Células-tronco e Regeneração...Regeneração = Células-tronco adultas/ progenitoras/ quiescentes. Zigoto = Totipotente Resultado da união do ovócito ao espermatozóide. É o

Células-tronco e Regeneração

Conhecer a terminologia, conversar com pesquisadores, impressionar

amigos e familiares nas festas...

Objetivo desta aula…

Ler artigos e assistir reportagens e realmente entender a mensagem, ter

opinião própria e lúcida sobre o assunto

Saber um pouco da história da pesquisa em células-tronco, como

chegamos até aqui? Onde estamos? Para onde vamos? Questões existenciais...

Regeneração - Qual a necessidade?

Aplicação na vida real

Conceito de Regeneração

Animais com grande capacidade de regeneração

Reparo Regeneração

Solução imediata para um problema Resolução e desaparecimento do problema

Reparo Regeneração

Solução imediata para um problema Resolução e desaparecimento do problema

Cicatriz = propriedades materiais diferentes do tecido original (não tem

elasticidade, não apresenta crescimento de pelos)

Não é funcional

Formação de novo tecidos com funções fisiológicas e morfológicas

preservadas

Reparo Tecido Cicatricial = Resposta Inflamatória, remodelamento de matriz extracelular

Lesão de medulaA cicatriz pode impedir

a aproximação dos prolongamentos

neurais

DerrameA cicatriz glial diminui a

atividade neural na área lesada

Ataque cardíacoO tecido cicatricial não apresenta a habilidade

de batimento compassado (fibrose)

Nós perdemos milhões de células a cada segundo

Um bilhão de células por hora

Sem o mecanismo de reposição destas células, nós

perderíamos...

Intestino: 2 horas

Pele: 3 semanas

Hemácias: 4 meses

Ossos: 5 anos

Importância das células-tronco na regeneração

Implantes Biônicos

Implantes Biônicos

Tecidos naturais ainda são insubstituíveis

- Auto-manutenção constante- Adaptação- Interligação

Porém, são muito difíceis de se conseguir - Transplantes

- Rejeição- Medicação constante (imunossupressores)- Nem todos os órgãos podem ser transplantados

Auto-renovação;

Manter-se indiferenciada;

Diferenciação em tipos celulares diferentes

Quem são as Células-tronco?

Célula-tronco (características especiais)

Auto-renovação, Indiferenciação e Diferenciação

Potencial = Quantidade de possíveis destinos que a célula-tronco pode adquirir (totipotente, pluripotente, progenitores)

Determinação do destino (músculo, osso, pele, neurônios, etc)

Regeneração ≠ Reparo tecidual (células-tronco adultas)

Uso terapêutico (estabelecidos/pesquisas)

Gametogênese: Formação dos óvulos e espermatozóides , redução dos cromossomos

Fertilização: União de óvulo e espermatozóide

Embriogênese: Formação do embrião (zigoto)

De onde vem as células-tronco?

Zigoto

Resultado da união do óvulo ao espermatozóide. É o início de um

novo organismo.

Embriologia

Primeira Clivagem

Nos seres humanos, a primeira clivagem (ou divisão celular) acontece cerca de 30 horas após a fecundação

(dia 1).

(blastômeros)

Embriologia

Clivagem: estágio de 4 células

As células tornam-se menores a cada divisão mitótica.

Embriologia

Clivagem: estágio de 8 células

Ao chegar neste estágio, as células começam a mudar sua forma e se agrupar firmemente, tornando-se

compactas.Essa proximidade entre as células permite uma interação entre as células e troca de informações.

Embriologia

Mórula

Ao atingir 12 a 32 células, a estutura recebe o nome Mórula (amora).

~4 dias após a fecundação

Começa a formar-se a cavidade blastocística (infiltração de fluído

uterino)

Embriologia

Blástula ou Blastocisto

O fluído aumenta a cavidade interna(~6 dias após a fecundação)

Duas estruturas se formam: 1) Trofoblasto (células externas);2) Embrioblasto (células internas)

Embriologia

Trofoblasto (placenta)

Embrioblasto (embrião)

Embriologia

Embriologia

Pluripotentes

Progenitores

Totipotentes

Cels diferenciadas

zigotoAdultas

Medula Óssea

≠

Regeneração é o uso das células-tronco para gerar novo tecido/órgão funcional

Diferente entre as espécies

Que tipo de célula-tronco é melhor para a REGENERAÇÃO?

Gametogênese: Formação dos óvulos e espermatozóides , redução dos cromossomos

Fertilização: União de óvulo e espermatozóide

Embriogênese: Formação do embrião (zigoto)

Regeneração = Células-tronco adultas/ progenitoras/ quiescentes

Zigoto = Totipotente

Resultado da união do ovócito ao espermatozóide.

É o início de um novo organismo.

O Zigoto é uma boa célula para regeneração?

Trofoblasto (placenta)

Embrioblasto (embrião) Células da Massa Interna

Degeneração MacularParkinson

ELA (esclerose lateral amiotrófica

Cardiopatias, Anemia, Leucemia, Artrite,

Fratura óssea

DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica)

DiabetesCirrose

Infertilidade

Células-tronco Embrionárias (ES)

As células-tronco embrionárias são boas fontes celulares para

regeneração?

Pluripotentes

Progenitores

Totipotentes

Cels diferenciadas

zigotoAdultas

Medula Óssea

As células-tronco adultas ou progenitoras são boas células

para regeneração?

Células-tronco Adultas - Regeneração

Sangue

Pele

Epitélio Intestinal

Uso terapêutico de células-tronco (adultas)

Todas as células-tronco são capazes de regeneração, o que varia é o potencial e o controle

Célula-tronco embrionária

EctodermaProgenitores

NeuraisNeurônios

C-MycLin28SSEA3SSEA4

Smad2/3Oct3/4FoxD3NanogCriptoSox2

Sox17

Notch1NestinTP63

Β3-TubulinaNestinaMAP2ABCG2MashAtoh7

NestinaJagged

SinapsinaTau

GluR2GluR4

SinaptotosinaRodopsinaCalbindina

Pluripotente Progenitor DiferenciadaZigoto

Determinação do Destino = Diferenciação

Como a célula controla estes processos de divisão e diferenciação?

Oscar Hertwig (~1916)

Os cromossomos controlam a célula

Wilhelm His (~1892)

Os componentes do citoplasma controlam a célula

Edmund Wilson (~1928)

Todo mundo tem uma certa razão…

Vou mais além…EPIGENÉTICA e

MICROAMBIENTE meus senhores!

Conrad Waddington (~1942)

Era moderna de pesquisa com células-tronco

No laboratório…

Como identificá-las?

Como isolá-las?

Qual a participação dos genes?

Podem ser manipulados por experimentação?

Quais os fatores envolvidos?

Estas células podem fazer o que EU quero?

Fre et al., PLosOne 2011http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0025785

Identificação das células-tronco(utilização dos conceitos conhecidos)

Barker et al., Nature 2007 doi:10.1038/nature06196

Diferenciação - Quimeras


No laboratório…


Como isolá-las?





Isolamento das células-tronco

Isolamento das células-tronco

Após conhecimento de marcadores específicos



NeuraisNeurônios



Sox17

Notch1NestinTP63


NestinaJagged

SinapsinaTau

GluR2GluR4


Pluripotente Progenitor DiferenciadaZigoto

Marcadores específicos


No laboratório…


Como isolá-las?

Qual a participação dos genes? Clonagem e Cultivo




1962 - Sir John Gurdon = Primeira reprogramação nuclear (clonagem de sapo)O potencial das células-tronco poderia ser reativado

- Sir John Bertrand Gurdon

- Nascido em 2 de outubro de 1933

- Durante seus estudos (1948-1949) , dos 250 alunos inscritos no curso de biologia, suas notas eram as mais baixas de todas, sendo o último no ranking dos estudantes

- Seus professores diziam que tentar uma carreira como cientista era “ridículo e uma perda de tempo para ele e aqueles que tivessem que ensiná-lo”

- Tentou trocar de curso se matriculando em disciplinas de História e Sociologia, mas foimatriculado erroneamente no curso de Zoologia

- DNA = material genético/ Michael Fischberg – Reprogramação Nuclear

- 1962 - Clonagem de sapo

- 2012 = Prêmio Nobel em Medicina pelo descobrimento da reprogramação celular

Relatório CientíficoNome: GurdonFoi um semestre desastroso. O trabalho dele está longe de ser satisfatório. Seuaprendizado foi mal sucedido e muitos dos seus ensaios foram rasgados; um dos seustrabalhos recebeu nota 2 de 50. Seu outro trabalho tem sido igualmente ruim, e pormuitas vezes ele apresentou dificuldades por não escutar, e insiste em fazer o trabalho dasua própria maneira. Acredito que ele tenha idéias de se tornar um cientista, o que éridículo, se ele não consegue aprender fatos biológicos simples, ele não tem chance derealizar um trabalho de especialista, e isso seria uma perda de tempo para ele e paraaqueles que terão que ensiná-lo.

Estabelecimento da primeira linhagem de células-tronco/pluripotentes de camundongos

Cultura de ES

+ bone morphogenetic protein (BMP) + leukemia inhibitory factor (LIF)+ mitogen-activated protein kinase (MEK) + glycogen synthase kinase 3 (GSK3)+ FGF+ ActivinFeeder Layer

Inibem a diferenciação celularAlgumas culturas de primatas

A espécie animal e as condições de cultivo influenciam no estado de pluripotência

Dolly 1996-2003

Clonagem e Cultivo

1 2

3


No laboratório…


Como isolá-las?







NeuraisNeurônios



Sox17

Notch1NestinTP63


NestinaJagged

SinapsinaTau

GluR2GluR4


Multipotente/Pluripotente

Progenitor Diferenciada

Diferenciação

Desdiferenciação

2006 - Pluripotentes Induzidas

- Fatores conhecidos por manterem células-tronco embrionárias indiferenciadas em cultura;

- 24 genes envolvidos com estes fatores

Ecat1 Eras Sox15 Sall4 Utf1 B-catenin

Dppa5 Dnmt31 Dppa4 Oct3/4 Tcl1 C-Myc

Fbxo15 Ecat8 Dppa2 Sox2 Dppa3 Stat3

Nanog Gdf3 Fthl17 Rex1 Klf4 Grb2

Ecat1 Eras Sox15 Sall4 Utf1 B-catenin

Dppa5 Dnmt31 Dppa4 Oct3/4 Tcl1 C-Myc

Fbxo15 Ecat8 Dppa2 Sox2 Dppa3 Stat3

Nanog Gdf3 Fthl17 Rex1 Klf4 Grb2

Teste de pluripotencialidade – Formação de teratoma

C-Myc

Klf4

Sox2Oct3/4

GFP

Teste de pluripotencialidade – Formação de Quimeras

Não é que eleestava certo?

Não é que elesestavam errados?


No laboratório…


Como isolá-las?





Patologias cardíacas

Lesões Medulares

Insuficiências Hepáticas

Esperança

Nós possuímos a capacidade regenerativa em nosso corpo.Porque nossa regeneração não é tão eficiente?

Salamandra = Regeneração completa do membro em 60-90 dias

CartilagemMúsculosOssosSist Nervoso

Cicatrização(Blastema)

Blastema =Conjunto de Células-tronco derivadasdos ossosMúsculosTecidos adjacentes

Regeneração https://youtu.be/_rtF_coKT8U

Ao invés de apresentar uma célula pluripotente se diferenciando em diversos tipos celulares, esse Blastema é composto por diferentes tipos de células-progenitoras tecido específicas

1) Amputação/lesão (peixes, salamandras)2) Migração das células epiteliais para o local da lesão3) Formação de uma multicamada epitelial (epiderme)4) Mesenquima subjacente inicia proliferação = 5) Conjunto de células = blastema.6) Fatores que podem influenciar a proliferação das células do blastema: nervos, glândulas especializadas, vasculatura, diferentes vias de sinalização

Blastema

barbatana

Blastema só se inicia frente a lesão

Células adultas tecido-específicas (ósseo, vascular, epitelial, etc) passam por um processo de ativação

= proliferação e reprogramação (desdiferenciação)

Progenitores = diferenciação limitada

Totipotente Pluripotente Multipotente Progenitores Células Adultas

Diferenciação

Desdiferenciação (Reprogramação)

Ativação

Cauda de peixe

Epiderme

Ósseo

Stewart S, Stankunas KDev Biol 2012;365(2):339-49

Stewart S, et al., Cell Rep 2014, 6(3):482-98

LesãoReprogramação (proliferação e desdiferenciação)Diferenciação

Osteócitos secretando osteocalcinaLesãoReprogramaçãoDiminuição da expressão de osteocalcinaProdução de muitos osteoblastosDiferenciaçãoNovo tecido ósseo

Novo tecido ósseo: Reparo x Regeneração

Novo tecido ósseo: Reparo x Regeneração

Alguns animais apresentam grande capacidade regenerativa, inclusive em idade adulta

Tipos de Regeneração

Salamandra

Hidra

Rearranjo de células

pré-existentes

Abraham Trembley, 1744 – modelo de estudo por + de 270 anos

Hidra

Hidra – diploblasto (2 folhetos germinativos)3 fontes celulares = morfalaxia

Após decapitação, as células epiteliais são estimuladas e passam por reprogramação e diferenciação para substituir a cabeça =

transdiferenciação

Li Q, Yang H, Zhong TP. J Genet Genomics. 2015

A porção lesada induz apoptose celular . Estas células secretam temporariamente o ligante Wnt3 que induz proliferação nas células vizinhas = regeneração


Hidra - epimorfismo

XenopusZebrafish

Planária

279 tiny pieces

Peter Simon Pallas1778

Planária = triploblasto


Morfalaxia = mudanças em células pré-existentes;Epimorfismo = formação de blastema = neoblastos (pluripotentes)

Planária = Neoblastos


Planária = neoblastos

Wagner et al., Science, 332 (2011), pp. 811–816

Planária

Dugesia japonica Schmidtea mediterranea

Alta flexibilidade de regeneração

Phagocata kawakatsu Procotyla fluviatilis

Regeneração limitada (cabeça-rabo)

Regeneração Muscular

Crescimento Muscular: Hipertrofia X Hiperplasia


Células Satélite


Células Satélite

Aumento de Myf5 interrompe auto-

renovação

A expressão de MyoD indica

comprometimento celular com a

diferenciação muscular = mioblastos

A miogenina desencadeia a

diferenciação do precursor muscular

em músculo = miogênese

Pax7 = auto-renovação

Anfíbios da ordem caudata (família das salamandras)

Ambystoma mexicanum (axolotl)Notophthalmus viridescens

Sandoval-Guzman et al (2014) Cell Stem Cell

Diversidade de Mecanismos de Regeneração

Notophthalmus viridescens Ambystoma mexicanum (axolotl)

Sandoval-Guzman (2014). Cell Stem Cell 14, 174–187

Regeneração da Retina

Epitélio Pigmentado Retiniano

Células gliais de MüllerCélulas do Epitélio CiliarCélulas da ÍrisCélulas-tronco Residentes

Progenitores

Reprogramação



Reprogramação



Indução de Reprogramação

Células gliais de MüllerCélulas do Epitélio Ciliar

A B

Epitélio Não-Pigmentado (ENP)

Epitélio Pigmentado (EP)

A pars plana

B pars plicata

Del Debbio et al., IOVS, 2014

Células Epiteliais

Proliferação

neuroesferas

CC

3 dias 6 dias

1 2 3

neuroesferas

FGFEGF

0 dias

ProgenitoresRetinianos

Rhodopsin

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Células-tronco e Regeneração...Regeneração = Células-tronco adultas/ progenitoras/ quiescentes. Zigoto = Totipotente Resultado da união do ovócito ao espermatozóide. É o