CICLO DE BACTERIOLOGIA - ibb.unesp.br .Departamento de Microbiologia e ... Encerradas as atividades,

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    Instituto de Biocincias IBB

    Departamento de Microbiologia e Imunologia

    Disciplina de Microbiologia Veterinria

    Aluno (a): _____________________________________

    Botucatu 2012

    ROTEIROS PARA AS AULAS PRTICAS

    CICLO DE BACTERIOLOGIA

    MEDICINA VETERINRIA

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    INFORMAES GERAIS 1. Durante a permanncia no laboratrio de aulas prticas, necessrio o uso

    de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em uma sacola ou saco plstico, de modo a evitar possvel contaminao do ambiente fora do laboratrio.

    2. No deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos prticos so

    realizados. 3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a bancada ou cho, ferimentos de qualquer espcie, aspiraes de culturas na boca, etc.). 4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado. 5. Lave bem as mos com desinfetante antes de deixar o laboratrio. 6. No permitido o uso de chinelo, sandlia ou qualquer outro calado que

    deixe os ps expostos.

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    EQUIPAMENTOS E MATERIAIS COMUMENTE UTILIZADOS EM LABORATRIOS DE MICROBIOLOGIA

    1. Ala e agulha de platina 2. Bico de Bunsen 3. Placas de Petri e tubos de ensaio 4. Meios de cultura 5. Soluo salina estril 6. Pipetas e pipetas Pasteur, zaragatoas (swabs) 7. Lminas e lamnulas para microscopia 8. Corantes 9. Microscpio 10. Estufa

    11. Banho-maria 12. Autoclave 13. Forno Pasteur

    CUIDADOS PARA SE EVITAR CONTAMINAO DE CULTURAS 1) A ala e agulha de platina devem ser flambadas, isto , aquecidas na chama

    do bico de Bunsen at se tornarem vermelhas, antes e depois de qualquer procedimento de semeadura. A flambagem mais facilmente e eficientemente conseguida mantendo-se a agulha ou ala num ngulo de 45 em relao mesa de trabalho. Antes da coleta do material, deve-se resfriar o instrumento, na parede do tubo, no prprio meio estril, ou simplesmente aguardando o seu desaquecimento natural por alguns segundos.

    2) Em relao s semeaduras procedidas em tubos de ensaio, exige-se flambar

    a boca dos mesmos aps a retirada e antes da colocao do tampo de algodo. O tampo de algodo deve ser segurado pelo dedo mnimo da mo oposta que segura o tubo e nunca deixado sobre a bancada.

    3) As pipetas so previamente esterilizadas e embrulhadas em papel. Para sua

    utilizao e ao mesmo tempo evitar que se contaminem, deve-se torcer o papel na regio central da pipeta, retirar primeiramente a parte superior do papel e depois a inferior (ponta da pipeta). Depois de utilizada, a pipeta dever ser colocada dentro de um recipiente apropriado, contendo soluo desinfetante.

    4) Todo recipiente (placas de Petri ou tubos de ensaio) com cultura ou meio

    estril dever ser manuseado com cuidado de modo a no ficarem abertos e expostos ao ambiente. Com esta medida e mais a exigncia de abri-los somente prximo ao bico de Bunsen em tempo suficiente para a semeadura, colheita do material ou simples inspeo, ser evitada a sua contaminao por microrganismos do ar. Uma vez semeados, devem ser incubados em estufa. As placas de Petri devem ser envolvidas por filme plstico (tipo Magipack) antes de ser colocadas na estufa e devem permanecer com as tampas voltadas para baixo.

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    OBSERVAO DE LMINAS AO MICROSCPIO

    Nos exerccios de: bacteriologia, as lminas contendo esfregaos de material fixado e

    corado sempre sero observadas atravs de objetiva de imerso; micologia, em geral as lminas so inicialmente observadas no menor

    aumento e a seguir nos aumentos maiores (at 40X), sem necessariamente empregar a objetiva de imerso. As lminas de esfregaos de levedura so examinadas como em bacteriologia.

    Aps a observao das lminas de esfregaos, estas devero ser colocadas em recipiente com detergente, especificamente destinado a este fim. As lminas permanentes devero ser deixadas sobre a bancada.

    Depois de utilizados, os microscpios devero ser limpos e devidamente guardados.

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    CICLO DE BACTERIOLOGIA

    PRTICA 1 - MORFOLOGIA E COLORAO DAS BACTRIAS

    I - Morfologia 1. As bactrias de um modo geral, apresentam-se sob a forma de: a) cocos: clulas esfricas, b) bacilos: clulas cilndricas, em formas de bastonetes, c) espirilos: clulas espiraladas, d) vibries Estas formas bsicas esto sujeitas a variaes, caso em que so denominadas de formas pleomrficas ou formas de involuo. 2. Agrupamentos

    Segundo o (s) plano (s) de diviso celular e a disposio das clulas entre si, as bactrias podem apresentar-se em agrupamentos: a) diplococos , b) estafilococos, c) estreptococos, d) estreptobacilos II - Colorao 1. Colorao de Gram Este mtodo de colorao permite a classificao das bactrias em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas: Gram positivas: so bactrias que no se deixam descorar quando submetidas ao de solventes orgnicos (lcool, ter, etc.) e permanecem com a cor do cristal violeta. Bactrias Gram positivas cor azul Gram negativas: So, portanto, aquelas que se deixam descorar pelo solvente orgnico tomando a cor do corante de contraste (safranina ou fucsina). Bactrias Gram negativas cor vermelha 2. Colorao de Ziehl-Neelsen Constitui um mtodo especfico para a colorao das micobactrias (ex.: bacilo de Hansen e bacilo da tuberculose). Tais bactrias se caracterizam por resistirem descolorao por uma mistura de lcool-cido clordrico, depois de tratadas com fucsina fenicada e azul de metileno, permanecendo com a cor da primeiro corante. Por apresentarem esta propriedade, estas bactrias so denominadas bacilos lcool cido resistentes (BAAR). B.A.A.R cor vermelha

  • 6 EXERCCIOS A) Colorao pelo Mtodo de Gram Material - Lmina com esfregao bacteriano da cultura A - Bateria de Gram: violeta genciana, lugol, lcool, fucsina Tcnica 1. Cobrir o esfregao bacteriano com violeta genciana e aguardar um minuto. 2. Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaos com lugol. Esperar 1 minuto. 5. Escorrer o lugol e descorar os esfregaos pelo lcool. Para isto, deixe o lcool cair, gota a gota, sobre a lmina, mantendo-a inclinada. Considerar os esfregaos suficientemente descorados quando o lcool no mais retirar o corante dos mesmos. 6. Lavar a lmina em gua corrente. 7. Cobrir os esfregaos com a soluo de fucsina, esperar de 30 segundos a 1 minuto. 8. Lavar a lmina em gua corrente. Secar com auxlio de papel de filtro. 9. Observar ao microscpio e desenhar as lminas das culturas A, B, C e D. OBS: o esfregao da Cultura A foi preparado conforme a seguir: - Com o auxlio da ala de platina, fazer esfregaos bem finos sobre a lmina de microscopia. Esperar secar. - Fixar os esfregaos, passando a lmina trs vezes sobre a chama do bico de Bunsen. - Deixar a lmina esfriar para seguir com a colorao de Gram. Desenhos:

    Lmina B

    Forma:________________

    Gram: ________________

    Lmina A

    Forma:________________

    Gram:_________________

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    B) Colorao de Bactrias pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen Material - Lmina de microscopia contendo esfregao de escarro - Bateria de Ziehl-Neelsen: fucsina fenicada, lcool-cido e azul de metileno. Tcnica

    1. Cobrir a lmina com fucsina fenicada. Com auxlio do bico de Bunsen, aquecer a preparao at a emisso de vapores. Manter o aquecimento durante 5 minutos. No deixar a fucsina ferver ou secar.

    2. Escorrer a fucsina e descorar completamente pelo lcool-cido. 3. Lavar em gua corrente. 4. Cobrir o esfregao com a soluo de azul de metileno. Esperar entre 30 segundos a

    1 minuto. 5. Lavar em gua corrente e secar com papel de filtro. 6. Observar ao microscpio e desenhar.

    Lmina C

    Forma:________________

    Gram: ________________

    Lmina D

    Forma:________________

    Gram: ________________

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    PRTICA 2 ESTRUTURA DA CLULA BACTERIANA

    a) Estruturas externas Flagelos Fmbrias ou pili Cpsula Parede celular Membrana citoplasmtica

    b) Estruturas internas

    Esporo Mesossomos Ribossomos Cromossomos Grnulos de reserva Plasmdios

    EXERCCIO Demonstrao de algumas estruturas da clula bacteriana. Observar lminas previamente preparadas das seguintes estruturas da clula bacteriana: cpsula e esporos. Desenhar.

    CPSULA ESPOROS

    PRTICA 3 - MEIOS DE CULTURA E CONDIES FSICAS DE CULTIVO BACTERIANO

    A) Meios de Cultura Para o cultivo e identificao das bactrias so utilizadas solues e substncias nutritivas, denominadas meios de cultura que podem ser classificados com base na sua constituio, ou seja, quanto s substncias nutritivas que os compem, quanto ao seu estado fsico e quanto capacidade seletiva e diferencial que apresentam.

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    Quanto s Substncias Nutritivas: 1. Meios Sintticos: quando as substncias que os compem so qumicamente definidas e a concentrao e caractersticas de cada ingrediente so conhecidas com exatido. 2. Meios Simples: quando constitudos somente de substncias essenciais para o crescimento de algumas bactrias. 3. Meios Complexos: quando se adicionam ao meio simples, substncias orgnicas complexas. Quanto ao Estado Fsico: 1. Meios Lquidos: tambm denominados caldos. 2. Meios Slidos: quando se adiciona ao caldo l,5% a 2% de gar. 3. Meios Semi-slidos: quando se adiciona gar ao caldo, na concentrao igual ou menor que 0,5%. Quanto capacidade seletiva e diferencial: 1. Meios Enriquecidos: so meios simples adicionados de certas substncias como soro, sangue, extrato de levedura, etc. Estes meios servem para o cultivo de bactrias que necessitam de substratos complexos. Ex: meios de gar sangue, de gar chocolate, de gar soro, etc. 2. Meios Seletivos: so meios de cultura con