'~~

~

Capítulo 1 9Cinética Enzimática

-\ cinética enzimática, estudo da velocidade de uma reacção em presença de um enzima, constitui umJ\ capítulo fundamental da enzimologia. Paraafirmá-lo, basta ter em conta a sua contribuição para o estudo

~ "1ecanismos de reacção enzimática. Em muitos estudos cinéticos não se exigem formas purificadas de enzima,

-:Jamentos sofisticados e os protocolos são relativamente simples - motivos que têm contribuído para a

~laridade da cinética enzimática entre os bioquímicos.

cÇe capítulo faz-se o estudo cinético de uma reacção de um substrato e de um produto à qual se aplica a~...ação de Michaelis-Menten (também designada por equação de Henri-Michaelis-Menten). Descrevem-se os

-é-.;x!os de determinação dos parâmetros cinéticos de uma reacção enzimática. Finalmente, apresentam-se os-ecanismos mais comuns de inibição da actividade enzimática.

"'"--'-- ---"lJI--

~omenclatura e Mecanismos de~;3

- ~ção de Cleland é usada para descrever inter-~ entre enzima e substratos: os substratos são

~.:,dDSpelas letras A, B, c... de acordo com a::;;.de ligação ao enzima e os produtos por P, Q ejc acordo com a ordem de dissociação a partir

...:Jmplexosenzimáticos:

~~~formas enzimáticas são representadas por<mlalinha horizontal, sendo a adição de subs-Jatos (ou outros ligandos) e a libertação de?Wdutos representadas por setas verticais..-.cSsetas podem incluir as constantes de velo-cidade (kb k.h kz, k.z...)..~ diferentes formas de enzima, por exemplo os~mplexos enzimáticos e as formas livres,representam-se sob a linha horizontal.::; número de substratos e produtos envolvidos~ processo enzimático é designado por Uni, Bi,

Ter ou Quad. Assim, por exemplo, uma reacçãoque envolva dois substratos e dois produtos édesignada por BiBi, mas se apenas ocorrer aformação de um produto a partir de dois subs-tratos é uma reacção BiUni. Estes termos usam--se conjuntamente com a designação do tipo demecamsmo.

Mecanismos em que a ligação dos substratos e/ou a libertação de produtos não ocorre numa ordemdeterminada são designados por mecanismos aoacaso; pelo contrário, um mecanismo é ordenadoquando existe uma ordem determinada na ligação(Fig. 19.1). Se todos os substratos se ligarem aocentro activo do enzima antes da saída de qualquerproduto, o mecanismo é designado por sequencial;no entanto, um enzima pode catalisar a transfor-mação de um substrato em produto, antes da ligaçãode um segundo substrato - mecanismo ping-pong(não sequencial) (Fig. 19.2). Um exemplo de me-

. 272

(a)

(b)

Figura. 19.1. Mecanismo BiBi ordenado (a): o substrato B liga-se aocomplexo EA; após a "isomerização" do complexo ternário EABemEPQ, libertar-se-ão os produtos da reacção. Mecanismo BiBiao acaso(b): neste mecanismo, não existe ordem preferencial para a ligaçãode substratos e/ou libertação de produtos.

E

i r r r

GEA'\ E' E'B'\E'P) Eq)

E

Figuras 19.2. Mecanismo BiBi ping-pong: trata-se de um mecanismonão sequencial, pois o substrato B liga-se após a libertação doproduto P. Entende-se que a sua ligação ao enzima só pode ocorrerse este for previamente modificado. No exemplo da reação detransaminação, essa modificação do enzima tem a ver com a alte-ração do cofactor fosfato de piridoxal.

canismo ping-pong observa-se nas reacções catali-sadas por aminotransferases ("transaminases"). O en-zima encontra-se ligado ao fosfato de piridoxal; apósa ligação de um aminoácido (A), este transforma-seem oxoácido (P) que é libertado. Com a saída doprimeiro produto de reacção, o grupo amina ficaligado ao cofactor, formando uma piridoxina. A suaregeneração a fosfato de piridoxal, sempre ligadoao enzima, só ocorre com a ligação de um novosubstrato (B), um oxoácido que passa então a ami-noácido (Q).

BIOQuíMICA - Organização Molec~ ~

19.2. Cinética de uma Reacção L"A equação de Henri-Michaelis-Me-No âmbito deste capítulo, estudar-se-á a c~-uma reacção UniUni segundo o modelo de ~::......-Menten (Fig. 19.3). Esta situação pode, por e--aplicar-se a hidrolases (H20 em excesso), iSG:::.:'."e à maioria dos liases.

A

I rE EA E

Figura 19.3. Mecanismo Uni Uni representado pela ~.::Cleland.

O modelo admite implicitamente que:

.A catálise ocorre através da formaçãc ::: ,

reversível de um complexo (EA) entre =::(E) e substrato (A).. Só se considera um passo com imporiZ;;- :..;

ponto de vista cinético entre o comple=. ~a libertação de produto (P) com regener ~,'!IIenZlma.

. O passo da formação de produto é irr.:' :-;;,'1(cinética de velocidades iniciais).

kl k2A + E ~ EA ~ E + P

kl

Apesar das limitações do modelo de ~fi ::

-Menten, a sua aplicação tem sido útil no es-"~'"um elevado número de reacções enzimáticas.. =::::"com enzimas com mais de um substrato. NeSte' -'

variando apenas a concentração de um substn..JIIIIobservar-se uma cinética de Michaelis-Menrcr.

Define-se para uma reacção, uma veloci~ ]cial (vo) que deve ser proporcional à cooc~inicial de enzima presente, isto é,

Vo = k(Eo1

Para uma concentração de enzima c.;::.observa-se que a velocidade inicial depenck ~ ,~j

centração inicial de substrato. Para muitos ~]IIesta relação pode ser representada por me. =-~-hipérbole (Fig. 19.4); a cinética de uma rea :

A B P Q

I I ! !-

E EA GEABJ EQ EEPQ

B A Q P