13
Universidade Católica de Brasília Curso de Formação Geral da Saúde Disciplina: Bioquímica Professora: Patrícia Silvestre Limeira Horário: 3AB Relatório Nº 3 CINÉTICA ENZIMÁTICA Clarissa Machado e Dias Borges Jairo de Sousa Martins Kacyus Handell de Almeida Silva

CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Universidade Católica de Brasília

Curso de Formação Geral da Saúde

Disciplina: Bioquímica

Professora: Patrícia Silvestre Limeira

Horário: 3AB

Relatório Nº 3

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Clarissa Machado e Dias Borges

Jairo de Sousa Martins

Kacyus Handell de Almeida Silva

Page 2: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Introdução:

Cinética enzimática é a análise quantitativa do efeito de cada um dos fatores que influencia a atividade enzimática avaliada através do aumento ou redução da velocidade da reação catalisada. A atividade da enzima é determinada pela concentração da enzima, a concentração de cofatores, pH, temperatura e concentração do substrato.

Figura 1: Imagem gerada por computador de um modelo da estrutura tridimensional da enzima purina nucleósido fosforilase bacteriana. (http://pt.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica)

Enzimas são catalisadores biológicos, formados por longas cadeias de aminoácidos. São um tipo de proteína com atividade catalítica, sendo encontradas na natureza em todos os seres vivos. Sua função é viabilizar a atividade das células, quebrando moléculas ou juntando-as para formar novos compostos. A singularidade desses compostos decorre do elevado grau de especifidade ao substrato em condições moderadas, sob as quais atuam. Algumas enzimas são específicas para determinado tipo de ligação química, como, por exemplo, a capacidade da α-amilase de romper unicamente as ligações α-1,4 das moléculas de amido. “Toda enzima é uma proteína, mas nem toda proteína é uma enzima.”

Page 3: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Figura 2: enzima de Trypanosoma cruzi. (http://boletim.ifsc.usp.br/Todas-Noticias.php?rowid_home=1240&rowid_vol=76)

O sítio ativo é constituído pelo conjunto de aminoácidos que entram em contato com o substrato. O centro catalítico atua sobre o substrato e o leva a sofrer a reação química e o local de fixação se combina por meio de ligações fracas.

A velocidade de uma reação enzimática é obtida pela medida da quantidade de produto formado pela unidade de tempo.

S + E P + E

Aonde: S= Substrato; E= Enzima; P= Produto.

A velocidade da reação enzimática pode ser medida de duas maneiras:

Pela reação em um tempo (t): v =d[P]

dt

Pelo decréscimo da concentração de substrato: v =d[S] Dt

Page 4: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Figura 3: velocidade de uma reação enzimática em presença de quantidades crescentes de enzima. (http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/concn_subst.htm)

Muitos fatores influenciam na atividade de uma enzima. Os que são mais importantes são: temperatura, pH, concentração de substrato, presença ou não de inibidores.

Temperatura: A velocidade de quase todas as reações químicas aumenta quando a temperatura aumenta. Nas reações enzimáticas, entretanto, as elevações além de certa temperatura reduz drasticamente a velocidade da reação. A temperatura enzimática ótima para a maioria das enzimas está entre 35 e 40ºC.

Figura 4: Diagrama esquemático mostrando o efeito da temperatura na atividade de uma enzima (http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/temperat.htm)

pH: A maioria das enzimas tem pH ótimo na qual a sua atividade é máxima. Quando está acima ou abaixo deste valor de pH, a atividade enzimática e a velocidade da reação diminuem.

Page 5: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Figura 5: efeito do pH na atividade de uma enzima.(http://qnint.sbq.org.br/qni/visualizarConceito.php?idConceito=57)

Concentração de substrato: Há uma taxa máxima na qual certa quantidade de enzima pode catalisar específica reação. Apenas quando a concentração de substrato é muito alta, essa taxa máxima pode ser alcançada.

Figura 6: efeito da concentração de substrato na atividade da enzima (http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/concn_subst.htm)

Inibidores: Qualquer substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática pode ser considerada como inibidor. Inibição competitiva ocorre quando um inibidor compete com o substrato por ligação com enzima livre. Alguns destes são estruturalmente semelhantes ao substrato ou ao produto, enquanto outros são estruturalmente diferentes.

Na inibição não-competitiva uma situação mais complicada ocorre, quando um inibidor reversível se liga tanto à enzima livre como ao complexo ES. Este

Page 6: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

modo de ligação leva a uma inibição de atividade mesmo com a presença de concentração elevadas de (S). ( DEVLIN, 2007)

Algumas vezes quando uma grande quantidade de substrato está presente, a velocidade da reação catalisada por enzima diminui pelo excesso de substrato. Este fenômeno é chamado inibição pelo substrato. Nesse caso, a velocidade da reação v atinge um máximo quando a concentração de substrato é aumentada até certo valor, e diminui quando a concentração de substrato ultrapassa esse valor. (Lehninger, 2002)

Figura 7: efeito de inibidores na atividade da enzima (http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/inibidores.htm)

Page 7: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Objetivos:

Observar efeito da concentração de substrato na atividade enzimática Observar efeito do pH na atividade enzimática Observar efeito da temperatura na atividade enzimática

Materiais:

Saliva Água destilada Amido 1% (mL) Amilase diluída 1:10 Reagente de Lugol Fosfato pH 7 Ácido acético pH 2 Carbonato de cálcio pH 9,7 Tubo de ensaio Banho Maria 37ºC Isopor com gelo Pipeta de Pasteur Pipetador Pipetas graduadas

Metodologia:

Efeito da concentração do substrato: Separar os 7 tubos para adicionar amido conforme os volumes citados na tabela e completa-los com água também conforme a tabela. Adicionar 0,1 mL de amilase no fundo do tubo de ensaio e agitar bem. Aguardar o banho maria a 37ºC por exatamente 3 minutos, após isso mergulhar os tubos juntos. Aguardar esfriar e adicionar de 2 a 3 gotas do reagente de Lugol. Analisar os resultados, observando a diferença de coloração entres os tubos.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7Amido 1% (mL)

0,0 0,2

0,4 0,6

1,0 2,0

3,2

Água 3,2 3,0

2,8 2,6

2,2 1,2

0,0

Page 8: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Efeito do pH: Preparar os tubos e adicionar 0,5 mL de amilase diluída em cada tubo, sempre no fundo e agitando bem. Esperar por 10 minutos. Adicionar de 2 a 3 gotas de reagente de Lugol. Analisar os resultados.

Tubo Volume do tampão (mL) Amido (mL)1 – fosfato pH 7 1,0 2,02- ácido acético pH 2 1,0 2,03- carbonato de cálcio pH 9,7 1,0 2,0

Efeito da temperatura: Preparar 3 tubos de ensaio e adicionar em cada um 2 mL de amido 1% e 1mL de tampão fosfato. Coloque previamente os tubos: 1 no gelo, 2 a 37ºC e 3 em água fervente por aproximadamente 5 minutos para o equilíbrio térmico. Adicionar 0,1mL da solução de amilase e sempre agite bem. Aguardar exatamente 10 minutos e teste a hidrólise com Lugol (2 a 3 gotas de reagente de Lugol). Analisar os resultados.

ATENÇÃO: Coletar saliva (1,0 mL e adicionar 9,0 mL de água destilada) em um tubo de ensaio, o mesmo corresponde a solução de amilase diluída 1:10.

Page 9: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Bibliografia:

NELSON, D.L & COX, M. M. Lehninger. Princípios de bioquímica. 4ª Edição. Editora Sarvier, 2006.

MOTTA T., VALTER. Bioquímica básica. 2ª Edição. Editora Medbook, 2011.

STRYER, L., BERG, J. M., TYMOCZKO, J. L. Bioquímica. 6ª Edição. Editora Guanabara-Koogan, 2008.

MARZZOCO, A. & TORRES, B.B. Bioquímica Básica. 3ª Edição. Editora Guanabara Koogan, 2007.

PALERMO, Jane Rizzo. Bioquímica da nutrição. 1ª Edição. Editora Atheneu, 2008.

Bibliografia das imagens:

http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/inibidores.htm

http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/concn_subst.htm

http://qnint.sbq.org.br/qni/visualizarConceito.php?idConceito=57

http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/temperat.htm

http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/concn_subst.htm

http://boletim.ifsc.usp.br/Todas-Noticias.php?rowid_home=1240&rowid_vol=76

http://pt.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica

*TODOS FORAM ACESSADOS EM 13/04/2013.

Page 10: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Discussão:

Efeito do pH:

As diferenças observadas deve-se ao fato de que as enzimas, em sua maioria, possuem um pH característico no qual sua atividade é máxima. Mudanças extremas de pH podem alterar a estrutura da enzima devido a uma repulsão de cargas, a velocidade da reação diminui na medida que o pH se afasta do valor ideal que cada enzima possui. No caso da amilase, seu pH é relativamente neutro, por isso que o ponto ideal foi alcançado num tempo menor quando se utilizou a amostra de pH 7. Acima ou abaixo desse pH, a enzima trabalha de forma mais reduzida, e por esse motivo o ponto ideal demorou mais de ser alcançado quando se utilizou a amostra de pH 9,7 e nenhuma atividade foi verificada com a aplicação do pH 2,0.

Efeito da temperatura:

O pH da saliva é em torno de 7, portanto é neutro. Foram testadas temperaturas de 37ºC, 92ºC e um isopor com gelo. Observou-se que ao adicionar Lugol, o único experimento que não reagiu foi o 37ºC, o que conclui que a amilase é neutra e está em seu estado normal à 37ºC.

IMPORTANTE: NA HORA DO EXPERIMENTO, ESQUECEMOS DE DEIXAR OS TUBOS DE ENSAIO QUE ESTAVAM NO GELO VOLTAREM PARA A TEMPERATURA AMBIENTE, PORTANTO, OS MESMOS NÃO REAGIRAM CONFORME O ESPERADO.

Efeito da concentração:

Após adicionar os conteúdos mandados para cada tubo de ensaio, coloca-los em banho maria, esperar esfriar e adicionar o Lugol, concluiu-se que quanto maior a presença de amido no tubo de ensaio, mais escura fica a coloração da amostra, conforme a tabela abaixo:

Tubo

Amido 1% Água Coloração final

1 0,0 3,2 Clara2 0,2 3,0 Mais escuro que o 13 0,4 2,8 Mais escuro que o 24 0,6 2,6 Mais escuro que o 35 1,0 2,2 Mais escuro que o 46 2,0 1,2 Mais escuro que o 57 3,2 0,0 Mais escuro que o 6

Fotos:

Page 11: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3

Efeito do pH

Efeito da temperatura

Efeito da concentração

Page 12: CINETICA ENZIMÁTICA PRE RELATORIO 3