Contagem Padrão em Placas

Profa. Leila Larisa Medeiros Marques

1. OBJETIVOS E ALCANCEEstabelecer procedimento para a contagem padrão de

microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis.

Aplica-se a amostras de matérias-primas, água e alimentos. 2. FUNDAMENTOSBaseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluições em

ágar padrão para contagem seguida de incubação em temperatura de 36 1ºC por 48 horas.

3. REAGENTES E MATERIAISVidraria e demais insumos básicos obrigatórios em

laboratórios de microbiologia de alimentos;Ágar padrão para contagem (PCA);Solução salina peptonada 0,1%.4. EQUIPAMENTOSEquipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de

microbiologia de alimentos.

2) Meio de Cultura

2.1) Ágar Padrão para Contagem (PCA):a) Composição:

Triptona 5,0 g

Extrato de Levedura 2,5 g

Glicose 1,0 g

Ágar 15,0 g

Água destilada 1000 ml

• Dissolver os componentes em água destilada.

• O pH final deste meio deve ser 7,0 ± 0,2

• Aquecer até completa dissolução

• Esterilizar em autoclave a 121oC/15 min.

• Observações: na forma desidratada, proceder conforme instruções do fabricante.

Ágar padrão para contagem (PCA) desidratadoPesar o ágar padrão para contagem de acordo com

o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante.

Transferir para recipiente adequado.Adicionar o volume de água destilada

correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução do ágar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme

norma específica do laboratório.Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Esterilizar a 121 ± 1ºC por 15 minutos.Identificar e armazenar adequadamente. 

2.2) Solução Diluente:Solução salina peptonada 0,1% (Diluente):Pesar separadamente os seguintes componentes:Cloreto de sódio - 8,5 gPeptona - 1,0 gÁgua destilada/deionizada - 1000 mLpH 7,0 0,2Transferir para recipiente adequado. Agitar com auxílio de bastão de vidro até dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme

norma específica do laboratório.Distribuir de forma a garantir o volume desejado após a

autoclavação. Identificar e datar.Autoclavar a 121 1ºC por 15 minutos. Armazenar adequadamente.

Obs. MEIOS DE CULTURA:Meios de cultura desidratados fornecidos por diferentes

fabricantes podem apresentar pequenas diferenças em suas composições.

Observar atentamente a quantidade necessária de meio desidratado, em gramas por litro de meio a ser preparado, o modo de preparo, o tempo e a temperatura de esterilização em cada caso.

Ao adquirir meios de cultura, observar atentamente a formulação, comparando-a com aquela indicada neste manual. Às vezes, as diferentes marcas utilizam diferentes termos para uma mesma substância. Por exemplo, os termos triptona e tripticase referem-

se à peptona de caseína obtida por digestão tríptica ou pancreática.

Grupo de risco de componentes de meio de cultura (Instrução Normativa 62 de 2003):

N = nocivo;I = irritante;T = tóxico;H = hidropoluente;P = perigoso para o meio ambiente;C = corrosivo;O = oxidante;F = inflamável;E = explosivo;M = mutagênico;Co = comburente.

 

3. Metodologia e Técnicas de Análise3.1. Técnica de análise:a) Retirar assepticamente 25g ou 25 ml da amostra e preparar

diluições sucessivas;b) Pipetar alíquotas de 1 ml de cada diluição para placas de Petri

(100 x 20 mm) esterilizadas, fazendo de cada diluição placas em duplicata;

c) Adicionar a cada placa 15 a 20 ml de ágar padrão para contagem, previamente fundido e resfriado à temperatura de 44 a 46oC;

d) Homogeneizar com movimentos suaves, em forma de oito (cerca de 10 vezes) e deixar a temperatura ambiente até a completa solidificação do ágar;

e) Após a solidificação, incubar as placas em posição invertida a 35-37oC/48 horas.

Obs.: Leitura:

- Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colônias;

- Amostras de água: Placas que contenham entre 30 e 300 colônias.

Diluições Seriadas:

As diluições seriadas devem ser realizadas para a partir delas se fazer a inoculação nos meios de cultura;

É feita pelo menos uma inoculação de cada diluição Com o alimento diluído, fica mais fácil encontrar uma placa

ideal para se fazer a contagem de microrganismos

AMOSTRA DE ALIMENTO 225 ML DE

DILUENTE(ÁGUA PEPTONADA) Diluição

10-1

ou 1/10ou 0,10

Diluição 10-3

ou 1/1000ou 0,0010

Diluição 10-4

ou 1/10000ou 0,00010

Diluição 10-2

ou 1/100ou 0,010

1 ml 1 ml1 ml

9 mldiluente

9 mldiluente

Homo-geneizar

PLACA

PLACA

PLACA

PLACA

Inoculação: “semeadura pour plate”A partir das diluições seriadas:

10-1 10-310-2 10-4

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

MEIO MEIOMEIOMEIO

PLACA PLACA PLACA PLACA

PLACA

PLACA

PLACA

PLACA

Após inoculação, inverter as placas e incubar em estufa

ESTUFA37oC 24/48 h

Passos da Técnica de Semeadura da Amostra em Passos da Técnica de Semeadura da Amostra em ProfundidadeProfundidade

3.2. Resultado:Transcorrido o tempo de incubação, considerar para

contagem, somente as placas da mesma diluição que apresentarem de 25 a 250 colônias ou 30 a 300, conforme amostra;

Multiplicar a média aritmética das mesmas pelo respectivo fator de diluição e expressar o resultado em Unidades Formadoras de Colônia /1,0 g de amostra (UFC/g)

Exemplo:Placa 10-1 : Acima de 1000 UFC (unidades formadoras de

colônia)Placa 10-2 : 250 UFCPlaca 10-3 : 23 UFCPlaca 10-4 : 0 UFC

A melhor placa para se obter o resultado desta contagem é a placa da diluição 10-2.

Resultado: 250 x 102 = 250 x 100 = 25.000 UFC/g ou mlExpressar o resultado sempre em exponencial: 2,5 x 104

UFC/g de alimento.

4) Significado nos AlimentosEsta contagem detecta em um alimento, o

número de bactérias aeróbias ou facultativas e mesófilas presentes tanto sob a forma vegetativa quanto esporulada;

A contagem padrão em placas (CPP) tem sido usada como indicador da qualidade higiênica dos alimentos, fornecendo também idéia sobre seu tempo útil de conservação.

Sua presença em grande número indica:Matérias-primas excessivamente contaminadas;Limpeza e desinfecção de superfícies

inadequadas;Higiene inadequada na produção;Condições inadequadas de tempo/temperatura

durante a produção ou a conservação dos alimentos, ou uma combinação destas circunstâncias.

OBS 1.: Estudar a aula de microrganismos indicadores- mesófilos!!!!!!!!!!

OBS2.: Para expressão dos resultados, consultar a IN62, 2003 (anexo IV- procedimento para contagem de colônias).