foi retirada e submetida a
histologia pela colorao de Hematoxilina e Eosina (A) ou Luxol Fast
Blue (B). Imagens em aumento de 20 x. Dados representativos de dois
experimentos independentes. T test * p
-
62
4.4.1 Papel das meMSC na infiltrao de macrfagos e ativao da
microglia
Seguidamente, fomos avaliar a ativao de macrfagos infiltrantes
do SNC e de
clulas da microglia, sendo que ambas so conhecidas por
expressarem a molcula de
superfcie CD11b, entretanto, os macrfagos possuem alta expresso
da molcula CD45
enquanto que a microglia a expressa em baixos nveis. A princpio,
pudemos observar uma
diminuio significativa de macrfagos e de clulas da microglia
ativadas (Fig. 21A).
Ao compararmos os dois grupos quanto ao perfil de ativao de
macrfagos
infiltrantes, notamos que h uma diminuio no nmero de clulas que
expressam MHC II e
as que expressam CD86. Alm disso, o MFI de MHC II e CD86 menor
em macrfagos
infiltrantes do SNC nos animais tratados com as meMSC (Fig.
21B). Quando nos atentamos
s clulas da microglia, embora no tenhamos obtido diferena na
expresso de CD86, a
quantidade de clulas da microglia que expressam MHC II menor com
o tratamento (Fig.
21C).
-
63
Figura 21 - As meMSC so capazes diminuir a infiltrao de
macrfagos e ativao da microglia no SNC no
modelo de EAE. As clulas mononucleadas do SNC (1 x 106
clulas/poo) de camundongos fmeas C57BL/6 WT (n=10) com EAE
tratados ou no com meMSC no pico da doena foram analisados quanto a
frequncia e o
nmero absoluto de macrfagos infiltrantes (CD11b+
CD45High
) e microglia (CD11b+
e CD45Low
) (A) e a expresso de molculas de ativao MHC II e CD86 em
macrfagos infiltrantes (B) e na microglia ativada (C) por
citometria de fluxo. MFI = Intensidade Mediana de Fluo
