85
Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos da oliveira Cynthia Malhadas Dissertação apresentada ao Instituto Politécnico de Bragança e à Universidade de Salamanca para obtenção do Grau de Mestre em Farmácia e Química dos Produtos Naturais Orientado por : Professora Doutora Paula Baptista Doutora Paula Guedes Bragança 2014

Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

Composição volátil e atividade antimicrobiana de

fungos endofíticos da oliveira

Cynthia Malhadas

Dissertação apresentada ao Instituto Politécnico de Bragança

e à Universidade de Salamanca para obtenção do Grau de Mestre em Farmácia e Química dos Produtos Naturais

Orientado por :

Professora Doutora Paula Baptista

Doutora Paula Guedes

Bragança

2014

Page 2: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 3: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

iii

“À estrelinha que me guia...

… Avó”

Page 4: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 5: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

v

Agradecimentos

Chega ao fim uma das etapas mais importantes da minha vida. A entrega desta tese,

marca uma vírgula no meu percurso académico. Pois, penso que pontos nunca deveriam

existir no caminho da vida!

Agradeço à minha orientadora Doutora Paula Baptista, por todo o carinho, preocupação,

ajuda, disponibilidade, conhecimentos transmitidos e acimo de tudo, amizade.

Obrigado, por ter estado sempre a meu lado e ter-me dado animo e força;

À minha co-orientadora Doutora Paula Guedes, pela disponibilide e ajuda;

Ao Ricardo Malheiro, pela total disponibilidade, transmissão de conhecimentos, ajuda,

conselhos e força nesta fase;

Ao laboratório de Agrobiotecnologia, em especial, à Teresa, Nuno e Diogo Ferrão, pela

amizade, momentos bem passados em otima disposição;

Ao meu Migo Pedro, pela nossa amizade desde do inicio da nossa vida em Bragança,

por teres sido sempre tu, pela ajuda, carinho, lágrimas, risos, desabafos, momentos bem

passados jamais esquecidos e paciência para comigo nesta fase;

Ao meu Titi pela amizade, pelo carinho, pelo teu mau feitio e o meu, e pela força que

me deste nesta fase;

À minha Cláudia, pela amizade, por teres tido sempre uma palavra meiga e de

incentivo, pelas horas a fio ao telemovél, palavras para quê?

Aos meus xuxus do Mestrado, à Marta, à Azucena, e em especial a Mélissa e ao Tó,

pela experiência incrível que vivemos em Salamanca, pelos momentos passados na

nossa querida Plazza, pela força, pelo carinho, pela paciência, e acima de tudo o que nos

juntou ainda mais e que ficará para sempre a nossa amizade;

À minha little Jusse, por toda a amizade, carinho e força, mesmo longe tiveste sempre

sempre a meu lado;

À minha querida Sofia, pela nossa amizade, ajuda incondicional, desabafos, força,

carinho e o resto tu sabes...;

Á minha querida Lili, pela força e preocupação que sempre tiveste comigo;

Page 6: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

vi

Às meninas lá de casa, à Diana por ter uma palavra de conforto nesta fase e pela boa

disposição e jantares feitinhos ao chegar, à Elzinha pelos momentos bem passados,

risos, lágrimas, desabafos e pela nossa amizade;

A todos os meus amigos que se cruzaram comigo nesta vida académica;

Á ma famille pour tout, loin mais toujours là…

A TI, pelo amor, carinho, amizade, cumplicidade, pela força que me deste nesta fase,

por me acalmares, pela paciência, por me fazeres rir mesmo quando não tinha vontade

para isso, pelas palavras de incentivo, por teres acreditado sempre em mim,

simplesmente por seres tu e fazeres parte da minha vida;

Aos meus pais e a minha irmã, pelo amor incondicional, pela força, carinho, ajuda, por

terem acreditado sempre sempre em mim, por me fazerem sentir todos os dias a pessoa

mais privilegiada deste mundo por ter uns pais e uma irmã como vocês, pelos desabafos

que duram horas e horas, pelos bons conselhos, a vós vos devo tudo.

Ao meu cunhado por ter sempre uma palavra de incentivo, ao meu sobrinho por me

perguntar repetitivamente: “Titi, já está”?

E assim, te respondo agora meu querido sobrinho, “sim já”, e isso devo a TODOS

vocês.

Mais uma vez um MUITO OBRIGADO.

Page 7: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

vii

Este trabalho é financiado por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação para a

Ciência e a Tecnologia no âmbito do projeto “EndoBio - Isolamento e seleção de fungos

endofíticos da oliveira para luta biológica contra Colletotrichum acutatum e Verticillium

dahliae” (PTDC/AGR-PRO/4354/2012).

Page 8: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 9: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

ix

Índice

Resumo .......................................................................................................................................... xi

Abstract ....................................................................................................................................... xiii

Capítulo 1 ...................................................................................................................................... 1

Introdução ..................................................................................................................................... 1

1.1. Introdução geral ............................................................................................................ 3

1.2. Fungos endofiticos ........................................................................................................ 4

1.3. Metabolitos bioativos produzidos por fungos endofiticos ........................................... 7

1.4. Bioprospeção de metabolitos bioativos ...................................................................... 15

1.5. Isolamento e identificação do fungo ........................................................................... 17

1.6. Cultura do fungo e optimização da produção de metabolitos ................................... 18

1.7. Elucidação da natureza química do metabolito .......................................................... 18

1.8. Avaliação das propriedades biológicas dos metabolitos fúngicos .............................. 19

1.9. Importância do estudo dos fungos endofiticos da oliveira ......................................... 20

1.10. Objetivos ................................................................................................................. 21

Objetivos especificos: ............................................................................................................. 21

Bibliografia .............................................................................................................................. 23

Capítulo 2 .................................................................................................................................... 31

Volatile composition and antimicrobial activity of endophytic fungi from olive tree ................ 31

Capítulo 3 .................................................................................................................................... 67

Conclusões .................................................................................................................................. 67

Page 10: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 11: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

xi

Resumo

Nos últimos anos, os fungos endófitos associados a diversas espécies de plantas,

têm sido explorados como potenciais produtores de novos compostos antimicrobianos

para superar os grandes problemas de resistência dos microrganismos aos

antibióticos/antifúngicos. No entanto, estudos sobre fungos endófitos de Olea europaea

L., são ausentes. Neste trabalho, foi estudado o potencial antimicrobiano de três fungos

endófitos de O. europaea e avaliado o efeito da planta hospedeira neste potencial. Os

compostos voláteis produzidos pelos endófitos foram identificados por cromatografia

gasosa / espectrometria de massa, e posteriormente correlacionados com a atividade

antimicrobiana. Os fungos endófitos, Penicillium commune e Penicillium canescens

foram os mais eficazes na inibição de bactérias [até 2,7 vezes mais em comparação com

cloranfenicol (30 µg/mL)] enquanto que Alternaria alternata foi mais eficaz na inibição

de leveduras [até 8,0 vezes mais em comparação com o fluconazol (25 µg/mL)]. Esta

espécie foi também a que apresentou o maior espetro de atividade na concentração

minima inibitória ≤ 0,095 mg/mL. O extracto de planta hospedeira mostrou

desempenhar um papel importante na actividade antimicrobiana dos endófitos,

dependendo da espécie. A análise do perfil volátil de A. alternata e P. canescens,

permitiu identificar seis compostos voláteis, sendo 3-metil-1-butanol e fenil-etil álcool

os mais abundantes. Outros compostos voláteis identificados incluiram o 3-metil-1-

butanol acetato, 1-octen-3-ol, β-cedreno e thujopsene. Através da análise de

componentes principais, foi possível verificar que a atividade antimicrobiana exibida

por A. alternata pode estar relacionada com a sua composição volátil, principalmente

devido ao elevado teor de voláteis antimicrobianos 3-metil-1-butanol e fenil-etil álcool.

Em geral, os resultados obtidos destacaram o potencial antimicrobiano de fungos

endofíticos de O. europaea e a possibilidade de serem explorados pelos seus agentes

antimicrobianos.

Palavras-chave: Olea europaea; Alternaria alternata; Concentração mínima inibitória;

HS-SPME/GC/MS

Page 12: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 13: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

xiii

Abstract

In recent years, fungal endophytes from diverse host plant species, have been

examined as potential producers of novel antimicrobials to overcome the growing

problems of drug resistance in microorganisms. Studies on fungal endophytes from

Olea europaea L. are however absent. In this study, the antimicrobial potential of three

fungal endophytes from O. europaea was studied and the host plant effect in the

antimicrobial activity was examined. The volatile compounds produced by endophytes

were identified by gas chromatography/mass spectrometry and further correlated with

the antimicrobial activity. Both Penicillium commune and Penicillium canescens were

most effective in inhibiting bacteria [in average up to 2.7-fold compared to

chloramphenicol (30 µg/mL)] whereas Alternaria alternata was most effective in

inhibiting yeasts [in average up to 8.0-fold compared to fluconazole (25 μg/mL)]. This

specie also displayed the widest spectrum of anti-microorganisms at MIC ≤ 0.095

mg/mL. Host plant extract showed to play an important role in the antimicrobial activity

of the endophytes, depending on the species. From the volatile composition of A.

alternata and P. canescens, six volatiles were identified, being 3-methyl-1-butanol and

phenylethyl alcohols the most abundant. Others volatiles like 3-methyl-1-butanol

acetate, 1-octen-3-ol, β-cedrene and thujopsene were identified. By a principal

component analysis it was possible to verify that the antimicrobial activity displayed by

A. alternata may be related to its volatile composition, mainly due to the high content in

the antimicrobial volatiles 3-methyl-1-butanol and phenylethyl alcohol. Overall the

obtained results highlighted the antimicrobial potential of endophytic fungi from O.

europaea and their possibility to be exploited for their antimicrobial agents.

Keywords: Olea europaea; Alternaria alternata; minimum inhibitory concentration;

HS-SPME/GC/MS

Page 14: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 15: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

Capítulo 1

Introdução

Page 16: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

2

Page 17: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

3

1.1. Introdução geral

Atualmente, a pesquisa de compostos bioativos naturais com aplicação no

tratamento e prevenção de doenças humanas tem vindo a ganhar cada vez mais

importância (Donadio et al., 2010). Alguns destes estudos centram-se na bioprospeção

de produtos naturais de origem microbiana, tendo sido já descritos neste âmbito mais de

22 000 metabolitos secundários bioativos (Berdy, 2005). De entre os microrganismos

com maior importância como fonte de produtos naturais destacam-se os fungos, sendo

responsáveis por 38% do total dos compostos biologicamente ativos de origem

microbiana descritos (Berdy, 2005). A maioria destes metabolitos é explorada pela sua

atividade como antibióticos, imunossupressores e antineoplásicos (Strobel & Daisy,

2003). Dos fármacos mais conhecidos e derivados de fungos destacam-se os

antibióticos da classe das penicilinas e cefalosporinas, os redutores de colesterol como a

mevastatina e lovastatina, imunossupressores como a ciclosporina e rapamicina, entre

outros (Cragg e Newman, 2005; Greve et al., 2010).

Apesar dos fungos serem reconhecidos como uma importante fonte de produtos

bioativos naturais é estimado que, uma grande quantidade destes compostos, se encontre

ainda por identificar (Higginbotham et al., 2013). Este facto deve-se sobretudo ao

desconhecimento da diversidade fúngica. Na realidade, somente cerca de 6,7% da

diversidade fúngica total que se estima existir na Terra é conhecida (Kirk et al., 2008).

Desta forma, estudos que visem a avaliação da diversidade fúngica em diversos

ecossistemas e a bioprospeção de novos produtos naturais resultantes do seu

metabolismo, serão um contributo valioso para a obtenção de novos fármacos. Nestes

estudos de bioprospeção de compostos bioativos naturais deve ser dada especial atenção

aos fungos que estabelecem associação mutualista com as plantas. Durante o

estabelecimento destas associações são induzidas vias biossintéticas especificas que

produzem novos e diversos metabolitos secundários (Carter, 2011), dependendo de

fatores bióticos (e.g. espécies envolvidas na interação) e abióticos (e.g. fatores

climáticos) (Soliman et al., 2013). Os fungos endofíticos são organismos que colonizam

os tecidos internos das plantas sem aparentemente causarem quaisquer danos no

hospedeiro (Hyde & Soytong, 2008). Nos últimos anos, estes fungos têm sido alvo de

Page 18: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

4

estudos com vista à identificação de novos produtos bioativos naturais que possam ser

utilizados não só na indústria farmacêutica (Liang et al., 2012; Qadri et al., 2013), mas

também alimentar e agrícola (Porras-Alfaro & Bayman, 2011).

1.2. Fungos endofiticos

Os fungos endofíticos são microrganismos que colonizam inter- e

intracelularmente os tecidos internos das plantas, durante todo o seu ciclo de vida ou

parte dele, sem causarem sintomas aparentes de doença no hospedeiro (Hyde e Soytong,

2008). O tipo de interação que se estabelece entre fungo endófito-planta hospedeira é

geralmente mutualista, mas também pode tornar-se parasita originando doença na planta

hospedeira (Schulz & Boyle, 2005). Na interação mutualista, o fungo endófito aumenta

o crescimento, reprodução e resistência/tolerância a stresses bióticos (insetos,

herbívoros, fitopatogénicos) e abióticos (stresse hídrico, salinidade, metais pesados,

entre outros) da planta hospedeira (Saikkonen et al., 2004; Jalgaonwala et al., 2011).

Por sua vez, a planta hospedeira serve de refúgio ao endófito protegendo-o, fornece-lhe

os nutrientes necessários para o seu desenvolvimento e possui ainda um papel

importante na sua transmissão (Saikkonen et al., 2004). Pensa-se que a interação

mutualista seja o resultado de um equilíbrio estabelecido entre a resposta de defesa da

planta à invasão fúngica e a virulência (Schulz & Boyle, 2005) ou as necessidades

nutricionais do endófito, bem como das condições ambientais onde decorre a interação

(Kogel, 2006). Se por qualquer motivo este equilíbrio for perturbado, surgem sintomas

de doença na planta ou alternativamente o fungo é excluído devido a reações de defesa

da planta (Kogel, 2006). Esta hipótese, proposta por Schulz e Boyle (2005) com o

intuito de explicar a relação do fungo endófito como parasita ou mutualista com a planta

hospedeira, encontra-se evidenciado na figura 1.

Page 19: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

5

Figura 1 – Hipótese explicativa para o estabelecimento de relações mutualistas ou parasitas

entre fungo endofítico - planta hospedeira (adaptado de Schulz e Boyle, 2005). A ocorrência de

equilíbrio entre a resposta de defesa da planta e a virulência do fungo resulta numa interação

mutualista. Na ausência de equilíbrio a interação é parasita ocorrendo doença.

Os fungos endofíticos são ubíquos tendo sido observada a sua presença em todas

as espécies de plantas estudadas até ao momento, desde herbáceas a lenhosas, e em

todas as regiões e habitats amostrados (Arnold, 2007; Finlay, 2007; Jalgaonwala et al.,

2011). A maioria das espécies fúngicas endofiticas pertencem ao filo Ascomycota

(Arnold, 2007). No entanto, espécies pertencentes aos filos Basidiomycota e

Deuteromycota, e alguns Oomicetes, foram também identificados (Kogel et al., 2006;

Rodriguez et al., 2009).

Os fungos endofiticos são classificados em dois grupos, clavicipitáceos e não-

clavicipitáceos, de acordo com diferenças evolutivas, taxonómicas, planta hospedeira e

funções ecológicas (Rodriguez et al., 2009). O grupo dos clavicipitáceos inclui fungos

pertencentes sobretudo à família Clavicipitaceae (filo Ascomycota) que colonizam

principalmente espécies de gramíneas de climas temperados (Rodriguez et al., 2009). A

colonização das plantas por estes fungos é feito de modo sistémico, e as espécies são

Page 20: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

6

transmitidas verticalmente pelas sementes para a próxima geração (Saikkonen K et al.,

2002). Os fungos endofiticos clavicipitáceos são reconhecidos por favorecerem o

crescimento e aumentarem a tolerância das plantas à herbivoria por insetos e a

fitpatogéneos, e a vários stresses abióticos (secura, metais pesados, entre outros) (Torres

et al., 2012). Grande parte destes benefícios deve-se à produção de metabolitos

secundários bioativos por parte dos fungos, destacando-se neste âmbito as espécies

pertencentes aos géneros Cordyceps, Balansia, Epichloe (forma anamórfica:

Neotyphodium), Claviceps e Myriogenospora (Rodriguez et al., 2009). No entanto, as

vantagens conferidas por estes fungos dependem da espécie e do genótipo da planta

hospedeira, e das condições ambientais (Higgins et al., 2014). O grupo não-

clavicipitaceos inclui espécies fúngicas filogeneticamente diversas, pertencentes

maioritariamente ao filo Ascomycota (Pezizomycotina e Saccharomycotina) e

Basidiomycota (Agaricomycotina, Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina) (Rodriguez

et al., 2009). A maioria das espécies pertence a géneros vulgarmente ubíquos, tais como

Acremonium, Alternaria, Cladosporium, Coniothyrium, Epicoccum, Fusarium,

Geniculosporium, Phoma, Pleospora e Phomopsis (Schulz & Boyle, 2005). Estes

fungos colonizam briófitas, pteridófitas, gimnospérmicas e angiospérmicas (Rodriguez

et al., 2009). Apesar de serem menos estudados face ao grupo anterior, os fungos não-

clavicipitaceos têm demonstrado ter efeitos variáveis nas plantas hospedeiras, sendo os

efeitos benéficos os mais mencionados. Estes fungos promovem o crescimento e

aumento da produção e aumentam a tolerância a stresses abióticos e bióticos (e.g.

fitopatogéneos) da planta hospedeira (Waqas et al., 2012). São ainda considerados uma

fonte rica de compostos com interesse biotecnológico (e.g. enzimas; Robl et al., 2013) e

farmacológico, pela produção de metabolitos secundários novos com atividades

biológicas diversas (Smith et al., 2008).

A composição da comunidade fúngica endofitica na planta hospedeira geralmente

varia de acordo com a espécie vegetal (Moricca et al., 2012), localização geográfica

(Hoffman e Arnold, 2008), condições climáticas (Giauque & Hawkes, 2013) e difere

entre os vários tecidos e orgãos de uma mesma planta hospedeira (Moricca et al., 2012).

A preferência de uma espécie endofitica por um determinado orgão da planta hospedeira

pode dever-se à composição química desse tecido. De fato, os diferentes tecidos e

órgãos da planta hospedeira podem constituir microhabitats distintos, permitindo o

desenvolvimento de uma determinada espécie fúngica endofitica. Foi já descrita a

Page 21: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

7

presença de fungos endofiticos em folhas, ramos, caules, raízes e estruturas florais como

pólen, ovário, anteras e estames (Kumar & Hyde, 2004).

Uma única planta pode conter várias dezenas de espécies fúngicas endofiticas e,

uma única espécie vegetal, distribuida por uma determinada área geográfica, pode

albergar centenas de espécies endofiticas (Rodriguez et al., 2009). Por exemplo,

nalgumas angiospérmicas tropicais verificou-se que 2 mm2 de tecido foliar pode conter

mais do que uma espécie fúngica endofitica (Gamboa et al., 2003).

1.3. Metabolitos bioativos produzidos por fungos endofiticos

O estabelecimento da interação mutualista entre fungo endofítico-planta

hospedeira caracteriza-se pela produção de metabolitos secundários que desempenham

um papel importante para o hospedeiro e/ou uma função ecológica relevante. A

produção destes metabolitos bioativos tem como principal objetivo o aumento da

tolerância/resistência da planta hospedeira a fitopatogéneos, ataque de insetos praga e

herbívoros (Ownley et al., 2010). Prevê-se que a diversidade destes metabolitos seja

elevada dada a multiplicidade de vias biossintéticas que podem ocorrer durante a

associação mutualista (Carter, 2011). A variabilidade de fatores bióticos (tais como as

espécies envolvidas na interação) e abióticos (como por exemplo fatores ambientais)

contribuem também para o incremento da diversidade de metabolitos produzidos

durante a interação fungo endofitico-planta (Soliman et al., 2013).

Os metabolitos secundários isolados de fungos endofíticos pertencem a várias

classes tais como alcalóides, esteróides, terpenos, isocumarinas, quinonas,

fenilpropanóides, lignanas, ácidos fenólicos, entre outros (Zhang et al. 2006; Yu et al.

2010). Estes compostos naturais, produzidos por fungos endofíticos, apresentam um

amplo espectro de actividades biológicas, como por exemplo antimicrobiana,

antiparasitária, neuroprotetiva, antioxidante, antidiabética, propriedades

imunossupressoras, antiviral, anticolinesterásica, antineoplásicos e citotóxica (Ondeyka

et al. 1997 ; Zhang et al. 1999 ; Guo et al., 2000 ; Zhang et al., 2006 ; Shweta et al.,

2010 ; Wang et al., 2012).

Page 22: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

8

No que concerne especificamente à atividade antimicrobiana, os metabólitos

isolados de fungos endófitos pertencem a diversas classes estruturais tais como

alcalóides, peptídeos, terpenóides, esteróides, fenóis, flavonóides e quinonas (Tabela 1).

Os alcalóides são compostos orgânicos nitrogenados, em geral heterociclicos, e

com ação tóxica e alucinogénica. Vários estudos têm demonstrado o efeito

antimicrobinano de alcalóides produzidos por fungos endofiticos (Yu et al., 2010). Os

alcalóides identificados como pirrocidinas A e B, produzidas durante o processo

fermentativo do fungo endofítico Acremonium zeae isolado de milho, mostraram uma

significativa atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positiva, Candida albicans

e alguns fungos filamentosos (Wicklow et al., 2005). De igual modo, foi isolado do

fungo Chaetomium globosum isolado de folhas de Ginkgo biloba vários alcalóides

(chaetoglobosina A e C) que apresentavam atividade antimicrobiana contra Mucor

miehei (Qin et al., 2009).

Os peptideos são outra classe de compostos com enorme importância a nível

antimicrobiano, sendo as penicilinas os compostos mais conhecidos desta classe. A

partir da cultura do fungo endofitico Penicillium sp. isolado de Acrostichum aureum,

Cui et al. (2008), identificaram 2 novos peptideos ciclicos, (Pro-Thr) e (Pro-Tyr), que

mostraram ação antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Candida albicans.

Terpenóides, terpenos ou isoprenóides são três nomes utilizados para designar

uma extensa e numerosa família de produtos naturais, alguns dos quais comercializados

como fármacos. Os terpenóides podem ser subdivididos em várias classes de acordo

com o número de átomos de carbono ou seja de unidades isoprénicas (como mono,

sesqui, di, tri, tetraterpenóides, esteróides, entre outros). No âmbito dos fungos

endofiticos, foi por exemplo já verificada a ação antimicrobina de 5 sesquiterpenos

(cadinenos) produzidos pelo fungo endofitico Phomopsis cassiae isolado da planta

Cassia spectabilis (Silva et al., 2006).

Os compostos fenólicos são uma classe de compostos de baixo peso molecular e

correspondem a metabolitos secundários com propriedades bioativas. As principais

classes dos compostos fenólicos são os ácidos fenólicos e os flavonóides (Cowan,

1999). A este último grupo pertence um número alargado de famílias de compostos

como os flavanóis, os flavonóis, as flavanonas, as flavonas e as antocianinas, que

diferem no seu padrão de oxidação (Cowan, 1999). A atividade dos flavonóides é

Page 23: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

9

devida à capacidade de formarem complexos nas proteínas extracelulares solúveis e

outros componentes das paredes celulares bacterianas. Desta forma, a actividade

antimicrobiana destes compostos tem como principal alvo as membranas bacterianas

(Cowan, 1999). Hoffman et al. (2008) estudaram os metabolitos do meio fermentativo

do fungo endofitico Phoma sp. isolado da planta Saurauia scaberrinae, culminando na

purificação e na caracterização de um composto fenólico derivado do ácido ústico

(Phomodione) que apresentou actividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus

e Escherichia coli.

Quinonas é o termo geral que se utiliza para classificar uma classe de compostos

que são bioquimicamente endógenos, encontrados em produtos naturais ou gerados

através do metabolismo de xenobióticos. As quinonas consistem num anel aromático

com dois grupos cetónicos. O efeito antimicrobiano das quinonas é enorme por

formarem complexos irreversíveis com aminoácidos nucleofílicos nas proteínas,

conduzindo à inativação ou perda da função das enzimas (Cowan, 1999). Os alvos mais

prováveis das quinonas são as adesinas, os polipeptídos da parede celular e as enzimas

membranares de células microbianas (Cowan, 1999). Aly et al. (2008) caracterizaram

novos metabólitos antimicrobianos da classe das quinonas de uma cultura do fungo

Ampelomyces sp., endófito isolado da planta medicinal Urospermum picroides. Estas

quinonas apresentavam atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus, S.

epidermidis e Enterococcus faecalis com IC50 = 12,5–25 µg/mL.

A maioria destes compostos com atividade antimicrobiana foram identificados em

fungos endofiticos pertencentes sobretudo aos géneros Phomopsis, Fusarium, Xylaria e

Colletotrichum (Tabela 1). Estas espécies fúngicas foram isoladas maioritariamente de

plantas medicinais, quer de espécies herbáceas (e.g. Artemisia annua, Artemisia

mongolica, Urospermum picroides, Cynodon dactylon, Vitex negundo, Tripterygium

wilfordii, Dendrobium devonianum, Dendrobium loddigesii, Hypericum perforatum,

entre outras) quer de espécies arbóreas e arbustivas (e.g. Garcinia scortechinii, Garcinia

mangostana, Ginkgo biloba, Azadirachta indica, Dracaena cambodiana, entre outras).

A atividade antimicrobiana das espécies endofiticas foi testada sobretudo contra

bactérias gram-positivas (destacando-se as espécies Staphylococcus aureus e Bacillus

subtilis) e gram-negativas (em especial Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli). A

actividade antimicrobiana contra leveduras e fungos filamentosos foi menos estudado

Page 24: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

10

comparativamente às bactérias. Ao nivel das leveduras, a mais estudada foi a Candida

albicans.

Tabela 1 – Exemplos de fungos endofíticos com atividade antimicrobiana (adaptado de Yu et

al., 2010; Radic e Strukelj, 2012).

Fungo endofítico Planta hospedeira Metabolito secundário Microrganismos testados Referência

Acremonium zeae Zea mays L. Alcalóides Aspergillus flavus

Fusarium verticillioides

Candida albicans

Wicklow et al.,

2005

Alternaria sp. Sonneratia alba Sm. Desconhecido Enterococcus cloacae

Enterococcus faecium

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Staphylococcus aureus

Streptococcus pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

Kjer et al. 2009

Ampelomyces sp. Urospermum picroides

(L.) Scop.

Quinonas Enterococcus faecalis

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Aly et al. 2008

Aspergillus sp. Garcinia L. Desconhecido Bacillus subtilis

Escherichia coli

Micrococcus luteus

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Ramasamy et al.

2010

Cynodon dactylon (L.)

Pers.

Ergosterol

Ácido helvólico

Monomethylsulochrin

3β-Hydroxy-5α,8α-

epidioxy-ergosta-6,22-

diene

Bacillus subtilis

Candida albicans

Escherichia coli

Helicobacter pylori

Pseudomonas fluorescens

Sarcina lutea

Staphylococcus aureus

Li et al. 2005

Chaetomium

globosum

Ginkgo biloba L. Compostos alifáticos

Alcalóides

Mucor miehei Qin et al. 2009

Chloridium sp.

Azadirachta indica A-

Juss.

Javanicin Bacillus sp.

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas fluorescens

Kharwar et al.

2009

Page 25: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

11

Fungo endofítico Planta hospedeira Metabolito secundário Microrganismos testados Referência

Cladosporium sp Quercus variabilis

Blume

Compostos alifáticos Aspergillus niger

Candida albicans

Epidermophyton floccosum

Microsporum canis

Trichophyton rubrum

Wang et al. 2000

Colletotrichum sp. Artemisia annua L. Esteróides Bacillus subtilis

Pseudomonas sp.

Sarcina lutea

Staphylococcus aureus

Lu et al. 2000

Colletotrichum

gloeosporioides

Artemisia mongolica

(Besser) Fisch

Desconhecido Bacillus subtilis

Pseudomonas sp.

Sarcina lutea

Staphylococcus aureus

Zou et al. 2000

Vitex negundo L.

Desconhecido Bacillus subtilis

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Arivudainambi et

al. 2011

Cryptosporiopsis sp. Pinus sylvestris L.

Fagus sylvatica L.

Péptidos Leveduras Noble et al. 1991

Cryptosporiopsis

quercina

Tripterygium wilfordii

Hook.f.

Péptidos Candida albicans Strobel et al.

1999

Dictyosporium

heptasporum*

Dracaena cambodiana Desconhecido Bacillus subtilis

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Cui et al. 2011

Fusarium sp. Quercus variabilis

Blume

Cerebroside 1

Cerebroside 2

Bacillus subtilis

Escherichia coli

Shu et al. 2004

Fusarium oxysporum* Dracaena

cochinchinensis Hort.

Desconhecido Bacillus subtilis

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Cui et al. 2011

Guignardia sp.

Spondias mombin L. Desconhecido Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Rodrigues et al.

2000

Hopea hainanensis

Monomethylsulochrin

Ácido rizotónico

Guignasulfide

Helicobacter pylori

Wang et al. 2010

Page 26: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

12

Fungo endofítico Planta hospedeira Metabolito secundário Microrganismos testados Referência

Microdiplodia sp. Erica arborea L. 3,4-

dihydroglobosuxanthone

Escherichia coli

Krohn et al. 2009

Microdiplodia

hawaiiensis

Garcinia mangostana

Linnaeus

Desconhecido Bacillus subtilis

Escherichia coli

Micrococcus luteus

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella typhi

Staphylococcus aureus

Radji et al. 2011

Microsphaeropsis sp. Lycium intricatum

Boiss.

Microsphaeropsone A

Microsphaeropsone C

Citreorosein

Enone

Escherichia coli

Krohn et al. 2009

Zygophyllum

fontanesii

Fusidienol A

8-Hydrox-6-metil-9-oxo-

9H-xanthene-1-acido

carboxilico

Ester metilico

Escherichia coli

Krohn et al. 2009

Muscodor albus Árvores tropicais Péptidos Candida albicans Strobel et al.

1999

Penicillium sp. Acrostichum aureum

L.

Péptidos Candida albicans

Staphylococcus aureus

Cui et al. 2008

Cerbera manghas Fenóis Staphylococcus aureus

Han et al. 2008

Periconia sp. Taxus cuspidata

Siebold & Zucc

Periconicin A

Periconicin B

Bacillus subtilis

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Salmonella typhimurium

Micrococcus luteus

Proteus vulgaris

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Kim et al. 2004

Pichia guilliermondii Paris polyphylla

var.yunnanensis

Desconhecido

Bacillus subtilis

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Staphylococcus haemolyticus

Zhao e Zhou

2008

Zhao et al. 2010

Phoma sp. Saurauia scaberrinae Fenóis Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Hoffman et al.

2008

Page 27: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

13

Fungo endofítico Planta hospedeira Metabolito secundário Microrganismos testados Referência

Phomopsis sp. Excoecaria agallocha

L.

Compostos alifáticos Candida albicans

Fusarium oxysporum

Huang et al. 2008

Garcinia dulcis

(Roxb.) Kurz

Alcalóides Mycobacterium tuberculosis Rukachaisirikul

et al. 2008

Salix gracilistyla var.

Melanostachys

Phomopsichlasin Bacillus subtilis

Enterocccus faecium

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Horn et al. 1995

Phomopsis sp. Aspidosperma

tomentosum

Desconhecido Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Corrado e

Rodrigues 2004

Erythrina crista-galli

L.

Phomol Arthrobacter citreus

Bacillus subtilis

Corynebacterium insidiosum

Escherichia coli

Pseudomonas fluorescens

We4ber et al.

2004

Cistus salviifolius. L. Pyrenocines Bacillus megaterium

Escherichia coli

Hussain et al.

2012

Notobasis syriaca (L.)

Cass.

Phomosine K

Phomosine A

Amido de fenilalanina

2-Hydroxymetil-

4β,5α,6β-

trihidroxiciclohex-2-eno

Phyllostine

Epiepoxydon

(monoacetato)

Bacillus megaterium

Escherichia coli

Hussain et al.

2011

Phomopsis cassiae

Rhizoctonia sp.

Cassia spectabilis

Cynodon dactylon (L.)

Pers.

Terpenóides

Monomethylsulochrin

Ergosterol

3β,5α,6β-

trihydroxyergosta-7,22-

diene

Cladosporium

sphaerospermum

Cladosporium

cladosporioides

Helicobacter pylori

Silva et al. 2006

Ma et al. 2004

Page 28: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

14

Fungo endofítico Planta hospedeira Metabolito secundário Microrganismos testados Referência

Trichoderma

ovalisporum

Panax notoginseng

(Burkill)

Koninginin A

2-3-

dihydroxpropyloctadec-

9-enoate

Ácido xiquimato

Citosina ribonucleoside

Bacillus cereus

Escherichia coli

Micrococcus luteus

Staphylococcus aureus

Dang et al. 2010

Thielavia

subthermophila

Hypericum perforatum

L.

Hypericin

Emodin

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella enterica

Staphylococcus aureus

Kusari et al. 2008

Xylaria sp

Acremonium sp.

Diaporthe sp.

Hypoxylon sp.

Pestalotiopsis sp.

Phomopsis sp.

Xylaria sp.

Ginkgo biloba L.

Torreya jackii Chun

Aegiceras

corniculatum L.

Blanco

Avicennia alba BI

Avicennia officinalis

L.

Bruguiera gymnorhiza

(L.) Savigny

Bruguiera parviflora

(Roxb) Arn.

Lumnitzera littorea

Rhizophora apiculata

Blume

Rhizophora mucronata

Lam

7-Amino-4-

metilcumarina

1-(Xylarenone

A)Xylariate A

Xylarioic acid B

Xylariolide A, B,C e D

Methyl xylariate C

Taiwapyrone

Desconhecido

Aeromonas hydrophila

Escherichia coli

Salmonella Enteritidis

Salmonella typhi

Salmonella Typhimurium

Shigella sp.

Staphylococcus aureus

Vibrio anguillarum

Vibrio parahaemolyticus

Yersinia sp.

Bacillus subtilis

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Liu et al. 2008

Hu et al. 2010

Buatong et al.

2011

Page 29: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

15

Fungo endofítico Planta hospedeira Metabolito secundário Microrganismos testados Referência

Alternaria alternata

Colletotrichum

gloeosporioides

Drechslera

dematioidea

Guignardia bidwelli

Phomopsis archeri

Lippia sidoides Cham Desconhecido Bacillus subtilis

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

De Siqueira et al.

2011

Fusarium equiseti

Guignardia vaccinii

Garcinia mangostana

Linnaeus

Desconhecido Aeromonas hydrophila

Bacillus subtilis

Listeria monocytogenes

Staphylococcus aureus

Streptococcus faecalis

Sim et al. 2010

Bionectria sp.

Fusarium solani

Dendrobium loddigesii

Rolfe

Desconhecido Bacillus subtilis

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Chen et al. 2010

Epicoccum nigrum

Fusarium sp.

Phoma sp.

Dendrobium

devonianum

Desconhecido Bacillus subtilis

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Xing et al. 2011

Desconhecido Daphnopsis

americana (Mill)

J.R.Johnst

Terpenóides Enterococcus faecalis

Staphylococcus aureus

Brady et al. 2000

Brady et al. 2001

Singh et al. 2000

*Dos 49 fungos endofíticos, dois destacaram-se com maior acividade antimicrobiana.

1.4. Bioprospeção de metabolitos bioativos

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), um dos maiores problemas de

saúde pública da atualidade advém das limitações dos antifúngicos e dos antibióticos

disponíveis para o tratamento de infeções causadas por fungos e bactérias,

respectivamente. O aumento do aparecimento de estirpes bacterianas multirresistentes a

antibióticos, devido sobretudo ao seu uso irracional, é a principal causa da ineficácia

destes agentes terapêuticos (ECDC, 2012). Atualmente, foram já isoladas bactérias

resistentes a todos os antibióticos disponíveis, e o número de estirpes resistentes a

antibióticos continua a aumentar atingindo já valores alarmantes (ECDC, 2012). Na

União Europeia morrem cerca de 25000 pessoas por ano, com uma infeção resultante de

Page 30: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

16

uma bactéria resistente aos antibióticos administrados (Carlet e Mainardi, 2012). O

aumento de resistência aos antibióticos no espaço europeu é sobretudo observado ao

nível das bactérias gram-negativas Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e

Pseudomonas aeruginosa (ECDC, 2012). Portugal foi um dos países da União Europeia

onde se observou um aumento do aparecimento de microrganismos multirresistentes

com poucas opções de tratamento, sendo a bactéria Staphylococcus aureus resistentes a

meticilina (MRSA) uma das mais persistentes (ECDC, 2012).

No que concerne aos antifúngicos, os maiores problemas da sua utilização no

tratamento de infeções contra fungos filamentosos e leveduras, residem na sua baixa

selectividade e elevada toxicidade, dadas as semelhanças entre as células fúngicas e as

humanas (Gupte et al., 2002). Adicionalmente, o número de casos de infeções fúngicas

humanas tem vindo a aumentar nos últimos anos, o que poderá estar relacionado com o

aparecimento de resistências por parte das leveduras/fungos filamentosos aos

antifúngicos comummente utilizados, entre outros fatores (Pfaller e Diekema, 2007).

Como resposta, tem-se verificado a introdução de novos fármacos antifúngicos no

mercado. Contudo, esta área encontra-se muito menos desenvolvida face à dos

antibióticos antibacterianos. As micoses profundas mais relevantes na Europa são a

aspergilose, produzida geralmente pelo Aspergillus fumigatus (e com menor frequência,

por outras espécies de Aspergillus spp.), as candidíases sistémicas, provocadas na sua

maioria por Candida albicans (ou por outras espécies de Candida spp., como sejam C.

glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. krusei), e a criptococose induzida por

Cryptococcus neoformans (Lass-Florl, 2009).

Face ao exposto, a Organização Mundial da Saúde considera que num futuro

próximo poderemos ter um quadro extremamente complicado de infeções por

microrganismos patogénicos se não forem tomadas algumas medidas. Uma dessas

medidas inclui a descoberta de novos antibióticos e antifúngicos com mecanismos de

acção distintos dos disponíveis no mercado. A implementação desta medida foi

reforçada pela Sociedade Americana de Doenças Infeciosas ao solicitar a descoberta de

10 novas classes de antibióticos até 2020 (Wright, 2012). O mesmo autor considera que

a bioprospeção de metabolitos bioativos de origem natural (microrganismos, plantas e

animais) apresenta um enorme potencial para a obtenção de novos antibióticos e

antifúngicos. A descoberta de novos metabolitos produzidos por fungos endofíticos

poderá assim constituir uma importante medida a implementar neste âmbito.

Page 31: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

17

A bioprospeção de metabolitos fúngicos envolve, geralmente, quatro etapas:

isolamento e identificação do fungo endofitico, cultura do fungo e otimização da

produção de metabolitos, elucidação da natureza química do metabolito e avaliação das

suas propriedades biológicas. Cada uma destas etapas é em seguida descriminada.

1.5. Isolamento e identificação do fungo

Os fungos endofíticos são normalmente isolados a partir de pequenos fragmentos

de material vegetal de diferentes órgãos da planta (folha, caule, raiz, etc.) previamente

esterilizados (Hallmann et al., 2006). Neste processo de esterilização é utilizado

geralmente etanol a 70% e hipoclorito de sódio (1 a 3% cloro ativo) (Qadri et al., 2013)

ou cloreto de mercúrio (0,1%) (Ding et al., 2013), cujas concentrações e tempo de

exposição são variáveis de acordo com o material vegetal, seguida de lavagem em água

destilada estéril. Os fragmentos de tecido vegetal superficialmente esterilizados são

depositados em caixas de Petri, contendo meio selectivo para o isolamento de fungos

(habitualmente Batata Dextrose Agar – BDA, entre outros) e suplementado com um

antibiótico (Hallmann et al., 2006). Por vezes, é adicionado ao meio de cultura, tecidos

ou extractos vegetais da planta hospedeira de forma a promover o crescimento de

espécies fúngicas especificas desta planta (Arnold et al., 2003). A eficácia do processo

de esterilização terá de ser sempre confirmada. Para tal poder-se-á, por exemplo,

inocular caixas de Petri, contendo BDA com um volume apropriado de água destilada

utilizada na última lavagem. As caixas de Petri são postas a incubar no escuro numa

estufa a 25ºC e diariamente são inspecionadas para avaliação de crescimento fúngico.

Quando as colónias se desenvolvem estas são repicadas para meio BDA até obtenção de

culturas puras (Hallmann et al., 2006).

A identificação de fungos endofíticos é realizada através da avaliação das

características morfológicas das colónias fúngicas, micélio e estruturas reprodutivas

(Devi e Prabakaran, 2014). Este processo é quase sempre complementado com a

identificação molecular (Huang et al., 2009; Lu et al., 2012). O método molecular mais

utilizado baseia-se na amplificação da região ITS (Internal transcribed spacer) do DNA

que contém o conjunto de genes que codificam o RNA ribossómico (rRNA), seguida da

sua sequenciação (Huang et al., 2009; Lu et al., 2012). A região ITS amplificada,

recorrendo à reação da polimerase em cadeia (PCR), corresponde a um fragmento do

Page 32: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

18

rDNA que inclui o gene 5,8S e as regiões ITS1 e ITS2 (Huang et al., 2009; Lu et al.,

2012). Esta região, por permitir uma maior variabilidade entre espécies, foi

recentemente aceite como a região “barcoding” (código de barras do DNA) de fungos

(Schoch et al., 2012).

1.6. Cultura do fungo e optimização da produção de metabolitos

A cultura de fungos endofíticos tem como principal objetivo aumentar a biomassa

dos isolados obtidos, de forma a conseguir um maior rendimento de extractos fúngicos.

Geralmente, a cultura é feita em meio liquido (Extrato de Malte, Czapek, Sabouraud’s,

Batata-dextrose, Wickerham, entre outros) previamente inoculado com discos de

micélio fúngico crescido em agar (Lu et al., 2012; Qadri et al., 2013; Devi e Prabakaran,

2014). Em geral, os metabolitos bioativos encontram-se em baixíssimas concentrações

nos fungos endofíticos sendo, por conseguinte, necessário otimizar o processo

fermentativo de forma a incrementar a sua produção. Para tal, fazem-se normalmente

pequenas alterações na composição química e valor de pH do meio de cultura,

temperatura, agitação, tempo de incubação, entre outros (Scherlach e Hertweck, 2009;

Tayung et al., 2011; VanderMolen et al., 2013). Por vezes é ainda acrescentado ao meio

de cultura extratos da planta hospedeira com o intuito de incrementar a produção de

metabolitos bioativos pelo fungo endofítico (Yenn et al., 2012).

1.7. Elucidação da natureza química do metabolito

A elucidação da natureza química dos metabolitos produzidos pelo fungo

endofítico é avaliada ao fim de um determinado tempo de incubação em meio de cultura

liquido, e envolve a extração, separação e a identificação dos metabolitos. Devido ao

desconhecimento da natureza química dos metabolitos bioativos produzidos pelo fungo

endofitico, não é possível estabelecer-se uma técnica especifica que garanta a extração

de todos os constituintes da mistura. Desta forma, a melhor abordagem consiste na

extração destes compostos do meio de cultura liquido (metabolitos extracelulares) e/ou

do micélio fúngico (metabolitos intracelulares) através do uso de água e solventes

orgânicos com diferentes polaridades, como por exemplo o acetato de etilo (Tayung et

al., 2011), metanol (V. Rukachaisirkul et al., 2008), o n-hexano (Gao et al 2010), entre

Page 33: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

19

outros. Os metabolitos contidos no extrato obtido são posteriormente separados por

técnicas cromatográficas convencionais (e.g. Sephadex, gel de sílica) (Y.Jiao et al.,

2013) ou mais frequentemente por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC)

(Sileshig et al.,2013) ou mesmo cromatografia gasosa (GC) (Tayung et al., 2011). Após

separação, os metabolitos são identificados, recorrendo para tal a diversas técnicas,

sendo as mais comuns a espectroscopia de infravermelho, ressonância magnética

nuclear (Y.Wang et al., 2012) e espectrometria de massa (MS) (Tayung et al., 2011).

1.8. Avaliação das propriedades biológicas dos metabolitos fúngicos

Os extratos fúngicos obtidos são submetidos a diferentes testes biológicos in vitro

ou in vivo, dependendo da fase da pesquisa, para avaliação das propriedades biológicas

dos metabolitos fúngicos. Dada a grande diversidade das propriedades biológicas que

podem ser avaliadas, dar-se-á especial relevância às propriedades antimicrobianas. Os

métodos mais utilizados na avaliação da actividade antimicrobiana de fungos

endofíticos incluem o método de difusão em agar e o método da microdiluição.

No primeiro método, o microrganismo é posto a crescer na presença de extractos

do fungo endofítico, preparado a partir do meio de cultura ou do micélio, em meio de

cultura sólido. A aplicação do extracto pode ser feita pela impregnação de discos (Lu et

al., 2000; Hoffman et al., 2008) ou em poços efectuados no meio de cultura sólido

(Krohn et al., 2009), realizados com auxílio de cilindros de 6-8 mm de diâmetro. A

colocação dos discos impregnados ou a perfuração dos poços nos quais são aplicados os

extractos a analisar, é efectuada em placas de Petri previamente inoculadas com

microrganismos, normalmente à concentração de 108 UFC (Unidade Formadora de

colónia)/mL para bactérias ou 106 UFC/mL para leveduras. A actividade antimicrobiana

dos extractos é estimada pelo tamanho do halo de inibição que se forma desde a

margem do disco ou poço até a margem onde há crescimento microbiano. O valor de

halo estimado é sempre comparado com um controlo positivo, onde se utiliza

antibióticos ou antifúngicos, de acordo com o microrganismo testado (bactéria ou

fungo/levedura, respectivamente). Como controle negativo utiliza-se o solvente

utilizado para a dissolução dos extratos, normalmente dimetilsulfóxido (DMSO).

Page 34: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

20

Na microdiluição utilizam-se microplacas com 96 poços, com o fundo em formato

de “U”. Em cada poço é colocado um volume de meio de cultura (entre 0,1 e 0,2 mL), e

um volume do extrato a analisar de forma a obter um gradiente crescente de

concentrações de extrato (Hu et al., 2010; Qadri et al., 2013). De seguida, cada poço é

inoculado com o microrganismo (normalmente à concentração de 104 UFC/poço). São

ainda reservados alguns poços da placa para efectuar o controlo positivo e negativo. As

placas são postas a incubar a uma temperatura controlada, normalmente a 37ºC para

bactérias e 27ºC para leveduras/fungos, durante 24 a 48h. Findo este tempo procede-se à

avaliação do crescimento microbiano num leitor de microplacas a um determinado

comprimento de onda ou pela adição de resazurina.

De acordo com os resultados do crescimento microbiano obtido nos dois métodos

(método de difusão em agar e o método da microdiluição) procede-se ao cálculo da

concentração mínima inibitória (MIC).

1.9. Importância do estudo dos fungos endofiticos da oliveira

Com base nestes resultados, os autores sugerem que a planta hospedeira, e

consequentemente o seu metabolismo, poderá ter uma grande influência na capacidade

sintetizadora do fungo endofítico. Desta forma é aconselhável que a bioprospeção de

compostos bioativos naturais em fungos endofíticos deva ser baseada na seleção da

espécie de planta hospedeira em detrimento da espécie fúngica (Suryanarayanan et al.,

2009).

Desde sempre, que a oliveira tem estado associada a usos medicinais e

gastronómicos. No que concerne à sua importância medicinal, destacam-se as

propriedades farmacológicas das folhas, descritas como anti-arritmicas, espasmoliticas,

imuno-estimulantes, cardioprotetor, hipotensor, antihiperglicémico, antimicrobiano e

anti-inflamatorio (Mahjoub et al., 2011). O seu óleo essencial é usado no combate de

inumeras doenças.Tanto quanto é do nosso conhecimento, a diversidade de fungos

endofiticos associados à oliveira bem como as suas propriedades bioativas nunca foram

estudadas. Este aspecto é extremamente importante na área farmacêutica uma vez que

acredita-se que algumas propriedades terapeuticas atribuidas às plantas também possam

Page 35: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

21

estar relacionadas com a produção de metabolitos secundários pelos fungos endofiticos

colonizadores dos tecidos vegetais. Desta forma, o estudo de propriedades bioativas de

fungos endofiticos associados às folhas da oliveira poderá contribuir para o

conhecimento do seu potencial farmacêutico e para a descoberta de novos metabolitos

com interesse biotecnológico/farmacêutico.

1.10. Objetivos

Os fungos endofiticos têm mostrado um grande potencial na produção de

metabolitos bioativos. Nos últimos 2 anos, mais de 250 novos metabolitos produzidos

por fungos endofiticos foram identificado. A presente proposta de trabalho tem como

objetivo geral avaliar o potencial antimicrobiano de fungos endofiticos isolados de

folhas de oliveira, bem como identificar o efeito da planta hospedeira nesta propriedade.

O perfil volátil das espécies fungicas será ainda avaliado com o intuito de correlacionar

os compostos identificados com atividade antimicrobiana exibida pelos endófitos. As

espécies fúngicas a estudar serão: Penicillium commune, Penicillium canescens,

Alternaria alternata.

Objetivos especificos:

1- Avaliar a atividade antimicrobiana dos fungos endofíticos com crescimento em meio

de cultura com e sem extratos aquoso de folhas de oliveira.

2- Avaliar, nas espécies fúngicas que mostraram maior atividade antimicrobiana, a

Concentração Mínima Inibitória (CMI) de extratos fúngicos e de meio de cultura

obtidos a partir de solventes orgânicos com diferentes polaridades. Nesta análise

pretende-se avaliar se a produção dos compostos antimicrobianos, se encontram

intercelularmente no micélio ou se são excretados para o meio de cultura.

3- Identificar, nas espécies fúngicas com menor CMI, os compostos volatéis

potencialmente responsáveis pela atividade antimicrobiana, recorrendo a análise

GC/MS.

Page 36: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 37: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

23

Bibliografia

Aly, A. H., Edrada-Ebel, R., Wray, V., Müller, W. E., Kozytska, S., Hentschel, U.,

Ebel, R. (2008). Bioactive metabolites from the endophytic fungus

Ampelomyces sp. isolated from the medicinal plant Urospermum picroides.

Phytochemistry, 69(8), 1716-1725.

Arnold, A. E., Mejía, L. C., Kyllo, D., Rojas, E. I., Maynard, Z., Robbins, N., Herre, E.

A. (2003). Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(26), 15649-15654.

Arnold, A. E. (2007). Understanding the diversity of foliar endophytic fungi: progress,

challenges, and frontiers. Fungal Biology Reviews, 21(2), 51-66.

Berdy, J. (2005). Bioactive microbial metabolites. The Journal of antibiotics, 58(1), 1-

26.

Carlet, J., Mainardi, J. L. (2012). Antibacterial agents: back to the future? Can we live

with only colistin, co‐trimoxazole and fosfomycin?. Clinical Microbiology and

Infection, 18(1), 1-3.

Carter, G. T. (2011). Natural products and Pharma 2011: Strategic changes spur new

opportunities. Natural product reports, 28(11), 1783-1789.

Chebbi Mahjoub, R., Khemiss, M., Dhidah, M., Dellaï, A., Bouraoui, A., & Khemiss,

F. (2011). Chloroformic and methanolic extracts of Olea europaea L. leaves

present anti-Inflammatory and analgesic activities. ISRN pharmacology, 2011.

Cowan, M. M. (1999). Plant products as antimicrobial agents. Clinical microbiology

reviews, 12(4), 564-582.

Cragg, G. M., Newman, D. J. (2005). Biodiversity: A continuing source of novel drug

leads. Pure and applied chemistry, 77(1), 7-24.

Devi, N. N., & Prabakaran, J. J. (2014). Bioactive metabolites from an endophytic

fungus Penicillium sp. isolated from Centella asiatica. Current Research in

Environmental & Applied Mycology, 4(1), 34-43.

Ding, X., Liu, K., Deng, B., Chen, W., Li, W., Liu, F. (2013). Isolation and

characterization of endophytic fungi from Camptotheca acuminata. World

Journal of Microbiology and Biotechnology, 29(10), 1831-1838.

Page 38: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

24

Donadio, S., Maffioli, S., Monciardini, P., Sosio, M., Jabes, D. (2010). Antibiotic

discovery in the twenty-first century: current trends and future perspectives. The

Journal of antibiotics, 63(8), 423-430.

ECDC - European Centre for Disease Prevention and Control (Antimicrobial resistance

surveillance in Europe 2011. Annual Report of the European Antimicrobial

Resistance Surveillance Network (EARS-Net), Stockholm: ECDC.2012.

Finlay, R.D. (2007). Fungal endophytes in forest, woody, plants and grass land

ecosystems: diversity, functional ecology, evolution. Fungal Biology Reviews,

(21):49-50.

Gamboa, M. A., Laureano, S., Bayman, P. (2003). Measuring diversity of endophytic

fungi in leaf fragments: Does size matter?. Mycopathologia, 156(1), 41-45.

Gao, S. S., Li, X. M., Du, F. Y., Li, C. S., Proksch, P., & Wang, B. G. (2010).

Secondary metabolites from a marine-derived endophytic fungus Penicillium

chrysogenum QEN-24S. Marine drugs, 9(1), 59-70.

Giauque, H., & Hawkes, C. V. (2013). Climate affects symbiotic fungal endophyte

diversity and performance. American journal of botany, 100(7), 1435-1444.

Greve, H., Mohamed, I. E., Pontius, A., Kehraus, S., Gross, H., König, G. M. (2010).

Fungal metabolites: structural diversity as incentive for anticancer drug

development. Phytochemistry Reviews, 9(4), 537-545.

Guo, B., Dai, J. R., Ng, S., Huang, Y., Leong, C., Ong, W., Carté, B. K. (2000).

Cytonic acids A and B: novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the

endophytic fungus Cytonaema species. Journal of natural products, 63(5), 602-

604.

Gupte, M., Kulkarni, P., Ganguli, B. (2002). Antifungal antibiotics. Applied

microbiology and biotechnology, 58(1), 46-57.

Hallmann, J., Berg, G., & Schulz, B. (2006). Isolation procedures for endophytic

microorganisms. In Microbial root endophytes (pp. 299-319). Springer Berlin

Heidelberg.

H.B. Cui, W.L. Mei,C.D. Miao, H.P. Lin, K. Hong, H.F. Dai. (2008). Antibacterial

constituents from the endophytic fungus Penicillium sp.0935030 of mangrove

plant Acrostichum aureurm. Chemical Journal of Chinese Universities, 33, 407-

410.

Higginbotham, S. J., Arnold, A. E., Ibañez, A., Spadafora, C., Coley, P. D., Kursar, T.

A. (2013). Bioactivity of fungal endophytes as a function of endophyte

Page 39: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

25

taxonomy and the taxonomy and distribution of their host plants. PloS one, 8(9),

e73192.

Higgins, K. L., Arnold, A. E., Coley, P. D., Kursar, T. A. (2014). Communities of

fungal endophytes in tropical forest grasses: highly diverse host-and habitat

generalists characterized by strong spatial structure. Fungal Ecology, 8, 1-11.

Hoffman, M. T., & Arnold, A. E. (2008). Geographic locality and host identity shape

fungal endophyte communities in cupressaceous trees. Mycological research,

112(3), 331-344.

Hussain, H., Krohn, K., Draeger, S., Meier, K., Schulz, B. (2009). Bioactive chemical

constituents of a sterile endophytic fungus from Meliotus dentatus. Records of

Natural Products, 3(2), 114-117.

Huang, W. Y., Cai, Y. Z., Surveswaran, S., Hyde, K. D., Corke, H., & Sun, M. (2009).

Molecular phylogenetic identification of endophytic fungi isolated from three

Artemisia species. Fungal Diversity, 36, 69.

Hyde, K. D., & Soytong, K. (2008). The fungal endophyte dilemma. Fungal Divers, 33,

163-173.

Jalgaonwala, R. E., Mohite, B. V., Mahajan, R. T. (2011). A review: Natural products

from plant associated endophytic fungi. J Microbiol Biotechnol Res, 1(2), 21-32.

Jiao, Y., Zhang, X., Wang, L., Li, G., Zhou, J. C., Lou, H. X. (2013). Metabolites from

Penicillium sp., an endophytic fungus from the liverwort Riccardia multifida (L.)

S. Gray. Phytochemistry Letters, 6(1), 14-17.

Kirk P, Cannon PF, Minter DW, Stalpers JA. (2008). Ainsworth & Bisby’s Dictionary

of the Fungi. 10th edn CAB International, Wallingford, UK.

Kogel, K. H., Franken, P., & Hückelhoven, R. (2006). Endophyte or parasite–what

decides?. Current opinion in plant biology, 9(4), 358-363.

Kumar, D. S. S., Hyde, K. D. (2004). Biodiversity and tissue-recurrence of endophytic

fungi in Tripterygium wilfordii. Fungal Divers, 17, 69-90.

Lass‐Flörl, C. (2009). The changing face of epidemiology of invasive fungal disease in

Europe. Mycoses, 52(3), 197-205.

Li, J. Y., Strobel, G., Sidhu, R., Hess, W. M., Ford, E. J. (1996). Endophytic taxol-

producing fungi from bald cypress, Taxodium distichum. Microbiology, 142(8),

2223-2226.

Page 40: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

26

Liang, H., Xing, Y., Chen, J., Zhang, D., Guo, S., Wang, C. (2012). Antimicrobial

activities of endophytic fungi isolated from Ophiopogon japonicus (Liliaceae).

BMC complementary and alternative medicine, 12(1), 238.

Lu, H., Zou, W. X., Meng, J. C., Hu, J., Tan, R. X. (2000). New bioactive metabolites

produced by Colletotrichum sp., an endophytic fungus in Artemisia annua. Plant

Science, 151(1), 67-73.

Lu, Y., Chen, C., Chen, H., Zhang, J., Chen, W. (2011). Isolation and Identification of

endophytic fungi from Actinidia macrosperma and investigation of their

bioactivities. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012.

Moricca, S., Ginetti, B., & Ragazzi, A. (2012). Species-and organ-specificity in

endophytes colonizing healthy and declining Mediterranean oaks.

Phytopathologia Mediterranea, 51(3), 587-598.

Ondeyka, JG., Helms, G.L, Hensens, O.D., Goetz, M.A., Zink, D.L., Tsipouras, A.

(1997). Nodulisporic acid A, a novel and potent insecticide from a

Nodulosporium sp. Isolation, structure determination, and chemical

transformation. Journal of the American Chemical Society, 119: 8809-8816.

Ownley, B. H., Gwinn, K. D., Vega, F. E. (2010). Endophytic fungal entomopathogens

with activity against plant pathogens: ecology and evolution. In The Ecology of

Fungal Entomopathogens (pp. 113-128). Springer Netherlands.

Pfaller, M. A., Diekema, D. J. (2007). Epidemiology of invasive candidiasis: a

persistent public health problem. Clinical microbiology reviews, 20(1), 133-163.

Porras-Alfaro, A., & Bayman, P. (2011). Hidden fungi, emergent properties: endophytes

and microbiomes. Phytopathology, 49(1), 291.

Qadri, M., Johri, S., Shah, B. A., Khajuria, A., Sidiq, T., Lattoo, S. K., Riyaz-Ul-

Hassan, S. (2013). Identification and bioactive potential of endophytic fungi

isolated from selected plants of the Western Himalayas. SpringerPlus, 2(1), 8.

Qin, J. C., Zhang, Y. M., Gao, J. M., Bai, M. S., Yang, S. X., Laatsch, H., & Zhang, A.

L. (2009). Bioactive metabolites produced by Chaetomium globosum, an

endophytic fungus isolated from Ginkgo biloba. Bioorganic & medicinal

chemistry letters, 19(6), 1572-1574.

Radić, N., & Štrukelj, B. (2012). Endophytic fungi—The treasure chest of antibacterial

substances. Phytomedicine, 19(14), 1270-1284.

Page 41: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

27

Robl, D., da Delabona, P., Mergel, C. M., Rojas, J. D., dos Costa, P., Pimentel, I. C., &

Padilla, G. (2013). The capability of endophytic fungi for production of

hemicellulases and related enzymes. BMC biotechnology, 13(1), 94.

Rodriguez, R. J., White Jr, J. F., Arnold, A. E., & Redman, R. S. (2009). Fungal

endophytes: diversity and functional roles. New Phytologist, 182(2), 314-330.

Rukachaisirikul, V., Sommart, U., Phongpaichit, S., Sakayaroj, J., & Kirtikara, K.

(2008). Metabolites from the endophytic fungus Phomopsis sp. PSU-D15.

Phytochemistry, 69(3), 783-787.

Saikkonen, K., Ion, D., & Gyllenberg, M. (2002). The persistence of vertically

transmitted fungi in grass metapopulations. Proceedings of the Royal Society of

London. Series B: Biological Sciences, 269(1498), 1397-1403.

Saikkonen, K., Wäli, P., Helander, M., & Faeth, S. H. (2004). Evolution of endophyte–

plant symbioses. Trends in plant science, 9(6), 275-280.

Scherlach, K., & Hertweck, C. (2009). Triggering cryptic natural product biosynthesis

in microorganisms. Org. Biomol. Chem., 7(9), 1753-1760.

Schoch, C. L., Seifert, K. A., Huhndorf, S., Robert, V., Spouge, J. L., Levesque, C. A.,

& Griffith, G. W. (2012). Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS)

region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the

National Academy of Sciences, 109(16), 6241-6246.

Schulz, B., & Boyle, C. (2005). The endophytic continuum. Mycological research,

109(6), 661-686.

Shweta, S., Zuehlke, S., Ramesha, B. T., Priti, V., Mohana Kumar, P., Ravikanth, G., &

Uma Shaanker, R. (2010). Endophytic fungal strains of Fusarium solani, from

Apodytes dimidiata E. Mey. ex Arn (Icacinaceae) produce camptothecin, 10-

hydroxycamptothecin and 9-methoxycamptothecin. Phytochemistry, 71(1), 117-

122.

Silva, G. H., Teles, H. L., Zanardi, L. M., Marx Young, M. C., Eberlin, M. N., Hadad,

R., & Araújo, Â. R. (2006). Cadinane sesquiterpenoids of Phomopsis cassiae, an

endophytic fungus associated with Cassia spectabilis (Leguminosae).

Phytochemistry, 67(17), 1964-1969.

Sileshi G. Wubsheta, Nils T. Nyberga, Mysore V. Tejesvib, Anna Maria

Pirttiläb,Marena Kajulac, Sampo Mattilac, Dan Staerka,. (2013). Targeting high

performance liquid chromatography high resolution mass spectrometry solid-

phase extraction nuclear magnetic resonance analysis with high-resolution

Page 42: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

28

radical scavenging profiles. Bioactive secondary metabolites from the

endophytic fungus Penicillium namyslowskii-journal of Chromatography A,

(1302), 34-39.

Smith, S. A., Tank, D. C., Boulanger, L. A., Bascom-Slack, C. A., Eisenman, K.,

Kingery, D., & Strobel, S. A. (2008). Bioactive endophytes warrant intensified

exploration and conservation. PLoS One, 3(8), e3052.

Soliman, S. S., Trobacher, C. P., Tsao, R., Greenwood, J. S., & Raizada, M. N. (2013).

A fungal endophyte induces transcription of genes encoding a redundant

fungicide pathway in its host plant. BMC plant biology, 13(1), 93.

Strobel, G., & Daisy, B. (2003). Bioprospecting for microbial endophytes and their

natural products. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67(4), 491-502.

Suryanarayanan, T. S., Thirunavukkarasu, N., Govindarajulu, M. B., Sasse, F., Jansen,

R., & Murali, T. S. (2009). Fungal endophytes and bioprospecting. Fungal

Biology Reviews, 23(1), 9-19.

Tayung, K., Barik, B. P., Jha, D. K., & Deka, D. C. (2011). Identification and

characterization of antimicrobial metabolite from an endophytic fungus,

Fusarium solani isolated from bark of Himalayan yew. Mycosphere, 2(3), 203-

213.

Torres, M. S., White Jr, J. F., Zhang, X., Hinton, D. M., & Bacon, C. W. (2012).

Endophyte-mediated adjustments in host morphology and physiology and effects

on host fitness traits in grasses. Fungal Ecology, 5(3), 322-330.

VanderMolen, K. M., Raja, H. A., El-Elimat, T., & Oberlies, N. H. (2013). Evaluation

of culture media for the production of secondary metabolites in a natural

products screening program. AMB Express, 3(1), 71.

Wang, Y., Xu, L., Ren, W., Zhao, D., Zhu, Y., & Wu, X. (2012). Bioactive metabolites

from Chaetomium globosum L18, an endophytic fungus in the medicinal plant

Curcuma wenyujin. Phytomedicine, 19(3), 364-368.

Waqas, M., Khan, A. L., Kamran, M., Hamayun, M., Kang, S. M., Kim, Y. H., & Lee,

I. J. (2012). Endophytic fungi produce gibberellins and indoleacetic acid and

promotes host-plant growth during stress. Molecules, 17(9), 10754-10773.

Wicklow, D. T., Roth, S., Deyrup, S. T., & Gloer, J. B. (2005). A protective endophyte

of maize: Acremonium zeae antibiotics inhibitory to Aspergillus flavus and

Fusarium verticillioides. Mycological Research, 109(05), 610-618.

Wright, G. D. (2012). Antibiotics: a new hope. Chemistry & biology, 19(1), 3-10.

Page 43: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

29

Yenn, T. W., Lee, C. C., Ibrahim, D., Zakaria, L. (2012). Enhancement of anti-candidal

activity of endophytic fungus Phomopsis sp. ED2, isolated from Orthosiphon

stamineus Benth, by incorporation of host plant extract in culture medium.

Journal of Microbiology, 50(4), 581-585.

Yu, H., Zhang, L., Li, L., Zheng, C., Guo, L., Li, W., .& Qin, L. (2010). Recent

developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by

endophytes. Microbiological research, 165(6), 437-449.

Zhang, B., Salituro, G., Szalkowski, D., Li, Z., Zhang, Y., Royo, I., & Moller, D. E.

(1999). Discovery of a small molecule insulin mimetic with antidiabetic activity

in mice. Science, 284(5416), 974-977.

Zhang, H. W., Song, Y. C., & Tan, R. X. (2006). Biology and chemistry of endophytes.

Natural product reports, 23(5), 753-771.

Page 44: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 45: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

Capítulo 2 Volatile composition and antimicrobial

activity of endophytic fungi from olive tree

Page 46: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 47: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

33

Cynthia Malhadas1, Ricardo Malheiro1, José Alberto Pereira1, Paula Guedes de Pinho2,

Paula Baptista1*

Manuscript in preparation 1CIMO/School of Agriculture, Polytechnic Institute of Bragança, Campus de Santa

Apolónia, Apartado 1172, 5301-854 Bragança, Portugal. 2REQUIMTE/Laboratory of Toxicology, Faculty of Pharmacy, Porto University, Rua

Jorge Viterbo Ferreira 228, 4050-313 Porto, Portugal.

Page 48: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 49: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

35

Volatile composition and antimicrobial activity of endophytic fungi from olive

tree: effect of host plant

Abstract

In recent years, fungal endophytes from diverse host plant species have been examined

as potential producers of novel antimicrobials to overcome the growing problems of

drug resistance in microorganisms. However no studies on fungal endophytes from

Olea europaea L. have been found in literature. In this study, the antimicrobial potential

of three fungal endophytes from O. europaea was studied and the host plant effect in

the antimicrobial activity was examined. The volatile compounds produced by

endophytes were identified by gas chromatography/mass spectrometry and further

correlated with the antimicrobial activity. Penicillium commune and Penicillium

canescens were the most effective inhibiting bacteria [in average up to 2.7-fold

compared to chloramphenicol (30 µg/mL)] whereas Alternaria alternata was most

effective inhibiting yeasts [in average up to 8.0-fold compared to fluconazole (25

μg/mL)]. This last species also displayed the widest spectrum of anti-microorganisms at

MIC ≤ 0.095 mg/mL. Host plant showed to play an important role in the antimicrobial

activity of the endophytes, depending on the species. From the volatile composition of

A. alternata and P. canescens, six volatiles were identified, being 3-methyl-1-butanol

and phenylethyl alcohols the most abundant. Others volatiles like 3-methyl-1-butanol

acetate, 1-octen-3-ol, β-cedrene and thujopsene were tentatively identified. By a

principal component analysis it was possible to verify that the antimicrobial activity

displayed by A. alternata may be related to its volatile composition, mainly due to the

high content in the antimicrobial volatiles 3-methyl-1-butanol and phenylethyl alcohol.

Overall the obtained results highlighted the antimicrobial potential of endophytic fungi

from O. europaea and their possibility to be exploited for their antimicrobial agents.

Keywords: Olea europaea; Alternaria alternata; minimum inhibitory concentration;

HS-SPME/GC/MS

Page 50: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 51: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

37

Introduction

The search for natural bioactive compounds with application in the treatment

and/or prevention of human diseases (Donaldo et al., 2010) as well as in the design of

nutraceuticals and functional food products (Gil-Chávez et al., 2013) has increased

markedly over the last few years. Endophytic fungi are one of the most prominent

producers of novel natural products (Selim et al., 2012). These fungi are characterized

to colonize the living internal tissues of all higher plants without causing any damage to

the host (Soytong and Hyde, 2008). In this relationship endophytes produce a broad

variety of bioactive secondary metabolites that can affect host plant physiology, defence

and tolerance against biotic and abiotic stresses (Carter, 2011; Rodriguez et al., 2012).

Some of these secondary endophytic metabolites with antimicrobial, antiparasitic,

cytotoxic, anti-inflammatory, antitumor, antioxidant, and neuroprotective activities are

compounds possessing unique chemical structures and they have been studied for novel

drug discovery (Selim et al., 2012; Gutierrez et al. 2012) .

The resistance of bacteria to antibiotics has become a global concern and the

search for new antibacterial agents is urgent and ongoing. The Infectious Diseases

Society of America (IDSA) launched an initiative that supports the development of 10

new classes of antibiotics by the year 2020 (Wright, 2012). Endophytic fungi are one of

the potential sources of novel antimicrobial compounds, due to chemical diversity of

their secondary metabolites (Yu et al., 2010). So far, studies reported a wide range of

novel antimicrobial compounds produce by endophytic fungi belonging to diverse

structural classes, including alkaloids, peptides, steroids, terpenoids, phenols,

phenylpropanoids, aliphatic compounds, polyketides, quinones and flavonoids (Yu et

al., 2010; Mousa and Raizada, 2013), as well as volatile organic compounds (VOCs)

such as esters, lipids, alcohols, acids, ketones, among others (Banerjee et al., 2010;

Kudalkar et al., 2012). However, several studies have shown that the plant host, and

ultimately its metabolism, influences the synthetic ability of endophytes (Strobel 2006;

Li et al., 2009; Riyaz-Ul-Hassan et al., 2012), which could prevent these

microorganisms from being used in a commercial production of antimicrobial

compounds (Kusari et al., 2014). Nevertheless, there still remain substantial questions

about this issue. For instances, the genome sequencing and analysis of one paclitaxel-

Page 52: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

38

producing endophyte fungus revealed its ability to synthesize paclitaxel (Taxol™), an

important anticancer drug, independently of the plant host (Yang et al., 2014).

Similarly, several studies have shown that fungal Taxol is produced independently of

the plant following several rounds of in vitro culturing (Guo et al., 2006; Soliman et al.,

2011). The extent to which fungal endophytes produce natural products independently

of their host plant is not precisely known; and their elucidation is one of the key

challenges to achieve the industrial production of desired bioactive metabolites from

endophytes (Kusari et al., 2014).

Although a considerable body of research has investigated the antimicrobial

metabolites synthesized by fungal endophytic isolated from various plants (Yu et al.,

2010), screening of endophytic fungi from olive tree (Olea europaea L.) for

antimicrobial activities has never been made. It has been estimated that only 5% of the

world's fungi have so far been described (Hawksworth, 2004), which suggested that a

large number of new bioactive natural products from endophytic fungi still remains to

discover, in especially VOCs (Morath et al., 2012). Therefore, the current study was

undertaken to screen the antimicrobial activity of three fungal endophytes isolated from

olive tree leaves and evaluate the effect of host plant on such activity. Also, the VOCs

produced by the tested fungi were identified by gas chromatography/mass spectrometry

(GC/MS) and further correlated with the antimicrobial activity with an attempted to

identify potential components responsible for the obtained antimicrobial activity. It is

expected that the results obtained may contribute to the knowledge of new antimicrobial

compounds produced by endophytic fungi and to the effect of host plant on its

production.

Materials and Methods

Microorganisms and culture conditions

The endophytic fungi tested, Penicillium commune Thom (PAL321FA),

Penicillium canescens Sopp (CA221FA) and Alternaria alternata (Fr.) Keissl.

(SE251FA), were obtained from the fungal culture collection of the School of

Agriculture, Polytechnic Institute of Bragança, Portugal. These isolates were originally

obtained from leaves of Olea europaea cv. Cobrançosa collected in the Trás-os-Montes

Page 53: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

39

region (northeast of Portugal) and were identified molecularly by sequencing the

internal transcribed spacer (ITS) region of the nuclear ribosomal DNA (rDNA). Spores

of these strains were stored in an aqueous glycerol solution (30%, v/v) at -80 ºC. The

fungal inoculum used in the assays was prepared from these frozen stocks by

transferring spores onto Potato Dextrose Agar (PDA) media. The fungus was grown in

the dark at 25±1ºC, for three to eight days, and conidial produced were used for the

subsequent studies.

The antimicrobial activities of endophytes were evaluated against three gram-

positive bacteria (Bacillus cereus ATCC 7064, Bacillus subtilis 48886 and

Staphyloccocus aureus ATCC 6538), two gram-negative bacteria (Escherichia coli

CECT 423 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145) and three yeasts (Candida

albicans IGC 3436T, Candida glabrata IGC 2418T and Candida parapsilosis 28B). All

the microorganisms were obtained from the Biology Department - University of Minho

(Braga, Portugal). Yeast strains were maintained at 4 ºC in YEPDA medium [1% (w/v)

yeast extract, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) glucose and 2% (w/v) agar], and sub-cultured

periodically. Growth was promoted aerobically at 28 ºC. Bacterial stocks cultures were

maintained at 4 ºC on LB agar [tryptone 1% (w/v), yeast extract 0.5% (w/v), NaCl 1%

(w/v) and agar 2% (w/v)], being sub-cultured periodically at 37 ºC.

Screening of fungal endophytes for antimicrobial activity

The screening of fungal endophytes for antimicrobial activity was performed in

two steps. In the first step, endophytic fungi were screen for their antimicrobial activity

on PDA medium with or without aqueous extract of olive tree leaves, to evaluate the

effect of host plant. In this primary screen was used the bioassay method developed by

Pereira et al. (2013). This method has the advantage of being less time consuming and

allows the direct detection of antimicrobial activity of growing fungi against single cell

microorganisms without the prior isolation of the active substance(s) (Pereira et al.,

2013). Also, this method allows to study the dynamics of antimicrobial compounds

production by filamentous fungi. In the second step, was calculated the minimum

inhibitory concentration (MIC) of the most active species found in the first screen. This

secondary screen was done by the micro-dilution method (Rios et al., 1988) with several

solvents extracts of the cultured broth and mycelium of the fungus, to determine if the

Page 54: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

40

antimicrobial compound were in the liquid culture secreted from the mycelium or inside

the mycelium.

Bioassay method

The antimicrobial activity assay was performed in Petri dishes (9 cm diameter)

containing PDA medium prepared with distilled water or prepared with aqueous extract

of host plant leaves (2%, w/v). The plant extract was prepared with fresh leaves

collected from healthy olive tree cv. Cobrançosa, located in Mirandela (northeast of

Portugal). The collected leaves were transported to the laboratory in an icebox, and

immediately upon arrival, they were rinsed in distilled water, ground to a fine powder in

liquid nitrogen and stored at −80°C. The plant extract was prepared by stirring 2 g of

fresh ground leaves in 100 mL distilled, at 150 rpm and 25 ºC, for 30 min. After

filtration through a Whatman filter paper No.4, the plant extract was used to prepare

PDA medium.

Both culture media (PDA with and without host plant extract) were inoculated

by transferring 10 µL of a spore suspension (1×106 spore/mL) of each P. canescens, P.

commune and A. alternata fungus to the centre of a Petri dish (9 cm diameter). Spore

suspensions were obtained by flooding fungal cultures growing on PDA medium with 2

mL of sterile aqueous solution of 0.02% (v/v) Tween 80. The spore concentration was

adjusted to 1×106 spore/mL with a Neübauer haemacytometer, under light microscope

(Leica, CTR 5000). After incubation at 25 ºC±1 ºC, in the dark, for 3 (P. commune), 6

(A. alternata) and 8 days (P. canescens), the inoculated plates were overlaid with the

sensitive indicator strain. To prepare the sensitive microbial suspension, yeast and

bacteria biomass were scraped from a 24 h YPDA or LB culture plate, respectively, and

suspended in 1 mL of NaCl 0.85% (w/v). Suspensions of the microorganisms were

prepared and mixed with melted-agar 0.8% (w/v) in order to obtain 106 CFU (colony

forming units)/mL. A volume of 5 mL of the mixture was then seeded as a lawn onto

the surface of the plates previously inoculated with endophytic fungi. The plates were

incubated at 25 ºC/48 h and 32 ºC/24 h for yeasts and bacteria, respectively. Standard

discs of chloramphenicol (30 μg/mL) and fluconazole (25 μg/mL) were obtained from

Oxoid Ltd. and served as positive controls for antibacterial and antifungal activity,

respectively. Antimicrobial activity was observed when the fungal inoculum was

surrounded by a clear zone of growth inhibition and evaluated by determining both the

Page 55: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

41

diameter of the fungal colony and the diameter of the inhibition halo. Values were used

to calculate the areas occupied by the fungus and by the inhibition halo formed by its

antimicrobial activity, which were further subtracted to obtain the inhibition halo area.

Data are presented as the mean of 3 independent experiments, with 3 replicas each. The

corresponding standard error values are displayed.

Micro-dilution method

MIC determination was only assayed with the endophytic fungus specie that

showed the highest antimicrobial activity, especially towards yeasts, in the first screen

(i.e. A. alternata, please see results and discussion section). This strain was cultured in

potato dextrose broth (PDB) liquid medium, and MIC values were determined for ethyl

acetate, methanol and methanol:water (1:1, v/v) extracts of both mycelium and cultured

broth. PDB medium was also included in this study as negative control. Submerged

cultures were grown in twelve 250 mL Erlenmeyer flasks with 150 mL of PDB each, at

25 ºC for 10 days, in the dark and without agitation. Several excised discs (5 mm

diameter) of the fungus grown on PDA, for 6 days at 25 ºC, were used as inoculum.

After incubation, the culture broth and fungal biomass were separated by filtration

through two layers of Miracloth (Calbiochem) and were further freeze-dried. The

freeze-dried mycelium/culture broth (3 g) were extracted by stirring with 100 mL of

each solvent [ethyl acetate, methanol and methanol:water (1:1, v/v)], at room

temperature, at 150 rpm for 1 hour, and filtered through Whatman nº 4 paper. Extraction

was additionally repeated two times, and the filtrates obtained for each solvent were

combined. The solvent was removed by evaporation under vacuum on reduced pressure

at 40–45 ºC using a rotary evaporator. After evaporation, the remaining water was

removed by lyophilisation. The extracts obtained were weighed and dissolved in 10%

(v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) at concentrations ranging from 25 to 350 mg/mL,

depending on the extraction yield, and further used to determine MIC values.

MIC values of the several extracts were determined by a broth micro-dilution

assay in PDB medium at 25 ºC, conducted in a sterile, 96-wells, U-shaped, microtiter

plate. A two-fold dilution of the extract was prepared with sterile medium and 100 μL

of the extract was dispensed into each well on the microtiter plate. The range of extract

concentration used to determine MIC values are indicated in Table S1 (Supporting

Page 56: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

42

information). Each well was further inoculated with 100 μL of yeast or bacteria

inoculum at 107 CFU/mL, for a final volume of 200 μL. Chloramphenicol (30 μg/mL)

and fluconazole (25 μg/mL) were used as positive controls for antibacterial and

antifungal activity, respectively; and a control with 10% (v/v) DMSO and yeast/bacteria

inoculum was also included. All experiments were performed in triplicate and repeated

twice. After a 24 h of incubation at 25 ºC, 10 μL of 0.15 mg/mL resazurin (Sigma)

dissolved in sterile distilled water was added to each well as a growth indicator. After a

second incubation of 2 h at 25 ºC, wells were assessed visually for color change. The

microtiter wells with a color change from purple to pink or colorless are indicative of

positive bacterial/yeast growth while wells remaining purple represent no microbial

growth. The MIC was recorded as the lowest concentration of extract that inhibited the

growth of bacteria/yeast. The results were expressed in milligrams per milliliter and

presented as the mean of three independent experiments.

Analysis of volatile compounds

Secondary metabolites present in the volatile fraction of the endophytic fungus

specie that showed the highest antimicrobial activity in the first screen (i.e. A. alternata,

please see results and discussion section) were studied, as an attempt to identify

compounds responsible for such activity. This study was performed in the fungus

growing in PDA medium (in vitro assay), in order to get a more realistic picture of the

microbial volatile organic compounds released from the endophyte. In this assay the

fungus specie that showed the lowest antimicrobial activity was used, as negative

control (i.e. P. canescens, please see results and discussion section) in the first screen.

The comparison of the volatile profile of the two fungal species (A,alternata and

P.canescens) will allow a more accurate identification of volatile antimicrobial

compounds.

In vitro fungal cultures

The fungi were grown in 50 mL flasks (Duran Gaines Synth, Bioblock),

containing 10 mL of PDA medium, sealed with a polypropylene cap with PTFE/silicon

septum (Duran) (Fig. S1, Supporting information). The inoculation of culture medium

Page 57: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

43

was done by transferring 10 µL of a spore suspension (1x106 spore/mL) of each P.

canescens and A. alternata fungus. Four replicates per fungal species were performed;

and flasks containing exclusively PDA medium were also included as control. The

cultures were incubated at 25 ºC in the dark, for 6 (A. alternata) and 8 days (P.

canescens), and further used to analyse the volatile compounds.

Extraction of volatile compounds by headspace solid-phase microextraction

The extraction of volatile compounds from in vitro cultures of P. canescens and

A. alternata was performed by headspace solid-phase microextraction (HS-SPME),

according with a previously describe method (with some adaptations). The volatile

compounds were extracted from the HS of the 50 mL vials containing the fungus in the

medium with an SPME fiber coated with divinylbenzene/ carbonex/

polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS 50/30 µM) (Supelco, Bellefonte, USA).

The entire procedure was done in a horizontal position in a gas emission system

(isolation) at 40 ºC. The vials with the respective fungus were placed 10 minutes in an

oven at 40 ºC for an incisive release of the volatile compounds. After this period, the

SPME fiber was exposed during 60 minutes for the compounds adsorption in the

headspace. The fiber was collected and inserted into the injection port of the

chromatography system.

The HS-SPME procedure was made in quadruplicate. The same procedure was

performed with a control sample containing only PDA medium.

Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC/MS) analysis

The retained compounds were eluted from the fiber by thermal adsorption for 1

minute. For cleaning and conditioning of further analyzes the fiber was maintained

during 10 minutes at 220 ºC in the injector port of the chromatography system. The

volatile compounds detection and quantification were performed in a gas

chromatographer Shimadzu GC-2010 Plus equipped with a mass spectrometer

Shimadzu GC/MS-QP2010 SE detector. A TRB-5MS (30 m × 0.25mm × 0.25μm)

column (Teknokroma, Spain) was used. The injector was set at 220 °C and the manual

injections were made in splitless mode. The mobile phase consisted in helium (Praxair,

Page 58: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

44

Portugal) at a linear velocity of 30 cm/s and a total flow of 24.4 mL/min. The oven

temperature was fixed at 40 °C during 1 minute and then raised 2 °C per minute to 220

°C, and held at this temperature during 30 minutes. The ionization source was

maintained at 250 °C with an ionization energy of 70 eV, and with a ionization current

of 0.1 kV. All mass spectra were acquired by electron ionization. The ionization was left

off during the first 3 minutes. The MS spectra fragments were compared with those

obtained from a database (NIST 11).

For quantification purposes, each sample was injected in quadruplicate, and the areas of

the chromatographic peaks were determined integrating the re-constructed

chromatogram from the full scan chromatogram using for each compound the ion base

(m/z intensity 100%).

Data analysis

Principal component analysis (PCA)

Principal components analysis (PCA) was applied for reducing the number of

variables regarding the volatile composition of P. canescens and A. alternata growing

under in vitro as well as their antimicrobial activity (diameter of the inhibition halo)

against several microorganisms (6 variables corresponding to volatile components, and

8 variables corresponding to inhibition halo values; with a total of 14 variables) to a

smaller number of new derived variables (principal component or factors) that

adequately summarize the original information, i.e., the in vitro volatile composition of

both fungi in study and their capability to inhibit microbial growth. Moreover, it

allowed recognizing patterns in the data by plotting them in a multidimensional space,

using the new derived variables as dimensions (factor scores). PCA was performed by

using SPSS software, version 21.0 (IBM Corporation, New York, U.S.A.).

Other statistical analysis

Significant differences among samples were estimated using one-way ANOVA

with a Tukey post-hoc test at p-value <0.05. Analyses were conducted with SPSS

software, version 21.0 (IBM Corporation, New York, U.S.A.).

Page 59: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

45

Results and discussion

Microbial natural products represent a huge and largely untapped resource of unique

chemical structures. More than 23,000 natural bioactive secondary metabolites of

microbial origin have been described in literature (Olano et al., 2008) and most of these

compounds have been isolated from only very few groups of microorganisms. Among

microorganisms, fungal endophytes represent a potential source of novel bioactive

metabolites (Selim et al., 2012; Mousa and Raizada, 2013) for exploitation in several

areas such as in the development of new classes of antibiotics. In fact, antibiotic

resistance is well recognized as a major threat to human health, and the development of

new antimicrobial agents is pointed out as one of the effective solutions to address this

problem (Laxminarayan et al., 2013). However, the extent to which fungal endophytes

produce natural products outside the host is not precisely known, which could

jeopardize the industrial bioprocesses for commercial production of biopharmaceuticals

using fungal endophytes (Kusari et al., 2014). The main objective of this study was to

explore the antimicrobial potential of three fungal endophytes isolated from olive leaves

and assess the effect of host plant on such potential. The composition of its volatile

organic compounds (VOCs) is also presented aiming to relate with their antimicrobial

activities. It is expected that the screening of endophytic fungi for antimicrobial

activities will serve as a good basis for discovering new antibiotic agents.

Antimicrobial activity of endophytes and effect of host plant extract

Three fungal endophytes, P. commune, A. alternata and P. canescens, were

initially screened for their inhibitory activity against gram-positive and gram-negative

bacteria and yeasts, by using the bioassay method developed by Pereira et al. (2013).

The bioassay was performed in culture medium with and without aqueous olive leaf

extract to assess the effect of host plant on the antimicrobial activity displayed by

endophytes. In medium without olive leaf extract, all bacteria under analysis, with

exception of E. coli, were significantly inhibited by the three endophytes when

compared with the control (Fig. 1B and C). Both P. commune and P. canescens were

Page 60: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

46

the most active against bacteria inhibiting up to 2.7-fold when compared to the control.

It is well known the capacity of this genus to produce a vast array of bioactive

secondary metabolites (Nicoletti et al., 2014), including antimicrobial compounds (Yu

et al., 2010). However, to our knowledge, the antimicrobial potential of the endophytes

P. commune (Moghaddam et al., 2013) and P. canescens (Nicoletti et al., 2007;

Bertinetti et al., 2009) was only explored against phytopathogenic fungi. Studies

focusing antimicrobial activity of P. commune against human pathogens are mainly

performed with marine sediment-derived strains (Gao et al., 2011). Thus, the present

study provides, for the first time, evidences of the antimicrobial potentialities of both

endophytes P. commune and P. canescens against human pathogens. The first specie

was the most effective in inhibiting B. cereus, P. aeruginosa and C. parapsilosis (up to

3.1-fold, 3.5-fold and 11.2-fold, respectively when compared to the control), whereas P.

canescens was found to be the most efficient in inhibiting E. coli, S. aureus and B.

subtilis (up to 2.5-fold, 2.7-fold and 2.9-fold, respectively when compared to the

control). These results suggested their potential use in the treatment of infections caused

by these microorganisms. This is of particular importance for E. coli and P. aeruginosa,

due to increased levels of resistance of these bacteria to multiple classes of antibiotics.

In fact, the multidrug resistance is an acute problem and treatment options are

particularly limited (Hogberg et al., 2010).

Although A. alternata inhibited significantly the bacteria to grow (B. cereus up

to 2.4-fold, B. subtilis up to 2.2-fold, S. aureus up to 2.4-fold and P. aeruginosa up to

3.0-fold, when compared to chloramphenicol), it showed higher activity against yeasts

(Fig. 1A). When compared with the control fluconazole, A. alternata reduced

significantly the growth of C. albicans (up to 8.2-fold), C. glabrata (up to 7.1-fold) and

C. parapsilosis (up to 9.0-fold). The endophyte A. alternata also displayed the widest

spectrum of anti-microorganisms (inhibited significantly 7 microorganisms among the 8

analyzed) and was the only one out of three endophytes with capacity to inhibit

significantly C. albicans more than the control. Extracts of A. alternata inhabiting

coffee plants (Reis et al., 2009), silver trumpet tree (Sadananda et al., 2011) and sweet

wormwood (Qadri et al., 2013) have been previously found to displayed antimicrobial

activity against an array of bacteria and yeasts, including C. albicans (Qadri et al.,

2013). Some antimicrobial compounds isolated from Alternaria sp. extracts, such as

altenusin, have showed to exhibit antimicrobial activity against several multidrug-

Page 61: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

47

resistant bacterial and fungal strains (Kjer et al., 2009). Similarly, altersetin isolated

from the culture broth of Alternaria sp. have showed potent activity against gram-

positive bacteria (Hellwig et al., 2002).

Figure 1 - Antimicrobial activity (halo of inhibition, in area) against yeasts (A), gram-

positive bacteria (B) and gram-negative bacteria (C) displayed by the endophytic fungi

Penicillium commune, Penicillium canescens and Alternaria alternata, cultured in

medium without and with olive leaf extract. Each value is expressed as mean standard

error of 3 independent experiments performed in triplicate. Bars with different letters

indicate values with significant differences at p < 0.05, within each microorganism.

A

B

C

0

10

20

30

40

50

60

C. glabrata C. albicans C. parapsilosis

Hal

o o

f in

hib

itio

n (

cm²)

a

bc

a

c

a

c

ba

cb

c

0

10

20

30

40

50

60

C. glabrata C. albicans C. parapsilosis

Hal

o o

f in

hib

itio

n (

cm²)

Fluconazole (25µg/ml)

P.commune

P.canescens

A.alternata

c

a

b b

b

a

b

a

b

a

b

a

0

10

20

30

40

50

60

B. subtilis B. cereus S. aureus

Hal

o o

f in

hib

itio

n (

cm²)

c

b

a

b

c

a

b

b

b

aa

a

0

10

20

30

40

50

60

B. subtilis B. cereus S. aureus

Hal

o o

f in

hib

itio

n (

cm²)

Chloramphenicol (30µg/ml)

P.commune

P.canescens

A.alternatac

b

aa

c

aa

b

b

aa a

0

10

20

30

40

50

60

P. aeruginosa E. coli

Hal

o o

f in

hib

itio

n (

cm²)

c

a

bb

c

b

a

d

Without olive leaf extract With olive leaf extract

0

10

20

30

40

50

60

P. aeruginosa E. coli

Hal

o o

f in

hib

itio

n (

cm²)

Chloramphenicol (30µg/ml)

P.commune

P.canescens

A.alternata

a

b

c

b

a

a

db

Page 62: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

48

The role of host plant extract on the biological activity of fungal endophytes is not

precisely known. Such knowledge would favor the industrial utilization and commercial

production of biologically useful compounds by endophytic fungi. Therefore, we have

tested the effect of aqueous olive leaf extracts on the antimicrobial activity displayed by

the three endophytes against bacteria and yeasts. Overall, the results indicate that host

extract plays an important role in the antimicrobial activity of the endophytic fungus,

depending on the species. When considering the results obtained for all the pathogens

analyzed, only the antimicrobial activity of P. commune grown on medium with host

extracts exhibited significant changes compared to the control (F1,190=21.140, p < 0.001;

Table 1). The antimicrobial activity displayed by this specie was increased significantly

(in average 1.4-fold), especially against yeasts (in average 2.4-fold; F1,70=34.083, p <

0.001) and gram-negative bacteria (in average 1.2-fold, F1,46=4.954, p < 0.05), upon

addition of host extract to the culture medium (Fig. 1; Table 1). The antimicrobial

activity of both P. canescens and A. alternata seems to be less influenced by host

extract than P. commune, since no significant differences were found between the

presence and absence of host extract on culture medium when considering the results

obtained for all the pathogens analyzed (Table 1). Despite this, host extract showed to

influenced significantly the antimicrobial activity of P. canescens against five

microorganisms (one yeast, three gram-positive bacteria and one gram-negative

bacteria) and of A. alternata against four bacteria (two gram-positive and two gram-

negative), out of the eight microorganisms analyzed. Previous studies have found

showing that host plant-derived compounds are required for the synthesis of bioactive

secondary metabolite by the endophytic fungi (Yenn et al., 2012; Soliman and Raizada,

2013). The anti-candidal activity of Phomopsis sp. isolated from the medicinal herb

Orthosiphon stamineus has shown to be enhanced upon addition of aqueous host extract

in the culture medium (Yenn et al., 2012). Some other studies have shown, however,

that fungal endophytes could produce bioactive compounds in the absence of any plant

tissues or extracts (Soliman et al., 2011).

Page 63: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

49

Table 1 - F values and probability levels of the effect of olive tree leaf on the

antimicrobial activity against gram-positive bacteria, gram-negative bacteria and yeasts

displayed by the endophytic fungi Penicillium commune, Penicillium canescens and

Alternaria alternata.

Microorganisms

Endophytic fungi

P. commune P. canescens A. alternata

Yea

sts

C. glabrata F(1,22) 421.255*** 14.649*** 0.296ns

C. albicans F(1,22) 139.074*** 0.100ns 0.335ns

C. parapsilosis F(1,22) 3.776ns 1.106ns 0.025ns

Total F(1,70) 34.083*** 0.366ns 0.335ns

Gra

m+

B. subtilis F(1,22) 8.684** 4.723* 17.850***

B. cereus F(1,22) 20.055*** 9.605** 20.490***

S. aureus F(1,22) 2.740ns 4.808* 3.034ns

Total F(1,70) 0.396ns 0.127ns 0.016ns

Gra

m-

P. aeruginosa F(1,22) 0.573ns 1.266ns 7.410*

E. coli F(1,22) 19.304*** 15.481*** 8.741**

Total F(1,46) 4.954* 0.519ns 4.956*

Total F(1,190) 21.140*** 0.461ns 2.417 ns

Probability levels: n.s. - no significant, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

Page 64: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

50

The results also indicate that plant host extract may induce or repress the

antimicrobial activity of the endophytic fungi (Fig. 1; Table 1). Plant host extract

significantly enhanced the antimicrobial activity of P. commune and P. canescens

against C. glabrata (25.4-fold and 1.2-fold, respectively), C. albicans (17.8-fold for the

first specie), B. subtilis (1.2-fold and 1.1-fold, respectively), S. aureus (1.1-fold for the

former specie) and E. coli (1.7-fold and 1.2-fold, respectively), but decrease against B.

cereus (1.4-fold and 1.2-fold, respectively). Although with less effect compared to

Penicillium strains, the host extract similarly shown to significantly increase the

antimicrobial activity of A. alternata against B. subtilis (1.4-fold) and E. coli (1.8-fold),

and to reduce against B. cereus (1.6-fold) and P. aeruginosa (1.5-fold). Curiously, was

also noticed that in the presence of host extract, the antimicrobial activity displayed by

all the endophytes was significantly enhanced against B. subtilis (in average 1.2-fold)

and E. coli (in average 1.6-fold), but reduced against B. cereus (in average 1.4-fold).

Our results, therefore, suggest that the presence of host plant in the medium may

stimulate or repress the production of antimicrobial metabolites by endophytic fungi,

which nature (at least some of them) seem to be common among the endophytes tested.

In the future, fractionation based bioassays using olive leaf extracts may be used to

identify candidate diffusible metabolites that affect endophytic antimicrobial

biosynthesis.

Determination of minimum inhibitory concentration (MIC)

During the initial screening, only A. alternata exhibited a potent broad spectrum

activity against yeasts, including C. albicans, independently of the host plant. This

feature makes this specie an ideal candidate to be explored as a microbial factory for

industrial production of desirable antimicrobial compounds. Therefore, we have

selected this specie to determine the MIC, by using a broth micro-dilution method. The

fungus was grown on PDB and extracts from both mycelium and cultured broth were

prepared in organic solvents with several polarities [ethyl acetate, methanol and

methanol:water (1:1, v/v)], which were further used to determine MICs values. PDB

medium was also included in this study as negative control.

Page 65: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

51

The results depicted in Table 2 showed that microorganism sensitivity differed

with the nature of the organic solvent used to extract active fractions. Ethyl acetate

extract exhibited a stronger broad spectrum activity when compared to methanol and

methanol:water (1:1, v/v). Ethyl acetate extracts inhibited all the tested strains at MIC

ranging from 0.095 to 25 mg/mL, being more active against yeast (MIC ≤ 0.095

mg/mL), followed by bacteria (MIC ≤ 3.125 mg/mL for gram-negative and MIC ≤

25.000 mg/mL for gram-positive). Fernandes et al. (2009) reported antimicrobial

activity of crude extract of A. alternata isolated from coffee leaves (Coffea arabica L.)

against S. aureus, E. coli and C. albicans at the MIC of range 0.05-0.1 mg/mL, 0.4-0.8

mg/mL and >0.8 mg/mL, respectively. Similarly, ethyl acetate extract of A. alternata

isolated from Nerium oleander L., have shown MIC values of 0.02 mg/mL against S.

aureus, B. cereus, E. coli and P. aeruginosa (Ramesha et al., 2013). By contrast, both

methanol and methanol:water (1:1, v/v) only inhibited the gram-positive bacteria B.

cereus at the MIC range of 0.351-0.683 mg/mL and 0.080-0.930 mg/mL, respectively

(Table 2). The highest antimicrobial activity found in the ethyl acetate extract compared

to these two solvents was previously observed for several endophytic fungi species

(Verma et al., 2008; Musavi and Balakrishnan, 2014). These findings suggested that

most active fraction of endophytic fungi was extracted in ethyl acetate rather than other

organic solvents. It was also notice a lack of growth inhibition of all microorganisms by

the PDB medium extract prepared from the several organic solvents (data not shown).

The results also indicate that, in general, the antimicrobial metabolites produced

by A. alternata were inside the mycelium or secreted into the culture medium. In fact,

ethyl acetate extract of the mycelium was found to be as effective as the culture broth of

A. alternata in inhibiting S. aureus, B. cereus, C. glabrata, C. parapsilosis and C.

albicans (Table 2). For some microorganisms, such as B. subtilis, E. coli and B. cereus,

the extracts prepared from mycelium presented a higher inhibition level when compared

to extracts from culture broth. The gram-negative bacteria P. aeruginosa was an

exception, being only inhibited by ethyl acetate extract prepared from culture broth.

In a general way, and according to the MIC values obtained, ethyl acetate should

be selected as the best extraction solvent to obtain optimized antimicrobial agents from

endophytic fungus.

Page 66: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

52

Table 2 - MIC values (mg/mL) of the extracts prepared from mycelium and cultured broth of Alternaria alternata cultures.

B. subtilis S. aureus B. cereus P. aeruginosa E. coli C. glabrata C. parapsilosis C. albicans

Ethyl acetate

Culture broth 25.000 6.250 0.095 3.125 3.125 0.095 0.095 0.095

Mycelium 0.095 6.250 0.095 - 0.095 0.095 0.095 0.095

Methanol:water

(1:1, v/v)

Culture broth - - 0.930 - - - - -

Mycelium - - 0.080 - - - - -

Methanol

Culture broth - - 0.683 - - - - -

Mycelium - - 0.351 - - - - -

- No inhibition

Page 67: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

53

Volatile profile

Some volatile organic compounds (VOCs) extracted from endophytic fungi have

been reported to have antimicrobial effects against a variety of human and plant

pathogens (Mitchell et al., 2010; Kudalkar et al., 2012). Therefore, we have analyzed

the VOCs produced by A. alternata by GC/MS in an attempt to identify the compounds

potentially responsible for the antimicrobial activity displayed by this specie. The VOCs

were identified in fungus growing in PDA medium (in vitro assay). Controls consisted

of uninoculated PDA medium that were used to subtract any possible compounds from

the medium. Moreover, the VOCs produced by P. canescens growing under in vitro

conditions were also analyzed in order to get a more accurate identification of the

antimicrobial compounds produced by A. alternata. In the first screening, P. canescens

shown to display the lowest activity against yeasts and the compounds appearing in this

specie will be compared to those acquired from the A. alternata growing under in vitro

conditions.

The GC/MS profile (Table 3; Fig. 2) revealed that six VOCs were found among

A. alternata and P. canescens. The VOCs formally and tentatively identified belong to

different chemical classes: three alcohols (3-methyl-1-butanol, 1-octen-3-ol, and

phenylethyl alcohol), one esters (3-methyl-1-butanol acetate), and two sesquiterpenes

(β-cedrene and thujopsene). The results revealed differences among samples, both in

compounds identified as well as in their amounts. The volatile fraction of A. alternata

was composed by 5 compounds and in P. canescens by three compounds (Table 3). The

most abundant volatile identified in A. alternata and P. canescens was 3-methyl-1-

butanol (63.4 and 66.6% of the total volatile fraction, respectively) followed by

phenylethyl alcohol (22.4 and 20.2% of the total volatile fraction, respectively). 3-

Methyl-1-butanol acetate (7.2%), was the third most abundant compound found in A.

alternata, followed by thujopsene (6.2%) and β-cedrene (0.7%); whereas in P.

canescens 1-octen-3-ol (13.1%) was the third most abundant compound identified,

being this mushroom-like alcohol exclusively found in this fungus. Some of the organic

compounds identified in this study have been reported to have antimicrobial activity

against a variety of pathogens. For instances, 3-methyl-1-butanol was reported to have a

high antimicrobial effect, and at low concentrations was shown to inhibit nearly 100%

the growth of phytopathogens under in vitro conditions (Fialho et al., 2011). Similarly,

it is well known that phenylethyl alcohol is a bacteriostatic agent that, at low

Page 68: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

54

concentrations, can inhibit the growth of gram-negative bacteria, including Salmonella,

Shigella, Aerobacter, Klebsiella, Escherichia, Pseudomonas and Proteus (Cretenet and

Vernoux, 2013). Thujopsene has shown potent antibacterial activity, for example

against phytopathogens (Manter et al., 2007)-and β-cedrene was considered a powerful

antimicrobial agent (Lin et al., 2012). This suggested that some of the volatile

compounds identified, in special the most abundant, could participate in the microbial

inhibition displayed by A. alternata as well as by P. canescens.

Page 69: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

55

Table 3 - Volatile profile of the endophytic fungi Penicillium canescens and Alternaria alternata growing in vitro conditions, expressed in

chromatographic normalized peak area (mean ± standard deviation). Compounds found in the control PDA are not included in this table.

Area/1000 ± SDd

Compound RTa LRIb Characteristic ions

(m/z)

QI (m/z

100%)c

Molecular

weight

Molecular

formula

P. canescens A. alternata

1 3-Methyl-1-

butanol

4.7 697 42/55/70 55 88 C5H12O 10115 ±

3151

25585 ±

11517

2 3-Methyl-1-

butanol acetate

9.8 820 43/55/70 43 130 C7H14O2 n.d. 2697 ± 467

3 1-Octen-3-ol 15.48 969 57 57 128 C8H16O 1901 ± 433 n.d.

4 Phenylethyl

alcohol

24.08 1136 91/92/122 91 122 C8H10O 3080 ± 986 9065 ± 4189

5 β-cedrene 44.70 1398 41/69/93/120/161/204 161 204 C15H24 n.d. 346 ± 338

6 Thujopsene 45.40 1416 41/93/105/119/133 119 204 C15H24 n.d. 2313 ± 1653

aRetention time; bLinear Retention Index reported in literature (NIST 11); cQuantification ions; dArea expressed as arbitrary units, S.D. - standard

deviation of four independent assays; n.d. – not detected.

Page 70: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

56

Figure 2 Full scan chromatographic profile obtained from the endophytic fungi

Penicillium canescens and Alternaria alternata growing in vitro by HS-SPME using

DVB/CAR/PDMS fiber (identification numbers correspond to those compounds

reported in Table 3).

Therefore, a principal component analysis was performed with volatile profile obtained

from P. canescens and A. alternata growing in vitro and their antimicrobial activity

(halo inhibition) against bacteria and yeasts, to describe the correlation between the two

parameters. The PCA obtained was able to distinguish the two species (Figure 3)

explaining in two principal components 85.25% of the total variance captured. In

accordance with previous volatile profile description, the first principal component

clearly separate A. alternata from P. canescens due to its higher content in 3-methyl-1-

butanol (2.5-fold) and phenylethyl alcohol (2.9-fold) when compared to P. canescens.

Other relevant discriminating compounds were 3-methyl-1-butanol acetate, β-cedrene

and thujopsene. An interesting result is the clustering of C. albicans and C. parapsilosis

together with these volatile compounds, suggesting their involvement in the inhibition

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.00.00

0.25

0.50

0.75

1.00(x10,000)

57

72

85

OH

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.00.00

0.25

0.50

0.75

1.00(x10,000)

43

70

87

115

O O

Penicillium canescens in vitro

Alternaria alternata in vitro

1

1

2

3

4

4

6

5

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.00.00

0.25

0.50

0.75

1.00(x10,000)

161

6941 204

93

120133

189

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.00.00

0.25

0.50

0.75

1.00(x10,000)

55

70

87

OH

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.00.00

0.25

0.50

0.75

1.00(x10,000)

91

122

6539

OH

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.00.00

0.25

0.50

0.75

1.00(x10,000)

119

10541

13369

204

189161

Page 71: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

57

displayed by A. alternata against those yeasts as previously observed. P. canescens as

well distinguished based on its 1-octen-3-ol content. The cluster of this compound

together with E. coli, B. subtilis and P. aeruginosa, suggested the participation of 1-

octen-3-ol in the observed inhibitory effect displayed by this fungus against those

bacteria.

Figure 3 - Principal component analysis obtained using the volatile composition of

Alternaria alternata ( ) and Penicillium canescens ( ) growing in vitro and

antimicrobial activity displayed by these fungi against bacteria and yeasts, evaluated as

halo inhibition (in cm2). The PCA factors explain 85.25% of the total variance.

P. aeruginosa

B. subtilis

E. coli 1-octen-3-ol

S. aureus

B. cereus

Thujopsene

C. glabrata

3-methyl-1-butanol

Phenylethylalcohol

β-cedrene

3-methyl-1-

butanol acetate

C. albicans

C. parapsilosis

Page 72: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

58

Conclusion

With the present work we concluded that the endophytic fungus P. commune, P.

canescens and A. alternata isolated from O. europaea possess antimicrobial agents

capable to inhibit gram-positive and gram-negative bacteria, as well as yeasts. A.

alternata revealed high capacity to inhibit Candida sp.. The role of host plant was

decisive over the antimicrobial potential, being observed different trends according to

the microorganisms assayed. Volatile composition was strongly influenced according to

the tested endophytic fungus, being the most abundant components identified ascribed

with antimicrobial potentialities. Therefore, future studies need to focus on the potential

use of the antimicrobial volatiles from endophytic fungus as an alternative and

innovative source of antimicrobial agents.

Acknowledgments

This work is funded by National Funds through FCT - Foundation for Science and

Technology under the project "EndoBio - Isolation and screening of endophytic fungi

for biological control of olive against Colletotrichum acutatum and Verticillium

dahliae" (PTDC / AGR-PRO / 4354/2012).

Page 73: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

59

References

Aly, A. H., Debbab, A., Kjer, J., Proksch, P. (2010). Fungal endophytes from higher

plants: a prolific source of phytochemicals and other bioactive natural products.

Fungal diversity, 41(1), 1-16.

Banerjee, D., Strobel, G., Geary, B., Sears, J., Ezra, D., Liarzi, O., Coombs, J. (2010).

Muscodor albus strain GBA, an endophytic fungus of Ginkgo biloba from

United States of America, produces volatile antimicrobials. Mycology, 1(3),

179-186.

Bertinetti, B. V., Peña, N. I., Cabrera, G. M. (2009). An antifungal tetrapeptide from the

culture of Penicillium canescens. Chemistry & biodiversity, 6(8), 1178-1184.

Carter, G. T. (2011). Natural products and Pharma 2011: Strategic changes spur new

opportunities. Natural product reports, 28(11), 1783-1789.

Donadio, S., Maffioli, S., Monciardini, P., Sosio, M., Jabes, D. (2010). Antibiotic

discovery in the twenty-first century: current trends and future perspectives. The

Journal of antibiotics, 63(8), 423-430.

Fernandes, M. D. R. V., Pfenning, L. H., Costa-Neto, C. M. D., Heinrich, T. A.,

Alencar, S. M. D., Lima, M. A. D., Ikegaki, M. (2009). Biological activities of

the fermentation extract of the endophytic fungus Alternaria alternata isolated

from Coffea arabica L. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 45(4),

677-685.

Fialho, M. B., Moraes, M. H. D. D., Tremocoldi, A. R., Pascholati, S. F. (2011).

Potential of antimicrobial volatile organic compounds to control Sclerotinia

sclerotiorum in bean seeds. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 46(2), 137-142.

Guo, B. H., Wang, Y. C., Zhou, X. W., Hu, K., Tan, F., Miao, Z. Q., Tang, K. X.

(2006). An endophytic taxol-producing fungus BT2 isolated from Taxus

chinensis var. mairei. African Journal of Biotechnology, 5(10).

Hawksworth, D. L. (2004). Fungal diversity and its implications for genetic resource

collections. Studies in Mycology, 50, 9-18.

Hellwig, V., Grothe, T., Mayer-Bartschmid, A., Endermann, R., Geschke, F. U.,

Henkel, T., Stadler, M. (2002). Altersetin, a new antibiotic from cultures of

Page 74: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

60

endophytic Alternaria spp. Taxonomy, fermentation, isolation, structure

elucidation and biological activities. The Journal of antibiotics, 55(10), 881-892.

Högberg, L. D., Heddini, A., Cars, O. (2010). The global need for effective antibiotics:

challenges and recent advances. Trends in pharmacological sciences, 31(11),

509-515.

Hosseini Moghaddam, M., Soltani, J., Babolhavaeji, F., Hamzei, J., Nazeri, S., Mirzaei,

S. (2013). Bioactivities of endophytic Penicillia from Cupressaceae. Journal of

Crop Protection, 2(4), 421-433.

Hyde, K. D., Soytong, K. (2008). The fungal endophyte dilemma. Fungal Divers, 33,

163-173.

Joana Gil‐Chávez, G., Villa, J. A., Fernando Ayala‐Zavala, J., Basilio Heredia, J.,

Sepulveda, D., Yahia, E. M., González‐Aguilar, G. A. (2013). Technologies for

extraction and production of bioactive compounds to be used as nutraceuticals

and food ingredients: an overview. Comprehensive Reviews in Food Science

and Food Safety, 12(1), 5-23.

Kjer, J., Wray, V., Edrada-Ebel, R., Ebel, R., Pretsch, A., Lin, W., Proksch, P. (2009).

Xanalteric acids I and II and related phenolic compounds from an endophytic

Alternaria sp. isolated from the mangrove plant Sonneratia alba. Journal of

natural products, 72(11), 2053-2057.

Kudalkar, P., Strobel, G., Riyaz-Ul-Hassan, S., Geary, B., Sears, J. (2012). Muscodor

sutura, a novel endophytic fungus with volatile antibiotic activities.

Mycoscience, 53(4), 319-325.

Kusari, S., Singh, S., Jayabaskaran, C. (2014). Biotechnological potential of plant-

associated endophytic fungi: hope versus hype. Trends in biotechnology, 32(6),

297-303.

Laxminarayan, R., Duse, A., Wattal, C., Zaidi, A. K., Wertheim, H. F., Sumpradit, N.,

Cars, O. (2013). Antibiotic resistance—the need for global solutions. The Lancet

infectious diseases, 13(12), 1057-1098.

Li, C. S., An, C. Y., Li, X. M., Gao, S. S., Cui, C. M., Sun, H. F., Wang, B. G. (2011).

Triazole and dihydroimidazole alkaloids from the marine sediment-derived

fungus Penicillium paneum SD-44. Journal of natural products, 74(5), 1331-

1334.

Page 75: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

61

Lin, J., Dou, J., Xu, J., & Aisa, H. A. (2012). Chemical composition, antimicrobial and

antitumor activities of the essential oils and crude extracts of Euphorbia

macrorrhiza. Molecules, 17(5), 5030-5039.

Li, Y. C., Tao, W. Y., Cheng, L. (2009). Paclitaxel production using co-culture of Taxus

suspension cells and paclitaxel-producing endophytic fungi in a co-bioreactor.

Applied microbiology and biotechnology, 83(2), 233-239.

Manter, D. K., Kelsey, R. G., & Karchesy, J. J. (2007). Antimicrobial activity of

extractable conifer heartwood compounds toward Phytophthora ramorum.

Journal of chemical ecology, 33(11), 2133-2147.

Morath, S. U., Hung, R., Bennett, J. W. (2012). Fungal volatile organic compounds: a

review with emphasis on their biotechnological potential. Fungal Biology

Reviews, 26(2), 73-83.

Mousa, W. K.; Raizada, M. N. (2013). The diversity of anti-microbial secondary

metabolites produced by fungal endophytes: an interdisciplinary perspective.

Frontiers in microbiology, 4.

MP Gutierrez, R., MN Gonzalez, A., M Ramirez, A. (2012). Compounds derived from

endophytes: a review of phytochemistry and pharmacology. Current medicinal

chemistry, 19(18), 2992-3030.

Musavi, S. F., Balakrishnan, R. M. (2014). A Study on the Antimicrobial Potentials of

an Endophytic Fungus Fusarium oxysporum NFX 06. Journal of Medical and

Bioengineering Vol, 3(3).

Naz, S., & Vernoux, M. C. J. (2013). Current knowledge on antimicrobial metabolites

produced from aromatic amino acid metabolism in fermented products.

Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and

education (A. Méndez-Vilas, Ed.) 337-346.

Nicoletti, R., Fiorentino, A., & Scognamiglio, M. (2014). Endophytism of Penicillium

Species in Woody Plants. Open Mycology Journal, 8, 1-26.

Nicoletti, R., Lopez-Gresa, M. P., Manzo, E., Carella, A., Ciavatta, M. L. (2007).

Production and fungitoxic activity of Sch 642305, a secondary metabolite of

Penicillium canescens. Mycopathologia, 163(5), 295-301.

Page 76: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

62

Nirupama, R., Chaithra, K., Govindappa, M., rappa, C. P., Vinay, R. B. (2011).

Antimicrobial and antioxidant activities of endophytes from Tabebuia argentea

and identification of anticancer agent (lapachol). Journal of Medicinal Plants

Research, 5(16), 3643-3652.

Olano, C., Lombó, F., Méndez, C., Salas, J. A. (2008). Improving production of

bioactive secondary metabolites in actinomycetes by metabolic engineering.

Metabolic engineering, 10(5), 281-292.

Pereira, E., Santos, A., Reis, F., Tavares, R. M., Baptista, P., Lino-Neto, T., Almeida-

Aguiar, C. (2013). A new effective assay to detect antimicrobial activity of

filamentous fungi. Microbiological research, 168(1), 1-5.

Qadri, M., Johri, S., Shah, B. A., Khajuria, A., Sidiq, T., Lattoo, S. K., Riyaz-Ul-

Hassan, S. (2013). Identification and bioactive potential of endophytic fungi

isolated from selected plants of the Western Himalayas. SpringerPlus, 2(1), 8.

Ramesha, A., Sunitha, V., Srinivas, C. (2013). Antimicrobial activity of secondary

metabolites from endophytic fungi isolated from nerium oleander. International

Journal of Pharma & Bio Sciences, 4(1), 683-693.

Rios, J. L., Recio, M. C., Villar, A. (1988). Screening methods for natural products with

antimicrobial activity: a review of the literature. Journal of ethnopharmacology,

23(2), 127-149.

Rodriguez, R. J., Woodward, C., Redman, R. S. (2012). Fungal influence on plant

tolerance to stress. Biocomplexity of plant–fungal interactions. Oxford: Wiley-

Blackwell, 155-163.

Selim, K. A., El-Beih, A. A., Abdel-Rahman, T. M., & El-Diwany, A. I. (2012).

Biology of endophytic fungi. Current Research in Environmental & Applied

Mycology, 2(1), 31-82.

Soliman, S. S., Tsao, R., Raizada, M. N. (2011). Chemical inhibitors suggest endophytic

fungal paclitaxel is derived from both mevalonate and non-mevalonate-like

pathways. Journal of natural products, 74(12), 2497-2504.

Soliman, S. S., & Raizada, M. N. (2013). Interactions between co-habitating fungi elicit

synthesis of Taxol from an endophytic fungus in host Taxus plants. Frontiers in

microbiology, 4.

Page 77: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

63

Strobel, G. (2006). Harnessing endophytes for industrial microbiology. Current opinion

in microbiology, 9(3), 240-244.

Ul-Hassan, S. R., Strobel, G. A., Booth, E., Knighton, B., Floerchinger, C., Sears, J.

(2012). Modulation of volatile organic compound formation in the Mycodiesel-

producing endophyte Hypoxylon sp. CI-4. Microbiology, 158(2), 465-473.

Verma, V. C., Gond, S. K., Mishra, A., Kumar, A., & Kharwar, R. N. (2008). Selection

of natural strains of fungal endophytes from Azadirachta indica A. Juss, with

anti-microbial activity against dermatophytes. Current Bioactive Compounds,

4(1), 36-40.

Wright, G. D. (2012). Antibiotics: a new hope. Chemistry & biology, 19(1), 3-10.

Yang, Y., Zhao, H., Barrero, R. A., Zhang, B., Sun, G., Wilson, I. W., Qiu, D. (2014).

Genome sequencing and analysis of the paclitaxel-producing endophytic fungus

Penicillium aurantiogriseum NRRL 62431. BMC genomics, 15(1), 69.

Yenn, T. W., Lee, C. C., Ibrahim, D., & Zakaria, L. (2012). Enhancement of anti-

candidal activity of endophytic fungus Phomopsis sp. ED2, isolated from

Orthosiphon stamineus Benth, by incorporation of host plant extract in culture

medium. Journal of Microbiology, 50(4), 581-585.

Yu, H., Zhang, L., Li, L., Zheng, C., Guo, L., Li, W., . Qin, L. (2010). Recent

developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by

endophytes. Microbiological research, 165(6), 437-449.

Page 78: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 79: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

65

Supporting information

Table S1 – Range of extract concentration (mg/mL) used to determine MIC values.

MIC values were determined for ethyl acetate, methanol and methanol:water (1:1, v/v)

extracts of both mycelium and cultured broth of Alternaria alternata. PDB medium was

also included as negative control

Ethyl acetate Methanol Methanol:water (1:1, v/v)

Mycelium 25 – 0.0475 45 – 0.08 45 – 0.08

Culture broth 50 - 0.095 350 – 0.682 240 – 0.46

PDB medium 50 - 0.0475 250 – 0.48 250 – 0.48

Figure S1 – Culture in vitro flasks (50 mL) sealed with a cap containing a silicone

septum. This system was used to evaluate the production of volatile organic

compounds by these fungi

Page 80: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 81: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

Capítulo 3 Conclusões

Page 82: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos
Page 83: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

69

Conclusão

Os fungos endofíticos caracterizam-se por colonizarem inter e intracelularmente

os tecidos internos das plantas, durante todo o seu ciclo de vida ou parte dele, sem

causarem sintomas aparentes de doença no hospedeiro. Estes fungos têm despertado o

interesse da comunidade científica por representarem uma fonte diversa de novos

compostos bioativos naturais, com aplicações na indústria farmacêutica, alimentar ou

agrícola. Apesar destes fungos terem sido alvo de intenso estudo nos últimos anos, é

estimado que uma grande quantidade destes compostos bioativos se encontre ainda por

identificar. Na atualidade, muitos dos antibióticos e antifúngicos disponíveis no

mercado têm-se mostrado ineficazes no tratamento de infeções causadas por

microrganismos resistentes. Esta resistência aos antibióticos é uma ameaça global à

saúde pública, e para a qual uma das soluções apontadas passa pelo desenvolvimento de

de novos fármacos e novas classes de antibióticos. A bioprospeção de novos compostos

antimicrobianos ao nível dos fungos endofiticos reveste-se, neste âmbito, de enorme

importância. Contudo, a aplicação destes fungos na indústria farmacêutica só será

possivel se estes possuirem a capacidade de produzirem os compostos bioativos de

interesse em meio de cultura, de forma independente da planta hospedeira. Assim, este

trabalho permitiu avaliar o potencial antimicrobiano de três fungos endofiticos isolados

de folhas de oliveira, Penicillium commune, Penicillium canescens, Alternaria

alternata, e o efeito da planta hospedeira nestas propriedades. Permtiu ainda identificar

potenciais compostos volatéis que possam ser responsáveis pela atividade

antimicrobiana exibida pelos endófitos.

Todos os fungos endofíticos testados no presente estudo apresentaram uma forte

atividade antimicrobiana. De entre as espécies estudadas, A. alternata pareceu ser a

mais promissora no tratamento de doenças infeciosas causadas por Candida sp.,

originando halos de inibição significativamente superiores aos antifúngicos comerciais.

Esta espécie foi também a que apresentou o maior espectro de inibição, reduzindo

significativamente sete microrganismos dos oito analisados, e a única que inibiu

significativamente Candida albicans quando comparada com o antifúngico comercial.

Por sua vez, as espécies P. canescens e P. commune, mostraram ser mais eficazes contra

as bactérias gram-positivas e gram-negativas. Extractos aquosos de folhas da oliveira

Page 84: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

70

mostraram influenciar a atividade antimicrobiana, em especial da espécie P. commune,

seguida pela P. canescens e A. alternata. O efeito dos extratos foliares fez-se sentir pelo

aumento ou diminuição da atividade antimicrobiana de acordo com as espécies

interatuantes (fungo endófito- microrganismo patogénico). Estes resultados permitiram

selecionar o fungo endófito A. alternata para os estudos subsequentes. De entre as três

espécies estudadas, esta é a que apresenta um maior potencial na indústria farmacêutica,

por ter exibido uma atividade antimicrobiana forte e de amplo espetro, e com reduzida

influência da planta hospedeira.

A partir do micélio de A. alternata e do respectivo meio de cultura prepararam-

se extratos com solventes de diferentes polaridades, de forma a determinar a

concentração minima inibitória (CMI). O extrato de acetato de etilo foi o que apresentou

um maior espetro, ao inibir todos os microrganismos analisados, e o que mostrou uma

menor CMI (a variar entre 0,095 – 25,00 mg/mL). Este extrato demonstrou ser mais

eficaz contra Candida sp. (MIC ≤ 0,095 mg/mL) quando comparado com as bactérias

(MIC ≤ 3,125 mg/mL para gram-negativa; MIC ≤ 25,000 mg/mL para gram-positiva).

Os extractos metanólico e metanólico:água 1:1 (v/v) só inibiram um microrganismo,

Bacillus cereus, a valores de MIC a variar entre 0,351-0,683 mg/mL e 0,080-0,930

mg/mL, respectivamente. A deteção de actividade antimicrobiana nos extratos obtidos a

partir da biomassa fúngica e do meio de cultura sugere que os compostos

antimicrobianos possam estar presentes nas hifas e/ou possam ser secretadas pelo fungo

para o meio de cultura. Este resultado sugere que ambas as matrizes poderão ser

utilizadas para o isolamento do composto antimicrobiano.

A avaliação dos compostos voláteis por GC/MS dos fungos A. alternata e P.

canescens em crescimento sob condições in vitro, permitiu identificar um total de seis

compostos pertencentes a três classes químicas: álcoois (3-metil-1-butanol, 1-octeno-3-

ol, e fenil-etil álcool), éstere (Acetato de 3-metil-1-butanol), e sesquiterpenos (β-

cedreno e thujopsene). Os compostos volatéis mais abundantes em A. alternata e P.

canescens foram o 3-metil-1-butanol (63,4 e 66,6% do total da fração volatil,

respectivamente) seguida pelo fenil-etil álcool (22,4 e 20,2% do total da fração volatil,

respectivamente). Todos os compostos identificados encontram-se descritos como

possuindo propriedades antimicrobianas o que poderá explicar, em parte, a actividade

Page 85: Composição volátil e atividade antimicrobiana de fungos endofíticos

71

antimicrobiana exibida pelos dois endófitos. Esta hipótese foi corroborada pela análise

de componentes principais que demonstrou o envolvimento de 3-metil-1-butanol e

fenil-etil álcool, produzido por A. alternata, no processo de inibição deste fungo contra

C. albicans e Candida parapsilosis. Por sua vez, o composto 1-octeno-3-ol produzido

pelo P. canescens parece ter um papel na inibição exibida por este fungo contra

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis.

Os resultados obtidos evidenciam, pela primeira vez, o potencial antimicrobiano

de espécies fungicas endofiticas da oliveira. As três espécies demonstraram ser uma

fonte promissora de antibióticos/antifúngicos naturais que poderão, no futuro, ser

exploradas ao nível da indústria farmacêutica. Apesar do seu potencial biotecnológico

na área farmacêutica, é ainda necessário proceder-se à elucidação da natureza química

dos metabolitos produzidos recorrendo, por exemplo, a vários métodos cromatográficos

acoplada a espectrometria de massa, entre outros.