Coliformes a 35ºC (Coliformes totais)

Introdução

Coliformes: são microrganismos indicadores

ocorrência de contaminação

deterioração do alimento

presença de patógenos

condições inadequadas durante processamento, manipulação ou armazenamento.

O grupo coliformes inclui bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas, na forma de bastonetes gram negativos, não formadores de esporos (não sobrevivem à pasteurização)

Coliformes totais: capazes de fermentar a lactose a 30-35ºC (por isso, atualmente vem sendo chamados de coliformes a 35ºC e não mais coliformes totais). O grupo inclui os seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.

Coliformes termotolerantes ou a 45ºC: capazesde promover a fermentação a 45ºC. O principal componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gênero Klebsiella e Citrobacter também apresentam essa capacidade.

Coliformes Totais (a 35º): Avaliar as condições higiênicas

o altas contagens: contaminação pós-processamento, limpezas e sanificações deficientes, tratamento térmicos ineficientes ou multiplicação durante o processamento ou estocagem.

Coliformes Termotolerantes (a 45ºC): Indicador de condições higiênico-sanitárias (contaminação de origem fecal)

o Principal representante: E. coli, que tem seu habitat no trato intestinal do homem e de outro animais.

o Indicar possibilidade de presença de outros patógenos entéricos.

Devido ao fato de serem destruídos com certa facilidade pelo calor, sua contagem pode ser útil em testes de contaminações pós-processamento.

Importante: Destruídos pela pasteurização, porém quanto maior a contaminação microbiana antes do processamento, maior será sua microbiota residual

Os coliformes metabolizam a lactose, produzindo, entre outras substâncias, ácido lático e CO2. Ácido lático: aumento da acidez

CO2 retido na massa dos queijos, dando lugar a pequenos buracos. Em excesso: estufamento precoce

Teste presuntivo para coliformes totais: indica a presença consiste na semeadura de volumes

determinados da amostra em tubos de

caldo lactado ou com caldo Lauril

Sulfato Triptose

Teste Confirmativo para coliformes totais A partir do presuntivo: transferência de cultura de todos os tubos positivos para tubos contendo

caldo Verde Brilhante.

Teste de diferenciação: confirmação da presença de E. coli, em caldo EC e meio EMB

Pode-se utilizar 2 métodos: método em placas

Método em tubos (NMP- Número mais provável ).

A escolha do método: número de microrganismos

disponibilidade de efetuar os métodos.

Método em placas: mais preciso

Método em tubos: mais utilizado, mais simples

Esta técnica consiste na inoculação de volumes decrescentes da amostra em meio de cultura VBB (Caldo Verde Brilhante Bile), sendo cada volume inoculado em uma série de tubos. Positivos: turvação do meio e produção de gás.

A combinação de resultados positivos e negativos

permite a obtenção de uma estimativa da

densidade das bactérias pesquisadas,

através de cálculos de probabilidade.

Vantagens em relação a contagem em placas:

possibilidade de inocular quantidades

maiores da amostra, aumentando-se proporcionalmente o volume de meio de cultura sensibilidade maior

Permite introdução de etapas de recuperação de células injuriadas.

É uma técnica versátil, permite a enumeração de diferentes grupos ou espécies de microrganismos, apenas variando os meios de cultura utilizados e as condições de incubação.

10mL

1mL

0,1mL

Incubar a 30ºC por 24- 48h

Os volumes podem ser ajustados de acordo com a contaminação na amostra

A determinação em placas consiste em adicionar amostras ou diluições em placas, em profundidade, com ágar VRB (Violeta vermelho bile) observar o crescimento de colônias

Vermelho purpura, circundada por uma zona roseada.

Coliformes a 35ºC – Metodologia segundo Standart Methods

- Tranferir 1mL das diluições em placas de petri esterilizadas;

- Adicionar, aprox., 15 mL de ágar VRB fundido, homogeneizar com movimentos em forma de “8”;

- Após a solidificação, colocar cerca de 4mL de VRB, sobrecamada;

- Após a solidificação, incubar invertidas a 32ºC/24h.

- Selecionar placas com 25 a 250 colônias e efetuar a contagem; Colônias típicas: vermelho-purpuras, circundada com zona roseada.

- Calcular o número de unidades formadoras de colônias por mililitro, (UFC/mL), multiplicando-se o numero de colônias pela diluição inoculada.

Coliformes a 35ºC – Metodologia do NMP segundo Norma FIL-73A: 1985

- Inocular 1, 0,1 e 0,01 mL de leite em 3 séries de tubos, contendo cada tubo,10 mL de caldo VBB e um tubinho de Durhan esterilizados*;

- Homogeneizar e incubar os tubos a 30ºC/24-48h;

- Calcular o NMP através da tabela, a partir do número de tubos positivos em cada série. São positivos aqueles tubos onde se observa turvação e produção de gás.

Grupo 1 Leite cru

Grupo 2 Leite pasteurizado

Grupo 3 Iogurte

Grupo 4 Doce de leite

10mL para 90mL de diluente Homogeneizar Diluições

Pesar 10g para 90mL de diluente Homogeneizar Diluições

Meio VRB

1mL 1mL

Incubar: - Tubos de VBB: 35ºC/ 24h - Placas VRB: 32ºC/ 24h

Leite

Incubar a 35ºC/24-48h Teste positivo: turvação e produção de gás

Tubos positivos com VBB: passar para caldo EC

Incubar em banho-maria a 45,5ºC/24h Teste positivo: turvação e produção de gás

Tubos positivos no EC: passar para meio EMB Incubar em banho-maria a 35ºC/24h

Colônias típicas: negras com brilho metálico

Provas confirmativas: Testes bioquímicos