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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CONSERVAÇÃO E
MANEJO DE RECURSOS NATURAIS – NÍVEL MESTRADO
LAÍS DAYANE WEBER
Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo
essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.
CASCAVEL-PR
Agosto/2013
ii
LAÍS DAYANE WEBER
Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo
essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação Stricto Sensu em Conservação e Manejo
de Recursos Naturais – Nível Mestrado, do Centro
de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade
estadual do Oeste do Paraná, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre em Conservação
e Manejo de Recursos Naturais
Área de Concentração: Conservação e Manejo de
Recursos Naturais
CASCAVEL-PR
Agosto/2013
iii
"Apesar dos nossos defeitos, precisamos enxergar que somos pérolas únicas no teatro
da vida e entender que não existem pessoas de sucesso e pessoas fracassadas. O que
existem são pessoas que lutam pelos seus sonhos ou desistem deles."
(Augusto Cury)
iv
DEDICATÓRIA
A minha família e ao meu namorado, por todo amor e
constante incentivo, com gratidão, dedico.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus por iluminar meu caminho e permitir que eu realizasse essa conquista.
A minha mãe pela fé, carinho, amor e incentivo, serei eternamente grata.
A minha orientadora Professora Fabiana Gisele da Silva Pinto por sua disponibilidade,
empenho, apoio e confiança. Serei eternamente grata por oportunizar esse trabalho.
Ao Professor Luis Francisco Angeli Alves, pelas sugestões recebidas na elaboração deste
trabalho.
A Professora Tereza Cristina Marinho Jorge, por ceder o Laboratório de Farmacognosia e
apoiar o desenvolvimento desta pesquisa.
A professora Lívia Godinho Temponi pela disponibilização do Herbário (UNOP) e
identificação de todas as plantas.
Aos colegas do laboratório de Biotecnologia Agrícola, pela amizade e pelo apoio durante
esses anos.
A Universidade Estadual do Oeste do Paraná, pela oportunidade de realização desta pesquisa.
Ao PTI pela disponibilidade da bolsa de mestrado.
Enfim, obrigado a todos, mesmo àqueles que não tenham sido citados, mas que de alguma
forma colaboraram para o desenvolvimento desta pesquisa.
vi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................p.1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................p.2
2.1 Resistência bacteriana e antimicrobianos sintéticos.................................p.2
2.2 Antimicrobianos alternativos...................................................................p.3
2.3 Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana...............................p.5
2.4 Cromatografia...........................................................................................p.5
2.5 Atividade antioxidante.............................................................................p.6
3. CAPÍTULO 1: Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de
óleo essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb.....................p. 8
4. CAPÍTULO 2: Atividade Antimicrobiana de Extratos Vegetais de Seis Espécies
Nativas do Brasil no Controle de Salmonella de Origem Aviária...................................p. 28
5. REFERÊNCIAS....................................................................................................p.44
6. ANEXOS ..............................................................................................................p.53
Anexo 1 – Nomas Revista Journal of Food, Agriculture & Environment............p.54
Anexo 2 – Nomas Revista Brasileira de Plantas Medicinais...............................p.65
vii
RESUMO:
A propriedade antimicrobiana das plantas pode ser explicada pela produção de compostos
ativos gerados durante o metabolismo secundário como também por compostos voláteis.
Atualmente os conhecimentos, as vezes empíricos, desta propriedade têm sido confirmados
cientificamente, revelando assim o enorme potencial das plantas no controle de doenças
infecciosas, enquanto verifica-se um aumento nos casos de micro-organismos patogênicos
resistentes aos antimicrobianos conhecidos. Extratos e óleos essenciais de plantas têm
mostrado efeitos sobre desenvolvimento de microrganismos em inúmeras situações, o que
sugere uso prático destes produtos. No presente estudo voltado à pesquisa de plantas como
fonte natural e alternativa de substâncias antimicrobianas, determinou-se a composição
química de diferentes extratos vegetais (aquoso, etanolico, acetato de etila e hexanico) e do
óleo essencial de Prunus myrtifolia (L.) Urb. (pessegueiro-bravo), através da triagem
fitoquímica e CG/MS respectivamente, bem como seu efeito antimicrobiano contra micro-
organismos patogênicos Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella
Typhimurium (ATCC 14028), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Klebsiella pneumoniae
(ATCC 13883), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus faecalis (ATCC 19433),
Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Bacillus subtillis (CCD-04) e Candida albicans (ATCC 10231) através da determinação
dos valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima
(CBM) utilizando a técnica de diluição em caldo; e por fim buscou-se avaliar a atividade
antioxidante dos extratos vegetais e óleo essencial pelo método de captura de radicais
livres DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil). De maneira geral através da triagem fitoquimica
dos extratos verificou-se a presença de metabolitos secundários como, flavonoides, taninos
(etanolico e aquoso), triterpenoides e saponinas (etanolico), que já se mostraram ativas em
diferentes estudos descritos na literatura. Em relação ao extrato hexânico ausência de
metabólitos secundários com atividade bacteriana. A maior classe de compostos voláteis
identificados no óleo de Prunus myrtifolia benzaldeido (97%) seguido de 3-hexen-1-ol
(0.07%) e Benzil e Benzoato (0.09%). Em sequência determinou-se o efeito
antimicrobiano para todos os produtos vegetais, exceto hexânico com uma discreta
tendência de maior susceptibilidade para a cepas Gram positivas. Os resultados apontam o
extrato aquoso e etanolicos como os mais efetivos os patógenos testados. Em relação ao
óleo, apresentou atividade antimicrobiana frente a todos patógenos avaliados. Em uma
terceira etapa do estudo verificou-se atividade antioxidantes entre o extrato aquoso,
etanolico e acetato de etila, sendo detectados baixos valores em relação ao extrato hexanico
e óleo essencial. Pelos resultados obtidos ficou estabelecida a capacidade antimicrobiana
dos produtos vegetais testados, bem como foi possível determinar a atividade antioxidante
dos mesmos. Em outro estudo, também voltado à pesquisa de plantas como fonte natural e
alternativa de substâncias antimicrobianas, teve por objetivo comparar a ação inibitória de
extratos aquosos e etanólicos das plantas Maytenus aquifolium Mart. (espinheira-santa),
Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (canela-
branca), Psidium guajava L. (goiabeira), e Ricinus communis L. (mamona) e Schinus molle
L. (aroeira) de extratos vegetais (aquoso e etanolico) através da determinação da
viii
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) por
meio da técnica de microdiluição em caldo frente a trinta e seis sorotipos de Salmonella de
origem avícola e Salmonella Typhimurium ATCC 14028. De maneira geral verificou-se a
atividade antimicrobiana de todos os extratos testados, sendo os etanólicos mais eficazes
quando comparados aos aquosos. Os extratos etanólicos de M. cauliflora e P.guajava,
apresentaram as maiores atividades inibitórias. Esses resultados confirmaram o potencial
antimicrobiano desses extratos vegetais, os quais merecem novas pesquisas abordando sua
possível adição na alimentação de aves.
Palavras-chave: Ação antimicrobiana, Plantas nativas, Patógenos, Extrato Vegetal, Óleo
Essencial.
1
1. Introdução
As doenças infecciosas representam uma importante causa de morbidade e
mortalidade entre humanos, especialmente nos países em desenvolvimento. Assim, as
indústrias farmacêuticas têm sido motivadas para o desenvolvimento de novas drogas
antimicrobianas nos últimos anos, especialmente em função da ocorrência de resistência
microbiana a tais medicamentos. Em geral, bactérias têm habilidade genética de transmitir
e adquirir resistência a drogas usadas como agentes terapêuticos (NASCIMENTO et al.
2000), pois são frequentes os relatos sobre isolamentos de bactérias que eram
reconhecidamente sensíveis às drogas de uso na rotina, mas que se tornam resistentes a
todos, ou a quase todos, fármacos disponíveis no mercado (SAKAGAMI; KAJAMURA,
2002).
Assim, no momento em que os antimicrobianos estão sendo substituídos, os
produtos alternativos se constituem numa alternativa importante. Neste contexto, os
extratos vegetais e óleos essenciais destacam-se como eficientes antimicrobianos
alternativos. Os princípios ativos dos óleos e extratos vegetais podem ser encontrados em
todo tecido vivo de plantas, geralmente concentrados na casca, flores, folhas, frutos,
sementes e quimicamente são constituídos frequentemente por um grupo de compostos
distintos como os hidrocarbonetos, alcoóis e compostos carbonílicos (aldeídos e cetonas),
etc. A exploração da atividade biológica de substâncias químicas de plantas brasileiras
constitui uma forma potencial de controle alternativo de doenças, zoonoses e resistência
microbiana gerando o desenvolvimento de modelos que viabilizem sistemas de produção
sustentáveis e a conservação da biodiversidade e recursos naturais.
Os principais compostos naturais com propriedades antimicrobianas encontrados
nas plantas são geralmente fenóis simples, ácidos fenólicos, quinonas, flavonas, flavonóis e
flavonóides, assim como o tanino, cumarina, terpenóides, alcalóides, lectinas e
polipeptídios (GONÇALVES et al., 2005).
Visto que os extratos vegetais e óleos essenciais têm um papel de destaque como
eficientes antimicrobianos, torna-se importante o estudo do efeito desses compostos
alternativos para o controle da salmonelose em aviários a fim de substituir os produtos
sintéticos que diminuem a qualidade dos alimentos e degradam o meio ambiente como
também em patógenos comumente relacionados a doenças hospitalares.
2
2. Revisão Bibliográfica
2.1 Resistencia bateriana e antimicrobianos sintéticos
As doenças infeciosas afetam milhões de pessoas em todo o mundo e ao longo da
história da humanidade, sempre representaram uma das principais causas de morte.
Segundo dados da Organização Mundial da Sáude (OMS), as doenças infeciosas
representam 26% da mortalidade global estimando-se que cerca de 50.000 pessoas morra a
cada dia em todo o mundo por estas doenças (BECKER et. al., 2006; CHANDA;
RAKHOLIYA, 2011). O problema tem se agravado devido o surgimento de micro-
organismos multirresistentes, presentes em infecções hospitalares e comunitárias,
diminuindo as opções de antibioticoterapia (LEVY, 2005; ANDRADE et al., 2006;
REYNOLDS, 2009; ANURADHA et al., 2010).
Segundo critério mais usado, bactérias multirresistentes são os micro-organimos
que apresentam resistência à maioria dos antimicrobianos, para os quais são originalmente
sensíveis (COUTO, 2003). O uso inteso e inadequado de antibióticos, terapêutica ou
profilaticamente, humano ou veterinário, a dificuldade dos pacientes em seguir o
tratamento prescrito, o transporte de bactérias resistentes a novas áreas em função das
viagens no mundo tem favorecido a pressão seletiva e predominância de espécies
bacterianas cada vez mais resistentes a diversos princípios ativos, bem como causam
diversos problemas ambientais (DEL FIOL et al., 2010; SAKARIDIS et al., 2011).
Segundo NGOWKE et al. (2011), a epidemiologia da resistência aos antibióticos
varia de região e de país. Enquanto alguns países estão registrando um declínio, outros
estão experimentando um aumento da resistência bacteriana. No entanto, esta evidente que
o aumento ou a diminuição tem sempre uma ligação com o uso indiscriminado de
antibióticos (TACCONELLI et al., 2009).
Elevadas taxas de resistência aos antimicrobianos são registradas em estudos
realizados no mundo todo e na medicina humana e veterinária (MOTA et al., 2005). Para
Salmonella, também, há registros de alta resistência aos principais antimicrobianos
normalmente utilizados em avicultura (RIBEIRO et al., 2008).
Genes resistentes, adquiridos por micro-organismos, podem ser facilmente
transferidos para organismos de diferentes ecossistemas, sendo levados da água para o solo
e vice-versa (BILA; DEZOTTI, 2003). No meio aquático, o contato físico entre as
bactérias possibilita alta freqüência de troca de plasmídeos codificadores de resistência aos
3
antimicrobianos (RHODES et al., 2000). A resistência pode ocorrer pela inativação do
composto por enzimas desintoxicantes, redução da permeabilidade celular ou expulsão da
droga por bombas específicas ou não-específicas e modificação dos alvos dos
antimicrobianos. Além disso, as bactérias podem adquirir um fenótipo de resistência via
reguladores transcricionais globais ou específicos. Estes mecanismos podem ser induzidos
pelo antibiótico em si ou por sinais ambientais (BOERLIN; REID-SMITH, 2008).
Apesar da disponibilização de novos antibióticos, a resistência bacteriana ocorre
em ritmo crescente nos diferentes patógenos Gram positivos e Gram negativos e representa
um grande desafio terapêutico (ROSSI; ANDREAZII, 2005). Nas últimas décadas o
enfoque dado para o controle das infecções por bactérias Gram negativas, pode ter
contribuído para o surgimento de bactérias Gram positivas multirresistentes,
principalmente Staphylococcus resistentes a meticilina, Pneumococcus resistente à
penicilina e eritromicina, Enterococcus resistentes à vancomicina e também as Gram
negativas Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae resistentes a β-lactâmicos e
carbapenens (LOW; NADLER, 1997; SANTOS FILHO et al. 2002).
Ressalta-se a importância de compreender o mecanismo de resistência microbiana,
bem como na busca de novos compostos antimicrobianos, sintéticos ou naturais, no intuito
de controlar a ação de micro-organismos patogênicos (CASTRO et al., 2002).
2.2 Antimicrobianos alternativos
As propriedades farmacológicas das plantas têm sido reconhecidas empiricamente
durante séculos, mas foram cientificamente confirmadas apenas nas últimas décadas.
Filtrados, infusões, macerados, sucos e extratos de plantas com propriedades medicinais
são utilizados no tratamento de diversas doenças, desde a antiguidade (COUTINHO et al.,
2008). O interesse por esses metabólitos extraídos de plantas se deve, principalmente, à
capacidade de produção de compostos biologicamente ativos que podem servir de modelos
para a síntese de novos fármacos e por possuírem propriedades terapêuticas utilizadas
como tratamento alternativo no cuidado de saúde tradicional (GIBBONS, 2005).
Com o desenvolvimento progressivo da resistência aos antimicrobianos sintéticos,
as propriedades biológicas dos produtos vegetais vêm sendo estudadas em busca de
produtos alternativos com ação antimicrobiana (ARYA et al, 2010). Neste contexto, os
extratos vegetais e óleos essenciais destacam-se como eficientes antimicrobianos e a partir
disso, surgiu-se a curiosidade e necessidade de conhecer melhor as características dos
4
vegetais e constatação do potencial antimicrobiano dos extratos e óleos essenciais
(NUNES et al., 2006; ALMEIDA et al., 2006; ARRUDA et al., 2006; BONA et al., 2010).
A forma de ação dos princípios ativos de extratos vegetais sobre as células
bacterianas são muito similares ao dos antimicrobianos convencionais. Os efeitos positivos
dos extratos vegetais estão associados aos princípios ativos, componentes químicos
presentes em todas as partes das plantas ou em áreas específicas que conferem às plantas a
capacidade de inibir a atividade de bactérias e de outros micro-organismos (DUARTE,
2004; RIZZO et al., 2010). Além dos extratos desempenharem um importante papel,
garantindo a sobrevivência das espécies no ecossistema, metabólitos secundários são
utilizados em escala industrial para a produção de inseticidas, corantes, flavorizantes,
aromatizantes e medicamentos (MARASCHIN; VERPOORTE, 1999). Existem vários
trabalhos que reportam a constituição fitoquímica de extratos vegetais, mas poucos estudos
reportam quais são as substancias responsáveis pelas atividades antimicrobianas destes
compostos. Portanto, é fundamental conhecer a classe dos componentes ativos através de
técnicas espectrométricas (MOREIRA et al., 2007).
Óleos essenciais são substâncias com alta volatilidade, odoríferas, líquidas e
lipofílicas, resultantes do metabolismo secundário das plantas e apresentam um elevado
potencial biológico, principalmente quanto à atividade antibacteriana e antifúngica. Do
ponto de vista farmacológico podem conter mais de 100 compostos orgânicos, sendo
terpenos e fenilpropenos os mais encontrados (CASTRO et al., 2004). Seu uso como
agentes medicinais é conhecido desde a antiguidade, em geral os óleos essenciais podem
apresentar propriedades antimicrobiana, anti-inflamatória, antisséptica, antioxidantes,
antifúngica, anticarcinogênicos entre outros, sendo produtos purificados e de alto efeito
comercial nas indústrias farmacêuticas, alimentícia, entre outras (SKOCIBUSI´C; BEZIC;
DUNKIC, 2006).
O Brasil, detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, possui
uma grande diversidade genética vegetal ainda pouco explorada. Dados revelam que
apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal (PINTO et
al, 2002). Essa grande diversidade genética vegetal que representa aproximadamente um
terço da flora mundial é promissora em compostos com potencial bioativo (YUNES et al,
2001). Essa riqueza necessita ser mais explorada, pois compostos potencialmente úteis
podem ser perdidos, deixando de serem descobertos, devido à extinção de algumas
espécies (PATINÕ; CUCA, 2011).
5
A Organização Mundial de Saúde, desde 1977, incentiva estudos que avaliem
cientificamente os benefícios e riscos do uso tradicional de plantas como medicamentos.
São necessárias evidências laboratoriais e clínicas a respeito da eficácia dessas plantas
medicinais utilizadas tradicionalmente pela população (LOGUERCIO et al, 2005).
Metabólitos secundários, produzidos por algumas espécies de plantas, são alvos de
maior interesse, pois agem como substâncias de defesa contra micro-organismos
patogênicos, insetos e animais herbívoros. Possuem composição química variada com
presença de terpenóides, alcalóides e cumarinas, que apresentam, com freqüência,
atividade antimicrobiana (RESCHKE et al, 2007).
Com esta perspectiva, é fundamental avaliar, a partir de técnicas microbiológicas
modernas e padronizadas, a atividade de extratos vegetais e óleos essenciais sobre
diferentes sorotipos de Salmonella e diferentes patógenos comumente relacionados com
doenças hospitalares.
2.3 Avaliação da atividade antimicrobiana
Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade antimicrobiana e
antifúngica dos extratos vegetais e óleo essencial, sendo que os mais conhecidos incluem:
método de difusão em ágar e o método de diluição em caldo (OSTROSKY et al., 2008).
São técnicas usualmente aceitas internacionalmente para medir quantitativamente a
atividade in vitro de um agente antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano,
sendo estas técnicas padronizadas para o uso de antimicrobianos comerciais (CLSI, 2003;
CLSI, 2006).
Pesquisas realizadas anteriormente por diversos autores com o objetivo de avaliar
métodos de avaliação de extratos vegetais e óleo essencial, sugerem uso de diferentes
metodologias para que os resultados possam ser comparados com estudos de diferentes
grupos de pesquisas (OSTROSKY et al., 2008; OTHMAN et al., 2011).
2.4 Cromatografia
Os óleos essenciais podem conter de 20 a 60, ou ainda mais, compostos diversos e
nas mais variadas concentrações (BAKKALI et al., 2008). A análise dos óleos essenciais
requer a aplicação de métodos analíticos atuais e instrumentação adaptada que permitam
avaliar a qualidade do óleo essencial e garantir a identificação de seus constituintes.
6
A cromatografia pode ser acoplada a diferentes sistemas de detecção, e trata-se de
uma das técnicas analíticas mais utilizadas e de melhor desempenho. O acoplamento do
cromatógrafo com um espectrômetro de massas (CG-EM) associa as vantagens da
cromatografia, que é a alta seletividade e eficiência de separação, com as vantagens da
espectrometria de massas, que é obtenção de informação estrutural, massa molar e aumento
adicional da seletividade. Esta técnica permite a separação dos constituintes pela
cromatografia gasosa, que são introduzidos individualmente em ordem de eluição na
câmera de ionização do espectrômetro de massas. O espectro de massas obtido para cada
um dos constituintes geralmente indica a massa molecular e o seu padrão de fragmentação.
O padrão de fragmentação pode ser comparado eletronicamente com aqueles constantes da
biblioteca de espectros de massas (AVATO et al., 2005).
Desse modo, é possível resolver picos cromatográficos parcialmente superpostos.
Assim, a espectrometria de massas acoplada à cromatografia gasosa fornece as
fragmentações dos componentes individuais separados (TAVARES et al., 2005).
A CG-EM é aplicável a compostos voláteis (como os óleos essenciais) e
termicamente estáveis nas temperaturas relativamente elevadas empregadas durante o
processo de separação cromatográfica (ARDREY, 2003).
A identificação de componentes de óleos voláteis tem feito o uso de CG e de CG-
MS em associação com a determinação do índice de Kovats. Este procedimento vem sendo
aplicado com sucesso na identificação de substâncias de estruturas conhecidas porque, em
sua maioria, os dados gerados podem ser comparados diretamente com os valores de tempo
de retenção (índice de retenção) obtidos em colunas de polaridades diferentes e com os
espectros de massas dos constituintes voláteis publicados (ADAMS, 2007).
2.5 Atividade Antioxidante
Um antioxidante é uma substancia sintética ou natural acrescida em produtos para
prevenir ou retardar a deterioração desses produtos através da ação do oxigênio presente no
ar. Para bioquímica e a medicina, os antioxidantes são enzimas ou substancias orgânicas,
como vitamina E ou β-caroteno, capazes de atuar contra os danos da oxidação nos tecidos
animais. Os antioxidantes naturais ou sintéticos interferem na participação do oxigenio e
atuam como inibidores de reação, fazendo papel ou de doadores de hidrogênio ou de
receptores de raicais livres dos ádicos graxos. (HUANG et al., 2005).
7
Os antioxidantes podem ser classificados em dois grupos: primários e secundários.
Os primários são aqueles que interrompem a cadeia de reações envolvidas na oxidação
lipídica através da doação de elétrons ou hidrogênio aos radicais livres, fazendo assim a
conversão deles em produtos mais estáveis. Os secundários são compostos que reduzem ou
diminuem a taxa de iniciação da oxidação, através da decomposição de hidroperóxidos
(SHAHIDI; NACZK, 2004).
A medida da habilidade antioxidante reflete a ação acumulada de todos os
antioxidantes que estiverem presentes em um extrato ou amostra biológica,
proporcionando, desta forma, uma analise de parâmetros associados. A capacidade
antioxidante pode ser considerada um marcador sensível e confiável para detectar
mudanças no estresse oxidativo in vivo, provendo ajuda no esclarecimento de fatores
fisiológicos e nutricionais importantes, e ainda, suprindo informações sobre absorção e
biodisponibilidade de compostos antioxidantes (GHISELLI et al., 2000).
Portanto, o interesse pela pesquisa sobre novos antioxidantes naturais tem
aumentado nos últimos anos, levando as indústrias de alimentos, de cosméticos e
farmacêuticos a ter maior atenção em novas fontes, principalmente às de origem vegetal.
Os antioxidantes vegetais são de natureza muito variada, mas os compostos fenólicos têm
sido apontados como responsáveis por maior capacidade antioxidante, sendo representados
pelos flavonóides e isoflavonóides, taninos, lignanas, xantonas e outros (RAZAVI et al.,
2008).
São várias as metodologias utilizadas para determinar a capacidade antioxidante de
uma amostra, portanto estão sujeitas a interferências e também se baseiam em diversos
fundamentos. Um método frequentemente utilizado para avaliar a capacidade antioxidante
se dá através da medição do sequestro de radicais livres. Ele se fundamenta na habilidade
de antioxidantes, que estão presentes na amostra, se ligarem com o DPPH, um radical
orgânico e estável. É um método tecnicamente rápido e não detecta agentes pró oxidantes,
sendo que determina apenas o poder redutor dos compostos analisados (BRAND-
WILLIANS et al 1995). Este método foi primeiramente descrito por Brand-Willians (1995)
e baseia-se na capacidade redutora dos antioxidantes presentes em uma amostra sobre o
DPPH, radical orgânico e estável, através de uma reação de transferência de elétrons, a
qual é medida através do decréscimo da absorbância a 515nm.
8
3. Capítulo 1: Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo 1
essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb. 2
3
Composição química, atividade antimicrobiana e antioxidante de óleo 4
essencial e diferentes extratos vegetais de Prunus myrtifolia (L.) Urb. 5
6
Journal of Food, Agriculture & Environment 7
8
9
10
Laís Dayane Weber, Fabiana Gisele da Silva Pinto, Mayara Camila Scur, Juliete Gomes de 11
Lara de Souza, Willian Ferreira da Costa 12
Weber, L.D.; Pinto, F.G.S.; Scur, M.C.; Souza, J.G.L.; Costa, W.F. 13
14
15
RESUMO 16
No presente estudo determinou-se a composição química de diferentes extratos 17
vegetais (aquoso, etanolico, acetato de etila e hexanico) e do óleo essencial de Prunus 18
myrtifolia (L.) Urb. (pessegueiro-bravo), através da triagem fitoquímica e CG/MS 19
respectivamente, bem como seu efeito antimicrobiano contra micro-organismos 20
patogênicos Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella Typhimurium (ATCC 21
14028), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), 22
Escherichia coli (ATCC 25922), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Staphylococcus 23
epidermidis (ATCC 12228), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtillis 24
(CCD-04) e Candida albicans (ATCC 10231) através da determinação dos valores de 25
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) 26
utilizando a técnica de diluição em caldo; e por fim buscou-se avaliar a atividade 27
antioxidante dos extratos vegetais e óleo essencial pelo método de captura de radicais 28
livres DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil). De maneira geral através da triagem fitoquimica 29
dos extratos verificou-se a presença de de metabolitos secundários como, flavonoides, 30
taninos (etanolico e aquoso), triterpenoides e saponinas (etanolico), que já se mostraram 31
9
ativas em diferentes estudos descritos na literatura. Em relação ao extrato hexânico 32
ausência de metabólitos secundários com atividade bacteriana. A maior classe de 33
compostos voláteis identificados no óleo de Prunus myrtifolia benzaldeido (97%) seguido 34
de 3-hexen-1-ol (0.07%) e Benzil e Benzoato (0.09%). Em sequência determinou-se o 35
efeito antimicrobiano para todos os produtos vegetais, exceto hexânico com uma discreta 36
tendência de maior susceptibilidade para as cepas Gram positivas. Os resultados apontam o 37
extrato aquoso e etanolicos como os mais efetivos os patógenos testados. Em relação ao 38
óleo, apresentou atividade antimicrobiana frente a todos patógenos avaliados. Em uma 39
terceira etapa do estudo verificou-se atividade antioxidantes entre os extratos aquoso, 40
etanolico e acetato de etila, sendo detectados baixos valores em relação ao extrato hexanico 41
e óleo essencial. Pelos resultados obtidos ficou estabelecida a capacidade antimicrobiana 42
dos produtos vegetais testados, bem como foi possível determinar a atividade antioxidante 43
dos mesmos. 44
45
46
Palavras-chave: Salmonella, extratos vegetais, microdiluição, bactericida, bacteriostático. 47
48
49
50
INTRODUÇÃO 51
O Brasil possui a maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta e 52
consequentemente uma grande diversidade genética vegetal pouco explorada. Em relação 53
ao potencial medicinal, apenas aproximadamente 17% das plantas foram estudadas 54
(PINTO et al, 2002). Devido essa grande diversidade o Brasil ganhou destaque na busca 55
por compostos com potencial bioativo (YUNES et al, 2001). Sendo necessária a 56
exploração desses vegetais, pois compostos potencialmente úteis podem ser perdidos, 57
deixando de serem descobertos, devido à extinção de algumas espécies (PATINÕ; CUCA, 58
2011). 59
A família Rosaceae compreende cerca de 100 gêneros e 3.000 espécies, sendo uma 60
das principais famílias do ponto de vista econômico, concentrada no Hemisfério Norte, 61
com poucas espécies nativas no Brasil (SOUZA; LORENZI, 2005). Fornece espécies que 62
10
detêm grande potencial nutricional e farmacológico sendo utilizadas na medicina popular 63
para o tratamento de diversas enfermidades e para a manutenção de boas condições de 64
saúde. O gênero Prunus é constituído por aproximadamente 130 espécies que ocorrem nas 65
regiões Norte, Sul e Sudeste do Brasil. Diversas frutas introduzidas e consumidas no Brasil 66
pertencem ao gênero Prunus, encontram-se o pêssego (P. persica), nectarina (P. persica 67
var. nucipersica), ameixa (P. domestica), amêndoa (P. dulcis) e a cereja (P. avium, P. 68
cerasus) (JUDD et al., 2002; SOUZA; LORENZI, 2005). 69
Quanto às espécies nativas do gênero Prunus, merece destaque Prunus myrtifolia 70
(L.) Urb. por ser uma espécie de ampla distribuição geográfica, (SOUZA; LORENZI, 71
2005), que possui como sinonimos Prunus sphaerocarpa Hook e Prunus sellowii Koehne. 72
P. myrtifolia é conhecida popularmente como pessegueiro-bravo, pessegueiro-do-mato, 73
miguel-pintado, coração-de-negro, marmelo-do-mato, coração-de-bugre, varova, varoveira 74
(LORENZI, 1992). 75
Nos últimos anos, a composição química, propriedades antibacterianas e 76
antioxidantes dos vegetais ganharam interesse na busca por produtos alternativos. Os óleos 77
essenciais podem conter de 20 a 60, ou ainda mais, compostos diversos e nas mais variadas 78
concentrações (BAKKALI et al., 2008). A análise requer a aplicação de métodos analíticos 79
atuais e instrumentação adaptada que permitam avaliar a qualidade do óleo essencial e 80
garantir a identificação de seus constituintes. Os metabólitos secundários, produzidos por 81
algumas espécies de plantas, são alvos de maior interesse, pois agem como substâncias de 82
defesa contra micro-organismos patogênicos, insetos e animais herbívoros. Possuem 83
composição química variada com presença de terpenóides, alcalóides e cumarinas, que 84
apresentam, com frequência, atividade antimicrobiana (RESCHKE et al, 2007). 85
Com o desenvolvimento progressivo da resistência aos antimicrobianos sintéticos, 86
as propriedades biológicas dos produtos vegetais vêm sendo estudadas em busca de 87
produtos alternativos com ação antimicrobiana (ARYA et al, 2010). Neste contexto, os 88
extratos vegetais e óleos essenciais destacam-se como eficientes antimicrobianos e a partir 89
disso, surgiu-se a curiosidade e necessidade de conhecer melhor as características dos 90
vegetais e constatação do potencial antimicrobiano dos extratos e óleos essenciais 91
(NUNES et al., 2006; ALMEIDA et al., 2006; ARRUDA et al., 2006). 92
A busca por novos antioxidantes naturais tem aumentado nos últimos anos, levando 93
11
as indústrias de alimentos, de cosméticos e farmacêuticos voltar pesquisas para material de 94
origem vegetal. Os antioxidantes vegetais são de natureza muito variada, mas os 95
compostos fenólicos têm sido apontados como responsáveis por maior capacidade 96
antioxidante, sendo representados pelos flavonóides e isoflavonóides, taninos, lignanas, 97
xantonas e outros (RAZAVI et al., 2008). 98
No presente estudo, determinou-se a composição química dos extratos vegetais e do 99
óleo essencial de Prunus myrtifolia (L.) Urb. (pessegueiro-bravo), bem como seu efeito 100
antimicrobiano contra micro-organismos patogênicos Pseudomonas aeruginosa ATCC 101
27853, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Proteus mirabilis ATCC 25933, 102
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus 103
faecalis ATCC 19433, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus 104
ATCC 25923, Bacillus subtillis CCD-04 e Candida albicans ATCC 10231; e por fim 105
buscou-se avaliar a atividade antioxidante dos extratos vegetais e óleo essencial. 106
107
MATERIAL E MÉTODOS 108
Material Vegetal 109
Folhas de Prunus myrtifolia foram coletadas na região Oeste do Paraná, Brasil. As 110
coletas foram realizadas de janeiro a fevereiro de 2013, sempre pelo período da manhã, de 111
acordo com a distribuição natural e disponibilidade da espécie. O material foi identificado 112
pela profª Drª Livia Godinho Temponi e incorporado no Herbário da Universidade 113
Estadual do Oeste do Paraná (UNOP). 114
As folhas coletadas foram secas em estufa com circulação de ar a 40 °C por 48h e 115
trituradas em moinho elétrico de facas. O pó da planta foi armazenado em recipiente 116
escuro, hermeticamente fechado, até ser usado para produção dos extratos e triagem 117
fitoquímica. 118
Obtenção do extrato aquoso 119
20 g de pó seco das plantas foi adicionado em 100 mL de água destilada e mantido 120
em agitador rotativo a 220 x g durante 24 h. Em seguida o material foi filtrado em papel de 121
filtro Whatman nº 1 e centrifugado a 5000 x g durante 15 min. O sobrenadante foi 122
recolhido, obtendo-se, desta forma, o extrato na concentração final de 200 mg/mL. Os 123
extratos obtidos foram armazenados em frascos hermeticamente fechados, sob abrigo da 124
12
luz a uma temperatura de 4º C (BONA et al., 2010). 125
Obtenção dos extratos orgânicos 126
Os extratos orgânicos foram obtidos segundo a metodologia descrita por Ceyahn et 127
al. (2012). Etanol (95%), acetato de etila e hexano foram utilizados como solventes 128
orgânicos. A partir de 10g de pó seco das plantas foi adicionado em 100 mL de solvente 129
orgânico e levado a um agitador rotativo a 220 x g por 24 h. Em seguida foi filtrado em 130
papel filtro Whatman nº 1 e centrifugado a 5000 x g durante 15 minutos. O sobrenadante 131
foi recolhido e submetido a roto-evaporadoção a temperatura máxima de 40ºC (Laboratório 132
de Farmacognosia, UNIOESTE), a fim de se retirar o solvente. O extrato obtido foi diluído 133
com água destilada estéril seguindo a proporção do seu peso, resultando em uma 134
concentração final de 400 mg/mL. Os extratos obtidos foram armazenados em frascos 135
hermeticamente fechados, sob abrigo da luz a uma temperatura de 4ºC. 136
Triagem fitoquímica 137
Os principais metabólitos secundários foram detectados de acordo com 138
metodologia desenvolvida por Wall et al (1954); Barbosa-Filho et al (1984) e Agra et al 139
(1990) na classificação química de 4.000 plantas diferentes, com modificações. 140
Extração óleo essencial 141
70 g de folhas frescas de Prunus myrtifolia foram submetidos a metodologia padrão 142
de arraste por vapor d’água durante 3 horas utilizando o equipamento tipo Clevenger. O 143
óleo foi recolhido diretamente sem a adição de qualquer solvente, e armazenado em frascos 144
escuros a 4 ° C. 145
Análise da composição química 146
Os constituintes do óleo essencial foram identificados através da cromatografia em 147
fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e pela determinação de seus 148
índices de retenção de Kovats (IK). 149
Cromatografia em fase gasosa acoplada ao espectrômetro de massas 150
As análises de GC-MS foram realizadas no Laboratório de Cromatografia Gasosa 151
acoplada à Espectrometria de Massas – COMCAP, Universidade Estadual de Maringá 152
(UEM), Paraná, Brasil. 153
A análise do óleo da Prunus myrtifolia foi realizada empregando um sistema CG-154
MS Thermo-Finigan, sendo realizadas em um sistema composto por um cromatógrafo em 155
13
fase gasosa FOCUS GC (Thermo Electron), acoplado a um espectrômetro de massas DSQ 156
II (Thermo Electron), empregando um detector com fonte de ionização por impacto de 157
elétrons de 70V e analisador de massas do tipo quadrupolo. As amostras foram injetadas 158
por um sistema automático de injeção modelo Triplus (Thermo Electron). O programa 159
“Xcalibur” (“Thermo Electron”) foi empregado para à aquisição e processamento dos 160
dados. 161
A separação cromatográfica foi realizada por uma coluna capilar de sílica fundida 162
DB-5ms da “J&W Scientific” (30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 163
µm de fase estacionária de composição de 5% fenil e 95% dimetilpolissiloxano). O gás de 164
arraste empregado foi o gás hélio 5.0. 165
A temperatura do injetor foi de 250 °C e a vazão do gás de arraste foi mantida 166
constante a 1,0 mL.min-1
. A amostra e os padrões dos alcanos foram injetados no modo 167
split com na razão de 1:25. A programação de temperatura empregada foi: temperatura 168
inicial 50 oC mantida por 2 min, aumento da temperatura para 180
oC a uma razão de 2,0 169
oC.min
-1 seguida de aumento para 290
oC a uma razão de 5,0
oC.min
-1. A interface entre o 170
CG e o EM foi mantida em 270 °C e a temperatura da fonte de ionização do espectrômetro 171
de massas foi de 250 °C. A faixa da razão massa/carga monitorada foi de 50-500 m/z. 172
Índice de retenção de Kovats 173
O cálculo do índice de retenção de Kovats foi baseado no emprego de uma mistura 174
de padrões de alcanos (C7 a C28). As amostras foram diluídas em n-hexano e analisada. 175
Os índices de retenção dos compostos foram determinados com a equação proposta por 176
(VAN DEN DOOL; KRATZ, 1963): 177
A identificação dos componentes foi baseada na comparação de seus espectros de 178
massas com os obtidos através dos espectros de massas da biblioteca espectral “NIST MS 179
Search 2.0” contida no software “Xcalibur” que acompanha o equipamento e pela 180
comparação dos seus índices de retenção de Kovats, obtidos experimentalmente, com os 181
dados de índice de retenção de Kovats obtidos na literatura para os mesmos compostos 182
analisados empregando a mesma coluna. 183
Micro-organismos utilizados 184
Para a realização do teste da atividade antimicrobiana do óleo essencial e extratos 185
vegetais de Prunus myrtifolia foram utilizados 5 patógenos Gram negativo, sendo eles, 186
14
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Proteus 187
mirabilis ATCC 25933, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e Escherichia coli ATCC 188
25922; 4 patógenos Gram positivo, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Staphylococcus 189
epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Bacillus subtillis CCD-190
04 e Candida albicans ATCC 10231 como levedura. 191
Os micro-organismos previamente mantidos a -20 °C foram recuperadas em meio 192
enriquecido, “Brain Heart Infusion” (BHI) e incubados a 36 °C por 24h. Após esse 193
período, foram ressuspensas em solução salina estéril a 0,9% (p/v) para se obter o inóculo 194
padrão a uma concentração de 1x108 UFC/mL na escala de MacFarland. Posteriormente 195
foram realizadas diluições em solução salina estéril (0,9% p/v) a fim de se obter um 196
inóculo final na concentração de 1x105 UFC/mL. Com exceção da Candida albicans que é 197
utilizada na concentração final de 1x106 UFC/mL. 198
Determinação da Concentração inibitória mínima (CIM) 199
Óleo essencial 200
A CIM do óleo essencial foi determinada pela técnica de microdiluição em caldo 201
proposta por Santurio et al. (2011) com modificações. Após pesagem de 70 mg do óleo 202
essencial foi diluído com metanol até atingir a concentração de 70 mg.mL-1
(solução I). A 203
seguir, foi diluído na proporção de 1:10 em Caldo Muller-Hinton (MH) para todos os 204
micro-organimos exceto Candida albicas que utilizou-se RPMI, obtendo-se a concentração 205
de 7000 µg.mL-1
(solução II). Com base no documento M31-A3 do CLSI (2008), volumes 206
de 100 µL da solução II foram adicionados ao primeiro poço e, após homogeneização, 207
realizou-se diluições sucessivas obtendo-se concentrações finais de 13.67 a 3500 µg.mL-1
. 208
Alíquotas (10 µL) da diluição dos micro-organismos foram distribuídas em cada poço já 209
contendo o óleo essencial em suas diluições finais. As placas foram incubadas a 36 °C por 210
24 h. Após avaliação visual dos resultados, cada poço recebeu uma alíquota de 10 µL de 211
cloreto trifenil de tetrazólio (CTT) a 0,5%, re-incubaram por 3h a 36 °C. A CIM foi 212
definida como a menor concentração do extrato em mg.mL-1
capaz de impedir o 213
crescimento microbiano (SARTORATTO et al., 2004). 214
Extratos vegetais 215
A CIM dos extratos foi determinada pela técnica da microdiluição em caldo 216
proposta por Ayres et al. (2008). Alíquotas (10 µL) da diluição foram distribuídas em 217
15
placas de 96 poços de microtitulação contendo 150 µL de caldo MH (concentração dupla), 218
com a adição anterior dos extratos. Os extratos foram diluídos em concentrações entre 0,04 219
e 100 mg/mL para o extrato aquoso, entre 0,035 e 75 mg/mL
para o extrato etanólico e 220
acetato de etila entre 0,0012 e 3 mg/mL para o extrato hexânico. As placas foram 221
incubadas a 36 °C por 24 h. Após avaliação visual seguiu-se os mesmos padrões de 222
avaliação que óleo essencial. 223
Determinação da Concentração bactericida mínima (CBM) 224
A CBM foi determinada com base na metodologia descrita por SANTURIO et al. 225
(2007). A partir dos poços onde não houve crescimento bacteriano visível no teste da CIM, 226
anterior a adição de CTT, foi retirada uma alíquota de 10 μL e inoculada na superfície do 227
ágar MH. As placas foram incubadas por 24h a 36 ºC e após foi definida a CBM como a 228
menor concentração do extrato capaz de causar a morte do inóculo. Os ensaios de CIM e 229
CBM foram realizados em triplicata. 230
Água destilada, etanol, acetato de etila e hexano foram usados como controle 231
negativo. Gentamicina foi utilizada como controle positiva para as bactérias e Nistatina 232
para C. albicans (Tabela 1). Os antimicrobianos sintéticos foram testados nas 233
concentrações de 0.78 a 100 mg/mL. 234
Tabela 1. Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima
(CBM) de água destilada, solventes orgânicos e antimicrobianos referência frente a micro-
organismos patogênicos.
CIM/CBM (mg/mL)
Micro-organimos Água
Destilada Etanol
Acetato de
etila Hexano Gentamicina Nistatina
P. aeruginosa ATCC 27853 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt
S. Typhimurium ATCC 14028 Na Na Na Na 3.125/6.25 Nt
P. mirabilis ATCC 25933 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt
K. pneumoniae ATCC 13883 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt
E. coli ATCC 25922 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt
E. faecalis ATCC 19433 Na Na Na Na 3.125/6.25 Nt
S. epidermidis ATCC 12228 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt
16
S. aureus ATCC 25923 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt
B. subtillis CCD-04 Na Na Na Na 6.25/6.25 Nt
C. albicans ATCC 10231 Na Na Na Na Nt 6.25/6.25
*Na: Sem atividade; Nt: não foi testado
Atividade antioxidante 235
A atividade antioxidante foi determinada pelo método de captura de radicais livres 236
DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil) baseado na metodologia preconizada por Scherer e 237
Godoy (2009) com modificações. Para a análise das amostras, 0,1 mL de cada diluição das 238
amostras ou padrões foram adicionados em tubos de ensaio que continham 3,9 mL do 239
radical DPPH (0,2 mM) diluído em metanol e homogeneizados em agitador de tubos. Para 240
o controle negativo, foi utilizado 0,1 mL de solução controle (álcool metílico, acetona e 241
água) com 3,9 mL do radical DPPH e homogeneizados. Como controle positivo utilizou-se 242
o antioxidante sintético BHT (butil hidroxi tolueno) e seguiu-se o mesmo procedimento do 243
controle negativo. Como branco foi utilizado álcool metílico, afim de calibrar o 244
espectrofotômetro. Todas as análises foram realizadas em triplicata. As leituras (λ = 515 245
nm) foram monitoradas a cada 30 minutos, até a estabilização da absorbância. 246
O índice DPPH foi calculado através da equação 1: I (%) = [(Abs0 -Abs1) /Abs0] 247
x100, onde Abs0 é a absorbância do branco e Abs1 é a absorbância da amostra. 248
Para o cálculo dos valores de IC50 (concentração do óleo/extrato necessário para 249
reduzir 50% do radical DPPH), utilizou-se as equações 250
251
252
RESULTADOS E DISCUSSÃO 253
Os testes realizados, na triagem fitoquímica (Tabela 2), revelaram que o extrato 254
aquoso apresenta apenas a classe dos taninos e flavonoides. O extrato etanolico foi o que 255
revelou maior número de classes de substâncias: taninos, saponinas, terpenos e 256
flavonoides. O extrato com o solvente acetato de etila revelou apenas a classe de 257
substancias dos flavonoides e o extrato hexânico não apresentou resultado positivo para as 258
classes de substanciais testadas. 259
Tabela 2. Classes de metabólitos secundários identificados nos diferentes 260 extratos de Prunus myrtifolia 261
EXTRATOS
17
Classes de
metabólitos
Aquoso Etanolico Acetato de
Etila
Hexânico
Taninos + + - -
Alcaloides - - - -
Cumarinas - - - -
Saponinas - + - -
Antocianinas - - - -
Antocianidinas - - - -
Flavonoides + + + -
Triterpenoides - + - -
Esteroides - - - - *- ausente + presente 262
263
Sabe-se que a constituição química de Rosaceae inclui especialmente taninos (OKUDA 264
et al., 1992), flavonóides (HARBONE, 1988; CHALLICE et al., 1972), além de triterpenos 265
e esteróides (WALLAART, 1980). 266
A maior classe de compostos voláteis identificados no óleo de Prunus myrtifolia 267
pertence aos aldeidos os quais representaram cerca de 97% da área total de picos. Em 268
sequência foram identificados em porcentagens inferiores as classes de álcoois (3-hexen-1-269
ol) e ésteres (Benzil e Benzoato) com 0,07 e 0,09% de área total de pico, respectivamente. 270
(Tabela 3). 271
Tabela 3. Composição química do óleo essencial de Prunus myrtifolia 272
Componentes Area (%) IK* IK** TR*
3-Hexen-1-ol 0.07 852 845(1)
5.74
Benzaldeido 96.96 964 962(2)
10.22
Benzil, benzoato 0.09 1759 1765(3)
57.22 * IK – índice de Kovats calculado ** IK – índice de Kovats literatura *Tempo de retenção 273
274 A principal classe de compostos voláteis no óleo do gênero Prunus é aldeídos, 275
tendo como composto majoritário Benzaldeido em sua composição química (MAIA; 276
GODOY, 1984; IBARRA-ALVARADO et al., 2009). O benzaldeído é resultado da 277
hidrólise enzimática de amigdalina, que ocorre com a liberação de cianeto de hidrogênio e 278
duas moléculas de glicose (TATSUMA et al., 1998). Além disto, o benzaldeido é um dos 279
principais componentes responsáveis pelo odor característico dos óleos essenciais 280
(KERDOGAN-ORHAN e KARTAL, 2011). Diversas atividades biológicas, como 281
antimicrobiana e antifúngica, são atribuídas a presença de compostos como benzaldeido 282
(DU et al., 2002; FUJI et al., 2005). 283
18
Os resultados presentes na Tabela 4 indicam que o óleo essencial e extratos 284
apresentaram atividade antimicrobiana para todas as cepas testadas, embora para o extrato 285
hexânico a CBM foi maior do que o limite de detecção. 286
Tabela 4. Concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima
(CBM) de óleo essencial e extratos vegetais de Prunus myrtifolia frente a micro-organismos
patogênicos.
CIM/CBM (mg/mL)
Micro-organimos
Óleo
essencial
(µg/mL)
Aquoso Etanolico Acetato de
Etila Hexânico
P. aeruginosa ATCC 27853 3500/3500 12.5/12.5 9.38/18.75 37.5/75 3/>LD
S. Typhimurium ATCC 14028 1750/3500 12.5/25 18.75/37.5 150/150 3/>LD
P. mirabilis ATCC 25933 3500/7000 12.5/12.5 18.75/18.75 37.5/75 3/>LD
K. pneumoniae ATCC 13883 3500/7000 12,5/12,5 18.75/37.5 37.5/37.5 3/>LD
E. coli ATCC 25922 1750/7000 12.5/25 9.38/37.5 37.5/75 3/>LD
E. faecalis ATCC 19433 1750/7000 12.5/25 9.38/18.75 9.38/18.75 3/>LD
S. epidermidis ATCC 12228 3500/7000 1.56/1.56 1.18/2.35 4.69/9.38 3/>LD
S. aureus ATCC 25923 3500/7000 0.04/0.09 0.07/0.15 2.34/4.68 3/>LD
B. subtillis CCD-04 3500/7000 3.13/6.25 4.69/4.69 4.69/9.38 3/>LD
C. albicans ATCC 10231 3500/7000 6.25/6.25 4.69/9.37 9.38/9.38 3/>LD
>LD: Maior que o limite de detecção
O óleo essencial apresentou atividade bacteriostática de 1750 a 3500 µg/mL 287
enquanto sua atividade bactericida foi em sua maioria de 7000 µg/mL, sendo que apenas P. 288
aeruginosa e S. Typhimurium apresentaram CBM de 3500 µg/mL. A atividade encontrada 289
no óleo pode ser devido à presença em sua composição do benzaldeido. Segundo Alanri et 290
al. (2012) derivados de benzaldeido são amplamente utilizados como compostos 291
antimicrobianos de modo ambientalmente seguro, considerando seu amplo espectro de 292
efeito inibidor, que são empregados como agente bactericida e fungicida. Benzaldeídos 293
assemelham fenóis na atividade antibacteriana interagindo com a superfície da célula e 294
levando a morte celular por meio da desintegração da membrana celular e liberação de 295
19
componentes intracelulares (ALANRI et al., 2012). 296
Em relação a atividade antimicrobiana encontrada nos extratos verificou-se uma 297
variação frente aos diferentes extratores utilizados. Para extrato aquoso observou-se 298
variação na CIM de 0.04 a 12.5 mg/mL e CBM de 0.09 a 25 mg/mL. O extrato etanolico 299
apresentou atividade bacteriostática variando entre 0.07-18.75 mg/mL e bactericida entre 300
0.15-37.5 mg/mL. O extrato de acetato de etila apresentou valores de CIM de 2.34 a 150 301
mg/mL e CBM de 4.68 a 150 mg/mL. E por fim, para o extrato hexânico todas as cepas 302
apresentaram valores de CIM de 3 mg/mL contudo a atividade bactericida não foi 303
detectada na concentração testada. 304
Yigit, et al. (2009) reportaram antibacteriana para os extratos etanolicos e aquosos 305
de Prunus armeniaca L. kernels frente a Gram negativa e positiva e a leveduras como 306
Candida albicans, corroborando com os dados encontrados em nossa pesquisa. 307
A atividade antibacteriana observada nos extratos aquoso, etanolico e acetato de 308
etila (Tabela 2) pode estar relacionada a presença de metabolitos secundários como, 309
flavonoides, taninos (etanolico e aquoso), triterpenoides e saponinas (etanolico), que já se 310
mostraram ativas em diferentes estudos descritos na literatura (RECIO et al., 1989). Em 311
relação ao extrato hexânico a não detecção da atividade bactericida pode ser devido à 312
ausência de metabólitos secundários com atividade bacteriana. 313
Um crescente número de mecanismos de ação inibitória tem sido atribuído a 314
compostos ativos presentes nos extratos vegetais. TALEB-CONTINI et al (2003) 315
avaliaram a atividade antimicrobiana de flavonoides isolados e constataram sua atividade 316
antibacteriana, principalmente frente a micro-organismos Gram positivos. Os flavonoides 317
agem na célula bacteriana através de complexos entre proteínas e a parede celular 318
bacteriana, ocasionando seu rompimento (TAGURI et al., 2004). Os taninos agem nos 319
micro-organismos impedindo seu crescimento, através da formação de complexos entre o 320
mesmo e a parede celular ou enzimas extra celulares secretadas, fazendo com que ocorra a 321
inibição do transporte de nutrientes para a célula (McSWEENEY et al., 2001). Estudos 322
sugerem que o mecanismo de ação dos triterpenos nos micro-organismos está relacionado 323
ao rompimento de compostos lipofílicos das membranas microbianas (BAGAMBOULA et 324
al., 2004). As saponinas são compostos que também possuem atividades biológicas como, 325
antilevadura e antibacteriano, agindo nos esteróis da membrana ativamente (KILLEEN et 326
20
al., 1998; SPARG et al., 2004) 327
No geral, os extratos aquoso e etanolico apresentaram melhores valores em 328
relação a CIM e CBM frente a todas as cepas testadas. Já o extrato acetato de etila 329
apresentou uma variação frente a atividade antimicrobiana em relação a Gram negativa, 330
onde apresentaram altos valores de CIM e CBM e em contrapartida as cepas Gram 331
positivas e leveduras quando analisados a CIM e CBM apresentaram maior suscetibilidade 332
ao extrato. A membrana externa tem constituição diferente conforme a bactéria seja Gram 333
negativa ou positiva. Entretanto, todas tem uma camada comum, o peptideoglicano que 334
serve como barreira de penetração para macromoléculas e compostos hidrofóbicos, e 335
consequentemente as tornam menos suscetíveis aos agentes antimicrobianos (TADEG et 336
al., 2005). Sendo justificada pela presença de flavonoides que possuem atividade 337
antimicrobiana principalmente em Gram positiva (TALEB-CONTINI et al., 2003). 338
O teste químico utilizado para a detecção de atividade antioxidante através do 339
sequestrador de radical DPPH, através do cálculo do índice de DPPH (Figura 1) e do IC50 340
(Tabela 5). 341
342
Figura 1. Índice de DPPH do óleo essencial e extratos vegetais de Prunus myrtifolia 343
nas diferentes concentrações testadas 344
345
346
347
21
Tabela 4. IC50 do óleo essencial e extratos vegetais de Prunus myrtifolia nas diferentes 348
concentrações testadas 349
Testes IC50
Controle 191,5
BHT 11,54
Oleo 1 167,36
Oleo 2 179,11
Oleo 3 184,72
Aquoso 1 14,45
Aquoso 2 21,9
Aquoso 3 23
Etanolico 1 15,9
Etanolico 2 15,27
Etanolico 3 13,54
Acetato de etila 1 14,27
Acetato de etila 2 53
Acetato de etila 3 62,09
Hexano 1 186,36
Hexano 2 186,45
Hexano 3 187,18
350
Quanto ao índice de DPPH o extrato aquoso e etanolicos nas diferentes 351
concentrações testadas apresentaram porcentagem de sequestro de DPPH aproximadas as 352
porcentagens encontradas para o BHT, antioxidante sintético comercializado, utilizado 353
como controle positivo. Variando de 89.73 a 94.77%, enquanto o índice de sequestro para 354
o BHT foi de 95.83%. Em relação ao extrato de acetato de etila houve uma redução 355
significativa no índice de sequestro quando comparadas as diferentes concentrações 356
avaliadas. 357
Segundo GAO (1999), os compostos fenólicos, como flavonoides, triterpenos e 358
taninos são polares e doadores de elétrons, portanto excelentes antioxidantes. Compostos 359
estes que foram encontrados na triagem fitoquímicas dos extratos testados (Tabela 2). O 360
flavonoides podem bloquear em grande escala efeitos enzimáticos, inclusive os que estão 361
associados a divisão celular (HOLLMAN, 1999). Foram relatados dados 362
etnofarmacológicos na literatura do gênero Prunus sobre a relação da atividade 363
antioxidante correlacionada com a presença de flavonoides (WANG et al., 1999; 364
NAKATANI et al., 2000). YGIT et al. (2012) reportaram atividade antioxidante bastante 365
22
significativa com valores de índice sequestro de DPPH iguais ou superiores aos 366
encontrados no BHT e extratos aquoso e etanolico. 367
O óleo essencial e extrato hexânico nas diferentes concentrações testadas 368
presentaram índice de DPPH relativamente baixos, não podendo ser detectada atividade. 369
Os valores encontrados no óleo essencial se devem a presença do seu composto 370
majoritário, benzaldeido, que conforme citado na literatura apresenta atividade 371
antioxidante de moderada a fraca (THANH; HOEI, 2012). Já o extrato hexânico 372
justificasse a ausência da atividade antioxidante devido à inexistência de metabolitos 373
secundários presentes no extrato que exerçam tal função. 374
Os valores do IC50 estão diretamente relacionados à porcentagem de sequestro do 375
DPPH, sendo inversamente proporcional (quanto maior o índice de sequestro menos o 376
IC50), portanto a relação dos dados permanece a mesma. 377
Gênero Prunus apresenta importância econômica na área de alimentos e 378
fitofármacos, sendo reportados na literatura mais de 100 patentes envolvendo diferentes 379
espécies de Prunus em sua formulação, com diversas finalidades: cosméticos clareadores 380
da pele (YAGI; NAGARUMA, 1998); protetores solares (HEO et al., 2001), como 381
alimento na pecuária (KHANAL, 2001), antimalárica (MUNOZ et al., 2000) e 382
hipotensivo (PIERONI, 2000). 383
Destaca-se a importância dos estudos fitoquímicos uma vez que através dos 384
mesmos justificam-se as atividades biológicas encontradas. Vale ressaltar a importância de 385
estudos preliminares para determinar a atividade desses compostos afim de que sirvam 386
como base para estudos posteriores a fim de isolar diferentes compostos com atividade 387
antimicrobiana. Em relação à atividade antioxidante ressalta-se a importância na 388
determinação da mesma uma vez que há necessidade de que o composto seja 389
antimicrobiano e antioxidante ao mesmo tempo. 390
391
392
CONCLUSÃO 393
O estudo químico de Prunus myrtifolia demonstra estar de acordo com relatos 394
encontrados na literatura no que concerne a química do gênero Prunus. Foram 395
identificados flavonoides, terpenoides, entre outros metabólitos especiais no extrato 396
23
vegetal aquoso, etanolico e acetato de etila. Com relação ao óleo essencial como composto 397
majoritário foi encontrado o Benzaldeido. Em relação a atividade antimicrobiana os micro-398
organismos se mostraram suscetíveis quando avaliados frente aos extratos vegetais aquoso, 399
etanolico e acetato de etila e óleo essencial, demonstrando potencial efeito antimicrobiano 400
da Prunus myrtifolia. Quanto à atividade antioxidade, os extratos alcoolico, aquoso e de 401
acetato de etila expressaram valores significativos comparáveis a antioxidantes sintéticos. 402
403
404
AGRADECIMENTO (S) 405
A Capes, a Fundação Araucária e CNPq pelo financiamento e ao Parque Tecnológico 406
Itaipú pela bolsa. 407
408
409
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532
533
534
28
4. CAPÍTULO 2: Atividade Antimicrobiana de Extratos Vegetais de Seis Espécies 535
Nativas do Brasil no Controle de Salmonella de Origem Aviária. 536
537
Revista Brasileira de Plantas Medicinais 538
Atividade antimicrobiana de extratos vegetais de seis espécies nativas do Brasil no 539
controle de Salmonella de origem aviária. 540
[Antimicrobial activity of extracts from plants native to Brazil control of Salmonella 541
as avian origin] 542
543
RESUMO 544
Avaliou-se a atividade antimicrobiana in vitro dos extratos vegetais de seis plantas 545
nativas brasileiras frente a trinta e seis sorotipos de Salmonella de origem avícola. A 546
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM) dos 547
extratos aquosos e etanólicos das plantas Maytenus aquifolium Mart. (espinheira-santa), 548
Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (canela-549
branca), Psidium guajava L. (goiabeira), e Ricinus communis L. (mamona) e Schinus molle 550
L. (aroeira) foram determinadas por meio da técnica de microdiluição em caldo. Observou-551
se a atividade antimicrobiana de todos os extratos testados, sendo os etanólicos mais 552
eficazes quando comparados aos aquosos. Os extratos etanólicos de M. cauliflora e 553
P.guajava, apresentaram as maiores atividades inibitórias. As CIMs variaram entre 1,56-554
100 mg.mL-1
e a CBM entre 3,13-100 mg.mL-1
. Esses resultados confirmaram o potencial 555
antimicrobiano desses extratos vegetais, os quais merecem novas pesquisas abordando sua 556
possível adição na alimentação de aves. 557
558
ABSTRACT 559
It was evaluated in vitro antimicrobial activity of extracts of six native Brazilian 560
plants against 36 serotypes of Salmonella from poultry products. The Minimum Inhibitory 561
Concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the ethanolic and 562
aqueous extracts of Maytenus aquifolium Mart. (thorn-saint), Myrciaria cauliflora (Mart.) 563
O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (cinnamon-white), Psidium guajava 564
L. (guava), Ricinus communis L. (castor) and Schinus molle L. (mastic-white) were 565
29
determined by broth microdilution technique. It was observed antimicrobial activity of all 566
the extracts tested, ethanol being the most effective when compared to aqueous. Ethanol 567
extracts of M. cauliflora and P. guajava showed the highest inhibitory activity. The MIC 568
ranged from 1.56 to 100 mg.mL-1
and CBM from 3.13 to 100 mg.mL-1
. These results 569
confirmed the antimicrobial potential from these plant extracts, which deserve further 570
research addressing a possible addition in poultry feed. 571
572
Palavras-chave: Salmonella, extratos vegetais, microdiluição, bactericida, bacteriostático. 573
574
Key words: Salmonella, plant extracts, microdilution, bactericidal, bacteriostatic. 575
576
INTRODUÇÃO 577
O gênero Salmonella é um patógeno de difícil controle e comumente encontrado 578
em toda a cadeia de produção avícola e, consequentemente, na carne de frango, podendo 579
causar surtos de intoxicação alimentar em humanos e prejuízos econômicos à indústria 580
avícola (SHINOHARA et al., 2008). Fatores que contribuem para a patogenicidade de 581
Salmonella spp. são seu grande número de sorotipos, a capacidade de adaptação a vários 582
hospedeiros, além de sua predisposição de adquirir e transmitir alelos de resistência aos 583
antimicrobianos (EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY, 2008a). 584
Uma vez que o uso intensivo de agentes antimicrobianos conduziu a seleção de 585
Salmonella spp. resistentes, bem como a presença de resíduos destes agentes 586
antimicrobianos na carne e derivados podem causar problemas ambientais e à saúde 587
humana (EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY, 2008b), a utilização de produtos 588
naturais como potencial agente antimicrobiano chama a atenção das industrias na busca de 589
novos compostos que não agridam o meio ambiente (MESA-ARANGO et al., 2009). 590
Neste contexto, os extratos vegetais vêm ganhando espaço nas pesquisas para o 591
controle de diferentes micro-organismos patogênicos (NASCIMENTO et al., 2000; 592
LOGUERCIO et al., 2005; USHIMARU et al., 2007; GONÇALVES et al., 2005; 593
CARVALHO et al., 2009) e, por isso, tem-se buscado novas plantas, a fim de que os 594
extratos sejam considerados como um produto sanitário alternativo, seguro e saudável 595
quando comparado aos antimicrobianos sintéticos (DUARTE et al., 2004; LOVATTO et 596
30
al., 2012). 597
Não há dúvidas de que as plantas possuem propriedades biológicas, devido à rica 598
presença de princípios ativos, além de serem biodegradáveis e, o mais importante, serem 599
também abundantes e renováveis (GONÇALVES et al. 2005). 600
O Brasil ganhou destaque neste aspecto, por apresentar a maior biodiversidade do 601
planeta, e consequente potencial para o desenvolvimento de novos produtos de origem 602
vegetal. Além disso, muitas plantas têm sido utilizadas e testadas há dezenas de anos com 603
as mais diversas finalidades por populações do mundo inteiro (FERRONATO et al. 2007). 604
Contudo, grande parte das pesquisas realizadas mencionam testes de extratos frente 605
aos micro-organismos referência, sendo necessário o estabelecimento de parâmetros mais 606
precisos quanto ao real potencial antimicrobiano de extratos em diferentes sorotipos de 607
Salmonella, uma vez que se tem relatados de diversos sorotipos como responsáveis por 608
casos e surtos de salmonelose humana no Brasil e no exterior, muitos deles envolvendo 609
alimentos de origem avícola. (KOTTWITZ et al. 2008). 610
Nesta pesquisa, objetivou-se verificar o perfil de resistência dos diferentes 611
sorovares de Salmonella frente aos antimicrobianos sintéticos comumente utilizados na 612
avicultura, avaliar a atividade antimicrobiana de extratos etanólicos e aquosos de seis 613
espécies vegetais nativas do Brasil e verificar a eficiencia dos diferentes extratores 614
testados. 615
616
MATERIAL E MÉTODOS 617
Micro-organismos 618
Cento e dezoito amostras de Salmonella provenientes de frango de corte de 619
diferentes aviários da região Oeste do Paraná foram obtidas em um Laboratório de 620
Sanidade Avícola no Paraná, credenciado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e 621
Abastecimento (MAPA), durante o período de 2006 a 2010. A sorotipagem foi realizada 622
pelo Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil. 623
As amostras coletadas estavam distribuídas em trinta e seis sorotipos, e um 624
representante de cada sorotipo foi selecionado aleatoriamente para avaliar a suscetibilidade 625
aos extratos vegetais. Como cepa referência, utilizou-se a Salmonella Typhimurium ATCC 626
14028 (American Type Culture Collection). 627
31
628
Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos 629
A suscetibilidade aos antimicrobianos foi avaliada através da técnica de disco-630
difusão de Kirby-Bauer conforme recomendações do “Clinical and Laboratory Standards 631
Institute” (CLSI, 2007) utilizando-se os seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico (30 632
µg), ampicilina (10 µg), cloranfenicol (30 µg), cefalotina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg), 633
enrofloxacina (10 µg), estreptomicina (10 µg), imipenem (10 µg), gentamicina (10 µg), 634
norfloxacina (10 µg), sulfazotrin (25 µg), tetraciclina (30 µg) e tobramicina (10 µg). 635
Plantas utilizadas 636
637
Planta utilizadas 638
As plantas de Maytenus aquifolium Mart. (espinheira-santa), Myrciaria cauliflora 639
(Mart.) O. Berg (jabuticabeira), Ocotea spixiana (Nees) Mez. (canela-branca), Psidium 640
guajava L. (goiabeira), e Ricinus communis L. (mamona) e Schinus molle L. (aroeira) 641
foram coletadas sempre pela manhã em diferentes localidades na região Oeste do Paraná, 642
sendo selecionadas baseando-se em suas atividades inibitórias reportadas anteriormente 643
(SANCHES et al., 2005; FENNER et al.. 2006; CAFFARINI et al., 2008; MACEDO-644
COSTA et al., 2009; SANTOS-OLIVEIRA et al., 2009). Todas as plantas foram 645
identificadas e incorporadas no Herbário da Universidade Estadual do Oeste do Paraná 646
(UNOP). 647
648
Preparo extratos 649
As folhas coletadas foram secas a 40 ºC e moídas em moinho de facas até 650
granulometria inferior a 0,42 mm para obtenção do pó. Para a realização do extrato 651
etanólico, adicionou-se ao material vegetal triturado álcool etílico P.A. na proporção de 652
2:10 (p/v) para maceração por 24 h em agitador rotativo a 23 ºC. A concentração do extrato 653
realizou-se em evaporador rotativo a 40 ºC. O extrato obtido foi diluído com água destilada 654
estéril na concentração de 200 mg.mL-1
e filtrado em papel de filtro. Para a obtenção do 655
extrato aquoso, a maceração foi realizada utilizando-se como solvente extrator a água 656
destilada estéril, seguindo o mesmo padrão de concentração e filtragem do extrato 657
etanólico. Para ambos os extratos, uma última filtração a vácuo foi realizada, utilizando 658
32
uma membrana filtrante com porosidade de 0,45mm. As soluções foram armazenadas à 5 659
°C (BONA, 2012). 660
661
Determinação das concentrações inibitórias mínimas 662
As suspensões bacterianas foram diluídas a fim de se obter um inóculo na 663
concentração de 1 × 105 UFC.mL. A CIM dos extratos foi determinada pela técnica da 664
microdiluição em caldo proposta por Ayres et al. (2008). Alíquotas (15 µL) da diluição 665
foram distribuídas em placas de 96 poços de microtitulação contendo 150 µL de caldo 666
Mueller Hinton (MH) (concentração dupla), com a adição anterior dos extratos. Os extratos 667
foram diluídos em concentrações entre 0,04 e 100 mg.mL-1
. As placas foram incubadas a 668
36 °C por 24 h. Após avaliação visual dos resultados, cada poço recebeu uma alíquota de 669
10 µL de cloreto trifenil de tetrazólio (CTT) a 0,5%, re-incubaram por 3h a 36 °C. A CIM 670
foi definida como a menor concentração do extrato em mg.mL-1
capaz de impedir o 671
crescimento microbiano (SARTORATTO et al., 2004). 672
673
Determinação das concentrações bactericidas mínimas 674
A CBM foi determinada com base na metodologia descrita por SANTURIO et al. 675
(2007). A partir dos poços onde não houve crescimento bacteriano visível no teste da CIM, 676
anterior a adição de CTT, foi retirada uma alíquota de 10 μL e inoculada na superfície do 677
ágar MH. As placas foram incubadas por 24h a 36 ºC e após foi definida a CBM como a 678
menor concentração do extrato capaz de causar a morte do inóculo. Os ensaios de CIM e 679
CBM foram realizados em triplicata. 680
681
RESULTADOS E DISCUSSÃO 682
No teste de suscetibilidade a antimicrobianos, 10 sorotipos de Salmonella 683
apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano, sendo eles: Lexington (AMP-684
CEF), Typhimurium e Infantis (GEN-NAL), Hadar (TET-NAL), Minnesota (NAL), 685
Cubana, Mbandaka, Newport, Enterica e Derby (TET). Porém, não foi estabelecida uma 686
relação entre o perfil de resistência destes sorotipos com a suscetibilidade aos extratos 687
(Tabela 1). 688
Informações sobre os sorotipos de Salmonella presentes no ambiente avícola, 689
33
quanto à prevalência, resistência a antimicrobianos e procedência são importantes fatores 690
para o controle de contaminação e transmissão. A verificação de que a atividade dos 691
extratos é independente da suscetibilidade aos antimicrobianos testados, é uma importante 692
constatação para incentivar a futura utilização dos extratos vegetais em substituição aos 693
antimicrobianos comerciais usados na alimentação de aves. 694
O extrato etanólico de M. cauliflora apresentou o maiores valores de CIM e CBM, 695
capaz de inibir o crescimento de todos os sorotipos, com a CIM variando entre 1,56 e 3,13 696
mg.mL-1
e CBM entre 3,13 e 6,25 mg.mL-1
(Tabela 1). Já o extrato aquoso apresentou CIM 697
e CBM entre 12,5 e 50 mg.mL-1
promovendo a inibição dos sorotipos Kentucky, 698
Corvallis, Cerro, Albany e Morehead a 12,5 mg. mL-1
(Tabela 2). 699
A atividade inibitória (bacteriostática e/ou bactericida) dos extratos da folha de M. 700
cauliflora pode estar relacionada à presença de compostos da classe do seu principal 701
constituinte, os taninos e em menores quantidades os flavonoides (SOUZA, 2007). 702
Um crescente número de mecanismos de ação inibitória tem sido atribuído a 703
compostos ativos presentes nos extratos vegetais. Nas bactérias, a atividade antimicrobiana 704
dos taninos levam à formação de complexos entre os mesmos e a parede celular ou 705
enzimas extra celulares secretadas, fazendo com que ocorra a inibição do transporte de 706
nutrientes para a célula, consequentemente retardando o crescimento do micro-organismo 707
(McSWEENEY et al., 2001). Já os flavonoides possuem atividade antimicrobiana 708
decorrente da desestruturação da parede celular e consequentemente destruição bacteriana, 709
destacando-se componentes como a quercetina e rutina, intimamente empregados como 710
fitoterápicos (TAGURI te al., 2004). Como também sua atividade antimicrobiana pode se 711
dar devido à inibição da atividade da DNA girasse e inibição do metabolismo energético da 712
bactéria (CUSHNIE; LAMB, 2006). Os flavonoides possuem como característica a 713
capacidade de atuarem na relação entre planta e micro-organismo devido ao fato de que a 714
ingestão dos mesmos pode interferir em diversos processos fisiológicos, bem como 715
apresentar atividade antimicrobiana (MENEZES, 2005; DJERIDANE et al., 2006). 716
Para S. molle o extrato etanólico apresentou CIM de 50 mg.mL-1
frente aos 717
sorotipos Morehead e Panamá e de 100 mg.mL-1
para os demais, não sendo detectados 718
valores de CBM. Os valores de CIM para extrato aquoso foram de 100 mg.mL-1
para todos 719
sorotipos e novamente não foram detectados os valores de CBM. 720
34
Não foram encontradas na literatura pesquisas sobre as propriedades 721
farmacológicas dos extratos aquosos ou etanólicos de S. molle. Porém, CARVALHO et al. 722
(2013) relataram que os compostos presentes em maior frequência na família 723
Anarcadiaceae são terpenoides e flavonoides. 724
Os terpenóides são considerados importantes alternativas no controle de patógenos 725
multirresistentes aos antimicrobianos convencionais (ZHANG; BASU, 2003). Sabe-se que 726
estes compostos possuem efeitos prejudiciais a parede celular bacteriana provocando sua 727
lise celular (TURINA et al., 2006). 728
O extrato etanólico de R. communis apresentou valores de CIM entre 12,5 e 25 729
mg.mL-1
para a maioria dos sorotipos, exceto para Rissen que apresentou CIM de 50 730
mg.mL-1
, Albany e Gallinarum de 100 mg.mL-1
. A CBM variou de 25 mg.mL-1
a 100 731
mg.mL-1
, e para 20 sorovares não foi detectável (Tabela 1). O extrato aquoso não 732
apresentou atividade inibitória para os sorotipos testados (Tabela 2). 733
A atividade inibitória de R. communis pode estar relacionada aos seus constituintes 734
como ricina e flavonoides como a rutina, antimicrobianos que atuam na inibição de 735
atividade enzimática dos micro-organismos (HENRIQUES et al., 2002). Um dos 736
problemas associados à utilização do extrato de mamona refere-se a presença de proteínas 737
tóxicas encontradas na mesma, das quais destaca-se a ricina. (JACKSON et al, 2006). 738
Sabe-se que esta é venenosa a humanos e insetos (LER, et al, 2006) podendo ser um fator 739
agravante para a utilização do extrato da mamona em ração de aves, sugerindo o 740
isolamento de compostos ou detoxicação do extrato. 741
Em relação ao extrato etanólico de P. guajava, observou-se inibição frente a todos 742
os sorotipos, sendo a CIM entre 3,13 e 6,25 mg.mL-1
e CBM 3,13 e 25 mg.mL-1
(Tabela 743
1). No entanto, o extrato aquoso apresentou atividade bacteriostática somente nas 744
concentrações mais elevadas (50-100 mg.mL-1
) e atividade bactericida foi de 100 mg.mL-1
745
frente a aproximadamente 50% dos sorotipos, exceto Albany que apresentou CMB de 50 746
mg.mL-1
(Tabela 2). 747
A presença de compostos como cumarinas, flavonoides como quercetina, 748
terpenoides e taninos justifica a atividade inibitória de P. guajava (GUTIÉRREZ et al., 749
2008; VARGAS-ALVAREZ et al., 2006). Foram encontradas na literatura relatos sobre a 750
atividade antimicrobiana de cumarinas (BASILE et al., 2009; CHIMENTI et al., 2010; 751
35
RAJA et al., 2011). Sua atividade antimicrobiana pode ser atribuída ao fato do anel de 752
cumarina levar à inibição da síntese do ácido nucleico bacteriano (ROSSELLI et al., 2007). 753
Provou-se que a adição de um grupo prenilo ao anel de cumarinas facilita a sua passagem 754
pela membrana bacteriana (STAVRI; GIBBONS, 2005). 755
Apenas o extrato etanólico de O. spixiana apresentou atividade antimicrobiana com 756
valores da CIM em 25 mg.mL-1
para todos os sorovares, exceto Senftenberg, que 757
apresentou CIM de 50 mg.mL-1
. Em relação à CBM, 50% dos sorovares apresentaram 758
concentrações entre 50-100 mg.mL-1
(Tabela 1). Já o extrato aquoso não apresentou 759
atividade inibitória dentro do limite de detecção (Tabela 2). 760
Não foram encontrados estudos fitoquímicos de extratos de O. spixiana, entretanto, 761
ZANIN; LORDELLO (2007) reportaram a presença de compostos alcaloides em cinquenta 762
e quatro espécies do gênero Ocotea. Segundo SAWER et al. (2005), alguns alcaloides 763
inibem a ação de bactérias gram-negativas causando lise celular e mudanças morfológicas. 764
Contudo, a atividade antimicrobiana pode ter outro mecanismo de ação uma vez que o 765
composto é conhecido por ser inibidor de síntese de DNA através da inibição da 766
topoisomerase (GUITTAT et al., 2003). 767
Para M. aquifolium, seu extrato etanólico também apresentou atividade 768
bacteriostática frente a todos os sorotipos de Salmonella, variando de 25 a 6,25 mg.mL-1
. 769
Contudo, a CBM foi determinada para menos de 40% dos sorotipos com valor de 100 770
mg.mL-1
exceto para S. Corvallis, pois, somente este sorotipo obteve a atividade 771
bacteriostática e bactericida nas concentrações de 6,25 mg.mL-1
e 12,5 mg.mL-1 772
respectivamente (Tabela 1). O extrato aquoso exibiu CIM de 50 a 100 mg.mL-1
para todos 773
os sorotipos e CBM maior do que o limite de detecção. 774
Embora não tenham sido encontrados na literatura trabalhos que explorem a 775
atividade de M. aquifolium, OLIVEIRA et al. (2009) afirmaram que o gênero Maytenus 776
possui propriedades fitoquímicas como a presença de terpenoides, taninos, alcaloides e 777
flavonoides, sendo compostos que podem atuar tanto na parede como na membrana da 778
célula. 779
Considerando os valores da CIM, foi possível verificar um potencial inibidor 780
decrescente dos extratos, sendo ele: M. cauliflora etanólico > P. guajava etanólico> M. 781
aquifolium etanólico > R. communis etanólico > M. cauliflora aquoso > O. spixiana 782
36
etanólico > M. aquifolium aquoso> P. guajava aquoso > S. molle etanólico > S. molle 783
aquoso. 784
De maneira geral, os extratos etanólicos apresentaram maior atividade inibitória 785
frente aos sorotipos de Salmonella quando comparados aos extratos aquosos. Devido à 786
diferença de polaridade, a extração aquosa e etanólica podem conferir a extração de 787
diferentes metabólitos, sendo a água capaz de extrair antocioninas, amidos, taninos, 788
saponinas, terpenoides, polipeptídeos e lecitinas, já o álcool, por sua vez, é responsável 789
pela extração além de taninos e terpenóides também de polifenois, poliacetilenos, esteróis, 790
alcaloides e os flavonoides (COWAN, 1999). Isto explica o fato de que em uma mesma 791
planta, diferentes extratos apresentarem resultados distintos. Como por exemplo, O. 792
spixina que devido à possível presença de alcaloides, que em sua maioria são extraídos 793
pelo etanol, justificando assim o fato da mesma não ter apresentado atividade no extrato 794
aquoso. 795
Além disso, a composição dos extratos pode também variar de acordo com as 796
condições ambientais, estações do ano em que foram coletadas, bem como, às diferentes 797
técnicas empregadas para avaliação da atividade, por não haver uma padronização 798
internacional para avaliação de extratos vegetais (ALVES et al., 2008; SANTURIO et al., 799
2011). Desta forma, é notória a necessidade da padronização de técnicas para avaliar a 800
atividade de extratos vegetais com o intuito de corroborar e assegurar os resultados 801
encontrados. 802
A sensibilidade aos antimicrobianos e aos extratos testados variou dependente do 803
sorotipo, conforme descrito anteriormente por CARRAMIÑANA et al., (2004), que 804
testaram a suscetibilidade de Salmonella spp., frente a diferentes antimicrobianos e 805
relacionam essa variação, também, à origem dos sorotipos. A explicação pode ser devido 806
às pressões seletivas que os sorotipos podem sofrer de acordo com a utilização de 807
diferentes antimicrobianos desenvolvendo resistência (WHO, 2000). 808
Sugere-se a realização de testes de toxicidade para atestar a segurança no uso dos 809
extratos vegetais com potencial antimicrobiano. RIZZO et al. (2010) relatam que dietas de 810
frango de corte contendo misturas de extratos vegetais promovem desempenho semelhante 811
ao obtido com dietas contendo antibióticos, sem qualquer efeito sobre as características de 812
carcaça e a utilização da energia e da proteína das dietas, demonstrando a seguridade da 813
37
sua utilização em substituição aos antimicrobianos convencionais. 814
Com isso, espera-se que o presente estudo contribua para busca de produtos 815
alternativos que assegurem a produção avícola, baseados em um cultivo sustentável, que 816
respeite o meio ambiente e que reduza as contaminações produzidas por Salmonellas no 817
ambiente de criação aviário. 818
819
CONCLUSÃO 820
Os extratos testados apresentaram atividade inibitória em diferentes concentrações 821
sobre os sorotipos de Salmonella variando de acordo com o solvente extrator. A 822
suscetibilidade aos extratos variou entre os sorotipos de Salmonella, independente da 823
resistência apresentada aos antimicrobianos testados. 824
825
AGRADECIMENTO (S) 826
Ao Dr. Alberto Bach por ter cedido os sorovares de Salmonella, a Capes, a Fundação 827
Araucária e CNPq pelo financiamento e ao Parque Tecnológico Itaipú pela bolsa. 828
829
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975
976
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978
43
Tabela 1 – CIM e CBM de extratos vegetais etanólicos frente à sorotipos de Salmonell, isolados de
aviários no Oeste do Paraná.
EXTRATO ETANÓLICO CIM/CBM (mg.mL-1
)
SOROTIPOS
Perfil de
Resistência Mc Sm Rc Pg Os Ma
Morehead Sensível 3,13/6,25 50/>LD 12,5/100 6,25/12,5 25/50 12,5/100
Lexington AMP-CEF 3,13/6,25 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/>LD 12,5/100
Give Sensível 1,56/6,25 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/100 12,5/100
Panamá Sensível 3,13/6,25 50/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/100 12,5/100
Typhimurium GEN-NAL 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/>LD 12,5/100
Rissen Sensível 3,13/6,25 100/>LD 50/>LD 6,25/12,5 25/50 12,5/100
Albany Sensível 3,13/6,25 100/>LD 100/100 3,13/3,13 25/50 12,5/100
Gallinarum Sensível 1,56/6,25 100/>LD 100/100 6,25/6,25 25/>LD 12,5/100
Cerro Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 6,25/6,25 25/>LD 12,5/100
Infantis GEN-NAL 3,13/3,13 100/>LD 12,5/50 6,25/12,5 25/>LD 12,5/100
Schwarzengrund Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 6,25/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Worthington Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/12,5 25/>LD 12,5/>LD
Saintpaul Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/12,5 25/>LD 12,5/100
Braenderup Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/12,5 25/>LD 12,5/100
Montevideo Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/12,5 25/>LD 12,5/100
Mbandaka TET 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 3,13/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Ohio Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/25 3,13/12,5 25/50 12,5/>LD
Agona Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/25 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Senftenberg Sensível 1,56/6,25 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 50/100 12,5/>LD
Corvallis Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 3,13/6,25 25/>LD 6,25/12,5
Hadar TET-NAL 1,56/3,13 100/>LD 50/>LD 3,13/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Grumpensis Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 3,13/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Gafsa Sensível 1,56/6,25 100/>LD 25/>LD 3,13/12,5 25/>LD 12,5/>LD
Orion Sensível 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 3,13/6,25 25/>LD 12,5/>LD
Tennessee Sensível 3,13/6,25 100/>LD 25/100 6,25/25 25/50 12,5/>LD
Cubana TET 1,56/3,13 100/>LD 25/>LD 6,25/6,12 25/>LD 25/>LD
Kentucky Sensível 1,56/3,13 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/50 25/>LD
Bareilly Sensível 3,13/6,25 100/>LD 25/>LD 3,13/12,5 25/50 25/>LD
Livingstone Sensível 3,13/6,25 100/>LD 25/>LD 6,25/12,5 25/50 25/>LD
Minnesota NAL 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Branderburg Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/100 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Enteritidis Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/25 6,25/12,5 25/>LD 12,5/>LD
Newport TET 3,13/6,25 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/>LD 12,5/>LD
Entérica TET 3,13/6,25 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Derby TET 1,56/3,13 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/50 12,5/>LD
Heidelberg Sensível 3,13/3,13 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 2550 12,5/>LD
Typhimurium
ATCC Sensível 3,13/6,25 100/>LD 12,5/>LD 6,25/12,5 25/100 12,5/>LD
AMP: Ampicilina; CEF: Cefalotina; GEN: Gentamicina; NAL: Ácido Nalidixico; TET: Tetraciclina; >LD: 979 Maior que o limite de detecção; Mc: Myrciaria cauliflora; Sm: Schinus molle; Rc: Ricinus communis; Pg: 980 Psidium guajava; Os: Ocotea spixiana; Ma: Maytenus aquifolium. 981 982
44
Tabela 2 – Perfil de resistência antimicrobiana, CIM e CBM de extratos vegetais aquosos frente
à sorovares de Salmonella, isolados de aviários no Oeste do Paraná.
EXTRATO AQUOSO CIM/CBM (mg.mL-1
)
SOROTIPOS CLO Mc Sm Pg Ma
Morehead 0,04 12,5/12,5 100/>LD 50/50 50/>LD
Lexington 0,04 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Give 0,04 12,5/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Panamá 0,04 25/50 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Typhimurium 0,04 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Rissen 0,04 25/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Albany 0,09 12,5/12,5 100/>LD 50/50 50/>LD
Gallinarum 0,09 50/50 100/>LD 50/100 50/>LD
Cerro 0,09 12,5/12,5 100/>LD 100/100 50/>LD
Infantis 1,5 25/25 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Schwarzengrund 0,09 25/25 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Worthington 0,09 25/50 100/>LD 100/100 100/>LD
Saintpaul 0,04 25/25 100/>LD 100/100 100/>LD
Braenderup 0,09 25/25 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Montevideo 0,04 12,5/25 100/>LD 100/>LD 100/>LD
Mbandaka 0,04 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Ohio 0,04 25/25 100/>LD 100/100 100/>LD
Agona 0,09 25/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Senftenberg 1,5 25/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Corvallis 0,09 12,5/12,5 100/>LD 100/100 100/>LD
Hadar 0,09 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Grumpensis 0,09 12,5/25 100/>LD 100/100 50/>LD
Gafsa 0,09 50/50 100/>LD 100/100 50/>LD
Orion 0,09 50/50 100/>LD 100/100 50/>LD
Tennessee 0,04 12,5/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Cubana 0,04 25/25 100/>LD 100/100 50/>LD
Kentucky 0,09 12,5/12,5 100/>LD 100/100 50/>LD
Bareilly 0,09 25/50 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Livingstone 0,04 25/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Minnesota 0,04 12,5/25 100/>LD 100/>LD 50/>LD
Branderburg 0,15 25/50 100/>LD 100/100 50/>LD
Enteritidis 0,15 25/50 100/>LD 50/100 50/>LD
Newport 0,04 25/25 100/>LD 100/100 50/>LD
Entérica 0,04 25/25 100/>LD 50/100 100/>LD
Derby 0,15 12,5/25 100/>LD 100/100 100/>LD
Heidelberg 0,15 25/25 100/>LD 50/100 50/>LD
Typhimurium
ATCC 0,15 12,5/25 100/>LD 50/100 50/>LD
>LD: Maior que o limite de detecção; CLO: cloranfenicol; Mc: Myrciaria cauliflora; Sm: Schinus molle; Rc: 983 Ricinus communis; Pg: Psidium guajava; Os: Ocotea spixiana; Ma: Maytenus aquifolium. 984
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Química Nova,v. 24, n. 01, p.147-152, 2001.
53
53
ANEXOS
54
54
Anexo 1 - Normas da Revista Cap. 1
Journal of Food, Agriculture & Environment
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
Tamanho
Normalmente, um manuscrito não deve exceder 30 páginas, espaçamento 1,5, 12
fontes, incluindo todos os materiais relevantes. Qualquer manuscrito submetido que é
muito longo pode ser devolvido ao autor correspondente para reformulação.
Texto datilografado
A cópia do manuscrito deve ser digitado em espaçamento 1,5 em um lado do A4 ou
8 ½ paper "× 11" com 2,5 cm de largura na margem esquerda, direita, superior e inferior.
Sublinhando para indicar o tipo itálico (ou o uso de itálico no original) deve ser restrito a
nomes de espécies em geral e, e descritores químicos (por exemplo, cis, trans, etc.). Não
sublinhar quaisquer títulos. As notas de rodapé devem ser mantidas a um mínimo e
indicado por *. Não use pontos finais após as abreviaturas, a não ser essencial para
entendimento. Abreviaturas dos nomes químicos e outros devem ser definidos quando
mencionado pela primeira vez no corpo do trabalho, a não ser comumente usado e
internacionalmente conhecido e aceito.
Unidades e nomenclatura
Use unidades SI de acordo com as recomendações da Organização Internacional de
Normalização (ISO). Utilize o formulário g kg-1ETC (não%) para especificar o conteúdo /
composição / concentração. Use %, apenas para expressar a mudança proporcional. Note-
se que a forma g 100g-1
, etc não é correto. Evite o uso de g por 100 g, por exemplo, na
composição de alimentos / alimentação, em vez disso usar g kg-1
. As doses de fertilizantes
deverão ser apresentados em termos do elemento aplicado. Mais informações sobre as
recomendações da ISO pode ser obtido a partir da seguinte publicação emitida pelo British
Standards Institution, Londres: Especificação para unidades SI e recomendações para o uso
de seus múltiplos e de algumas outras unidades, BS 5555:1993 ISO 1000:1992.
Símbolos
55
55
Escrever todos os símbolos, fórmulas e equações com muito cuidado. Símbolos
usuais (incluindo letra grega) deve ser definido em palavras na margem esquerda, na
primeira menção.
Os nomes científicos
Dê os nomes científicos (com autoridade) para plantas, animais, micro-organismos,
com nomes genéricos, na íntegra, a primeira menção, por exemplo, Myzus persicae
(Sulzer). Seguidamente, abreviar-los neste texto, por exemplo, M. persicae, dar-lhes na
íntegra (sem autoridade) nos títulos das seções, tabelas, figuras e palavras-chave. Sempre
que necessário, as cultivares devem ser especificados.
Nomenclatura enzima
Identificar cada enzima, juntamente com o seu número CE, se disponível, na primeira
menção, seguindo as recomendações da última edição da nomenclatura enzimática.
Nomenclatura química
Use a atual sistemática nomenclatura IUPAC por toda parte.
As análises estatísticas
Um cuidado especial deve ser tomado para garantir que as análises estatísticas
apropriadas foram realizadas. Os métodos utilizados devem ser descritas de forma concisa,
ainda informação suficiente para explicar como os métodos escolhidos tenham sido
aplicados aos dados. A forma de todos os erros experimentais e sua significância estatística
deve ser dada de forma clara. As análises estatísticas devem ser utilizados na discussão
para justificar inferências feitas no contexto de variação biológica normal.
Traçado
O corpo principal do trabalho deve ser dividido em seções não numeradas, e cada
um de um título apropriado. Principais títulos devem ser na esquerda sobre o texto (11
fontes, negrito). Escolha das posições vai depender do conteúdo, mas o seguinte é
recomendado para trabalhos de investigação:
56
56
Título: deve ser conciso, curto, específico e explicar a natureza da obra.
Título do manuscrito (14 fontes, negrito, como "Food conssumption na Finlândia")
3 espaço de linha
O autor (s) nome (s) de (começando com nome próprio, depois da família, 11 fontes,
negrito).
Os nomes dos autores, cada um deve ter o apelido habitual na íntegra e iniciais (por
exemplo, William. B. Jain). Indicar o endereço completo (es) onde o trabalho foi feito, e
incluem todos os endereços do autor correspondente e todos os co-autor (es), se possível
por e-mail.
Para facilitar a correspondência, por favor manter o escritório Editorial JFAE informado de
quaisquer alterações em seu endereço, e-mails e telefone ou número de fax.
2 espaço de linha
Resumo
O resumo deve ser informativo ou conciso, dando uma visão geral e informações
essenciais, tais como o fim do trabalho, os dados dele derivados e sua significância
estatística, e ser inteligível sem referência ao próprio papel. Ele não deve normalmente
exceder 400 palavras, mas não menos do que 250 palavras. Os autores devem se lembrar
que o resumo é muitas vezes a única parte de um artigo lido, como na abstração revistas,
bem como a utilização de siglas ou abreviaturas incomuns devem ser evitados.
2 espaço de linha (para o resto das subseções)
Palavras-chave:
57
57
Liste os principais temas incorporados no papel, incluindo qualquer dado já no título.
(Preferencialmente mais do que 10 palavras-chave)
Introdução
Incluir uma descrição clara dos objetivos do inquérito (sem resumindo o trabalho em si), e
uma breve exposição dos trabalhos anteriores relevantes com referências. Para artigos de
revisão, indicam claramente o âmbito da análise, tais como áreas temáticas, área geográfica
ou período coberto na revisão.
Material e métodos
Descrever claramente em detalhes suficientes para permitir que o trabalho possa ser
repetido. Só as novas técnicas e modificações aos métodos conhecidos necessitam serem
descritos em detalhe, mas deve ter métodos conhecidos e referências adequadas. Incluir o
nome, cidade, país e código do fornecedor ou fabricante de qualquer produto químico ou o
aparelho não estiver em uso comum. Dê o delineamento estatístico (incluindo replicação)
de cada experimento onde apropriado.
Resultados
Apresentá-los de forma concisa, o uso de tabelas e ilustrações, para maior clareza,
não repetir a lista dos resultados no texto. Indicar claramente a forma do erro experimental
e a significância estatística dos resultados. Não exagerar a precisão das medições. Gráficos
histogramas ou barras, a menos preparada cuidadosamente, são inferiores às tabelas. Só em
circunstâncias excepcionais será ambas as tabelas e ilustrações com base no mesmo
conjunto de dados / ser aceito medições. As seções experimentais e os resultados podem
ser combinados quando apropriado.
Discussão
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58
Os resultados devem seguir uma seção concisa para discutir e interpretá-los. Por
favor, não basta repetir os resultados. Um combinado de resultados e seção de discussão às
vezes simplifica a apresentação.
Conclusões
Não se limitam a repetir o conteúdo das secções anteriores. As seções de discussão
e as conclusões não podem ser mescladas.
Agradecimentos
Mantenha-os ao mínimo absoluto.
Referências
Verifique cuidadosamente para precisão e seguir o estilo correto. Referem-se a
trabalhos inéditos apenas no texto (William MN não publicado), (Brown CD pers comm).
Indicar referências bibliográficas no local apropriado no texto utilizando números
sobrescritos, na ordem em que eles aparecem e uma lista numérica completa deve aparecer
no final do artigo, dando a todos os autores com as iniciais após o respectivo apelido.
Certifique-se de que todas as referências da lista são citados no texto e vice-versa. Dê a
data e o título completo do artigo no idioma em que ele apareceu ou uma tradução exata
Inglês. Abreviar todos os títulos de periódicos, como no Chemical Abstracts ou Biological
Abstracts e o BIOSIS, sem usar pontos finais após a abreviatura. Se a revista não está
incluída, dar o seu título na íntegra. Números de volume deve ser em negrito.
Observe o seguinte estilo e ordem para citação:
Um artigo com um ou mais autores
1Hiilovaara-Teijo, M., Hannukkala, A., Griffith, M., Yu, X.-M., e Pihakaski-Maunsbach,
K. 1999. Proteínas apoplástica Snow-molde induzidas pelo centeio de inverno deixa
actividade anticongelante falta. Plant Physiol. 121: 665-674.
Um artigo publicado em um livro
59
59
2Bradfort, ML, Kangas L., e Nordlund, G. 1990. Cálculos do modelo de enxofre e
deposição de nitrogênio na Finlândia. In: Kauppi, P. et ai. (Eds.). Acidificação na
Finlândia. Berlin: Springer-Verlag. p. 167-197.
Um livro com um ou mais autores
3ARC 1984. As exigências nutricionais dos ruminantes. Suplemento No. 1. Técnico
revisão por um partido de Pesquisa Agropecuária Conselho de trabalho, Commonwealth
Agricultural Bureaux, Slough, Reino Unido. 45 p.
4Lominadze, D.G. 1981. Cyclotrone ondas no plasma. 2nd ed. Oxford: Pergamon Press.
206 p.
5Møller, J., Th ¸ Gersen, R., Kjeldsen, AM, Weisbjerg, MR; øegaard, K., Hvelplund, T., e
6Børsting, CF 2000. Fodermiddeltabel. Sammensætning og foderværdi af fodermidler til
7kvæg. Rapport 91. Århus: Landbrugets Rådgivningscenter. 52 p.
8Senauer, B., Asp, E., e Kinsey, J. 1991. Tendências de alimentos e os consumidores a
mudar. St. Paul, MN: Eagan Press.
Documentos de conferências
1Petit, M., Garel, JP, D'Hour, P., e Agabriel, J. 1995. O uso de forragens pelo rebanho de
bovinos de corte. In: Journet, M. et ai. (Eds.). Desenvolvimentos recentes na nutrição dos
herbívoros. Anais do IV Simpósio Internacional sobre a Nutrição de herbívoros. Paris:
edições do INRA. p. 473-496.
2Niskanen, M. 1990. A adsorção de zinco e aumento da concentração de zinco planta após
a aplicação de zinco em solos minerais da Finlândia. Transações do 15 º Congresso
Mundial de Ciência do Solo, Acapulco, México. 5b: 395-396.
Ao citar patentes dar o nome do candidato, o ano de publicação, o título, o país e de
patentes ou número do pedido, por exemplo:
3Hilton MS e Williams ML. 1980. Método de classificação de sementes. A Patente UK
1.777.888.
Abreviaturas
O Sistema Internacional de Unidades (SI) deve ser usado. Nomes comuns aceitos
dos ingredientes ativos de formulações químicas devem ser usados de preferência a nomes
60
60
comerciais, e confirmou a códigos internacionalmente reconhecidos de nomenclatura.
Nomes latinos genéricas e específicas devem ser digitados em itálico.
Tabelas
As tabelas com dados numéricos deve ser mantido a um mínimo, e deve incluir
apenas a informação essencial (com o nível de erros significativos). Todas as tabelas,
gráficos ou fotos devem ser inseridas no corpo do texto. Cada tabela deve ter um título
auto-explicativo conciso e abreviaturas utilizadas devem ser definidos diretamente abaixo
das tabelas. Pontos finais, mas não vírgulas, devem ser utilizados como pontos decimais.
Ao preparar tabelas com um processador de texto, por favor, note que a chave de
tabulação, e não a barra de espaço, devem ser utilizados para alinhar as colunas.
Procedimentos mesa de decisões também pode ser usado.
Figuras (desenhos e fotografias)
As figuras devem ser selecionados tendo em consideração o formato da folha
impressa, para permitir o efeito de um potencial de redução (menos do que 33%) no
tamanho. Caracteres alfabéticos ou numéricos deve ser de pelo menos 1,5 mm de altura na
impressão. As figuras devem ser numeradas consecutivamente em algarismos arábicos, ea
sua posição deve ser indicada na margem. Todas as legendas de figuras devem ser
impressos na mesma folha para cada figura. Desenhos reproduzidos com uma impressora
laser de alta qualidade são os preferidos. Fotografias, se usada, deve ser de bom contraste e
impressos em papel brilhante. Todas as figuras, fotografias ou tabelas deve ser apresentado
no corpo do texto. Por favor, não use utilizar quaisquer ilustrações digitalizadas.
Por favor, use 300 dpi para 600 dpi na digitalização de suas fotos ou gráficos para
evitar a má qualidade de impressão. Por favor, reduzir o tamanho do seu arquivo.
Sempre que possível, ilustrações também devem ser enviados pelo correio aéreo e
apresentada em formato eletrônico (salvo em CD, juntamente com o texto da cópia
impressa) ou enviadas como (email / MSword.version). Também salvar cada figura como
um arquivo separado, em formato TIFF ou EPS de preferência, e incluir o arquivo de
origem. Escrever no disco o software usado para criar os arquivos. Use pacotes de
ilustração dedicadas em detrimento de ferramentas como Excel ou PowerPoint.
61
61
Desenhos de linhas e figuras devem estar em um formato adequado para
reprodução direta, não maior do que A4 ou 8 ½ "x 11", em tinta preta, com letras
estampado (evitar o uso de transferência seca, datilografada ou lettering manuscrito), todos
na proporção da quantidade de detalhe. Diagramas de computador desenhados devem ser
preparados em um laser de alta qualidade ou impressora jato de tinta ou plotter, e não em
uma impressora matricial ou equivalente.
Use apenas caracteres essenciais e inserir esses e quaisquer outros símbolos
claramente, explicar todos os símbolos usados, e onde é necessária uma chave para os
símbolos, por favor, inclua isto no trabalho artístico, e não na legenda da figura. Em
gráficos, incluem rótulos e unidades nos eixos. Apresente com escalas logarítmicas
aritmética numeração 0,1, 1, 10, 100, em vez de -1, 0, 1, 2. Evite desnecessariamente
longos eixos que levam a grandes espaços em branco em gráficos.
Linhas de desenho e figuras devem todos requerem o mesmo grau de redução e de
todos os caracteres devem ser escolhidos de modo que, após a redução que são pelo menos
1,5 mm de altura. A área tipo do Jornal são de 172 mm de largura x 249 milímetros de
profundidade, em duas colunas cada 81 milímetros de largura, e os personagens devem,
portanto, ser grande o suficiente para ser legível após a redução das ilustrações para caber
na página ou a largura da coluna.
Fotografias (meios-tons) deve ser fornecido como impressões brilhantes (quatro cópias
originais de cada) de bom contraste, fotocópias não são aceitáveis. Não permitir que sejam
danificadas por clipes de papel, etc dobragem Alguma perda de clareza pode ocorrer
durante a reprodução.
As estruturas químicas
Prepare-se estes em folha separada, tal como descrito para as ilustrações eo número
fórmulas indivíduo com algarismos romanos (I, II). Todas as obrigações, encargos e
radicais livres deve ser posicionado com precisão. Indique sistemas heterocíclicos
aromáticos e insaturados, utilizando ligações duplas. De preferência use estruturas gerais,
distinguindo compostos relacionados por substituintes R1, R2, etc.
O texto deve ser escrito em Inglês gramaticalmente correta e bem estruturada em termos de
estilo e conteúdo. Manuscritos mal escrito, não serão considerados para publicação.
62
62
Primeiro você deve enviar-nos por e-mail um pequeno resumo de seu artigo, então
vamos decidir se o papel se encaixa no escopo da revista JFAE (leia mais).
Se o artigo é adequado um manuscrito de corpo inteiro devem ser enviadas a pelo
menos dois ou três revisores externos (falante nativo Inglês) antes de enviá-lo para a
revista JFAE.
Nomes completos e endereços, incluindo e-mails dos dois ou três revisores devem
ser mencionados na carta final. Documentos sem revisão adequada será rejeitada.
Uma vez que o manuscrito está totalmente revisto, melhorado e corrigido, você
pode enviá-lo primeiro por e-mail (MS Word), por favor, verifique o seu manuscrito
(linguagem, símbolos, equações, referências, teste estatístico, utilize 300 dpi para 600 dpi
na digitalização de fotos Mas não digitalizar figuras ou tabelas, basta usar os originais).
Se o seu manuscrito contém símbolos, gráficos ou tabelas complicadas equações etc, nós
convidamo-lo a enviar por correio aéreo, uma versão eletrônica salva em um CD em um
formato compatível com o MS Word, mais uma cópia do manuscrito. Isto irá permitir-nos
de verificar cuidadosamente todos os símbolos, equações, sinais etc usados em seu texto
(incluir cópias originais de fotografias, etc.) Por favor, inclua todas as tabelas ou fotos
dentro do corpo do texto.
Por favor, note que o manuscrito inadequada ou incorreta serão rejeitadas. O Inglês do
manuscrito devem ser verificados por pelo menos dois cientistas ingleses nativos ou três
especialistas em linguagem.
Os autores receberão por e-mail um aviso de recepção de seu trabalho (s).
Manuscrito só aceito (s) será publicado dentro de um curto período de
tempo. O período estimado varia entre 3 e 6 meses.
A prova galera só será enviado por e-mail (arquivo pdf) para o autor
correspondente. Pedimos a todos os seus e-mails e endereços postais
completos em seu manuscrito.
Nosso escritório deve receber pelo correio aéreo (sem e-mails) a forma de
direitos de autor e assinado a taxa de publicação antes do prazo, caso
contrário, vamos adiar a publicação do texto (s).
Quando o escritório do editor recebe os documentos solicitados antes do
prazo, vamos enviar pelo correio aéreo a cópia impressa da revista ao autor
correspondente (reprints se pago, será enviado anteriormente), apenas. No
63
63
entanto, co-autores poderão adquirir cópia extra da revista (s) ou algumas
reimpressões.
Ao preparar um manuscrito, os autores devem se referir a uma edição recente da
revista (versão impressa ou on-line ou em um artigo de amostra que pode ser baixado a
partir de www.world-food.net). Mencione o nome das seções em que seu artigo deve ser
considered.Check área sujeita revista.
O manuscrito deve ser acompanhado por uma carta de transmissão (enviada por e-
mail ou pelo correio aéreo), no qual o autor pode especificar o nome de usuários que
revisaram o manuscrito mais três ou mais potenciais árbitros, incluindo os seus endereços
completos, telefone e números de fax , endereços de e-mail, e áreas de especialização.
As instruções detalhadas para a preparação do manuscrito são apresentados abaixo.
O autor correspondente deve obter o consentimento de todos os co-autores para a
apresentação do manuscrito. Também é necessário um formulário de submissão do
manuscrito. (Por favor, adicionar endereços de correio completo e todos os e-mails dos co-
autores). Os trabalhos somente serão aceitos no entendimento de que os conteúdos não
foram publicados nem estão sendo considerados para publicação em outros lugares.
O autor correspondente (s) deve fazer muito certo de que todos os apresentados
originais de pesquisa artigos, comentários ou notas foram revisadas por cientistas ingleses
nativos. Assim que recebermos o seu contributo, os nossos especialistas vai passar por isso
mais uma vez. O manuscrito aceito ou outras contribuições serão publicadas tanto na
versão impressa e on-line da revista. O conselho Editorial da revista pode pedir autores
para apresentar informações ou ilustrações adicionais, tais como fotos em GIF ou JPEG
para a revista on-line, eo formato TIFF para a revista impressa.
O texto deve ser escrito em Inglês gramaticalmente correta e bem estruturada em
termos de estilo e conteúdo. Manuscritos mal escrito, não serão considerados para
publicação.
Uma vez que o manuscrito for aceito para publicação, o autor correspondente será
solicitado para enviar ou atribuir direitos sobre o artigo para WFL Editor Oy antes do
prazo. Caso contrário, a publicação do documento, que será adiada.
Taxas
Os autores serão informados por e-mail uma vez que seus manuscritos chegaram a
nossa redação. Depois de um processo de revisão (entre 3 e 6 meses), nós lhe enviaremos
64
64
por e-mail uma nota de aceitação ou não aceitação para publicação do manuscrito. Se o
manuscrito for aceito, nós lhe enviaremos por e-mail a carta de aceitação, a forma de
direitos de autor e os pub.fees.
Cobramos as taxas de publicação pelo número de páginas (excluindo impostos,
custos de envio ou taxas de manipulação). A fatura será enviada por e-mail.
Antes da revista ser impressa, só aqueles que pagaram as taxas de publicação
receberão por e-mail (arquivo PDF) a prévia para uma verificação rápida e final. Nós,
portanto, pedimos para nos enviar todos os seus e-mails. Por favor, certifique-se que seu
endereço postal esteja completo e correto, de modo que você vai receber uma cópia
impressa da revista. Nós não podemos voltar a enviar duas vezes a mesma revista por
causa do alto custo de impressão e postagem.
Por favor, encurtar o seu manuscrito, porque se o comprimento é mais do que cinco
páginas, um custo adicional de € 25 / € 15 (desenvolvidos / países em desenvolvimento)
por página (excluindo o custo de envio) será adicionado.
Autor (es) cuja biblioteca ou departamento subscreve a revista (ou comprado alguns
livros da editora WFL) beneficiarão de um desconto.
Um tamanho de página A4: espaço duplo, fonte 12, margens: 2,5 carga da página:
Manuscritos aceitos serão publicados com o entendimento de que o autor irá pagar uma
taxa que abrange: manuscrito publicação, análise entre pares, edição de texto, design,
administração e envio.
Países desenvolvidos pagam a taxa de € 60 e países em desenvolvimento € 40 - Um
tamanho de página A4: espaço duplo, fonte 12, margens: 2,5.
Manuscritos apenas aceitos serão publicados entre 3 e 6 meses.
O JFAE promove a rápida publicação de trabalhos de pesquisa ou revisão. Durante
os últimos anos, o tempo total para análise entre pares, edição de texto e publicação
reduziu drasticamente. Para rápida avaliação, os autores podem submeter seus manuscritos
por meio de e-mail.
Nosso objetivo é informar os autores da decisão sobre o seu manuscrito a primeira
hora. Após a aceitação do manuscrito, sob a forma de direitos de autor assinado juntamente
com a cópia das taxas de publicação devem ser enviadas por correio registado antes do
prazo e do papel normalmente será publicado no próximo número disponível (§: política
revista).
65
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Anexo 2 - Normas da Revista Cap. 2
Revista Brasileira de Plantas Medicinais
Normas Editoriais
A Revista Brasileira de Plantas Medicinais - RBPM é publicação trimestral,
exclusivamente eletrônica a partir de 2012, e destina-se à divulgação de trabalhos
científicos originais, revisões bibliográficas, e notas prévias, que deverão ser inéditos e
contemplar as grandes áreas relativas ao estudo de plantas medicinais. Manuscritos que
envolvam ensaios clínicos deverão vir acompanhados de autorização da Comissão de
Ética pertinente para realização da pesquisa. Os artigos podem ser redigidos em português,
inglês ou espanhol, sendo obrigatória a apresentação do resumo em português e em inglês,
independente do idioma utilizado. Os artigos devem ser enviados por e-
mail: [email protected], com letra Arial 12, espaço duplo, margens de 2 cm, em
"Word for Windows". Os artigos, em qualquer modalidade, não devem exceder 20
paginas. No e-mail, enviar telefone para eventuais contatos urgentes.
Para a publicação, os artigos aprovados submetidos à RBPM a partir de 1º de
Abril de 2013 (inclusive), terão custo de tramite de 300 reais (trezentos reais) a ser
efetivado pelos autores/responsáveis somente na ocasião do recebimento da carta de
aceitação do artigo, quando receberão o respectivo boleto e instruções para o pagamento.
Forma e preparação de manuscritos
ARTIGO CIENTÍFICO
Os artigos deverão ser organizados em:
TÍTULO: Deverá ser claro e conciso, escrito apenas com a inicial maiúscula, negrito,
centralizado, na parte superior da página. Se houver subtítulo, deverá ser em seguida ao
título, em minúscula, podendo ser precedido de um número de ordem em algarismo
romano. Os nomes comuns das plantas medicinais devem ser seguidos pelo nome
científico (binômio latino e autor) entre parênteses.
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AUTORES: Começar pelo último sobrenome dos autores por extenso (nomes
intermediários somente iniciais, sem espaço entre elas) em letras maiúsculas, 2 linhas
abaixo do título. Após o nome de cada autor deverá ser colocado um número sobrescrito
que deverá corresponder ao endereço: instituição, endereço da instituição (rua e número
ou Caixa Postal, cidade, sigla do estado, CEP, e-mail). Indicar o autor que deverá receber
a correspondência. Os autores devem ser separados com ponto e vírgula.
RESUMO: Deverá constar da mesma página onde estão o título e os autores, duas linhas
abaixo dos autores. O resumo deverá ser escrito em um único parágrafo, contendo
objetivo, resumo do material e método, principais resultados e conclusão. Não deverá
apresentar citação bibliográfica.
Palavras-chave: Deverão ser colocadas uma linha abaixo do resumo, na margem
esquerda, podendo constar até cinco palavras.
ABSTRACT: Apresentar o título e resumo em inglês, no mesmo formato do redigido em
português, com exceção do título, apenas com a inicial em maiúscula, que virá após a
palavra ABSTRACT.
Key words: Abaixo do Abstract deverão ser colocadas as palavras-chave em inglês,
podendo constar até cinco palavras.
INTRODUÇÃO: Na introdução deverá constar breve revisão de literatura e os objetivos
do trabalho. As citações de autores no texto deverão ser feitas de acordo com os seguintes
exemplos: Silva (1996); Pereira & Antunes (1985); (Souza & Silva, 1986) ou quando
houver mais de dois autores Santos et al. (1996).
MATERIAL E MÉTODO (CASUÍSTICA): Deverá ser feita apresentação completa das
técnicas originais empregadas ou com referências de trabalhos anteriores que as
descrevam. As análises estatísticas deverão ser igualmente referenciadas. Na metodologia
deverão constar os seguintes dados da espécie estudada: nome popular; nome científico
com autor e indicação da família botânica; nome do botânico responsável pela
identificação taxonômica; nome do herbário onde a exsicata está depositada, e o
respectivo número (Voucher Number); época e local de coleta, bem como, a parte da
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planta utilizada.
RESULTADO E DISCUSSÃO: Poderão ser apresentados separados, ou como um só
capítulo, contendo a conclusão sumarizada no final.
AGRADECIMENTO: deverá ser colocado neste capítulo (quando houver).
REFERÊNCIA: As referências devem seguir as normas da ABNT 6023 e de acordo com
os exemplos:
Periódicos:
AUTOR(ES) separados por ponto e vírgula, sem espaço entre as iniciais. Título do
artigo. Nome da Revista, por extenso, volume, número, página inicial-página final, ano.
KAWAGISHI, H. et al. Fractionation and antitumor activity of the water-insoluble residue
of Agaricus blazei fruiting bodies. Carbohydrate Research, v.186, n.2, p.267-73, 1989.
Livros:
AUTOR. Título do livro. Edição. Local de publicação: Editora, Ano. Total de páginas.
MURRIA, R.D.H.; MÉNDEZ, J.; BROWN, S.A. The natural coumarins: occurrence,
chemistry and biochemistry. 3.ed. Chinchester: John Wiley & Sons, 1982. 702p.
Capítulos de livros:
AUTOR(ES) DO CAPÍTULO. Título do Capítulo. In: AUTOR (ES) do LIVRO. Título
do livro: subtítulo. Edição. Local de Publicação: Editora, ano, página inicial-página final.
HUFFAKER, R.C. Protein metabolism. In: STEWARD, F.C. (Ed.). Plant physiology: a
treatise. Orlando: Academic Press, 1983. p.267-33.
Tese ou Dissertação:
AUTOR. Título em destaque: subtítulo. Ano. Total de páginas. Categoria (grau e área de
concentração) - Instituição, Universidade, Local.
OLIVEIRA, A.F.M. Caracterização de Acanthaceae medicinais conhecidas como
anador no nordeste do Brasil. 1995. 125p. Dissertação (Mestrado - Área de
Concentração em Botânica) - Departamento de Botânica, Universidade Federal de
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Pernambuco, Recife.
Trabalho de Evento:
AUTOR(ES). Título do trabalho. In: Nome do evento em caixa alta, número, ano,
local. Tipo de publicação em destaque... Local: Editora, ano. página inicial-página
final.
VIEIRA, R.F.; MARTINS, M.V.M. Estudos etnobotânicos de espécies medicinais de uso
popular no Cerrado. In: INTERNATIONAL SAVANNA SYMPOSIUM, 3., 1996,
Brasília. Proceedings… Brasília: Embrapa, 1996. p.169-71.
Publicação Eletrônica:
AUTOR(ES). Título do artigo. Título do periódico em destaque, volume, número,
página inicial-página final, ano. Local: editora, ano. Páginas. Disponível em:
<http://www........>. Acesso em: dia mês (abreviado) ano. PEREIRA, R.S. et al. Atividade
antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de infecção urinária. Revista de
Saúde Pública, v.38, n.2, p.326-8, 2004. Disponível em:http://www.scielo.br. Acesso em:
18 abr. 2005.
Não citar resumos e relatórios de pesquisa, a não ser que a informação seja muito
importante e não tenha sido publicada de outra forma. Comunicações pessoais devem ser
colocadas no rodapé da página onde aparecem no texto e evitadas se possível. Devem ser
também evitadas citações do tipo: Almeida (1994) citado por Souza (1997).
TABELAS: Devem ser inseridas no texto, com letra do tipo Arial 10, espaço simples. A
palavra TABELA (Arial 12) deve ser em letras maiúsculas, seguidas por algarismo
arábico; já quando citadas no texto devem ser em letras minúsculas (Tabela).
FIGURAS: As ilustrações (gráficos, fotográficas, desenhos, mapas) devem ser em letras
maiúsculas seguidas por algarismo arábico, Arial 12, e inseridas no texto. Quando citadas
no texto devem ser em letras minúsculas (Figura). As legendas e eixos devem ser em Arial
10, enviadas em arquivos separados, com resolução 300 DPI, 800x600, com extensão JPG
ou TIFF, para impressão de publicação.
Processo de avaliação: Os manuscritos são analisados por, pelo menos, dois pareceristas,
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segundo um roteiro de análise baseado principalmente no conteúdo científico. Os
pareceristas recomendarão a aceitação com ou sem necessidade de retornar; recusa, ou
sugerir reformulações, e que, neste caso, o artigo reformulado retornará ao parecerista até
que a avaliação seja concluída. Quando no mínimo 2 pareceristas aprovarem, sem
necessidade de retornar, o artigo estará pronto para ser publicado e o autor receberá a carta
de aceite bem como as instruções para pagamento dos custos de tramite (R$300 reais)*.
Os nomes dos pareceristas permanecerão em sigilo, omitindo-se também perante estes os
nomes dos autores.
* Somente os artigos aprovados que foram submetidos a partir de 1º de abril de 2013 terão
custo para publicação.
Direitos autorais: Ao encaminhar um manuscrito para a RBPM os autores devem estar
cientes de que, se aprovado para publicação, o copyright do artigo, incluindo os direitos
de reprodução em todas as mídias e formatos, deverá ser concedido exclusivamente para
as Memórias.
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Observação: São de exclusiva responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos
emitidos nos trabalhos. Contudo, reserva-se ao Conselho Editorial, o direito de sugerir ou
solicitar modificações que julgarem necessárias.
