Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Mecanismos de Transduo de Sinal Ativados por Purinas, Pirimidinas e Fatores de Crescimento em Culturas de Astrcitos

Guido Lenz

Orientador Dr. Richard RodnightTese apresentada ao curso de PsGraduao em Cincias Biolgicas Bioqumica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como requisito parcial obteno do grau de Doutor em Bioqumica

Porto Alegre 2000

O que conhecemos finito, o desconhecido infinito; intelectualmente estamos parados numa ilha no meio de um oceano ilimitado da inexplicabilidade. Nosso objetivo a cada gerao conquistar um pouco mais terra.Thomas Huxleyii

Ao Dr. Heinrich Engelbert Lenz (in memorian) Por ter me ensinado a pescar

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AgradecimentosAo Dr. Rodnight, por to bem ter me orientado e incentivado pelos melhores caminhos; Aos colaboradores mais diretos, Dani, Cris, Carmem, Ju, Fram, Letcia, Silvana, Connie obrigado pelo colegismo e pela eficincia; Aos pacientes revisores, Osvaldo, Fernanda, Lauren, CA e Fabiana; Aos colegas do lab, obrigado por toda a ajuda e alegria; Carla Tasca e ao Diogo Souza, pelo auxlio com as dosagens de cAMP; Aos colegas do Departamento de Biofsica, especialemente Ana Lgia e ao Jorge; Maria del Mar e ao Prof. Zaha, pelo auxlio com as bactrias;

I would like to thank Dr. Neary for his pacient and wise orientation; Connie for teaching me so much in the lab; To my nice lab-mates in Nearys lab; Holly for welcoming me so nicely to Miami.

Mrcia, pelo amor e companheirismo comprensivo na longa ausncia e nas horas difceis necessrias para esta conquista; Aos meus pais, por terem me incentivado tanto por toda esta jornada; Aos meus irmos, amigos e a todos aqueles com os quais convivo.

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ndice1. PRLOGO 1

2. 2.1.

INTRODUO PARTE 1. TRANSDUO DE SINAL

5 5 6 7 7 13 17 19 20 22 32 42 43

2.1.1. COMPONENTES 2.1.1.1. Receptores 2.1.1.2. Mensageiros 2.1.1.3. Efetores 2.1.1.4. Protenas de ancoramento ou adaptadoras 2.1.2. AS CASCATAS DAS MAPKS 2.1.2.1. Eventos celulares regulados pelas MAPKs 2.1.2.2. A cascata da ERK. 2.1.2.3. Isoformas das cascatas das MAPKs 2.1.3. INTEGRAO DA SINALIZAO NA CASCATA DAS MAPKS 2.1.3.1. Protenas G 2.1.3.2. Ca2+

44 44

2.1.3.3. cAMP / PKA 2.1.3.4. PKCs 46 2.1.4. CARACTERSTICAS ESPECIAIS DE MECANISMOS DE SINALIZAO 2.1.4.1. Amplificao e digitalizao 2.1.4.2. Sinergismo e coincidncia 2.1.4.3. Sinalizaes Redundantes 2.1.4.4. Deteco de freqncia 2.1.4.5. Retroalimentao e ciclos 2.2. PARTE 2. PURINAS E PIRIMIDINAS COMO TRANSMISSORES.

47 47 48 50 51 52 54 55 57 57 57

2.2.1. LIGERAO E EFEITOS FISIOLGICOS 2.2.2. RECEPTORES P1 OU DE ADENOSINA 2.2.3. RECEPTORES P2 2.2.3.1. Ionotrpicos (P2X)

v

2.2.3.2. Metabotrpicos (P2Y) 2.2.4. MECANISMOS DE SINALIZAO ATIVADOS POR RECEPTORES P2Y 2.3. PARTE 3. ASTRCITOS

58 63 66 67 67 68 68 68 69 70 70 72

2.3.1. INTERRELAO GLIA-GLIA E GLIA-NEURNIO 2.3.2. RECEPTORES PURINRGICOS NOS ASTRCITOS 2.3.3. OUTROS GPCRS PRESENTES NOS ASTRCITOS 2.3.3.1. Receptores adrenrgicos 2.3.3.2. Receptores Serotoninrgicos 2.3.3.3. MAPK nos astrcitos 2.3.3.4. Proliferao induzida por ATP e FGF-2 2.3.3.5. Gliose reativa 3. OBJETIVOS

4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 5. 5.1.

MATERIAIS E MTODOS AGONISTAS INIBIDORES E ATIVADORES CULTURA DE CLULAS, TRATAMENTO E LISE. ENSAIO ACOPLADO DA RAF E MAPKKKS ENSAIO DA MEK E DA ERK ENSAIO DO CAMP PRODUO DE PROTENAS ATRAVS DE E. COLI TRANSFORMADAS. RESULTADOS ATIVAO DA CASCATA POR AGONISTAS PURINRGICOS.

73 73 74 74 75 77 78 80 83 83 85 87

5.1.1. EFEITOS DOS AGONISTAS PURINRGICOS SOBRE DIVERSOS ATIVADORES DE MEK. 5.1.2. CINTICA DE ATIVAO DA CASCATA POR ATP E UTP. 5.1.3. ATP DIMINUI A CONCENTRAO BASAL DE CAMP, MAS SINERGISOU POSITIVAMENTECOM FORSCOLINA.

89 90 91

5.2.

INTERAO ENTRE AS VIAS DE SINALIZAO ATIVADAS POR ATP E FGF-2.

5.2.1. ATP BLOQUEIA A ESTIMULAO DA CRAF-1 INDUZIDA POR FGF-2.

vi

5.2.2. CURVA DOSE-RESPOSTA DA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP. 5.2.3. CURVA DE TEMPO DA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP. 5.2.4. EFEITO DE INIBIDORES DE PKC NA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP. 5.2.5. A ATIVAO DE CRAF-1 POR EGF E PDGF TAMBM FOI BLOQUEADA POR ATP. 5.2.6. EFEITO DO ATP SOBRE OUTROS ATIVADORES DE MEK1. 5.2.7. EFEITO DA NORADRENALINA (NA) E DA SEROTONINA (5-HT) SOBRE A ATIVIDADE DACRAF-1.

92 93 94 96 97

98 99 102

5.2.8. EFEITO DA INTERAO DAS VIAS DE SINALIZAO SOBRE MEK E ERK. 6. 6.1. DISCUSSO RECEPTORES PURINRGICOS ASSOCIADOS ATIVAO DA CASCATA DA ERK EM

ASTRCITOS.

102 102 103 103 104 106 106 108 108 109

6.1.1. RECEPTORES P2Y EXPRESSOS EM CULTURAS DE ASTRCITOS. 6.1.2. EFEITOS DA ATIVAO DE PURINOCEPTORES SOBRE A CASCATA DA ERK. 6.1.3. RECEPTOR P2Y ENVOLVIDO NA ATIVAO DE ERK POR UTP. 6.1.4. RECEPTOR P2Y ENVOLVIDO NA ATIVAO DE ERK POR ATP. 6.1.5. CURVAS DE TEMPO 6.1.6. SINERGISMO ENTRE FORSCOLINA E ATP NA PRODUO DE CAMP. 6.2. MECANISMO DE ATIVAO DA CASCATA DA ERK POR PURINOCEPTORES.

6.2.1. MECANISMO DE ATIVAO DA CASCATA DA ERK POR ATP. 6.2.2. MECANISMO DE ATIVAO DA CASCATA DA ERK POR UTP. 6.3. INTERAO ENTRE A SINALIZAO ATIVADA POR AGONISTAS PURINRGICOS E

FATORES DE CRESCIMENTO.

110 110 111 114 115 116 116

6.3.1. PURINOCEPTOR ENVOLVIDO NA INIBIO DE CRAF-1. 6.3.2. CINTICA DE ATIVAO E INIBIO DA CASCATA 6.3.3. MECANISMO DA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP. 6.3.3.1. Efeito de inibidores de PKC. 6.3.3.2. O mecanismo de inibio no foi especfico para cRaf-1 ativada por FGF-2. 6.3.3.3. Evidncias de outros agonistas de GPCR

6.3.3.4. O mecanismo de sinalizao ativado por ATP no foi especfico para a inibio de cRaf1. 118 6.3.3.5. Provveis candidatos envolvidos no mecanismo de inibio 6.3.4. EFEITOS SOBRE ERK 119 120

vii

6.4.

EFEITOS DO ATP E FGF-2 SOBRE O CICLO CELULAR POSSVEL MECANISMO PARA 123 124

EXPLICAR O SINERGISMO NA PROLIFERAO.

6.5.

COMPLEXIDADE DOS MECANISMOS DE TRANSDUO DE SINAL

6.5.1. ESPERANAS METODOLGICAS PARA A OBTENO DE DADOS EM TRANSDUO DESINAL.

126 129 129 130 131 131 131 131

7. 7.1. 7.2. 8. 8.1.

CONCLUSES ESPECFICAS GERAIS PERSPECTIVAS MECANISMO DE SINALIZAO ATIVADOS POR PURINOCEPTORES

8.1.1. MECANISMO DE ATIVAO DA CASCATA DA ERK POR ATP E UTP. 8.1.2. MECANISMO DE INIBIO DA CRAF-1 POR ATP.

8.1.3. POSSIBILIDADE DO ENVOLVIMENTO DA INIBIO DE CRAF-1 POR ATP NA ATIVAO DACASCATA DA ERK POR AGONISTAS PURINRGICOS.

132 134 134 134 135

8.2.

EFEITOS REGULATRIOS DO CICLO CELULAR

8.2.1. MECANISMO DO SINERGISMO 8.2.2. ESTUDO DO SINERGISMO EM LINHAGENS DE ASTROCITOMAS. 9. REFERNCIAS

10. 10.1. 10.2.

ANEXOS MANUSCRITO DOS ARTIGOS REFERENTES TESE OUTROS TRABALHOS REALIZADOS DURANTE O DOUTORADO (NO ANEXADO)

163 163 164

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ResumoA cascata da ERK (Extracellular Signal Regulated Protein Kinase) formada por trs quinases (cRaf-1, MEK1 e ERK) e est envolvida em inmeros processos celulares como proliferao e diferenciao. Esta cascata ativada por uma grande variedade de mecanismos e transmissores. ATP e UTP so importantes molculas sinalizadoras, atuando sobre purinoceptores, tanto ionotrpicos (P2X) como metabotrpicos (P2Y). Nos astrcitos, a ativao dos receptores P2Y leva ativao da ERK que est envolvida na induo da proliferao celular. No presente trabalho foram realizadas dosagens dos componentes da cascata em culturas primrias de astrcitos tratados com diversos agonistas purinrgicos e/ou fatores de crescimento. Baseados na atividade de cRaf-1, MEKK1, MEKK2, MEK e ERK e tambm na dosagem de cAMP, pode ser sugerido que astrcitos expressam pelo menos dois purinoceptores metabotrpicos (P2Y) funcionalmente ligados com a ativao da cascata da ERK. Um receptor P2Y preferencialmene ativado por ATP, ativou MEK e ERK de uma forma independente de cRaf-1, MEKK1 e MEKK2, enquanto que um segundo receptor, ativado preferencialmente por UTP, estimulou a atividade de cRaf-1, MEKK1, MEKK2, MEK e ERK. Alm de ativar ERK, ATP tambm inibe a ativao de cRaf-1 induzida por FGF-2 com caractersticas que indicam que esta inibio ocorre acima de cRaf-1 e abaixo do receptor do fator de crescimento, atravs de mecanismos que no envolvem PKC nem o aumento de cAMP. O presente estudo mostra a complexidade da sinalizao purinrgica nos astrcitos tanto a nvel dos receptores bem como a nvel das integraes entre as vias de sinalizao, com potenciais implicaes na compreenso de eventos celulares como a proliferao e eventos fisiopatolgicos como a astrogliose.

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AbstractThe trophic actions of extracellular nucleotides on astrocytes, which may be important in development as well as in brain injury and repair, appear to be mediated by extracellular signal regulated protein kinase (ERK), a member of a protein kinase cascade crucial for cellular proliferation and differentiation. Here we have investigated components of the ERK signaling pathway recruited by P2Y receptors. Rat astrocytes express several types of metabotropic P2Y nucleotide receptors. Stimulation of these astrocytic receptors by ATP or UTP leads to activation of ERK. We found that in primary cultures of rat cortical astrocytes UTP and 2MeSATP, as well as FGF-2, activated c-Raf whereas ATP did not, even though ATP, UTP, 2MeSATP and FGF-2 stimulated ERK to a similar extent. Furthermore, ATP did not activate B-Raf or MEKK1 but inhibited the activation of c-Raf induced by FGF-2. This inhibitory effect seems to act on a component between the growth factor and the MEK activates and was not mediated by PKC or cAMP. The differences in activation of c-Raf by ATP, UTP and 2MeSATP, together with the inhibitory effect on FGF-2-induced c-Raf and the lack of effect on cAMP synthesis, suggests the presence of a group of ERK-coupled, P2Y receptor subtypes on astrocytes which do not seem to match the characteristics described for cloned P2Y receptor subtypes. The present study shows the complexity of the purinergic signaling in astrocytes both at the receptor level as at the singnal transduction pathway level, with potential implications in the understanding of cellular events such as proliferation and physiopathological events like astrogliosis.

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ndice de FigurasFigura 1. Mecanismos de transduo de sinal intracelular. _____________________________ 6 Figura 2. Representao esquemtica de alguns mensageiros intracelulares. _______________ 8 Figura 3. Ciclo regulatrio da subunidade da protena G. ____________________________ 9 Figura 4. As diversas cascatas das MAPKs, seus ativadores e seus efeitos. ________________ 19 Figura 5. Modelo para a ativao de Ras por EGF (A) e por NGF (B). ___________________ 23 Figura 6. Vias de sinalizao ativadas por FGFR. ___________________________________ 33 Figura 7. Integrao da sinalizao proveniente de cAMP, Ca2+ e DAG no nvel das Rafs. ___ 42 Figura 8. Adenilil Ciclase como detector de coincidncia. _____________________________ 50 Figura 9. Dendograma representando a relao entre as seqncias dos subtipos de receptores P2Y, bem como a sua sensibilidade aos agonistas purinrgicos. ________ 59 Figura 10. Enquema do ensaio acoplado de ativadores de MEK. _______________________ 77 Figura 11. Expresso e purificao da RBD-GST e ERK. ______________________________ 82 Figura 12. Efeito dos agonistas purinrgicos e FGF-2 sobre cRaf-1 (A), MEK (B) e ERK (C) e quantificao destes resultados (D). _____________________________________ 84 Figura 13. Ensaio acoplado de B-Raf (A), MEKK1 (B) ativados por agonistas purinrgicos e FGF-2 e quantificao destes experimentos (C). _____________________________ 86 Figura 14. Curva de tempo para ativao de cRaf-1 (A) e ERK (B) por ATP, UTP, 2MeSATP e FGF-2. _____________________________________________________ 88 Figura 15. ATP inibiu a ativao de cRaf-1 por FGF-2 _______________________________ 91 Figura 16. Inibio de cRaf-1 ativada por FGF-2 por ATP (A) e a curva dose-resposta deste efeito e da ativao de ERK por ATP (B).___________________________________ 92 Figura 17. Curva de tempo de ativao de cRaf-1 por ATP, FGF-2 e A+F. ________________ 93 Figura 18. Efeito do ATP na atividade de cRaf-1 induzida por FGF-2, EGF e PDGF. _______ 96 Figura 19. Efeito do ATP e do FGF-2 sobre diferentes ativadores de MEK. _______________ 97 Figura 20. Curva de tempo de ativao de MEK e ERK por ATP e FGF-2. _______________ 100 Figura 21. Grficos da cintica de ativao (A) dos componentes da cascata e inibio da cRaf-1 (B). __________________________________________________________ 113 Figura 22. Esquema da interao entre as vias de sinalizao ativadas por ATP e FGF-2.___ 119 Figura 23. Atividade da ERK induzida por A+F (medida) e a soma da atividade de ERK induzida por ATP e FGF-2 isoladamente(calculada). ________________________ 121 Figura 24. Possvel envolvimento da inibio da cRaf-1 por ATP na ativao da cascata da ERK pelos agonistas purinrgicos. _______________________________________ 133

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ndice de TabelasTabela 1. Stios de fosforilao da cRaf-1 e seus efeitos regulatrios. ____________________ 27 Tabela 2. Fosfatases que podem regular da atividade das cascatas MAPKs. _______________ 31 Tabela 3. Homologia da famlia das Rafs e MEKKs com a cRaf-1 de rato. ________________ 38 Tabela 4. Famlias de receptores para purinas e pirimidinas.___________________________ 55 Tabela 5. Sensibilidade dos receptores P2Y recombinantes aos agonistas purinrgicos em clulas transfectadas. __________________________________________________ 60 Tabela 6. Condies nas quais os agonistas foram utilizados.___________________________ 73 Tabela 7. Condies nas quais ativadores e inibidors foram utilizados. ___________________ 74 Tabela 8. Curva de calibrao para a dosagem de cAMP. _____________________________ 79 Tabela 9. Solues para a dosagem de cAMP._______________________________________ 80 Tabela 10. Meios para crescimento de E. Colis compententes. __________________________ 81 Tabela 11. Solues para o isolamento e purificao da ERK___________________________ 81 Tabela 12. Efeito do ATP e forscolina sobre os nveis de cAMP._________________________ 90 Tabela 13. Estudo do envolvimento da PKC na inibio de cRaf-1 por ATP. _______________ 95 Tabela 14. Efeito da noradrenalina e da serotonina na atividade da cRaf-1 induzida por FGF-2. ______________________________________________________________ 99 Tabela 15. Tempo no qual a atividade dos componentes da cascata atinge 50% da atividade mxima (t0,5) em segundos. _____________________________________________ 113

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Lista de AbreviaturasAC Adenylyl Ciclase Enzima produtora de cAMP2 ATF Activating Transcription Factor ATP Adenosine Triphosphate ATPS adenosine 5-S-(3-thiotriphosphate);

1

AEBSF 4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonylfluoride Inibidor de proteases.

BAPTA-AM 1,2-bis(2-aminophenoxy)-ethane-N, N, N,N,-tetraacetic acid tetrakis (acetoxymethyl)ester Quelante de Ca2+ intracelular CaM Calmodulin CaMKII Ca2+/Calmodulin dependent kinase II cAMP 3,5-Cyclic Adenosinemonophosphate cGMP 3,5-Cyclic Guanosinemonophosphate CHO Chinese Hamster Ovary Linhagem Celular CK2 - Casein Kinase 2 CNS - Central Nervous Sistem cPLA2 Cytosolic Phospholipase A2 CR Conserved Region CREB - cAMP Responsive Element Binding Protein Fator de transcrio DAG Diacylglycerol Ativador endgeno das PKCs DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium - Meio de cultura de clulas. DMSO Dimethyl sulfoxide Solvente orgnico. DTT Dithiothreitol Redutor de pontes dissulfeto. EGF Epidermal Growth Factor EGFR EGF Receptor EGTA - Ethilene Glycol-bis(-Aminoethil Ether N, N, N, N, Tetraacetic Acid Quelante de Ca2+ ERK - Extracellular Signal-regulated Kinase

Abreviaturas citadas somente uma vez no esto listadas. Na primeira vez que uma abreviatura utilizada no texto aparece a sua traduo. 2 Quando aplicvel, a principal caracterstica ser citada.

1

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FCS - Fetal Calf Serum soro utilizado em culturas de clulas. FGF - Fibroblast Growth Factor FGFR FGF Receptor FRS2 - FGF receptor substrate 2 GABA -aminobutiric Acid Neurotransmissor inibitrio GAP - GTPase activating proteins inibidores de G e Ras GDP Guanosine diphosphate GEF Guanine nucleotide exchange factors ativadores de G e Ras GFAP - Glial Fibrillary Acidic Protein Componentes do Filamento Intermedirios e marcador especfico de astrcitos. GPCR - G protein-coupled receptors GRK - G-protein coupled receptor kinases GST glutathione-S-transferase GTP Guanosine triphosphate Hsp Heat shock protein 5-HT 5-Hydroxytryptamine Neurotransmissor IP3 - Inositol-1,4,5-Triphosphate JNK c-Jun Kinase KO knockout Deleo de um gene. LTP - Long-Term Potentiation MAPK (KK)- Mitogen-Ativated Protein Kinase (Kinase Kinase) MAPKAPK - MAPK activated protein kinase MBP Mielin Basic Protein Substrato da ERK. , MeATP , -methylene ATP agonista P2Y MEK - Mitogen Activated, ERK-Activating Kinase 2-MeSATP 2-Methylthio ATP Agonista P2Y mGluR - Metabotropic Glutamate Receptor MKP MAPK Phosphatase mRNA Messenger RNA NA - Noradrenaline NMDA N-methyl-D-aspartate Neurotransmissor estimulatrio xiv

P2X Ionotropic purinergic receptor P2Y Metabotropic purinergic receptor p38 Um tipo de MAPK. PAGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis PC12 Pheochromocytoma Cells PC-PLC - Phosphatidylcholine-specific Phospholipase, PDE - Phosphodiesterase PDGF Platelet-derived Growth Factors PDGFR PDGF Receptor PH Pleckstrin Homology PI3K - Phosphatidyl inositol-3-OH Kinase PKA cAMP Dependent Protein Kinase PKC Protein Kinase C PKG cGMP Dependent Protein Kinase PLC - Phospholipase C PLD - Phospholipase D PMA - Phorbol 12-Myristate 13-Acetate Ativador das PKCs PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluride Inibidor de proteases. PP1 Proten Phosphatase 1 PP2A Proten Phosphatase 2A PPADS Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2, 4-disulfonic acid PTP Protein Tyrosine Phosphatase PTx Pertussis Toxin Inibidor da Protena Gi PY Phosphotyrosine Pyk2 - Proline-rich tyrosine kinase 2 Ras-GEF Ras-Guanine Exchange Factor (Esta protena tambm conhecida por Ras-GRF Ras-Guanine Release Factor ou Ras-GRP Ras-Guanine Release Protein. RBD Ras Binding Domain RGS - Regulators of G-protein signaling Rsk Ribosomal S6 kinase

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RTK Receptor Tyrosine Kinase RT-PCR Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction SDS - Sodium Dodecil Sulfate Sos Son of Sevenless Um tipo de GEF Src Sarcoma t0,5 - Tempo de Meia Vida STAT Signal transducer and activator of transcription Fator de transcrio. TC Tampo cAMP TCB Thrombin Cleavage Buffer TE Tampo de Ensaio TNF - Tumor Necrosis Factor UTP Uridine Triphosphate VSCC - Voltage Sensitive Ca2+-Channels

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1. PrlogoDarwin, em sua obra que marcou o incio da biologia moderna, enfatizou as transformaes lentas sofridas pelos seres vivos e guiadas pela seleo natural, que produziram, ao longo de bilhes de anos, as mais variadas formas de vida. Embora este aspecto esteja correto e desempenhe um papel fundamental no processo evolutivo, a vida como a conhecemos tambm foi moldada por eventos muito mais drsticos, entre os quais se destacam as extines em massa, que podem ser considerados verdadeiras mudanas de direo no curso da vida. O exemplo mais estudado e divulgado a extino dos dinossauros, que liberou inmeros nichos ecolgicos, posteriormente ocupados pelos mamferos. Sem esta extino, muito provavelmente, os mamferos representariam um pequeno grupo de animais insignificantes. Mas as extines parecem no representarem as nicas mudanas profundas na histria da vida. Vrias evidncias apontam para eventos relativamente repentinos tambm no surgimento de novas formas de vida, seguidos por longos perodos nos quais as grandes modificaes foram lapidadas. Esta teoria, proposta por Eldredge e Gould (Gould, 1993) e denominada de equilbrio pontuado, tem se tornado uma parte importante da moderna teoria evolutiva. Com exceo das extines, que certamente representam as alteraes mais intensas na histria da vida, as mudanas mais inovativas provavelmente tiveram uma caracterstica em comum: a comunicao! O aparecimento da comunicao parece ter sido responsvel por, no mnimo, trs revolues biolgicas e uma quarta, no biolgica, mas sim tecnolgica, que est se desenrolando a todo vapor, transformando profundamente o comportamento do Homo sapiens. As comunicaes de massa, desde a inveno da prensa por Guttenberg h 500 anos e passando por todas as maravilhas comunicativas que se seguiram, transformou profundamente a vida de todos ns, da forma de pensar, agir, trabalhar, relacionar-se, enfim, esmigalhou praticamente todas as semelhanas entre a sociedade feudal e a aldeia global. A parafernlia comunicativa tomou conta de tal forma da nossa vida que passou a ser praticamente impossvel ima1

ginar o mundo no qual a nica forma de comunicao seria a palavra falada. Na histria da humanidade, a ampliao da comunicao falada para a escrita e todas as formas comunicativas que se seguiram, certamente representou uma revoluo, da qual temos a sorte de sermos parte integrante. Muito antes da atual revoluo, outra, talvez mais profunda e intrigante, aconteceu: o prprio aparecimento da linguagem. A comunicao lingstica prescinde de simbolismo, que, no Homo sapiens, representou muito mais do que comunicao, pois com ele tambm foi possvel o ato de pensar, imaginar, planejar com uma vantagem evolutiva considervel. Deacon, (1997) em seu livro The Symbolic Species afirma que Biologicamente, ns somos apenas mais um macaco. Mentalmente, ns somos um novo filo de organismos. Somos organismos especializados no simbolismo comunicativo. Esta especializao produziu o que denominamos cultura, isto , um conjunto de informaes transmitidas de uma gerao a outra de forma simblica e no mais, exclusivamente, de forma gentica. A grande maioria dos animais, seno todos, possuem formas de se comunicar, como por exemplo os macacos vervet, que possuem gritos distintos para comunicar a presena de leopardos, guias ou cobras e com isso podem escolher a forma de escape mais adequado. Este tipo de comunicao pode ser comparada com o sorriso, o grito de susto ou o choro nos humanos, geralmente inconscientemente produzidos e com um grande impacto comunicativo. Estas formas de comunicao so bem diferentes da comunicao que est sendo realizada na redao e leitura deste pargrafo, com a utilizao de smbolos (palavras escritas) que referem a simbolismos complexos que se, adequadamente integrados, levam compreenso de um conceito, completamente diferente da comunicao exercida por uma risada. Com um sorriso ou uma lgrima podemos entender que a pessoa est alegre ou triste, mas somente com a comunicao em forma de linguagem como a conhecemos que podemos compreender um conceito de porque aquela pessoa est alegre ou triste. O tamanho aumentado do crtex nos humanos em relao aos outros mamferos parece ter sido a modificao evolutiva mais importante para o apareci-

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mento da linguagem humana, pois pode ter permitido a integrao de um conjunto de informaes capazes de formar um conceito complexo. Evidncias fsseis e genticas indicam que a revoluo acima aconteceu entre 2 a 5 milhes de anos atrs, muito provavelmente no continente africano, em um ambiente intermedirio entre a mata e a savana (Foley, 1993). Outras formas de comunicao, no entanto, tiveram que estar muito bem estabelecidas para que estas revolues pudessem ocorrer. Da mesma forma como a comunicao falada foi a base da revoluo comunicativa dos dias atuais, a comunicao entre as clulas foi fundamental para que a linguagem falada pudesse surgir. As clulas do sistema nervoso central se especializaram em comunicao e so a base para o simbolismo comunicativo. A comunicao celular parece ter surgido entre 1 bilho e 600 milhes de anos atrs e foi um dos ou o principal responsvel pela grande exploso no nmero e nas formas de vida ocorrida durante a exploso do cambriano, um perodo curtssimo, ocorrido h aproximadamente 550 milhes de anos (Erwin et al. 1997). Um dos argumentos para este aumento impressionante de formas de vida que os nichos ecolgicos para organismos unicelulares estavam ocupados e que organismos multicelulares, mais versteis, maiores e mais fortes, puderam ocupar nichos antes desocupados, permitindo uma grande ampliao dos nichos ecolgicos ocupveis (Gould, 1989). Uma sociedade celular integrada a base da existncia de um organismo multicelular, o que implica complexas formas de comunicao entre as clulas. Em outras palavras, as clulas passaram a se comunicar e formaram milhares de sociedades celulares, que apresentaram muitas vantagens evolutivas quando comparadas com as clulas isoladas. Todas estas revolues comunicativas esto baseadas no big-bang da biologia, ou seja, o surgimento da vida, o que tambm pode ser visto como uma revoluo comunicativa. Molecularmente falando, a vida pode ser descrita como molculas capazes de estocar, transmitir, compreender e utilizar informaes3. A

A semntica utilizada neste trabalho foi cunhada para a comunicao humana, mas, considerando a total ausncia de vocbulos para descrever especificamente a comunicao celular e que muitos conceitos entre comunicao humana e celular so semelhantes, eles so

3

3

linguagem molecular est baseada primeiramente na seqncia (DNA, RNA e protenas), mas tambm linguagens moleculares mais complexas como estrutura4 e atividade protica envolvidos na compreenso e utilizao da informao molecular. O aparecimento desta comunicao ocorreu h aproximadamente 3,5 bilhes de anos, muito provavelmente quando molculas de RNA atingiram uma complexidade capaz de catalisar a sua cpia, transmitindo informao de uma molcula a outra, o que a base da vida como a conhecemos (Orgel, 1998). Desta forma, a vida pode ser vista como sistemas comunicativos distribudos nos nveis molculares, clulares, indivduais e sociais. Compreender, ao invs de somente entender, uma parte fundamental da comunicao humana. Mas qual o correlato da compreenso para a comunicao celular. Clulas possuem sistemas comunicativos moleculares suficientemente complexos para compreender? Ou a comunicao celular uma comunicao simplria, com informaes do tipo sim ou no ou alegre ou triste? Como era de se esperar para uma sociedade altamente integrada composta por bilhes de indivduos, as clulas possuem comunicaes extremamente complexas, com caractersticas que indicam que as informaes celulares podem ser compreendidas e no somente entendidas

usados sem aspas. Neste caso, compreender a informao guardada no DNA possui semelhanas, mas tambm muitas diferenas, com a compreenso humana.4

Informaes estas que podem at transmitir uma doena, como no caso do prion.

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2. IntroduoO conceito de comunicao celular muito provavelmente nasceu com a teoria celular e a aceitao de que o sistema nervoso central (CNS Central Nervous System) no era um retculo, mas sim, composto por clulas interligadas, como proposto por Ramn y Cajal no final do sculo passado (Ramn y Cajal, 1937). O conceito de que o rgo cuja especialidade a comunicao composto de clulas separadas implicava em uma comunicao celular intensa. As descobertas de neurotransmissores, como a acetilcolina e de sinalizadores endcrinos, como a adrenalina ou a insulina, mostraram que a sinalizao celular era uma regra para as clulas dos organismos pluricelulares (Alberts et al. 1994).

2.1. Parte 1. Transduo de sinalOrganismos multicelulares podem ser considerados sociedades celulares extremamente complexas, na qual cada indivduo (clula) possui funes especficas e dinmicas, objetivando o bem do organismo e no o de cada clula. Para que estas funes possam ser desempenhadas adequadamente, clulas recebem e emitem uma grande variedade de informaes, desde o contato com as clulas vizinhas at sinalizadores qumicos sintetizados por outras clulas. Inicialmente, as vias de transduo de sinal eram descritas como sendo lineares e compostas de poucos componentes: geralmente um receptor, um segundo mensageiro e um efetor, responsvel pela regulao (fosforilao) de um grupo restrito de substratos. Ou seja, desde o recebimento do sinal no receptor at a regulao dos substratos acreditava-se que existia uma ligao direta com a funo de transferncia de informao, como visto na Figura 1A. Porm, estudos posteriores revelaram vias de sinalizao extremamente complexas, com inmeros pontos de integrao, retroalimentao e redundncia. Esta complexidade tornou impossvel a viso de que estas vias possuam como nica funo a transmisso de sinais, tornando-as muito mais integradoras de informaes envolvidas na compreenso de uma informao qumica composta de concentra5

es variadas de uma grande quantidade de sinais (Figura 1B) (Bhalla, Iyengar, 1999).

AR SM E

B

S

Figura 1. Mecanismos de transduo de sinal intracelular.Mecanismos de transduo de sinal como mensageiros de sinais simples (A), ou integradores, capazes de compreender informaes de vrios sinais simultaneamente (B). Ativao: Inibio: R: Receptor, SM: Segundo Mensageiro, E: Efetor, S: Substratos.

2.1.1. ComponentesOs componentes celulares responsveis pela transduo de sinal so basicamente constitudos de molculas pequenas (como o cAMP), ons (como o Ca2+) e protenas (como canais inicos, protenas de reconhecimento e enzimas). Como mostrado na Figura 1A, o mecanismo de sinalizao bsico constitudo de pelo menos trs componentes, quais sejam, o receptor, o segundo mensageiro e o efetor. Atualmente, principalmente considerando a complexidades das vias de sinalizao (Figura 1B) esta classificao funcional foi deixada de lado, sendo que, com exceo dos receptores, muito difcil classificar os outros componentes das vias de sinalizao como segundo, terceiro, quarto mensageiros ou efetores, principalmente porque o papel de um determinado sinalizador pode desempenhar papis distintos em duas via de sinalizao.

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2.1.1.1. ReceptoresReceptores so protenas de membrana capazes de se ligar a um transmissor na parte extracelular e permitir a modificao de algum componente intracelular. Isto , os receptores so os pontos de entrada da informao na clula. Existem trs grandes grupos de receptores (Alberts et al. 1994): F Ionotrpicos: receptores ligados a canais inicos que, quando ativados, permitem a passagem de ons como o Na+, Ca2+ ou Cl-. So exemplos destes receptores os subtipos de receptores glutamatrgicos AMPA (DL - -Amino3-hydroxy-5-Methylisoxazolepropionic Acid) cos P2X (permeveis a Na+ e Ca2+). F Metabotrpicos: ligados protena G, uma protena de membrana que pode regular a atividade de vrias protenas, como adenilil ciclase (AC - Adenylyl Ciclase), fosfolipase C (PLC - Phospholipase C) e canais inicos. Nesta classe esto includos os receptores de serotonina, -adrenrgicos, purinrgico P2Y, glutamatrgico metabotrpicos (mGluR Metabotropic Glutamate Receptor), entre outros; F Receptores com atividade enzimtica: nestes, a ligao do transmissor induz a uma atividade enzimtica intracelular, geralmente a fosforilao em resduos de tirosina. So exemplo os receptores para fatores de crescimento, como o EGFR, FGFR (Epidermal Growth Factor Receptor, Fibroblast Growth Factor Receptor respectivamente). (permevel a Na+), NMDA (permevel a Na+ e Ca2+), GABA (permevel a Cl-) e os receptores purinrgi-

2.1.1.2. MensageirosA funo dos mensageiros intracelulares transmitir o sinal do receptor da membrana a diversas protenas, que faro com que um determinado sinal possa ser sentido pela clula. Historicamente, estes mensageiros foram denominados segundos mensageiros, pois eram produzidos em resposta a primeiros mensageiros (como a adrenalina), sendo que os segundos mensageiros clssicos, Ca2+ e cAMP, ativam diretamente quinases (os efetores). Um esquema com alguns mensageiros intracelulares como o Ca2+, inositol-1-4-5-trifosfato (IP3 7

Inositol-1,4,5-Triphosphate) diacilglicerol (DAG Diacylglycerol ), juntamente com alguns efetores ativados por estes mostrado na Figura 2.

Receptor Metabotrpico com protena G

Receptor com atividade enzimtica VSCC

Receptor Ionotrpico

PLC

AC

cAMP IP3 DAG

PKA Ca2+ Na+

CaMKRetculo Endoplasmtico

PKC

Figura 2. Representao esquemtica de alguns mensageiros intracelulares.PLC: Phospholipase C; AC: Adenylyl Clyclase; cAMP: Cyclic Adenosine Monophosphate; PKA: Protein Kinase A; PKC: Protein Kinase C; CaMK: Ca2+/CaM dependent Kinase; VSCC: Voltage-sensitive Ca2+-channel.

2.1.1.2.1. Protena GAs protenas G so compostas por trs subunidades proticas, (, e ) e transmitem a informao dos receptores metabotrpicos para diversos componentes de vias de sinalizao como ACs, fosfolipases (como a PLC), canais de Ca2+ e canais de K+, entre outros. A ligao do transmissor ao receptor faz com que a subunidade da protena G troque GDP por GTP, produzindo a dissociao da subunidade do dmero (Figura 3). Desta forma, estes dois componentes podem-se difundir livremente pela superfcie interna da membrana regulando a atividade das protenas citadas anteriormente. A subunidade possui uma atividade GTPsica intrnseca, catalisando a quebra do GTP em GDP, levando, desta forma, a sua autodesativao. A ativao e desativao das pro-

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tenas G pode ser intensamente regulada, tanto por protenas que catalisam a troca de GTP por GDP, ou protenas que alteram a velocidade de hidrlise do GTP (Fisher, Agranoff, 1999) (Figura 3). GEFs

Inativa G-GDP G-GTP Ativa

+

GAPs

GIPs

Figura 3. Ciclo regulatrio da subunidade da protena G.Fatores de troca de nucleotdeos de guanina (GEF Guanine nucleotide exchange factors) catalisam a troca de GDP por GTP, levando a ativao da protenas G enquanto que as protenas ativadoras de GTPase (GAPs GTPase activating proteins) e as GIPs (GTPase-inhibiting proteins) regulam a velocidade de hidrlise do GTP (Adaptado de Nestler, Duman, 1999).

At recentemente, 23 subtipos de subunidades das protenas G foram descritos (Gudermann et al. 1997). Estes subtipos podem ser divididos em Gs, Gi, Gq e G12 baseado nas semelhanas na seqncia, seletividade de efetores e sensibilidade a inibidores. Os subtipos Gs e Gi foram tradicionalmente descritos como ativadores e inibidores da AC, respectivamente. Duas toxinas bacterianas se mostraram ferramentas fundamentais para o estudo das protenas G. A toxina da clera, inibe a atividade GTPsica da famlia da protena Gs, mantendo-a na forma ativa, enquanto que a toxina pertussis (PTx Pertussis Toxin) inibe a troca de GTP por GDP na famlia da protena Gi, mantendo esta protena G na sua forma inativa (Nestler, Duman, 1999).

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Inicialmente, acreditava-se que a nica funo das subunidades era a de regular a subunidade , que era responsvel pela regulao de enzimas como a AC e a PLC. No entanto, as subunidades se mostraram sinalizadores extremamente dinmicos. Por exemplo: G pode inibir canais de Ca2+ dependentes de voltagem, inibir calmodulina (CaM Calmodulin), levando ao bloqueio da CaMKII, ativar AC2 e 4 (na presena de G), PLC3, canais de K+ e inibir a AC1 (Zamponi et al. 1997 e Chen et al. 1995a).

2.1.1.2.2. Ca2+O Ca2+ um importante sinalizador celular, que foi historicamente classificado como segundo mensageiro. A concentrao de Ca2+ intracelular em condies basais muito reduzida (na faixa de nM) enquanto a concentrao externa est na faixa de mM, possibilitando um rpido aumento da concentrao intracelular com a abertura de canais na membrana celular. Estes canais podem ser tanto abertos por transmissores, como o caso do receptor purinrgico P2X, como pelo potencial, como o caso dos canais de Ca2+-dependentes de voltagem (VSCC Voltage Sensitive Ca2+-Channels), ou por ambos, como o caso do receptor glutamatrgico do tipo NMDA, que por ser regulado tanto pela presena de glutamato como pelo potencial, funcionando como um detector de freqncia da sinalizao sinptica (Alberts et al. 1994). Outra forma de aumento de Ca2+ intracelular a liberao de Ca2+ dos estoques intracelulares. Uma das principais via de liberao de Ca2+ dos estoques intracelulares a clivagem de fosfatidil inositol, com a produo de IP3, que pode se ligar a receptores do retculo endoplasmtico liberando Ca2+ destes compartimentos, permitindo que um receptor metabotrpico ligado a PLCs possa elevar a concentrao intracelular de Ca2+ (Putney, 1999). Ca2+ possui inmeros efetores intracelulares, como as CaMKs, a fosfatase CaN (Calcineurin), ACs e GEFs, sendo que a maioria destes efeitores so regulados pela protena ligadora de Ca2+ denominada calmodulina (CaM), que sofre uma mudana conformacional ao se ligar ao Ca2+, expondo um domnio hi-

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drofbico que pode interagir com vrios domnios presentes em protenas reguladas por Ca2+/CaM. A sinalizao mediada por Ca2+ bastante complexa na maioria da clulas, considerando o grande nmero de protenas reguladas por este on e as diversas formas de aumento na concentrao intracelular. Finkbeiner, Greenberg, (1997) revisaram os diferentes efeitos do aumento de Ca2+ em diversas regies de neurnios, sendo que o efeito que o Ca2+ induz sobre a expresso gnica dependente tanto da intensidade como do local no qual seu aumento na concentrao ocorre, sendo a cascata da ERK uma das vias responsveis pela integrao destes sinais (Bito et al. 1997 e Rusanescu et al. 1996). interessante mencionar que a sinalizao mediada pelo Ca2+ possui uma particularidade nos astrcitos, que a capacidade de se difundir por uma grande quantidade de clulas atravs das junes gap (Verjhratsky, Kettenmann, 1996).

2.1.1.2.3. ACs/cAMPO cAMP o outro segundo mensageiro clssico, sendo responsvel pelos efeitos de muitos transmissores que ativam receptores metabotrpicos ligados protena Gs, como por exemplo, vrios receptores 5-hidroxitriptamina (5-HT - 5Hydroxytryptamine) (subtipos 5-HT5 e 5-HT6 - item 2.3.3.2) e -adrenrgicos (item 2.3.3.1). Esta via de sinalizao tem uma importncia muito grande, pois alm de ser a primeira sinalizao metabotrpica a ser identificada, tambm foi responsvel pela descoberta das protenas G (a partir da qual foi desenvolvida a tradicional viso de protenas Gs e Gi, estimulatrias e inibitrias da AC, respectivamente) (Alberts et al.1994). A regulao das AC bastante varivel, representando um importante ponto de integrao de sinalizao (Cooper et al. 1995). cAMP produzido pelas ACs e degradado por fosfodiesterases (PDE Phosphodiesterase). So conhecidos nove genes diferentes para ACs e sete famlias de PDEs, sendo que em cada caso ainda existem diversas variantes de processamento (splice variants) indicando a complexidade e importncia destes mecanismos de sinalizao (Xia, Storm, 1997, Cooper et al. 1995 e Burns et al. 1996).

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O diterpeno forscolina (forskolin) uma poderosa ferramenta no estudo da sinalizao do cAMP, pois esta molcula permevel membrana, estimula todos os subtipos de ACs (com exceo da ACIX, recentemente clonada, Cooper et al. 1995). Estudos estruturais da AC ligada forscolina mostraram que esta molcula promove a ligao de monmeros de AC formando o tetrmero ativo. A ligao da forscolina ocorre bem prximo ao stio cataltico, no sendo excluda uma participao efetiva da forscolina da catlise, alm da promoo da tetramerizao (Cooper et al. 1995).

2.1.1.2.4. Fosfolipdio e Inositol FosfatoOs lipdios so os principais componentes das membranas celulares, possuindo as mais diversas funes. Muitos lipdios assimetricamente concentrados na parte citoplasmtica da membrana celular, possuem importantes funes na sinalizao celular. Vrios grupos polares ligados a lipdios esto envolvidos em vias de sinalizao, entre os quais podem ser destacados a serina, a colina e o inositol e seus derivados fosfatados. Um dos principais mecanismos de sinalizao envolvendo lipdios a clivagem de fosfatidil inositis de membrana para a formao de DAG e IP3 por PLCs. IP3 pode se ligar a receptores do retculo endoplasmtico, liberando Ca2+ destes estoques, como visto anteriormente, enquanto que DAG pode ativar diversas isoformas de PKCs (Toker, 1998). At o momento foram caracterizadas trs famlias de PI-PLCs, isto , fosfolipases C que clivam fosfatidil inositis (PI-PLC, e ). Estes trs subtipos possuem domnios homlogos de plecstrina (PH Pleckstrin Homology), provavelmente para poder se ligar a membranas ricas em fosfatidil inositis. A PLC, alm do domnio PH, possui domnios SH2 e SH3 (Src Homology), podendo conseqentemente ligar-se a fosfotirosinas e a domnios ricos em prolina. Vrios receptores de fatores de crescimento, como por exemplo PDGFR, (Platelet Growth Factor Receptor) e FGFR possuem stios de ligao para a PLC (Huang et al. 1995 e Pawson, Saxton, 1999). As PLC so principalmente ativadas pela famlia de protenas Gq (q, 11, 14, 16). Subunidades e tambm podem ativar as PLC, o que provavel12

mente o mecanismo pelo qual receptores ligados protena Gi ativam as PLC. Interessantemente, a PLC funciona como uma GAP para a Gq, representando um mecanismo de dessensibilizao desta via de sinalizao (Singer et al. 1997). PI-PLC possui 4 motivos EF hand ligadores de Ca2+, sendo que a deleo deste domnios inibe a atividade cataltica, indicando uma regulao desta PLC por Ca2+(Singer et al. 1997). Outro tipo de PLC reconhece especificamente fosfatidilcolina (PC-PLC Phosphatidylcholine-specific Phospholipase), podendo transformar5 linhagens de fibroblastos sendo esta transformao revertida por transfeco com dominantes negativos de PKC e cRaf-1, indicando que a PC-PLC pode ativar estas duas enzimas e com isto levando transformao celular (Bjorkoy et al. 1995). Fosfolipase D (PLD Phospholipase D) cliva fosfolipdios produzindo PA (phosphatidic acid), que pode ativar vrias enzimas, como PKC e , PLC e cRaf-1 (Singer et al. 1997).

2.1.1.3. EfetoresAs modificaes ps-traducionais mais freqentes nas protenas a fosforilao de resduos de serina, treonina e tirosina. Protenas quinases catalisam a transferncia de grupos fosfato do ATP para o substrato protico, enquanto que protenas fosfatases catalisam a reao de hidrlise do fosfato. Estas duas classes de enzimas podem ser consideradas os efetores das vias de sinalizao, ou seja, os componentes que produzem o efeito final na clula6.

2.1.1.3.1. QuinasesConsiderando o grande nmero de protenas quinases identificadas (Hunter et al. 1995) sero discutidos aqui somente as quinases mais bem estudadas e as que so relevantes para o presente trabalho. A PKA, PKC e CaMK foram as primeiras quinases identificadas, justamente por serem ativadas pelos5

Crescimento independente de acoramento, o que uma transformao utilizada para determinar a potencialidade de induo de transformao oncognica. 6 Geralmente as vias de sinalizao so considerados at a ativao de quinases, fosfatases ou fatores de transcrio, sendo muito difcil determinar o efetor final real.

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segundos mensageiros tradicionais. Atualmente, foram identificadas inmeras isoformas de cada uma destas quinases, em alguns casos com particularidades bastante acentuadas entre estas isoformas. 2.1.1.3.1.1. Protena Quinase C (PKC) As protenas quinases C (PKCs) so uma famlia heterognea de quinases dependentes de fosfolipdios que podem ser divididas em trs grandes grupos, baseadas no mecanismo de ativao e na estrutura (Nishizuka, 1995 e Jaken, 1996). As PKCs convencionais (, , , ) requerem a presena de fosfatidil serina, DAG e Ca2+, sendo as PI-PLC as principais responsveis pela sua ativao. As PKCs novas (novel) (, , , , ) so independentes de Ca2+ e ativadas somente por DAG, sendo que a fosfolipase envolvida na ativao deste subtipo parece ser a PLD. Os mecanismos de ativao das PKCs atpicas ( e ) ainda no esto bem estabelecidos, mas no envolvem DAG e/ou Ca2+, sendo que alguns trabalhos descreveram que podem ser ativadas por fosfatidil serina (Toker, 1998 e Nishizuka, 1995). steres de forbol (phorbol esters) como o PMA (4- phorbol 12-myristate13-acetate) so fortes ativadores das PKCs ativadas por DAG, ou seja, os subtipos convencionais e novos. Os steres de forbol so conhecidos por sua capacidade de induzir a proliferao e transformao de clulas (Weinstein, 1985), sendo a maioria dos seus efeitos mediados pelas PKCs (Nishizuka, 1995), embora stios de ligao funcionais dos steres de forbol tambm tenham sido descritos em outras protenas, como por exemplo a Ras-GRP (Guanine-releasing protein) (Tognon et al. 1998). Os steres de forbol so muito utilizados em estudos de transduo de sinal, pois, alm de ativarem as PKCs, podem ser utilizados para induzir a degradao e desativao (down regulation) das PKCs. Tratamentos longos (normalmente 16 horas) com steres de forbol fazem com que as PKC reguladas por DAG sejam levadas para a membrana, na qual, depois de um certo tempo, so defosforiladas e degradadas por fosfatases e proteases envolvidas no trmino da sinalizao mediada por PKC (Borner et al. 1989 e Millward et al. 1999). Por 14

exemplo, tratamento com 100nM de PMA por dois dias levou a completa degradao dos subtipos PKC , , (Johnson et al. 1995). Desta forma, tratamentos curtos com steres de forbol ativam as PKCs, enquanto que tratamentos longos bloqueiam as sinalizaes mediadas pelas PKCs. Vrios inibidores de PKC so disponveis comercialmente, sendo que muitos parecem apresentar uma especificidade questionvel. O alcalide microbiano estaurosporina serviu como base para diversos compostos utilizados atualmente, entre os quais se encontram o GF109203X (Toullec et al. 1991) e o Ro 31-8220 (Davis et al. 1989). 2.1.1.3.1.2. PIKs Fosfatidil inositol-3-OH quinases (PI3K Phosphatidyl inositol-3-OH Kinase) so quinases que fosforilam a posio 3 de fosfatidil inositis de membrana, produzindo principalmente fosfatidil inositol-3,4-P2 e fosfatidil inositol3,4,5-P3, que so ligantes para os domnios PH de protenas como PLC, certos tipos de GEFs e alguns subtipos de PKCs (Leevers et al. 1999). Toker et al. (1994) mostraram que os fosfatidil inositis mencionados anteriormente so fortes ativadores dos subtipos de PKC , e . Considerando que as PI3Ks podem ser ativadas por Ras (Rodriguez-Viviana et al. 1994) e pelas subunidades da protena G (Lopez-Ilasaca et al. 1997) estas enzimas representam um importante ponto de ligao entre as sinalizaes ativadoras da protena G, Ras e a PKC e seus inmeros substratos (Fruman et al. 1998). 2.1.1.3.1.3. CaMKs As CaMKs so uma famlia de quinases ativadas pela ligao de Ca2+/CaM. Alm desta ativao, a CaMKII possui uma forma regulatria peculiar, que consiste da sua autofosforilao quando na presena de Ca2+/CaM, tornando a sua atividade independente da presena deste mensageiro, o que parece estar envolvido no processo molecular de memria (Dosemesi, Albers, 1996 e Lisman, Goldring, 1988).

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2.1.1.3.1.4. PKA A protena quinase regulada por cAMP formada por quatro subunidades, duas catalticas e duas regulatrias, sendo que as subunidades regulatrias possuem um pseudosubstrato, que se liga alostericamente s subunidades c atalticas, inibindo-as. Com a ligao de cAMP s subunidades regulatrias, estas se desligam do tetrmero, permitindo com que as subunidades catalticas fosforilem os seus substratos em seqncias consenso do tipo R-R/K-X-S*/T*, no qual XX qualquer aminocido, enquanto que o asterisco indica a posio de fosforilao (Walaas, Greengard, 1991 e Kennelly, Krebs, 1991).

2.1.1.3.2. FosfatasesProtenas fosfatases hidrolisam fosfato de substratos proticos, tendo portanto uma funo fundamental na reversibilidade dos sinais ativados pelas quinases, o que certamente no implica que as fosfatases no possam ter funes ativadoras. Funcionalmente, as fosfatases podem ser divididas em serina/treonina fosfatases e tirosina fosfatases, sendo que at recentemente foram identificados aproximadamente 200 protenas serina/treonina fosfatases e 100 tirosina fosfatases (Oliver, Shenolikar, 1998). 2.1.1.3.2.1. Protenas Ser/Thr Fosfatases As protenas Ser/Thr fosfatases foram classificadas de acordo com suas caractersticas bioqumicas em tipo 1 e 2, sendo que o tipo 2 foi subseqentemente dividido em PP2A, PP2B e PP2C, sendo que clonagem destas protenas revelaram que elas possuem seqncias conservadas (Oliver, Shenolikar, 1998). Baseado em semelhanas nas seqncias, vrias fosfatases foram identificadas, como por exemplo PP4 e PP5. No entanto, estimativas indicam que fosfatase 1 (PP1 - Protein Phosphatase 1) e fosfatase 2A (PP2A Protein Phosphatase 2A) so responsveis por at 90% da atividade fosfatsica em clulas de mamferos (Oliver, Shenolikar, 1998). Embora diversas formas de regulao possam atuar sobre as fosfatases, como expresso, localizao subcelular, fosforilao e mensageiros intracelula-

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res, as principais formas de regulao parecem ser mediadas por inibidores proticos, cujo efeito regulado por expresso e fosforilao. Inibidor-1, inibidor2, DARPP-32 so reguladores de PP1, enquanto que inibidor-12A e inibidor-22A so inibidores especficos da PP2A (Oliver, Shenolikar, 1998). 2.1.1.3.2.2. Protenas Tyr Fosfatases (PTPs) As protenas Tyr fosfatases (PTP Phosphotyrosine Phosphatase) possuem uma alta atividade basal, em torno de 10 a 1000 vezes maior do que a atividade basal das tirosinas quinases, fazendo com que os nveis de fosfotirosina permaneam bastante reduzidos em clulas em condies basais. Esta grande diferena tambm faz como que a ativao das quinases e a inibio das fosfatases seja uma excelente forma de ampliao da sinalizao (Lau et al. 1999). Estas fosfatases podem ser transmembrana, isto , receptores com atividade fosfatsica e tambm protenas no-transmembrana. As PTPs so reguladas principalmente atravs da fosforilao e da localizao celular. Por exemplo, muitas PTPs possuem domnios SH2 (item 2.1.1.4) que localizam estas fosfatases em complexos proticos ricos em fosfotirosinas. Parece que estas ligaes, alm deste efeito de aproximarem as fosfatases dos seus substratos, tambm podem funcionar como ativadores alostricos. 2.1.1.3.2.3. Protena Ser/Thr/Tyr Fosfatases Estas fosfatases defosforilam tanto tirosina como treonina e serina, denominadas tambm de fosfatases duplo-especficas (Dual-specific

phosphatases). Os principais substratos destas fosfatases so quinases ativadas por fosforilao em tirosina e treonina, como as quinases envolvidas na regulao do ciclo celular cdc2, ou as MAPKs (item 2.1.2.2.8 e Neel, Tonks, 1997).

2.1.1.4. Protenas de ancoramento ou adaptadorasPara o funcionamento e principalmente para a especificidade das vias de sinalizao, protenas de ancoramento ou adaptadoras, capazes de formar, transitoriamente, imensos complexos proticos, so fundamentais. As interaes entre protenas envolvidas na transduo de sinal so geralmente mediadas por 17

domnios ligadores, que formam unidades compactas, com os N e C terminais prximos, possibilitando a sua insero em protenas sem interferir muito na sua estrutura. Estes domnios so encontradas nas mais diversas protenas, como por exemplo quinases, fosfatases, fatores de transcrio e protenas do citoesqueleto (Pawson, Scott, 1997). Um dos domnios ligadores mais descritos foi encontrado primeiramente no oncogene Src (Rous sarcoma virus). O protooncogene correspondente uma tirosina quinase que possui dois domnios ligadores, que foram denominados SH2 e SH3. Domnios SH2 so formados de 100 aminocidos, e tm a caracterstica de se ligar a resduos de fosfotirosina (pY Phosphotyrosine). Domnios SH2 foram encontrados nas mais diversas protenas, como as enzimas GTPases, fosfolipases, quinases e fosfatases ou protenas adaptadoras. Considerando isto, necessrio que a ligao dos domnios SH2 nas pY sejam especficos para uma determinada seqncia. Os trs aminocidos localizados aps (direo C-terminal) da pY desempenham um papel fundamental para esta especificidade. Um outro domnio importante na sinalizao celular o SH3, que se liga a seqncias ricas em prolinas, constitudas geralmente de uma seqncia de 9 aminocidos nas quais as posies 4, 5 e 7 so invariavelmente ocupadas por prolinas (Pawson, Scott, 1997). As protenas de ligao regulam protenas envolvidas em vias de sinalizao principalmente de duas formas: 1. Atravs da localizao em um local especfico na clula, co-localizando-as com seus reguladores ou substratos; 2. Atravs da induo de mudanas conformacionais. Provavelmente o mecanismo de regulao mediado por protenas de ligao/adaptao mais estudado a ativao de Ras por receptores de fatores de crescimento, no qual os domnios SH2 e SH3 da Grb2 e Sos trazem Ras para a membrana na qual esta pode ativar cRaf-1 (ver item 2.1.2.2.2). Muitos outros domnios ligadores foram descritos at o momento, como PH, PTB, EH, PDZ, EVH1 e WW com seqncias de reconhecimento distintas, mas com caractersticas funcionais semelhantes (Sudol, 1998).

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2.1.2. As cascatas das MAPKsMAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases ou Microtubule Associated Protein Kinases) so formadas por trs famlias de quinase, MAPK, MAPKK e MAPKKK. Embora vrias quinases possam regular as MAPKKK e inmeras outras possam ser reguladas pelas MAPKs, produzindo cascatas de 5 ou mais quinases, estes trs nveis de quinases so conhecidos como cascata das MAPKs. Em cada um dos nveis existem vrios subtipos, sendo que trs cascatas razoavelmente independentes tm sido denominadas ERK, c-jun quinase (JNK - cJun Kinase) e p38, como visto na Figura 4.Ativadores Fatores de Crescimento Agonistas GPCR Fatores de Crescimento, Estresse. Estresse

MAPKKK

cRaf-1, B-Raf, A-Raf, Mos

MEKK1, 2, 3, Tpl-2

MEKK4-5 DLK

TAK1, ASK1, MLK3

PAK

MAPKK

MEK1 MEK2

?

MEK5

MEK 4 MEK7

MEK3 MEK6

MAPK

ERK1 ERK2

ERK3 ERK4 ?

ERK5

JNK1, JNK2 JNK3

p38, p38 p38, p38

Substratos

Sos, Elk1, Rsk PLA2, EGFR STATS, Ets1, Sap1a, c-Myc, CREB

MEF2C

c-jun, ATF-2, Elk1, p53, DPC4

MAPKAPK2,

ATF2 Elk1, Chop Max.

c-jun

Hsp27

Efeitos Celulares

Crescimento, sobrevivncia diferenciao

Crescimento, diferenciao Produo de citocinas sobrevivncia, apoptose apoptose

Figura 4. As diversas cascatas das MAPKs, seus ativadores e seus efeitos. Adaptado de Garrington, Johnson, (1999).

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Um caracterstica interessante destas cascatas a alta especificidade e baixa variabilidade na parte intermediria (MAPKK), sendo que para cada cascata existem somente duas MAPKKs, que por sua vez so totalmente especficos para as MAPK da sua cascata. Por exemplo, os dois nicos substratos identificados at o momento para a MEK1 so ERK1 e 2. Por outro lado, as duas extremidades da cascata possuem inmeras formas de integrao dos sinais, tanto devido ao grande nmero de componentes, ou as diversas formas de regulao. Pelo menos oito quinases podem ativar MEK1, com a mais variada regulao e distribuio. No nvel dos substratos de ERK, tambm existe uma grande variedade de protenas e quinases (Schlessinger et al. 1998). Garrington, Johnson (1999) revisaram estudos que mostram que as protenas que compem uma cascata especfica possuem vrias protenas de ligao e ancoramento que as mantm em proximidade fsica, mantendo distantes as protenas de outras cascatas. Estas protenas parecem ser, em parte, responsveis pela especificidade de cada uma das cascatas. A Figura 4 mostra as cascatas das MAPKs. Considerando a grande variabilidade da nomenclatura utilizada na literatura importante enfatizar que neste trabalho o termo MAPK refere-se famlia de protenas que envolve as ERKs, JNKs, p38s. Da mesma forma, as cascatas das MAPKs referem-se a todas as cascatas mostradas anteriormente, enquanto que a cascata da ERK indica somente Raf (ou MEKK1/2/3), MEK1/2 e ERK1/2.

2.1.2.1. Eventos celulares regulados pelas MAPKsAs cascatas das MAPKs esto envolvidas em diversos eventos celulares, entre os quais podem ser destacados: F Proliferao celular: o mecanismo parece envolver expresso da ciclina D1 e a represso do inibidor de ciclo celular p27Kip mediada pela ERK (Lavoie et al. 1996 e Kerkhoff, Rapp, 1998). As MAPKs tambm esto envolvidas na sinalizao que inibe a proliferao celular, sendo que a ativao da p38 e atividades muito elevadas da cRaf-1 (e provavelmente ERK) aumentam a expresso de protenas inibidoras do ciclo celular como p21cip1 (Sewing et al. 1997, Kerkhoff, Rapp, 1998 e Lavoie et al. 1996).

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F Apoptose: A ativao da JNK induz apoptose, enquanto que a ativao da ERK bloqueia o processo apopttico em linhagens feocromocitoma (PC12 Pheochromocytoma Cells) (Xia et al. 1995), o que foi confirmado pelo efeito supressor da ativao da ERK por FGF-2 da apoptose induzida por fator de necrose tumoral (TNF - Tumor Necrosis Factor ) (Gardner, Johnson, 1996). A p38 tambm parece ser uma das responsveis pela apoptose induzida pela retirada de fatores de crescimento (Kummer et al. 1997); F Transcrio de genes: Vrios fatores de transcrio podem ser regulados pelas MAPKs, como a protena ligadora ao elemento regulado por cAMP (CREB cAMP Regulated Element Binding Protein), atravs de uma quinase ativada pela ERK denominada Rsk2 (Xing et al. 1996). ERK e JNK podem fosforilar diretamente a Elk1, podendo levar induo da expresso da cfos, integrando desta forma os sinais destas duas cascatas (Karin, 1995 e Whitmarsh et al. 1995). JNK tambm pode fosforilar e ativar cjun, que forma, juntamente com cfos, o ativador transcripcional AP1 (Gupta et al. 1995); F Integrao de sinais: as MAPK, por serem ativadas pelos mais diversos mecanismos de transduo de sinal, so importantes integradoras de sinal, como por exemplo a mediao de muitos efeitos do Ca2+ em neurnios (Finkbeiner, Greenberg, 1996); F Diferenciao celular: ativaes com cinticas de desativao lenta podem induzir diferenciao em PC12 (Marshall, 1995 e 1998) e megacaricitos (Rache et al. 1997); F Plasticidade neuronal: Tanto estudos com deleo de genes (KO knockout) bem como utilizando inibidores mostraram o envolvimento das MAPKs em eventos de plasticidade como potenciao de longa durao (LTP long-term potentiation) e memria (Impey et al. 1999 e Walz et al. 1998).

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2.1.2.2. A cascata da ERK.Embora a cascata da ERK seja ativada por uma grande variedade de sinais, a ativao por fatores de crescimento tem sido melhor caracterizada, sendo portanto utilizada a seguir para a descrio dos mecanismos envolvidos na sua regulao.

2.1.2.2.1. Receptores com atividade tirosina quinsica (RTKs)RTKs so protenas transmembrana que possuem um stio de ligao para o fator de crescimento no lado extracelular e uma atividade quinsica (geralmente tirosina quinsica) na parte intracelular. O fator de crescimento induz a dimerizao de RTKs, permitindo a autofosforilao intermolecular em resduos de tirosina especficos. Estas fosfotirosinas podem ser reconhecidas por vrias protenas, ativando com isto outros componentes de sinalizao (Alberts et al. 1994). A Figura 5 mostra o EGFR fosforilado ligado a protenas adaptadoras. Por motivos didticos, somente uma fosfotirosina mostrada no EGFR, mas normalmente os resduos de tirosina fosforilveis so inmeros, como por exemplo o PDGFR, que possui 7 tirosinas fosforilveis nas quais podem se ligar entre outros Grb2, Gap, Shc, PI3K e PLC (Pawson, Saxton, 1999).

2.1.2.2.2. Protenas adaptadoras.A localizao de uma determinada protena ou molcula sinalizadora fundamental para a sua funo. Existem muitas protenas cuja nica funo ligarse a duas ou mais protenas para prend-las em um certo local da clula, ou simplesmente uni-las. A autofosforilao dos RTKs possibilita a ligao de protenas com domnios SH2 ou PTB (phosphotyrosine binding). Por exemplo, a ativao de EGFR leva fosforilao de resduos que so reconhecidos por uma protena adaptadora denominada Grb2.

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Esta protena possui dois domniosEGF

SH3, que possuem grande afinidade por#

A-P * Sos# GDP

seqncias de prolinas, presente entre outros, na protena Sos. Estes domnios proticos com afinidades especficas fa-

Ras

EGFR

Grb2GTP

zem com que a fosforilao do EGFR seja o sinal para a montagem de um complexo protico responsvel por trazer Ras membrana celular ativando-a atravs da catlise da troca de GDP por GTP (item 2.1.1.2.1). Outros RTKs utilizam outras protenas adaptadoras,TrkAGF

NGF

B#

-P

-P *#

SosGDP

Ras

Shc Grb2GTP

Figura 5. Modelo para a ativao de Ras por EGF (A) e por NGF (B).* Domnios ligadores de fosfotirosina do tipo SH2 e; # domnios ligadores de seqncias de prolina do tipo SH3.

como no caso da TrkA (receptor de NGF), que utiliza uma molcula adaptadora denominada Shc, que por sua vez pode ligar-se Grb2 com isto levando ativao de Sos por Ras (Denhardt, 1996), ou o FGFR que utiliza a FRS-2 (Kouhara et al. 1997 e Figura 5B).

Adaptado de Denhardt, (1996).

2.1.2.2.3. RasRas faz parte de uma superfamlia de protenas ligadoras de nucleotdeos de guanina de 20-25 kDa, semelhantes s subunidades das protenas G. A Ras foi descoberta primeiramente como genes transformantes nos vrus sarcomas, sendo considerada um marco na oncologia molecular. O oncogene, uma Ras sem atividade GTPsica, isto , permanentemente ativa, encontrado em aproximadamente 30% de tumores (Alberts et al. 1994). Uma amostra da importncia da sinalizao mediada pelas Ras o impressionante grau de conservao ao longo da evoluo, mostrado pela total igualdade entre a Ras humana e de camundogo e pela funcionalidade da Ras humana em leveduras e viceversa (Malumbres, Pellicer, 1998).

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A famlia da Ras possui um domnio CAAX (sendo A = resduo aliftico e X = qualquer aminocido) na sua parte C-terminal, que pode ser farnesilado na cistena. Alm disto, algumas Ras tambm so transformados com grupos palmitoil, permitindo com que estas protenas sejam reversivelmente translocadas para a membrana. O mecanismo bsico da regulao de atividade das Ras similar ao das subunidades da protena G (Figura 3) e envolve pelo menos dois tipos de protenas, as GEFs e as GAPs. A Ras inativa se encontra ligada GDP, sendo que GEFs catalisam a troca de GDP por GTP, levando a uma modificao conformacional que expe alguns domnios que podem interagir com vrios efetores, trazendo-os membrana, e/ou regulando a sua atividade alostericamente. Protenas Ras possuem atividade GTPsica intrnseca, que pode ser aumentada pelas GAPs, reguladores negativos da Ras. interessante mencionar que as formas oncognicas da Ras no aparesentam atividade GTPsica intrnseca, e/ou se tornaram inertes regulao das GAPs, fazendo com que esta Ras no possa mais ser inativada (Malumbres, Pellicer, 1998). Segundo Marshall (1996), existem trs principais mecanismos pelos quais Ras regula a atividade de seus efetores: 1. Ativao direta: A interao da Ras-GTP transloca o efetor para a membrana, ativando-o. Exemplos B-Raf e PI3K; 2. Translocao membrana e associao com um ativador: Idem ao a nterior, sendo necessria ainda uma segunda protena que ativa o efetor, como o caso da cRaf-1 que, ao ser levada para a membrana, pode ser fosforilada pela Src e ativada; 3. Translocao membrana e associao com o(s) substrato(s): Neste caso, a ativao se d pela proximidade fsica entre o efetor e seus substratos, obtida com a translocao membrana. 2.1.2.2.3.1. GEFs Considerando a importncia da sinalizao mediada por Ras no surpresa que os mecanismos de regulao sejam vastos e complexos. Uma das prin-

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cipais Ras-GEFs envolvidas na ativao da Ras por RTKs so as Sos. Este conjunto de protenas possuem domnios SH3 com os quais elas se ligam a Grb2, translocando-a desta forma membrana e concentrando-a em relao Ras. O CNS expressa duas Ras-GEFs importantes para a integrao de sinais. A Ras-GRF (Guanyl Nucleotide-Releasing Factor) uma GEF que possui um motivo ligador de calmodulina do tipo IQ, desta forma podendo ser ativada pelo aumento de Ca2+ intracelular (Farnsworth et al. 1995), estando envolvida em processos como LTP e memria (Brambilla et al. 1997). Um terceiro tipo de Ras-GEF amplia ainda mais o potencial de sinalizao e integrao da Ras, pois pode ser ativada pela ligao de DAG e Ca2+, o que parecia ser prerrogativa das PKCs. A Ras-GRP (Guanyl Nucleotide-Releasing Protein) possui um motivo ligador da Ca2+ do tipo EF hand e um stio de ligao de DAG do tipo C1 sendo efetivamente ativada por steres de forbol, indicando que muitos dos efeitos creditados s PKCs podem, na verdade, ser dev ido ativao da Ras atravs da Ras-GRP. Esta protena foi encontrada no timo e no CNS, mais especificamente nas reas CA1 e CA3 do hipocampo (Ebinu et al. 1998 e Togon et al. 1998). 2.1.2.2.3.2. GAPs A atividade GTPsica da Ras muito baixa e GAPs so necessrias para acelerar esta atividade. Seis famlias de GAPs foram caracterizadas at recentemente (Malumbres, Pellicer, 1998), sendo que a sua regulao tambm bastante variada. A principal GAP da Ras a p120GAP, sendo esta tambm regulada pela ligao de SH2 a RTK, desta forma representando uma ligao negativa entre RTK e Ras (Denhardt, 1996). A SynGAP especificamente expressa em densidades ps-sinpticas, possui domnios PH (regulao por PI3K) e C1 (similar ao encontrado nas PKCs) (Kim et al. 1998) e sua atividade inibida por fosforilao pela CaMKII (Chen et al. 1998).

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2.1.2.2.4. Rafs e MEKKsEm vertebrados foram identificados trs genes de Raf, A-Raf, B-Raf e cRaf1. Estas enzimas possuem trs regies conservadas (CR1-3 Conserved Region), sendo que a CR1 est envolvida na interao com Ras, CR2 possui um dedo de zinco, provavelmente responsvel por ligar a protena ativa me mbrana, enquanto que CR3 responsvel pela atividade enzimtica (Daum et al. 1994). cRaf-1 foi identificada como o primeiro componente de uma cascata de quinases ativada por fatores de crescimento (Kyriakis et al. 1992 e 1993), posteriormente indentificada como a cascata da ERK. Ao contrrio das outras quinases da cascata (MEK e ERK), cuja ativao ocorre pela fosforilao em dois stios, o mecanismo de ativao da cRaf-1 (e das outras MAPKKK) ainda no foi completamente esclarecido, tendo inmeros stios de fosforilao e interaes com outras protenas, como Ras e membros da famlia das protenas 14-3-3. De forma anloga s PKCs, a translocao membrana parece ser uma etapa fundamental para a ativao das Rafs e MEKKs (Morrison, Cutler, 1997). A adio de uma seqncia de ligao membrana na cRaf-1 produziu uma enzima com atividade constitutiva, indicando que a translocao um evento fundamental para a sua ativao. Na ativao fisiolgica, acredita-se que esta translocao mediada pela Ras ativa, que se localiza na membrana e possui uma alta afinidade pela CR1 da cRaf-1 (Leevers et al. 1994 e Stokoe et al. 1994). Outro evento importante na ativao da cRaf-1 a sua oligomerizao, sendo que a oligomerizao induzida por molculas ponte tambm levam a sua ativao (Luo et al. 1996 e Farrar et al. 1996). A cRaf-1 regulada atravs da fosforilao em diversos stios. At recentemente, foram identificados nove stios de fosforilao na cRaf-1, tendo as fosforilaes nestes stios os mais variados efeitos sobre a sua atividade e localizao (Tabela 1), indicando para o papel fundamental da cRaf-1 (e das suas isoformas) na integrao de sinais (Morrison, Cutler, 1997).

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Tabela 1. Stios de fosforilao da cRaf-1 e seus efeitos regulatrios.Stio Ser43 Ser 259 Ser 259 Thr268/269 Efeito na atividade Inibidor Dessensibilizador Ativador Ativador Quinase PKA, PKG PKC PKC CPK Pak3 Src Ref. ou item Item 2.1.3.3 Schnwasser et al. (1998). Item 2.1.3.3 Yao et al. (1995). King et al. (1998), Diaz et al. (1997). Jelinek et al. (1996), Marais et al. (1995).

Ser338/339 Ativador/Permitir a fosforilao de Tyr340 e 341 Tyr340/341 Necessrio para a ativao por Ras e PKC Ser 497 Ser499 Ser 621 Desconhecido Ativador Inibidor

PKCs PKA

Item 2.1.3.3 Mischak et al. (1996).

CPK - Ceramide-activated protein kinase; Pak3 - p21-activated kinase 3, PKG cGMP-dependent protein kinase.

Um dos passos fundamentais para a ativao da cRaf-1 parece ser a fosforilao dos resduos Tyr 340 ou 341 pela tirosina quinase Src, evento que ocorre na membrana. Marais et al. (1997) observaram que a transfeco de Src oncognica produziu um aumento de 5 vezes na atividade da cRaf-1, enquanto que a transfeco de Src e Ras oncognicas produziu um aumento de 25 vezes na atividade da cRaf-1, indicando a existncia de um sinergismo entre estes dois componentes na ativao da cRaf-1. Quanto a inativao de cRaf-1, existem alguns estudos que mostram a defosforilao dos stios envolvidos na sua ativao. A fosforilao das Tyr340 e 341 pode ser revertida pela tirosina fosfatase PTP-1B sendo que um mecanismo da estabilizao da cRaf-1 ativa parece ser atravs do bloqueio da atividade da PTP-1B sobre Tyr340 e 341 (Jelinek et al. 1996). Parece que cRaf-1, como muitas outras protenas, funciona como parte de um enorme complexo protico funcional de 300 a 500 kDa, formado por duas protenas de choque trmico (Hsp Heat chock protein) (Hsp90 e Hsp50), MEK e 14-3-3 (Wartmann, Davis, 1997). Um importante cofator para o perfeito

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funcionamento da cRaf-1 parece ser a protena 14-3-3, que pode ligar-se tanto cRaf-1 inativa, mantendo-a desta forma, como cRaf-1 ativada, tambm estab ilizando a sua atividade (Tzivion et al. 1998). Alm deste papel na sinalizao e integrao de sinais que levam ativ ao da cascata da ERK, cRaf-1 parece estar envolvida em funes diferentes das desempenhadas na sinalizao ativada por fatores de crescimento. Ziogas et al. (1998) mostraram que durante a mitose, cRaf-1 ativada por um mecanismo independente de Ras, mas dependente da fosforilao nas tirosinas 340 e 341 por Src. Surpreendentemente, a cRaf-1 ativada desta forma est principalmente no citoplasma, contrariando as observaes de que a translocao membrana um passo fundamental para a sua ativao. Alm disto, Ziogas et al. (1998) mostraram que cRaf-1 ativada durante a mitose no ativa MEK e ERK, indicando a existncia de outros substratos regulados por cRaf-1.

2.1.2.2.5. MEKMEKs so quinases que fosforilam resduos de treonina e tirosina nas MAPKs, possuindo uma grande especificidade pelo substrato, isto , uma determinada MEK ativa somente uma MAPK especfica. A ativao da MEK tambm ocorre pela dupla fosforilao, em resduos de serina pelas Rafs ou MEKKs (Zheng, Guan, 1994). PD098059 uma importante ferramenta para o estudo da cascata das MAPKs pois inibe especificamente MEK1 (Dudley et al. 1995), bloqueando tambm alteraes celulares mediadas pelas MAPKs, como por exemplo diferenciao de PC12 (Alessi et al. 1995 e Pang et al. 1995).

2.1.2.2.6. ERKERK fosforilada por MEK nos resduos Thr183 e Tyr 185 (da ERK de 42kDa), sendo a dupla fosforilao necessria para a ativao desta enzima. A atividade da ERK fosforilada em somente um resduo em torno de 1% em relao enzima fosforilada nos dois stios. Estudos com difrao de raio X mostr a-

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ram que a fosforilao, principalmente da Tyr185 retira o domnio inibitrio do stio cataltico, desta forma, ativando a enzima (Zhang et al. 1994). ERK fosforila substratos que possuem uma serina ou treonina seguida de uma prolina. Uma grande quantidade de substratos citoslicos e nucleares da ERK foram identificados at o momento, entre os quais podem ser destacados fosfolipase A2 citoslica (cPLA2 Cytosolic Phospholipase A2) (Lin et al. 1993), protena associada ao microtbulo e os fatores de transcrio Elk, Ets1, Sap1, cMyc, Tal, STAT, Myb e c-Jun (Garrington, Johnson, 1999). Normalmente a ativao da ERK leva a sua translocao ao ncleo sendo esta translocao regulada por outras vias de sinalizao, como por exemplo cAMP/PKA, neste caso podendo levar a um aumento sinergstico da fosforilao de CREB (Impey et al. 1998).

2.1.2.2.7. Quinases ativadas pelas MAPKsAt o momento foram identificadas diversas quinases que podem ser ativadas por ERK, sendo, em muitos casos, aquelas responsveis pelos efeitos destas. Um dos grupos de quinases ativadas pelas ERK mais estudadas so as Rsks (Ras/ERK/pp90 ribosomal S6 kinases) sendo que at o momento foram identificadas 3 isoformas. Foi demonstrado que Rsk responsvel pela fosforilao de SRF, Fos, CREB em resposta a fatores de crescimento como NGF e BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) e em resposta ao aumento de Ca2+ intracelular, sendo que o subtipo Rsk2 parece ser o principal envolvido na fosforilao de CREB-Ser133 (Ginty et al. 1994 e Xing et al. 1996, Finkbeiner et al. 1997, Impey et al. 1998).

2.1.2.2.8. Fosfatases e a desativao da cascata das MAPKs.Considerando que todos os componentes das cascatas das MAPK so fosforilados e que as fosforilaes desempenham um papel fundamental na regulao da atividade, mecanismos de defosforilao representam importantes formas de regulao da cascata.

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A cascata da ERK regulada por fosfatases especficas, que atuam somente sobre componentes da cascata, como o caso das MAPK fosfatases (MKP - MAPK Phosphatase), ou por fosfatases que possuem muitos outros substratos celulares, como a PP2A e a PP1 (Tabela 2). Como na grande maioria dos casos, as fosfatases envolvidas em um sistema de fosforilao so muito menos estudadas do que as quinases envolvidas, sendo que a cascata das MAPKs no exceo. Embora existam vrios estudos, muitos deles foram realizados in vitro, dificultando a sua utilizao na interpretao de dados obtidos em clulas intactas. A PP2A parece ser uma das principais fosfatases da cascata da ERK, podendo defosforilar e desativar as trs quinases cRaf-1, MEK e ERK, in vitro (Millward et al. 1999 e referncias neste). A PP1 tambm apresentou atividade fosfatsica quando cRaf-1 foi utilizada como substrato, indicando para um possvel envolvimento desta enzima (Dent et al. 1995). Dois estudos indicam que PP2A realmente est envolvida na regulao da cascata da ERK in vivo. Hrich et al. (1997) mostraram que tanto a expresso como a atividade da PP2A podem ser ativadas pela casena quinase 2 (CK2 Casein Kinase 2) levando a inibio da atividade da cascata da ERK e a reverso da transformao celular induzida por Ras ativada (Baharians, Schonthal 1999). interessante observar que a ativao de PP2A por CK2 inibida pelo tratamento com fator de crescimento de plaqueta (PDGF Platelet-derived Growth Factor), indicando que fatores de crescimento tambm podem regular a desativao e no somente a ativao da cascata da ERK (Hrich et al. 1997). As principais fosfatases da ERK (e das outras MAPKs) so as MKPs, que so um grupo de fosfatases capazes de defosforilar tirosina e treonina de diversos componentes das MAPKs, inativando-os. As MKPs, da mesma forma como os outros componentes da cascata das MAPKs, so um grupo relativamente grande de enzimas (9 subtipos, Camps et al. 1998), com uma especificidade variada, formas e locais de expresso diferenciados (Tabela 4). A principal forma de regulao parece ser a expresso, ativada, entre outros, pelas prprias MAPKs, caracterizando mecanismos de retroalimentao negativa, embora cer30

tas MKPs, como a MKP3, que especfica para ERK, tambm possam ser ativadas pela ligao com o substrato, no caso a prpria ERK (Camps et al. 1998). Estas retroalimentaes negativas que so ativadas no nvel da expresso, necessitam de pelo menos 1 hora, no caso da MKP1 ou 3 horas, no caso da MKP2 (Brondello et al. 1997). A contribuio das MKPs e da PP2A para a inativao da cascata da ERK depende tanto do agonista quanto do tipo celular. Por exemplo, em fibroblastos tratados com EGF, MKP1 parece ser a principal fosfatase envolvida na defosforilao da ERK, enquanto que em clulas PC12 tratadas com EGF, a PP2A, juntamente com uma tirosina fosfatase no identificada, parecem ser os responsveis pela defosforilao dos componentes da cascata (Millward et al. 1999). Vrios inibidores de fosfatases ativam a cascata da ERK, como o inibidor da PP2A, cido ocadico, o inibidor inespecfico de tirosina fosfatases, vanadato (Sonoda et al. 1997) e o inibidor de PP1 e PP2A caliculina A, sendo que um inibidor de PP2B, ciclosporina A, no tem efeito sobre a atividade da ERK (Wo-

etmann et al. 1999). O decaimento da atividade da cRaf-1 foi inibida somente quando as fosfatases PP1 e PTP1 foram inibidas, indicando que defosforilao tanto em serina/treonina como em tirosina so fundamentais para desativao da cRaf-1 (Dent et al. 1995).

Tabela 2. Fosfatases que podem regular da atividade das cascatas MAPKs.Regulao Fosfatase MKP1-4 PP2A PP1 PTP1B Substrato(s) ERK, JNK e p38 (a) cRaf-1, MEK, ERK (d,e) cRaf-1 (e) cRaf-1 (e) Atividade ERK, JNK, p38(b) Inibidor 1 e 2 2a Inibidor 1 e 2 Desconhecido Expresso JNK, ERK(c)

a: as 4 isoformas possuem especificidades diferenciadas pelas isoformas das MAPKs, sendo que MKP3 defosforila somente ERK enquanto que MKP1 defosforila as 3 isoformas. b: a atividade dos subtipos MKP3 e 4 regulada por estas quinases (Camps et al. 1998); c: regulao da expresso da MKP1, que considerado um IEG (Bokemeyer et al. 1996), d: Testes realizados in vivo (Millward et al. 1999); e: Testes realizados in vitro Dent et al. (1995).

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2.1.2.3. Isoformas das cascatas das MAPKsComo visto na Figura 4, em cada nvel da cascata existem vrias isoformas, o que aumenta em muito a complexidade destas vias de transduo de sinal. Neste item, sero discutidas algumas diferenas importantes entre as isoformas das protenas que constituem a cascata das MAPKs e seus ativadores.

2.1.2.3.1. RTKs e fatores de crescimento2.1.2.3.1.1. FGF-2 A famlia do FGF (Fibroblast Growth Factor) engloba em torno de 20 fatores, que possuem de 30 a 70 % de identidade na seqncia primria e pelo menos quatro receptores, que so muito semelhantes entre si e que podem ligar-se a praticamente todas as isoformas de FGF, possibilitando uma grande redundncia de sinalizao. Os receptores de FGF so expressos em praticamente todos os tipos de cultura e na maioria dos tecidos, embora estudos in vivo ainda sejam precrios (Klint, Claesson-Welsh, 1999). Yayon et al. (1991) demonstraram que a ligao de FGF ao seu receptor necessita de heparam sulfato. Este glicosaminoglicano complexo normalmente encontra-se ligado a protenas formando os proteoglicanos, que se localizam tanto na membrana como na matriz extracelular. O mecanismo de ao do heparam sulfato ainda no est bem definido, mas acredita-se que ele esteja envolvido na dimerizao do receptor, pois oligosacardeos longos com um padro de sulfatao especfico so necessrios, sendo que oligosacardeos curtos, embora sejam capazes de ligar ao FGF-2, no so capazes de mediar a sua interao com o receptor. Portanto, parece que o heparam sulfato est envolvido na formao de um complexo ternrio de heparam sulfato/FGF/FGFRs interagindo tanto com o fator de crescimento como com os seus receptores. (Klint, Claesson-Welsh, 1999). O mecanismo de ativao dos receptores de FGF-2 (FGFRs) no parece ser muito diferente dos descritos para outros RTKs. A ligao de FGF leva a homoou hetero-dimerizao dos receptores, estimulando a atividade tirosina quinsica

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do receptor, que por sua vez, autofosforila-se em resduos de tirosina especficos, que incluem os resduos Y463, Y583, Y585 e Y766 (Mohammadi et al. 1996), formando vrios stios de ligao para protenas reconhecedoras de fosfotirosina. FGFRs podem interagir com uma molcula adaptadora denominada substrato 2 do receptor de FGF (FRS2 - FGF receptor substrate 2). FRS2 possui um domnio ligador de fosfotirosina denominado PTB que pode interagir com o FGFR1 fosforilado em tirosina, levando com isto a fosforilao de vrias tirosinas do FRS2, que por sua vez pode se ligar Grb2, conseqentemente ativando Ras atravs de Sos. No foi possvel detectar nenhuma ligao direta entre Grb2 e FGFR1, indicando que FRS2 fundamental para a ativao de Ras pelos FGFRs. FRS2 ativado por FGF e NGF, mas no por EGF ou PDGF (Klint et al. 1995 e Kouhara et al. 1997). A ausncia de ligao direta entre o FGFR e Grb2 foi confirmada com a utilizao de peptdeos mimetizadores do stio de ligao de Grb2 ao receptor de EGF, que bloqueou a ativao de ERK e o efeito mitognico tanto de EGF como de PDGF, mas no o efeito de FGF-2 (Williams et al. 1997 e Figura 6).FGF

FGFR

P-

-P -PFRS2

.Grb2

PKCPLC

Sos

Ras

Raf

Crescimento AxonalClulas PC12

ProliferaoMioblastos A1

Figura 6. Vias de sinalizao ativadas por FGFR.Baseado nas referncias citadas no item 2.1.2.3.1.1.

Portanto, FRS2 desempenha o papel de regular especificamente a sinalizao mediada pelo FGFR, isto , a sua ausncia pode bloquear especificamente a sinalizao mediada pelas FGFRs, uma vez que os receptores de NGF 33

possuem, alm da FRS2, outras protenas adaptadoras, como a Shc, como visto abaixo. Alm da ativao de Ras atravs de FRS2, outras vias sinalizadoras tambm podem ser ativadas pelos FGFRs. A fosforilao no resduo Y766 permite a ligao de fosfolipase C. Estudos utilizando mutagnse stio dirigida indicaram que esta fosfotirosina fundamental para a ativao de PKC por FGF e que pode estar envolvida na ativao da ERK, embora a atividade de Ras no tenha sofrido nenhuma mudana com a retirada deste resduo de tirosina (Huang et al. 1995). A mutao Y766F no afetou a proliferao induzida por FGF, indicando que o bloqueio da via PLC/PKC no influencia a sinalizao que induz a proliferao. Peptdeos bloqueadores da ativao de PLC por FGFR1 inibiram o crescimento axonal induzido por FGF e CaMs em PC12 (Saffell et al. 1997), mas no a ativao de ERK e a proliferao em mioblastos A1 (Williams et al. 1997). Os receptores de FGF tambm podem ser regulados por outras vias de sinalizao, com por exemplo PKC. Gillespie et al. (1995) mostraram que esteres de forbol, atravs da ativao PKC, inibiram o efeito do FGF atravs da fosforilao do receptor na Thr424 e que variantes de processamento que no possuem esta parte do receptor no foram afetados pela ativao de PKC. A sinalizao mediada por FGF est envolvida em diversas situaes fisiolgicas e patolgicas. Entre as principais respostas biolgicas sinalizadas por FGF esto a proliferao, diferenciao e migrao celular, sendo fundamental durante o desenvolvimento, pois KOs de FGFRS se mostrarram inviveis. Interessantemente, apesar da grande redundncia entre a ligao de FGFs aos seus receptores, KOs dos quatro FGFRs produziram diferentes anomalias durante o desenvolvimento, indicando que as sinalizaes no so totalmente redundantes (Klint, Claesson-Welsh, 1999). A sinalizao mediada por FGF tambm muito importante em processos patolgicos. Na tumorignese, os FGFs tm sido ligados a migrao, proliferao, diferenciao endotelial e angiognese, processos fundamentais para a progresso de tumores e metstase (Klint, Claesson-Welsh, 1999). Tambm existem muitas evidncias que ligam os FGFs a leses no CNS. Um grande au34

mento de RNA mensageiro (mRNA Messenger RNA) de FGF aps a injeo de cido canico (Riva et al. 1994) e de leses provenientes de convulses induzidas (Gall et al. 1994) foram observadas principalmente em reas sensveis a estas leses, tanto nos neurnios como nos astrcitos. FGF-2 tambm pode potencializar a induo de gliose reativa de leses mecnicas e eletrolticas, pois a injeo de FGF-2 no local da leso produz um aumento no nmero de astrcitos reativos, processos celulares aumentados e uma intensa marcao para protena fibrilar glial cida (GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein) (Eclancher et al. 1996). 2.1.2.3.1.2. EGF Os receptores de EGF possuem trs principais tirosinas fosforilveis, nas quais podem ligar-se Grb2, Shc e p85 (subunidade da PI3K), podendo desta forma ativar PI3K e a cascata da ERK atravs de Sos (Moghal, Sternberg, 1999). 2.1.2.3.1.3. PDGF Duckworth, Cantley, (1997) mostraram evidncias para a existncia de duas vias sinalizadoras entre o receptor de PDGF e Raf, uma dependente de PI3K e a outra dependente de PLC/PKC. Montmayeur et al. (1997), utilizando mutaes em tirosinas especficas, mostraram que somente a ativao da PLC fundamental para a ativao de ERK pelos receptores de PDGF. 2.1.2.3.1.4. NGF NGF age principalmente em dois receptores, TrkA e p75. O receptor TrkA possui tirosinas que, quando fosforiladas, podem ligar a Shc e PLC, sendo que estudos com mutagnese stio dirigida mostraram que estas duas protenas levam ativao da ERK de forma redundante, isto , somente a mutao das duas tirosinas do receptor TrkA bloqueia totalmente a ativao de ERK e o crescimento de neuritos em clulas PC12 induzida por NGF (Stephens et al. 1994).

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2.1.2.3.2. RasAs Ras servem como prottipos para um grupo de protenas ligadoras de nucleotdeos de guanina que compartilham seqncia primria, homologia estrutural e atividade biolgica. At recentemente, foram identificados mais do que 60 componentes das superfamlia da Ras, que podem ser divididas em vrias subfamlias, entre as quais podem ser destacados: Ras, Rho, Rab, Arf, Ran e Rad/Gem, sendo que cada uma destas subfamlias possui um conjunto variado de componentes (Malumbres, Pellicer, 1998). A subfamlia da Ras pode ser dividida em sete subgrupos, com as mais diversas funes e distribuio no organismo. Enquanto a famlia das Ras (H-, Ke N-Ras) est principalmente envolvida com a sinalizao que ativa a cascata das MAPKs em resposta a fatores de crescimento, os outros componentes da famlia das Ras esto envolvidas na integrao de sinais, como o caso das Rap, Rheb e TC21, como visto no item 2.1.3.3. Um exemplo interessante a ativao de ERK por NGF em linhagens PC12. Esta ativao permanece por vrias horas e est envolvida na induo da diferenciao, enquanto que a ativao da ERK induzida por EGF rpida e transitria, produzindo a proliferao celular (Marshall, 1995 e 1998). York et al. (1998) mostraram que os receptores de NGF, TrkA, possuem duas vias para ativar MEK e ERK, uma envolvendo Ras e sendo responsvel pela parte inicial da ativao e a outra dependente de Rap e B-Raf (item 2.1.2.3.3.1) e sendo responsvel por manter a cascata ativa por mais tempo.

2.1.2.3.3. MAPKKK (Rafs e MEKKs)2.1.2.3.3.1. Isoformas da cRaf-1 B-Raf e A-Raf B-Raf a principal isoforma da Raf no CNS (Catling et al. 1994), apresentando uma alta atividade basal (item 5.2.4), muito provavelmente devido ao fato de que os stios de fosforilao em tirosina da cRaf-1 (resduos 340 e 341) so

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substitudos por dois resduos de aspartato na B-Raf7 (Jelinek et al. 1996). Pelo mesmo motivo, a B-Raf no parece ser regulada pela Src, sendo que o seu principal mecanismo de ativao mediado pela Ras e Rap (Marais et al. 1997 e York et al. 1998). A B-Raf um componente fundamental na integrao da sinalizao, pois ela no inibida por PKA, ao contrrio de cRaf-1 (item 2.1.3.3) e tambm possui um importante papel nas ativaes duradouras da cascata da ERK, como visto anteriormente. A-Raf possui muitas semelhanas com cRaf-1, tambm sendo ativada por fatores de crescimento, como EGF atravs de Ras e Src e podendo ativar MEK (Storm et al. 1990, Marais et al. 1997 e Wu et al. 1996). A principal diferena entre A-Raf e cRaf-1 que a primeira expressa principalmente na epiderme, ovrio, rins e bexiga, no sendo encontrada nos pulmes e no CNS enquanto que a segunda expressa em todos os tecidos (Morice et al. 1999). 2.1.2.3.3.2. As MEKKs As cinco isoformas de MEKK (MEK Kinase), ao contrrio das Rafs, podem ativar mais do que uma cascata, sendo que as MEKK1 - 4 ativam as cascata da ERK e/ou da JNK com intensidades diversas. MEKK1, 2 e 3, mas no MEKK4, ativam a cascata da ERK enquanto todas as 4 isoformas ativam a cascata da JNK. Em estudos com transfeco utilizando clulas HEK293 ou COS, nenhuma destas isoformas ativou p38. MEKK2 ativa preferencialmente a cascata da JNK em relao cascata da ERK, enquanto o MEKK3 possui uma e specificidade inversa (Blank et al. 1996 e Ellinger-Ziegelbauer et al. 1997) A especificidade de MEKK1 por uma das duas cascatas varia conforme o tipo celular e se o estudo envolve transfeco ou no (Yan et al. 1994 e Schlessinger et al. 1998). A MEKK1 pode ser ativada por sinais indicadores de estresse celular, como TNF, radiao ionizante e cisplatina (Widmann et al. 1998), estando envolvida na induo da apoptose (Johnson et al. 1996). Ativadores que

Aminocidos com carga negativa como o aspartato ou o glutamato podem desempenhar um papel semelhante ao de um resduo fosforilado, provavelmente devido carga. A protena na qual o AA fosforilvel trocado por um AA negativo geralmente apresenta uma atividade semelhante ao da protena fosforilada naquele stio.

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estimulam as Raf tambm podem ativar as MEKKs, como por exemplo EGF e insulina (Haystead et al. 1994). As MEKKs apresentam uma alta similaridade entre os seus domnios catalticos C-terminais, enquanto que as partes N-terminais destas enzimas so bastante distintas. Por exemplo, MEKK2 (619aa) e MEKK3 (626aa) possuem 94% dos aminocidos conservados na parte cataltica C-terminal, enquanto que a parte regulatria N-terminal possui somente 64% dos aa conservados, indicando uma alta sobreposio dos substratos, mas uma baixa sobreposio das formas de regulao (Blank et al. 1995). MEKK1 (1486aa) possui uma parte Nterminal imensa quando comparada com MEKK2 e 3, possuindo muitos domnios potencialmente envolvidos em diversas formas de regulao (Xu, Cobb, 1997), sendo que o domnio cataltico possui somente 32% de aminocidos idnticos com o domnio cataltico da MEKK2 (FASTA-Swissprot). As semelhanas entre as sequncias das isoformas dos ativadores de MEK mostrado na Tabela 3. Tabela 3. Homologia da famlia das Rafs e MEKKs com a cRaf-1 de rato.Enzima A-Raf B-Raf MEKK1b MEKK2b MEKK3b Animala Rato Humano Rato Camundongo Humano Nmero de ami- % de aminoci- Nm. de aminocinocidos dos idnticos dos analisados 604 765 1493 619 626 61,5 57,5 24,6 26,0 25,4 608 653 435 442 444

Estes dados foram produzidos pela programa FASTA utilizando como banco de dados a Swissprot e obtidos do endereo: http://src.ebi.ac.uk da Sequence Retrieval System. a: as seqncias para rato no esto disponveis para todas as enzimas, sendo que, nos casos de comparao com a seqncia em humanos e camundongos, a homologia apresentada muito provavelmente menor do que seria se a seqncia de rato fosse utilizada; b: somente o domnio cataltico foi comparado OBS: cRaf-1 possui 648 aminocidos.

Outra observao importante que seqncias