CITOMETRIA DE CITOMETRIA DE FLUXOFLUXO

Aplicações práticasAplicações práticas

Patrícia Cisneiros dos SantosPatrícia Cisneiros dos SantosBióloga- UCSALBióloga- UCSAL

Mestranda do curso de Imunologia-UFBaMestranda do curso de Imunologia-UFBa

PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO

CITO METRIA FLUXO

Célula Medida Movimento

Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

ANTICORPOS MONOCLONAIS

ANTICORPOS MONOCLONAIS

CITÔMETRO DE FLUXO

CITÔMETRO DE FLUXO

SISTEMA FLUIDO SISTEMA ÓTICO

SISTEMA ELETRÔNICO

SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS PARTÍCULAS EM UM FLUXO CONTÍNUO

SISTEMA ÓPTICO: GERA E COLETA OS SINAIS DE LUZ.

SISTEMA ELETRÔNICO: CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS PARA ANÁLISE NO COMPUTADOR.

FOCO DO LASERFOCO DO LASER

CÂMARA DE FLUXOCÂMARA DE FLUXO

SISTEMA FLUIDO

CONVERGÊNCIA HIDRODINÂMICA

Low Sample Pressure12µl/min

Sample

LaminarFlow

LOW DIFFERENTIAL PRESSURE

Sheath SheathSample

LaminarFlow

Sheath Sheath

FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH”

HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE

High Sample Pressure60µl/min

SISTEMA ÓPTICOSISTEMA ÓPTICO

SISTEMA É COMPOSTO POR UM LASER E LENTES PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER.

A COLEÇÃO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A DISPERSÃO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA PELAS PARTÍCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE DO LASER.

UM SISTEMA DE ESPELHOS ÓPTICOS E FILTROS DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA LUZ PARA OS DETECTORES ÓPTICOS ESPECÍFICOS.

FACSCaliburFACSCaliburFL1

Red Diode LaserRed Diode Laser~635 nm~635 nm

SSC

FL3

FL4

670LP

661/16

585/42

488/10

90/10 Beam Splitter

DM 560SP

FluorescenceCollection Lens

DM 640LP

Half Mirror

488/10

.488 nm488 nm

Blue LaserBlue Laser FSC Diode

FocusingLens

FL2

530/30

Beam CombinerFlowCell

FlowCell

SISTEMA ÓTICO

Filtros Ópticos – coletar sinais de luz

Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu número é deixado passar e menor que seu número é refletido.Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu número é deixado passar e acima de seu número é refletido.Espelhos BP (bandpass) = só deixa passar o comprimento de onda específico.

SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/30BP500/30

Longpass Shortpass Bandpass

460 500 540 460 500 540460 500 540

Filtro

Detector – célula fotoelétrica

ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)

ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)

LASER

SISTEMA ELETRÔNICOSISTEMA ELETRÔNICO

CONVERTE OS SINAIS ÓPTICOS EM SINAIS ELETRÔNICOS PROPORCIONAIS, DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM ANALISADOS NO COMPUTADOR.

A medida proveniente de cada detector é denominada Parâmetro

• Parâmetro 1 FSC• Parâmetro 2 SSC• Parâmetro 3 FL1• Parâmetro 4 FL2 • Parâmetro 5 FL3

SISTEMA ELETRÔNICOSISTEMA ELETRÔNICO

FLUORESCÊNCIA

O que é a fluorescência ?Comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da

luz do laser

Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior

comprimento de onda

Fluoresceína

= 530 nm

Luz Incidente de maior energía Fluorocromo

CO2H

OOH = 480 nm

FLUORESCÊNCIASFLUORESCÊNCIAS

O detector de O detector de FL-1FL-1 (Fluorescência 1) capta (Fluorescência 1) capta luz de comprimento de onda luz de comprimento de onda 530 nm, que 530 nm, que corresponde à luz verde.corresponde à luz verde.

O detector de O detector de FL-2 FL-2 (Fluorescência 2) capta (Fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda luz de comprimento de onda 570 nm, o que 570 nm, o que corresponde à luz laranja.corresponde à luz laranja.

O detector de O detector de FL-3 FL-3 (Fluorescência 3) capta (Fluorescência 3) capta luz de comprimento de onda luz de comprimento de onda 650 nm, o que 650 nm, o que corresponde à luz vermelha.corresponde à luz vermelha.

SISTEMA ELETRÔNICO

DISPERSÃODISPERSÃO

POLIMORFONUCLEARES

LINFÓCITOS

MONÓCITOS

DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS

BLASTOSV

OLU

ME

(F

S)

VO

LUM

E (

FS

)

GRANULOSIDADE (SS)GRANULOSIDADE (SS)

DISPERSÃO:DISPERSÃO:

Sid

e S

catt

er

Forward Light Scatter

0 200 400 600 800 1000

02

00

40

06

00

80

01

00

0

Linfócitos

Monócitos

Neutrófilos

Visão dos dados coletadosS

ide S

catt

er

Forward Light Scatter

0 200 400 600 800 1000

02

00

40

06

00

80

01

00

0

CD3 FITC

CD

4 P

E

0 200 400 600 800 1000

0

200

400

600

800

1000

•DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL2

ALGUNS MARCADORESALGUNS MARCADORESCD3CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos - presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos

timócitos.timócitos.

CD4CD4- 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo - 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticasauxiliar, mas também em monócitos, macrófagos e células dendríticas

CD8CD8-- 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica. 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxica.

CD19CD19- presente em mais de 95% das células B.- presente em mais de 95% das células B.

CD20CD20-- assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do assim como o CD19 está presente em todas as células B maduras do tecido linfóide e sangue periférico.tecido linfóide e sangue periférico.

CD45- CD45- expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo expresso quase exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.

CD56CD56- marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou - marcador de NK, não está expresso em células B, monócitos ou granulócitos.granulócitos.

CD10

CD2

CD20

CD3

CD7

CD19

CD22

CD23

CD26

CD5

Leucemias Linfociticas ou

Enfermidade residual mínima

CD3

CD7

HLA DR

CD 42a

CD 61

CD19

CD33

CD13

CD14

CD34

Leucemias mielóides

CD3

CD7

CD2

CD19

CD5

CD56

Linfomas e Mielomas

LEUCEMIAS

APLICAÇÕES CLÍNICAS

- Análise da subpopulação linfocítica

- Diagnóstico e acompanhamento de leucemias e linfomas

- Diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo

- Detecção de células neoplásicas não-hematopoiéticas

- Monitoramento quimioterapêutico / doença residual mínima- Análise de reticulócitos

- Diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna

- Detecção de anticorpos antiplaquetários

- Análise do conteúdo de DNA- Quantificação de células progenitoras (Stem cells)- Avaliação imunológica de paciente transplantado, de infusãolinfocitária

OBRIGADA A TODOS!OBRIGADA A TODOS!

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