Centro Univer sitár io Feevale Programa de Pós­Graduação em Gestão Tecnológica

Mestrado em Qualidade Ambiental

GRAZIELA MARIA SCHUH

ESTUDO DA INSTABILIDADE GENÔMICA CAUSADA POR VÍRUS,

DROGAS ANTI­RETROVIRAIS E OUTROS FATORES AMBIENTAIS EM

PACIENTES HIV POSITIVO

Novo Hamburgo, 2007

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

2

Centro Univer sitár io Feevale Programa de Pós­Graduação em Gestão Tecnológica

Mestrado em Qualidade Ambiental

GRAZIELA MARIA SCHUH

ESTUDO DA INSTABILIDADE GENÔMICA CAUSADA POR VÍRUS,

DROGAS ANTI­RETROVIRAIS E OUTROS FATORES AMBIENTAIS EM

PACIENTES HIV POSITIVO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós­

Graduação em Gestão Tecnológica como requisito

para a obtenção do título de mestre em Gestão

Tecnológica: Qualidade Ambiental

Orientador: Prof. Dr. Sharbel Weidner Maluf

Novo Hamburgo, 2007

3

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)

Bibliotecária responsável: Rosângela Terezinha Silva – CRB 10/1591

Schuh, Graziela Maria Estudo da instabilidade genômica causada por vírus, drogas anti­

retrovirais e outros fatores ambientais em pacientes HIV positivo / Graziela Maria Schuh – 2007.

XX f. ; 30 cm.

Dissertação (Mestrado em Qualidade Ambiental) – Programa de Pós­Graduação em Gestão Tecnológica: Mestrado em Qualidade Ambiental ­ Impacto Biológico, Centro Universitário Feevale, Novo Hamburgo, 2007. Inclui bibliografia e apêndice. “Orientador: Prof. Dr. Sharbel Weidner Maluf”.

1. Pessoas HIV­Positivo. 2. Anti­retrovirais. 3. Genotoxicidade. I. Título.

4

GRAZIELA MARIA SCHUH

ESTUDO DA INSTABILIDADE GENÔMICA CAUSADA POR VÍRUS,

DROGAS ANTI­RETROVIRAIS E OUTROS FATORES AMBIENTAIS EM

PACIENTES HIV POSITIVO

Dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora em 28 de fevereiro de 2007,

conferindo ao autor o título de mestre em Gestão Tecnológica: Qualidade Ambiental.

Componentes da Banca Examinadora:

...................................................................... Prof. Dr. Sharbel Weidner Maluf

FEEVALE ­ Orientador

...................................................................... Prof. Dr. Bernardo Erdtmann

UFRGS ­ Examinador

...................................................................... Prof. Dr. Luciano Basso da Silva

FEEVALE ­ Examinador

5

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por estar sempre ao meu lado, mostrando o caminho a seguir.

À minha família, agradeço a compreensão e todo o amor dedicado para que eu pudesse concluir

mais uma etapa profissional.

Ao Dr. Sharbel pela incansável dedicação para que este trabalho pudesse ser realizado, sempre

mostrando a direção a ser tomada nos momentos de dúvidas.

E não poderia esquecer dos grandes amigos que fiz ao longo do Curso Mestrado em Gestão

Tecnológica: Qualidade Ambiental, pela amizade e companheirismo.

6

RESUMO

O vírus HIV pode causar mutações nas células infectadas, proporcionando maior risco para o

desenvolvimento de tumores. Este trabalho teve como objetivo geral avaliar a freqüência de

instabilidade genômica causada por vírus, por drogas anti­retrovirais e outros fatores ambientais

através da técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese e ensaio cometa, em indivíduos HIV+

sem o com o uso de drogas ARVs e como objetivos específicos: avaliar o efeito genotóxico da

contaminação viral através dos índices de dano de DNA medidos pelas técnicas de micronúcleo e

cometa; avaliar o efeito das drogas através dos índices de dano de DNA medidos pelas técnicas de

micronúcleo e cometa; avaliar o efeito genotóxico de outros fatores como idade, sexo e tabagismo em

indivíduos HIV+ com e sem uso de ARVs e no grupo controle através dos índices de dano de DNA

medidos pelas técnicas de micronúcleo e cometa. A amostra constou de um total de 135 indivíduos.

Foram realizadas as técnicas do cometa e de micronúcleos com o bloqueio da citocienese. Os valores

desta avaliação, assim como outros parâmetros, como a carga viral (CV) e a taxa de T­CD4+ foram

analisados e relacionados com o uso de drogas e outros fatores ambientais. Os dados demonstraram

que os pacientes HIV+ sem ARVs apresentam os maiores níveis de dano de DNA pela técnica do

cometa, quando comparados com os controles (p=0,007), demonstrando um efeito genotóxico da carga

viral, que apresentou­se elevada em relação aos pacientes em tratamento (p<0,001). A taxa de T­CD4+

não apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos HIV+ sem e com medicação.

As drogas, quando analisadas individualmente, não apresentaram um efeito genotóxico detectável

pelas nossas avaliações. Entre os pacientes HIV+ com ARVs, os fumantes apresentaram uma

freqüência de micronúcleos estatisticamente maior do que os não fumantes (p=0,020), indicando um

possível efeito sinérgico entre as drogas ARVs e o tabagismo. Este achado é importante para o

7

aconselhamento dos pacientes no sentido de melhorar sua qualidade de vida e evitar outros problemas

secundários de saúde, como o desenvolvimento de neoplasias, que pode ser causado pelo acúmulo de

mutações. Não ficou evidenciado, neste estudo, a influencia do sexo e da idade nos índices de dano de

DNA.

Palavras­chave: vírus HIV, drogas anti­retrovirais, genotoxicidade, técnica de micronúcleo, técnica do

cometa.

8

ABSTRACT

The human immunodeficiency virus (HIV) may cause mutations in infected cells. The general

objective of the present study was to evaluate the frequency of genomic instability caused by virus,

antiretroviral drugs

9

Key words: human immunodeficiency virus (HIV), antiretroviral drugs, genotoxicity, micronucleus technique, comet technique.

10

LISTA DE ABREVIATURAS

APRT Adenina fosforribosiltransferase ARVs Anti­retrovirais AZT Zidovudina BPDE Benzopireno­diolepóxido CBMN Técnica de micronúcleo com bloqueio da citocinese CCI Câncer cervical invasivo CEP Comitê de ética da Feevale CONEP Conselho nacional de pesquisa CV Carga Viral d4T Stavudina ddI Didanosina DNA Ácido desoxirribonucléico DSTs Doenças sexualmente transmissíveis EBV Vírus Epstein­Barr EFV Efavirenz FDA Food and drug administration HBV Vírus da hepatite B HIV Vírus da imunodeficiência adquirida HPRT Gene hipoxantina­guanina fosforribosiltransferase HPV Papilomas vírus ICPEMC Comissão internacional de proteção a mutágenos e

carcinógenos ambientais KSHV Herpes vírus do sarcoma de l

l

m

omotodei ans r HPRT

F

om c

11

PHA Fitohemaglutinina Pis Inibidor da protease PN Ponte nucleoplasmática RNA Ácido ribonucléico SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida SK Sarcoma de Kaposi TK Timidina quinase UV­A Ultravioleta A UV­B Ultravioleta B 3TC Lamivudina

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1­ Ensaio de MN com bloqueio da citocinese..................................... 30

Figura 2 ­ Técnica do Cometa......................................................................... 46

13

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 ­ FDA (Food and Drug Administration) ­ Agentes Anti­

Retrovirais Aprovados, Maio 1999................................................................. 36

14

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 ­ Características da amostra estudada...................................................... 42

Tabela 2 ­ Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e índice de DNA do Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+..................................................................................................... 47

Tabela 3 ­ Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+ sem medicação e com medicação................... 48

Tabela 4 ­ Comparação da taxa de células TCD4+ e Carga Viral (CV) entre os grupos HIV+ sem e com medicação....................................................................... 49

Tabela 5 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+ sem medicação e com medicação em relação ao sexo........................................................................................................ 49

Tabela 6 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo controle em relação ao sexo..................................................................... 50

Tabela 7 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ em relação ao sexo........................................................................ 50

Tabela 8 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem medicação em relação ao sexo............................................... 50

15

Tabela 9 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ com medicação em relação ao sexo.............................................. 50

Tabela 10 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos HIV+ sem e com medicação e controle em relação ao tabagismo................................................................................................................ 51

Tabela 11 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem e com medicação em relação ao tabagismo............... 52

Tabela 12 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo controle em relação ao tabagismo............................................... 52

Tabela 13 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem medicação em relação ao tabagismo.......................... 52

Tabela 14 ­ Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos HIV+ com medicação em relação ao tabagismo...................... 53

16

SUMÁRIO

1 ­ INTRODUÇÃO................................................................................................. 18

1.1 – Dano de DNA em populações humanas........................................................ 18

1.2 ­ Exposição a agentes genotóxicos no ambiente............................................... 22

1.3 – Fatores que podem influenciar na freqüência de mutações........................... 23

1.3.1 – Idade............................................................................................................ 23

1.3.2 – Sexo............................................................................................................. 24

1.3.3 – O hábito de fumar....................................................................................... 24

1.3.4 – Bebidas alcoólicas....................................................................................... 25

1.4 – MÉTODOS DE DETECÇÃO........................................................................ 27

1.4.1 – Micronúcleo (MN), Pontes Nucleoplasmáticas (PN) e Buds..................... 27

1.4.2 – Técnica do Cometa..................................................................................... 30

1.5 – SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA (SIDA)................ 32

1.6 – DROGAS ANTI­RETROVIRAIS (ARVs)................................................... 36

1.6.1 – AZT............................................................................................................. 37

1.6.2 – AZT+3TC................................................................................................... 39

1.6.3 – d4T.............................................................................................................. 40

1.6.4 – EFV............................................................................................................. 40

2 – OBJETIVOS..................................................................................................... 41

2.1 – Objetivo Geral................................................................................................ 41

2.2 – Objetivos Específicos..................................................................................... 41

3 – MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 42

17

3.1 – Delineamento................................................................................................. 42

3.2 – Procedimentos................................................................................................ 43

3.2.1 – Técnica de Micronúcleo com Bloqueio da Citocinese (CBMN)................ 43

3.2.2 – Técnica do Cometa..................................................................................... 45

4 – RESULTADOS................................................................................................. 47

4.1 – Sexo................................................................................................................ 49

4.2 – Idade............................................................................................................... 51

4.3 – Fumo.............................................................................................................. 51

5 – DISCUSSÃO.................................................................................................... 56

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 59

ANEXOS................................................................................................................ 74

Anexo I: Termo de Consentimento Informado....................................................... 74

Anexo II: Questionário de Saúde Pessoal............................................................... 75

18

1 INTRODUÇÃO

1.1 Dano de DNA em populações humanas

O DNA carrega um código genético para aminoácidos, com cada aminoácido sendo representado

por uma seqüência de três bases de DNA. Estes tripletes de bases são chamados de códons. A ordem

de códons na seqüência de DNA reflete na ordem dos aminoácidos unidos em uma cadeia de proteína.

A seqüência completa de DNA necessária para determinar a seqüência de aminoácidos de uma única

proteína é chamada de gene (Kreuzer e Masey, 2002). Nas células, o DNA está localizado dentro dos

cromossomos, no núcleo. O DNA contém as instruções para a produção de todas as proteínas do

corpo. No entanto, as proteínas são produzidas nos ribossomos localizados no citoplasma. Depois que

a seqüência de bases de um gene (DNA) é copiada no RNA mensageiro, este mRNA viaja até o

ribossomo, onde seu código é traduzido em uma proteína. O passo de tradução é realizado por um

segundo tipo de RNA, chamado de RNA transportador (tRNA). O tRNA combina os aminoácidos

corretos aos códons do mRNA, e os aminoácidos são ligados uns aos outros para formar a nova

proteína (Kreuzer e Masey, 2002).

Como entre outros genomas, o DNA do genoma humano não é uma entidade estática. Ao

contrário, ele está sujeito a diferentes tipos de mudanças hereditárias (mutações). Anormalidades

cromossômicas de grande escala envolvem a perda ou o ganho de cromossomos ou a quebra e a

reunião de cromátides. Mutações de menor escala podem ser agrupadas em diferentes classes de

mutações e podem, também, ser categorizadas com base se elas envolvem­se numa única seqüência de

DNA (mutações simples) ou se elas envolvem­se em trocas entre duas seqüências alélicas ou não­

alélicas (Strachan e Read, 2002).

19

O DNA, molécula que carrega a informação genética, possui estabilidade química limitada.

Alterações do material genético podem resultar de radiações externas, genotóxicos químicos no

ambiente, infecções virais e, tanto de origem exógena, quanto endógena (Maluf e Erdtmann, 1999).

As alterações que ocorrem no DNA são denominadas como mutações. Elas podem ser resultado

tanto de erros durante a duplicação do DNA, na divisão celular, quanto de danos causados por agentes

externos diretamente no DNA. Ocorrem em todos os seres vivos, sendo fundamentais para a evolução

e diversificação das espécies (Ribeiro et al., 2003; Silva et al., 2003).

Muitas vezes a mutação causa mudanças não detectáveis, ou então determina a morte celular.

Somente quando ocorrem em genes específicos podem evoluir para um crescimento celular

desordenado (Ribeiro et al., 2003; Silva et al., 2003). Genes específicos são aqueles que estão relacionados com a estimulação e inibição da proliferação celular. E, somente quando há um

determinado número de alterações nesses genes, é que surgem as células neoplásicas, já que os danos

no DNA além de irreversíveis são cumulativos. Os agentes mutagênicos podem acelerar ou aumentar o

aparecimento de mutações que se associam ao surgimento de neoplasias (Ribeiro et al., 2003).

A exposição a agentes genotóxicos no meio ambiente pode produzir uma ampla variedade de

efeitos na saúde humana. Alguns destes efeitos aparecem imediatamente, enquanto que outros indicam

evidências muitos anos depois. Sabe­se que efeitos tardios incluem carcinogênese e doenças genéticas

que podem afetar gerações futuras e desenvolvendo incapacidades (Au, 1991).

Em várias síndromes raras, a instabilidade genética, expressa como instabilidade

cromossômica, é conhecida. Pacientes com estas síndromes têm predisposição a câncer. Evidências

têm sido acumuladas, mostrando que instabilidade cromossômica ocorre em algumas outras doenças,

embora a freqüência não seja tão elevada. Instabilidade genética pode induzir a um evento mutacional

em genes cujo homólogo tenha uma alteração congênita, ou pode induzir dois eventos de mutação

nestes genes em indivíduos não portadores desta alteração, levando ao desenvolvimento de uma

neoplasia na célula alvo. É altamente provável que a instabilidade genética na população humana não

se expresse como "presente ou ausente" nos indivíduos. Graduações de instabilidade genética podem

20

existir por uma variedade de causas. Ocorrendo uma lesão no DNA nas células de pessoas com

sistema de reparo deficiente, haverá pouco ou nenhum reparo, logo, maior freqüência de aberrações

cromossômicas. Quando as células de indivíduos com o sistema de reparo deficiente são expostas a

agentes clastogênicos, podem­se observar aumento das taxas de aberrações cromossômicas, quando

comparadas a pessoas com maior estabilidade genética (Hsu, 1983).

A ativação de oncogenes e o conhecimento atual sobre as síndromes de instabilidade

cromossômica mostram que tanto mutações gênicas como aberrações cromossômicas são importantes

para iniciar o processo carcinogênico. Um agente pode produzir alterações genéticas em um

determinado tecido sem produzir câncer, dependendo da alteração e do tecido. Uma aberração

cromossômica pode ser irrelevante a nível de epitélio, mas significante na medula óssea, e vice­versa.

Isto tem implicações vitais para a genética toxicológica: (1) tanto mutações gênicas como aberrações

cromossômicas devem ser medidas, e (2) agentes carcinogênicas podem ser mutagênicos em tecidos

em que não causam câncer (Heddle, 1991).

Existe uma variação na freqüência de alterações cromossômicas entre indivíduos saudáveis e,

células do mesmo doador podem mostrar diferentes níveis de aberrações em diferentes períodos.

Informações variadas vêm sendo reunidas e parece quase impossível encontrar indivíduos

completamente não expostos, porém é necessário, tanto quanto possível, conhecer a freqüência

espontânea normal, suas variâncias e os fatores que a influenciam (Ganguly, 1993).

Além disso, existem indivíduos que apresentam uma freqüência de alterações citogenéticas

elevada, sem estarem, aparentemente, expostos a agentes mutagênicos fora do padrão normal. Parece

existir um gradiente de instabilidade genética, com as síndromes de instabilidade cromossômica

representando o extremo do espectro. Indivíduos que apresentam aumento na freqüência de alterações

cromossômicas nas células cultivadas sem qualquer indução, mostram uma sensibilidade maior

quando submetidos a um "stress" mutagênico. Isto foi testado pela exposição de fibroblastos em

cultura a uma variedade de agentes mutagênicos. Foi usada irradiação com UV como agente físico, e

químicos selecionados que agem por diferentes mecanismos genotóxicos, como mitomicina C (MMC),

N­metil­N­nitro­N­nitrosoguanina (MNNG), e benzopireno­diolepóxido (BPDE) (Rümmelein et al., 1992).

21

O aumento de instabilidade cromossômica está bem documentado em quatro doenças

autossômicas recessivas associadas com alto risco de câncer: anemia de Fanconi, síndrome de Bloom,

xeroderma pigmentosum e ataxia telangiectasia. Apesar das diferenças clínicas e genéticas entre estas

quatro doenças, elas são, muitas vezes, tratadas juntas, não só pelo aumento na freqüência de

alterações cromossômicas, como também pelo risco aumentado dos pacientes desenvolverem câncer

(Schroeder, 1982; Heim et al.,1992).

German (1969) sugere que xeroderma pigmentosum e síndrome de Down sejam chamadas de

"síndromes de instabilidade cromossômica condicional", por que as taxas de aberrações

cromossômicas espontâneas nestas duas síndromes não são elevadas, mas as taxas de aberrações

induzidas por exposição mutagênica são mais altas que em células normais. A síndrome de Down é a

anormalidade cromossômica mais comum no homem, sendo a principal causa de retardo mental.

Caracteriza­se pela trissomia do cromossomo 21 e ocorre com uma freqüência de 1/700 nascidos

vivos. A predisposição dos indivíduos portadores desta síndrome para desenvolver leucemia é bem

conhecida (Heidemann et al., 1985).

A anemia de Fanconi caracteriza­se como uma doença autossômica recessiva, envolvendo

pancitopenia progressiva e uma série de malformações congênitas em vários sistemas, como o sistema

nervoso central, musculoesquelético, urogenital, renal, tegumentário, cardíaco, ocular, auditivo e

gastrointestinal, e pré­disposição ao desenvolvimento de câncer, especialmente leucemia mielóide

aguda (LMA) (Fanconi, 1927; Auerbach e Allen, 1991). Alguns distúrbios mitóticos, como pontes

entre núcleos, fragmentos aberrantes e micronúcleos foram observados em medula óssea de pacientes

com anemia de Fanconi, já em 1966, por Schroeder. Tem sido sugerido que uma deficiência no

sistema de reparo ou processamento de DNA danificado esteja associado a um aumento na incidência

de câncer, e também com várias anormalidades clínicas. Um aumento no nível de aberrações

cromossômicas espontâneas tem sido detectado em cultura de linfócitos e fibroblastos obtidos de

pacientes com anemia de Fanconi (Schroeder et al., 1964; Zakrzewski e Sperling, 1989; Arwert e Kwee, 1989; Natarajan et al., 1989).

22

Em adição, instabilidade cromossômica tem sido descrita em pacientes com variados tipos de

câncer (Hsu et al., 1985; Delhanty et al., 1983). Em fibroblastos cultivados, de pacientes com melanoma, foi descrito um aumento espontâneo nas taxas de micronúcleos e um aumento na

sensibilidade a UV­A e UV­B, quando comparados a controles normais (Roser et al., 1989).

1.2 Exposição a agentes genotóxicos no ambiente

A espécie humana tem atravessado sua evolução sendo exposta a uma infinidade de

genotóxicos pela ingestão de alimentos e bebidas (contaminantes naturais da dieta), e pela inalação de

fumaças e irradiações diversas do meio ambiente. A análise de alterações citogenéticas devidas a

fatores genotóxicos em uma população requer um valor "normal" de micronúcleos para ser usado

como referência da taxa de mutação basal. Esse valor já estaria influenciado por vários fatores, alguns

destes endógenos, outros exógenos (Koteles, 1993), como estilo de vida, dietas, consumo de fumo e

álcool, várias terapias médicas e até mudanças climáticas (aumento de exposição a radiação

ultravioleta devido à destruição do ozônio atmosférico). Por isso, torna­se relevante: (a) determinar

quais são os níveis aceitáveis de dano genético na população humana; (b) identificar indivíduos que

possam ser hipersensíveis a determinadas genotoxinas; (c) testar, de maneira efetiva, os novos

químicos que estão sendo sintetizados para serem lançados no meio ambiente; (d) monitorar,

rotineiramente, indivíduos expostos a agentes que possam ser perigosos a nível genético e (e)

determinar o nível de aumento na freqüência de alterações genéticas em uma população após

exposição acidental (Fenech, 1993).

O tipo de câncer que predomina na população varia em diferentes partes do mundo: câncer de

estômago é o mais freqüente no Japão, câncer de fígado nos países do sudeste asiático, câncer

nasofaringial no sul da China, câncer da cavidade oral na Índia, e câncer de bexiga urinária no Egito.

Suspeita­se que as diferenças se devam às condições relativas a estilos de vida particulares, ou por

doenças endêmicas específicas de cada região. Desta maneira, câncer de bexiga urinária no Egito está

relacionado à infecção com Schistosoma mansoni, e câncer da cavidade oral na Índia está relacionado ao hábito de mascar tabaco (Doll, 1977).

23

Investigações epidemiológicas resultaram na formulação da hipótese que pôde ser testada no

laboratório: altos níveis de gordura na dieta aumentam o risco de câncer de mama. Guias de dieta, com

respeito à gordura e câncer, costumam considerar a percentagem total de calorias derivadas da

gordura. Por este caminho, obteve­se uma correlação positiva para incidência de morte por câncer de

mama, comparada com a ingestão diária de gordura em populações de diferentes países. Na dieta da

maioria dos países industrializados, o consumo de gordura fica em torno de 40% do total de calorias

diárias, enquanto os guias de dieta recomendam apenas 30%. Resultados de outros estudos

epidemiológicos têm demonstrado correlação entre consumo de gordura e a freqüência de câncer em

outros órgãos, particularmente na próstata e cólon (Renner, 1990).

Durante os últimos dez anos, uma grande variedade de químicos mutagênicos e carcinogênicos

foram sendo detectados nos alimentos, medicamentos, cosméticos, inseticidas e também na atmosfera

e na água que nós utilizamos diariamente. Alguns mutágenos agem diretamente nas células para

produzir mutações, e outros devem ser modificados por enzimas ou outros fatores para se tornarem

cancerígenos. Estes mutágenos indiretos podem ser metabolicamente ativados por enzimas em órgãos

ou tecidos, ou podem ser inativados e inibidos por algum componente de nossa dieta ou por fatores

presentes em nossas células (Kuroda, 1990).

1.3 Fatores que podem influenciar na freqüência de mutações

A seguir seguem alguns fatores que podem influenciar na freqüência de mutações.

1.3.1 Idade

Tem sido demonstrado que a idade afeta significativamente a freqüência da formação

espontânea de micronúcleos ou o dano de DNA em linfócitos de homens e mulheres (Ganguly, 1993).

Anormalidades cromossômicas numéricas surgem, usualmente, devido à não­disjunção durante a

meiose. Tanto células aneuplóides em mitose como não­disjunção em meiose aumentam com o avanço

da idade (Nakagome et al., 1984). Alterações cromossômicas estruturais também apresentaram correlação com a idade (Mattevi e Salzano, 1975). O aumento de mutações com a idade pode também

24

ser devido ao acúmulo de DNA lesado não reparado e/ou à diminuição da capacidade de reparar DNA

(Fenech e Morley, 1985­b). Com a idade, a proporção de células com falta de cromossomos do grupo

C aumenta em mulheres, e a freqüência de não­disjunção meiótica aumenta com o avanço da idade

materna (Trimble e Baird, 1978). No homem, a incidência de não­disjunção pode também aumentar

com o avanço da idade (Matsunaga et al., 1978). Fenech e Morley (1985­b) demonstraram uma

correlação positiva na expressão de micronúcleos em linfócitos, com o aumento da idade. O mesmo

sendo encontrado por Koteles et al. (1993) ao monitorarem uma amostra de 188 indivíduos residentes

em uma área urbana industrial.

1.3.2 Sexo

O "Grupo de Estudos Colaborativos para o Teste de Micronúcleos" (The Colaborative Study

Group for the Micronucleus Test, 1986) demonstrou que existem diferenças entre os sexos quanto às

freqüências de micronúcleos induzidas por algumas drogas em eritrócitos de camundongos. Estas

diferenças são específicas, ou seja, cada droga testada se comporta de maneira diferente, dependendo

dos mecanismos de interação das mesmas com o organismo.

O sexo é um fator que deve ser considerado na escolha dos indivíduos controles, apesar de

geralmente não haver diferença significativa quanto à freqüência de aberrações cromossômicas. Para

troca de cromátides irmãs, há tanto estudos que demonstram não haver diferença entre os sexos

(Galloway e Evans, 1975; Crossen et al., 1977; Livingston et al., 1983), quanto os que demonstram haver esta diferença. Margolin e Shelby (1985) encontraram uma diferença estatisticamente

significante de aproximadamente 0,5 % mais alta em mulheres. Um aumento similar em mulheres foi

também encontrado por Soper et al. (1984). Em estudos onde as diferenças esperadas são pequenas, o pareamento dos controles deve respeitar o sexo. Freqüências mais elevadas de troca de cromátides

irmãs foram também encontradas em mulheres grávidas (Sharma e Das, 1986).

1.3.3 O hábito de fumar

25

O hábito de fumar também pode alterar a freqüência de mutações. Fumar causa uma variedade

de problemas no homem. Desta maneira, um quarto a um terço de todos os fumantes morrem como

resultado do seu hábito (Doll e Peto, 1976). Evidências epidemiológicas têm demonstrado claramente

que o fumo está relacionado com carcinoma bronquial (Doll e Peto, 1976). Com respeito à indução de

câncer de pulmão, pode ser observada uma relação dose­efeito entre o hábito de fumar e a incidência

da doença (Doll e Peto, 1976). Extratos de cigarros demonstraram ter atividade de iniciadores de

tumor em testes com roedores e em células humanas in vitro (Benedict et al., 1975), e no teste de

Ames são mutagênicos na presença de metabolizador preparado a partir de pulmão e fígado de

mamíferos (Hutton e Hackney, 1975; Mizusaki e cols., 1977). Obe e Herha (1978) observaram que

linfócitos de fumantes mostram um aumento significante de cromossomos dicêntricos, anéis e trocas

cromatídicas, indicando uma forte correlação entre a atividade carcinogênica e mutagênica do cigarro.

Larramendy e Knuutila (1991) observaram um aumento na freqüência de micronúcleos, tanto em

linfócitos B como em linfócitos T8 de fumantes, em relação aos controles. O hábito de fumar aumenta

a freqüência de micronúcleos (Cruz et al., 1994).

1.3.4 Bebidas alcoólicas

Várias bebidas alcoólicas têm sido descritas como contendo substâncias mutagênicas (Loquet et

al., 1981; Bull et al.,1987; Obe e Anderson, 1987), mas as evidências indicam que a atividade mutagênica associada a estes produtos não vem do etanol, mas preferencialmente de outros

componentes derivados dos processos envolvidos na produção de bebidas (Yu et al., 1986; Brusick et al.,1988).

Problema relativo a danos de saúde por exposição química está dirigido aos agentes químicos

produzidos ou concentrados, e de uso intensivo, pelo homem. Contaminantes atmosféricos depositados

no solo e na água participam também, via ingestão de alimentos e da água, do conjunto de substâncias

que podem afetar a saúde humana. Na realidade, modelos de exposição humana são complicados, se

considerarmos a quantidade de agentes simples e de misturas complexas envolvidas. O quadro torna­

se mais complicado quando consideramos agentes e exposições agindo sinergisticamente ou

moduladores com efeitos contraditórios de aumento e/ou redução da genotoxicidade. Na avaliação de

26

exposições biologicamente significantes, pode ser mais relevante dar atenção para os primeiros efeitos,

diretamente nos indivíduos ou grupos expostos, do que tentar prever o risco potencial de um modelo

de exposição tão complexo como este. Metodologias aplicáveis ao monitoramento humano ganham

crescente atenção (Sorsa et al., 1990).

A exposição a agentes genotóxicos em nosso ambiente pode causar uma variedade de efeitos

sobre a saúde humana. Alguns deles se expressam imediatamente, enquanto outros levam anos para se

manifestarem. Efeitos tardios bem reconhecidos incluem a indução de câncer, doenças genéticas nas

gerações seguintes, desordens de desenvolvimento, entre outros (Au, 1991). Esforços contínuos têm

sido feitos para identificar os agentes perigosos, reconhecer condições de exposição danosa e

monitorar populações que podem estar sofrendo exposição excessiva, com o objetivo de prevenir

conseqüências adversas sobre a população.

É crescente a preocupação sobre o efeito mutagênico e carcinogênico de agentes genotóxicos

em populações humanas expostas ocupacionalmente, acidentalmente ou por estilo de vida (Carrano e

Natarajan, 1988). Mutação é toda a alteração do material genético de uma célula, que não resulta de

recombinação t

ãoo

t

tçam

m

so ex

ar

tpo ooda

e

m po ã

o

ns po a rgo e o suses m

e

27

destes estágios, embora existam muitos outros fatores envolvidos. Muitos dos agentes potencialmente

carcinogênicos estão presentes na nossa alimentação e no nosso ambiente. Há evidências convincentes

de que o sítio de ação destes agentes é o material genético celular, sendo que muitos dos carcinógenos

químicos conhecidos atuam via mutações (Wigley, 1987).

A freqüência espontânea de aberrações cromossômicas em recém­nascidos é da ordem de 6 por

1000. A análise cromossômica de abortos espontâneos em humanos indica que mais de 50% de todos

os abortos são cromossomicamente anormais (Thompson e Thompson, 1980). Populações expostas à

radiação ionizante e a genotóxicos químicos têm a freqüência de aberrações cromossômicas

aumentada em seus linfócitos. Muitas formas de câncer humano estão associados a aberrações

cromossômicas específicas e não­específicas (Yunis, 1983). Algumas doenças hereditárias humanas,

como as síndromes de instabilidade cromossômica resultam num aumento da freqüência de aberrações

cromossômicas e também estão associadas a um aumento na incidência de câncer. O aumento na

freqüência de alterações citogenéticas em relação a taxa basal da população, pode ser uma indicação

de sensibilidade genética ou de exposição a mutágenos. Estas situações produzem sempre o aumento

do risco de câncer e de doenças genéticas (Carrano e Natarajan, 1988). Segundo Ashby (1991), todos

os produtos que são clastogênicos in vivo são também cancerígenos para o organismo testado.

Nas últimas décadas, a quantidade de produtos químicos produzidos e usados pelo homem

aumentou muito. Estas substâncias podem afetar a saúde humana por sua disseminação no meio

ambiente, mas são os trabalhadores que manipulam rotineiramente estes agentes que constituem o

maior grupo de risco, devido à constante exposição. Testes de mutagenicidade, incluindo

monitoramento citogenético em populações humanas, são de máxima importância para o

conhecimento e prevenção de doenças públicas e ocupacionais (Koteles et al., 1993).

1.4 Métodos de Detecção

1.4.1 Micronúcleo (MN), Pontes Nucleoplasmáticas (PN) e Buds

Dentre os testes que analisam mutações cromossômicas em mamíferos, destaca­se o teste de

micronúcleos em medula óssea de camundongo (Heddle, 1973), que detecta agentes genotóxicos

28

clastogênicos e os que interferem na formação do fuso mitótico, afetando a distribuição eqüitativa dos

cromossomos na divisão celular. O ensaio serve como primeiro passo no estudo de compostos

mutagênicos, tendo a vantagem de ser mais rápido do que a análise de quebras cromossômicas

(clastogênese), sendo mais eficiente para detectar a perda de cromossomos inteiros (aneugênese)

(Maluf, 1994).

Micronúcleos são fragmentos cromossômicos ou cromossomos inteiros perdidos durante a

divisão nuclear (Migliore et al., 1991). São formados durante a anáfase pela falha da ligação ao fuso mitótico. Derivam de fragmentos de cromossomos ou cromossomos inteiros que foram perdidos

durante esta fase (Norppa, 2003). Na análise microscópica, pela formação de carioteca ao seu redor, é

possível a visualização de um pequeno núcleo que pode ter um diâmetro entre 1/16 e 1/3 do diâmetro

dos núcleos principais. Acredita­se que estas estruturas também podem ser formadas na fase S da

replicação celular, através da amplificação gênica, projetando buds nucleares, os quais possivelmente

serão cortados após a telófase (Schubert e Oud, 1997). Já as pontes nucleoplasmáticas representam

cromossomos dicêntricos que tiveram os centrômeros puxados para os pólos opostos da célula em

anáfase. Aproximadamente 60% das amostras que contêm esta difusão também apresentam

micronúcleos, pois quebras são necessárias para que os cromossomos dicêntricos sejam formados e,

ambos ocorrem em células expostas a agentes causadores de quebras no DNA, como radiação

ionizante (Maluf, 2004).

A freqüência de micronúcleos em linfócitos do sangue periférico humano foi estudada por

Countryman e Heddle (1976), que observaram o efeito da radiação­X e mitomocina C in vitro, mostrando a possibilidade de se medir dano cromossômico através da análise de micronúcleos em um

tecido de mais fácil acesso, já que, originalmente a técnica de micronúcleos tinha sido descrita apenas

para eritrócitos de medula óssea, em 1975 por Schmid. A dificuldade desta técnica era distinguir as

células que, em cultura, haviam passado por um ciclo de divisão, daquelas que não haviam se dividido,

o que torna difícil quantificar a freqüência de micronúcleos com o propósito comparativo (Maluf,

1994).

A expressão de micronúcleo pode ser conseqüência de aberrações cromossômicas causadas por

quebras de DNA (clastogênese) ou por disfunção de fuso mitótico, caracterizando a perda de

29

cromossomos inteiros (aneugênese) (Surralés, 1992). Além da detecção de eventos clastogênicos e

aneugênicos, o micronúcleo pode expressar amplificação gênica. Com o bloqueio da citocinese, é

possível analisar aquelas células que completaram apenas uma divisão e se apresentaram binucleadas

(Norppa, 2003).

A freqüência de MN nas células humanas iniciou de um critério de testes citogenéticos por

monitorização de populações de risco. O teste de micronúcleo com o bloqueio da citocinese (CBMN)

é o método preferido para mensurar micronúcleos em cultura de células humanas, pois a contagem é

restritamente específica para uma divisão celular. Estas células são reorganizadas pelo aparecimento

de binucleações após a inibição das citocinas pelas citocalasina­B (Maluf, 2004).

Comparando com outra técnica citogenética, o ensaio de MN possui várias vantagens sobre a

quantificação de MN, incluindo a rapidez a facilidade da análise, e sem o requerimento de células em

metáfase (Tucker e Preston, 1996). Diferentes mecanismos podem ser envolvidos na formação do

micronúcleo (Heddle et al; 1983; Evans, 1988) incluindo o rompimento cromossômico (clastogênese)

e ruptura do fuso (aneuploidogênese). As vantagens observadas no ensaio de bloqueio da citocinese é

descrito por Fenech (1997): identificação confiável das células que foram completadas apenas em uma

divisão celular, sensitividade, precisão e detecção de outros pontos finais tal como as pontes

dicêntricas.

Os linfócitos de sangue circulante de mamíferos, inclusive o homem, são um ótimo sistema para

se testar uma substância quanto à sua capacidade em produzir aberrações cromossômicas. A técnica

serve também para o monitoramento de populações expostas a drogas, seja por razões profissionais,

terapêuticas ou por acidente (Natarajan e Obe, 1980). Supondo­se que haja uma correlação entre o

dano induzido no sangue e em outras células somáticas, os linfócitos serviram como um sistema

sentinela para grupos de alto risco (Nordenson et al., 1984).

Os linfócitos do sangue periférico encontram­se em um estágio de repouso, pré­síntese (G0). Ao

serem colocados em cultura, na presença de fitohemaglutinina (PHA) são estimulados, sintetizam

RNA, proteína e DNA; após cerca de 48 horas estão, na maioria, em sua primeira mitose. A PHA

estimula, principalmente, os linfócitos T, que constituem de 40 a 70% da população total de linfócitos

31

O dano de DNA induzido por agentes genotóxicos depende do transporte entre as

membranas celular e nuc

32

A utilização do ensaio cometa também está sendo desenvolvido em estudos relacionados a

intervenção dietética, no monitoramento do aumento dos danos de DNA resultando em doenças ou

tratamento com drogas genotóxicas e no monitoramento de grupos ou indivíduos expostos a

substâncias genotóxicas devido ao estilo de vida, poluição ambiental ou ocupacional tem aumentado

substancialmente (Faust, 2004).

Geralmente, células com altos níveis de dano de DNA exibem um aumento dos parâmetros de

cometa, cujo pode ser expresso pelo comprimento da cauda, porcentagem de DNA na cauda e o

momento da cauda (comprimento da cauda X %DNA na cauda), ou simplesmente dano alto, médio ou

baixo (Fairbairn et al., 1995).

Os efeitos da interação do DNA com as drogas são observados em diferentes níveis. O primeiro,

o nível mais básico, é a interação química da droga com o DNA dupla hélice. Variedade de técnicas

tem sido desenvolvidas para examinar os níveis de interação, e é mostrada qual a química da interação

que é mais similar do estudo da região exposta do DNA ou das células em cultura. Alcalização de

sítios específicos e seqüências em células podem ser examinadas usando ensaio de clivagem térmica

(Nelson et al., 2004).

1.5 Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA)

A síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) é uma doença retroviral, causada pelo vírus

da imunodeficiência adquirida (HIV), caracterizada por imunossupressão profunda, que leva a

infecções oportunistas, neoplasias secundárias e manifestações neurológicas (Melo, 2002).

As tentativas atuais de terapia gênica para desordens infecciosas são predominantemente

dirigidas ao tratamento de pacientes com SIDA. O agente infeccioso dessa desordem, geralmente fatal,

é uma classe de retrovírus conhecida como HIV­1, capaz de infectar linfócitos T auxiliares, um

subgrupo fundamental de células do sistema imune. Duas características do HIV­1 o tornam

especialmente mortal: ele acaba por matar as células T auxiliares (tornando os pacientes suscetíveis a

outras infecções) e o pró­vírus tende a persistir em um estado latente antes de ser subitamente ativado

(a ausência de produção de vírus durante o estado latente complica o tratamento com drogas

33

antivirais). Um problema importante reside no fato de o genoma do HIV estar mutando com uma

freqüência extremamente elevada (Melo, 2002).

A estrutura genômica típica do vírus HIV­1 consiste de duas monofitas idênticas de RNA, com

aproximadamente 9,2 kb de comprimento, que, supostamente existe na forma de uma

ribonucleoproteína contendo as enzimas RT, integrase, protease e a proteína p7 de ligação ao RNA

(Peçanha et al., 2002). Envolvendo o genoma, e suas enzimas associadas, há um cerne ou capsídeo

formado pela proteína p24, que está contido em uma matriz protéica (proteína p17) circundante.

Finalmente, a parte mais externa do vírus é formada por um envelope de membrana fosfolipídica

(derivada das células do hospedeiro), contendo proteínas de membrana (gp41 e gp120) – codificadas

pelo genoma viral – que se ligam às moléculas de CD4 da membrana do hospedeiro (Peçanha et al.,

2003).

A infecção se inicia com a ligação das subunidades da proteína gp120 às moléculas de CD4 e

seus co­receptores de quimiocinas. Em seguida há uma alteração conformacional da proteína gp41 que

se insere na membrana celular (fusão peptídica) e induz a fusão da membrana viral com a membrana

celular da célula hospedeira. Ocorre, então, a liberação do genoma viral no citoplasma da célula. A

partir deste momento são ativadas as enzimas virais do complexo nucleoprotéico, iniciando­se assim o

ciclo replicativo do HIV. O genoma RNA do vírus é transcrito, pela RT viral, formando o DNA viral

de fita dupla que, juntamente com a integrase viral, penetra no núcleo da célula e, com o auxílio desta

enzima, integra­se ao genoma do hospedeiro (Hoffmann et al., 2005).

Em princípio, várias estratégias de terapia gênica poderiam ser utilizadas no tratamento da SIDA.

Como no caso da terapia gênica do câncer, as células infectadas podem ser destruídas diretamente

(pela inserção de um gene codificando uma toxina ou uma pró­droga) ou indiretamente, pela

estimulação de uma resposta imune contra elas. Isso, por exemplo, pode envolver a transferência de

um gene que codifica um antígeno de HIV­1, como a proteína do envoltório viral gp120, e a sua

expressão de um gene codificando uma citocina, como um interferon. (Strachan e Read, 2002).

A suscetibilidade do hospedeiro depende da entrada do HIV nas células através dos receptores de

superfície CD4 (linfócitos T auxiliares) e das quimiocinas. Entre as células que expressam esses

34

receptores estão os linfócitos T, as células de Langerhans e as células dendríticas e outros macrófagos.

Com exceção dos linfócitos T, as outras células podem ser freqüentemente encontradas na mucosa

genital. Assim situações que aumentam a população local dessas células, tais como traumatismos

repetidos ou doenças sexualmente transmissíveis (DSTs) associadas, aumentam a chance de

transmissão do vírus; por outro lado, pessoas que expressam baixo número de tais receptores de

superfície, ou não os expressam, tem menor chance de serem contaminadas. Dessa forma, indivíduos

homozigotos que apresentam mutação no receptor CCR5 (com deleção no alelo ∆32) podem ser mais

resistentes à transmissão sexual, pois não expressam essa quimiocina na superfície celular dos

macrófagos. Por fim, a infectividade da pessoa depende da fase da doença e da quantidade de vírus em

seu organismo. Assim, pessoas no período agudo da infecção têm uma maior chance de contaminarem

outras pessoas, pois apresentam viremias plasmáticas extremamente elevadas. Da mesma forma,

pessoas com SIDA (fase avançada da doença) têm chance maior de contaminar outros (Sprinz et al., 1999).

O mecanismo bioquímico de algumas células linfóides desestabiliza seu genoma em pacientes

infectados pelo vírus HIV. Os linfócitos de pacientes HIV+ são caracterizados por uma intensa

liberação de radicais oxidativos juntamente com a ativação da xantina oxidase. Estas mudanças

aumentam com o progresso da doença com o estágio máximo da SIDA. O grau das manifestações

bioquímicas da instabilidade genômica aumenta na dinâmica da infecção pelo HIV (Kozhemiakin e

Bondarenko, 1992).

O sarcoma de Kaposi (SK) e o Linfoma de não­Hodgkin (LNH) são os cânceres relacionados

diretamente com pacientes HIV+, e considerados endêmicos (Spina, 1999). Outros específicos

cânceres também ocorrem em grande proporção, mas o risco paterno depende da região geográfica e

qual a exposição do grupo HIV estudado (Biggar, 2000; Frisch, 2001). De acordo com Spina (1999),

três malignidades são consideradas em pacientes com SIDA: SK; grau intermediário ou alto de células

B no LNH; câncer cervical invasivo (CCI).

Pacientes com HIV têm propensão ao desenvolvimento de neoplasia do sistema linfático,

presumivelmente devido à ativação da infecção do vírus Epstein­Barr (EBV) que está latente. O SK

pode desenvolver­se devido ao vírus da herpes humana tipo 8, ou a neoplasia anogenital pode estar

35

relacionada a infecção pelo papiloma vírus (HPV). Infecções persistentes de viroses de DNA como o

HPV, EBV, vírus da hepatite B (HBV) e o herpes vírus do sarcoma de Kaposi (KSHV), tem implicado

na carcinogênese em humanos. O genoma das viroses de DNA oncogênicas estão integradas e formam

uma forte ligação com o grupo do genoma celular. Infecções sozinhas não são suficientes para causar

uma transformação neoplásica a menos que esteja acompanhada de mutações somáticas e eventos

epigenéticos, facilitados pela exposição de outros cofatores ambientais e alterações no mecanismo

imune (Beebe­Dimmer e Schottenfeld, 2006).

Pacientes com HIV possuem um risco consideravelmente maior de desenvolver um câncer

comparado a outras pessoas (Frisch, 2001). A infecção pelo vírus HIV está intimamente associada

com uma elevação do risco de desenvolvimento de linfomas sistêmicos da doença de Hodgkin e

também de linfomas primários no sistema nervoso central (Parekh et al., 2003). Além disto, alguns estudos demonstraram que, em situações nas quais os indivíduos têm seu sistema imunológico muito

debilitado, aumentam até cem vezes os riscos de desenvolverem cânceres associados ao vírus. Em uma

pesquisa realizada com dois grupos de pacientes imunossuprimidos para avaliar a incidência de SK –

um grupo de pessoas infectadas pelo HIV e outro de pessoas que receberam transplantes de órgãos e

utilizavam drogas imunossupressoras para evitar a rejeição – ficou demonstrado que o SK foi quase

quatro vezes mais freqüente em indivíduos infectados pelo HIV do que em transplantados, tornando

evidente que o HIV é um agente potencialmente indutor deste tipo de neoplasia (Serraino et al., 2005).

Neste mesmo estudo evidenciou­se que o desenvolvimento do SK em indivíduos HIV+ é

significamente mais baixo em mulheres do que em homens, porém há um aumento significativo do

risco relacionado com a idade. E o histórico individual da administração de drogas anti­retrovirais é

consistentemente associado com a redução do risco ao SK (Serraino et al., 2005; Spin, 1999).

De acordo com Hoffmann et al. (2005), as drogas antire­trovirais não diminuem significamente o risco de desenvolver o LNH e o SK. E conclui que pacientes com SIDA terão uma sobrevida maior,

porém o índice de linfomas malignos serão as principais causas de morbidade e mortalidade no futuro.

36

Um outro agente causador de lesões escamosas intra­epiteliais, de alto e baixo grau, precursoras

de câncer cervical em mulheres, é o HPV. Mulheres infectadas pelo vírus HIV têm um grande risco de

desenvolver câncer cervical em conseqüência de infecções secundárias pelo HPV. O mecanismo pelo

qual a infecção pelo HIV eleva os riscos de neoplasia cervical não é completamente conhecido. Uma

explicação plausível é que a imunossupressão induzida pelo HIV leva a inabilidade em controlar a

expressão do HPV e a produção de oncoproteínas pelo HPV (Hawes et al., 2006).

1.6 Drogas Anti­Retrovirais (ARVs)

Uma das principais armas contra o HIV, que promove uma maior sobrevida nos pacientes, são os

coquetéis para o tratamento da SIDA. Porém a medicação causa muitos efeitos adversos, fazendo com

que vários pacientes abandonem o tratamento (Kotwal, 2005).

O principal objetivo dos ARVs é agir na replicação viral, retardando a progressão da

imunodeficiência e tentar restaurar a imunidade do paciente para aumentar o tempo e a qualidade de

vida dos pacientes com HIV ou SIDA. Assim, a supressão máxima e contínua da replicação viral é

desejável para reduzir ou reverter o dano imunológico (Eron, 1999).

Quadro 1. FDA (Food and Drug Administration) ­ Agentes Anti­Retrovirais Aprovados, Maio 1999.

Inibidor Nucleosídeo da Transcriptase Reversa (NRTIs)

Inibidor não­Nucleosídeo da Transcriptase Reversa (NNRTIs)

Inibidor da Protease (PIs)

AZT (zidovudina, ZDV, Retrovir)

ddI (didanosina, Videx)

ddC (zalcitabina, Hivid)

3TC (lamivudina, Epivir)

d4T (stavudina, Zerit)

abacavir (ABC, Ziagen)

Nevirapina (NVP, Viramune)

Delavirdina (DLV, Rescriptor)

Efavirenz (EFV, Sustiva)

Saquinavir hard­gel cápsulas (SQV­HGC, Invirase)

Ritonavir (RTV, Norvir)

Indinavir (IDV, Crixivan)

Nelfinavir (NFV, Viracept)

Saquinavir soft­gel cápsulas (SQV­SGC, Fortovase)

Amprenavir (APV,

37

Agenerase)

A terapia anti­retroviral em pacientes HIV+ resulta em uma variedade virológica, imunológica, e

benefícios clínicos. A diminuição da concentração do vírus no soro ou no plasma, o aumento da

contagem de linfócitos T­CD4+, melhora no ganho de peso, diminuição da hepatoesplenomegalia e

linfadenopatia, e melhora na associação do HIV com a encefalopatia (Kline, 1998). Os ARVs tem

melhorado a qualidade de vida em indivíduos HIV+. A diminuição da carga viral tem melhorado o

sistema imune e a clínica dos pacientes (Shah, 2005).

O benefício da terapia anti­retroviral potente já foi claramente demonstrado em pacientes com

doença sintomática avançada e naqueles que, apesar de assintomáticos, apresentam imunodeficiência

acentuada (contagem de linfócitos T­CD4+ abaixo de 200/mm 3 ). Para os assintomáticos e com

contagem de linfócitos T­CD4+ acima de 350/mm 3 , os benefícios parecem ser insuficientes para

contrabalançar os potenciais efeitos adversos e o risco de falha terapêuti

i

ato

,

,epsf

i

om ara

afli

A

o

tEcasnass ga erap m conl s

quersi

nob ooaE eç o

içuada

t

o

la a a

d

s

ccni

,

e

ena ói ci mi e

ntis ute s

mmage

, e m cs leus

Sh

iado

cex

ã e n s

c o

e

n

t

i

s e

lióiíf n aado deCo

r x o o s 200/ mm ) . o l n f n c uada , o a t c r t t i e i l en c a ­ C í f de 3 rl t a Sm o 3 em ) ) V+. i . i eda x mi n c i que,zf n c , f o i ado o o o c oEi em f s n f t ad d t s v A s s n x f í o b i n r e t u i i s u o . tdc o , de t b ni a Em vi r í eda i m u . e et a s h s i n o Es a o li uada e o e m i i i R i . i e , s uada m a i r tmma_ x i a do s E de a h ado

hà n n ed t p e )n 3 ab n í c i edo l e

v a_ ha s as nse lca oed s

em

ii

3

38

e Dong, 2001). Pancreatite é mais comum em pacientes que utilizam a Didanosina, Lamivudina e a

Stavudina provoca anemia; a neutropenia é mais comum quando administrado a Zidovudina. Abacavir

pode causar uma reação fatal de hipersensibilidade em aproximadamente 5% dos indivíduos

infectados pelo vírus HIV (Hervey e Perry, 2000).

O AZT também demonstrou ser um potente indutor de anormalidades estruturais dos

cromossomos, em concentrações iguais ou maiores que 3 µg.Ml ­1 , em estudos citogenéticos utilizando

cultura de linfócitos humanos. Nestas mesmas culturas, a ddI (didanosina, 2’,3’­didesoxiinosina), em

altas concentrações (≥ 5000 µg.Ml ­1 ), elevou a freqüência de células com mutações cromossômicas

(Farmacopéia USP­DI/98). A análise dos efeitos mutagênicos destas duas drogas, em cultura de

linfoblastos humanos, revelou um aumento complementar da incorporação do AZT no DNA humano e

também um aumento da freqüência de indução de mutações quando as drogas foram utilizadas

associadas em coquetéis, maiores que nas exposições às drogas em monoterapias. Foram observados,

como sítios­alvo de mutagênese induzida, o gene hipoxantina­guanina fosforribosiltransferase (HPRT) ligado ao cromossomo X e dois genes autossômicos, timidina quinase (TK) e adenina

fosforribosiltransferase (APRT). Os níveis de incorporação do AZT e ddI, mensuradas por radioimunoensaio, demonstraram aumentos nas taxas de incorporação de AZT no DNA (Meng et al., 2000 a e b; Olivero et al., 1999). Também nos ensaios para HPRT e TK foram observados efeitos mutagênicos em culturas de células expostas ao AZT, ou doses equimolares de AZT combinado com

ddI, em exposições a concentrações variando de 3 a 30 vezes os níveis máximos encontrados no

plasma humano (Meng et al., 2000 a e b).

Vpr, um gene presente no HIV tipo1, induz a anormalidade do ciclo celular pelo acúmulo de

células na fase G2­M. Mari Shimura (1999) identificou que o Vpr causa formação de micronúcleo e

aneuploidia. Também induz quebras cromossômicas e amplificação gênica. A expressão do Vpr induz

aumento de mais de 10 dobras resistentes às colônias para N­(phosphonacetyl)­L­aspartato, e inibição

da síntese da pirimidina (Shimura et al., 1999).

O dideoxynucleosídeo azidothymidina (AZT; Zidovudine) é uma droga que induz a formação de

MN em células eritróides de ratos com uma dosagem baixa (terapêutica). Não foram observadas

mudanças significativas na freqüência de micronúcleos no grupo controle, enquanto a continuação do

micronúcleo na entrada para o sangue periférico permanece com níveis secundários. Mutuamente, os

39

ratos tratados com AZT exibiram uma estatística significante no aumento de líquido nas células com

micronúcleo acima do curso da dosagem dos eritrócitos com a alta incidência de micronúcleos que

entram no sangue periférico. (Dertinger et al., 1996).

O AZT, sozinho ou combinado com uma outra droga anti­retroviral, é usado em recém­nascidos

para prevenir a transmissão do vírus HIV tipo1 da mãe para o filho. O AZT é mutagênico in vitro e

mutagênico e carcinogênico quando administrado em ratos neonatais (Von Tungeln et al., 2004).

1.6.2 AZT+3TC

A associação zidovudina/lamivudina (AZT/3TC) foi considerada a dupla de análogos de

nucleosídeos de primeira escolha para compor o esquema triplo inicial. O perfil favorável de

toxicidade de ambos NRTI, a facilidade de adesão à combinação e a larga experiência com ela

justificam esta opção (Ministério da Saúde).

Um dos componentes padrões no tratamento para a SIDA é o 3TC, segunda geração de

nucleosídio análogo da inibição da NRTI que é substancialmente melhor farmacologicamente que o

AZT e os inibidores da dideoxinucleotídeo. 3TC também é um potente inibidor da polimerase

hepadnavirus. Foi observado que o tratamento com 3TC mostra uma redução acentuada do HBV. A

resistência inicial ao 3TC está associado à substituição da isoleucina pela metionina na posição 184 da

transcriptase reversa do vírus HIV – 1, que resulta na troca de uma base simples (ATG – ATA)

(Serafianos, 1999).

O tratamento com 3TC é um efetivo inibidor da replicação do vírus HIV, e associado com a

dideoxycytidine (ddC) e AZT mostra efetividade contra o HIV pois podem fosforilar para resultar em

5’­tripfosfato, cujo inibe competitivamente sobre a transcriptase reversa viral (Hart, 1992).

A transcriptase reversa é uma enzima que copia o genoma de fita simples do RNA do retrovírus

para dentro do DNA dupla­fita. Nesta enzima pode ocorrer mutações, causando resistência do HIV­1

ao tratamento com 3TC (Essink, 1997).

40

1.6.3 d4T

O AZT e o 2’,3’­didehydro­3’deoxthymidine (d4T; Stavudina) tem mostrado eficácia clínica em

pacientes com infecção do vírus HIV e também é utilizado em conjunto com outras drogas. Estudos

clínicos e básicos indicaram que o AZT tem o potencial de cruzar as barreiras sangüíneas do cérebro e

do fluído cérebro­espinhal e consegue entrar no cérebro. Porém o d4T é bem distribuído no organismo,

mas não tem habilidade de entrar no fluído cerebral (Thomas, 1998).

A Stavudina é uma piramidina nucleosídica, um potente agente anti­retroviral com ativação in vitro contra o HIV e é similar à Zidovudina (Horton et al., 1995; Kline, 1995). De acordo com Kline (1995), esta droga é bem tolerada e não possui dose clínica relatada ou eventos laboratoriais adversos

como a Zidovudina. A ativação da Stavudina é mensurada indiretamente pela contagem de linfócitos

T­CD4+ e pelas mudanças na concentração do antígeno sérico p24, e conclui que a Stavudina mostra­

se muito eficaz no tratamento de infecções por HIV em crianças.

1.6.4 EFV

Muitas drogas antire­trovirais, incluindo a efavirenz (EFV), estão associadas ao aumento dos

lipídios séricos. A EFV, uma inibidora não­nucleosídea da transcriptase reversa (NNRTI), é a mais

utilizada, pois promove maior eficácia e tolerabilidade. Também é um indutor do citocromo P450

(CYP) e 3A4 (Gerber, 2005; Wire, 2004), e também reduz as concentrações do inibidor da protease no

plasma, incluindo o APV, indinavir, lopinavir e o atazanavir (Wire, 2004).

O regime alimentar é necessário quando é administrado a EFV devido a sua alta potência, a

longa meia­vida e o potencial de efeitos adversos associados com o inibidor da protease. Porém, o

princípio genético para a resistência à droga é baixa com a EFV do que com o inibidor da protease: a

mutação simples no gene da transcriptase reversa do HIV­1 produz altos níveis de resistência

fenotípica para a entrada do inibidor não­nucleosídico da transcriptase reversa na classe de agentes,

enquanto a importância clínica da resistência do inibidor da protease geralmente requer múltiplas

mutações (Lucas, 2001).

41

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a freqüência de instabilidade genômica, através da técnica de micronúcleos com

bloqueio de citocinese e ensaio do cometa, em indivíduos HIV+ com e sem o uso de drogas anti­

retrovirais (ARVs) em relação aos indivíduos controles.

2.2. Objetivos Específicos

Avaliar o efeito genotóxico da contaminação viral através dos índices de dano de DNA medidos

pelas técnicas de micronúcleo e cometa.

Avaliar o efeito das drogas através dos índices de dano de DNA medidos pelas técnicas de

micronúcleo e cometa.

Avaliar o efeito genotóxico de outros fatores como idade, sexo e tabagismo em indivíduos HIV+

com e sem uso de ARVs e no grupo controle através dos índices de dano de DNA medidos pelas

técnicas de micronúcleo e cometa.

42

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Delineamento

O trabalho é um estudo transversal, onde foram analisadas 135 amostras, sendo 34 (25,2%)

indivíduos­controle, 39 (28,9%) indivíduos HIV+ sem tratamento e 62 (45,9%) indivíduos HIV+ com

tratamento. A pesquisa foi realizada na Vigilância Sanitária do Município de Novo Hamburgo, Rio

Grande do Sul – Brasil. Os dados foram coletados a partir do “Questionário de Saúde Pessoal”

publicado pela Comissão Internacional de Proteção a Mutágenos e Carcinógenos Ambientais

(ICPEMC) (Carrano e Natarajan, 1988) e por revisão de prontuários. O protocolo do estudo foi

aprovado pelo Comitê de Ética da Feevale (CEP) e pelo Conselho Nacional de Pesquisa (CONEP).

Todos os participantes receberam e assinaram um “Termo de Conhecimento Livre e Esclarecido”

aprovado pelo Comitê de Ética do Centro Universitário Feevale (Anexo I) e preencheram o

Questionário de Saúde Pessoal (Anexo II). A tabela 1 mostra as características da amostra estudada.

Tabela 1. Características da amostra estudada.

Controles HIV sem medicação HIV com medicação Masculino 13 (38,24%) 15 (38,46%) 36 (58,06%) Feminino 21 (61,76%) 24 (61,54%) 26 (41,94%) Idade 42,97 ± 21,75 37 ± 7,61 38,89 ± 9,88 Fuma 11 (32,35%) 18 (46,15%) 22 (35,48%) Total 34 (25,19%) 39 (28,89%) 62 (45,93%)

Foram coletados 4 mL de sangue periférico dos pacientes HIV+ com e sem uso de ARVs e de

indivíduos controle no início da manhã. Esta quantidade foi suficiente para a realização do Ensaio

Cometa e da técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese (CBMN). O transporte das amostras

43

foi realizado pela executora do estudo nas normas de biossegurança, como também todo o

procedimento das mesmas no Laboratório de Citogenética do Centro Universitário Feevale.

3.2. Procedimentos

3.2.1. Técnica de Micronúcleos com Bloqueio da Citocinese (CBMN)

As freqüências de MN, de núcleos ligados por pontes de material nuclear e de “buds” nucleares

(indicativos de amplificação gênica) foram determinadas em 1000 células binucleadas por indivíduo,

em lâminas feitas a partir de cultura de linfócitos, em meios de cultura RPMI mais aditivos, com

bloqueio da citocines

44

8. Adicionar 4 gotas de Formalina, previamente aquecida a 37°C e agitar;

9. Deixar 5 minutos em banho­maria;

10. Adicionar 5 mL de citrato de sódio já aquecido em banho­maria a 37°C;

11. Ressuspender com pipeta Pasteur;

12. Deixar por 7 minutos em banho­maria;

13. Adicionar 0,5 mL de fixador (3metanol/1 ácido acético);

14. Ressuspender;

15. Centrifugar a 1000 r.p.m. por 7 minutos;

16. Adicionar 5 mL de fixador;

17. Ressuspender;

18. Centrifugar a 1000 r.p.m. por 7 minutos;

19. Desprezar o sobrenadante;

20. Adicionar 5 mL de fixador;

21. Ressuspender;

22. Estocar no congelador com tampa, ou em geladeira por, no mínimo, 15 minutos.

Confecção da Lâmina:

1. Após tirar do congelador, centrifugar a 1000 r.p.m. por 7 minutos;

2. Desprezar o sobrenadante;

3. Adicionar 5 mL de fixador;

4. Ressuspender;

5. Centrifugar a 1000 r.p.m. por 7 minutos;

6. Desprezar o sobrenadante, desta vez deixando aproximadamente 1 mL no tubo;

7. Ressuspender;

8. Pingar duas gotas do material a ser analisado na lâmina, a uma altura de aproximadamente 18

cm;

9. Esperar secar na bancada;

10. Sob a pia, preencher toda a lâmina com o corante Giemsa (20% em água destilada) com uma

seringa;

11. Deixar agir por 4 minutos;

45

12. Desprezar o corante em água corrente abundante, deixando que a água escorra pela lâmina na

horizontal (na direção do dedo para fora);

13. Desprezar o excesso de água batendo a lâmina lateralmente em papel absorvente.

Foram utilizadas lâminas novas, lavadas com detergente e guardadas em álcool 70% no

refrigerador. Para o uso, foram lavadas novamente em água corrente (nas cubetas) e por último, com

água destilada. Estas foram retiradas das cubetas com pinça e permanecem com o lado superior

molhado. Todas as lâminas foram identificadas com o número da amostra.

3.2.2. Técnica do Cometa:

O ensaio cometa foi desenvolvido de acordo com o protocolo padrão de preparação e análise

(Tice et al., 2000). Lâminas foram preparadas pela adição de 300 µl de solução de agarose e colocadas em geladeira para solidificar a solução (5­30 mim à 4ºC). Uma mistura de 5 µl de sangue total com 95

µl de 0,7% agarose low­melting­point foi adicionado à lâmina. A lamínula foi imediatamente

adicionada e após a lâmina foi novamente colocada na geladeira por 5 min para que a agarose

solidificasse. Depois de transcorrido este tempo a lamínula foi retirada e as lâminas foram submersas

na solução de lise que estava previamente preparada na geladeira (2,5 M NaCl, 100mM EDTA, 10mM

Tris, pH 10,2, com 1% de Triton X­100 e 10% DMSO foi adicionado). Após 1­24h à 4ºC, as lâminas

foram retiradas da solução de lise, e o excesso de líquido foi retirado. As lâminas foram colocadas na

horizontal na cuba de eletroforese à 4ºC e cobertas com tampão alcalino (300 mM NaOH, 1 mM

EDTA, ph>13). O líquido cobre as lâminas, que ficam expostas ao tampão por 20 min, sem corrente

elétrica. A eletroforese é então iniciada a 25 V e 300 mA (~0,95 V/cm) por 20 min. Esses passos são

realizados sob luz vermelha para evitar dano de DNA que a luz branca pode causar. Depois da

eletroforese, as lâminas são gentilmente retiradas da cuba e um tampão neutralizador (0,4 M Tris, pH

7,5) é adicionado sobre as lâminas três vezes, com intervalo de 5 min cada vez. As lâminas são lavadas

também três vezes com água destilada e colocadas para secar por 24 h à temperatura ambiente. Após,

são fixadas e coradas com o corante de prata, de acordo com Nadin et al. (2001). Para a avaliação do dano de DNA, 100 células por indivíduo foram analisadas com o microscópio óptico em aumento de

400x. As células foram classificadas em cinco classes, a partir da intensidade do dano: nenhum dano =

46

0; dano máximo = 4. Depois da análise, os valores obtidos na contagem dos danos podem ir de 0 a 400

(Figura 2) (Maluf e Erdtmann, 2001).

Figura 2: Técnica do Cometa. As imagens foram obtidas do laboratório de Citogénetica do Centro Universitário Feevale.

As lâminas de pacientes e controles foram analisadas e os valores foram tabulados para posterior

avaliação estatística. Os testes utilizados foram não­paramétricos. Para a análise de correlação entre

variáveis quantitativas foi realizado o teste de correlação de Pearson e Spearman, para analisar a

diferença entre dois grupos foi utilizado o teste de Mann­Whitney. Para as análises foi utilizado o

programa SPSS versão 10.0.

47

4 RESULTADOS

Quando comparamos os pacientes HIV+ com e sem medicação com o grupo controle, não

encontramos diferença significativa para nenhum dos indicadores de dano de DNA da técnica de MN.

Porém, ficou evidenciada a diferença significativa entre estas duas amostras para o índice de dano

medido pelo ensaio cometa (p=0,016). Outros resultados gerais como as médias e os desvios padrões

dos grupos HIV+ e controle, assim como os níveis de significância estatística encontrados quando

comparamos as amostras, estão apresentados na Tabela 2. As alterações medidas pela técnica CBMN

estão apresentadas em forma de médias e desvios­padrão, obtidas a partir de valores absolutos da

contagem de 1000 linfócitos binucleados por indivíduo. Mesmo as anomalias encontradas em células

com mais de dois núcleos, seguem as médias e desvios­padrão da contagem geral de 1000 células

binucleadas, ou seja, a contagem de todas as anomalias era feita até ser encontrado o linfócito

binucleado de número 1000, em cada indivíduo. Os índices de dados da técnica do cometa

apresentados são obtidos através do somatório dos dados observados em 100 células por indivíduo e

na Tabela 2 estão apresentados em forma de média.

Tabela 2. Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e índice de dano de DNA do Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+.

Controles HIV+ p Cometa 9,62±8,96 (n=34) 33,61±44,87 (n=101) 0,016 PN 0,88±0,88 (n=25) 1,13±1,34 (n=38) 0,800 BUD 1,32±1,35 (n=25) 1,92±1,95 (n=38) 0,213 MN 3,80±2,04 (n=25) 3,13±2,02 (n=38) 0,233

A média das freqüências de micronúcleos, pontes dicêntricas e buds e o índice de dano de DNA

medido pela técnica do cometa dos pacientes HIV+ sem e com medicação e indivíduos controle estão

apresentados na Tabela 3.

48

Encontramos diferença significativa no dano medido pelo ensaio cometa quando comparado os

grupos HIV+ sem medicação e controle (p=0,007). Para esta técnica a média e o desvio­padrão foi de

38,03±45,43 e 9,62±8,96, respectivamente. Os grupos HIV+ sem medicação e controle apresentaram

como médias para MN, PN e BUD os seguintes valores: 3,71±1,96 e 3,80±2,04 (p=1,000); 1,35±1,62

e 0,88±0,88 (p=0,655) e 1,94±2,16 e 1,32±1,35 (p=0,323), respectivamente. As médias não

apresentaram diferença estatística significante (Tabela 3).

Tabela 3. Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensai

49

obtivemos diferenças estatisticamente significativas (cometa: p=0,751; MN: p=0,070; PN: p=0,950;

BUD: p=0,418).

Os pacientes HIV+ sem e com medicação possuem média das células T­CD4+ igual a

415,29±205,38 e 388,84±299,38, respectivamente (p=0,169) (Tabela 4). A média da carga viral (CV)

dos respectivos grupos foi de 26.987,93±40.909,37 e 5.818,73±26.734,74, apresentando diferença

significativa, com p<0,001 (Tabela 4).

Tabela 4. Comparação da taxa de células TCD4+ (mm³) e Carga Viral (cópias/mL) entre os grupos HIV+ sem e com medicação.

HIV+ sem medicação HIV+ com medicação p

T­CD4+ 415,29±205,38 (n=35) 388,84±299,38 (n=56) <0,169

Carga Viral (CV) 26.987,93±40.909,37 (n=34) 5.818,73±26.734,74 (n=51) <0,001

Foram testadas as correlações entre os grupos HIV+, HIV+ sem medicação e com medicação em

relação à CV. Nesta análise não houve uma correlação estatisticamente positiva para estes dados. Este

resultado também foi encontrado quando testado os referidos grupos com a taxa de T­CD4+.

4.1. Sexo

Considerando toda a amostra (grupos controle, HIV+ sem e com medicação), os indivíduos do

sexo masculino apresentaram uma média de 3,34 (n=32) linfócitos binucleados com micronúcleos e

um desvio padrão de 1,86, enquanto os do sexo feminino, uma média de 3,45, com desvio padrão de

2,23. Não ficou evidenciada diferença estatisticamente significante entre os sexos, quanto a freqüência

de micronúcleos, pontes dicêntricas, buds e ensaio cometa (Tabela 5).

Tabela 5. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+ sem medicação e com medicação em relação ao sexo.

Cometa MN PN BUDS

Masculino 25,77±34,99 (n=64) 3,34±1,86 (n=32) 1,12±1,18 (n=32) 2,03±2,06 (n=32)

Feminino 29,20±44,89 (n=71) 3,45±2,23 (n=31) 0,94±1,18 (n=31) 1,32±1,30 (n=31)

Total 27,57±40,39 (n=135) 3,40±2,04 (n=63) 1,03±1,18 (n=63) 1,68±1,75 (n=63)

50

Quando avaliamos o grupo controle em relação ao sexo, também não observamos diferença

estatística. Indivíduos do sexo masculino e do sexo feminino apresentaram as seguintes médias e

desvios­padrão para a técnica do cometa, MN, PN e BUD: 9,62±6,44; 3,57±1,62; 1,00±1,00 e

1,86±1,35, respectivamente (Tabela 6).

Tabela 6. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo controle em relação ao sexo.

Cometa MN PN BUDS

Masculino 9,62±6,44 (n=13) 3,57±1,62 (n=7) 1,00±1,00 (n=7) 1,86±1,35 (n=7)

Feminino 9,62±10,37 (n=21) 3,89±2,22 (n=18) 0,83±0,86 (n=18) 1,11±1,32 (n=18)

Total 9,62±8,96 (n=34) 3,80±2,04 (n=25) 0,88±0,88 (n=25) 1,32±1,35 (n=25)

Não obtivemos valores significativos para o grupo HIV+ em relação ao sexo. As médias e

desvios­padrão estão apresentados na Tabela 7.

Tabela 7. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células do grupo HIV+ em relação ao sexo.

Cometa MN PN BUDS

Masculino 29,88±38,05 (n=51) 3,28±1,95 (n=25) 1,16±1,25 (n=25) 2,08±2,23 (n=25)

Feminino 37,42±51,00 (n=50) 2,85±2,19 (n=13) 1,08±1,55 (n=13) 1,62±1,26 (n=13)

Total 33,61±44,87 (n=101) 3,13±2,02 (n=38) 1,13±1,34 (n=38) 1,92±1,95 (n=38)

Nas tabelas 8 e 9 estão apresentadas as médias e desvios­padrão, e após análise verificou­se que

os dados não apresentam significância estatística.

Tabela 8. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem medicação em relação ao sexo.

Cometa MN PN BUDS

Masculino 27,40±28,85 (n=15) 3,44±2,01 (n=9) 1,11±1,54 (n=9) 2,00±2,69 (n=9)

Feminino 44,67±52,75 (n=24) 4,00±2,00 (n=8) 1,63±1,77 (n=8) 1,88±1,55 (n=8)

Total 38,03±45,43 (n=39) 3,71±1,96 (n=17) 1,35±1,62 (n=17) 1,94±2,16 (n=17)

Tabela 9. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ com medicação em relação ao sexo.

Cometa MN PN BUDS

Masculino 30,92±41,61 (n=36) 3,19±1,97 (n=16) 1,19±1,11 (n=16) 2,13±2,03 (n=16)

Feminino 30,73±49,41 (n=26) 1,00±0,71 (n=5) 0,20±0,45 (n=5) 1,20±0,45 (n=5)

51

Total 30,84±44,66 (n=62) 2,67±1,98 (n=21) 0,95±1,07 (n=21) 1,90±1,81 (n=21)

4.2. Idade

Foi testada a correlação de Pearson entre idade e técnica do cometa, freqüência de micronúcleos,

pontes dicêntricas e buds. Quando correlacionamos as técnicas do cometa e de CBMN de toda a

amostra com a idade, foi observado uma correlação positiva em um dos danos de DNA avaliado pela

técnica de MN, o BUD, com nível de significância igual 0,024. Esta correlação estatística não foi

observada na técnica do cometa (p=0,858), nas PN (p=0,119) e no MN (p=0,169).

Os grupos foram testados separadamente, e quando analisamos apenas o grupo HIV+ não foi

evidenciado correlação estatística significativa para cometa (p=0,453), MN (p=0,716), PN (p=0,581) e

BUD (0,696). O mesmo ocorre quando correlacionamos o grupo HIV+ sem medicação: Cometa

(p=0,829), MN (p=0,500), PN (0,192) e BUD (0,824); e o grupo HIV+ com medicação: Cometa

(p=0,400), MN (p=0,989), PN (p=0,718) e BUD (p=0,748). Porém, quando correlacionamos o grupo

controle com a idade obtivemos valor significativo para BUD, com p=0,010. A técnica do Cometa

(p=0,263), o MN (p=0,377) e a PN (p=0,115) não apresentaram correlações positivas.

4.3. Fumo

Quando relacionamos os indivíduos de todos os grupos em fumantes e não fumantes,

observamos uma diferença significativa para o dano de DNA medido pela técnica de MN (p=0,006),

como observado na Tabela 10.

Tabela 10. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos HIV+ sem e com medicação e controle em relação ao tabagismo.

Cometa MN PN BUDS

Não Fuma 26,69±41,74 (n=84) 3,03±2,13 (n=39) 0,97±1,09 (n=39) 1,51±1,60 (n=39)

Fuma 29,02±38,42 (n=51) 4,00±1,74 (n=24)* 1,13±1,33 (n=24) 1,96±1,97 (n=24)

Total 27,57±40,39 (n=135) 3,40±2,04 (n=63) 1,03±1,18 (n=63) 1,68±1,75 (n=63)

*p<0,05

52

Separamos os grupos para verificar a presença de alguma alteração estatística significativa. O

nível de significância, para a técnica de MN, se manifesta quando comparamos pacientes HIV+ que

fumam com aqueles pacientes HIV+ que não fumam (p=0,033). A técnica do cometa (p=0,956), PN

(p=0,754) e BUD (p=0,611) não apresentou alterações significativas (Tabela 11). Já entre os

indivíduos controle não há diferença significativa entre fumantes e não fumantes para todas as

técnicas: Cometa (p=0,435), MN (p=0,120), PN (p=0,672) e BUD (p=0,970) (Tabela 12).

Tabela 11. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem e com medicação em relação ao tabagismo.

Cometa MN PN BUDS

Não Fuma 33,46±47,13 (n=61) 2,55±1,84 (n=22) 1,05±1,29 (n=22) 1,77±1,97 (n=22)

Fuma 33,85±41,77 (n=40) 3,94±2,02 (n=16)* 1,25±1,44 (n=16) 2,13±1,96 (n=16)

Total 33,61±44,87 (n=101) 3,13±2,02 (n=38) 1,13±1,34 (n=38) 1,92±1,95 (n=38)

*p<0,05

Tabela 12. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células do grupo controle em relação ao tabagismo.

Cometa MN PN BUDS

Não Fuma 8,74±7,21 (n=23) 3,65±2,37 (n=17) 0,88±0,78 (n=17) 1,18±0,88 (n=17)

Fuma 11,45±12,04 (n=11) 4,13±1,13 (n=8) 0,88±1,13 (n=8) 1,63±2,07 (n=8)

Total 9,62±8,96 (n=34) 3,80±2,04 (n=25) 0,88±0,88 (n=25) 1,32±1,35 (n=25)

Quando separamos os grupos de pacientes HIV+ e realizamos a comparação com as técnicas do

cometa, danos de DNA medido pelo MN, observamos que o grupo HIV+ sem uso de medicação não

possui diferença significativa (cometa: p=0,877; MN: p=0,620; PN: p=0,646; BUD: p=0,878) em

relação ao fumo (Tabela 13). E entre os pacientes HIV+ com medicação há diferença significativa nos

fumantes em relação aos não fumantes para a técnica de MN (p=0,020). As outras técnicas

apresentaram os seguintes valores: cometa (p=0,935), PN (p=0,316) e BUD (p=0,502). Estes dados

estão apresentados na Tabela 14.

Tabela 13. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem medicação em relação ao tabagismo.

Cometa MN PN BUDS

Não Fuma 35,95±42,07 (n=21) 3,56±2,01 (n=9) 1,56±1,74 (n=9) 2,11±2,76 (n=9)

Fuma 40,44±50,19 (n=18) 3,87±2,03 (n=8) 1,13±1,55 (n=8) 1,75±1,39 (n=8)

53

Total 38,03±45,43 (n=39) 3,71±1,96 (n=17) 1,35±1,62 (n=17) 1,94±2,16 (n=17)

Tabela 14. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células dos grupos HIV+ com medicação em relação ao tabagismo.

Cometa MN PN BUDS

Não Fuma 32,15±50,04 (n=40) 1,85±1,41 (n=13) 0,69±0,75 (n=13) 1,54±1,27 (n=13)

Fuma 28,45±33,67 (n=22) 4,00±2,14 (n=8)* 1,38±1,41 (n=8) 2,50±2,45 (n=8)

Total 30,84±44,66 (n=62) 2,67±1,98 (n=21) 0,95±1,07 (n=21) 1,90±1,81 (n=21)

*p<0,05

54

5 DISCUSSÃO

Aproximadamente 15% dos cânceres humanos são associados a infecções por vírus. Nas últimas

décadas, uma grande série de dados experimentais e epidemiológicos tem apontado vários vírus

humanos como agentes causais de tumores específicos (Hilleman, 1998).

Os mecanismos através dos quais os vírus podem contribuir para o desenvolvimento de tumores

no homem incluem a inflamação crônica, o estímulo da proliferação celular, a alteração da resposta

imune e o acúmulo de mutações na célula infectada. Pacientes infectados com o vírus HIV apresentam

um risco maior de desenvolver certos linfomas. De fato, a tríade infecção viral, exposição a um

carcinógeno e deficiência imunológica do hospedeiro está presente em muitos tumores (Boccardo e

Villa, 2006).

A partir deste contexto, comparamos 101 pacientes HIV+ com 34 controles, e obtivemos uma

diferença estatisticamente significante (p=0,016) para o índice de dano medido pela técnica do cometa.

Este resultado pode estar indicando tanto um efeito do vírus, quanto um efeito das drogas utilizadas.

Quando separamos os pacientes HIV+ sem e com tratamento, observamos que o grupo constituído

pelos pacientes HIV+ sem o uso de ARVs tem um índice de dano de DNA maior do que os pacientes

que já estão em tratamento. Este fato é devido à ação do vírus sobre as células, pois pacientes que não

administram os ARVs permitem que o vírus atue de forma mais agressiva sobre as células. Nosso

estudo deve ser analisado a partir de dois grupos amostrais: em um deles a ação do vírus pode ser

observada de maneira isolada, tendo interferência apenas dos mesmos fatores que interferem no dano

de DNA na amostra controle; no outro grupo amostral, temos uma diminuição da ação do vírus e o

acréscimo da ação das drogas como fatores que influenciam no dano de DNA.

55

A técnica do cometa detecta principalmente quebras de cadeia simples, uma lesão de DNA que

pode ser efetivamente reparada pelas células, enquanto que a técnica de micronúcleos detecta o

resultado das lesões, como micronúcleos, pontes dicêntricas e buds nucleares, que não são reparáveis.

Portanto, os resultados encontrados com o ensaio cometa são um indicativo de dano de DNA

aumentado em pacientes HIV+. De um modo geral, é importante salientar os altos valores de desvio

padrão na técnica do cometa, que refletem uma grande variação inter­individual, que é um achado

freqüente quando esta técnica é utilizada (DeMéo, et al., 1991; Tice, 1995; Vaghef, et al., 1997).

Quando comparado os grupos HIV+ com medicação e controle, notamos que os valores para a

técnica do Cometa e MN se aproximaram do nível de significância (p=0,078 e p=0,061,

respectivamente). Em relação ao grupo amostral sem tratamento, podemos dizer que o dano de DNA

medido pela técnica do cometa está menor, porém parece haver um aumento na freqüência de

alterações estabelecidas não reparáveis, medidas pela freqüência de micronúcleos. Esse achado pode

estar relacionado com o fato de que os pacientes que estão sendo tratados foram contaminados com o

vírus há mais tempo, estando, portanto, expostos a um agente genotóxico biológico e, posteriormente,

a agentes genotóxicos químicos por um período maior de tempo.

Na Tabela 4 está evidenciado que a média da CV está aumentada em pacientes HIV+ que não

administram os ARVs (p<0,001), porém a taxa de T­CD4+ não mostrou alterações significantes. Este

resultado está de acordo com a alteração encontrada no grupo HIV+ sem medicação, os quais estão

apresentando maior dano genômico. A combinação dos ARVs deve ser suficiente para suprimir a

replicação viral abaixo dos limites de detecção do teste (<50 cópias/mL). A supressão máxima diminui

a evolução viral, limitando o potencial para a seleção de cepas virais resistentes, pois o

desenvolvimento de resistência à determinada droga pode diminuir a potência de outras drogas

(principalmente dos ARVs com mecanismo de ação semelhante). Porém, Hatano et al (2000) apresentaram em seu estudo que a replicação viral ativa pode persistir em vários locais do organismo

(células mononucleares do sangue periférico, fluido cerebroespinhal, nódulos linfáticos) depois de

baixos níveis de viremia. Outro estudo aponta que a replicação viral inicia quando é retirada as drogas

ARVs.

56

Não percebemos diferença significativa nas drogas analisadas individualmente, isto é, não

detectamos alterações estatísticas quando um paciente HIV+ administrava alguma droga em

específico. Este resultado foi contraditório aos estudos feitos por Von Tungeln et al. (1997), o qual

observou que o AZT é mutagênico in vitro e carcinogênico quando administrado em ratos neonatais. Nossos dados apresentam muitos fatores que podem influenciar nas taxas de dano de DNA, por isso,

talvez fosse necessário o aumento no tamanho das amostras que utilizam determinada droga para

detectar o dano de DNA causado por cada uma delas. Entretanto, os pacientes que utilizam a droga

ARV 3TC apresentaram uma diferença estatisticamente próxima do significativo para a técnica de

MN, com p=0,070. Este resultado demonstra que esta droga pode estar promovendo um maior dano de

DNA sobre as células. De acordo com Hoffman et al (2005), a Lamivudina (3TC) desenvolve resistência rapidamente: somente um único ponto de mutação é requerido (M184V), entretanto esta

mutação pode aumentar a sensibilidade de alguns vírus AZT­resistentes, reduzindo a adaptação viral e

tornando a droga bastante eficiente.

Segundo a literatura, a supressão da viremia plasmática para a redução de níveis detectáveis é

conseguido em pacientes HIV+ tipo 1 através de drogas anti­retrovirais administradas corretamente

(Gulick et al., 1997; Perelson et al., 1996). Porém, a replicação de vírus competente persiste nestes indivíduos e a viremia rapidamente aumenta quando a supressão dos ARVs é interrompida (Davey et al., 1999). A partir destes dados, verificamos que o vírus HIV provoca alterações importantes a nível

de DNA quando não é administrado os ARVs nos casos de viremia plasmática alta (>50 cópias/mL),

pois a replicação viral persistente é sinônimo de dano progressivo do sistema imunológico e,

conseqüentemente, aumento de alterações citogenéticas. E de acordo com os dados encontrados,

observamos que nossos pacientes HIV+ estão tendo boa resposta à medicação, porém os pacientes que

não estão recebendo ainda os ARVs, ou por terem abandonado o tratamento, apresentam instabilidade

genômica mais acentuada em relação aos pacientes em tratamento.

Quanto ao fator sexo, como indicado na literatura, não houve diferença significativa entre o sexo

masculino e feminino. Para testar a sensibilidade ao vírus e às drogas, foram testadas as diferenças

entre freqüências de micronúcleos, pontes dicêntricas e buds, assim como o índice de dano medido

pela técnica do cometa encontradas entre os sexos, separadamente, nas amostras controle, HIV+ não

tratada e HIV+ tratada. Nenhuma das amostras apresentou diferenças entre os sexos, nas taxas de dano

57

de DNA. Esse achado está em concordância com a maioria das publicações que testaram as diferenças

entre os sexos (Galloway e Evans, 1975; Crossen et al., 1977; Livingston et al., 1983).

As médias de idade dos pacientes com HIV+ sem medicação, dos pacientes HIV+ com

medicação e dos controles foram de 37 ± 7,61, 38,89 ± 9,88 e 42,97 ± 21,75, respectivamente. As

médias dos pacientes HIV+ demonstram um aumento da faixa etária dos indivíduos infectados. No

Brasil houve aumento do número de casos em idosos e da proporção de indivíduos afetados nessa

faixa etária entre os anos de 1991 e 2000 (Melo et al., 2002).

O aumento na freqüência de MN dependente da idade é uma questão muito discutida. Enquanto

alguns autores sugerem um aumento definitivo com a idade (Fenech e Morley, 1986; Scarfi et al.,

1990; Cruz et al., 1994), outros não encontram tal correlação (Hogstedt, 1984; Sbrana et al., 1991). Nosso estudo não apresentou correlação estatisticamente significativa entre as idades e as freqüências

de MN, pontes nucleoplasmáticas e o índice de dano do teste de cometa, quando a amostra total foi

testada. Porém foi encontrada correlação entre idade e freqüência de buds (p = 0,024). Quando estas

correlações foram testadas em cada amostra, também não foram encontrados resultados positivos nas

amostras de indivíduos HIV+ com tratamento e sem tratamento. Já para o grupo controle, encontramos

uma correlação positiva entre idade e freqüência de buds (p = 0,010), o que explica o resultado

encontrado na amostra total. A freqüência de buds foi muito baixa em todas as amostras e,

particularmente, nos controles, com média de 1,32 ± 1,35 nos 25 indivíduos analisados. Além disso, o

desvio padrão tem um valor maior do que a média. Esses fatores citados influenciam negativamente na

importância desse achado, podendo esta, ser uma análise com baixo poder estatístico.

Nossa amostra total havia 51 fumantes e 84 não fumantes. Os fumantes apresentaram uma

freqüência de MN maior que os não fumantes (p=0,006) (Obe e Herha, 1978; Larramendy e Knuutila,

1991; Cruz et al., 1994). Esta diferença também foi observada no grupo de pacientes HIV+ que utilizam a medicação anti­retroviral, no qual, os pacientes que fumam apresentam maior freqüência de

MN em relação aos pacientes não­fumantes (p=0,020). Já esta diferença não foi encontrada nos grupos

HIV+ que não utilizam a medicação anti­retroviral e controle em relação ao tabagismo. Este achado

demonstra um efeito sinérgico entre as drogas anti­retrovirais e o tabagismo, o que deve ser levado em

consideração no aconselhamento destes pacientes, na busca de uma melhor qualidade de vida, no

58

sentido de evitar o desenvolvimento de neoplasias pelo acúmulo de mutações ocasionadas por estes

dois fatores. Para o grupo controle, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas

entre as freqüências de dano de DNA em fumantes e não fumantes. O tabagismo tem efeito genotóxico

comprovado apenas em amostras maiores e quando o hábito é mais freqüente, ou seja, quando os

fumantes consomem maiores quantidades de cigarros.

59

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ASHBY, J. Determination of genotoxic status of a chemical. Mutation Research, 248:221­231, 1991.

AU, W.W. Monitoring human populations for effects of radiation and chemical exposures using

cytogenetics techniques. Occupational Medicine, 4: 97­611, 1991.

AUERBACH, A. D. e ALLEN, R. G. Leukemia and Preleukemia in Fanconi Anemia patients.

Cancer. Genet. Cytogenet., 51:1­12, 1991.

BEEBE­DIMMER, J. e SCHOTTENFELD, D. Chronic Inflammation: A Common and Important

Factor in the Pathogenesis of Neoplasia. CA Cancer J Clin, 83: 56­69, 2006.

BENEDICT, W. F., RUCKER, N., FAUST, J. e KOURI, R. E. Malignant transformation of mouse

cells by cigarrete smoke condensate. Cancer Research, 35:857­860, 1975.

BIGGAR, R. J. Epidemiology of malignances in HIV/AIDS. In: Feigal E. G., Levine A. M., Biggar R.

J., eds. AIDS related cancers and their treatment. New York, NY: Marcel Dekker Inc; 25­58, 2000.

BRUSICK, D. J., JAGANNATH, D. R., MYHR, B., SERNAU, R., ORR, J. C. e CHAPPEL, C. I.

Genetic toxicology evaluation of commercial beers, I. Development of procedures for the preparation

of extracts from commercial beers products. Mutation Research, 206:33­39, 1988.

60

BULL, P., YANEZ, L. e NERV, F. Mutagenic substances in red and white wine in Chile, a high risk

area for gastric cancer. Mutation Research, 187:113­117, 1987.

COUNTRYMAN, P. J. e HEDDLE, J. A. The production of micronuclei from chromosome aberration in irradiated cultures of human lymphocytes. Mutation Research, 67:321­332, 1976.

CARRANO, A. V. e NATARAJAN, A. T. Considerations for population monitoring using

cytogenetics techniques. ICPEMC publication 14. Mutation Research, 204:379­406, 1988.

CARTER, S. B. Effects of cytochalasis on mammalian cells. Nature, 213: 216­264, 1967.

COLLINS, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair. Molecular Biotechnology, 26:

249­257, 2004.

CROSSEN, P. E., DRETS, M. E., ARRIGHI, F. E., e JOHNSTON, D. A. Analysis of the frequency

and distribution of sister chromatid exchanges in cultured human lymphocytes. Human Genetics,

35:345­352, 1977.

CRUZ, A. D., McARTHUR, A. G., SILVA, C. C., CURADO, M. P. e GLICKMAN, B. W. Human

micronucleus counts are correlated with age, smoking, and cesium­137 dose in the Goiânia (Brasil)

radiological accident. Mutation Research, 313:57­68, 1994.

DAVEY, R. T., et al. HIV­1 and T cell dynamics after interruption of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with a history of sustained viral suppression. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 96:15109­15114, 1999.

DeMÉO, M., et al. Genotoxic activity of potassium permanganate in acidic solutions. Mutation

Research, 260: 295­306, 1991.

DERTINGER, S. D., TOROUS, D. K. e TOMETSKO, K. R. Induction of micronuclei by low doses of

azidothymidine (AZT). Mutation Research, 368: 3­4, 1996.

61

DOLL, R. e PETO, R. Mortality in relation to smoking: 20 years' observations on male British

doctors. British r M

62

FENECH, M. The cytokinesis micronucleus technique: a detailed description of the method and its

application to genotoxicity studies in human population. Mutation Research, 285: 35­44, 1993.

FENECH, M. The advantages and disadvantages of the cytokinesis­block micronucleus method.

Mutation Research, 392:11­8, 1997.

FENECH, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research, 455: 81­95, 2000

FENECH, M. e CROTT, J. W. Micronuclei, nucleoplasmic bridges and nuclear buds induced infolic

acid deficient human lymphocytes­evidence for breakage­fusion­bridge cycles in the cytokinesis­block

micronucleus assay. Mutation Research, 504: 131­136, 2002.

FRISCH, M., BIGGAR, R. J., ENGELS, E. A. e GOEDERT, J. J. Association of Cancer With AIDS­

Related Immunosuppression in Adults. Jama, 285 (13):1736­1745, 2001.

GALLOWAY, S. M. e EVANS, H. J. Sister chromatid exchanges in human chromosomes from

normal individuals and patients with ataxia telangiectasia. Cytogenet. Cell Genet., 15:17­29, 1975.

GANGULY, B. B. Cell division, chromosomal damage and micronucleus formation in peripheral

lymphocytes of healthy donors: related to donor's age. Mutation Research, 295:135­148, 1993.

GERBER, J. G., et al. Effect of Efavirenz on the Pharmacokinetics of Simvastatin, Atorvastatin, ans Pravastatin. J Acquir Immune Defic Syndr, 39(3): 307­312, 2005.

GERMAN, J. Chromosomal breakage syh

.

ea

63

GULICK, R. M., et al. Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infefction and prior antiretroviral therapy. N. Engl. J . Med, 337: 734­739,

1997.

HART, G. J., et al. Effects of (­) – 2’­Deoxy­3’­Thiacytidine (3TC) 5’­Triphosphate on Human Immunodeficiency Virus Reverse Transcriptase and Mammalian DNA Polymerases Alpha, Beta, and

Gamma. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 36: 1688­1694, 1992.

HATANO, H., et al. Pre­HAART HIV burden approximates post­HAART viral levels following interruption of therapy in patients with sustained viral suppression. AIDS, 14:1357­1363, 2000.

HAWES, S. E., et al. Incident high­grade squamous intraepithelial lesions in senegalense women with and without human immunodeficiency virus type 1 (HIV­1). Journal of the National Cancer

Institute, 98 (2): 100­111, 2006.

HEDDLE, J. A. A Rapid in vivo Test for Chromosomal Damage. Mutation Research, 18:187­190,

1973.

HEDDLE, J. A., et al. The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity: a report of the U.S. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gen­Tox Program. Mutation Research,

123:61­118, 1983.

HEDDLE, J. A. Implications for genetic toxicology of the chromosomal breakage syndromes.

Mutation Research, 247:221­229,1991.

HEIDEMANN, A., SCHMALENBERGER, B. e ZANKLl, H. Sister chromatid exchange frequency

and lymphocytes proliferation in a Down’s syndrome mosaic developing an acute lymphoblastic

leukemia. Cancer Genet. Cytogenet., 15,109­112, 1985.

64

HEIM, R. A., LENCH, N. J. e SWIFT, M. Heterozygous manifestations in four autosomal recessive

human cancer­prone syndromes: ataxia telangiectasia, xeroderma pigmentosum, Fanconi anemia e

Bloom syndrome. Mutation Research, 284:25­36, 1982.

HERVEY, O. S. e PERRY, C. M. Abacavir: a review of its clinical potential in patients with HIV

infection. Drugs, 60(2): 447­79, 2000.

HILLEMAN, M. R Overview of viruses, cancer, and vaccines in concept and in reality. Cancer

Research, 154:345­362,1998.

HOFFMANN, C., ROCKSTROH, J. K. e KAMPS, B. S. HIV Medicine 2005.

HOGSTEDT, C. Micronuclei in lymphocytes with presesrved cytoplasm. A method for assessment of

cytogenetic damage in man. Mutation Research, 130:63­72,1984.

HORTON, C. M., et al. Population Pharmacokinetics of Stavudine (d4T) in Patients with AIDS or Advanced AIDS­Related Complex. Antimicrobial Agents and Chemoterapy, 39: 2309­2315, 1995.

HUTTON, J. J. e HACKNEY, C. Metabolism of cigarrete smoke condensate by human and rat

homogenates to form mutagens detectable by Salmonella typhimurium TA 1538. Cancer Research, 35:2461­2468, 1975.

HSU, T. C. Genetic Instability in the Human Population: A Working Hypothesis. Hereditas, 98:1­9,

1983.

HSU, T. C., CHERRY, L.. M. e SAMAAN, N. A. Differential mutagen susceptibility in cultured

lymphocytes of normal individuals and cancer patients. Cancer Genet. Cytogenet, 17:307­313, 1985.

JANOSSY, G., GREAVES, M. F. Lymphocyte activation II. Discrimination stimulation of

lymphocyte subpopulations by phytomitogens and heterologous antilymphocyte sera. Clin Exp.

Immunol. 10:525­536, 1972.

65

KLINE, M. W., et al. A Phase I/II Evaluation of Stavudine (d4T) in Children With Human

Immunodeficiency Virus Infection. Official Journal of the American Academy of Pediatrics,

96:247­252, 1995.

KLINE, M. W., et al. A Randomized Comparative Trial of Stavudine (d4T) Versus Zidovudine (ZDV, AZT) in Children With Human Immunodeficiency Virus Infection. Official Journal of the American

Academy of Pediatrics, 101:214­220, 1998.

KOTELES, G. J., et al. Micronucleus frequency in cultured lymphocytes of an urban population.

Mutation Research, 319:267­271, 1993.

KOTWAL, G. J., et al. Anti­HIV, Anti­Poxvirus, and Anti­SARS Activity of a Nontoxic, Acidic Plant Extract from the Trifollium Species Secomet­V/anti­Vac Suggests that it Contains a Novel Broad­ Spectrum Antiviral. Annals New York Academy of Sciences, 1056: 293­302, 2005.

KOZHEMIAKIN, L. A. e BONDARENKO, I. G. Genomic instablity and AIDS. Biokhimiia, 57

(9):1417­26, 1992.

KREUZER, H. e MASSEY, A. Engenharia Genética e Biotecnologia. Editora Artmed, 2ª edição, pág

434, 2002.

KURODA, Y. Antimutagenic activity of vitamins in cultured mammalian cells, in: Y.Kuroda,

D.M.Shankel e M.D.Waters (Eds.) Antimutagenesis and anticarcinogenesis mechanisms II. Plenum

Press, New York and London, pág.233­256, 1990­b.

LARRAMENDY, M. L. e KNUUTILA, S. Increased frequency of micronuclei in B and T8

lymphocytes from smokers. Mutation Research, 259:189­195, 1991.

LIVINGSTON, G. K., et al. Sister chromatid exchange: variation of age, sex, smoking, and breast cancer status. Cancer Genet. Cytogenet., 8:289­299, 1983.

66

LOQUET, C. G., TOUSSAINT, G. e LeTALAER, J. Y. Studies on mutagenic constituents of apple

brandy and various alcoholic beverages collected in Western France, a high incidence area for

esophageal cancer. Mutation Research, 88:155­164, 1981.

LUCAS, G. M., CHAISSON, R. E., MOORE, R. D. Comparison of initial combination antiretroviral

therapy with a single protease inhibitor, ritonavir and saquinavir, or efavirenz. AIDS, 15: 1679­1686,

2001.

MALUF, S. W. Estudo da Sensibilidade Humana a Eventos Mutagênicos. Porto Alegre: 1999. 112 pg.

Tese (Doutor). Programa de Pós­Graduação em Genética e Biologia Molecular – UFRGS, 1999.

MALUF, S. W. Monitoramento da Genotoxidade Causada por Exposição Ocupacional. Poro Alegre:

1994. 81 pg. Dissertação (Mestre). Curso de Pós­Graduação em Genética e Biologia Molecular –

UFRGS, 1994.

MALUF, S. W., ERDTMANN, B. Follow­up study of genetic damage in lymphocytes of pharmacists

and nurses handling antineoplastic drugs evaluated by cytokinesis­block micronuclei analysis and

single cell gel electrophoresis assay. Mutation Research, 471:21­27, 2000.

MALUF, S. W. Monitoring DNA Damage Following Radiation Exposure Using Cytokinesis­Block

Micronucleus Method and Alkaline Single­Cell Gel Electrophoresis. Clinica Chimica Acta, 347:15­

24, 2004.

MARGOLIN, B. H. e SHELBY, M. D. Sister chromatid exchanges: A reexamination of the evidence

for sex and race differences in humans. Environmental Mutagen., 7(4):63­72, 1985.

MATSUNAGA, E., TONOMURA, A., OISHI, H. e KIKUCHI, Y. Reexamination of paternal age

effect in Down's syndrome. The American Journal of Human Genetics, 40:259­268, 1978.

MATTEVI, M. S. e SALZANO, F. M. Senescense and human chromosome changes. Human

Genetik, 27,1­8, 1975.

67

MELO, M. R., GORZONI, M., MELO, K. C., MELO, E. Síndrome da Imunodeficiência Adquirida no

Idoso. Revista Diagnóstico e Tratamento, 7 (2): 13­7, 2002.

MENG, Q., et al. Mutagenicity and loss of heterozigosity at the APRT locus in human lymphoblastoid

cells exposed to 3’­azido­3’­deoxythymidine. Mutagenesis, 15: 405­410, 2000­a.

MENG, Q., et al. Zidovudine­didanosine coexposure potentiates DNA incorporation of zidovudine and mutagenesis in human cells. PNAS, 97: 12667­12671, 2000­b.

MIGLIORE, L., et al. Micronucleated lymphocytes in people occupationally exposed to potencial

environmental contaminants: the age effect. Mutation Research, 256: 13­20, 1991.

MIZUSAKI, S., TAKASHIMA, T. e TOMARU, K. Factors affecting mutagenic activity of cigarrete

smoke condensate in Salmonella typhimurium TA 1538. Mutation Research, 48:29­36, 1977.

NADIN, S. B., VARGAS­ROIG, L. M., CIOCCA, D. A silver staining method for single­cell gel

assay. J . Histochem Cytochem, 49: 1183­1186, 2001.

NAKAGOME, Y., et al. The "loss" of centromeres from chromosomes of aged women. The American Journal of Human Genetics, 36:398­404, 1984.

NATARAJAN, A. T. e OBE, G. Screening of human populations for mutations induced by

environmental pollutants: use of human lymphocyte system. Ecotoxicol. Environ. Safety, 4:468­481,

1980.

NATARAJAN, A. T., VOSSEN, J. M. J. J. and VAN WEEL­SIPMAN, M. H. Aplastic Anemia and

Fanconi Anemia: Response of lymphocytes to X­rays and mitomicin C, in: Fanconi Anemia Clinical,

Cytogenetic and Experimental Aspects. T. M . Schroeder­Kurth, A. D. Auerbach & G. Obe (Eds.),

Springer Verlag, Berlin, pp. 100­104, 1989.

68

NELSON, S. M., FERGUSON, L. R. e DENNY, W. A. DNA and the chromosome – varied targets for

chemotherapy. Cell & Chromosome, 3: 1­26, 2004.

NORDENSON, I., et al. Chromosomal aberrations and cancer risk. Hum. Hered. 34: 76­81, 1984.

NORPPA, H. e FALCK, G. What do micronuclei contain? Mutagenesis, vol. 18, nº3, 221­233, 2003.

OBE, G. e HERHA, J. Chromosomal aberrations in heavy smokers. Human Genetics, 41:259­263,

1978.

OBE, G. e ANDERSON, D. Genetic effects of ethanol. Mutation Research, 186:177­200, 1987.

OLIVERO, O. A., et al. 3’­azido­3’­deoxythymidine (AZT) transplacental perfusion kinetics and DNA incorporation in normal human placentas perfused with AZT. Mutation Research, 428: 41­47,

1999.

ÖSTLING, O. e JOHANSON, K. J. Microelectrophoretic study of radiation­induced DNA damages in

individual cells. Biochem Biophys Res Commun, 123:291­298, 1984.

PEÇANHA, E. P., ANTUNES, O. A. e TANURI, A. Estratégias farmacológicas para a terapia anti­

AIDS. Química Nova, 25 (6B): 1108­1116, 2002.

PAREKH, S., RARTECH, H. e SPARANO, J. A. Human immunodeficiency virus­associated

lymphoma. Clinical Advances in Hematology and Oncology, 1(5): 295­301, 2003.

PERELSON, A. S., et al. HIV­1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life­span, and viral generation time. Science, 271:1582­1586, 1996.

PETER, K. e GAMBERTOGLIO, J. G. Intracellular phosphorylation of zidovudine (ZVD) and other

nucleoside reverse transcriptase inhibitors (RTI) used for human immunodeficiency virus (HIV)

infection. Pharmaceutical Research, 15(6): 819­825, 1998.

69

PHILLIPS, B. e ROITT, L. M. Evidence for transformation of human B lymphocytes by PHA. Nature

New Biol. 241:254­256, 1973.

PRESTON, R. J., SAN SEBASTIAN, J. R. e McFEE, A. F. The in vitro human lymphocyte assay for assessing the clastogenicity of chemical agents. Mutation Research 189:175­183, 1987.

RABELLO­GAY, M. N., RODRIGUES, M. e MONTELEONE­NETO, R. Mutagênese,

Teratogênese e Carcinogênese. Sociedade Brasileira de Genética. Ribeirão Preto, pp.241, 1991.

RENNER, H. W. Anticlastogênic dietary factors assessed in mammalian assays, in: Y.Kuroda,

D.M.Shankel e M.D.Waters (Eds.) Antimutagenesis and anticarcinogenesis mechanisms II. Plenum

Press, New York and London, pp.35­43, 1990.

RIBEIRO, L. R., SALVADORI, D. M. F. e MARQUES, E. K. Mutagênese Ambiental. Canoas:

ULBRA, 2003: 21­22, 31­32 p., 2003.

ROSER, M., et al. Ultraviolet induced formation of micronuclei and sister chromatid exchange in cultured fibroblasts of patients with cutaneous malignant melanoma. Cancer Genet. Cytogenet.,

41:129­137, 1989.

ROSS, G. M., et al. The single cell microgel electrophoresis assay (comet assay): technical aspects and applications. Report on the 5 th LH Gray Trust Workshop, Institute of Cancer Research, 1994.

Mutation Research, 337:57­60, 1995.

Recomendações para Terapia Anti­Retroviral em Adultos e Adolescentes Infectados pelo HIV 2006.

Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde – Programa Nacional de DST e AIDS.

RUMMELEIN, B., et al. Increased Mutagen Sensitivity in Human Cultured Fibroblast With

Constitutively High Micronucleous Level. Cancer Genet. Cytogenet, 58: 186­190, 1992.

70

SARAFIANOS, S. G., et al. Lamivudine (3TC) resistence in HIV­1 reverse transcriptase involves steric hindrance with ß­branched amino acids. Procedings of the National Academy of Sciences of

the United States of America, 96: 10027­10032, 1999.

SBRANA, I., CARETTO, S. e BATTAGLIA, A. Chromossomal aberration analysis of workers in

tannery industries. Mutation Research, 260:331­336, 1991.

SCARFÍ, M. R., et al. Age­related increased of mitomicin C­induced micronuclei in lymphocytes from Down’s syndrome subjects. Mutation Research, 237:247­252, 1990.

SCHUBERT, I. e OUD, J. L. There is an upper limit of chromosome size for normal development

ofan organism. Cell, 88:515­520, 1997.

SCHROEDER, T. M., ANSCHÜTZ, F. e KNOPP, A. Spontane Chromosomenaberrationen bei

familiärer Panmyelopathie. Humangenetik, 1: 194­196, 1964.

SCHROEDER, T. M. Genetically determined chromosome instability syndromes. Cytogenet. and

Cell Genet., 33:119­132, 1982.

SERRAINO, D., et al. Kaposi’s Sarcoma in transplant and HIV­infected patients: an epidemiologic study in Italy and France. Transplantation, 80 (12): 1699­1704, 2005.

SARAFINOS, S. G., et al. Lamivudine (3TC) resistence in HIV­1 reverse involves steric hindrance

with bet­branched amino acids. PNAS, 96: 10027­10032, 1999.

SHAH, I. Related Clinical Manifestations of HIV Infection in Indian Children. J Trop Pediatr ,

51(51): 300­3, 2005.

SHARMA, T. e DAS, B. C. Higher incidence of spontaneous sister­chromstid exchanges (SCEs) and

X­ray­induced chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes during pregnancy. Mutation

Research, 174:27­33, 1986.

71

SHIMURA, M., et al. Micronuclei Formation with Chromosome Breaks and Gene Amplification

Caused by Vpr, an Accessory Gene of Human Immunodeficiency Vírus. Câncer Research 59;259­

2264, 1999.

SILVA, J., ERDTMANN, B. e HENRIQUES, J. A. P. Genética Toxicológica. Porto Alegre: Ed

Alcance, 27­28 p., 2003.

SINGH, N. P., et al. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Research, 175:184­191, 1988.

SOPER, K. A., et al. Sister chromatid exchange (SCE) report on control subjects in a studyof occupationally exposed workers. Mutation Research, 129:77­88, 1984.

SORSA, M., et al. Human biomonitoring in exposure to environmental genotoxicants, in: Y.Kuroda,

D.M.Shankel e M.D.Waters (Eds.) Antimutagenesis and anticarcinogenesis mechanisms II. Plenum

Press, New York and London, pp. 79­86, 1990.

SPINA, M., et al. Neoplasic complications of HIV infection. Annals of Oncology, 10: 1271­1286,

1999.

SPRINZ, E. e FINKELSZTE, J. N. Rotinas em HIV e AIDS. Ed. Artmed, 1ª edição, 51­52 e 340 pág,

1999.

STRACHAN, T. e READ, A. P. Genética Molecular Humana. Editora Artmed, 2ª edição, 576 pág,

2002.

SURRALÉS, J., et al. A collaborative study on the improvement of the micronucleus test in cultured human lymphocytes. Mutagenesis, 7(6):407­410, 1992.

72

THOMAS, S. A. e SEGAL, M. B. The transport of the anti­HIV drug, 2’,3’­didehydro­3’­

deoxythymidine (D4T), across the blood­brain and blood­cerebrospinal fluid barriers. British Journal

of Pharmacology, 125:49­54, 1998.

THOMPSON, J. S. e THOMPSON, M. W. Genética Médica. Editora Guanabara, Rio de Janeiro,

pp.265, 1980.

TICE, R. R. The single cell gel/comet assay: a micrgel electrophoretic technique for the detection of

DNA damage and repair in individual cells. In: Phillips D. H., Venitt S., editors. Environmental

mutagenesis. Oxford, UK: Bios Scientific Publishers, 1995.

TICE, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environmental Molecular Mutagen, 35:206­221, 2000.

TRIMBLE, B. K. e BAIRD, P. A. Maternal age and Down syndrome: age­specific incidence rates by

single­year intervals. The American Journal of Medical Genetics, 2:1­5, 1978.

TUCKER, J. D. e PRESTON, R. J. Chromosome aberrations, micronuclei, aneuploidy, sister

chromatid exchanges, and câncer risk assessment. Mutation Research, 365:147­59, 1996.

VAGHEF, I. I., et al. Alkaline single­cell gel electrophoresis and human biomonitoring for genotoxicity: a pilot study on breast cancer patients undergoing chemotherapy including

cyclophosphamide. Mutation Research, 395:127­138, 1997.

VERDE, P. E., et al. Application of public­domain statistical analysis software for evaluation and comparison of comet assay data. Mutation Research, 604: 71­82, 2006.

VON TUNGELN, L. S. et al. Frequence of Tk and Hprt lymphocyte mutants and bone marrow

micronuclei in mice treated neonatally with zidovudine and didanosine. Mutagenesis, 19 (4): 307­11,

2004.

73

VISCHER, T. Mitogenic factors by lymphocyte activation: Effect on T­and B­cells. J . Immunol,

109:401­402, 1972.

WIGLEY, C. Carcinogênese química e lesões pré­cancerosas, em: Introdução à biologia celular e

molecular do câncer. Livraria Rocca, São Paulo, pp.127­148, 1987.

WIRE, M. B., et al. Pharmacokinetics and safety of GW433908 and ritonavir, with and without

efavirenz, in healthy volunteers. AIDS, 18: 897­907, 2004.

WOJEWÓDZKA, C., GRADZKA, I. e BURACZEWSKA, I. Modified neutral comet assay for

lymphocytes. Nukleonika, 47: 1­5, 2002.

YU, C.L., et al. Isolation and identification of rutin as the major mutagen in red wine. Mutation

Research, 170:103­113, 1986.

YUNIS, J. J. The chromosomal basis of human neoplasia. Science, 221:227­236, 1983.

74

ANEXOS

Anexo I: Termo de Consentimento Informado

I ­ Justificativa e objetivos da pesquisa: Este estudo consiste em uma avaliação das alterações no material genético (DNA) de cada

participante. Estas alterações ocorrem normalmente nas células em níveis bastante baixos, e são apontadas como responsáveis, entre outros efeitos, pelos processos de envelhecimento e câncer.

II ­ Procedimentos que serão utilizados: Será feita uma coleta de 5 ml de sangue periférico com o propósito de avaliar a freqüência de

mutações através da técnica de micronúcleos (que avalia quebras cromossômicas e perdas do cromossomo inteiro) e da técnica do "cometa" (que acusa lesões menores do material genético).

Pelo presente Consentimento Pós­Informação, declaro que fui informado de forma clara e detalhada, dos objetivos, da justificativa, dos procedimentos que serei submetido, dos riscos, desconfortos e benefícios do presente Projeto de Pesquisa, assim como dos procedimentos alternativos aos quais poderia ser submetido.

Fui igualmente informado: ­da garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida a cerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados com a pesquisa; ­da liberdade de retirar meu consentimento, a qualquer momento, e deixar de participar do estudo, sem que isto traga prejuízo à continuação do meu cuidado e tratamento; ­da segurança de que não serei identificado e que se manterá o caráter confidencial das informações relacionadas com a minha privacidade.

O Pesquisador Responsável por este Projeto de Pesquisa é Graziela Maria Schuh (fone: 9718­ 6622). Data: ___/___/___.

Nome e assinatura do Paciente ou Voluntário: ________________________________________________________________

Nome e assinatura do Responsável Legal, quando for o caso: ________________________________________________________________

Assinatura do Pesquisador Responsável: _______________________________________________________________

75

Anexo II:

QUESTIONÁRIO DE SAÚDE PESSOAL (De acordo com modelo recomendado por: International Commission for Protection against

Environmental Mutagens and Carcinogens (ICPEMC) Mutation Research, 204:379­406, 1988)

Este questionário, assim como o estudo a ele relacionado, deve ser de seu interesse. A participação e espontânea e constará destas informações gerais sobre saúde e dieta, mais uma coleta de sangue para estudo citogenético. O estudo consiste em uma avaliação de mutações nos cromossomos de cada participante. Mutações cromossômicas ocorrem normalmente nas células de todas as pessoas em nível bastante baixo, e são apontadas, entre outros efeitos, nos processos de envelhecimento e do câncer.

Trabalhadores em atividades de risco (por exemplo, radiologia, quimioterapia, uso de óxido de etileno e outras), se não seguirem normas adequadas de segurança, podem aumentar a freqüência de mutações cromossômicas em suas células. Este estudo poderá servir como sinal de alerta para prevenir e melhorar as condições de segurança. Caso não se encontrem diferenças entre trabalhadores de atividades de risco e outros de atividades diversas, poderemos concluir que os itens de segurança são efetivos neste aspecto. Isto servirá de estímulo para continuar tomando cuidados com a vida no local de trabalho.

Leia e responda cuidadosamente as seguintes questões. A informação dada por você não será associada com o seu nome, sendo conhecida apenas pelos pesquisadores associados a este estudo. As respostas deste questionário poderão ter influência direta na interpretação de nossos resultados. Por isso, contamos com sua cooperação em fornecer informações corretas.

Obrigado pelo seu interesse.

1.Nome:________________________________________________________

Data:_____/_____/_______

2.Para ser preenchido pelo pesquisador: Código n.:_____________ .

Essa folha será destacada das demais do questionário e arquivada. Apenas o número do código será usado como identificação nas próximas páginas. Se espaços adicionais forem necessários para completar uma resposta, por favor escreva atrás da página e identifique o complemento da resposta com o número da questão.

76

Código n.:___________ . HISTÓRIA PESSOAL

3.Data de hoje:_________________________________________________. 4.Qual a sua idade? _______________(em anos). 5.Sexo: ( )Masculino ( )Feminino 6.A qual grupo étnico você pertence:

( )Caucasiano ( )Negro ( )Chinês ( )Japonês ( )Outro. Qual?____________________________________ .

7.Qual o seu estado civil? ( )Casado ( )Solteiro ( )Separado ( )Divorciado ( )Viúvo 8.De quantos filhos você é pai natural (isto é, não inclua filhos adotados e de criação, e inclua filhos que moram separadamente)? ______________________

HISTÓRIA OCUPACIONAL

9.Qual o seu local de trabalho ? _______________________________________. 10.Há quanto tempo você trabalha neste local? ___________________________. 11.Se há menos de dez anos, onde você trabalhou previamente e por quanto tempo? ________________________________________________________ . 12.Que tipo de trabalho você faz? ___________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ___________

EXPOSIÇÃO

13.Liste os agentes químicos (por exemplo, gases tóxicos, benzeno, chumbo, fármacos, agrotóxicos,etc.) ou físicos (radiação) a que você se expôs nos últimos 10 anos em seu trabalho. Nos últimos 12 meses: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ Nos últimos 10 anos: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________

77

Código n.:__________

14.Liste os agentes químicos (agrotóxicos e outros que julgar necessário) ou físicos a que você se expôs nos últimos 10 anos fora de seu trabalho.

Nos últimos 12 meses: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________

Nos últimos 10 anos: Quantas vezes por mês: __________________ ___________________ __________________ ___________________

HISTÓRIA DE FUMO

15.Alguma vez você fumou? ( )Sim ( )Não Se não, passe para a questão 16. Se sim, continue: a).­Quanto tempo você fumou?______________(em anos) b).­Você fuma atualmente? ( )Sim ( )Não

Se sim, passe para a 15.c) Se não: Quando você parou de fumar?___________________(mês e ano).

c).­Você fuma cigarros? ( )Sim ( )Não Se sim, quantas carteiras por dia? ( )Menos de ½ carteira

( )½ a 1 carteira ( )Mais de 1 carteira, quantas?______

Você fuma cigarros com filtro? ( )Sim ( )Não Qual a sua marca usual?_________________________________ .

d).­Você fuma charutos? ( )Sim ( )Não Se sim, quantos charutos por dia? ( )1 charuto

( )2 a 3 charutos ( )4 ou mais charutos. Quantos?____

e).­Você fuma cachimbo? ( )Sim ( )Não Se sim, quantas vezes por dia? ( )1 vez

( )2 a 3 vezes ( )4 ou mais vezes. Quantas?_______

f).­.O que você fumava no passado? ( )Cigarros ( )Charutos ( )Cachimbo

g).­.Você mastiga tabaco? ( )Sim ( )Não

78

Código n.:_________

MEDICAMENTOS E DOENÇAS 16.Você tem tomado algum medicamento prescrito pelo médico no último ano (por exemplo,comprimidos para pressão, insulina, tranquilizantes, relaxantes musculares, etc.)?

( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique:

Per íodo . Tipo de medicamento: Dose: Quantos por dia: Início(mês): Término(mês): _________________ ________ ___________ _________ ___________ _________________ ________ ___________ _________ ___________ _________________ ________ ___________ _________ ___________

17.Você tem tomado algum medicamento não prescrito por médico no último ano (por exemplo, aspirina, anti­ácidos, anti­histaminas, sedativos ou outras drogas)?

( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique:

Per íodo : Tipo de medicamento: Dose: Quantos por dia: Início(mês): Término(mês): _________________ ________ ___________ _________ ___________ _________________ ________ ___________ _________ ___________ _________________ ________ ___________ _________ ___________

18.Você toma ou tomou alguma vitamina nos últimos 6 meses? ( )Sim ( )Não

Se sim, por favor indique: Tipo de vitamina: Dose: Quantas vezes por semana: _________________ __________ _______________________ _________________ __________ _______________________ 19.a).­ Você teve ou tem alguma dessas doenças?

Câncer ( )Sim ( )Não Hepatite ( )Sim ( )Não Mononucleose ( )Sim ( )Não Herpes ( )Sim ( )Não AIDS ( )Sim ( )Não Meningite ( )Sim ( )Não Infecção bacteriana ou viral ( )Sim ( )Não Doença cardiovascular ( )Sim ( )Não Diabete ( )Sim ( )Não Outras doenças importantes ( )Sim ( )Não

79

Código n.:__________

b).­Se sim, indique abaixo: Doença: Per íodo da doença: Tratamento: ________________ _________________ ___________ ________________ _________________ ___________

c).­Liste as vacinações que você recebeu nos últimos 12 meses. Vacina: Data: ___________________________ ___________________ ___________________________ ___________________

d).­Liste os raios­X diagnósticos e terapêuticos, recebidos nos últimos 10 anos. Razão para o raio­X Data(ano) ___________________________ ___________ ___________________________ ___________ ___________________________ ___________

e).­Você fez alguma cirurgia durante o último ano? Data: Razão: ______________ _______________________________________ ______________ _______________________________________

f).­Dê as datas de quando você teve febre nos últimos 12 meses. Data(mês): Doença associada: Medicamento tomado: _______________ __________________ ____________________ _______________ __________________ ____________________

DIETAS (deve refletir apenas os hábitos frequentes)

20.Você come apenas vegetais? ( )Sim ( )Não 21.Você come carne? ( )Sim ( )Não

a).­Se sim, com que frequência você come o seguinte: Dias por semana :

1 a 2 3 a 4 5 a 6 todos dias

80

Carne bovina ( ) ( ) ( ) ( ) Peixe ( ) ( ) ( ) ( ) Galinha ( ) ( ) ( ) ( ) Porco ( ) ( ) ( ) ( ) Outras ( ) ( ) ( ) ( )

Código n.:__________

b).­Como você prefere sua carne? ( )Mal passada ( )No ponto ( )Bem passada

22.Você usa adoçantes? ( )Sim ( )Não Quantos por dia?____________

23.Você bebe refrigerantes? ( )Sim ( )Não Quantos por dia?____________

24.Comente sobre sua dieta, caso ela tenha algo de especial (por exemplo, dieta rica em proteínas e pobre em carbohidratos,etc). ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________

25.Você bebe café? ( )Sim ( )Não Quantos xícaras pequenas por dia?__________

26.Você bebe chá? ( )Sim ( )Não Quantos xícaras por dia?__________

27.Você toma chimarrão? ( )Sim ( )Não Com que freqüência?__________________________________________.

28.Você bebe cerveja? ( )Sim ( )Não

Se sim, por favor indique sua média de consumo semanal: ( )1­6 garrafas por semana ou menos. ( )7­12 garrafas por semana. ( )13­24 garrafas por semana. ( )Mais de 24 garrafas por semana. Quantas?_________ .

29.Você bebe vinho? ( )Sim ( )Não

81

Se sim, por favor indique sua média de consumo semanal: ( )1­4 copos por semana ou mais. ( )5­8 copos por semana. ( )9­16 copos por semana. ( )Mais de 16 copos por semana. Quantos?__________ .

30.Você bebe outras bebidas alcoólicas (excluindo cerveja e vinho)? ( )Sim ( )Não

Se sim, qual ou quais?____________________________ Código n.:________

.Por favor, indique sua média de consumo semanal: ( )1­4 copos por semana ou menos. ( )5­8 copos por semana. ( )9­16 copos por semana. ( )Mais de 16 copos por semana. Quantos?___________ .

HISTÓRIA GENÉTICA

31.Você tem conhecimento de algum defeito de nascimento ou outra desordem genética ou doença hereditária que tenha afetado seus pais, irmãos, irmãs ou seus filhos?

( )Sim ( )Não Se sim, por favor especifique: ___________________________________

32.Você ou a sua esposa teve ou tem dificuldade para engravidar? ( )Sim ( )Não

Se sim, por favor especifique: ___________________________________ 33.Você já teve um filho que tenha nascido prematuramente ou que tenha sido abortado?

( )Sim ( )Não 34.Você tem um gêmeo idêntico vivo? ( )Sim ( )Não

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas

Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo