Universidade Federal da Paraíba – UFPB Centro de Ciências Exatas e da Natureza – CCEN Departamento de Biologia Molecular – DBM Laboratório de Genética de Microrganismos – LGM

IX Semana de Biologia da UFPB

Mini-curso

COLORAÇÃO DE GRAM

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Coloração de Gram A coloração de Gram foi

desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é um dos procedimentos de coloração mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas. Neste procedimento, um esfregaço fixado pelo calor é recoberto com um corante básico púrpura, usualmente a violeta de genciana. Uma vez que a coloração púrpura impregna todas as células, é denominada coloração primaria. Após um curto tempo, o corante púrpura é lavado e o esfregaço é recoberto com iodo, um mordente. Quando o iodo é lavado, ambas as bactérias gram-positivas e gram-negativas aparecem em cor violeta escuro. A seguir, a lâmina é lavada com álcool ou uma solução de álcool-acetona. Esta solução é um agente descolorante, que remove o púrpura das células de algumas espécies, mas não de outras. O álcool é lavado e a lâmina é então corada com safranina, um corante básico vermelho. O esfregaço pé lavado novamente, seco em papel e examinado microscopicamente (Fig. 1, 2 e Anexo).

A parede celular bacteriana é composta de uma rede macromolecular denominada peptideoglicana, que está presente isoladamente ou em combinação com outras substancias. A peptideoglicana consiste de um dissacarídeo repetitivo unido por polipeptídeos para formar uma rede que circunda e protege a célula. A porção dissacarídica é composta por monossacarídeos denominados N-acetilglicosamina (NAG) e ácido N-acetilmurâmico (NAM) (Fig.3).

Figura 1 – Coloração de Gram: Bacillus cereus (+) e Escherichia coli (-).

Figura 3 - Moléculas que formam a peptideoglicana.

Na maioria das bactérias gram-

positivas (Fig. 4), a parede celular consiste de muitas camadas de peptideoglicana, formando uma estrutura rígida. Além disso, contém ácidos teicóicos, que consistem primariamente de um álcool e fosfato.

As paredes celulares das bactérias gram-negativas (Fig. 5) consistem de uma ou algumas camadas de peptideoglicana e uma membrana externa. A peptideoglicana está ligada a lipoproteínas na membrana externa e está no espaço periplasmático, um espaço entre a membrana externa e a membrana plasmática. As paredes gram-negativas não possuem ácidos teicóicos, mas sim de lipopolissacarídeos (LPS) e fosfolipídios.

Figura 4 - Parede celular gram-positiva.

Figura 5 - Parede celular gram-negativa.

Referências: - Grupo de Ciências Biológicas do IST. Coloração de células pelo método de Gram. Disponível em: http://www.e-escola.pt/site/topico.asp?topico=306&ordem=3&canal=5 - TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2003.

Figura 2 – Coloração de Gram mista: Streptococcus sp (+). e E. coli (-).

Anexo - Procedimento

1- Cobrir o esfregaço da cultura em estudo (previamente fixado à lâmina de vidro) com uma solução de Violeta de cristal (VC). Deixar atuar durante 1 minuto. Nota: após este passo, todas as células ficam coradas com o violeta de cristal (corante primário).

2- Escorrer o corante e lavar com água. Secar com papel de filtro, sem esfregar. Cobrir a preparação com reagente de Lugol e deixar atuar durante 1 minuto.

3- Escorrer a solução de Lugol, lavar com água e secar.

Nota: o iodo da solução de Lugol forma um complexo insolúvel com o corante primário. O complexo violeta de cristal - iodo (VC-I) tem uma cor mais intensa (violeta escuro) do que o VC livre e é mais difícil de remover das células.

4- Diferenciar pelo álcool a 90°, deixando cair a solução de álcool gota a gota sobre a preparação até que não saia mais corante. Nota: este é o passo de diferenciação entre bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. As primeiras perdem o complexo VC-I e as últimas retêm-no. As células de bactérias Gram-positivas ficam, então, coradas de violeta-escuro e as Gram-negativas ficam incolores. 5- Lavar com água, escorrer e secar com papel de filtro.

6- Tornar a corar a preparação, durante 5 minutos, com uma solução de safranina. Nota: as células incolores de bactérias Gram-negativas ficam coradas de cor-de-rosa (cor do contra-corante safranina).

7- Escorrer o corante, lavar com água e secar com papel de filtro.