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Loci de resistência que afetam distintos estágios da patogênese do fungo: uso de linhas de introgressão para mapeamento de QTL e caracterização do patossistema milho – Setosphaeria turcica Loci de resistência que afetam distintos estágios da patogênese do fungo: uso de linhas de introgressão para mapeamento de QTL e caracterização do patossistema milho – Setosphaeria turcica Chung et al., 2010. BMC Plant Biology, 10:103-128 Chung et al., 2010. BMC Plant Biology, 10:103-128 Introdução Introdução • Patogênese é uma série de eventos que ocorre numa interação patógeno-hospedeiro; • A variação genética no hospedeiro e/ou patógeno pode ter efeitos quantitativos ou qualitativos sobre a extensão da doença; • Resistência quantitativa tenha um efeito relativamente pequeno sobre a patogênese, este tipo de resistência é de interesse agrícola, porque é mais durável; • Um grande número de QTL para resistência a doença foram mapeadas em plantas, mas pouco se sabe sobre as bases genéticas subjacentes ou mecanismos de defesas envolvidos. Introdução Introdução • Mancha foliar foi utilizada como sistema modelo para identificar e caracterizar QTL de doença em nível macro e microscópico. Setosphaeria turcica (Exserohilum turcicum anamorfo) • Uma das doenças foliares mais prevalentes na maioria das regiões de cultivo de milho do mundo. • Formas qualitativas e quantitativas de resistência contra S. turcica estão disponíveis em germoplasma, e têm sido amplamente utilizados, isolados ou em associação, nos programas de melhoramento de resistência. Introdução Introdução • Análise de QTLs utilizando linhagens puras recombinantes (RILs) proporciona maior poder estatístico na detecção de QTL. • Linhas de introgressão podem ser eficientemente utilizadas para produzir linhas quase-isogênicas (NILs), que permitem uma análise cuidadosa dos efeitos fenotípicos associados com os segmentos introgredidos. • No geral, a resistência em plantas adultas ou folhas mais velhas é maior do que em plantas jovens; • A expressão e a eficácia de muitos genes/QTL tem sido observados sendo regulados por condições ambientais. • Saber se o QTL doença confere resistência específica ou de amplo espectro.

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Loci de resistência que afetam distintos estágios da patogênese do fungo: uso de linhas de introgressão para mapeamento de QTL e

caracterização do patossistemamilho – Setosphaeria turcica

Loci de resistência que afetam distintos estágios da patogênese do fungo: uso de linhas de introgressão para mapeamento de QTL e

caracterização do patossistemamilho – Setosphaeria turcica

Chung et al., 2010. BMC Plant Biology, 10:103-128Chung et al., 2010. BMC Plant Biology, 10:103-128IntroduçãoIntrodução

• Patogênese é uma série de eventos que ocorre numainteração patógeno-hospedeiro;

• A variação genética no hospedeiro e/ou patógenopode ter efeitos quantitativos ou qualitativos sobre aextensão da doença;

• Resistência quantitativa tenha um efeitorelativamente pequeno sobre a patogênese, este tipode resistência é de interesse agrícola, porque é maisdurável;

• Um grande número de QTL para resistência a doençaforam mapeadas em plantas, mas pouco se sabesobre as bases genéticas subjacentes ou mecanismosde defesas envolvidos.

IntroduçãoIntrodução

• Mancha foliar foi utilizada como sistema modelo paraidentificar e caracterizar QTL de doença em nívelmacro e microscópico.

• Setosphaeria turcica (Exserohilum turcicum anamorfo)

• Uma das doenças foliares mais prevalentes namaioria das regiões de cultivo de milho do mundo.

• Formas qualitativas e quantitativas de resistênciacontra S. turcica estão disponíveis em germoplasma,e têm sido amplamente utilizados, isolados ou emassociação, nos programas de melhoramento deresistência.

IntroduçãoIntrodução

• Análise de QTLs utilizando linhagens purasrecombinantes (RILs) proporciona maior poderestatístico na detecção de QTL.

• Linhas de introgressão podem ser eficientemente utilizadaspara produzir linhas quase-isogênicas (NILs), que permitemuma análise cuidadosa dos efeitos fenotípicos associadoscom os segmentos introgredidos.

• No geral, a resistência em plantas adultas ou folhasmais velhas é maior do que em plantas jovens;

• A expressão e a eficácia de muitos genes/QTL temsido observados sendo regulados por condiçõesambientais.

• Saber se o QTL doença confere resistência específicaou de amplo espectro.

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IntroduçãoIntrodução

• Utilização de linhas de introgressão e derivados deNILs para mapeamento de QTLs e caracterizaçãomacro e microscópica do patossistema Setosphaeriaturcica-milho.

• Linhas de introgressão disponíveis TBBC3;– Genótipo doador Tx303;– Genótipo parental recorrente B73;

Material e MétodosMaterial e Métodos

• Material vegetal:

– Conjunto de 82 linhas de introgressão (Univ. CN);

– Informação genotípica foi publicamente disponibilizada para cada linha, consistindo de 14 RFLPs e 116 SSR no genoma.

• Avaliação da mancha foliar

– Cultivo do fungo – meio LCA e em grãos de sorgo;

– Plantas juvenis (5-6 folhas) e plantas adultas (2 semanas antes do espigamento)

– Inóculo líquido – CV

– Inóculo sólido – Campo

Material e MétodosMaterial e Métodos• Caracterização fenotípica da resistência à

mancha foliar:

– Análise microscópica

• Eficiência de infecção;

• Incidência de multiplos apressórios

• Eficiência na invasão vascular

• Diâmetro reforçado de área fluorescente

– Análise macroscópica

• PI

• EL

• AFD primária

• AFD

• SD

• CPD – Curva de progresso da doença

– Quantificação da biomassa fúngica na planta porqPCR.

Material e MétodosMaterial e Métodos• Avaliação para resistência múltipla a doenças:

– Murcha de Stewart – Pantoea stewartii;

– Antracnose – Colletotrichium graminicola;

– Carvão – Ustilago maydis;

– Ferrugem – Puccinia sorghi.

– Análise microscópica

• Extração de DNA e genotipagem (SSR – DNA Analyzer);

• Desenho experimental:

– Aurora (NI)

– Clayton (CN)

• 2 repetições

• 14 blocos por repetição

• 6 linhas experimentais com linha controle B73.

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Linhas de introgressãoda população BC3

Subconjunto de linhas de introgressão

B73 x linhas de introgressão selecionadas

Populações BC4F2

Conjuntos derivados de NILs

NILs selecionados

Figura 1 - Estratégias para o mapeamento e caracterização de QTLs usando linhas de introgressão.

(A) Avaliação fenotípica do conjunto completo de 82 linhasde introgressão (PI, AFL e SD).

(C) Avaliação fenotípica de 15 linhas de introgressão

selecionadas quanto a resistência/suscetibilidade àmancha foliar comparada a B73. Juvenis e adultas (PI,AFL, EL).

(D) Desenvolvimento de populações segregantes BC4F2

(E) Cada planta foi testada com marcadores-alvo para asregiões introgredidas. Foram determinados QTLs

candidatos à mancha foliar(F) Desenvolvimento de NILs carregando diferentesintrogressões de Tx303 provenientes de populações F2.

(G) Validação de QTL nas NILs.

(H) Seleção de NILs carregando QTL para caracterizaçãodetalhada do mesmo.(I) NILs avaliados com vários componentes da doençaalvo em suas diferentes fases de desenvolvimento.

(B) Identificação de linhas que diferiam de B73 ou queapresentavam fenótipos extremos, além de QTLsputativos.

(J) Caracterização preliminar dos potenciais efeitos doQTL em múltiplas doenças.

Identificação de outliers e QTLs putativos à

mancha foliar na população TBBC3

• 82 linhas de introgressão

– A população TBBC3 foi geralmente mais suscetível que B73 tanto em NI quanto na CN;

– Em Aurora (NI)

• 3 linhas foram consideradas mais resistentes;

• 20 linhas foram consideradas mais suscetíveis que B73 – AFL primária;

• 39 foram mais suscetíveis que B73 com base na curva

de progresso da doença.

– Em Clayton (CN)

• 8 linhas foram consideradas mais resistentes;

• 13 foram mais suscetíveis que B73 com base na curva de progresso da doença.

Avaliação fenotípica no subconjunto de 15 linhas TBBC3

Mais resistentes que B73 (parental recorrente)Mais suscetíveis que B73 (parental recorrente)

Co

nsis

ten

tem

en

te

mais

resis

ten

teC

on

sis

ten

tem

en

tem

ais

su

scetí

vel

Validação de qNLB1.02B73 e qNBL1.06Tx303

em conjuntos selecionados de NIL

Figura 2 – Efeitos do qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 no campo. (A) Diferentes níveis

de resistência em B73, Tx303, TBBC3-38-05F (NIL com qNBL1.06) e TBBC3-42-10E-02 (com qNBL1.02). Fotos tiradas em Aurora (NI), 7ª folha - 28 DAI.

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Validação de qNLB1.02B73 e qNBL1.06Tx303

em conjuntos selecionados de NIL

Figura 2 – Efeitos do qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 no campo. (B) Substituição do aleloB73 pelo alelo Tx303 (1.02) aumenta e muito a suscetibilidade à mancha foliar. Fotostiradas em Aurora (NI), 68 DAI.

Figura 3 – Micrografias de luz da infecção e recente colonização de S. turcica em folhasde milho. Amostras da casa de vegetação coradas com azul de tripano.

Germinação do conídio e

formação do apressório.

Tubo de penetração do

apressório perfurando a cutícula e parede celular

Linhagem CML52 (resistente). Osconídios continuam a produzir novostubos germinativos até esgotar suasreservas.

Diminuição citoplasmática do conídio foi observada após processo de infecção, propagação

das hifas a células adjacentes causando morta da hospedeira.

Figura 4 – Micrografias de fluorescência da patogênese de S. turcica em folhas de milho.Amostras da casa de vegetação tratadas com azul de anilina-KOH.

Conídio

germinando na

superfície da folha.

Hifas infectivas

crescendo em

contato com as

células do mesófilo

Resposta de

defesa induzida

em torno do local da infecção.

Deposição de

calose e acúmulo

de compostos

fenólicos

autofluorescentes.

Hifas infectivas

crescendo em

direção ao feixe vascular

Hifas crescendo

fora do feixe

vascular vizinhos

Hifas se

espalhando com

sucesso pelo

sistema vascular

Movimento das

hifas através do

feixes vasculares

Colonização

necrótica de

hifas na lesão de murcha

Figura 5 – Investigação microscópica dos efeitos de QTL nos componentes da doença.

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Efeito do QTL no crescimento micelial de S. turcica na planta

Figura 6 – Quantificação do efeito do QTL no crescimento micelial de S. turcica naplanta usando DNA baseado qPCR

Coleta – 9 DAI

Caracterização preliminar dos efeitos potenciais dos QTLs para múltipla

resistência a doenças - NILs

Caracterização preliminar dos efeitos potenciais dos QTLs para múltipla

resistência a doenças - NILs

• Diferenças significativas foram observadas entre Tx303 e

B73;

– Em campo Tx303 é resistente à Murcha de Stewart e à antracnose;

– Em campo B73 é mais resistente ao carvão e à ferrugem comum;

• Evidências sugerem que qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73

foram efetivos para resistência à murcha de Stewart;

• NILs que possuiam qNBL1.06Tx303 eram mais resistentes que B73;

• qNBL1.06Tx303 foi ineficiente para resistência à antracnose, carvão e ferrugem;

• qNBL1.02B73 foi ineficiente para resistência à antracnose e carvão, mas potencialmente eficiente para ferrugem.

DiscussãoDiscussão

• 2 QTLs para resistência à mancha foliar, qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 foram identificados com sucesso, validados e caracterizados usando população de linhas de introgressão e derivados de NILs.

• O mecanismo subjacente à resistência conferido por qNLB1.02B73 e qNLB1.06Tx303

é improvável que seja o mesmo que o mecanismo subjacente a resistência qualitativa conferidos por genes importantes conhecidos atualmente.

DiscussãoDiscussão

• PI é uma característica-alvo conveniente na seleção e melhoramento para resistência a mancha foliar;

• qPCR foi empregado pela 1ª vez para medição da biomassa de S. turcica na planta (apenas nos estágios iniciais da doença);

• Apesar do custo elevado, o qPCR serve como boa ferramenta para quantificar mais cedo o grau de colonização micelial de S. turcica.

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DiscussãoDiscussão

H#1 - QTL individual afeta distintos estágios do desenvolvimento da doença

• Avaliações macro e microscópicas revelaram

características distintas de qNBL1.06Tx303 e qNBL1.02B73 e no desenvolvimento da doença;

• Incorporando um QTL eficaz em retardar a invasão da vasculatura deve assim aumentar consideravelmente a resistência total.

DiscussãoDiscussão

H#2 – Eficácia do QTL para doença é afetada pela maturidade da planta

• Geralmente a expressão consistente da resistência ou

suscetibilidade foi observada nas duas fases (floração e desenvolvimento da doença), não apresentando nenhuma implicação na eficácia destes QTLs em plantas maduras.

DiscussãoDiscussão

H#3 – A eficácia do QTL é afetado

por condições ambientais

• Uma grande limitação para aplicações de QTLs é a falta

de consistência dos efeitos destes em diversos ambientes;

• Os dados obtidos nesse trabalho foram consistentes nos locais avaliados, sugerindo sua aplicabilidade para o melhoramento genético a resistências.

• Os resultados sugerem que a resistência de qNLB1.02B73

foi expresso de forma estável na CV e no campo,

enquanto que qNLB1.06Tx303 conferia um nível de resistência maior no campo do que na CV.

DiscussãoDiscussão

H#4 – QTL para resistência à mancha foliar

inclui genes ou grupos de genes que

envolvem um amplo espectro de resistência

• Em NILs sugere-se que tanto qNLB1.02B73 quanto

qNLB1.06Tx303 abranjam gene(s) que contribuem com efeitos inespecíficos de defesa.

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ConclusãoConclusão

• Identificação bem sucedida de 2 QTLs expressos

seguramente, que pode potencialmente ser utilizado para proteger o milho de S. turcica em diferentes ambientes.

• Clonagem baseada em mapas irá revelar mais sobre os genes e os mecanismos subjacentes às características distintas de qNLB1.02B73 e qNLB1.06Tx303 nas fases da patogênese.

• Mapeamento de grandes populações foram gerados a

partir do NILs e o mapeamento fino de qNLB1.02B73 e qNLB1.06Tx303 está em andamento.

Obrigada!Obrigada!