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 Engenharia Genética e a Tecnologia do DNA recombinante: CLONAGEM MOLECULAR 

Clonagem Molecular

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Engenharia Genética e a Tecnologia do DNA recombinante:

CLONAGEM MOLECULAR 

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CLONAGEM

NDB – Núcleo de Difusão BiotecnológicaBiotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.

Desenvolvimento Inicial da Genética Clonagem

1953 – Estrutura do DNA - Watson e Crick.

1971-1973  – Desenvolvimento das Técnicas de Clonagem de DNA – Boyer e Cohen  

1962  –

1ª evidência da existência de Nucleases de Restrição  –

Linn e Arber .

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• Após 1973 – o DNA passou a ser a molécula mais fácil de ser analisada.

As técnicas de clonagem permitiram:

isolar, seqüenciar e manipular genes individuais

de qualquer tipo celular; possibilitando estudos

moleculares detalhados da estrutura e função dos

genes eucarióticos.

Fundamental importância para o desenvolvimento de estudos na Biologia Celular,Bioquímica e Genética 

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Clonagem MolecularIsolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas, permitindo a obtenção deuma amostra pura de um gene individual, separado de todos os outros genes da célula.

Etapas:

1- O fragmento do DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outramolécula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA 

recombinante .

2- A molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeiracompatível, num processo chamado de transformação . A célula hospedeira queadquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante.

Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisãocelular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante.

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Técnicas de Clonagem

Desenvolvimento fundamentado pela descoberta de:

● Enzimas de Manipulação de DNA.

● Vetores de Clonagem.

● Desenvolvimento de Métodos de Transformação deBactérias.

● Métodos Capazes de Distinguir Células Transformadas denão Transformadas.

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Enzimas Utilizadas na Manipulação

de DNA 

● Nucleases

• Exonucleases 

• Endonucleases

● Ligases

● Polimerases

Clivam, encurtam e degradamMoléculas de DNA, quebrandoligações fosfodiéster que únemnucleotídeos adjacentes.

Removem um nucleotídeo porvez, a partir da extremidade deuma molécula.

Quebram ligações fosfodiéster nointerior da molécular de DNA.

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1962 - Endonucleases de Restrição.

• As bactérias produzem uma enzima quedegrada o DNA de fagos antes que eletenha tempo para se replicar.

• O DNA bacteriano é protegido do ataque

por ser portador de grupos metila adicionais,os quais bloqueiam a ação da enzima.

Estas enzimas reconhecem seqüências

específicas de 4 a 8 pares de base (pb)na molécula de DNA e fazem dois cortes,um em cada fita.

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2 tipos distintos de clivagem:

O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma seqüênciapalindrômica , isto é, ela tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de umafita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta

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• A função das ligases na célula é reparar quebras em fitas individuais, que

surgem em moléculas de DNA de fita dupla durante a replicação do DNA .

Ela atua na clonagem molecular unindo ofragmento de interesse ao vetor utilizado,formando um híbrido vetor/fragmento.

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Junção de duas fitas de DNA

A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias deDNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia

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Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas emcoesivas pela adição de poli (A) e poli (T).

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Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformados emcoesivas pela adição de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restriçãoque reconhece o adaptador.

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• São enzimas que sintetizam uma nova fita de DNA, complementar a ummolde de DNA ou RNA preexistente

DNA Polimerase

Sua importância na clonagem molecular se dá,principalmente, em reações de PCR (Reaçãoem Cadeia da Polimerase), e na construção

de bibliotecas de DNA recombinante.

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Vetores de Clonagem

• Dependendo do tamanho do inserto de DNA e da finalidade doexperimento, muitos tipos diferentes de vetores de clonagem podemser utilizados para geração de moléculas recombinantes.

Tipos de Vetores:

● Plasmídeos  – clonagem de até 15.000 bp

● Fagos - clonagem de até 23.000 bp

● Cosmídeos  – clonagem de até 35 a 40 kb

● Cromossomo Artificial de Leveduras (YACs) - Clonam até 20 a 40 kb

● Cromossomo Bacteriano Artificial (BACs) - podendo alguns cloneschegar a 300 kb. 

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Plasmídeos

● Propriedades: 

● Origem de replicação (O)

Multiplicar-se de maneira independente 

● Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC)Sítios p/ várias enzimas de restrição 

● Gene marcador (AmpR)

● São os mais simples e mais utilizados na clonagem gênica;

● Restrição: tamanho de DNA a ser inserido (máximo 15.000bp)

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Eletroporação 

Submeter células competentes de E. coli a um pulso de altavoltagem:

● Como conseqüência do campo elétrico gerado, a membranaplasmática desestabiliza (ddp), produzindo poros transitórios

e permitem a passagem de macro e micromoléculas.

● É bastante eficiente e simples

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Cloreto de Cálcio: Choque Térmico 

- As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcioseguido de um choque térmico de curta duração. 

- Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas do DNA e da membrana

bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do

choque térmico.

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AATGCTTCG........CTGAGTAA

ATTACCAAGC........GACTCAT

Seleção das Células Transformadas 

- A identificação das colônias recombinantes é feita utilizando característicasconferidas pelos vetores:

• Marcadores de Seleção lac Z (-galactosidade)AmpR

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AATGCTTCG........CTGAGTAA

ATTACCAAGC........GACTCAT

Meio Seletivo

Amp + X-Gal

Seleção das Céls. Tansformadas 

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Bibliotecas de DNA

São coleções dos clones recombinantes obtidos por ligaçãode fragmentos de DNA de interesse a um vetor.

Amplificação do seu DNA de interesse 

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Bibliotecas de DNA

● Bibliotecas Genômicas:

Contêm clones portando fragmentos de DNA representantes de todoo genoma do organismo

- Fragmentos entre 20 e 40 kb. 

● Bibliotecas de cDNA:Clonar apenas mensagens que são

transcritas em mRNAs.

- É mais seletiva- Isolamento de genes específicos- Exclui regiões intrônicas- Baseia-se na transcrição reversa do mRNA de

interesse 

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Bibliotecas de cDNA

● Dependente da síntese de um cDNA a partir deum mRNA

- Transcriptase reversa

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Bibliotecas de DNA Genômico● Utilizada em Projetos Genomas

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DNA Genômico x cDNA

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Bibliotecas de DNA Genômico

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Bibliotecas de DNA Genômico x cDNA

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Biotecnologia: o DNA em foco

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