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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA Y DE ALIMENTOSESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

Ingeniera de Alimentos II

Compuestos voltiles del vino

PROFESOR: Ing. Isabel Berrocal.

ALUMNOS

Alva Rivera, Nadia

Milla Melgarejo, Erick Tamayo Siguas, Julio

Vega Huamn, Diego

Fernndez Gngora, Samuel

Vega Gmez, Ricardo

2011

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BASADO EN TESISDOCTORAL

Estudio analtico de compuestos

voltiles en vino.

Caracterizacin quimiomtrica de

distintas denominaciones de origen

M Trinidad Cedrn Fernndez

Universidad de La Rioja

Servicio de Publicaciones2004

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Introduccin

- Historia del vino

- Componentes del vino

- Componentes de saborazucarado

- Componentes de saborcido- Componentes de saborsalado

- Componentes de sabor amargo yastringente

- Otros componentes

- El aroma del vino

- Compuestos responsables del aroma del vino

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1.- INTRODUCCIN

El presente estudio nace de la necesidad de mejorar el conocimiento de unproducto vital en nuestra Comunidad Autnoma, como es el vino, con la finalidadde ampliar el campo de conocimiento de parmetros todava muy desconocidoscomo son los responsables del aroma, que a lo largo de la memoria denominaremoscon frecuencia como compuestos aromticos, no por ello refirindonos acompuestos con estructura qumica aromtica.

El problema tcnico de la calidad, entendida como el cumplimiento de las propiedades intrnsecas y las especificaciones de tipo legal, se resolver mejorcunto ms se conozca del vino, sus constituyentes y las transformaciones que

tienen lugar en l (por lo que el anlisis qumico y sensorial tiene cada vez ms peso). Innovar y disear nuevos productos ser casi siempre el resultado deavances cientficos basados en el anlisis qumico y sensorial. Se piensa incluso enla posibilidad de crear un sistema, que permita evitar fraudes de competencia demercado, cada vez ms habituales en el mundo de la vitivinicultura.

Las caractersticas organolpticas de un producto lo deben hacer atractivo alconsumidor. Son importantes la consistencia, el sabor y las apreciaciones ysensaciones gustativas debidas al aroma. Por ello, caracterizar un producto enrelacin a su composicin aromtica, es tanto como asegurar su limpieza, modo de

elaboracin y envasado, e incluso evitar fraudes y falsificaciones.

Tradicionalmente, el anlisis sensorial ha sido la herramienta bsica para lacaracterizacin del aroma. A pesar de las normas establecidas para estandarizar lametodologa (CEE, OIV, ISO, etc.), las caractersticas de un vino nunca dejarn deestar sometidas a la subjetividad del degustador. Adems, el anlisis sensorial nonos proporciona informacin sobre la composicin qumica del vino, por ello setrata de un instrumento limitado a la bsqueda de las causas de determinadasalteraciones y la tipificacin del producto segn su origen, variedad, etc.

No pretendemos con este trabajo mejorar un producto, sino ampliar losconocimientos qumicos que se tienen sobre l, de modo que puedan facilitar elprotocolo de actuacin en el mercado, tanto nacional como internacional. Adems,el anlisis de los aromas de una matriz tan compleja como es el vino es tan largo ycomplicado, que merece la pena el esfuerzo para ampliar su conocimiento.

El objetivo de este trabajo es conseguir un estudio exhaustivo, analtico,cientfico y qumico de alguno de los compuestos aromticos que contiene el vino,con la finalidad de contribuir a un mejor conocimiento de ste.

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Abordamos el tema desde distintos puntos de vista: queremos profundizar enlos compuestos voltiles que forman el vino, conocer su significado sensorial yoptimizar unas condiciones de extraccin, de modo que nos permitan separar de

forma efectiva los compuestos a tratar.

1.1.- Historia del vino1

El vino, del latn, Vinum, es el licor alcohlico que se obtiene del zumo de lauva exprimida y fermentado. Algunos autores sitan los orgenes de la vid en AsiaCentral, mientras otros aseguran que su origen es europeo. Lo que s se puedeafirmar, es que el vino era conocido por todos los pueblos antiguos. La revelacin

del proceso de esa elaboracin se atribuye a Osiris, entre los egipcios, y aDionisios, entre los griegos. Por su parte, los hebreos afirman que fue No elprimero en cultivar la vid. Los romanos heredaron la aficin al vino de los griegos,gracias a las vias plantadas por los etruscos.

La viticultura debe su mayor desarrollo a la propagacin del cristianismo,por ser el vino necesario para la celebracin de la misa. Durante la Edad Media laelaboracin del vino fue un menester importante en los monasterios. Cada unoposea su propio viedo de donde se extraan los vinos litrgicos. As, los monjes

medievales se pueden considerar precursores de la viticultura y vinicultura, ydejaron huellas tan claras como los vinos llamados priorato que vienen de lapalabra prior.

Junto al carcter religioso, el vino ha tenido desde la antigedad un granvalor poltico. Heredoto nos cuenta en su Historia que los persas despus de bienbebidos, suelen deliberar acerca de los negocios de mayor importancia.

Hacia el Siglo XVI, la vinicultura se practicaba ampliamente en Francia. Eneste pas, el monje benedictino Dom Perignon (1638-1715) introdujo el vino

espumoso. Este monje tuvo la feliz idea de utilizar tapones de corcho para sus botellas para evitar que la fermentacin secundaria producida en el vino dechampagne despus de embotellado, explosionara el tapn que se utilizaba hastaentonces que era de lana y lacre. Utilizando el corcho, tcnica aprendida de losespaoles, y una botella ms gruesa, la segunda fermentacin pudo desarrollarse,dando origen al champagne. Fue entonces cuando pronunci sus conocidas

1 Barea Surez E., Historia del Vino I y II, (2003)www. lavidyelvino. iespana.es

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palabras: Venez vite mes frres, je bois des toiles! (Venid rpido hermanos,estoy bebiendo estrellas!).

Si el vino es conocido desde antiguo en el mundo, no lo es menos en Espaadesde que en el ao 2200 a.C., los Tartesos llegaron a la Pennsula Ibrica y noslo conocan el vino, sino que comercializaban con l.

Con la dominacin romana el comercio floreci de tal manera, que en el ao20 de nuestra era se enviaron 20 millones de nforas de vino espaol a Italia, a loque Diocleciano puso freno para evitar la ruina de los viedos de Italia. Los vinosde la poca se clarificaban con ceniza, arcilla, resina, etc., luego se envasaban ennforas de barro, tapadas con corcho o yeso y se dejaban envejecer hasta diez aos,a veces junto a las chimeneas para que tuvieran cierto sabor ahumado.

Los visigodos, grandes consumidores de vino, aumentaron la produccin.San Isidoro de Sevilla dedica varios captulos en sus Etimologas a la vid y el vino,que corra en abundancia en aquella poca, hasta el extremo de que San Jernimoavisa a los jvenes que deben huir del vino como del veneno, no sea que por elcalor de su juventud beban y perezcan.

Con la llegada de los rabes, nuestros viedos fueron en principiodevastados o abandonados por la prohibicin a sus fieles de beber vino, ya que elprofeta les haba prometido para el otro mundo, muchsimo ms vino del que lesnegaba en ste. Sin embargo, la arraigada costumbre vincola de los espaoles,unido a que el Corn no prohbe la plantacin y cultivo de la vid, hizo que elconsumo de vino persistiese.

Con el avance de la reconquista, los monjes comenzaron la repoblacin decepas, porque el rito cristiano exiga la produccin de vino. Tambin el Camino deSantiago fue una va de comunicacin e intercambio de todo tipo de ideas,conocimientos, lenguas y culturas, y por l entraron nuevas variedades de uva,como la Albario, al parecer de origen alemn, trada por monjes cistercienses. El

Camino tambin fue gran impulsor del comercio de vinos, que renace plenamenteen los siglos XVI y XVII.

Durante el siglo XVIII se inici un proceso en la enologa espaola connuevos tipos de vid procedentes, sobre todo, de Francia e Italia que se plantan enestacas y en injertos.

Por esta poca lleg a ser tan grande la produccin de vino en La Rioja, quesobrepasaba el consumo general, agravado porque el excedente de vino no se podaalmacenar ms de un ao y medio motivado por los mtodos rudimentarios

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utilizados en su elaboracin. Tal era la abundancia que casi siempre se tena quetirar vino. Para solucionar estos problemas, en 1787 se cre la Real SociedadEconmica de Cosecheros de La Rioja Castellana, la cual regulaba la elaboracin y

exportacin de estos vinos a sus clientes habituales, los mercados vascos ymontaeses. Pero la expansin del Rioja no llegara hasta el siglo XIX.

El siglo XIX se caracteriza por dos grandes acontecimientos. El primero fuela transformacin de las tcnicas artesanales en nuevos procedimientos industrialessumado a la implantacin del ferrocarril como mtodo de transporte. Y por otrolado, a finales del siglo XIX y principios del XX una devastadora plaga, la invasinde la filoxera, que ya haba arrasado los grandes viedos en el resto de Europa.

Pasadas estas calamidades, a principios del siglo XX comienza a florecer

una nueva actividad vincola. Josep Ravents, despus de varios viajes a laChampagne obtiene su primera botella de vino espumoso en su bodega.

Con el siglo XIX lleg a los viedos gallegos el oidium, enfermedad queoblig a azufrar los viedos, consiguiendo que fuera regenerndose el comercio delvino. Pero por el ao 1885, un hongo llamado mildiu atac de nuevo a losviedos y tuvieron que ser tratados con un producto a base de sulfato de cobre,llamado caldo bordels.

La evolucin de la calidad viene dada por la Convencin de Pars en 1883,por el Acuerdo de Madrid en 1891 y sobre todo por el de Lisboa en 1958, sobre laproteccin de las Denominaciones de Origen como mtodo de proteccin de lacalidad de los vinos. En 1970 se crea el Instituto Nacional de Denominaciones deOrigen.

El siglo XX fue trascendente para el vino en cuanto a la evolucin de sucalidad, gracias a las investigaciones de Pasteur en la tecnologa aplicada a laelaboracin del vino y a las Estaciones de Viticultura y Enologa situadas en zonasestratgicas productoras del pas.

Es el siglo en el que se produce una evolucin tcnica que sirve al desarrolloy divulgacin de la Enologa por todo el pas, con la creacin del Instituto Nacionalde Investigaciones Agronmicas en los aos 30. Anteriormente, por los aos 20, secrea la Oficina Internacional de la Via y el Vino para resolver los problemas quesurjan en la vid y en el vino, dividida en tres secciones: viticultura, enologa ylegislacin.

Posteriormente, se crea la Unin Internacional de Enlogos, donde seincluyen las Asociaciones de Enlogos de los grandes pases productores de vino.

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Por los aos treinta, concretamente entre 1931 y 1932 se crea el Estatuto delVino, que persigue todo aquello que tienda a distorsionar el mercado de los vinosde produccin natural. Posteriormente, en 1970, se dicta el Estatuto de la Via, del

Vino y de los Alcoholes, inspirado en los Estatutos de la Oficina Internacional dela Via y el Vino.

Actualmente, en Espaa, el viedo se encuentra muy implantado, en algunaszonas con carcter de monocultivo. La superficie de viedo cultivada supone el33% de la superficie vitcola de la Unin Europea, y el 16% de la superficiemundial.

En los ltimos aos, Espaa ha pasado de una situacin excedentaria, a unade equilibrio entre produccin y necesidades, debido fundamentalmente a la

poltica de la Unin Europea y a la mejora cualitativa del viedo, abandonndose laidea de una gran produccin frente a una significativa mejora de las cualidades delvino.

Son muchas las denominaciones de origen que existen en Espaa, tal y como puede observarse en la figura 1-1, donde se muestra un mapa con ellas. Acontinuacin se detallan por orden alfabtico, junto con las provincias a las quecorresponden.

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1.2.- Componentes del vino2

Una clasificacin general de los componentes del vino teniendo en cuenta la

participacin en sus caractersticas olfativas y gustativas puede ser la siguiente:1.2.1.- Componentes de sabor azucarado

1.2.2.- Componentes de sabor cido

1.2.3.- Componentes de sabor salado

1.2.4.- Componentes de sabor amargo y astringente

1.2.5.- Otros componentes

1.2.1.- Componentes de saborazucarado

Estos compuestos transmiten al vino suavidad, y sabor dulce, el cual no esexclusivo de los azcares, pues otras sustancias qumicamente distintas de losazcares poseen sabor dulce.

Las sustancias dulces del vino pertenecen a tres grandes grupos:

A) Azcares propiamente dichos. Se encuentran en la uva y permanecensin fermentar en los vinos blancos dulces y en pequea concentracin en el vino

blanco seco y tinto. A este grupo pertenecen algunas hexosas (glucosa y fructosa) ypentosas (arabinosa y xilosa).

La uva apenas contiene sacarosa, adems sta es desdoblada en glucosa yfructosa por las levaduras durante la fermentacin, por lo cual el vino no contienesacarosa. Su presencia por adicin para enriquecer ciertos vinos supone un engaopara el consumidor, aunque sea legal.

B) Polialcoholes. En los vinos se encuentran en mayor o menor concentracin segn la transformacin sufrida en la fermentacin. Los principalesson: inositol, manitol, arabitol, iritritol y sorbitol.

C) Sustancias con uno o varios radicales alcoho l. Se forman durante lafermentacin alcohlica por oxidacin de los azcares, el principal es el alcoholetlico, procedente de la fermentacin de la glucosa, aunque tambin se encuentranel glicerol y el butilenglicol.

2 Badui Dergal S., Qumica de los alimentos, Mxico, (1999)Mareca Corts I., Origen, composicin y evolucin del vino, Madrid, (1983)

Belitz H.D., Qumica de los alimentos, Zaragoza, (1997)

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Despus del agua, 85% del total del vino, el etanol es el componente msimportante. La graduacin de los vinos en Espaa vara entre 9 y 15 % (v/v).

El glicerol es el componente ms abundante en el vino despus del etanol (de5 a 10 g L-1), es un producto resultante de la fermentacin del mosto y contribuye aendulzar el vino por tener sabor azucarado.

1.2.2.- Componentes de saborcido

La acidez del vino se atribuye a diversos cidos orgnicos. En la tabla 1-1 seindican los principales constituyentes de la acidez.

Procedentes de la uva

Ac. tartrico

Acidez fija Acidez total

Ac. mlico

Ac. ctrico

Originados por la fermentacinAc. succnico

Ac. lctico

Ac. actico Acidez voltil

x Tabla 1-1: Componentes del vino de saborcido

En el vino se encuentran adems otros cidos en pequeas cantidades, talescomo el galacturnico, glucornico, pirvico, etc.

La mayor parte de los cidos del vino se encuentran en estado libre yrepresentan la acidez total. Otra parte se encuentran en forma de sales, y sedeterminan por la alcalinidad de las cenizas.

1.2.3.- Componentes de saborsalado

El gusto salado lo comunican al vino las sales de los cidos minerales y dealgunos cidos orgnicos (tabla 1-2). Contiene alrededor de 2 a 4 g L-1 de estassustancias.

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ANIONES CATIONES

Minerales

Fosfato Potasio

Sulfato Sodio

Cloruro Magnesio

Sulfito Calcio

Otros

Tartrato Hierro

Malato Aluminio

Lactato Cobre

x Tabla 1-2: Componentes del vino de saborsalado

En el vino tambin se encuentran trazas de otros componentes minerales(oligoelementos) como flor, silicio, yodo, bromo, boro, zinc, magnesio, plomo,cobalto, cromo, nquel, etc.

1.2.4.- Componentes de sabor amargo y astringente

stos son los compuestos fenlicos, conocidos antiguamente como materiastnicas. Proporcionan a los vinos su color y gran parte de su sabor. La diferenciaentre vinos blancos y tintos se debe a los compuestos fenlicos y explican suevolucin. Adems, tienen la propiedad de coagular las protenas y de intervenir enla clarificacin de los vinos por encolado, algunos de ellos tambin intervienen enlas propiedades alimenticias del vino tinto, sobre todo en su riqueza vitamnica ypoder bactericida.

Los compuestos fenlicos pertenecen a cinco grupos qumicos:

A) Antociano s : son los colorantes rojos.

B) Flavonas: de color amarillo, slo estn presentes en cantidades muypequeas.

C) steres de los cidos cinmico y benzoico.

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D) Taninos condensado s : se localizan en las pepitas, en el hollejo de la uva yen el raspn.

E) Taninos piroglicos: se encuentran en el vino, aunque no provienen de la

uva. Posiblemente provengan de la adicin de taninos comerciales o de lamadera de los toneles.

1.2.5.- Otros componentes

En este apartado se pueden englobar:

A) Sustancias nitrogenad a s: aunque apenas tienen importancia en el sabor,son importantes como nutrientes indispensables para las bacterias y las levaduras.

Adems de la forma amoniacal, el nitrgeno puede encontrarse en losmostos y vinos bajo diferentes formas, que se pueden clasificar segn el tamao dela molcula:

a) Aminocidos: son los componentes elementales de las protenas y de lospolipptidos. De ellos, el cido glutmico es posible que intervenga en el gusto delvino.

b) Polipptidos: son agrupamientos de aminocidos ms o menos largos y

constituyen la forma ms importante de encontrar el nitrgeno en los vinos.c) Protenas: tambin llamadas materia albuminoide. Son de peso molecular

elevado. Se encuentran en estado de macromolculas y tienen carcter coloidal.Precipitan por el calor y por la presencia de taninos, siendo un problema para laestabilizacin de los vinos blancos, de los cuales se eliminan en la clarificacin portratamiento con colas orgnicas que son tambin protenas.

B) Peptinas, go m as y m u clago s : cuando se aaden algunos volmenes dealcohol al mosto o a un vino, se produce un enturbiamiento, se trata de un poso

gelatinoso. Este sedimento est formado por peptinas, gomas y muclagos.

C) Sustancias voltiles y aro m ticas : hasta principios del siglo XX el olordel vino se atribua a una sola sustancia, el cido enntico, poco a poco, con elavance de la ciencia analtica, se fue corrigiendo el error y ya hacia 1952 seconocan unos cincuenta componentes del olor del vino. Posteriormente y gracias ala utilizacin de las tcnicas cromatogrficas, fundamentalmente la de fase gaseosa,se han podido separar ms de 1000 componentes del vino, aunque todava no se hapodido establecer una tarjeta de identidad de cada tipo de vino.

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Las sustancias voltiles del vino, muchas de las cuales son responsables delaroma, pertenecen a distintos grupos qumicos (cidos, alcoholes, aldehdos,steres). Este punto se desarrollar en el apartado 1.3.

D) Vita m inas : el vino contiene todas las vitaminas necesarias para la vida yen l actan como factores de crecimiento indispensables para levaduras ybacterias.

1.3.- El aroma del vino

El aroma de un vino se describe como la interaccin del sabor y olor que

imparten a cada individuo una experiencia sensorial agradable o no. Las sustanciasaromticas son compuestos voltiles, que se perciben a travs de los receptores delolor del rgano olfativo. El aroma tiene una base fsico-qumica, pero lo querealmente cuenta a la hora de consumir un producto es el efecto que produce en elconsumidor.

Para el anlisis sensorial disponemos de dos aparatos quimio-receptores, queson el gusto y el olfato, siendo el olfato mucho ms importante a la hora dedeterminar las caractersticas de un alimento, ya que su intervencin es ms directa,al percibir los vapores que se encuentran sobre el alimento y porque en ladeglucin vuelve a intervenir mediante la va retronasal. Por ello se utiliza eltrmino anglosajn flavour, que tiene una percepcin global y abarca trminoscastellanos que se quedan cortos como olor o sabor.

Dentro del vino se distinguen varios tipos de aromas: varietales, prefermentativos, fermentativos y postfermentativos, o bien aromas primarios,secundarios y terciarios que se describen a continuacin.

Los aromas primarios proceden en parte de la uva3 e incluso las partes

slidas del racimo pueden contribuir en este aspecto y en ocasiones estn presentes

3 Mallouchos A. et al,J. Agric. Food Chem., 51, 3060-3066, (2003)Boido E. et al,J. Agric. Food Chem., 51, 5708-5413, (2003)DallAgnol I. et al,J. Int. Sci. Vig. Vin., 36, 71-76, (2002)Lanaridis P. et al,J. Int. Sci. Vig. Vin., 36, 39-47, (2002) RosilloL. et al, J. Chromatogr. A, 847, 155-159, (1999) Hashizume K. etal, J. Agric. Food Chem., 45, 1333-1337, (1997) Dimitriadis E. etal, Am. J. Enol. Viticult., 35, 250-258, (1984)Mareca I., Origen, composicin y evolucin del vino, Madrid, (1983)

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en las hojas en estados fisiolgicos tales que las uvas no los contienen. Dentro delgrano, la mayor parte de los aromas se hallan en el hollejo y clulas contiguas almismo, existiendo en menor medida en la pulpa (a excepcin de ciertas variedades

tales como algunos moscateles y malvasas). Las pepitas, tambin puedencontribuir a ceder algunas sustancias aromticas. Aportan caracteres que hacenrecordar en el vino a ciertas flores, o a frutas, dando tambin en ocasiones notasherbceas.

Como el aroma primario tiene su origen en la uva, se le asigna tambin elcalificativo de varietal. Son compuestos complejos, en general terpnicos, que pasan de la uva al vino sin transformacin. Los terpenos se encuentran en loshollejos de la uva, por lo que para valorar su presencia es muy importante elproceso de la maceracin, los tratamientos por calor y las infecciones por botritis.

Se trata de sustancias aromticas libres, o de precursores de aromas combinados,que no son aromticos en s mismos, pero que liberan aromas por hidrlisis cida oenzimtica. Los ms importantes dentro de los terpenos libres son: linalol, geraniol,terpineol, nerol, citroneol y dentro de los terpenos combinados el dinodienol.

Los aromas secundarios se forman en la fermentacin que tiene lugardurante la vinificacin4, variando con las condiciones en las que sta se desarrolle5.El aroma generado durante la fermentacin obedece a la presencia de steres6,formados biolgicamente en el interior de las clulas microbianas, aldehdos precursores que han quedado en el medio como restos en su condicin demetabolitos intermedios, cetonas, cidos, alcoholes superiores, etc., queproporcionan en conjunto, la impresin total que da un vino.

La teora de la participacin de los steres en el aroma de los vinos tiene suimportancia y ha sido discutida a lo largo de los aos. Antes de los aos treinta,cuando no se realizaban anlisis, se les daba mucha importancia. Desde entonceshasta los sesenta se minimiz en extremo su aportacin al aroma y, posteriormente,con la utilizacin de la cromatografa de gases se les ha encontrado su sitio en elaporte total del aroma del vino.

Wildenradt H.L. et al, Am. J. Enol. Viticult., 26, 148-153, (1975)Cordonnier R.,Rev. Fr. Doenol., 53, 15-26. (1977)Stevens K.L. et al, J. Agric. Food Chem., 14, 249-252, (1966)4

Frivik S. et al,Am. J. Enol. Viticult., 54, 31-38, (2003)Aleixandre J.L. et al,J. Agric. Food Chem., 51, 1889-1893, (2003)Daz Yubero F. et al, Vitivinicult., 1, 61-68, (1991)5 Gerbaux V. et al,Am. J. Enol. Viticult., 53, 131-137, (2002)6Lpez T., Tesis Doctoral Facultad de Ciencias (Qumicas), Zaragoza, (1987)Marais J. et al, Vitis, 19, 151-164, (1980)

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Es difcil determinar la influencia sensorial de compuestos individuales, yaque existen mezclas muy complejas en las que los compuestos interaccionan en loque a acciones organolpticas se refiere. A la nariz son diferentes el aroma de la

uva, el del mosto y el del vino a que da origen, y el aroma de este vino vaevolucionando gradualmente con el paso del tiempo, aunque no se conoce bien estaevolucin. Ciertos constituyentes voltiles desaparecen, otros quedan inalterados yse observa la formacin de algunos compuestos merced a las levaduras pormecanismos diversos, bien metablicos o bien por hidrlisis enzimtica. Con todoello el vino experimenta un enriquecimiento, tanto cuali como cuantitativo.

En algunas ocasiones los aromas secundarios pueden ser negativos eindeseables7, las causas pueden ser muy diversas, fermentaciones mal elaboradas,embotellamientos precoces, levaduras mal seleccionadas o utilizadas inadecuada-

mente, poca higiene, etc.

Durante el almacenamiento8 y la maduracin de los buenos vinos seproducen modificaciones9 del aroma que conducen al bouquet (aromasterciarios). Supone en los vinos el equilibrio final, caracterizado por perfumesdelicados y penetrantes, conseguidos una vez cursado el desarrollo que madura alos vinos. La aparicin del aroma terciario acarrea transformaciones de distintoorden, no en todos los vinos del mismo modo, y que son originadas pormecanismos de xido-reduccin complejos y no del todo conocidos10. Los aromasse desarrollan poco a poco, tanto en la fase de tonel como en la de botella,alcanzando su mayor auge a los tres o cuatro aos, segn los vinos.

La naturaleza de las sustancias que originan el aroma terciario es tambinvariada: alcoholes, steres, aldehdos, etc. Durante este proceso tienen lugarreacciones de esterificacin entre cidos y alcoholes y de oxido-reduccin decompuestos aromticos y fenlicos, que se traducen en una mejora de loscaracteres organolpticos de los vinos y en la transformacin del aroma en lo quese denomina bouquet. Tambin se pierde el afrutado debido a la disminucin de

7

Chatonnet, P. et al, J. Int. Sci. Vigne Vin, 26, 253-269, (1992)8 Bentez P. et al.,J. Agric. Food Chem., 51, 6482-6487, (2003)Prez L. et al,J. Agric. Food Chem., 51, 5444-5449, (2003)Prez L. et al,J. Agric. Food Chem., 50, 3272-3276, (2002)Ibern M. et al,Am. J. Enol. Viticult., 52, 159-164, (2001)Cutzach I. et al,J. Agric. Food Chem., 48, 2340-2345, (2000)Cutzach I. et al,J. Agric. Food Chem., 47, 2837-2846, (1999)9 Jimnez N. et al,J. Agric. Food Chem., 51, 5732-5737, (2003)Tominaga T. et al,J. Agric. Food Chem., 51, 1016-1020, (2003)10 Carnacini A. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 2225-2228, (1997)Martn B. et al, J. Agric. Food Chem., 40, 475-478, (1992)

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algunos steres como el acetato de etilo, succinato de dietilo, etc. y se aportanaromas especficos de la madera, como son aldehdos furnicos, lactonas,etilfenoles, etc.

La evolucin del aroma del vino acabado puede ser distinta segn lascircunstancias ambientales impuestas por la tcnica. Una lnea por ejemplo es elcarcter oxidativo en la fase de crianza o aejamiento, y que corresponde a losvinos llamados "rancios", para esto se mantienen en un envase de madera,controlando el contacto con al aire y la temperatura ambiental. Componentescaractersticos correspondientes a este tipo de crianza son el etanal y el cidoactico a mayores concentraciones de las habituales, procedentes de la oxidacindel etanol.

Otra va tcnica es el aejamiento clsico, caracterstico de los vinos de mesade calidad. En este caso, despus de un tiempo en el que se producen oxidacionespor contacto limitado con el aire, conservando el vino en envase de madera, siguela fase real de formacin del bouquet, caracterizada por ambiente esencialmentereductor, disponiendo el vino en botella bien tapada, en posicin horizontal, cierrehermtico y temperatura de bodega fresca y constante.

Para alcanzar el mejor estado del aroma hace falta tiempo, aos, diferente deunos tipos de vinos a otros. Todo vino ofrece su curva de calidad en funcin deltiempo, con aumento continuado hasta cierto punto en el que presenta un mximo,a partir del cual disminuye su riqueza.

Asimismo, durante la vinificacin y posterior periodo de conservacin11

puede haber tambin transformaciones nocivas que deben ser cuidadas, en especialel aumento de la temperatura que volatiliza los compuestos, la aparicin deacusadas oxidaciones, ataques microbiolgicos12, influencia del corcho13, efecto de

11

Cutzach I. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 2217-2224, (1997)Puech J.L., Elaboration et connaissance des spiritieux", (1993)Rabier P.H. et al, Les eaux de vie traditionnelles dorigine viticole, (1991)Dubois P.,Rev. Fr. Doenol., 120, 19-24, (1989)Puech J.L., Connais. Vigne Vin, 19, 151-162, (1987)

Nishimura, K. et al, Flavour of distilled beverages, (1983)Ribereau-Gayon J. et al, Sci. Technol. Vin, 3, 702-719, (1976)Marche M. et al, Rev. Fr. D`oenol., 57, 1-106, (1975)Singleton V.L.,Some aspects of wooden container as a factor in wine maturation, (1974)12 Rocha S. et al, J. Agric. Food Chem., 44, 865-871, (1996)13 Boudaoud N. et al, J. Agric. Food Chem., 51, 1530-1533, (2003)

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los pesticidas14, etc., por lo que todos esos factores, deben ser tenidos en cuenta conobjeto de llegar a la obtencin de vinos de calidad.

En general, todava se sabe poco sobre el bouquet de los vinos, si seexceptan las sustancias aromticas tpicas de cada variedad. S que est clarodesde hace aos, que los distintos compuestos terpnicos, son muy importantes enel aroma de los vinos de diversas variedades, o que el vino de Jerez por ejemplo,tiene una notas particulares de su aroma, generadas en los procesos defermentacin en solera (lactonas).

Pero lo cierto es que la bibliografa actual todava no presentan estudiosintensivos sobre la aportacin de los distintos compuestos al aroma del vino.

Hay aromas defectuosos que enmascaran el resto de aromas del vino comoson el pronunciado aroma a sulfhdrico, acetaldehdo o cido actico. Loscompuestos que generan estos defectos forman, sin embargo, parte de lacomposicin normal del vino, de ah la importancia del concepto de equilibrio, yaque pasan a ser defectuosos cuando su concentracin supera un cierto nivel. Lomismo ocurre con ciertos compuestos que dan una determinada nota, se encuentran presentes en muchos vinos, sin embargo slo en algunos de ellos tienen unaconcentracin suficiente como para ser percibidos.

Adems, al hablar de concentraciones, se hace de modo relativo, ya que unmismo compuesto en las mismas concentraciones puede no ser reconocido en dosvinos de distintas caractersticas, o puede generar distintos aromas comoconsecuencia de las interacciones que puede entablar con otros compuestospresentes.

Queda entonces clara la dificultad que existe a la hora de comprendertotalmente el aroma de un vino desde el punto de vista analtico. Son necesariastodava, por ello, muchas horas de investigacin para alcanzar una comprensintotal del aroma del vino.

En lo que s se ha avanzado considerablemente es en la racionalizacin de lacata del vino, donde se han definido distintos grupos de aromas (florales, afrutados,especiados, madera, qumicos, picantes, etc.). Sin embargo, dichos trminoscorresponden a percepciones integradas por nuestro cerebro, no teniendo por qucoincidir el olor con un compuesto determinado, aunque recientemente se han

14 Oliva J. et al, J. Agric. Food Chem., 47, 2830-2836, (1999)

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realizado estudios donde se les dan descriptores aromticos (limn, banana, kiwi,etc.), que se relacionan con los compuestos voltiles15.

Los avances en estos campos son importantes al igual que curiosos, porejemplo en la Universidad Hebrea (Jerusaln)16 han creado un proceso patentadoque enriquece el aroma del vino. Consiste en el aislamiento de un gen responsablede la produccin de una enzima especial llamada beta glucoserase. Este gen fueintroducido en levaduras de vino que emitieron la enzima durante la produccin delvino. Las enzimas descomponen los componentes del aroma, brindando al vinomejores bouquet y sabor. De modo que gracias a estos esfuerzos, vinos simplespueden convertirse en variedades mucho mejores, con un aroma mejorado.

1.4.- Compuestos responsables del aroma del vino

Ya se ha comentado que las sustancias aromticas son compuestos voltilesque se detectan con los receptores olfatorios y se encuentran en los alimentos endistintas cantidades. Los componentes voltiles conocidos se ordenan poralimentos y tipos de compuestos en tablas que se actualizan y publicanperidicamente17.

De los compuestos voltiles slo una pequea proporcin tiene importanciadesde el punto de vista del aroma. nicamente se consideran sustancias aromticasaquellas cuya concentracin en el alimento es superior a su umbral olfativo ogustativo.

Se denomina umbral olfatorio o umbral de reconocimiento a aquellaconcentracin de un compuesto que resulta suficiente para reconocerlo por su olor.Se mide como valor de la actividad aromtica (OAV) de un compuesto x y secalcula de acuerdo a la siguiente ecuacin:

OAVCxAx

15 Moio L. et al, Vignevini, 29, 115-123, (2002)16 Siegel-Itzkovich J., M.F.A., Israel, revista en www.mfa.gov.il, (2001)17 Maarse H. et al, Volatile compounds in food. Qualitative and quantitative data, (1990)

http://www.mfa.gov.il/http://www.mfa.gov.il/

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(Cx es la concentracin del compuesto x en el alimento; Ax es la concentracin

umbral olfatoria del compuesto x en el alimento).Se puede distinguir entre aromas activos e inactivos, segn el valor de

actividad aromtica de un compuesto en una matriz determinada. Los compuestosaromticos activos, son aqullos cuyo parmetro es superior a 1. En este sentido,Etivant18 aporta algunos datos referidos al aroma del vino:

1.- Sustancias con valores de aroma comprendidos entre 1 y 20 son: etanol,lactatos de los alcoholes de fsel, acetato de etilo, steres etlicos de los cidosgrasos de 6, 8 y 10 tomos de carbono y alcoholes isoamlicos.

2.- Sustancias con valores de aroma entre 0.1 y 2 son: 3-hidroxipropionatode etilo, isobutanol, feniletanol, hexanol, nanolactona, 1,1-dietoxietano, 4-etilfenol,4-etilguaiacol, y 2,3-butanodiona.

3.- Sustancias con valores de aroma comprendido entre 0.001 y 1 son:cidos isobutrico, hexanico, octanico y decanico, 3-hidroxibutanona,benzaldehdo, sulfuro de dimetilo, metionol y eugenol.

4.- Sustancias caractersticas del olor de vinos diversos, y con valores dearoma comprendidos entre 1 y 10: cinamato de etilo, linalol, geraniol y nerol(Moscatel), damascenona (Riesling y Chardonnay), 4-vinilguaiacol (Traminer),1,1-dietoxietano (Jerez), 2-metoxi-3-isopropilpirazina y 2-metoxi-3-pirazina(Sauvignon), lactonas de roble (vinos envejecidos en barriles nuevos), vitispirano(vinos blancos envejecidos) y TDN o 1,1,6-trimetil-1,2,-dihidronaftaleno (Rieslingenvejecidos).

En la tabla 1-3 se muestran los datos sensoriales de algunos compuestos presentes en el vino, el umbral olfatorio, las concentraciones habituales en vinos

tintos y la aportacin global.

18 Etivant P.X., Volatile compounds in foods and beverages, (1991)

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COMPUESTOS DESCRIPCINSENSORIAL

UMBRAL

OLFAT. (1)

C (mg L-1) APORTAC.

GLOBAL (2)

ALCOHOLES

MAYORITARIOS

EtanolPropanolIsobutanol1-Butanol2,3-Metilbutanol

PentanolHeptanolOctanol

Alcohol benclicoE-Feniletanol

Alcohlico, fuerteAlcohlico, dulznAlcohlicoAlcohlicoAlcohlico, vinoso,yodoformo, dulzn, pltano

Alcohlico, yodoformoAlcohlico, grasoAlcohlico, graso

Almendra amargaFloral, rosa,polen

14000300-500100-50015060-180

64.45.20.8

-7.5-200

1200005-1259-174tr-8.587-564

tr-5.1tr-0.050.09-1.5

0.008-0.424-197

m.s.p.s.s.i.m.s

i.i.

?

ALCOHOLES HERBCEOS2-Hexenol3-HexenolHexanol

Manzana verde, herbceoHoja verde, herbceoAlcohlico, dulzn,almendra verde, herbceo

--1.1-5.2

0.050.01-0.850.3-12

??s.-m.s.

ACETATOS DE ALCOHOLESSUPERIORES

Acetato depropilo

Acetato debutiloAcetato de isobutiloAcetato de amiloAcetato de isoamiloAcetato de hexiloAcetato de feniletiloAcetato de etilo

STERES ETLICOS DECIDOS GRASOSPropanoato de etiloIsobutirato de etiloHexanoato de etilo

Octanoato de etiloDecanoato de etilo

Disolvente, frutal, qumicoFrutal, dulzn, fresa sintticaFrutal, pltano, fresa sintticaDulce, frutal, pltanoPltano, manzana, frutalManzana madura, frutalRosa, miel, dulznDisolvente, pegamento,dulzn, frutal

Fruta sinttica, manzanaFrutal, manzana, papayaFrutal, manzana, anisadoFrutal, manzana, dulznFrutal, caprlico, dulzn,disolvente

4.741.83?0.10.16-1.00.67-2.41.812.3

1.80.10.080.580.51

-tr-0.020.01-1.2tr-0.040-230-4.80.02-8.00.15-257

tr-200.1-1.0tr-3.40.05-3.8tr-2.1

p.s./ s.i.p.s./ s.i.m.s.s. s.m.s.

s./m.s.m.s.m.s.s./ m.s.s.

x Tabla 1-3: Descripcin aromtica, umbrales olfatorios y contribucin al aroma delvino.

(1) UMBRAL OLFATORIO, (2) APORTACIN GLOBAL, i.=insignificante; p.s.=poco significativa s.=significativa; m.s.=muy significativa; tr=trazas.

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Un caso que hace referencia a esta dificultad, son las lactonas y sucontribucin al aroma. Tradicionalmente se les consideraba compuestosimportantes en vinos de Jerez28 y aunque se han encontrado lactonas en el aroma de

algunos vinos29

, los datos sensoriales, apuntana que su contribucin esinsignificante, excepto en el caso de los vinos de Jerez o en vinos envejecidos enbarrica 30. Sin embargo, otros investigadores31 muestran que la aportacin sensorialde la J-nonalactona de ciertos vinos elaborados con las varidades Pinot Noir,Merlot, Cavernet Sauvignon y Zifandel, puede ser significativa.

Respecto al papel que juegan las variedades, hasta el momento no se hadilucidado. Por otra parte, es conocida la influencia de la maceracin y de los primeros tratamientos de los mostos, y cmo afectan al aroma final del vino.Numerosos autores han tratado este tema y se ha concluido, que la maceracin es

un proceso importante para la extraccin de determinados compuestosaromticos32. La maceracin en fro de mostos blancos es muy interesante33. Sinembargo, todava no est muy claro qu compuestos aromticos son losresponsables de las notas afrutadas en vinos macerados.

Se ha estudiado tambin la influencia de determinados compuestos presentesen uvas, precursores aromticos, que aunque no sean voltiles contribuyensignificativamente en el aroma final del vino. Numerosos estudios han demostradoeste efecto y tambin se ha encontrado que no slo los compuestos terpnicospueden participar en el aroma varietal, sino que otros compuestos sintetizados por

otras vas distintas, como el cido shikmico y algunos carotenoides, pueden jugarun importante papel. Los compuestos estudiados por Williams y su equipo34,haban sido descritos como constituyentes del aroma y se haba hablado de rutasmetablicas importantes35, pero no se haba demostrado la importancia de estosprecursores como contribucin al aroma final del vino.

28 Criddle W. J. et al, Am. J. Enol. Vitic., 34, 61-71, (1983)Martn B. et al, J. Agric. Food Chem., 39, 1501-1503, (1991)29 Sakato K. H. et al, Am. J. Enol. Vitic., 26, 70-74, (1975)30 Maarse H. et al, Volatile compounds in food. Qualitative and quantitative data, (1989)31Nakamura S. et al, J. Food Sci., 53, 1243-1244, (1988.)32 Baumes R. et al, Conn. Vigne Vin, 22, 209- 223, (1988)Arnold R. A. et al, Am. J. Enol. Vitic., 30, 179-181, (1979)33 Franco Aladrn, E., Informe de vinificacin de las bodegas piloto de la Estacin deViticultura y Enologa de Movera (Zaragoza), (1988-1989)34 Williams P. J. et al, The aromatic substances of grapes and wines, (1989).35 Versini G. et al, LEnotecnico, 9, 595-600, (1983)

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1.5.- Determinacin de los compuestos voltiles

1.5.1.- Tcnicas de aislamiento o separacin

El inters por conocer la composicin de los aromas ha estado siemprepresente en la Enologa. Sin embargo, su estudio no ha sido posible hasta pocasrecientes, debido a la inexistencia de mtodos analticos capaces de determinar laconstitucin en compuestos minoritarios, de manera que slo la cata era elprocedimiento til para discernir sobre este tipo de compuestos.

Los procedimientos de aislamiento de los compuestos voltiles del vino delresto de la matriz estn basados en distintas propiedades fsico-qumicas como sonla volatilidad, la solubilidad en distintas fases orgnicas inmiscibles con la matriz y

la capacidad de ser adsorbidos selectivamente sobre ciertos materiales. Loscompuestos mayoritarios no necesitan su preconcentracin a partir de los vinos,sino que la inyeccin directa en el cromatgrafo o bien la inyeccin en espacio decabeza36, permite detectarlos, ya que tienen una concentracin lo suficientementealta como para poder ser registrados por los detectores habituales. Sin embargo,hay otro grupo, que se encuentran en concentraciones tan pequeas que necesitanser extrados y concentrados para poder ser determinados, stos son los voltilesminoritarios (son la mayora, exceptuando metanol, etanol, los alcoholessuperiores, acetato de etilo, acetaldehdo, formiato deetilo, propanal, 2,3butanodiol, glicerina, otros steres y los cidos que contribuyen a la acidez voltil).

Algunos de los mtodos que se utilizan para concentrar los voltiles de bajaconcentracin requieren demasiado tiempo, o suponen una gran manipulacin, loque puede conducir a distintos tipos de error, algunos tienen baja reproducibilidado bien pueden producir alteraciones de los voltiles originales cuando se superandeterminadas temperaturas, tambin pueden formarse nuevos compuestos, eincluso puede que la fraccin de aroma determinada no sea representativa de lamuestra37. Por ello se piensa que lo ms prximo a la composicin real de un vinose conseguir utilizando un mtodo con la mnima manipulacin posible, en el que

36 Gassiot M. et al, Afinidad, 5, 207-212, (1983)Noble A.C. et al, Vini dItalia, 11, 325-340, (1982)37Nnez A. J. et al, Chromatographia., 21, 44-48, (1986)

Nez A. J. et al, Chromatographia, 18, 153-158, (1984)Sugisawa C.R., Prerequisites for sample preparation in flavour analysis, in Analysis ofvolatiles, (1984)Shimizu J., Agric. Biol. Chem., 46, 2265-2274, (1982)Stan Kung M., Am. J. Enol. Vitic., 3, 187-190, (1980)Drozd J. et al, J. Chromatogr. A, 165, 141-165, (1979)

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los compuestos analizados sean los que realmente definen el aroma, con altareproducibilidad, y a ser posible que pueda controlarse de modo automtico.

Dentro de las tcnicas de aislamiento y separacin utilizadas con matrices devino cabe destacar38:

x El arrastre de las sustancias voltiles por medio de un gas inerte y posteriorrecuperacin en piezas refrigeradas. Es un mtodo propuesto ya en 196039 y suposterior aplicacin al vino fue utilizada por otros investigadores40. Consiste endesplazar los vapores del vino con un gas inerte, por ejemplo el nitrgeno41,que borbotea en el vino y arrastra preferentemente las sustancias de mayortensin de vapor.

x La extraccin por medio de un disolvente orgnico y posterior eliminacin deste por destilacin es una tcnica conocida desde muy antiguo. Ya sobre 1940se utiliz42 emplendose distintos disolventes como el ter de petrleo y pentano. Desde entonces han sido muchos los disolventes empleados43, ascomo sus mezclas44. Se utilizan indistintamente embudos de decantacin45,extractores en continuo46, as como tcnicas con ultrasonidos47. Las variablesson muy numerosas, siendo las ms importantes el tipo y cantidad dedisolvente, el volumen de muestra a tratar y el tiempo de extraccin.

38Cela R. et al, Tcnicas de separacin en Qumica Analtica, (2002)Varclcel M. et al, Tcnicas Analticas de separacin, (1988)39Nawar W. et al, Anal. Chem., 32, 1534-1535, (1960)40 Rankine B. C.,J. Sci. Food Agric., 4, 79-91, (1963)41Ortega-Heras M. et al,Anal. Chim. Acta, 458, 85-93, (2002)Mato F. et al, Ann. Quim., 79, 121-132, (1983)42 Moio L. et al, Ital. Food Sci., 3, 265 (1995)

Van Wyk C.J. et al, J. Food Sci., 32, 313-333, (1976)Peynaud E.,Rev. Vitic., 87, 362-382, (1937)43 Blanch G. P. et al,Food Chem., 56, 439-444, (1996)Carnacini A.B. et al,Am. J. Enol. Vitic., 31, 131-136, (1980)Cobb C.S. et al, J. Agric. Food Chem., 17, 656-658, (1978)Cobb C. S. et al, J. Agric Food Chem, 25, 197-199, (1978)44 Usseglio Tomasset L., Bull. OIV, 623, 19-34, (1983)Drawert F. et al, Vitis, 5, 351-376, (1966)45 Cobb C. et al,J. Agric. Food Chem., 26, 197-199, (1978)46 Gutirrez A.R. et al, Vitivinicultura, 9, 44-47, (1990)47

Mecozzi M. et al,J. Chromatogr. A, 963, 363-373, (2002)

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La destilacin y extraccin simultneas fue un mtodo desarrolladoinicialmente para el estudio de aceites esenciales vegetales48 y posteriormente hasido aplicado a los vinos por algunos autores.49 No obstante, ha sido poco

estudiado.

La desmixtura o microextraccin es un mtodo de concentracin conseguidopor saturacin de sales minerales, y posterior adicin o no de disolvente como faseorgnica, por medio del cual, algunos compuestos poco solubles en agua pasan a lafase alcohlica, o bien a la fase orgnica que se forma si se utiliza un disolvente. Latcnica consiste en aadir al vino las sales en proporciones adecuadas, agitar ydisolver, aadir el disolvente (en caso de utilizarse) y dejar que se produzca laseparacin de fases encontrndose en la fase alcohlica u orgnica los compuestosextrados50.

Extraccin con fluidos supercrticos. Es una tcnica que emplea un disolventeen condiciones supercrticas. Estos disolventes presentan propiedadesintermedias entre un gas y un lquido, lo que favorece su penetracin endiferentes matrices y, por tanto, la solubilizacin de los solutos. Su aplicacincomo tcnica de preparacin de muestras a escala analtica ha abierto nuevasperspectivas, no solamente porque sus aplicaciones simplifican la preparacin de lamuestra, sino porque se ha planteado la posibilidad de la automatizacin de todoel proceso analtico. Donde ms se ha utilizado es en el campomedioambiental y en el anlisis de alimentos, incluido el vino51.

Anlisis por espacio de cabeza. El vino se satura con una sal soluble paradisminuir la presin de vapor del agua y establecido el equilibrio lquido- vapor secromatografa esta ltima fase52.

48 Likens S. T. et al, Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 64, 5-13, (1964)49 Mesias J.L. et al, Sem. Vitiv., 32, 519-523, (1987)50 Senz C. et al, Chromatographia, 51, 221-226, (2000)51

Karasek P. et al, J. Chromatogr. A, 1002, 13-23, (2003)Levy J.M., Supercritical fluid sample preparation: A selective extraction strategy, LC-GC, (2000)Smith R.M.,J. Chromatogr. A, 856, 83-115, (1999)52

Castro R. et al, J. Chromatogr. A, 995, 11-20, (2003)Rodrguez-Bencomo J. J. et al, J. Chromatogr. A, 991, 13-22, (2003)Conde J.E. et al, Food Chem., 80, 125-133, (2003)

Nez A. J. et al, Chromatographia, 21, 44-48, (1986)Brander C. F. et al, Am. J. Enol. Vitic., 31, 69-75, (1980)Drozd J. et al, J. Chromatogr. A., 165, 141-165, (1979)Murray K. E. et al,J. Chromatogr A., 135, 49-55, (1977)

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Extraccin en fase slida o Solid Phase Extraction53 (SPE). Consiste en hacer pasar la disolucin que contiene los analitos a estudiar sobre una fase slida quelos adsorbe de manera especfica. Con ella se reduce el uso de disolventes orgnicos

y la utilizacin de material caro y frgil.

Tambin una tcnica de pervaporacin se ha venido utilizando recientementeen la industria enolgica54. Consiste en la separacin de voltiles del vino a travs deuna membrana colocada en un pervaporador. A travs de esta membrana pasan loscompuestos en estudio a una cmara donde se recogen en un portador en el que sedisuelven para ser medidos posteriormente.

La microextraccin en fase slida o Solid Phase Microextraction (SPME), esla tcnica ms actual y prometedora, adems de por su sencillez por los buenosresultados obtenidos55. Consiste en la utilizacin de una fase estacionaria donde seadsorben los analitos a estudiar directamente de la matriz, sin utilizar disolventesorgnicos. Debido al xito alcanzado se viene utilizando en numerosos campos:qumicos, medioambientales, alimentarios, forenses, etc.

Recientemente un nuevo mtodo de extraccin, ha sido introducido en elanlisis de compuestos orgnicos en matrices acuosas. La tcnica se llama " stir barsorptive extraction" (SBSE)56. Utilizando una varilla de agitacin recubierta con unafase de silicona, los compuestos orgnicos pueden ser extrados de muestras acuosas.Los resultados obtenidos son muy buenos.

Finalmente, comentar que son muchos los mtodos de extraccin que hansido desarrollados para la determinacin de voltiles en el vino. Sin embargo, estgeneralmente admitido que ninguno de ellos cubre todas las necesidadesrequeridas. Para cada problema en concreto la tcnica a aplicar es distinta y paraconocer todos los compuestos aromticos, es necesario combinar distintos mtodosde extraccin que nos den un conocimiento ms completo de estos57.

1.5.2.- Tcnicas de determinacin

Una vez que se han obtenido los extractos y que contienen los compuestos aestudiar, el siguiente paso es su determinacin.

53 Arrhenius S.P. et al, J. Agric. Food Chem., 44, 1085-1090, (1996)54 Luque de Castro M. D. et al, J. AOAC Int., 86, 394-399, (2003)55 Lord H. et al,J. Chromatogr. A, 885, 153-193, (2000)56 Dez J. et al, J. Chromatogr. A, 1025, 263-267, (2004)Sandra P. et al, J. Chromatogr. A, 928, 117-126, (2001)David F. et al, J. Microcolumn Sep., 11, 737-747, (1999)57 Ortega-Heras M. et al,Anal. Chim. Acta, 458, 85-93, (2002)

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Fue alrededor de 1960 cuando aparecieron nuevas tcnicas de anlisis, enespecial la cromatografa gaseosa (CG), que permiti introducir al estudio de losaromas, nuevas y numerosas aportaciones efectuadas por distintos autores58, que

marcaran la pauta de posteriores trabajos.Sobre los aos 50, antes de la introduccin de la CG, el anlisis de los

voltiles del vino se realizaba partiendo de cantidades muy grandes de material,que eran sometidos a destilaciones fraccionadas y cromatografa en columna59 conel objeto de obtener fracciones enriquecidas de las distintas familias decompuestos. La separacin final se realizaba por cromatografa de papel o en capafina y la identificacin, mediante la aplicacin sobre las placas cromatogrficas dedistintos reveladores ms o menos selectivos. De esta forma y tras un tediosotrabajo se consiguieron identificar y cuantificar algunas decenas de compuestos.

En la mayora de los casos, la informacin obtenida era de tipo cualitativo,debido a la pequea capacidad de resolucin de las tcnicas cromatogrficasempleadas entonces. Por ello, los primeros investigadores en este campo estuvieroncentrados, sobre todo, en el tratamiento de la muestra antes del anlisis, y a ellosdebemos, en gran medida, la mayor parte de los mtodos de aislamiento utilizadosen la actualidad.

La CG es una tcnica analtica de separacin que ha experimentado un grandesarrollo desde sus inicios. Adems, sus posibilidades han ido amplindose amedida que se ha mejorado la instrumentacin (columnas capilares, integradorescomputerizados, sistemas de gradiente de temperatura, nuevos detectores, etc.).Esta tcnica cromatogrfica es la que ofrece mejor poder de resolucin para loscompuestos voltiles. Su principal limitacin se encuentra en la labilidad de lossolutos, los cuales deben ser estables a la temperatura requerida para suvolatilizacin.

En CG la fase mvil es un gas, mientras que la fase estacionaria puede ser unslido adsorbente, un lquido retenido en un soporte slido (como es el caso de las

58 Cordonnier R.,Rev. Fr. Doenol., 53, 15-26, (1977)Bayonove C.,Ind. Alim. Agric., 88, 1559-1567, (1971)Ribereau-Gayon P., et al,Bull. O.I.V., 44, 428-466, (1971)Suomalainen H. et al, J. Inst. Brewing, 73, 477-484, (1967)Drawert F. et al, Vitis, 5, 351-376, (1966)Webb A.D. et al, Adv. Appl. Microbiol., 15, 317-353, (1963)Khun R. et al, Angew. Chem. Int. Edit, 67, 32-41, (1955)59 Garoglio P. G.,Nuovo trattato di enologa, (1953)

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columnas empaquetas) o un lquido impregnando la pared interna de una columnacapilar.

La CG acta globalmente como instrumento, ya que realiza tanto laseparacin como las determinaciones cuali y cuantitativas de los compuestos enestudio. Por tanto, se encuadra dentro de las tcnicas de separacin que tienenincorporado un sistema de deteccin.

En CG, la mezcla a separar, una vez volatilizada, se hace pasar a travs de lacolumna con la ayuda de un gas inerte, basndose la separacin en la distintavelocidad de los compuestos a su paso por sta, los cuales van llegando acontinuacin al sistema de deteccin. Las seales del detector se registranadecuadamente obtenindose una serie de picos que constituyen el cromatograma.

La posicin de los picos (tiempo de retencin) se utiliza con fines cualitativos,mientras que el rea o la altura de los mismos se relaciona con la concentracin delos compuestos.

Los componentes de un cromatgrafo de gases son:

x Siste m a de su m inistro del gas portador , generalmente es una botella de gas apresin, con un manorreductor a la salida y con un sistema de regulacin ymedida del caudal. Su misin es llevar la mezcla de los solutos desde que seintroduce en el sistema cromatogrfico hasta la salida del detector, pasando atravs de la columna donde se produce la separacin. Debe ser qumicamenteinerte y no interaccionar ni con la columna ni con los componentes de lamezcla.

x Siste m a de introduccin de la m u estr a , cuya configuracin vara en funcin delestado fsico de la misma y el tipo y capacidad de la columna utilizada. Estesistema pone en contacto la muestra con la corriente de gas portador.

x Siste m a de control de la te m peratur a . Existen tres zonas del cromatgrafo

donde esta variable debe controlarse: en la zona de inyeccin, en la columna yen el detector. Desde el punto de vista de la separacin cromatogrfica, es en lacolumna donde mayor incidencia tiene esta variable, ya que de ella depende elxito de la separacin. Para controlar la temperatura de la columna, sta estsituada en el denominado horno del cromatgrafo, que dispone de un sistemade calefaccin elctrico con un sistema de ventilacin adecuado, regidos ambospor un sistema electrnico.

x Colu m n a , se trata del componente principal del cromatgrafo, ya que es dondese produce la separacin de los compuestos. En ella se encuentra la fase

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estacionaria (lquida o slida). Presenta distintas medidas o tamaos segn eltipo de aplicacin.

x Siste m a de detecci n , situado a la salida de la columna. A travs de l pasa elgas portador con los compuestos ya separados. Cada vez que pasa uncompuesto se genera una seal elctrica que es amplificada adecuadamente.

x Registrador, al que llega la seal elctrica amplificada y da lugar alcromatograma. A partir del mismo se obtienen los datos cuali y cuantitativos.

x Integrador- co m putador , es el sistema informtico incorporado al cromatgrafo para la toma y tratamiento de datos. Realiza automticamente las operacionesde integracin de picos, medida de los tiempos de retencin, clculos con

estndares e imprime el informe final del anlisis.

La incorporacin de la CG y la columna capilar en el anlisis del aroma, hapermitido la identificacin y cuantificacin de los voltiles del vino. Sin embargo,todava el estudio de un extracto tan complejo no es tarea fcil.

La inyeccin cromatogrfica es un parmetro importante a valorar, ya que la precisin del proceso cromatogrfico viene determinada por la calidad de lainyeccin. Las formas de inyeccin ms comunes son:

x Split 60o divisin de flujo, donde una vez volatilizada la muestra se despreciaun fraccin del volumen inyectado, por lo que frente a otros tipos de inyeccinrequiere una superior concentracin del extracto.

x Splitless61o flujo sin dividir, donde una vez volatilizada, toda la muestra pasaa la columna.

x On-colu m n 62o en columna, donde la muestra no sufre un paso previo devolatilizacin, sino que se inyecta directamente en la columna en forma lquida.

Las tres tcnicas permiten el anlisis de muestras que contengan una ciertacantidad de no voltiles, las dos primeras por quedar retenidas en el inyector, y la

60Ortega C. et al,J. Chromatogr. A, 923, 205-214, (2001)Condon R. D.,Anal. Chem., 31, 1717-1723, (1959)61 Grob K. et al, J. Chromatogr. Sci., 7, 584-589, (1969)62 Grob K.,J. HRC & CC, 1, 263-265, (1978)

Schomburg G. et al, J. Chromatogr. A, 142, 87-89, (1977)

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ltima si se coloca una precolumna que peridicamente sea reemplazada olimpiada.

La inyeccin ms utilizada tradicionalmente en el anlisis de los aromas esen split. Las razones son varias: su sencillez, dar bandas cromatogrficas msestrechas, permite introducir muestras sucias y los tiempos de retencin que seobtienen son muy reproducibles.

Ahora bien, la inyeccin en split obliga a despreciar la mayor parte de lamuestra inyectada, por lo que comparando con otras tcnicas de inyeccin, requiereuna concentracin de extracto superior.

La inyeccin en splitless evitara tener que concentrar la muestra de forma

tan exhaustiva. Sin embargo, difcilmente va a poder aplicarse a extractosaromticos obtenidos segn esquemas clsicos63.

Finalmente, la inyeccin en columna, no resulta prctica con muestrassucias, como son la mayora de las que se obtienen con las operaciones de rutinaen el estudio de los aromas.

Por tanto, la inyeccin en el cromatgrafo tambin es algo complejo desde el punto de vista cuantitativo. Se complica, adems, si el extracto tiene compuestosno voltiles.

La CG es muy til cuando pretendemos identificar los compuestos quedeterminan una caracterstica aromtica conocida. Por lo tanto, es necesarioconocer los umbrales a partir de los cuales el producto mejora o se desvirta.

La informacin que nos pueda suministrar la CG en el control de calidadser mayor cuanto mejor conozcamos el perfil cromatogrfico de la fraccinaromtica de nuestro producto. Por ello, hay que disponer de un amplio banco dedatos del producto en las diferentes etapas de elaboracin y en diferentes aadas, y

relacionar estadsticamente compuestos con ciertas anomalas.Fue entre 1976 y 1982 cuando comenz a utilizarse la determinacin de

compuestos con contribucin al aroma para tratar de establecer clasificaciones

63 Grob K, Classical Split and Splitless Injection in Capillary GC, (1988)Grob K. et al, J. HRC & CC, 1, 57-61, (1978)

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varietales64. Por esta poca tambin comienzan a estudiarse los vinos portuguesesdesde el punto de vista de los voltiles65.

Adems, otros investigadores, aplican los mtodos de la cromatografagaseosa, para la identificacin de compuestos66, comenzando a trabajarse en vinosvarietales concretos, como el Moscatel Blanco del Piamonte67. Por esa mismapoca se elabora un estudio sobre la aplicacin del arrastre por nitrgeno para ladeterminacin de steres68. Al mismo tiempo que otros investigadores hacen lopropio, pero refiriendo el estudio al aroma de mostos y uvas.

Tambin en esa misma poca (1982), se conocen estudios sobre vinos deBorgoa69 y vinos italianos70, mediante el uso de columnas capilares.

Son muchos los autores y los libros que a partir de entonces se conocensobre los aromas de bebidas alcohlicas71 y en concreto sobre el vino. Se efectantambin distintos trabajos sobre los aromas de diferentes variedades de VitisVinifera72, al igual que un grupo de investigadores del Instituto de FermentacionesIndustriales que destacan en la tarea del conocimiento de los voltiles en el vino73.

Actualmente, los numerosos trabajos de investigacin que existen daninformacin abundante sobre la composicin de los aromas en uva, vino yaguardientes diversos74.

64Noble A.C., Vini dItalia, 11, 325-340, (1982)65 Da Cunha A. et al, Ann. Inst. vino Porto, 32, 243- 251, (1979)Da Cunha A. et al, Ann. Inst. vino Porto, 32, 253- 269, (1979)66 Donath- Jobbagy A. et al, Qual. wines, 20, 245-253, (1979)Shinohara T. et al, Agri. Biol. Chem. , 40, 2475-2477, (1976)67 Usseglio-Tomasset T. et al, Ann. I. Sperim. loenolog. Asti, 80, 3-13, (1980)Usseglio-Tomasset T.,Ann. I. Sperim. loenolog. Asti, 482, 47-56, (1980)Usseglio-Tomasset T. et al, Vignevini, 103, 33-38, (1979)68

Maynar J.I., Sem. Vitivin., 70, 2463-2467. (1980)69 Dubois P. et al, Rev. Fr, Doenol., 4, 51-53, (1982)70 Bertuccioli M et al, Vini dItalia, 3-4, 62-68, (1982)Bertuccioli M. et al, Vini dItalia, 6, 149-156, (1982)Carnaccini A. et al, Vini dItalia, 6, 106-112, (1982)71 Nykanen L.et al, Aroma of beer, wine and distilled alcoholic beverages, (1983)Piggot J.R., Flavour of distilled beverages: origin and development, (1983)72 Mesas J.L. et al, Rev. Fr. Doenol., 4, 55-60, (1982)73 Gassiot M. et al, Afinidad, 5-6, 207-212, (1983)74 Peinado R. A et al,Food Chem., 84, 585-590, (2004)Hummel T. et al,Appetite, 41, 197-202, (2003)

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Sin embargo, a pesar de la cantidad de estudios y datos sobre el tema, no seha llegado todava a establecer conclusiones definitivas, que hagan posible ladiferenciacin absoluta de distintos tipos de vino. Esto es debido por una parte, a la

riqueza y variedad de los propios compuestos aromticos del vino (una sustancia presente en una pequea cantidad, puede ser responsable del aroma caractersticode un vino, mientras que otras en mucha mayor proporcin no parecen afectar en lamisma medida), y por otra, las tcnicas de anlisis resultan complejas al tener quedeterminar sustancias en concentraciones tan bajas.

En el vino se han identificado ms de 1000 compuestos voltiles (estacantidad avanza a medida que avanzan los sistemas de deteccin) con unaconcentracin total de 0.8-1.2 g L-1, que tienen un papel importante en la calidad ytipifidad del vino, confirindole su personalidad, aunque hasta ahora slo se tiene

la certeza de que unos pocos participan en el aroma. Muchos de ellos se sabe queexisten, pero no se conoce su significado para la cata. Tampoco debemos pensarque los identificados con la nariz son los de mayor concentracin.

Algunos de los componentes del vino se encuentran en cantidadesinapreciables, por lo que es necesario el tratamiento previo de las muestras conobjeto de proceder a la concentracin de dichos componentes.

Estas razones han inducido al desarrollo de diversas metodologas,

propuestas por distintos autores,

75

las cuales muestran en comn: la utilizacin dela CG; los gases portadores ms utilizados son el nitrgeno y el helio; las columnasson variadas, destacando las Carbowax 1520 y 20M, ESD, FFAD, DEGS, OV1,Poropack Q y Tenax Gc y el detector ms utilizado es de ionizacin de llama(FID). An as, la bsqueda de nuevos productos sigue siendo un procesocomplejo.

Aunque HPLC (cromatografa lquida de alta resolucin) se ha utilizado paraseparacin y cuantificacin76, realmente no es una buena alternativa. La eficacia enla separacin es un problema, el anlisis es largo, y el acoplamiento con masas

(HPLC-MS) es todava bastante complicado, sin embargo la deteccin poracoplamiento de CG y MS, se viene utilizando con frecuencia para el anlisis dearomas, de manera que est sustituyendo al FID. Desde el punto de vista de laseparacin analtica, resulta ms ventajoso hacer acoplamientos con tcnicas

75 Ribereau-Gayon P.,Bull. O.I.V., 44, 428-466, (1971)Prillinger F.,Bull, OIV, 44, 548-560, (1971)Cordonnier R.,Bull. OIV, 44, 1128-1148, (1971)Drawert F. et al, Vitis, 5, 351-376, (1966)76 Escobal A. et al, J. Chromatogr. A, 823, 349-354, (1998)

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basadas en distintos principios, los cuales han sido utilizados, aplicados con xitoen la separacin e identificacin de aromas complejos77.

Una propuesta que proporciona un gran conocimiento sobre los voltiles dedeterminadas matrices, como es el vino, es el caso de la CG Multidireccional(CGMD). Aunque la introduccin de la columna capilar optimiz la separacin decompuestos, la utilizacin de una sola columna en matrices complejas, como es elvino, a menudo no es suficiente para separar determinados analitos. La CGMDpermite la conmutacin de varias columnas de distinta fase estacionaria y con ellola posibilidad de optimizar el anlisis segn la tcnica utilizada. Una fraccin deleluato de la primera puede ser desviada hacia la segunda antes de llegar aldetector78. Este dispositivo puede automatizarse, pero tiene la desventaja de que esnecesario duplicar la instrumentacin.

Los estudios clsicos, por as llamarlos, nos permiten obtener unainformacin, sobre todo, de compuestos mayoritarios, pero sin embargo, hay notasdel aroma que no pueden explicarse con datos cuantitativos extrados de uncromatograma. Por esto, la tendencia para responder a estas cuestiones es larealizacin de ensayos olfatomtricos. Estos se basan en desviar el flujo de salidade la columna hacia un portal de olfaccin de forma que puedan ser registrados losolores y la intensidad de cada uno de los compuestos eluidos a travs de la columnacapilar.

La deteccin olfatomtrica o sniffing permite determinar el perfilaromtico de los vinos a partir del anlisis cromatogrfico.

El olfatmetro puede ser un portal olfatorio donde un panel de jueces,debidamente entrenados, huelen los extractos a la salida del cromatgrafo79, o

77 Kourkoutas Y. et al,Food Chem., 82, 353-360, (2003)Kotseridis Y. et al,J. Enol. Viticult, 49, 44-48, (1998)Perez M.S. et al, Chromatographia, 47, 427-432, (1998)

Chamblee T. S. et al, J. Agric. Food Chem., 39, 162-169, (1991)Maarse H. et al, Distilled beverages flavour, (1989)Chamblee T. S. et al, J. Chromatogr. A, 330, 141-151, (1985)Teitelbaum C.L.,J. Agric. Food Chem., 25, 466-470, (1977)78 Eshwar J. et al, J. Agric. Food Chem., 50, 5797-5802, (2002)Wright D.W., Food Sci Tech., 79, 113-141, (1997)79 Schneider R. et al, J. Chromatogr. A, 936, 145-157, (2001)Charles M. et al,J. Agric. Food Chem., 48, 70-77, (2000)Hashizume K. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 1333-1337, (1997)Priser C. et al, J. Agric. Food Chem., 45, 3511-3519, (1997)Guth H.,J. Agric. Food Chem., 45, 3022-3026, (1997)

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bien un olfatmetro electrnico o nariz electrnica80 que puede entrenarse parareconocer y diferenciar el aroma del vino normal, frente a olores anmalos, y enconsecuencia clasificar las muestras. Para ello basta con someter la muestra a un

espacio de cabeza que se hace incidir en un grupo de sensores, midiendo larespuesta de stos. Una vez puesto a punto el sistema, cada determinacin escuestin de minutos.

A pesar de que las apreciaciones nasales son ms discriminantes yreproducibles que las bucales y que en la descripcin de la singularidad de un vinola evaluacin por nariz es la ms apropiada, hay notas como las herbceas, demadera o pimienta, por ejemplo, que se perciben mejor por la boca. Para simular lava retronasal se han introducido tcnicas que retienen las percepcionesretronasales en un polmero, previo al anlisis olfatomtrico.

Las limitaciones de esta tcnica son la falta de sensibilidad para algunoscompuestos, en los que el umbral de percepcin es menor que el de deteccin y laincapacidad de interpretar los efectos sinrgicos y antagonistas entre los distintoscompuestos aromticos.

Con la nariz electrnica, lo que se pretende es conseguir rplicas fiables delolfato, pero con mquinas dotadas de sistemas de deteccin (sensores de gases yespectrometra de masas) que respondan a la presencia de molculas. Las sealesemitidas por las diferentes muestras son procesadas por sistemas quimiomtricos.

La incorporacin de narices electrnicas en el campo de la enologa es algomuy reciente81, aunque en otros sectores como son el alimentario, cosmtico ofarmacutico ya ha sido demostrada su efectividad82.

Las perspectivas en enologa son buenas, como en el caso de deteccin desustancias anmalas o txicas, algo muy preocupante en la industria alimentaria.

Deibler K.D. et al, J. Agric. Food Chem., 47, 1616-1618, (1999)Peter K.C. et al, J. Agric. Food Chem., 47, 665-670, (1999)Moio L. et al, Am. J. Enol. Viticult , 46, 393-398, (1995)Chisholm M.G. et al, Am. J. Enol. Vitic , 45, 201-211, (1994)80 Garca G. et al, Quim. Anal., 20, 3-11 (2001).Capone S. et al, Sensor Actuat.-B: Chem., 69, 230-235, (2000)81 Di Natale C. et al, Sensor Actuat.-B: Chem., 69, 342-347 (2000)Escudero A. et al, J. Agr. Food Chem., 48, 4268-4272, (2000)82 Gardner J.W. et al, Electronic noses-principles and applications, (1999)Gonzlez Y et al, Anal. Chim. Acta, 384, 83-94, (1999)Tan T. et al,LC-GC Int., 8, 218-225, (1995)

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PROCEDIMIENTOSDEEXTRACCINEMPLEADOS

Tiene las ventajas de que el control puede ser continuo y no necesita personalcualificado.

En resumen, hemos comentado diversas tcnicas de estudio, que a pesar desus limitaciones, proporcionan informacin valiosa y complementaria sobrediversos aspectos del aroma: caracterizacin organolptica (anlisis sensorial),composicin qumica cualitativa y cuantitativa del aroma (CG), caracterizacionaromtica individual de los compuestos (deteccin olfatomtrica) y modelacinquimiomtrica del aroma global (nariz electrnica).

Se ha investigado mucho ms sobre el aroma del vino que sobre el de lasuvas, en parte por tratarse de una matriz ms manejable, y en parte porque el vinoes al fin y al cabo la evolucin tecnolgica de las uvas.

En esta memoria se han puesto a punto cada una de las siguientesmetodologas, que se ven en profundidad en los captulos correspondientes.

x Extraccin liquido-liquido (ELL). Se han considerado diferentes disolventes ysus mezclas, diferentes volmenes de fase acuosa y tambin distintosextractores, tanto en discontinuo, continuo, como con ultrasonidos (captulos 6,7 y 8 respectivamente).

x Microextraccin por des m ezcla, utilizando diclorometano como disolvente deextraccin y con dos tipos de detectores muy diferentes, de ionizacin de llamay espectrometra de absorcin molecular ultravioleta visible (FID y EAM-UV-Vis) (captulos 9 y 10).

x Extraccin en fase slida (SPE), utilizando como fase slida cartuchoscomerciales (Zorbax C18) (captulo 11).

x Microextraccin en fase slida (SPME) en la que los analitos se adsorbenmediante extraccin en espacio de cabeza sobre una fibra de slice fundida

recubierta con una fase estacionaria adsorbente de naturaleza polimrica, sinnecesidad de utilizar ningn disolvente de extraccin (captulo 12).

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PROCEDIMIENTOSDEEXTRACCINEMPLEADOS

2.- OBJETIVOS

La finalidad de este trabajo es contribuir al conocimiento de la composicindel vino, en lo que a determinados compuestos voltiles se refiere y emplear dicho

conocimiento para la clasificacin de vinos.

En el desarrollo de esta memoria se han planteado dos objetivos generales,que se pueden dividir en otros ms concretos.

Objetivo 1. Realizacin de un estudio analtico para la determinacin decompuestos voltiles en vino.

x Bsqueda y actualizacin de la bibliografa relacionada con el tema.

x Estudio de diferentes procedimientos de extraccin y su optimizacin: lquido-lquido (continuo, discontinuo y ultrasonidos), slido-lquido, microextraccinpor desmezcla y microextraccin en fase slida.

x Puesta a punto de mtodos analticos para la identificacin y cuantificacin dediferentes aromas del vino, tanto por rectas de calibrado como por patrninterno. Estudio comparativo de ambos procedimientos.

x Obtencin de las caractersticas analticas en los distintos mtodos.

x Comparacin de las diferentes metodologas estudiadas y seleccin de la msadecuada para la determinacin de los compuestos de inters.

x Aplicacin del mtodo seleccionado en muestras de vino procedentes dedistintas denominaciones de origen (Rioja, La Mancha, Valdepeas, Navarra yCariena).

Objetivo 2. Realizacin de un estudio quimiomtrico para la caracterizacin de

vinos procedentes de distintas denominaciones de origen.x Bsqueda y actualizacin de la bibliografa relacionada con el tema.

x Evaluacin inicial de diferentes tcnicas quimiomtricas.

x Clasificacin de las muestras de vino en funcin de su contenido en loscompuestos voltiles objeto de estudio, empleando anlisis componentesprincipales, anlisis discriminante y anlisis cluster.

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PROCEDIMIENTOSDEEXTRACCINEMPLEADOS

5.- PROCEDIMIENTOS DE EXTRACCIN EMPLEADOS

Uno de los objetivos planteados en esta memoria es el estudio yoptimizacin de diferentes mtodos de extraccin de los compuestos voltiles a

partir de muestras de vino sinttico y posterior aplicacin a muestras de vino real.

Segn la bibliografa consultada, existen muchos procedimientos para laextraccin de compuestos voltiles en el vino (captulo 1), hay numerosos trabajosen este campo y todos encaminados a encontrar un sistema sencillo y prctico pararealizar el estudio de la extraccin.

Los mtodos de extraccin que se han puesto a punto se han seleccionadoadems de por su accesibilidad, por utilizar tanto mtodos clsicos como alguno

ms actual. En la figura 5-1 se muestran los procedimientos utilizados. Para todosellos, los extractos obtenidos se analizaron por CG con detector FID y comoestudio particular, tambin los extractos obtenidos con microextraccin por sales seanalizaron por CG con detector de absorcin molecular UV-Visible.

PROCEDIMIENTOS DEEXTRACCIN UTILIZADOS

EXTRACCINLQUIDO-LQUIDO(ELL)

EXTRACCINEN FASE

SLIDA (SPE)

MICRO-EXTRACCIN

CON SALES

MICRO-EXTRACCIN

EN FASESLIDA(SPME)

DISCONTINUO

ULTRASONIDOS

CONTINUO

x Figura 5-1: Procedimientos de extraccin empleados

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La estructura de exposicin seguida en cada una de las metodologasutilizadas es la siguiente:

1. Introduccin del procedimiento utilizado, en la que se da una explicacinde la metodologa que va a usarse, anotando los campos en los que se havenido utilizando y realizando un estudio bibliogrfico.

2. Material especfico utilizado, si procede, en dicho procedimiento,independientemente del material ms comn utilizado para todos ellos yexpuesto en el apartado 3 de instrumentacin general.

3. Procedimiento operativo, donde se expone a modo de receta la forma detrabajo con las condiciones idneas, las cuales se optimizarn en los

apartados siguientes.

4. Optimizacin de las diferentes variables que afectan a la extraccin.

5. Caractersticas analticas de los compuestos seleccionados en dichomtodo de extraccin.

6. Cuantificacin en muestras de vino real.

Asignacin de seales y eleccin de compuestos

El detector de ionizacin de llama ha sido el ms utilizado en CG para elanlisis de aromas. En los ltimos aos se han ampliado los conocimientos en estecampo gracias a la incorporacin de la Espectrometra de Masas (MS). LaEspectrometra de Masas abarca distintas tcnicas que se emplean para medir lasmasas de iones y su abundancia en fase gaseosa. Los pasos que sigue son:

x Generacin de molculas de fase gaseosa.

x Ionizacin de las mismas.x Separacin segn sus masas.

La Espectrometra de Masas se ha convertido en una de las herramientas msverstiles y poderosas del anlisis qumico, y gracias a la variedad de fu

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diseadas para vaporizar e ionizar las molculas que inicialmente no son gases, seha ampliado su aplicacin al anlisis de casi todo tipo de muestras.

Mediante CG con columna capilar acoplada a Espectrometra de Masas (CG-

MS), se han separado e identificado numerosos compuestos voltiles,pertenecientes a diversas familias de aromas89.

Para elegir los compuestos a estudiar, se hizo un anlisis de vino de Riojapor CG-MS, con la finalidad de identificar las sustancias que lo forman.

Las condiciones cromatogrficas experimentales utilizadas fueron:

temperatura del detector: 210 C

temperatura del inyector: 210 Ctemperatura de la interfase: 230 C

gas portador: helio (0.9 mL min-1)

relacin de split 0.2:1

volumen de inyeccin: 2.0 PL

columna polar: Supelcowax 1090

El programa de temperatura utilizado, a partir de datos bibliogrficos y porla experiencia previa en compuestos similares, fue el siguiente:

4 C min-1

60 C 210 C3 min 5 min

Tiempo total empleado= 45.5 min

89 Demyttenaere J. et al, J. Chromatogr. A, 985, 233-246, (2003)90

30m x 0.53 mm I.D., 1 m film thickness de Supelco, Bellefonte, PA, USA

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4-1a.El cromatograma obtenido en estas condiciones se representa en la figura

C

A B

x Figura 4-1a: Cromatograma obtenido por CG-MS para muestras de vino

Algunos de los compuestos que se detectaron se indican a continuacin:

Alcoholes-3-Metil-1-butanol -1-Hexanol-3-Hexenol -2-Feniletanol-1-Pentanol

Terpenos-D-Terpineol -Geraniol-Linalol

cidos-cido butanoico -cido hexanoico-cido octanoico -cido decanoico-cido actico -cido frmico

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15

steres-Succinato de dietilo -Octanoato de etilo-Acetato de 3-metil-1-butilo -Acetato de 2-feniletilo

-Hexanoato de etilo -Acetato de hexilo-cido frmico-2-fenil etil ster -Decanoato de etilo-Dodecanato de etilo (laurato de etilo) -Nanoato de etilo

Otros-Benzaldehdo -2-Etiltiofeno

Este cromatograma lo dividimos en tres zonas (A, B y C), cada una de las

cuales la ampliamos (figura 4-1b) con el fin de ver mejor las seales.

6 9

A 7 10

8 11

2

1 3 12

B 16

13

14

x Figura 4-1b: Cromatograma obtenido por CG-MS. Ampliacin porzonas

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17

C

x Figura 4-1b: Continuacin

De entre todos ellos se hizo una seleccin de los 17, que se indican en lafigura. Se eligieron compuestos que pertenecan a diferentes grupos o familiasqumicas (cidos, steres, alcoholes y terpenos). El nombre y abreviatura de cada

uno de ellos as como el n correspondiente a cada seal se indican a continuacin:

1 = Acetato de 3-metil-1-butilo (A3M1B)

2 = 3-Metil-1-butanol (3M1B)

3 = Hexanoato de etilo (HE)

4 = 1-Pentanol (1P)

5 = 1-Hexanol (1H)

6 = Octanoato de etilo (OE)7 = cido butanoico (AB)

8 = Decanoato de etilo (DE)

9 = Linalol (L)

10 = Succinato de dietilo (SD)11 = D-Terpineol (T)

12 = Acetato de 2-feniletilo (AFE)

13 = Geraniol (G)

14 = cido hexanoico (AH)

15 = 2-Feniletanol (2FE)

16 = cido octanoico (AO)

17 = cido decanoico (AD)

Los espectros de masas de cada uno de estos compuestos se muestran en elapndice C.

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El aroma del vino ha atrado desde hace tiempo a numerosos investigadores,sin embargo todava no esta claro como la interaccin entre el numeroso grupo decompuestos que lo forman y la matriz vnica, generan todas las notas, matices,

aromas y sabores que forman el vino.Por ello es importante tambin el estudio de otros compuestos minoritarios o

presentes en concentraciones ms bajas, aunque desde el punto de vista analticosean mayores las dificultades, ya que influyen de forma muy importante en el valorsensorial de los vinos.

A continuacin mostramos en la tabla 4-1 la seleccin de los compuestos enfuncin del grupo qumico al que pertenecen.

ALCOHOLES TERPENOS CIDOS STERES

3-Metil-1-butanol1-Hexanol2 Feniletanol1-Pentanol*

LinalolD-TerpineolGeraniol

Ac. octanoicoAc. decanoicoAc.butanoico*Ac. hexanoico*

Acetato de 3-metil-1-butiloHexanoato de etiloOctanoato de etiloSuccinato de dietiloAcetato de 2-feniletilo

Decanoato de etilo *

x Tabla 4-1: Compuestos seleccionados*Estos compuestos se han utilizaron puntualmente a lo largo de la memoria

A continuacin, describimos brevemente los cuatro grupos qumicos decompuestos seleccionados:

Los steres son, cualitativamente, los constituyentes ms importantes delvino. Tambin se consideran importantes en el aroma global del vino ya que dan eltpico afrutado que describe a menudo a stos. Respecto a su origen, la mayora proceden de las uvas, otro origen es el metabolismo secundario durante lafermentacin alcohlica o bien se producen a lo largo del tiempo dealmacenamiento, la causa de esta ltima es la esterificacin de cidos con losalcoholes:

cido + alcohol ster + H2O

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Los factores que ms afectan al contenido de steres son todos aquellosrelacionados con la uva (variedad, maduracin, estado sanitario, etc.), condicionesde fermentacin (temperatura, anaerobiosis estricta, maceracin), las cepas de

levadura y la edad del vino.Los principales steres que aparecen en los vinos, en correspondencia con

las altas concentraciones de etanol, isobutanol (2-metilpropanol) y alcoholisoamlico (3-metil-1-butanol) son: steres de etilo, butilo e isopentilo.

El grupo de los steres de los cidos, est compuesto principalmente por etilderivados. El acetato de etilo a concentraciones altas (mayores de 160 mg L-1) esdesagradable, pero a bajas dosis forma parte del aroma agradable del vino. Elacetato de 3-metil-1-butilo se considera responsable del aroma afrutado de los

vinos jvenes. Los steres de los cidos grasos son muy importantes en el aroma devinos blancos. Y a medida que se incrementa el nmero de tomos de carbono, lapercepcin organolptica se acerca ms al sabor jabonoso, alejndose del afrutado.

Los alcoholes, al igual que los steres han sido muy estudiados y son, juntocon ellos, cuantitativamente los compuestos ms importantes formados durante lafermentacin. Sin embargo, stos al contrario que los steres, nunca han sidoconsiderados factores de calidad. Se han descrito como picantes, alcohlicos, etc.,el hexanol, concretamente como herbceo, considerndose nicamente el 2-feniletanol como placentero, con olor a rosa, dulce o a perfume.

Su contribucin al aroma no est claramente indicada en todos los casos, yaun a pesar de su carcter no agradable, muchos autores sugieren que sucontribucin al aroma del vino es de calidad. Contribuyen al sabor dulce de labebida. Para que la sensacin sea agradable deben estar equilibrados los saborescidos y amargos con el dulce.

Los alcoholes presentan tambin otra peculiaridad, que es su impresin altacto en la lengua con sensacin ardiente, debido a su poder deshidratante ylipodisolvente.

Los monoalcoholes presentan toxicidad que se ha comprobado ser notablemente creciente con el nmero de tomos de carbono, y as los isoamlicostienen una toxicidad unas dieciocho veces superior a la del metanol.

Los alcoholes proceden, en general, de la fermentacin del azcar del vino.Han sido demostrados dos caminos para explicar el metabolismo de estecompuesto. El primer origen descrito, es el catabolismo de los correspondientesaminocidos (leucina para el 3-metil-1-butanol, 2 fenilalanina para el 2-feniletanol,etc.), y el segundo es el anabolismo de aminocidos a travs del catabolismo de los

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azcares. Su concentracin en los vinos puede verse alterada por distintos factorescomo el estado de la uva (presencia de Botritis Cinerea), temperatura de lafermentacin, grado de anaerobiosis, etc. En el caso del 2-feniletanol, influye

considerablemente la edad del vino, parece que es debido a un proceso deoxidacin de la fenilalanina, sin embargo este incremento en la concentracin del2-feniletanol con el tiempo no es sistemtico.

El hexanol tiene diferente origen, por una parte es un constituyenteimportante de las uvas, y tambin se forma tras una oxidacin enzimtica de loscidos linoleicos y oleicos durante la fase de despalillado y prensa.

Los terpenos son compuestos que crean un amplio espectro de aromas, percibido generalmente como muy agradable. Su contribucin al aroma de

los vinos es de ciertas notas florales en el caso de linalol y geraniol y agradable, sindefinir, la contribucin del terpineol. Es decir todos ellos aportan una nota positivaa la calidad del vino.

Los cidos son compuestos que no se describen como aromasagradables para el vino, su individual olor se conoce o identifica con elvinagre, la mantequilla, el queso, aceites vegetales, etc.

Se discuten diferentes vas de formacin, posiblemente el mecanismo

es una va de degradacin E-oxidacin al principio de la fermentacin y unproceso anablico. Todos los cidos grasos con menos de 5 tomos de carbono nose consideran de calidad, ya que indican una actuacin bacteriana o bien el iniciode la fermentacin con levaduras esporgenas. Sin embargo, si el nmero de tomoses mayor de 5, s constituyen factor de calidad.

De hecho, muy pocos estudios se han encontrado en la bibliografa msreciente sobre los cidos concretamente, y este hecho probablemente sea debido aque su contribucin no se considera positiva.

Sin embargo, ya sobre los aos sesenta Rizzon citaba en un estudio larelacin positiva entre la concentracin de cidos de 6, 8 y 10 tomos de carbono, yla calidad del vino. Con esto queda demostrada, la difcil interpretacin sensorialde estos compuestos respecto al vino.

Los cidos grasos no aparecen, o lo hacen en trazas en las uvas. Proceden dela sntesis en las fermentaciones, con el tiempo o por bacterias. Los factores queafectan a su concentracin son: temperatura, oxgeno, pH, etc.

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Queda demostrada la influencia positiva de la baja temperatura defermentacin o una estricta anaerobiosis en el contenido total de cidos grasos.Tambin determinadas tcnicas como son largos procesos de maceracin o

clarificaciones despus de la fermentacin son procesos que incrementan elcontenido de cidos grasos en el vino, pero no hay muchos ms datos sobre ello.

Una vez seleccionados los compuestos, se prepar una disolucin de vinosinttico con los compuestos elegidos, y se analiz por CG-Masas, en lascondiciones iniciales citadas anteriormente.

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Apndice E .- Rango de concentraciones en vino real yfrmulas de los compuestos voltiles

En este apndice se presentan las frmulas y concentraciones de loscompuestos voltiles que se utilizan a lo largo del trabajo en vinos tinto y blanco.

x

x

xx

x

x

Acetato de 3-metil -1-butilo

3-Metil- 1-butanol

Hexanoato de etilo1-Pentanol

1-Hexanol

Octanoato de etilo

0-23 ppm (T)

6-490 ppm

tr-3.4 ppm (T)0.008-5.1 ppm

0.3-12 ppm

0.2-3.8 ppm (T)

0.03-0.5(B)

0.003-1.3(B)

0.005-2.3(B)

x Linalol libres 100Pg/kg uva ligados 390

x cido butanoico 0.4-4.8ppm (T) 0.04-1.1(B)

x

Decanoato de etilo tr-0.3ppm (T) 0-2.1(B)x Succinato de dietilo 1,.5-7.9 ppm

x

x

-Terpineol

Acetato de 2-feniletilo

libres 5Pg/kg uva

0.02-8ppm (T)

ligados 40

0-18.5(B)

x cido hexanico (Caprico) 0.7-2.6 ppm (T) 0.02-5.7(B)

x Geraniol libres 5Pg/kg uva ligados 330

x 2-Feniletanol 4-197 ppm

x cido octanoico ( Caprlico) 0.7-3.7 ppm (T) 0.07-20.9(B)

x cido decanoico (Cprico) 0-1,.6 ppm (T) 0-4.5(B)

x Rango de concentraciones encontrado en la bibliografa sobre muestras de vino real(T: tinto, B: blanco). En caso de no especificarse engloban ambos tipos.

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0 OH

Acetato de 3-metil-1-butilo

O

O

(C7H14O2) A3M1B Succinato de dietilo

O

O

(C8H14O4) SD

O

3-Metil-1-butanol (C5H12O) 3M1B

D-Terpineol

O

(C10H20O) T

OH

Hexanoato de etilo (C8H16O2) HE

O

O

Acetato de 2-feniletanol

O

OH

(C10H12O2) AFE

1-Pentanol (C 5H12O) 1PO

OH

1-Hexanol (C6H14O) 1H

cido hexanoico (C6H12O2) AH

O

OHOH

Octanoato de etilo (C10H20O2) OE

O

2-Feniletanol (C8H10O) 2FE

OH

O

Linalol (C10H18O) L Geraniol (C10H18O) G

OH OH

cido butanoico

O

(C4H8O2) ABcido octanoico (C8H16O2) AO

O

OHOH

Decanoato de etilo (C12H24O2) DE

O

cido decanoico (C10H20O2) AD

O

x Frmulas desarrolladas de los compuestos voltiles

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OT