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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Curso de graduação em Farmácia-Bioquímica
Construção de farmacóforo para o receptor AT1 baseado em agonistas enviesados, um estudo de modelagem
molecular.
SILVESTRE MASSIMO MODESTIA
Trabalho de Conclusão do Curso Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo
Orientadora: Profa. Dra. Carlota de Oliveira Rangel-Yagui Co-Orientador: Prof. Dr. Gustavo Henrique Goulart Trossini
São Paulo
2014
2
SSUUMMÁÁRRIIOO
CONTEÚDO
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................... 1
RESUMO ........................................................................................................................ 2
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ........................................................................................ 4
1.1 Insuficiência cardíaca ................................................................................................ 4
1.2 Agonismo enviesado no AT1R ..................................................................................... 5
1.3 Planejamento racional de fármacos e modelagem moelcular ............................................ 6
2. OBJETIVOS .................................................................................................................. 8
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................. 8
3.1 Construção e otimização de ligantes ............................................................................ 8
3.2 Dinâmcia Molecular ................................................................................................. 9
3.2.1 Construção e otimização do sistema ...................................................................... 9
3.2.2 Minimização ................................................................................................... 10
3.3.3 Equilibração .................................................................................................... 10
3.3.4 Dinâmica de produção ...................................................................................... 10
3.3 Seleção de confôrmeros .......................................................................................... 11
3.3 Construção do farmacóforo ..................................................................................... 11
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................... 11
4.1 Minimização e equilibração ...................................................................................... 11
4.2 Seleção de confôrmeros .......................................................................................... 17
4.3 Construção do farmacóforo ..................................................................................... 18
4.4 Discussão e modelo final ......................................................................................... 22
5. CONCLUSÕES ............................................................................................................. 26
6. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................ 26
7. ANEXOS .................................................................................................................... 31
3
LISTA DE ABREVIATURAS
Ang II Angiotensina II
AT1R Angiotensin II Type 1 Recepetor (Receptor de Angiotensina II do tipo 1)
ARB Angiotensin II Receptor Blocker (Bloqueadores do receptor de angiotensina II)
IC Insuficiência cardíaca
LBDD Ligand Based Drug Design (Planejamento de Farmáco Baseado no Ligante)
DM Dinâmica Molecular
PAC Perfil de Amostra Conformacional
PBC Periodic Bondary Conditions (Condições Periódicas de Contorno)
PDB Protein Data Bank
RMN Ressônancia Magnética Nuclear
RMSD Root Mean Square Deviation (Desvio Quadrático Médio das Posições
Atômicas)
RMSF Root Mean Square Fluctuation (Média do Desvio Quadrático Médio)
SAR Structure Activiy Relationship (Relação Estrutura Atividade)
SBDD Structure Based Drug Design (Planejamento de Fármaco Baseado no
Receptor)
SUS Sistema Único de Saúde
4
Resumo
MODESTIA, S. M. Construção de farmacóforo para o receptor AT1
baseado em agonistas enviesados, um estudo de modelagem molecular.
Trabalho de Conclusão de Curso Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências
Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014.
Palavras-chave: Insufuciência Cardíaca, Agonismo Enviesado, Modelagem
Molecular e Planejamento de Fármacos Baseado na Estrutura do Ligante (LBDD).
Introdução: A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome de elevada
morbimortalidade, correspondendo a um grave problema de saúde pública. Estudos
recentes mostram que agonistas enviesados para o receptor de Angiotensina II do
tipo 1 (AT1R) ativam a via da β-arrestina de modo independente da via da proteína
G. Isso representa uma vantagem terapêutica sobre os antagonistas do AT1R, que
bloqueiam ambas as vias. Desta forma, entender os requisitos estruturais que levam
um composto a ter atividade agonista enviesada consiste no primeiro passo para a
descoberta de novos compostos com potencial terapêutico para o tratamento de IC.
Objetivo: O objetivo deste trabalho é a construção de um farmacóforo para o
receptor AT1R baseado na estrutura de um grupo de agonistas enviesados.
Materiais e Métodos: A estrutura da Angiotensina II obtida por RMN foi utilizada
como geometria inical para a geração das coordenadas de sete agonistas envieados
e da própria Angiotensina II. O programa computacional GROMACS e o campo de
força AMBER99sb*-ildn foram utilizados para a criação do sistema de simulação. As
estruturas foram minimizadas pelo método Steepest Descent com 10.000 passos.
Simulações de dinâmica molecular com solvente explicito (água modelo TIP3P)
foram realizadas a 310 K e 1 atm por 10ns, utilizando-se o termoestato V-Rescale e
o barostato de Parrinello-Rahman, ambos com constante de acomplamento de 0,2
ps. Os confôrmeros selecionados foram sobrepostos para a geração de modelos
farmacóforicos no programa computacional Sybyl 2.0 – módulo Unity.
5
Resultados: Os parâmetros de controle da dinâmica molecular foram mantidos
(pressão média = 1 bar, temperatura = 310 ± 3,8 K, densidade = 987 ± 4.6 Kg/m3). A
análise por RMSD mostrou que todos os compostos alcançaram a estabilidade
conformacional após 6,5 ns. Uma grande flexibilidade dos três primeiros
aminoácidos foi observada por análise de RMSF. O modelo final apresentou seis
pontos farmacofóricos: dois pontos aromáticos, um ponto doador de ligação
hidrogênio, um centro carregado negativamente e dois pontos doadores/aceptores
de ligação de hidrogênio.
Conclusão: A construção de um farmacóforo por meio da sobresposição de
confôrmeros obtidos por dinâmica molecular foi bem sucedida. Nossos resultados
indicam que a posição alternativa da carboxila terminal é responsável pelo agonismo
enviesado. Estudos posteriores como triagem virtual e ensaios biológicos poderiam
ser usados para a validação deste modelo.
6
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
1.1. Insuficiência cardíaca
A insuficiência cardíaca (IC) é definida como uma síndrome resultante de
qualquer desordem funcional ou estrutural do coração que cause ou aumente o risco
do desenvolvimento de manifestações de um baixo débito cardíaco. Ela consiste na
via final de várias doenças, como hipertensão arterial sistêmica, diabetes melitus,
doença de Chagas e coronariopatias.1
Estudos de prevalência estimam que 23 milhões de pessoas no mundo
tenham IC e que dois milhões de casos novos sejam diagnosticados anualmente. Só
nos EUA, conjecturam-se 550 mil novos casos por ano e 5 milhões de portadores
desta síndrome. A IC gera um custo anual ao sistema de saúde americano de mais
de 26 bilhões de dólares com assistência médica e de até 13 bilhões de dólares em
custos indiretos, provocados por incapacitações. 2,3
A prevalência da IC aumentou nas últimas 5 décadas e, ainda hoje, a
mortalidade pode ultrapassar 50% em 5 anos, a partir do momento do diagnóstico.4
Segundo o Sistema Único de Saúde (SUS) ocorreram cerca de 400 mil internações
por IC no ano de 2000 no Brasil. Isso correspondeu a um consumo de mais 33% dos
gastos com doenças do aparelho circulatório, o que tornou a IC a primeira causa de
internação de pacientes acima de 65 anos no SUS. Projeções indicam que em 2025
o Brasil terá a sexta maior população de idosos do mundo e que a IC será a primeira
causa mundial de morte por doença cardiovascular. Por esse motivo, esta sindrome
é considerada um problema de saúde publica pela Organização Mundial de
Saúde.4,5
Há 40 anos a terapia para IC consistia no uso de glicosídeos cardiotônicos e
diuréticos, que serviam apenas como medida paliativa. Hoje, o tratamento visa
mudar ou evitar a progressão da doença, através do uso de β-bloqueadores
adrenérgicos, vasodilatadores, antagonistas de aldosterona, inibidores da enzima
conversora de angiotensina (IECA) e bloqueadores do receptor AT1R de
angiotensina II (ARB, Angiotensin Receptor Blocker)2. Essas últimas três classes
agem sobre o sistema hormonal renina-angiotensina-aldosterona, responsável pela
regulação da pressão arterial e da homeostase eletrolítica.1
7
O atual arsenal de ARBs consiste em oito fármacos: candesartana,
losartana, irbesartana, olmesartana, telmisartana, valsartana, azilzartana e
eprosartana, esses últimos dois fármacos não são comercializados no Brasil. Os
ARBs agem de maneira potente e seletiva prevenindo e revertendo a maioria dos
efeitos da angiotensina II (Ang II). Essa inibição leva à vasodilatação, excreção de
sódio e redução da contração da musculatura lisa vascular. Porém, estudos recentes
sobre as formas de ativação do AT1R apontam que a importância fisiológica e
patológica deste alvo é subestimada por essa classe de fármacos.6,7,8,9
1.2. Agonismo enviesado no AT1R
O AT1R pertence à família dos receptores com sete seguimentos
transmembrana (7TM) acoplados à proteína G (GPCR). Este tipo de receptor é
responsável por 80% da sinalização hormonal e aproximadamente 5% do genoma
codifica GPCRs. Por esse motivo a modulação de GPCRs por fármacos agonistas
ou antagonistas é uma das estratégias mais utilizadas atualmente no planejamento
de fármacos, resultando em vários agentes terapêuticos. 10,11
A sinalização celular do AT1R começa com a ligação da angiotensina II,
provocando a estabilização da conformação capaz de se ligar à proteína G
heterotrimérica.7 A ativação da proteína G gera segundos mensageiros,
desencadeando o restante da cascata de sinalização intracelular. 8,12 Logo após sua
ativação, quinases de receptor acopladas à proteína G (GRKs) fosforilam a porção
citosólica do AT1R, começando o processo de dessensibilização. Essa porção
fosforilada do receptor promove o recrutamento da β-arrestina, que se liga ao AT1R
impedindo a continuidade da interação entre a proteína G e o receptor, o que
maracá o término da cascata de sinalização.
Estudos recentes mostram ser possível a ativação da via da β-arrestina de
modo independente da via da proteína G.13 Essa ativação seletiva pode ainda ser
obtida por meios farmacológicos, como é o caso do composto SII [(Sar1,Ile4,Ile8)-Ang
II] capaz de ativar vias dependentes da β-arrestina (internalização e
dessenssibilização do receptor), sem a geração de segundos mensageiros da via da
proteína G.13,14,15 A observação de fenômenos similares em diferentes GPCRs levou
ao desenvolvimento do termo seletividade funcional ou agonismo enviesado.16,17
8
Esta seletividade funcional do AT1R é particularmente interessante porque
a componente dependente de proteína G (Figura 1) é responsável pelo
desenvolvimento de morte celular e fibrose tecidual, o que leva à hipertrofia cardíaca
deletéria e a progressão a insuficiência cardíaca. Por outro lado, a sinalização
seletiva da via da β-arrestina está associada com fenótipos como renovação celular
e regulação de contrações musculares. Desta forma, compostos capazes de ativar
apenas a via da β-arrestina poderiam corresponder a uma nova estratégia
terapêutica no tratamento de doenças cardiovasculares.6
Figura 1. Diferentes efeitos de ligantes sobre o AT1R (adaptado de Aplin et al. 2009).
Dentre os agonistas enviesados para a via da β-arrestina destaca-se o
TRV27, que atualmente encontra-se em ensaios clínicos de Fase IV para o
tratamento de insuficiência aguda descompensada. 9,18,19,20,21 Apesar das vantagens
apresentadas pelo TRV27, sua natureza peptídica o torna farmacocineticamente
inviável por via oral devido a degradação por peptidases gástricas, o que limita o seu
uso ao ambiente hospitalar. Desta forma, entender as diferenças estruturais que
levam a esta seletividade funcional seria o primeiro passo para a obtenção de
fármacos agonistas enviesados de natureza não proteica.
1.3. Planejamento racional de fármacos e modelagem molecular
A modelagem molecular é uma alternativa cada vez mais viável e econômica
no organograma de introdução de um novo fármaco no mercado. Isso se deve aos
9
constantes avanços em diversas áreas, como a caracterização de
biomacromoléculas, conhecimento de processos bioquímicos envolvidos nas bases
moleculares das doenças e, principalmente, da ciência computacional 22,23.
Segundo a IUPAC a modelagem molecular é definida como a investigação
das estruturas e das propriedades moleculares pelo uso de química computacional e
técnicas de visualização gráfica, visando fornecer uma representação tridimensional
de um sistema, sob um dado conjunto de circunstâncias. Nesta definição se
encaixam os sistemas biológicos como os envolvidos na interação fármaco-
biomacromolécula alvo (receptor, enzima, ácido nucléico, canais de íons).
A modelagem molecular pode ser dividida em duas vertentes, o
planejamento direto ou dependente do receptor (SBDD), que utiliza a estrutura
tridimensional da biomacromolécula alvo em complexo com a micromolécula, e o
planejamento indireto ou independente do receptor (LBDD), que se vale somente da
estrutura dos ligantes disponíveis.24,25,26 Como o AT1R ainda não foi cristalizado,
este trabalho recorreu ao LBDD, utilizando um conjunto de ligantes para fornecer os
requisitos estruturais mínimos para a interação com o receptor.
A dinâmica molecular é um procedimento de simulação que consiste na
computação dos movimentos atômicos de uma molécula ou de átomos individuais
ou moléculas em sólidos, líquidos e gases de acordo com as leis newtonianas de
movimento. As forças que agem sobre os átomos são calculadas utilizando um
conjunto de parâmetros e equações chamado de campo de força. Essa técnica
considera a flexibilidade do sistema ao longo do tempo e permite a exploração de
variações conformacionais registradas em um arquivo trajetória, que corresponde ao
perfil de amostragem conformacional (PAC) do sistema investigado. As simulações
de DM têm se tornado ferramenta importante no estudo estrutural de modelos de
biomoléculas para complementar os dados experimentais.27
Segundo a IUPAC, farmacóforo é definido como o conjunto de
características eletrônicas e estéricas necessárias para garantir uma interação
supramolecular ótima em um alvo biológico específico e, deste modo, desencadear
(ou impedir) uma resposta biológica. Uma das formas mais comuns de construção
de um farmacofóro é por meio da sobreposição da estrutura de compostos com o
mesmo mecanismo de ação e alvo. 26 Assim sendo, a dinâmica molecular pode ser
utilizada para fornecer confôrmeros representativos (obtidos em simulações em
condições biológicas) para a criação de um modelo farmacofórico por sobreposição.
10
Neste trabalho técnicas de dinâmica molecular e criação de farmacóforo
foram empregadas com o intuito de se entender o comportamento estrutural e,
principalmente, criar um modelo farmacóforico de agonistas enviesados para o
receptor AT1R.
2. OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho consistiu na construção de um farmacóforo
tridimensional para o receptor AT1 baseado na comparação estrutural entre a
Angiotensina II e um conjunto de agonistas enviesados. Desta maneira, buscou-se
elucidar as características estruturais que poderiam levar moléculas a apresentarem
perfil de agonistas enviesados para esse receptor.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Construção e otimização de geometria dos ligantes
A estrutura da angiotensina II (Ang II) em meio aquoso (RMN) foi extraída da
base de dados PDB (Protein Data Bank) sob o código 1N9V.28 Esta estrutura foi
utilizada como geometria inicial para a construção da série de agonistas enviesados
análogos de angiotensina II (Tabela 1) no programa computacional HyperChem v.
7.5. 29
Tabela 1. Lista de peptídeos agonistas e agonistas enviesados para o AT1R obtidos na literatura. 9,19
Em
negrito estão representadas as substituições feitas em relação à estrutura inicial da Angiotensina II.
Nome Sequência peptidica Ação sobre o AT1R
Ang II Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe Agonista
SI Sar Arg Val Tyr Ile His Pro Ile Agonista enviesado
SII Sar Arg Val Ile Ile His Pro Ile Agonista enviesado
TRV27 Sar Arg Val Tyr Ile His Pro D-Ala Agonismo enviesado
TRV23 Sar Arg Val Tyr Lys His Pro Ala Agonista enviesado
DVG Asp Arg Val Tyr Val His Pro Gly Agonista enviesado
SVdF Sar Arg Val Tyr Val His Pro D-Phe Agonista
11
3.2. Dinâmica Molecular
O pacote GROMACS v. 4.5.6 consiste em um conjunto de programas para a
realização de DMs, minimizações energéticas e análises, sendo utilizado nas etapas
seguintes. 30
3.2.1. Construção do sistema
As estruturas construídas na etapa anterior serviram de input para a geração
de topologias no campo de força Amber99sb*-ildn.31 Cada composto foi colocado no
centro de uma caixa cúbica de simulação de volume 103 ± 1 nm3 distando 1,1 nm da
borda da caixa. Condições periódicas de contorno (PBC) foram usadas. A caixa foi
preenchida com moléculas de água do modelo TIP3P e íons Na+ e Cl- de modo a
neutralizar a carga líquida do sistema e manter a concentração iônica fisológica de
0,15 mols/L.32 Vale ressaltar que o campo Amber99sb*-ildn não possui parâmetros
para o aminoácido sarcosina (Figura 2). Desta forma, a parametrização manual do
campo de força foi realizada baseada em valores validados obtidos na literatura, que
são apresentados na Figura 3.33
Figura 2. Formula estrutural do aminoácido artificial sarcosina (N-metilglicina).
Figura 3. Tipos atômicos, cargas atômicas e ângulo H-C-N do aminoácido sarcosina. Estes
valores foram adicionados ao campo de força AMBER99sb*-ildn.
12
3.2.2. Minimização:
Após a adição de moléculas de água e íons ao sistema, geometrias e
contatos estéricos inapropriados podem surgir. Uma minimização pelo método
Steepest Descent com 10.000 passos foi realizada tendo como critério de
convergência energética o valor de 100 kJ/mol/nm.
3.2.3. Equilibração:
As etapas de equilibração têm por objetivo a adequação das moléculas de
água e íons ao redor do ligante à medida que condições de simulação, como
temperatura e pressão, são gradativamente impostas. Diferente da DM de
produção, as DM de equilibração são realizadas mantendo-se o ligante rígido.
A primeira etapa da equilibiração foi conduzida em ensemble NVT canônico
(NVT- número constante de partículas, volume e temperatura) durante 200 ps.
Utilizou-se o PME (Particle Mesh Ewald) como método de cálculo de interações
elétricas de longa distância com valor de raio de corte de interações de 10 Å.34 O
termostato de Berendsen foi utilizado tendo a temperatura de 310K como referência
e constante de acoplamento de 0,2 ps.35 O acoplamento foi feito separadamente
para o ligante e solvente.
A segunda etapa foi realizada em ensemble NPT (isotérmico-isobárico),
mantendo-se as condições prévias com exceção da adição do barostato de
Parrinello-Rahman, tendo como referência a pressão de 1 bar e constante de
acoplamento de 0,2 ps.
3.2.4. Dinâmicas de Produção:
Cada dinâmica molecular (MD) de produção (sem posição restrita) foi feita
com 5.000.000 passos de 0,002 ps totalizando 10 ns (10.000 ps) de simulação. O
algoritmo Leap-Frog foi empregado para a resolução da equação de movimento
Newtoniana. A temperatura de referência de 310K (temperatura corpórea) e a
pressão de 1 bar foram equilibradas separadamente pelo uso do termoestato V-
rescale e o barostato de Parrinello-Rahman, respectivamente. As coordenadas,
velocidades e energias foram salvas a cada 100 ps. Os arquivos trajetória foram
13
salvos a cada 20 passos de simulação, gerando um PAC de 50.000 confôrmeros
para cada ligante.
Este protocolo de simulação foi baseados no trabalho de Lindorff-Larsen et
al, que realizou a validação sistemática do campo Amber99sb*-ildn com peptídeos
em meio aquoso. 31
3.3 Seleção de Confôrmeros
Os confôrmeros obtidos do PAC de cada dinâmica foram submetidos ao
método de agrupamento por Desvio Quadrático Médio (RMSD) utilizando-se o
algoritmo gromos.36 O RMSD mede o quanto as posições atômicas de uma
determinada conformação diferem de uma conformação modelo. As estruturas com
valores de RMSD inferiores a 0,15 nm entre si foram alocadas no mesmo
agrupamento.
3.4 Construção do farmacóforo
O farmacóforo foi gerado no programa Sybyl 2.0 utilizando-se o módulo
Unity.37 Os confôrmeros selecionados na etapa anterior foram sobrepostos e todos
os grupos semelhantes contidos em um raio de 1Å foram considerados possíveis
grupos farmacofóricos. Os pontos farmacofóricos incluídos na busca foram: aceptor
de ligação de hidrogênio, grupo aromático, doador de ligação de hidrogênio,
hidrofobicidade, centro carregado positivamente e centro carregado negativamente.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Minimização e Equilibração
O sistema de simulação criado para a Ang II consistiu em uma caixa de
simulação cúbica com volume de 103 nm3. Esta caixa continha 3302 moléculas de
água e 20 íons, além da Ang II em seu centro (Figura 4). Os demais compostos
foram simulados nas mesmas condições.
14
Figura 4. Representação da caixa de simulação da dinâmica molecular com a Ang II em seu centro. Moléculas de água e íons foram omitidos.
Os valores de energia potencial na etapa de minimização são apresentados
na Figura 5. Pode-se verificar que após 5000 passos há a formação de uma
assíntota horizontal, indicando a convergência energética do sistema em um mínimo
local.
Figura 5. Gráfico de Energia Potencial da etapa de minimização da Ang II. A energia do sistema
converge para um mínimo local, indicado pela linha vermelha.
15
Os gráficos de controle da etapa de equilibração da Ang II (Figura 6)
mostram que a temperatura do sistema e a densidade da água foram mantidas
constantes, com valores de 310 ± 3,8 K e 987 ± 4,6 Kg/m3, respectivamente. Os
resultados dos demais compostos são apresentados no Anexo (Figuras A2 e A3).
Figura 6. Gráficos de Temperatura (A) e densidade (B) das etapas de equilibração nvt e npt,
respectivamente.
Utilizou-se como critério de estabilidade da dinâmica o valor de RMSD da
cadeia principal dos confôrmeros em relação à estrutura inicial. Para a Ang II, a
estabilidade foi alcançada no intervalo de 6,5-10ns (Figura 7), pois há a manutenção
de um valor médio de RMSD (0,24 nm) acompanhado de uma baixa amplitude entre
o valor máximo e mínimo desse intervalo (0,1 nm) por um longo período (4 ns). Em
contrapartida, quando incluímos as cadeias laterais nessa análise, observa-se um
aumento nos valores de RMSD, refletindo a maior liberdade conformacional das
cadeias laterais.
16
Figura 7. Gráfico de Desvio Quadrático Médio (RMSD) das posições atômicas. Estrutura inteira da
angiotensina em (A) e somente o esqueleto peptídico (B). O intervalo de estabilização da dinâmica é
marcado em vermelho.
Uma avaliação mais precisa foi feita discriminando-se cada um dos átomos
(Figura 8). O gráfico de flutuação do desvio quadrático médio (RMSF) mostra que há
uma maior flexibilidade dos 3 primeiros resíduos (Asp, Arg, Val) e suas cadeias
principais. Os demais compostos apresentaram resultados similares (Figura A5),
com execeção do composto TRV23. Este composto possui o resíduo Lisina, que é
muito flexível, na posição 5 ao invés da isoleucina/valina, o que explica esse
resultado. De fato, essas observações sobre uma maior flexibilidade da porção N-
terminal são descritas em estudos estruturais por ressonância magnética nuclear e
simulações feitas em água e dimetilsulfóxido. 28,38,39
Essa maior rigidez da porção C-terminal poderia ser consequência da
formação de interações intermoleculares, como ligações de hidrogênio e interações
do tipo π-π. Portanto, avaliamos as distâncias entre tirosina, histidina e fenilalanina
(Figura 9), que poderiam fazer estes tipos de interação.
17
Figura 8. Valores de RMSF de cada átomo para a Ang II (esquerda) e TRV23 (direita). OSIntervalos de maior
flexibilidade correpondem as cadeias laterais dos aminoácidos.
Os requisitos para a formação de ligações de hidrogênio incluem a distância
de 1,6-2,4 Å entre o átomo aceptor de ligação de hidrogênio e o hidrogênio; e ângulo
entre eles de 180-150º. Já a interação do tipo π-π tem distância ótima de 3,3-3,8 Å
entre o centro dos dois anéis aromáticos com ângulos próximos de 180º (paralelos)
ou 90º (perpendiculares).40,41 Como mostrado na figura 9, as distâncias entre os
átomos são muito superiores àquelas descritas como mínimas e os ângulos também
não se encontram nos intervalos descritos. Outros estudos teóricos também não
observaram a presença dessas interações quando a Ang II ou análogos são
simulados em água.38,39
18
19
Continuação Figura 9
Figura 9. Estrutura molecular da Ang II e gráficos de distância e ângulo entre os átomos destacados.
4.2 Seleção de confôrmeros
Os confôrmeros obtidos no intervalo de estabilidade de cada dinâmica (Figura
A4) foram submetidos ao método de agrupamento gromos. Um confôrmero de um
agrupamento diferia até 0,15 nm de qualquer outro integrante do mesmo
agrupamento. A aplicação desta metodologia resultou na formação de poucas
dezenas de agrupamentos por composto. Selecionou-se o confôrmero com o menor
valor de RMSD em relação à estrutura da Ang II obtida por RMN (estrutura inicial). A
formação de agrupamentos antes da seleção visou garantir que o confôrmero é
representativo de uma série de outros confôrmeros do mesmo grupo. Os
confôrmeros selecionados são apresentados sobrepostos na Figura 10.
20
Figura 10. Sobreposição dos conformeros selecionados de todos os análogos e Ang II
4.3 Construção do farmacóforo
Diferentes combinações de agonistas e agonistas enviesados foram
sobrepostas resultando na geração de quatro modelos. As informações fornecidas
por esses modelos foram discutidas e combinadas para a geração do modelo final.
Isso foi feito para contornar a baixa disponibilidade de agonistas enviesados, o que
impossibilita a validação estatísitica do modelo. Os modelos criados são
apresentados abaixo:
Modelo 1: Todos os peptídeos foram sobrepostos gerando três pontos
farmacofóricos. Este modelo teve como objetivo identificar os centros comuns para
as duas classes de compostos. Com exceção do ponto correspondente à cadeia
lateral da valina, observa-se que os pontos farmacofóricos encontrados ficaram entre
as posições 6 e 7, ou seja, regiões menos flexíveis da molécula. Apesar disso, a
sobreposição do anel imidazólico da histidina apresentou um ponto farmacofórico
com valor de tolerância de 0,955 Å (Figura 11), quase ultrapassando o limite de 0,1
nm (1 Å).
21
Figura 11. Modelo 1 feito com a sobreposição de todos os compostos. As esferas
coloridas correspondem aos pontos farmacofóricos.
Grupo Doador e Aceptor de Ligação Hidrogênio: Nitrogênio δ do anel
imidazólico da histidina (Tolerância = 0,955 Å).
Grupos Hidrofóbicos: Cadeia lateral da valina (Tolerância – 0,500) e anel da
prolina (Tolerância = 0,500 Å).
Modelo 2: Foram utilizados somente os agonistas enviesados: SI, SII, TRV23,
TRV27 e DVG. Este modelo teve como objetivo identificar pontos farmacofóricos
exclusivos dos agonistas enviesados. O ponto correspondente ao nitrogênio da
ligação peptídica do resíduo 8 apresentou baixa sobreposição (valor de tolerância de
0,985 Å). Contrariamente, a sobreposição de todos os anéis Imidazólicos dos
agonistas enviesados foi feita em uma esfera de raio de 0.500 Å. O centro carregado
negativamente foi outro ponto exclusivo apresentando valor de tolerância de (0,722
Å). O modelo 2 é apresentado na Figura 12:
22
Figura 12. Modelo 2 feito com a sobreposição de todos os agonistas enviesados As
esferas coloridas correspondem aos pontos farmacofóricos.
Grupo Doador e Aceptor de ligação Hidrogênio: Nitrogênio δ da histidina
(Tolerância = 1,000 Å).
Grupo Doador de ligação Hidrogênio: Nitrogênio da ligação peptídica do
resíduo 8 (Tolerância = 0,985 Å).
Grupos Hidrofóbicos: Cadeia lateral da valina (Tolerância = 0,500 Å) e anel
da prolina (Tolerância = 0,500 Å).
Grupo Aromático: Anel imidazólico da histidina (Tolerância = 0,500 Å).
Centro Carregado Negativamente: Carboxilato terminal (Tolerância = 0,722
Å).
Modelo 3: Foram utilizados os agonistas enviesados: SI, SII, DVG e os
agonistas Ang II e SVdF. O objetivo deste modelo foi verificar se a identificação de
algum dos pontos exclusivos do modelo 2 poderia ser feita se dois agonistas
enviesados fossem substituídos por agonistas plenos. Neste modelo temos 6 pontos
farmacofóricos (Figura 13).
23
Figura 13. Modelo 3 feito com a sobreposição dos compostos DVG, SVdF, SI, SII e Ang
II. As esferas coloridas correspondem aos pontos farmacofóricos.
Grupo Doador de ligação de Hidrogênio: Nitrogênio da ligação peptídica do
resíduo 8 (Tolerância = 0,960 Å).
Grupos Doadores e Aceptores de ligação de Hidrogênio: Nitrogênio δ da
histidina (Tolerância = 0,680 Å) e nitrogênio δ da histidina (Tolerância = 0,680
Å) e
Grupos Hidrofóbicos: Cadeia lateral da valina (Tolerância = 0,500 Å) e anel
da prolina (Tolerância = 0,500 Å).
Modelo 4: Foram utilizados os peptídeos SI, TRV23, TRV27. A utilização dos
três agonistas enviesados mais potentes permitiu identificar de maneira mais precisa
os pontos comuns aos agonistas enviesados.9,19 Neste modelo temos 9 pontos
farmacofóricos.
24
Figura 14. Modelo 4 feito com a sobreposição dos agonistas enviesados SI, TRV23 e
TRV27. As esferas coloridas correspondem aos pontos farmacofóricos.
Grupo Doador de Ligação de Hidrogênio: Nitrogênio da ligação peptídica do
resíduo 8 (Tolerância =0,628 Å).
Grupos Doadores e Aceptores de Ligação de Hidrogênio: Nitrogênio ε da
histidina (Tolerância = 0,739 Å) e o nitrogênio δ da histidina (Tolerância =0,739 Å).
Grupos Hidrofóbicos: Cadeia lateral da valina (Tolerância= 0,500 Å) e o anel da
prolina (Tolerância 0,500 Å).
Centro Carregado Negativamente: Oxigênio do carboxilato terminal (Tolerância
=0,739 Å).
Grupo Aromático: Anel benzênico da tirosina (Tolerância = 0,500 Å) e anel
imidazólico da histidina (Tolerância = 0,500 Å).
4.4 Discussão dos modelos e modelo final
Discussão dos modelos:
Nenhum dos modelos foi capaz de gerar um grupo farmacofórico para os
resíduos na posição 1 e 2. Esse resultado era esperado, pois, como dito
anteriormente, a porção N-terminal deste grupo de compostos apresenta grande
liberdade conformacional, o que dificulta a avaliação por sobreposição. A
25
importância da arginina (resíduo 2) para o agonismo é reconhecida, porém, devido à
alta variação de posição apresentada, esse grupamentoe não pôde ser considerado
um ponto farmacófórico.42
Os pontos hidrofóbicos, correspondentes aos resíduos 3 e 5, cadeia lateral da
valina e anel da prolina, respectivamente, aparecem em todos os modelos.
Experimentos com análogos de Ang II rígidos tendo substituições nas posições 3 e
5 indicam que estes resíduos não são essenciais, pois levam a pequenas variações
nos valores de atividade de agonistas e antagonistas.43,44 Já os estudos sobre a
substituição da prolina indicam que o anel em sí parece não interagir com o receptor.
Por ser um aminoácido rígido, sua função se resumiria a manter os demais resíduos
em uma posição definida para interagir com o receptor.42
A comparação entre o modelo 2 e o modelo 4 mostra que o anel aromático da
tirosina é considerado um grupo farmacofórico somente no modelo 4. Quando o
composto SII [(Sar1,Ile4,Ile8)-Ang] é removido do modelo 2, o anel benzênico passa a
ser considerado um ponto farmacofórico, pois há a remoção da isoleucina, que
corresponde ao resíduo 4 neste composto. Todos os outros agonistas enviesados
possuem a tirosina na posição 4 e apresentam potência superior à do composto SII.
9,19 A histidina é outro ponto interessante, pois aparece em todos os modelos. De
fato, diversos estudos de relação estrutura-atividade apontam a tirosina e a histidina
como resíduos essenciais para a atividade agonista, o que justifica a presença
destes dois pontos no modelo final.42,43,44
O nitrogênio da ligação peptídica do último resíduo é outro ponto recorrente,
que aparece nos modelos 2, 3 e 4. Agonistas enviesados fracos, como o TRV26
[(Sar1,Tyr5, Pro7-NH2)-Ang II] e o TRV45 [(Sar1, Arg5, Pro7-NH2)-Ang II são
heptapeptídeos terminados em um grupo amidico, sugerindo que este ponto poderia
ser parcialmente responsável pela atividade agonista enviesada, sendo, portanto,
considerado para o modelo final. 9,18
Quando todos os modelos são comparados, percebe-se que a presença dos
agonistas Ang II e SVdF não permite a formação do grupamento negativo do resíduo
8. De fato, a sobreposição da cadeia principal de todos os compostos (Figura 15)
mostra que as carboxilas terminais dos agonistas enviesados ocupam um espaço
bem definido, diferindo dos agonistas plenos. Esse ponto farmacofórico foi
considerado no modelo final por ser capaz de diferenciar as duas classes de
compostos.
26
Figura 15. Sobreposição do resíduo número 8 de todos os compostos, as cadeias laterais foram
omitidas para melhor visualização. Circulado em azul temos o agrupamento das carboxilas dos agonistas
enviesados e circulado em vermelho temos os agonistas plenos Ang II e SVdF.
A partir da discussão apresentada anteriormente, chegou-se ao seguinte
modelo de farmacóforo:
Modelo Final: Sobreposição dos agonistas enviesados: SI, DVG, TRV23 e
TRV27.
Figura 16. Modelo Final feito com a sobreposição dos agonistas enviesados DVG, SI, TRV23 e
TRV27. As esferas coloridas correspondem aos pontos farmacofóricos.
27
Grupo Doadorde Ligação de hidrogênio: Nitrogênios δ e ε do anel
imidazólico e nitrogênio da ligação peptídica do resíduo 8.
Grupo Aceptor de Ligação de Hidrogênio: Nitrogênios δ e ε do anel
imidazólico.
Grupo Negativo: Carboxilato terminal.
Grupos Aromáticos: Anel benzênico da tirosina e Anel imidazólico da
histidina.
Figura 17. Farmacóforo para o AT1R. Grupo aromático - esfera amarela (Tolerância = 0,500 Å),
Grupo doador e aceptor de ligação de hidrogênio - esfera verde (tolerância = 0,500 Å), grupo
aromático - esfera amarela (Tolerância = 0,500), grupo doador e aceptor de ligação de hidrogênio
- esfera verde (Tolerância = 0,739), grupo doador de ligação de hidrogênio - esfera azul
(Tolerância = 0,650) e grupo carregado negativamente - esfera vermelha (Tolerância = 7,32 Å).
O modelo final apresentado (Figura 17) contem 6 pontos farmacofóricos.
Ressaltamos que os pontos aromático (esfera amarela) e doadores e aceptores de
ligação de hidrogênio (esferas verdes) visam reproduzir o anel imidazólico em sua
totalidade. Além de este anel aparecer em todos os modelos e ser essencial para a
atividade, todos os ARBs no mercado possuem em sua estrutura o anel imidazólico
livre ou fundido a outro anel.45 Desta forma, os pontos negativo (esfera vermelha) e
o doador de ligação hidrogênio (esfera azul) seriam exclusivos para a atividade
agonista enviesada enquanto que os demais pontos seriam essenciais para a
atividade biológica de um modo geral (agonista, antagonista ou agonista enviesada).
28
5. CONCLUSÃO
Neste trabalho simulações de dinâmica molecular foram empregadas com o
intuito de gerar confôrmeros representativos para a geração de um modelo
farmacofórico.
Os resultados dos controles de simulação indicam a construção de um
sistema de simulação estável. Os compostos simulados apresentaram alta liberdade
conformacional, principalmente da porção N-terminal, estando de acordo com
resultados experimentais e com o fato de serem estruturas peptídicas.
A construção de um modelo farmacófórico através da sobresposição de
confôrmeros obtidos por simulação foi bem sucedida. O modelo farmacofórico
gerado apresentou 6 pontos farmacofóricos. Destes pontos, dois são bem
conhecidos e descritos na literatura, porém nossos resultados indicam um ponto
exclusivo dos agonistas enviesados. Apesar da importância do grupo carboxilato ser
conhecida para o agonismo, esses resultados levantam a hipótese de que os
diferentes substituintes no resíduo 8 sejam responsáveis pela indução de mudanças
sutis na disposição espacial do grupo carboxilato que poderiam ser responsáveis
pelo surgimento do perfil agonista enviesado destes compostos.
O modelo farmacofórico gerado nesse trabalho pode ser futuramente
empregado em ensaios de triagem virtual (VS). Os compostos assim selecionados
poderiam ter sua atividade in vivo/in vitro avaliadas como forma de validação do
modelo aqui gerado.
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33
7. ANEXOS
Figura A1. Gráficos de temperature da etapa de minimização de todos os análogos de
Ang II
34
Figura A2. Gráficos de temperature da etapa de equlibração nvt de todos os análogos
de Ang II
35
Figura A3. Gráficos de densidade da etapa de equilibração npt dos análogos de Ang II
36
Figura A4. Gráficos de Desvio quadrático médio da posição atômica (RMSD) de todos os
análogos de Ang II. As linhas vermelhas indicam os períodos de estabilidade conformacional
de cada dinâmica.
37
Figura A5. Gráficos de Média do Desvio Quadrático Médio (RMSF) de todos os análogos de
Ang II. Os picos correspondem as cadeias laterais dos aminoácidos.
38
