CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA …repositorio.ul.pt/bitstream/10451/8395/1/668029_Tese.pdfséricas de Haptoglobina. À Dra. Joana Freitas pela disponibilidade para o estudo dos

CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA

1

Faculdade de Medicina

Universidade de Lisboa

CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA

ATOPIA E NA ASMA

Tese de Mestrado em

Epidemiologia

MARGARIDA CORTEZ


2

ORIENTADOR

Prof. Doutor Manuel Bicho

Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina de Lisboa


3

Esta Tese de Mestrado foi escrita de acordo com o antigo acordo ortográfico.


4

ÍNDICE

1. NOTAS BREVES ……………….………………………………………………………………………………………………..….6

2. GLOSSÁRIO …………………….…..………………………………………………………………………………….………..….7

3.RESUMO….………………………………………………….…………………………………………………………………..…..13

4. ABSTRACT………….…………………………….……………………………………………………………………………..…..15

5. INTRODUÇÃO . ............................................................................. ........................................... ..17

6. REVISÃO DA LITERATURA………....................................................................................................27

6.1 DESCRIÇÃO DA HAPTOGLOBINA ,DA HEMOGLOBINA E DO METABOLISMO DO FERRO

DERIVADO DA HEMOGLOBINA………………………………………………………………………..………….27

6.2 SÍNTESE DA HAPTOGLOBINA………………………………………………………………………….……..28

6.3 HP COMO PROTEÍNA DE FASE AGUDA…..………………………………………………………………30

6.4 ASPECTOS ESTRUTURAIS E FENÓTIPOS………..………………………………………………….….…31

6.5 O COMPLEXO Hp-Hb…………………….……………………………………………………………….…….…32

6.6 FUNÇÕES FISIOLÓGICAS DA Hp EM GERAL ………………………..………………………………….33

6.7 Hp COMO INIBIDORA DA LIPOXIGENASE E CICLOXIGENASE …………………………..…….34

6.8 Hp COMO ADIPOCINA NA INFLAMAÇÃO NA OBESIDADE ……..………………………………35

6.9 Hp COMO LIGANDO DO CD11/CD18 ………………………………………………………………….…37

6.10 Hp COMO LIGANDO DO CD22 ……………………………………………………………………………..37

6.11 POLARIZAÇÃO DOS MACRÓFAGOS ASSOCIADO À HIPÓXIA ,SINTASE DO ÓXIDO

NÍTRICO (NOS),ARGINASE E POLIMORFISMO DA HP …………….…………………………………….…37

6.12 HAPTOGLOBINA, IMUNIDADE INATA E ATOPIA …….…………………………………………….39

6.13 CD163 E VIAS METABOLIZADORAS DA Hp …….…………………………………………..…………44

6.14 TOLERÂNCIA, DOENÇA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA Hp ……………..…………………52

6.15 PAPEL DAS DCs NA ORIGEM DAS iTregs …………………………….……………………………..…54

6.16 POLUIÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE INDIVIDUAL ASSOCIADA AO POLIMORFISMO DA

Hp …………………………………………………………………………………………………………………………….57

6.17 STRESS OXIDATIVO E POLARIZAÇÃO MACROFÁGICA ……..…………………..…….………57

6.18 PAPEL DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS NA RESPOSTA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA

Hp ……………………………………………………………………………………………………………………………58

6.19 IgE , RECEPTOR DA IgE , RESPOSTA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA Hp ……..…….59


5

6.20 Hp NA NEO-ANGIOGÉNESE , NA MIGRAÇÃO CELULAR E REMODELAÇÃO …….…60

6.21 A HAPTOGLOBINA E A ASMA ALÉRGICA -DOENÇA Th2 ……………………..………..…63

7. OBJECTIVOS DO ESTUDO ……………………………………………………………………………………67

8. MATERIAL E MÉTODOS ………………………………………………………………………………….……68

9. RESULTADOS ………………………………………………………………………………………………..……73

10.DISCUSSÃO E CONCLUSÃO …….…..……………………………………………………………..……. 102

11. BIBLIOGRAFIA …………………………….…………………………………………………………………..108


6

1.NOTAS BREVES A Genética, a Imunologia e a doença alérgica sempre reuniram ente si características científicas

únicas que fizeram despertar cedo em mim o gosto por estas matérias.

Todo o trabalho de investigação sobre a Haptoglobina e sua associação com a doença alérgica só

foi possível graças ao empenho de uma equipa pluridisciplinar do Laboratório de Genética da

Faculdade de Medicina de Lisboa, pelo que os meus agradecimentos vão para : o Prof. Doutor

Manuel Bicho, que tem sido um grande impulsionador da Genética Médica; Prof. Cláudia Marinho

que soube incutir desde o início o gosto pela investigação científica translacional; ao Prof. Doutor

José Augusto Gamito Melo Cristino, Director do Serviço de Patologia Clínica do CHLN, e Dra Helena

Proença pelo apoio dado na central de colheitas do CHLN e nos doseamentos das concentrações

séricas de Haptoglobina. À Dra. Joana Freitas pela disponibilidade para o estudo dos polimorfismos

genéticos , análise e compilação de dados, e à Sra. D. Conceição Gonçalves que se responsabilizou

por organizar a colheita de plasmas de doentes e executar os polimorfismos genéticos da

haptoglobina.

À minha família

O meu muito Obrigado


7

2.GLOSSÁRIO

aa- Aminoácidos

AA-Ácido araquidónico

ACQ7- Questionário de controlo da asma 7

APCs- Células apresentadoras de Antigénio

Apo A1- Apolipoproteína A1

APRE- Elementos de resposta de fase aguda

Asp- Aspergilus

BCR- Receptor do antigénio das células B

BR- Biliverdina redutase

CCL20- quimiocina C-C motivo ligando 20

CCL22- quimiocina C-C motivo ligando 22

CCR6- Receptor de quimiocina tipo 6

CD4- Células Thelper

CD4+CD25+Treg- Células Treguladoras

CD5- Receptor de IgM das células B

CD6- Cluster de diferenciação pertencente à família de receptores capturadores ricos em cisteína

CD8-Células T citotóxicas

CD11/CD18- família de β-integrinas

CD22- Cluster de diferenciação 22 receptor multifuncional transmembranar das células B

CD23- Receptor de baixa afinidade para a IgE

CD40- proteina co-estimuladora das APCs

CD54- Proteina co-estimuladora das células apresentdoras de antigénio

CD86- Proteina co-estimuladora das células apresentdoras de antigénio

CD163- Receptor do complexo Hp-Hb

CD206-Receptor da manose

CIC -Complexos imunes

CO-Monóxido de carbono

COX- Cicloxigenase

CXCL10- quimiocina CXC motivo ligando 10

DAMPs- Padrões moleculares associados a lesão


8

Dcs- Células dendríticas

Dc1- Células dendríticas tipo1

Dc2- Células dendríticas tipo2

DCV-Doença cardio-vascular

DEP- Partículas da exaustão do diesel

Derp1-Alergénio molecular 1 do dematofagoides pteronyssinus

Derp2- Alergénio molecular 2 do dematofagoides pteronyssinus

DNA- Ácido desoxiribonucleico

ECP- Proteína catiónica dos eosinófilos

ECM -Matriz extracelular

Eos-Eosinófilos

FOXP3- Forkhead box p3:marcador das Tregs

Fe2+-Ferro ferroso

Fe3+-Ferro Férrico

FcεRII- Receptor de baixa afinidade para a IgE

FeNO- Òxido nítrico exalado

FEV1- Volume expiratório forçado em 1 segundo

GATA3-Factor de transcrição trans-actuante específico das células T h2

GINA- Linhas de orientação da iniciativa global da asma

GM-CSF- factor estimulante de colónias dos granulócitos-macrófagos

GREs- Glucorticoide e elementos de resposta

Hb- Hemoglobina

HbSR- Receptor capturador da Hb

HDL-Lipoproteína de alta densidade

12-HETE- 12- Hidroxieicosatetraenóicos

HIF1α -factores de transcrição indútiveis pela hipoxia 1α

HIF-2 α -factores de transcrição indútiveis pela hipoxia 2α

HIV-1-Vírus da Imunodeficiência humana tipo 1

HO- Heme-oxigenase

Hp- Haptoglobina

Hp*1 –Alelo 1 da Haptoglobina


9

Hp*2- Alelo 2 da Haptoglobina

Hp1 -1- Homozigóticos para o Alelo 1 da Haptoglobina

Hp2-1- Heterozigóticos para o Alelo1 e 2 da Haptogloina

Hp2-2 - Homozigóticos para o Alelo 2 da Haptoglobina

Hp-Hb- complexo Hp-Hb

ICAM-1- Molécula de adesão intercelular 1

IFNγ- Interferão gama

IgE- Imunoglobulina E

IL-1RI- Receptor da IL-1 tipo1

IL-1-RII- Receptor da IL-1 tipo2

IL-1RA- Antagonista do Receptor da IL-1 tipo1

IL-2- Interleucina 2

IL-4-- Interleucina 4




IL-12-Interleucina 12







iNOS- Sintase do óxido nítrico indutível

ISAC- Immuno Solid-phase Allergen Chip

iTreg- Células T reguladoras induzidas

LBA -Lavado bronco-alveolar

LO- Lipoxigenase

LPS- Lipopolissacárido

M1- Macrófagos activados pela via clássica, tipo1

M2- Macrófagos activados pela via alterna, tipo2


10

M2a- Macrófagos activados pela via alterna ,tipo 2a

M2b- Macrófagos activados pela via alterna, tipo 2b

M2c- Macrófagos activados pela via alterna ,tipo 2c

M4-Macrófagos indutíveis pelas quimocinas plaquetárias

M-DC: macrófagos que originam células dendríticas

Mb-Macrófago indutível pelos complexos Hp-Hb

Mc-Mastócitos

M-CSF- factor estimulante de colónias dos macrófagos

MCP1-Proteína quimioatractiva de monócitos

MDDCs- células dendríticas derivadas dos monócitos

MD2- factor de diferenciação mielóide 2

M-HA: Macrófagos associados à hemorragia

MHC-Sistema major de histocompatibilidade

Mo-Monócitos

M-ox: Células esponjosas

MPO- Mieloperoxidase

mRNA- RNA mensageiro

NADPH oxidase –Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidase

NF-E2- Factor 2 relacionado com o factor nuclear eritróide2

NF-kB- factor nuclear Kβ

NGF- factor de crescimento neuronal

NK-Células natural killer

NLRs- Nod-Like-Receptors

NO- Óxido Nítrico

NO2- Díóxido de azoto

NOS- Sintase do óxido nítrico

NTBI- ferro lábil plasmático não ligado à transferrina

nTreg- Células T reguladoras naturais

NU-Neutófilos

O3-Ozono

24p3- Proteína de fase aguda


11

PAF- factor activador de plaquetas

PAGE -electroforese em gel de poliacrilamida

PAI-1- Inibidor 1 do activador do plasminogénio

PALMs- mediadores lípidicos associados aos pólens

PAMPs- Padrões moleculares associados a patogénios

PAQLQ- Questionário da qualidade de vida do asmático em Pediatria

PAR-2-Receptor activado pela protease

PCR- proteína C reactiva

PD20- Dose de teste de provocação que diminui os débitos respiratórios de 20%

pDc2-Células dendríticas plasmocitóides

PGE2- Prostaglandina E2

PGF2α- Prostaglandina F2α

PKC - proteína quinase C

PPRs- Receptores de reconhecimento de patogénios

PST- Prolina Serina Treonina

RAST- Radioallergosorbent test

RORγT- Factor de transcrição relacionado com o receptor orfão do ácido retinóico- t

RNI- Espécies reactivas de azoto

ROI- Intermediários reactivos de Oxigénio

ROS –Espécies reactivas de Oxigénio

sCD163-Receptor solúvel para o complexo Hp-Hb

SCRC- Receptores capturadores ricos em cisteína

SP-A- Proteina de surfactante A

SP-D- Proteina de surfactante D

STAT3- Transdutor de sinal e activador de transcrição 3

Syk- tirosina cinase

TAM-Macrófagos associados a tumores

Tbet- Factor de transcrição das células Th1

Tconv- Células T convencionais

TCR- Receptor das células T

TGFβ- Factor transformador de crescimento β


12

Th0- Células T naive

Th1- Células Thelper tipo 1

Th2-Células Thelper tipo 2

Th3- Células reguladoras T helper 3

Th17- Células Thelper tipo 17

TLRs-Toll-Like-Receptors

TNFα- Factor de necrose tumoral α

Tr1- Células reguladoras tipo1

Treg- Células T reguladoras

TSLP-linfopietina do estroma tímico

TWEAK -receptor do factor-like de necrose tumoral fraco indutor de apoptose

TxA2-Tromboxano A2

VOC- Compostos orgãnicos voláteis


13

3.RESUMO

Fundamentos: A haptoglobina (Hp), uma alfa2-sialoglicoproteina liga-se à hemoglobina livre (Hb)

e tem sido implicada na modulação da resposta Th1/Th2 interferindo na resposta imune inata e

adaptativa.O locus da Hp localiza-se no cromossoma 16q22, sendo nos humanos, polimórfico

para a cadeia α. A cadeia α da Hp tem 2 alelos major co-dominantes, Hp*1 e Hp*2, com 3

variantes genotípicas, Hp1-1, Hp2-1, Hp2-2.

OBJECTIVOS: Doentes asmáticos (controlados e não controlados) foram comparados com um

grupo controlo para :1) Avaliar as frequências alélicas e genotípicas da Hp no grupo controlo e no

grupo de doentes asmáticos e dentro dos asmáticos entre controlados e não controlados.

2)Determinar os níveis de Hp nos controlos e asmáticos.3) Estabelecer a relação entre o genótipo

da Hp e fenótipo intermédio/endótipo (níveis de Hp) no doente asmático e compará-lo com o

grupo controlo.4) Verificar se a relação genótipo de Hp e fenótipo intermédio/endótipo (níveis de

Hp) está relacionada com a gravidade da asma (comparar asmáticos controlados com não

controlados).

Material e Métodos: 114 doentes asmáticos e 50 controlos. Níveis de Hp ,determinados por

nefelometria e genótipos por electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) . A análise estatística

foi realizada com o software estatístico PASW versão 18, tendo-se estabelecido um nivel de

significância de p< 0.05.

Resultados: A distribuição das frequência alélicas Hp*1 e Hp*2 e das frequências genotípicas (Hp

1-1 , Hp 2-1 , Hp 2-2 ) não apresenta diferenças estatísticamente siginificativas entre o grupo de

doentes asmáticos e grupo controlo (p>0,05).

Os diferentes genótipos também não parecem estar associados ao risco de se ter asma brônquica

quando comparados com o grupo controlo , ou da asma poder estar ou não controlada, e

portanto ser de maior gravidade dentro do grupo de asmáticos (p>0,05).

Dentro dos asmáticos,na distribuição de frequências de genótipos também não há diferenças

estatísticamente significativas entre sexo masculino e feminino , por grupo etário , alérgicos e não

alérgicos, não-controlados e controlados e por raça (p>0,05).

No grupo controlo não há diferenças estatísticamente significativa dos níveis de Haptoglobina por

genótipo e por grupo etário (p>0,05).


14

Em comparação com o grupo controlo verificou-se que os asmáticos têm sempre níveis mais

baixos (125,13±50,95vs137,86±51,39mg/dL) de Hp quando comparados com o grupo controlo

sendo essa diferença apenas significativa nos genótipos Hp2-2 (95,60±41,43 vs

128,40±51,48mg/dL) (p<0,05).

Nos asmáticos os níveis de Hp não apresentam diferenças estatísticamente significativas entre

asma controlada e não controlada , alérgicos e não alérgicos, sexo masculino e feminino e por

raça (p>0,05), mas é estatísticamente diferente entre idade> 30 anos e <15 anos (135.6±50.05 vs

87.45± 38.89 mg/dL) ( p<0.05).

Nos asmáticos os níveis de Hp apresentam diferenças estatísticamente significativas por genótipo

(p=0,000).

Os Hp 2-2 apresentam níveis mais baixos de proteína circulante quando comparados com Hp 2-1

e Hp 1-1(95,6 ± 41,93 vs 137,37±49,58 vs 146,09±47,37mg/dL) , e a diferença é estatísticamente

significativa (p=0.000 ). Em doentes com idade ≥15 anos os níveis de Hp são diferentes por

genótipo (p<0.05): 1-1 e 2-1 diferem do 2-2. Em doentes com idade <15 anos os níveis de Hp não

são diferentes entre os genótipos(p>0,05). Numa análise pos-hoc o genótipo Hp 2-2 mostrou-se

um factor independente associado aos níveis mais baixos de Hp, assim como a idade< 15 anos.

Conclusão: Apesar de não termos encontrado diferenças estatísticamente significativas entre a

distribuição alélica e genotipica da Hp no grupo de doentes asmáticos quando comparados com o

grupo controlo, verificámos que os asmáticos têm níveis mais baixos da Hp circulante quando

comparados com controlo e que essa diferença está associada ao genótipo Hp2-2. Nos asmáticos

os níveis de Hp são diferentes por genótipo( com idade ≥15 anos) devido aos níveis mais baixos de

Hp associados ao Hp2-2 quando comparado com os outros genótipos. Dado que os níveis de Hp

são mais baixos no grupo etário com menos de 15 anos, sugere-se que estudos futuros sejam

controlados em relação à idade. Os dados obtidos sugerem diferenças entre grupos que poderão

estar relacionadas com os genótipos da Hp, e possívelmente com diferentes perfis imunológicos .

Palavras-Chave : POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA; ASMA BRONQUICA.


15

4.ABSTRACT

Background: Haptoglobin (Hp), an alfa2-sialoglycoprotein known to bind free hemoglobin (Hb)

has been implicated in modulation of Th1/Th2 response ,intervening in innate and adaptive

immune response.The Hp locus is situated at 16q22 chromosome, being in humans ,

polymorphic for the αchain . The α chain of Hp has 2 major co-dominant alleles Hp*1 and Hp*2,

with 3 genotype variants, Hp1-1, Hp2-1, Hp2-2.

Aims: In asthmatic patients (controlled and uncontrolled) when compared with control group:1)

Determine genotype and allelic frequencies of Hp between control group and asthmatics, and in

this group: between controlled and uncontrolled asthma. 2) Determine Hp levels in control group

and make a comparison with asthmatics.3) Establish a relation between genotype of Hp and

intermediate phenotype/endotype (Hp levels) in asthmatics and compare with control-group.4) To

verify if the relation between Hp genotype and intermediate phenotype/endotype (Hp levels) is

related with the severity of asthma ( compare controlled and uncontrolled asthma).

Material and Methods: 114 asthmatic patients and 50 controls were studied. The Hp levels were

determined by nephelometry and genotypes by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).

Statistical analysis was performed with statistical software PASW version 18, having established

a level of significance of p< 0.05.

Results: Allelic (Hp*1 e Hp*2 ) and Hp genotype (Hp 1-1 , Hp 2-1 , Hp 2-2 ) distribution in

asthmatics, are not statistical different from control group (p> 0.05). The different genotypes

seem not to be related with an increased risk of having asthma when compared with the control

group, or that the asthma could be controlled or uncontrolled among asthma patients (p>0,05).

There is no statistical differences in the asthmatics between, gender, age-group, atopics and non-

atopics, controlled and uncontrolled and by ethnic group (p>0,05).

In control group there is no statistical differences in Hp levels by genotype and age-group (p>0,05).

When we compare asthmatics with control group we verified that in asthma , the levels of Hp are

always lower than in the control group (125,13±50,95vs137,86±51,39mg/dL) and there was a

statistical difference in Hp2-2 genotype (95,60±41,43 vs 128,40±51,48mg/dL) (p<0,05).

In asthmatics Hp levels, were no different between controlled and uncontrolled asthma, atopics

and non-atopics, gender and ethnic group (p>0,05).But is statistical different between ages >30

years and <15 years (135.6±50.05 vs 87.45± 38.89 mg/dL) ( p<0.05).


16

In asthmatics Hp levels, present statistical differences by genotype (p=0,000).

Those who express Hp 2-2 had the lower levels of the circulating protein when compared with

Hp 2-1 and Hp 1-1(95,6 ± 41,93 vs 137,37±49,58 vs 146,09±47,37mg/dL) ,and it is statistical

different (p=0.000 ).In those asthmatics with age ≥15 years Hp levels are different by genotype

(p<0.05): 1-1 and 2-1 differ from 2-2. Those patients with age <15 years, Hp levels were no

different between genotypes (p>0,05). In a pos-Hoc analysis Hp 2-2 is an independent factor, as

age <15 years, associated with lower levels of Hp.

Conclusion: Although no statistical differences were find between Hp genotype and allelic

distribution in the group of asthmatics when compared to control group we verified that

asthmatics had lower levels of the circulating Hp when compared to the control-group and that

this difference is associated with Hp 2-2 genotype. In asthmatics, Hp levels are different between

genotypes (with age ≥15 years) because Hp levels are lower in the Hp2-2 genotype when

compared with the other genotypes.In the future, studies done with Hp should be controlled by

age , because the Hp levels are lower in the pediatric group. These data point to differences

among groups that could be related to Hp genotypes , and possibly with different immunological

profiles.

Keywords: HAPTOGLOBIN POLYMORPHISM; BRONCHIAL ASTHMA.


17

INTRODUÇÃO A haptoglobina (Hp)é uma alfa 2-sialoglicoproteina (proteina de fase aguda) que tem como

funções básicas: a ligação à hemoglobia (Hb); anti-inflamatória/anti-oxidante; activação dos

neutrófilos; regulação do transporte do colesterol através da HDL( lipoproteina de alta densidade),

inibição da lipoxigenase(LO) e cicloxigenase (COX), imunomodulação; angiogénese (proliferação e

diferenciação das células endoteliais); remodelação; interação com CD11/CD18 e CD22; adipocina;

interfere com a atopia IgE mediada e inflamação eosinofílica1,2.

O complexo Hp-Hb leva a uma reciclagem da globina e grupo heme. A Hb livre pode ser altamente

lesiva através da acumulação de radicais hidroxilo: H2O2+Fe2+→Fe3++OH-+OH → Reacção de

Fenton.

Há duas formas de metabolizar o complexo Hp-Hb, uma é no hepatócito e outra nos monócitos-

macrófagos através do receptor CD1633 (Figura 1)

Figura 1: Receptor do complexo Hp-Hb

Macrófago

Bilirrubina

Biliverdina

Endocitose

Hp-Hb degradado

Macrófago

Bilirrubina

Biliverdina

Endocitose

Hp-Hb degradado


18

A haptoglobina é composta de 2 subunidades: cadeias leves alfa(9-18kDa) e cadeias pesadas beta

(38-42kDa), sendo o locus da Hp nos humanos localizado no braço longo do cromossoma 16q22

polimórfico para a cadeia alfa.

A Hp é constituida por 2 tipos de cadeias polipeptídicas: beta (pesadas :de 40 kD) e alfa(leves:

alfa1 de 8.9kD e alfa2 de 16kD ). As cadeias beta são idênticas em todos os fenótipos de Hp e as

variantes devem-se à presença das cadeias alfa.

A cadeia alfa da Hp é polimórfica com dois alelos co-dominantes Hp*1 e Hp*2 que dão origem a 3

variantes genotípicas/fenotípicas:Hp1 -1(dímero)86 kDa, Hp2-1(polímero linear) e Hp2-2 (polímero

cíclico) 170-900 kDa.

O alelo1 contém 5 exões , o alelo2 terá sido originado provávelmente a partir de 2 alelos 1 e como

resultado tem uma duplicação dos exões 3 e 4 do alelo1.

A frequência do alelo Hp*1(alelo selvagem) varia muito com a região geográfica, sendo no sudeste

Asiático de 0,10, na América do sul 0,80 e na Europa 0,384.(Figura 2)

Figura 2: Frequência do alelo 1 na Europa


19

Cada um dos fenótipos tem diferente afinidade para a Hb, diferente resistência ao stress oxidativo,

e diferente papel imunoregulador5,6.

O Hp*1 é mais eficiente a lidar com a Hb e é mais eficiente na resposta ao stress oxidativo do que

Hp*2.

Cada genótipo/fenótipo tem diferente afinidade para a Hb, diferente resistência ao stress

oxidativo e diferente papel imunoregulador e angiogénico/remodelação vascular e muscular

(Figura 3).

A Hp actua como anti-oxidante não só por se ligar à Hb e estabilizar o ferro contido nas bolsas da

Hb , mas também porque promove a sua captura através do receptor CD163.

Figura 3: Fenótipos da Haptoglobina7

A existência de vias comuns às doenças com factores de susceptibilidade individual/genéticos

(polimorfismo da Hp) associados a marcadores subclínicos/fenótipos intermédios/endótipo

(níveis de Hp pex.) tendo como alvo o fenótipo distante :doença (ASMA neste caso) permite uma

abordagem translacional da Medicina .

Subunidade 1

Subunidade

Subunidade 2

Subunidade 1

Subunidade

Subunidade 2


20

Por seu lado a prevalência da doença alérgica tem vindo a aumentar de forma alarmante nos

últimos 50 anos.Sabe-se que 80 milhões de europeus sofrem de doença alérgica e 30 milhões têm

asma. Em Portugal 20% têm alergia, sendo actualmente uma probabilidade de 1 em cada 5 ter

alergia.

Pensa-se que em 2015: 1 em cada 2 Europeus terá doença alérgica.

Os alérgénios são normalmente proteínas ou derivados proteicos que em indivíduos susceptíveis

podem provocar uma reacção imunológica alérgica mediada por IgE.Os mais conhecidos são:

ácaros, pólens, faneras de animais, fármacos, latex, alimentos.

A biotecnologia veio permitir a caracterização molecular dos alergénios (Figura 4).

Figura 4: Alergénio recombinante purificado da ambrosia

As alergias,e a asma alérgica são doenças mediadas imunológicamente em que a resposta Th2 é

um pré-requisito para a reacção de hipersensibilidade de tipo I com produção de IgE8-12.

No caso dos pólens, há libertação de proteínas alergénicas e não alergénicas/bioactivas com

capacidade pró-inflamatória e imunomoduladora (Figura 5).


21

Figura 5: Pólens e proteína bioactivas com capacidade pró-inflamatória e imunomoduladora

Tal como nos pólens, nos ácaros, a inflamação alérgica é o resultado da polarização Th2, e da

activação do sistema imune inato. Esta activação é feita através do alergénio ele próprio e dos

sinais de perigo presentes no ambiente ou associados ao alergénio:em que intervêm os

PRRs(receptores de reconhecimento de patogénicos ou padrão): PRRs sinalizadores (Toll-Like-

Receptors membranares; citoplasmáticos NodLikeReceptors )ePRRs endociticos( destaca-se o

receptor da Hp-CD163).PAMPs(padrões moleculares associados a patogénios (LPS e beta glucans)

e DAMPs(padrões moleculares associados a lesão)que são reconhecidos pelos PRRs.

O receptor de captura da Hp dos macrófagos CD163 (HbSR) é um membro da família de

receptores de captura ricos em cisteína (SRCR). Este tipo de receptores foram inicialmente

estudados pela sua capacidade de se ligar e internalizar lipoproteínas modificadas, pelo que se

pensou que poderiam ter um papel na aterosclerose. Os receptores capturadores também

Alergénio CofactoresAntropogénicos

ComplexoParticula

-alergénio

Adjuvantes Th2

Activação das células T

Resposta imune alergénio-específica

Lesão epitelial

FitoprostanosOxilipinas

Quimiotaxia

Proinflamatório Imunomodulador

DC-IL12 baixoCCL22 alto

Nitração proteica

Coexposição

“Neo”-alergénios

Alergénio CofactoresAntropogénicos

ComplexoParticula

-alergénio

Adjuvantes Th2

Activação das células T

Resposta imune alergénio-específica

Lesão epitelial

FitoprostanosOxilipinas

Quimiotaxia

Proinflamatório Imunomodulador

DC-IL12 baixoCCL22 alto

Nitração proteica

Coexposição

“Neo”-alergénios


22

funcionam como receptores de reconhecimento padrão para uma série de agentes patogénicos,

podendo interferir na resposta a estes e potenciar/associar-se à resposta ao alergénio. O CD163

estando envolvido na endocitose do complexo Hp/Hb controla o stress oxidativo associado à

hemólise, assim como através de vias efectoras monócito/macrofágica tem um papel

imunoregulador importante13.

A resposta alérgica é o resultado de uma complexa interacção entre a predisposição genética, a

exposição alergénica e factores ambienciais (Figura 6).

adjuvante causa

Alergénios

Tamanho e PM

Hidrofobicidade

Pregueamento

proteico

Estabilidade

Solubilidade

Oligomerização

Modificação pós-

translacional da função

PREDISPOSIÇÃO GENÉTICA

P.EX.: DISFUNÇÃO DE BARREIRA;

DESREGULAÇÃO DE CITOCINAS

Ausência de

factores

protectores.

Cofactores

biogénicos e

antropogénicos

p. Ex.: PALMs; LPS;

NADPH oxidase;

DEP; NO2; O3;

compostos voláteis

orgãnicos.

Irritantes: emissão

de partículas;

exposição a

tabagismo; NO2;

O3; infecção;

exercício.

Sensibilização alérgica

Hiperreactividade das vias aéreas

Asma Alérgica

Figura 6: Predisposição genética - exposição alergénica e factores ambienciais

O resultado final da sensibilização alergénica é a inflamação, aqui documentada com as vias aéreas

de um asmático (Figura 7).


23

Figura 7: Vias aéreas do asmático

A resposta imune adaptativa divide-se em dois grandes grupos:Th1 e Th210,estando os primeiros

relacionados com as doenças autoimunes e os segundos com a atopia.Quando o papel das Treg (

naturais ou induzidas)falha haverá emergência de um perfil Th1 ou Th2, havendo aumento da

expressão dos factores de transcrição correspondentes à diferenciação celular a partir das células

T naive.Tendo no entanto as células Treg um papel importante na inflamação crónica e

remodelação tal como os diferentes polimorfismos da Hp. Quando há falência da regulação T

(Th1eTh2) há perda de tolerância e emergência de doença- neste caso doença alérgica (Figura 8).


24

Figura 8: Resposta imune inata e adaptativa

Figura 9: Resposta imune inata e adaptativa


25

Na resposta alérgica a proteínas ambientais, a imunidade inata aparece como orquestrador da

resposta adaptativa Th2, através da interacção das células APCs, na presença do MHC classe II ao

TCR das células Th0 (Figura 9). Os alergénios (Figura 10) podem activar a imunidade inata através

de actividade proteolítica, ligação a receptores de reconhecimento padrão, mimetismo molecular,

ou complexos de sinalização dos Tol like receptor (TLR), actividade ligante com lípidos e potencial

oxidativo14.

Figura 10: Alergénios e resposta imune inata

Tal como as células Th também os macrófagos se polarizam em M1 e M2 (Figura 11), em resposta

a uma série de estímulos ambientais. Os M1 são activados pela via clássica: IFN gama, LPS e levam

a uma polarização Th1 enquanto os macrófagos M2 são activados pela via alterna: IL-4,10,13 e

expressam o receptor CD163 para a Hp nos macrófagos e o receptor para a IgE (CD23-macrófagos

M2a).

Alergia Tolerância

Activação da PAR-2

Clivagem do Sp-D e SP-A

Mais alergénio disponivel

Aumento da permeabilidade epitelial

Polen

-glucano

Alergia Tolerância

Activação da PAR-2

Clivagem do Sp-D e SP-A

Mais alergénio disponivel

Aumento da permeabilidade epitelial

Polen

-glucano


26

Figura 11: Polarização M1/M2

A Hp é também um excelente suppressor da proliferação T. Os macrófagos activados pela

endocitose do complexo Hp2-2:Hb através do receptor CD163 desviam a respostaT helper para um

perfil Th1 enquanto que os macrófagos activados pela endocitose do complexo Hp1-1:Hb

produzem citocinas Th2 .Este balanço na resposta T, é particularmente importante no espaço

extravascular, através da expressão local de Hp, minimizando a lesão tecidular.No espaço

extravascular as células dendríticas, respondem a sinais de alerta (stress oxidativo, etc..) e

interagem com antigénios/alergénios10,15.

O polimorfismo genetico para a cadeia alfa da Hp pode levar a uma diferente activação e

polarização dos macrófagos M1(IL-12 alto,IL-23 alto,IL-10 baixo) ou M2(IL-12 baixo,IL-23 baixo, IL-

10 alto; elevada expressão do receptor da manose CD206 e do receptor para o complexo Hp-Hb

CD163), na imunidade inata, derivando daí uma activação preferencial M2 e consequentemente

uma resposta adaptativa Th2.

Polarização M1 Polarização M2

Inflamação Tipo IDestruição tecidular

Morte de parasitas intracelularesResistência tumoral

Inflamação Tipo IIRemodelação tecidular e

angiogéneseEncapsulação de parasitas

Crescimento tumoral

Quimiocinas M1 (CXCL10)ROI; RNI

Quimiocinas M2 (CCL22)Receptores: CD163, CD23, manose e

galactose

IL4/IL13, glucocorticoides, TGF

Polarização M1 Polarização M2

Inflamação Tipo IDestruição tecidular

Morte de parasitas intracelularesResistência tumoral

Inflamação Tipo IIRemodelação tecidular e

angiogéneseEncapsulação de parasitas

Crescimento tumoral

Quimiocinas M1 (CXCL10)ROI; RNI

Quimiocinas M2 (CCL22)Receptores: CD163, CD23, manose e

galactose

IL4/IL13, glucocorticoides, TGF


27

6.REVISÃO DA LITERATURA

6.1.DESCRIÇÃO DA HAPTOGLOBINA ,DA HEMOGLOBINA E DO METABOLISMO DO FERRO

DERIVADO DA HEMOGLOBINA

O Ferro16 derivado da Hb, pode catalizar um certo número de reacções oxidativas que podem ser

inibidas pela Hp.Primeiro o Ferro ferroso (Fe2+) do heme pode reagir com o peróxido de

hidrogénio e originar Ferro férrico (Fe3+) e espécies altamente reactivas de radicais hidroxilo. Este

tipo de radicais podem iniciar o processo de peroxidação lipídica.

O ferro ferroso (Fe2+) pode também reagir com o peróxido de hidrogénio e produzir

ferrilhemoglobina, que é uma molécula altamente instável e que reage em seguida com uma

segunda molécula de peróxido de hidrogénio para originar Ferro férrico (Fe3+) e anião superóxido.

A capacidade lesiva do anião superóxido por um lado deve-se a : redução do Ferro férrico da Hb

(Fe3+) a ferro ferroso (Fe2+) levando a mais radicais hidroxilo e dismutação do anião superóxido

para produzir peróxido de hidrogénio e ROS-espécies reactivas de oxigénio.

Em todas estas reacções, o ferro derivado do heme continua na bolsa heme da molécula de

globina. No entanto o ferro férrico com Fe3+, também conhecido como metahemoglobina, pode

expontâneamente transferir a metade heme, que passaria para ambientes lipofílicos como as LDL

ou as membranas celulares. Uma vez no “novo” ambiente lipídico, o ferro do heme pode reagir

com o peróxido de hidrogénio ou com os lípidos peróxidos adjacentes gerando uma cascata de

radicais livres e extensa oxidação lipídica.

O Ferro17 é capaz de gerar radicais livres de Oxigénio altamente reactivos como os radicais

superóxido e hidroxilo sob circunstâncias fisiológicas.No entanto a maioria do ferro do nosso

organismo está armazenado ligado a proteínas como a transferrina e ferritina, nas quais o ferro

esta redox inactivo e incapaz de oxidar substractos. Nos últimos 10 anos, ficou claro que existe um

pool de ferro que não está ligado a estas proteínas e que é redox activo(NTBI-ferro lábil plasmático

não ligado à transferrina). O NTBI representa um número de espécies moleculares, entre as quais

o complexo Hp-Hb.

A Hp é uma proteína plasmática que se liga com alta afinidade à Hb.Enquanto que o ferro heme da

Hb é um potente oxidante, a ligação à Hp diminui a capacidade oxidativa.No homem o fenótipo

Hp2-2 é incompetente no bloqueio da capacidade oxidativa mediada pelo ferro derivado da Hb,


28

enquanto que o complexo Hp1-1Hb é redox-inactivo.Pelo contrário o complexo Hp2-2Hb contém

ferro não ligado à transferrina redox-activo.Foi verificado que na placa aterosclerótica há mais

ferro extracelular no fenótipo Hp2-2, assim como o tráfego intracelular do complexo Hp2-2Hb

também está comprometido.

A Hp18 surge como anti-oxidante porque previne a oxidação que deriva da Hb. A ligação

estoiquiométrica da Hp à Hb só estabiliza a metade de ferro-heme e promove a sua captura pelo

receptor CD163 dos macrófagos, através da endocitose receptor-mediada.Esta mesma capacidade

da Hp proteger contra a oxidação produzida pela Hb fica comprometida na Diabetes com a

glicosilação da Hb.Mais uma vez a depuração do complexo Hp-Hb que na Diabetes assume vital

importância está mais acelerada nos Hp1-1Hb do que nos Hp2-2Hb, o que conduz nestes últimos a

maior stress oxidativo e doença cardiovascular.

Como 75% do ferro total está ligado à Hb, as diferenças genéticamente determinadas na

disponibilização e metabolismo do ferro derivado da Hb vão ter profundas consequências no

metabolismo do ferro e no potencial oxidativo induzido pelo ferro.

A Hp19 que é abundante no plasma liga-se à Hb formando um complexo estável, acelerando a sua

clepuração .O complexo Hp1-1Hb é eliminado 2x mais rapidamente que o Hp2-2, derivando deste

um maior risco de lesão tecidular oxidativa associada à Hb livre.Uma das consequências deletérias

da Hb livre é a captura do óxido nítrico pela Hb através da reacção de dioxigenação envolvendo Hb

oxigenada em que HbO2 representa o O2 ligado à Hb e MetHb refere-se a methemoglobina com

heme férrico (oxidado).

A afinidade com que a Hb se liga à Hp é de aproximadamente (Kd ~ 10−12 M) . As proteínas de Hp

que provêm dos alelos 1 e 2 diferem nas propriedades bioquímicas e biofísicas e podem ser

eliminadas através do complexo Hp-Hb via receptor CD163 dos monócitos/macrófagos.

6.2.SÍNTESE DA HAPTOGLOBINA

A Hp é na sua maioria sintetizada1,16 no fígado, e parte no pulmão, pele, baço, rim e tecido

adiposo.É uma proteína de fase aguda. A Hp é importante em muitas doença pulmonares, tendo

um importante papel imunoregulador. A Hp expressa-se em níveis elevados em células específicas

incluindo os macrófagos alveolares e eosinófilos no pulmão com inflamação e com doença, mas

não no pulmão saudável.A síntese da Hp aumenta com a hormona de crescimento, insulina, LPS,

prostaglandinas e citocinas como a IL-6.


29

A semi-vida da Hp é 3,5 dias, e a semi-vida do complexo Hp-Hb é de 10 minutos, O complexo Hp-

Hb é removido por ligação ao receptor CD163 da superfície de monócito-macrófagos. A expressão

de CD163 está aumentada pelos glucocorticoides, IL-6, IL-10. Além de ser detectada no plasma,

também pode ser detectada na urina, fluido sinovial, líquido ascítico, líquor e líquido pleural.

A Hp é uma glicoproteína de fase aguda plasmática20, composta por duas cadeias alfa : alfa1 e

alfa2 e uma cadeia beta (15, 20 e 40b kDa).

Jayle e Polonovski-1º trabalho sobre Hp em 1938- descrevendo a Hp como uma substância

plasmática que interage com a Hb.O gene da Hp está localizado no braço longo do cromossoma

16q22. A função primária da Hp é a sua ligação à Hb livre para protecção contra o stress oxidativo

ou espécies reactivas de O2(ROS) e facilitar a sua captação por receptores como o CD163.

Após mais de 60 anos de investigação ligada à Hp, ela é reconhecida como proteína multifuncional

envolvida na regulação de múltiplos processos tais como: resposta imunológica, angiogénese,

síntese de prostaglandinas e transporte de colesterol.

Devido ao polimorfismo genético, tem sido alvo de interesse no campo da genética e bioquímica.

O gene humano da Hp existe em 2 formas alélicas Hp*1 e Hp*2. O Hp*2 vem de uma duplicação

intragénica de um fragmento de 1,7 kb deDNA do gene Hp*1.

O polimorfismo genético da Hp com os 3 genótipos Hp1-1, Hp2-1, Hp2-2 resulta da expressão dos

2 alelos Hp*1e Hp*2 no cromossoma 16q22. Há marcadas diferenças geográficas: os

asiáticos mostram frequências do Hp2-2 de 55% enquanto os Europeus apresentam frequências

de cerca de 30%. Na Europa Noroeste, as frequências de genótoipos são: Hp1-1:16%, Hp2-2: 36%,

Hp 2-1 :48% correspondendo a frequências alélicas de 0,4 Hp*1 e 0,6 Hp*2. No sudeste asiático a

frequência do Hp*1 é 0,1% enquanto na América do sul é 0,8%..

Os fenótipos têm grande heterogeneidade molecular, sendo os Hp1-1 pequenas moléculas de

86kDa, os Hp 2-1 são heteropolímeros (86-300kDa) e os Hp2-2 são grandes complexos

macromoleculares com 170-900kDa. As diferenças estruturais vão ter consequências funcionais

sendo os Hp1-1 associados a hipersensibilidade ao sal , HTA essencial e asma alérgica , enquanto

os Hp2-2 estão associados a progressão da doença aterosclerótica, como a doença isquémica


30

coronária e enfarte agudo do miocárdio, doença arterial periférica e complicações vasculares da

diabetes e doenças autoimunes4,8.

6.3.Hp COMO PROTEÍNA DE FASE AGUDA

A Hp pertence ao grupo de proteínas de fase aguda (PFAs) que aparecem durantea reacção de

fase aguda (RFA) que aumentam após libertação de IL-6, TNF- alfa, glucocorticoides e

catecolaminas. A reacção de fase aguda foi definida pela primeira vez em 1941 por Abernethy e

Avery e correspondem à resposta do organismo à lesão, infecção ou trauma tecidular, assim como

alterações imunológicas como a asma alérgica e as doenças autoimunes.Compreende uma

complexa cascata de reacções que têm como objectivo prevenir futura lesão tecidual, eliminar

organismos infecciosos e aumentar o processo de cicatrização.Este processo é iniciado pelos

macrófagos dos tecidos envolvidos ou pelos monócitos circulantes e pelas citocinas

libertadas.Estas citocinas libertadas actuam localmente sobre fibroblastos e células endoteliais

criando uma segunda vaga de citocinas e outros mediadores que vai acentuar a reacção de fase

aguda local e sistémica.Daqui resulta o recrutamento de leucócitos, e outras células para o local de

inflamação e sistémicamente actuam na resposta imunológica, medula óssea e fígado.

A síntese de proteínas de fase aguda,PFA, é controlada pelas citocinas que actuam directamente

na superfície dos hepatócitos levando à síntese de PFA. As PFA tipo 1 são reguladas pela IL-1, TNF-

alfa, enquanto as de tipo 2 são reguladas pela IL-6 . Os genes das PFA ficam activados com IL-6 e

posteriormente a resposta é amplificada pela TNF-alfa e IL-1. A Hp é uma PFA tipo 2 nos humanos

e tipo 1 no ratinho, após indução pela IL-6 a transcrição do gene é mediada por proteínas

sinalizadoras como a STAT3.Depois da ligação da IL-6 ao seu receptor, a STAT 3 é activada do lado

citoplasmático do receptor da IL-6 por fosforilação. Ao ser activada passa para o núcleo onde se

processam os 3 mecanismos reguladores mais importantes do gene promotor da Hp.

A Hp existe sobretudo no plasma, mas também pode ser encontrada noutros fluídos como: leite,

urina, LCR (líquor), fluido amniótico e saliva.

O mRNA da Hp pode ser encontrado no baço, timo, coração, pulmão, rim, exsudado vaginal, pele,

adipócitos após estimulação com LPS .Assim como nas células epiteliais do pulmão e do tecido

reprodutor.

Adicionalmente, macrófagos, eosinófilos e queratinócitos da epiderme expressam Hp.


31

Para além do seu efeito regulador, as citocinas podem também actuar através do eixo

hipótalámo-hipófise-supra-renal na produção de PFA. Ao aumentar a produção de

glucocorticoides, através da ACTH (Hormona adrenocorticotrópica) que aumenta durante a fase

aguda. Os glucocorticóides por sua vez, aumentam a produção de PFA no hepatócito, e diminuem

a produção de citocinas pelos monócitos e macrófagos por outro.No entanto a expressão de Hp

nos hepatócitos é baixa quando comparada com a via directa.Suspeita-se que poderá haver um

receptor para os glucocorticoides no gene promotor (região reguladora que está a uma curta

distância da extremidade 5’ de um gene e que actua para ligação da RNA polimerase) da Hp e que

seria a via sinalizadora (Figura 12).

Figura 12: Mecanismos reguladores da produção de PFA

Há várias proteínas consideradas PFA, nos humanos a PCR, a proteína sérica amiloide A são as que

mais aumentam ea Hp aumenta apenas de forma moderada.

6.4.ASPECTOS ESTRUTURAIS E FENÓTIPOS

A heterogeneidade molecular da Hp humana relacionada com os dois alelos Hp*1 e Hp*2 foi pela

primeira vez referida por Smithies em 1955, que distinguiu 3 fenótipos: Hp 1-1, Hp 2-1; Hp 2-2

baseado nos padrões de migração electroforética. Os homozigóticos para o alelo 1 :Hp1-1 têm

uma só banda proteica de migração rápida, os homozigóticos para o alelo 2 : Hp2-2 têm várias


32

bandas migratórias lentas, os heterozigóticos Hp 2-1 têm várias bandas migratórias lentas e uma

banda adicional mais fraca que Hp1-11,21.

As Hp são proteínas com subunidades alfa e beta tendo um domínio proteico de controlo do

complemento(alfa) e um domínio serino-protease(beta).

A cadeia beta (40 kDa)não varia nos humanos e contém 4 locais de glicosilação do tipo(Asn-X-

Thr/Ser). Por outro lado, a cadeia alfa ocorre em 2 variantes: a cadeia alfa Hp1: 15 kDa, a cadeia

alfa Hp2: 20 kDa) codificada pelas 2 formas alélicas do gene Hp: Hp*1 e Hp*2. Comparada com a

cadeia alfa, a cadeia beta está mais conservada entre as diferentes espécies-Hp GenBank P00738-

1.

Através do microscópio electrónico Wejman et al22analizaram a molécula de Hp: a Hp1-1 foi

descrita como um alter (dímero)com 2 estruturas esféricas de cadeias beta conectadas por um

fino filamento com um nó central. Apesar a sua natureza polimórfica, a Hp é interessante como

proteína do ponto de vista da evolução devido à semelhança entre a cadeia beta e membros da

família de serina-proteases com acção anti-inflamatória como a tripsina, quimotripsina e

elastase.A Hp 2-1é um polímero linear ligada por pontes dissulfito assim como a Hp 2-2 que é um

polímero cíclico .

6.5.O COMPLEXO Hp-Hb

A ligação entre Hp-Hb é uma das interacções fisiológicas não-covalentes mais fortes que se

conhece8,2-é uma interacção irreversível e não-covalente.

A estrutura tetramérica da Hb composta por duas cadeias alfa e duas beta, tem sido estudada por

métodos de cristalografia. As 4 subunidades da Hb interagem através de interacções não

covalentes e cada sub-unidade liga-se a uma molécula de heme. Quando se liberta dos eritrócitos

a Hb rapidamente se dissocia em dímeros alfa e beta que se ligam à Hp numa relação de 1:1

estoiquiométrica. Um dímero de Hb por unidade alfa-beta de Hp.


33

6.6. FUNÇÕES FISIOLÓGICAS DA Hp EM GERAL

Os principais papéis da Hp são1: transporte e captura da Hb, imunomodulação, regulação da

resposta ao sress oxidativo,interferência na inflamação,activação dos neutrófilos,regulação do

transporte do colesterol através da HDL, angiogénese, inibição da lipoxigenase e cicloxigenase,

remodelação, adipocina.

A função mais reconhecida é a ligação à Hb livre plasmática resultante da hemólise ou da

apoptose dos eritrócitos, e consequente transporte até ao fígado, no entanto também tem

expressão no espaço extravascular através da Hp que aí está presente.Desta forma a Hp minimiza

a peroxidação lipídica dependente da Hb, proteje o DNA assim como tecidos contra o stress

oxidativo, podendo ser considerada como anti-oxidante5.2O complexo Hp-Hb não passa a filtração

glomerular. Tal como a hemopexina a Hp converge no efeito protector contra a hemólise

intravascular.

Na sua função como anti-oxidante/anti-inflamatória, sabe-se que em condições de hipoxia, como

na lesão, infecção ou neoplasias podem-se gerar espécies reactivas de oxigénio com electrões

desemparelhados, durante o transporte mitocondrial (ROS) - espécies reactivas de Oxigénio ou

radicais livres de Oxigénio.A Hp tem uma actividade anti-oxidante, fenotípico-dependente,

contribuindo para este processo sobretudo no espaço extravascular. Os Hp 1-1 resistem mais ao

stress oxidativo celular, que os Hp 2-2, sendo os Hp 2-1 um fenótipo intermédio2.

Durante a lesão tecidular ou infecção, os neutrófilos activados, que são a primeira linha de defesa

ajudam no recrutamento de outras células inflamatórias.Podem gerar ROS, assim como recrutar

outras células como os monócitos-macrófagos. A Hp, é sintetizada durante a diferenciação dos

neutrófilos, e armazenada para ser libertada quando estes são activados. O fenótipo Hp2-2,

continua a ser um factor de risco para as doenças inflamatórias.

A Hp também se liga à Apo A1 (Apolipoproteina A1), protegendo da acção dos radicais livres, e

prevenindo a HDL de fazer complexos com outras lipoproteínas.

O complexo Hp-Hb liga-se ao Óxido Nítrico-NO, havendo vantagem do complexo Hp1-1:Hb, que é

removido mais fácilmente da circulação.


34

A Hp tem capacidade de inibir a Lipoxigenase (LO) e cicloxigenase (COX), interferindo na síntese de

prostaglandinas e leucotrienos.

A Hp tem também outras propriedades anti-oxidantes, como seja a de impedir a associação de

proteínas induzida pelo stress oxidativo ou pelo calor, estando elevada em situações como a

gravidez, obesidade e enfarte do miocárdio.

A Hemogolobina quando está fora do eritrócito é altamente tóxica.O grupo prostético (heme) é

lipofílico e pode destruir a membrana das células; o Ferro do heme cataliza a formação de ROS

através da reacção de Fenton e Haber-Weiss, adicionalmente a Hb liga-se àvidamente ao óxido

nítrico, que é um modulador do tónus vascular. A remoção da hemoglobina que se liberta da

hemólise intra-vascular e extravasclar, envolve a Haptoglobina, Hemopexina e receptor CD163 dos

macrófagos. Tanto a capacidade de ligação à Hb como a afinidade para o CD 163 dos macrófagos,

é fenótipo dependente. A protecção contra um evento hemolítico é a seguinte: Hp1-1>Hp2-

1>Hp2-21.

6.7.Hp COMO INIBIDORA DA LIPOXIGENASE E CICLOXIGENASE

A Hp liga-se à Hb23, específica e estoiquiométricamente. Como a Hb estimula a síntese de

prostaglandinas(PGs), tem particular relevância o efeito que a Hp possa ter na via do ácido

araquidónico(AA). Aparentemente apenas 50-250 microgramas de Hp chegam para inibir a síntese

de PG pela cicloxigenase(COX) e 12-HETE pela lipoxigenase (LO) nas plaquetas.Dos 3 genótipos a

Hp1-1 é a mais eficiente na remoção da Hb, tendo maior papel protector. Estes dados vêm

reforçar o papel da Hp na regulação das vias da COX( PGs :E2,F2α e TxA2) e LO, envolvendo a Hp

no sistema de defesa do organismo contra a inflamação.

A Hp, circula no plasma como um polímero cujas propriedades estoiquiométricas e biofísicas

dependem do genótipo (Hp 1-1, Hp 2-1, ou Hp 2-2 ). Muitas diferenças têm sido observadas

quanto às suas funções. A Hp1-1 protege melhor a LDL contra a oxidação induzida pela Hb, do que

a Hp 2-224-28. Apesar do Hp2-2 se ligar com maior afinidade (10x) ao receptor CD163 é menos

eficiente do que o Hp1-1 e Hp2-1, estando associado nos homens a níveis mais elevados de Ferro ,

saturação mais elevada da transferrina, e ferritina mais alta.


35

O Hp2-2 também está associado a pior prognóstico na infecção por HIV1 ao contrário do Hp1-1.A

razão pela qual os Hp1-1 estarão mais protegidos em relação `a inflamação poderá dever-se ao

facto de que a maior capacidade de captação do Ferro (3x) associado ao Hp1-1 em relação ao Hp2-

2. Estas características da Hp ligadas ao genótipo e disponibilidade do ferro da Hb e estão

indissociadas do controlo endógeno da inflamação também através do controlo do metabolismo

do AA através da COX e LO.

6.8.Hp COMO ADIPOCINA NA INFLAMAÇÃO NA OBESIDADE

O tecido adiposo branco é agora reconhecido como um órgão multifuncional, capaz de armazenar

lípidos , e ter uma função endócrina major secretando várias hormonas, nomeadamente Leptina e

adiponectina, e vários outros factores proteicos. A estes sinais proteicos tem sido dado o nome de

adipocinas, por não serem nem citocinas nem “citocina-like”. As adipocinas são proteínas

secretadas e sintetizadas nos adipócitos.

O adipocinoma: ácidos gordos, PGs-secretoma das células gordas, incluem outras proteínas

envolvidas no metabolismo lipídico, sensibilidade à Insulina, activação da via alterna do

complemento, hemostase, regulação da Pressão Arterial, angiogénese e balanço energético.

Há também uma lista crescente de adipocinas envolvidas na inflamação (TNFalfa; IL-1beta; IL-6; IL-

8; IL-10; TGF-beta; factor de crescimento neuronal) e resposta de fase aguda ( inibidor1 do

activador do plasminogénio; Hp; amiloide sérica A). A produção destas proteínas pelo tecido

adiposo, aumenta na obesidade, e os níveis elevados de citocinas inflamatórias e de PFA , leva à

conclusão que a obesidade é caracterizada por uma inflamação ligeira e crónica podendo levar à

resistência à insulina e ao síndrome metabólico (Figuras 13 e 14), entre outras funções autócrinas,

parácrinas,endócrinas ou envolvendo múltiplos níveis.


36

Figura 13: Adipocinas caracterizadas por papel functional

Figura 14: Proteínas inflamatórias e de fase aguda secretadas pelos adipócitos

Proteínas inflamatórias e de fase aguda secretadas pelos adipócitos. A vermelho estão as que

foram claramente identificadas como adipocinas e a azul as prováveis adipocinas (PCR-proteína C

reactiva, IL- Interleucina, NGF- factor de crescimento neuronal, PAI-1- inibidor 1 do activador do

plasminogénio, TGF-beta-factor transformador do crescimento-beta, TNF-alfa-factor de necrose

tumoral alfa, MCP1-proteína quimioatractiva de monócitos)29,30.

Balanço energético e apetite

Imunidade

Angiogénese

Sensibilidade à insulina

Inflamação e resposta de fase aguda

Pressão arterial

Hemostase

Metabolismo lipídico

Balanço energético e apetite

Imunidade

Angiogénese

Sensibilidade à insulina

Inflamação e resposta de fase aguda

Pressão arterial

Hemostase

Metabolismo lipídico

Proteinas de fase agudaPAI-1HaptoglobinaAmilóide A séricoA1-glicoproteína ácida24p3PCR?

Proteínas relacionadas com a inflamação

AdiponectinaNGF

MCP-1

CitocinasTNFIL-1IL-6IL-8IL-10TGB(leptina)IL-17DIL-18

Proteinas de fase agudaPAI-1HaptoglobinaAmilóide A séricoA1-glicoproteína ácida24p3PCR?

Proteínas relacionadas com a inflamação

AdiponectinaNGF

MCP-1

CitocinasTNFIL-1IL-6IL-8IL-10TGB(leptina)IL-17DIL-18


37

6.9.Hp COMO LIGANDO DO CD11/CD18

A Hp é uma PFA com presumíveis propriedades anti-inflamatórias, com capacidade de se ligar a

monócitos, neutrófilos, células CD8, NK, por um processo dependente de cálcio e ADP. A Hp é um

ligando de baixa afinidade para as integrinas nomeadamente CD11/CD18 que são responsáveis

pela ligação ao ICAM-1 das células endoteliais inibindo a adesão e extravasão dos neutrófilos.

6.10.Hp COMO LIGANDO DO CD22

A Hp31 é uma glicoproteína que se liga especificamente ao CD22 dos linfócitos B podendo modular

a sinalização do BCR assim como a migração das células B. O CD22 é um receptor multifuncional

transmembranar que é um regulador da sinalização do receptor de antigénio das células B (BCR) e

molécula de adesão lectina-like que se liga a ligandos com alfa2,6 ácido siálico.Das inúmeras

proteínas plasmáticas com alfa2,6 ácido siálico, só a Hp e a IgM são ligandos de alta afinidade para

o CD22.

Tem sido sugerida uma relação entre os polimorfismos da Hp e os níveis de linfócitos B periféricos

sendo positiva para Hp2-2 e negativa para Hp1-1.

Os Hp 2-2 dada a grande afinidade para os receptores CD163 dão origem a macrófagos

sobrecarregados de ferro e fontes de ROS, Os Hp1-1 levam os macrófagos a secretar IL-10 e outras

citocinas anti-inflamatórias e heme-oxigenase1(HO1)

6.11.POLARIZAÇÃO DOS MACRÓFAGOS ASSOCIADO À HIPÓXIA ,SINTASE DO ÓXIDO

NÍTRICO(NOS),ARGINASE E POLIMORFISMO DA Hp

A resposta à hipoxia e32,33 à inflamação envolve o HIF1α e HIF-2 α -factores de transcrição

indútiveis pela hipoxia, e são ambos similarmente regulados pós-traducionalmente, embora a

relação funcional destas duas isoformas não seja clara.


38

A polarização de macrófagos deve-se a diferentes processos: um deles é o NO-óxido nítrico que

em parte é controlado pelo HIF. As isoformas de HIf α podem ser activadas de forma diferente: o

HIF1α é induzido pelas citocinas Th1 na resposta M1 e o HIF-2 α é induzida pelas citocinas Th2

durante a resposta M2.

Esta diferente resposta é mais evidente nos macrófagos polarizados durante a regulação específica

das isoformas HIF- α sobre o gene da sintetase indutível do NO- para o HIF-1 α - e no gene da

arginase 1 pelo HIF-2 α . O HIF1α aumenta e o HIF2 α suprime a síntese de NO.

A caracterização funcional dos macrófagos em M1-activados pela via clássica- em resposta a

liposscáridos (LPS) ou citocinas Th1 como IFN gama, por oposição aos da via alterna M2, activados

por citocinas Th2 IL-4 e IL-13 e em que interfere o receptor CD163 para a Hp. Estes macrófagos

polarizados tmbém originam populações Th1 e Th2 respectivamente.

Os macrófagos34 estão frequentemente presentes em tecidos hipóxicos, sendo que a hipoxia

afecta fortemente a função dos macrófagos. Muita da resposta transcricional à hipoxia é mediada

por factores de transcrição conhecidos como HIF(hipoxia-inducible factors). Um destes o HIF-1α, é

expresso de forma ubiquitária, e está muito ligado à resposta inflamatória e microbicida. Outro

componente da família HIF:HIF-2α, é expresso de forma mais limitada . De entre os alvos

transcricionais do HIF-1α, o gene da sintase do NO indutível (iNOS) é regulado pela hipoxia além

de outros factores.Também se exprime primáriamente nos macrófagos polarizados M1 .A iNOS

produz NO- mensageiro aerócrino entre as vias aéreas superiores e inferiores- ao metabolizar o

seu substrato, o amino ácido L-arginina .Os macrófagos têm outro enzima metabolizador da

arginina a arginase 1-que origina ornitina e ureia.. A Arginase1 está altamente expressa nos

macrófagos M2 , e compete com a iNOS para um substracto comum, L-arginina . Arginase1pode

assim regular a produção de NO através da limitação da disponibilidade de arginina no ambiente

extracelular . A expressão do gene da Arginase1 também é induzido pela hipoxia . A regulação na

hipoxia destes 2 destinos da Arginina: sintese de NO e arginase1, depende dos factores de

transcrição HIF -1α e HIF-2α que estão expressos de forma diferente nos macrófagos M1 e M2,

devido ao ambiente de citocinas Th1 ou Th2.O HIF -1α e HIF-2α actuam de forma cooperante para

manter a homeostasia do NO através de um antagonismo funcional em dois genes alvo: iNOS e

Arginase1.


39

6.12.HAPTOGLOBINA, IMUNIDADE INATA E ATOPIA

Os macrófagos 35caracterizados por elevada expressão do receptor da manose CD206 e CD163

existem nas placas ateroscleróticas em zonas de hemorragia intraplaca. A subunidade heme do

complexo Hp-Hb é degradada pela heme-oxigenase.Esta ligação do complexo Hp-Hb ao receptor

CD163 assim como o aumento da IL-10 pode ter um papel importante na polarização M1/M2

(Figura 15).

Figura 15: Classificação dos macrófagos

Propriedades dos macrófagos polarizados: os macrófagos activados pela via clássica (M1) são

induzidos pelo LPS e/ou estimulação por produtos microbianos. O seu repertório inflamatório é

caracterizado pela secreção de mediadores pró-inflamatórios, e libertação de intermediários

reactivos de oxigénio (ROI) e intermediários reactivos azotados (RNI). Pelo contrário a activação


40

alterna dos macrófagos (M2) confere um continuum de estados funcionais classificados como M2a

induzidos pela IL4/IL-13, M2b induzido por complexos imunes e agonistas dos toll like receptors

(TLRs), e M2c induzidos pelos glucocorticoides e IL-1036.

Os macrófagos são células do sistema immune que estão distribuídas pelo organismo e são

indispensáveis na homeostasia e defesa.Podem ser polarizados fenótipicamente pelo

microambiente. Assim os macrófagos activados pela via clássica-M1- cujos factores de activação

são: IFN gama e LPS. Os macrófagos M2 ou da via alterna, subdivididos em M2a( após exposição a

IL-4 ou IL13); M2b (complexos imunes em combinação com IL1beta ou LPS) e M2c (IL-10, TGF beta

ou glucocorticóides). Os M1 têm uma potente acção anti-microbiana e promovem respostas Th1 ,

IL-12 mediadas. Os M2 suportam as funções efectoras Th2. Estes últimos estão relacionados com a

alergia os M2, têm um papel na resolução da inflamação. Os TAM-tumor associated macrophages

têm um fenótipo semelhante aos M2 e acção anti-tumor.

Os macrófagos activados pelo LPS ou citocinas Th1 como IFN gama, são macrófagos M1 e

constituem a via clássica. Os M2 são activados pels citocinas Th2 incluindo Il-4 e IL-13 e constituem

a via alterna. A polarização M1 é importante na depuração e fagocitose dos patogénios

intracelulares, isto é mediado pela produção de citocinas pró-inflamatórias, ROS e NO. Os

macrófagos M2, activados pelas citocinas M2 da via alterna são importantes na imunidade

humoral e reparação tecidular.

Os monócitos ao passarem a parede vascular, polarizam-se de modo diferente de acordo com o

ambiente envolvente.M-DC: células dendríticas por acção do GM-CSF granulócito-macrófago

factor estimulante de colónias e IL-4; M-ox, células esponjosas, indutível por oxLDL; M-HA:

macrófagos associados à hemorragia indutível pelos complexos Hp-Hb; M4-indutíveis pela

quimocina plaquetária CXCL4;M2a indutível pelas IL-4, IL-13; M2b- indutível pelos Complexos

imunes; M2c indutível pela IL-10; M1-indutíveis pelo GM-CSF e LPS-lipopolissacárido/ IFN

gama35,37.

Os macrófagos têm um papel fundamental na imunidade inata, e orquestram a inflamação numa

série de doenças inflamatórias mediadas imunológicamente. Derivam dos monócitos circulantes,

diferenciam-se em macrófagos nos tecidos e podem ser activados por derivados dos

microorganismos e antigénios.


41

Existe evidência de que a resposta macrofágica não depende tão sómente do tipo de activação,

mas também do micro-ambiente em que as células se diferenciam antes da activação.O exemplo

mais frequente é o da activação dos macrófagos pelo LPS através do TLR dependendo de um pré-

estimulação pelo IFN gama ou Complexos imunes(CIC) levando a perfis diferentes:M1 e M2.O IFN

gama, polariza no sentido M1-via clássica- que secreta altos níveis de TNF, IL-12, IL-1β e baixos de

IL-10 e tem um papel importante no combate a patógénios intracelulares. Em contraste, a IL-4 , IL-

10, glucocorticóides, TGFbeta e CIC,induz os macrófagos da via alterna-M2- que se caracterizam

por citocinas de baixo poder pro-inflamatório e aumento de IL-10 ,e estão envolvidos na reparação

tecidular, reacções alérgicas e anti-parasitárias

Além desta diferença nas citocinas, o conceito de polarização foi confirmado por diferenças na

produção de qumioquinas, metabolismo do NO , fagocitose, trancricional , morfologia celular e

fenótipo . Alterações fenotípicas são o receptor da manose CD206 e o receptor capturador da Hp

CD163, cuja expressão aumenta com a IL-4 e IL-10 respectivamente. Os TAM-tumor associated

macrophage- são um fenótipo à parte que partilham propriedades pro e anti-inflamatórias.

Outro é o ATM-adipose tissue macrophage- que inclui macrófagos M1, M2 e M1/M238-41.

A Hp interfere de diferentes formas nas actividades celulares e humorais, tanto no sistema Imune

inato como adaptativo, incluindo síntese de prostaglandinas e leucotrienos, recrutamento e

migração de leucócitos, perfis de citocinas e reparação tecidular.

A Hp é um excelente supressor da proliferação de células T. Os macrófagos activados pela

fagocitose do complexo Hp2-2:Hb através do receptor CD163, desviam a resposta Th-T helper para

um perfil Th1, enquanto os macrófagos activados pelo complexo Hp1-1:Hb geram citocinas Th2. O

balanço desta resposta T parece ser particularmente importante no espaço extravascular, através

da expressão local de Hp, reduzindo a lesão dos tecidos circulantes.

Nos espaço extravascular as células dendriticas respondem a sinais de alarme (metabolitos

biomoleculares, ROS, RNI-compostos reactivos azotados, etc.)5 e interagem com

antigénios/alergénios. Estas células dendríticas diferenciam-se em células maduras e migram para

os gânglios linfáticos onde interagem com células T naive-Th0. Sendo a Hp um ligando para os

macrófagos pode ter um papel importante no processo de activação destas células (Hp1- perfil

Th2 e Hp2 -perfil Th1).


42

A asma alérgica é uma doença inflamatória Th2 das vias aéreas. A asma aparece como uma falha

nos mecanismos imunoreguladores a nível do epitélio respiratório.

Na hipótese da higiene a ausência de estimulação da via Th1 da resposta imune adaptativa, iria

implicar uma prevalência Th2. No entanto, dados actuais, em que se verifica haver um aumento

das doenças autoimunes Th1 como a Diabetes tipo1 e esclerose múltipla nas sociedades

ocidentais, veio sugerir que os 2 grupos de doenças Th1 e Th2 podem coexistir no mesmo

doente.Estes dados contrariam a prevalência de um tipo de ambiente imunológico- Th1 ou Th2

sobre o outro- como defende a hipótese da higiene.

Estes novos dados apontam para a existência de uma regulação (papel das células Tregs- células T

reguladoras) deficiente em ambas as doenças. No entanto os defensores da hipótese da higiene,

continuam a defender, que a “higiene” privaria o sistema imunológico dos sinais necessários para

o desenvolvimento das vias reguladoras capazes de controlar tanto a resposta Th1 como a Th2.

Simultaneamente, os avanços na imunologia vêm focalizar a atenção no papel central da

Imunidade inata como grande orquestrador da resposta imunológica e manutenção da tolerância.

A Imunidade Inata é em geral não específica, de curta duração, depende de células da linhagem

mielóide (como: monócitos, macrófagos, mastócitos, células dendríticas e neutrófilos) e células da

linhagem linfóide (como as células NK-natural killer).

As células do sistema imune adaptativo, são activadas mais tardiamente e induzem uma resposta

duradoura e específica mediada pelas células T helper CD4+, células T citotóxicas CD8+ e células B.

Uma sequência de citocinas produzidas após activação do sistema imune inato leva à

diferenciação das células T naive CD4+ Th0, em células Th efectoras: Th1, Th2, Th17 e Tregs.

Em particular as células APCs-células apresentadoras de Antigénio- como as células dendríticas,

expressam TLRs (Toll-like receptors), levando à activação do sistema imune adaptativo e indução

das células Treg e mediadores. Por seu lado as Tregs, que ocorrem naturalmente ou induzidas

pela imunidade inata, regulam todos os tipos de resposta adaptativa assim como as células

macrofágicas e a sua activação e regulação.


43

As célula dendrítica e macrofágica (APC) modulam o balanço dinâmico entre a resposta Th2 e os

mecanismos reguladores influenciando todas as fases da inflamação das vias aéreas (iniciação e

efectora).

As doenças alérgicas são doenças inflamatórias que se desenvolvem numa complexa interacção

entre os genes e o ambiente. A prevalência das alergias está aumentar e parece estar associada a

diferentes estilos de vida. O balanço entre células Th1, Th2 e Treg, é desencadeado por um

sistema imune inato activo ou alterado.

Esta activação da imunidade inata através das células Apresentadoras do Antigénio(APCs) em que

intervém a Hp e o seu receptor CD163 no macrófago ( marcador dos macrófagos M2), pode ser um

factor adicional na polarização Th2 da resposta alérgica tal como o fazem os alergénios3. Estes,

conseguem activar o sistema Imune inato das mucosas , provocando um influxo celular que vai ter

uma resposta adaptativa polarizada no sentido Th2. Esta activação do sistema imune inato pelos

alergénios é feita através de: actividade proteolítica; ligação a receptores de reconhecimento

padrão; mimetismo molecular com os complexos moleculares sinalizadores dos TLRs; actividade

ligante com lípidos e potencial oxidativo.

Tal como a nomenclatura Th1/Th2, os macrófagos polarizados são referidos como M1 e M29.

Durante a resposta imune inata, os macrófagos activados formam um contínuo entre M1 e M2,

produzindo diferentes citocinas e receptores para citocinas. Os macrófagos M1 estimulam as

respostas mediadas por células, através da produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6, IL-

12, IL-23, Factor de necrose tumoral α-TNF α, IL1RI-receptor tipo I da IL-1. Os macrófagos M2

estimulam a resposta humoral, remodelção tecidular e angiogénese, através da produção de

citocinas anti-inflamatórias(IL-10, TGFβ (Factor de transformação de crescimento β), IL1RII e

antagonistas dos receptores de IL1.

Os M1 são também designados como activados pela via clássica, e podem ser induzidos pelo IFNγ,

LPS, TNF-α e GM-CSF. Este tipo de macrófagos, actua na fase inicial da inflamação, e produz

grandes quantidades de citocinas pró-inflamatórias(IL1-β, TNFα, IL-6) , radicais livres de oxigénio ,

compostos intermédios de azoto e participa como inductor e efector nas reacções polarizadas

Th1.A fase de resolução é caracterizada por macrófagos que produzem citocinas anti-

inflamatórias, elevada capacidade fagocítica e têm elevada expressão do receptor da manose :


44

CD206 e dos receptor para o complexo Hb-Hp : CD163-macrófagos M2. São macrófagos activados

pela via alterna, e podem ser induzidos pela I-4, IL-13, complexos imunes, IL-10, glucocorticoides,

activina-A (membro da família TGF-β) e IL-21.Em geral os macrófagos M1 são IL-12 alto, IL-23 alto,

IL-10 baixo. Além de participarem na resposta Th1, também são responsáveis pela resistência

contra parasitas intracelulares e actividade contra células tumorais. Em contraste as várias formas

de macrófagos M2 (M2a, M2b e M2c), são IL-12 baixo, IL-23 baixo, IL-10 alto, e têm uma

capacidade variável de produzir citocinas inflamatórias, com um perfil Th2.Estão associadas à

atopia e asma alérgica, podem promover crescimento de tumores e formação de metástases. O

controlo homeostático, dos monócitos/macrófagos, é feito também pelas células TregCD4+CD25+.

6.13.CD163 E VIAS METABOLIZADORAS DA Hp

O receptor capturador42 CD163 contém 9 domínios ricos em cisteína de receptor captador (SRCR)

e devido a esta proteína ancestral o CD163 pertence à superfamília SRCR. O CD163 está limitado

às células monócito/macrófago, sendo a sua expressão aumentada por estímulos anti-

inflamatórios, e os pro-inflamatório diminuem a sua expressão.A sua função mais conhecida é a de

se ligar e internalizar os complexos Hp-Hb.Mais tarde foi identificado como receptor de adesão

dos eritroblastos, receptor do factor-like de necrose tumoral fraco indutor de apoptose(TWEAK),

receptor para várias bactérias e vírus,de que resulta endocitose, ou despoletar sinalização e

secreção de outras moléculas podendo assim também ser considerado como imunomodulador.A

porção solúvel do CD163, que se deve a um derramamento do ectodomínio também exerce

funções anti-inflamatórias, podendo ser um marcador de algumas doenças.O facto, do seu padrão

de expressão restrito e potencial de internalização tornam-no um candidato a imunoterapia

celular- dirigida.

Os macrófagos e as suas células progenitoras, monócitos são peças chave na resposta immune, e

não só cumprem uma série de funções como são complementados por uma série de moléculas de

superfície. O receptor CD163 é uma delas e foi inicialmente identificado como RM3/1 em 1987

(Zwadlo et al., 1987)antes de receber o seu número em 1996 (Kishimoto et al., 1997) e receptor

capturador de Hb (HbSR) (Kristiansen et al., 2001). Só em 2001 foi atribuída uma função ao CD163

quando esta glicoproteína foi identificada como receptor capaz de internalizar o complex Hp-Hb.


45

No entanto, outros ligandos foram sendo descritos indicando que o CD163 é um receptor

multifuncional envolvido não só en endocitose como em processos de sinalização após interacção

com diferentes ligandos.

ESTRUTURA

Haptoglobina

Hemoglobina

Resposta anti-

inflamatóriaBilirrubina

BilirrubinaBiliverdina

Heme

Ligandos de

proteinas

degradados

Reciclagem

de receptores

EndocitoseVia sinalizadora

Figura 16: Receptor CD163

O CD163 (Figura 16) é uma proteina transmembranar composta de 9 domínios consecutivos

extracelulares SRCR tipoB, SRCR 6 e 7 separados por um polipéptido de 35 (aa)-aminoácidos-

(PST).Após os domínios SRCR uma sequência PST conecta SRCR 9 com um domínio

transmembranar e uma cauda citoplasmática. Esta cauda intracelular está sujeita a várias

alterações resultando em várias isoformas de CD163. (Law et al., 1993; Ritter et al., 1999).A forma

mais abundante tem uma cauda de 49 aa(aminoácidos) e a menos tem 84-89aa. Os primeiros 42

aa podem ser fosforilados e a molécula do CD163 é extensamente glicosilada.


46

EXPRESSÃO E REGULAÇÃO

A expressão do CD163 está restrita à linhagem monócito/macrófago. E é preponderante nos

macrófagos “residentes”: macrófagos da polpa vermelha esplénica, células de kupfer hepáticas e

macrófagos alveolares do pulmão.Também nos gânglios linfáticos, amígdalas e meníngeos. Estes

macrófagos “maduros” têm maior expressão de CD163 do que os monócitos circulantes, também

se observando durante a fase de resolução de um processo inflamatório .A expressão do CD163 é

regulada por uma série de factores entre eles os glucocorticóides, IL-10 e IL-6. Por outro lado, os

estímulos pró-inflamatórios como :IFN gama, LPS e TNF alfa suprimem a expressão de CD163 . No

entanto a redução observada pode-se dever (como no caso da LPS)à queda do ectodomínio do

CD163-sCD163.

PAPEL FUNCIONAL

O CD163 é um receptor que se liga à Hb ligado à depuração dos complexos Hp-Hb(2001 -

Kristiansen et al). A libertação de Hb para o plasma pode ser fisiológica no processo que ocorre

durante a senescência dos eritrócitos, ou associada a doenças como a doença hemolítica ou

mesmo na reacção alérgica e aterosclerose. A remoção da Hb livre é essencial devido ao potencial

oxidante do ferro contido no heme da Hb. Depois da libertação da Hb liga-se à Hp numa ligação

não-covalente muito forte, levando à exposição de um neo-epitopo que interage com o 3º SRCR-

domíno do CD163 de uma forma dependente do cálcio .De entre as três variantes a que tem a

cauda mais curta é a que tem maior capacidade de endocitose ligante . Após endocitose a carga é

deixada em endosomas e o CD163 volta à membrana plasmática. Depois de libertada a

subunidade heme da Hb é degradada pela hemeoxigenase-1 (HO-1), originando biliverdina, ferro

livre e CO. As funções da Hp e do CD163/HbSR podem ser avaliadas como um mecanismo eficaz de

prevenir a acumulação da Hb no plasma, e dos efeitos tóxicos do Ferro hémico.No entanto em

casos de acelerada hemólise, a deplecção de Hp pode levar a dano tecidular, em particular nos

túbulos proximais renais, que captam a Hb dos ultrafiltrados glomerulares.

Os humanos diferem de outros mamíferos, pelo facto de terem duas variantes alélicas Hp*1 e

Hp*2. O gene para Hp-2 originou-se de uma duplicação parcial da região que contém uma cisteína

envolvida na homodimerização. Este resíduo extra de cisteína, pode originar pontes dissulfito com


47

outras moléculas Hp-2. Os heterozigotos com genótipo/fenótipo Hp2-1, são uma mistura de

dímeros e oligómeros.O CD163/HbSR liga-se aos complexos multiméricos de Hp2-2 e Hp2-1 de

forma mais forte quando comparados com os dimérico Hp1-1, embora sejam menos eficientes na

sua função de captura plasmática da Hb. A IL-6 –mediador de fase aguda- aumenta a expressão de

CD163 e heme-oxigenase. Durante o processo inflamatório este sistema “captura-molécula-

receptor-enzima”pode estar coordenado e contribuir para a remoção da Hb do plasma.

O RECEPTOR CD163 COMO MEDIADOR DE EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIOS

Após a endocitose 41 do complexo Hp-Hb, o enzima limitante heme-oxigenase (HO) degrada a

subunidade heme da Hb.As 3 isoformas da HO(HO-1, HO-2 e HO-3) têm origem em diferentes

genes.A que é expressa constitutivamente HO-2, não responde a nenhum dos indutores da HO-1.

A isoenzima HO-3 é desprovida de actividade catalítica e serve como “sensor” do heme (Elbirt &

Bonkovsky, 1999).

A HO oxida o heme para biliverdina, que depois é convertido em bilirrubina CO e Ferro livre pela

biliverdina reductase.A HO-1, é induzida rapidamente na resposta às citocinas, NO , peroxinitrito e

ROS.O aumento da expressão de HO-1 confere protecção contra o stress oxidativo e pode ter

acção anti-inflamatória( Alcaraz et al.,2003).

CD163 COM PAPEL IMUNOREGULADOR

A regulação do CD163, pelos mediadores de fase aguda pode sugerir uma função

imunoreguladora.A via sinalizadora inclui a fosforilação da cauda citoplasmática, produção de

trifosfato inositol e mobilização lenta do cálcio.

Além de ser um marcador dos macrófagos M2, hoje ainda não se atribui um valor diagnóstico e

terapêutico ao CD163.Recentemente demonstrou-se que o CD163, existia no plasma .Devido à

constante libertação para o plasma, a sua concentração pode reflectir a sua expressão geral, como

nalgumas doenças.

O CD163 é um receptor capturador da classe B expresso nos macrófagos maduros tecidulares. Não

só é responsável pela depuração43 da Hb através da endocitose dos complexos Hp-Hb prevenindo

a lesão oxidativa, mas também activa uma cascata sinalizadora que resulta na produção de

moléculas anti-inflamatórias.Por seu lado o sCD163 solúvel é um marcador de actividade


48

macrofágica, pensa-se que a sua concentração poderá traduzir a quantidade de macrófagos M2,

que são os que têm maior expressão de CD163.Há neste momento numerosos estudos que

tentam relacionar o sCD163 com estados patológicos de inflamação como: infecção, doenças

autoimunes, transplante, aterosclerose, alergia e cancro.

Durante o processo de endocitose do complexo Hp-Hb, o receptor é internalizado voltando depois

à superfície, podendo este processo ser aproveitado para transporte de fármacos anti-

cancerígenos e proteínas.

CD163 é um receptor endocítico de 130 kDa para os complexos Hp-Hb e expressa-se nos

macrófagos e monócitos cuja forma solúvel sCD163 tem sido identificada como marcador de

actividade macrofágica em doenças como: sepsis, doença autoimune, doença hepática entre

outras.Enquanto que a função do CD163 membranar, como receptor do complexo Hp-Hb está

bem estabelecido, o papel do CD163 solúvel: sCD163, não é claro. A queda do sCD163 pode

interferir com a captação do ferro e inibir o crescimento de patogénios intracelulares.Tem sido

proposto que o sCD163, pode estar directamente envolvido na sequestração de ferro, ao ligar-se

aos complexos Hp-Hb circulantes.

A expressão de CD163 44,45 é induzida pela IL-6, Il-10 e glucocorticóides.

A sua função primordial é a remoção de complexos Hp-Hb do plasma. Além do efeito anti-

oxidante , a endocitose do complexo Hp-Hb através do receptor CD163, pode representar uma via

major para captação do ferro pelos macrófagos dos tecidos.A ligação entre a Hp e o receptor

CD163, que aumentam durante a inflamação, sugerem propriedades anti-inflamatórias

relacionadas com o receptor CD163 e os diferentes genótipos de Hp.

O CD163, contém 9 cópias do domínio SRCR o qual existe em 2 variantes (Classe A e B).

Os receptores capturadores ricos em cisteína-SRCR são proteínas de membrana com uma cauda

citoplásmica curta, um segmento transmembranar e uma região extracelular só com domínios

SRCR da classe B. Até agora o conhecimento estava limitado aos CD5 e CD6, que se pensa estarem

relacionados com interacções entre leucócitos. No entanto a identificação do HbSR-CD163- veio

abrir novas perspectivas nas funções dos receptores da classe B SRCR.


49

A função combinada da Hp e do CD163 , é um mecanismo eficiente que previne a acumulação de

Hb no plasma e os efeitos tóxicos do ferro hémico46.

Law et al. (1993)identificaram o CD163,como um antigénio associado aos macrófagos com 130

kDa, pertencente à famílla de receptores capturadores ricos em cisteína (SRCR)tipo B.

O papel biológico do CD163 está relacionado por um lado com a depuração da Hb e potencial

função imunoreguladora (anti-inflamatória) (Graversen et al., 2002) que partilha com o próprio

polimorfismo da Hp.

De entre os sistemas eficientes para remoção deHb41,46 tóxica e pró-inflamatória da circulação e

dos tecidos, encontra-se o macrófago com o seu receptor CD163. Está envolvido, tanto em

processos fisiológicos como patofisiológicos: citoprotecção e inflamação.

Em quantidades moderadas a Hb liga-se ao receptor CD163, mas se for em grandes quantidades

pode aumentar o stress oxidativo e contribuir para a inflamação. O CD163, tem um papel crucial

no controlo da inflamação não só pela activação dos macrófagos M2, captação da Hb, indução da

ferritina, vias anti-inflamatórias com intervenção de citocinas como a IL-10 e o enzima HO.Desta

forma além de contribuirem para uma nova perspectiva dos processos fisiológicos e patológicos,

tanto o CD163 como o sCD163, são possíveis armas terapêuticas e diagnósticas em doenças tão

distintas como: alergia, aterosclerose, rejeição de transplantes e cancro.


50

Figura17: Representação esquemática das principais vias de metabolização da Hb

A Hb (Figura 17) libertada na circulação ou nos tecidos liga-se à Hp, estes complexos estáveis da

Hp-Hb passam rápidamente para o sistema reticuloendotelial hepático, havendo receptores

específicos (não CD163)à superfície do hepatócito para o complexo Hp-Hb.A Hp dirige a Hb para os

sitema monócito-macrófago, no fígado e baço prevenindo a filtração glomerular, mas também

para os macrófagos tecidulares através do receptor CD163, que pertence à superfamília de

receptores capturadores ricos em cisteína tipo B(SRCR).Defenindo-se para o CD163 e complexo

Hp-Hb um papel central nas funções homeostáticas dos macrófagos a nível dos tecidos na

prevenção da toxicidade mediada pela Hb.

Os eritrócitos senescentes ou malformados, são fagócitados pelos macrófagos do baço, fígado e

medula óssea.O catabolismo normal da Hb, formação de pigmento biliar e reciclagem do ferro tem

lugar fora da circulação. A hemólise intravascular gera Hp que está estiquiométricamente ligada

com a Hp para ser removida pelos macrófagos tecidulares.No entanto se a capacidade tampão da

Hp plasmática for excedida, como acontece nos episódios de hemólise intravascular, então a Hb é

filtrada pelo rim, reabsorvida pelo epitélio tubular renal ou excretada na urina, ou ainda

formarem-se complexos de baixa afinidade com a hemopexina e albumina .


51

A Hp é produzida como uma proteína de fase aguda, pelos hepatócitos durante a resposta

imediata à agressão do hospedeiro.A proteína é sintetizada como uma cadeia simples, sendo

depois clivada num terminal amino : cadeia alfa e num terminal carboxil: cadeia beta(7).A

electroforese em gel de poliacrilamida desenvolvido por Oliver Smithies, levou à descoberta dos

diferentes polimorfismos a partir dos dois alelos Hp*1 e Hp*2. As variantes proteicas dos

polimorfismos diferem no comprimento da cadeia alfa designada alfa1 e 2 e os diferentes

genótipos/fenótipos:Hp(1-1) ,Hp(2-2), e Hp(2-1) .Os complexos Hp-Hb são capturados pelo CD163

dos macrófagos, que aumenta na presença de IL-10 e glucocorticoides . Tanto a Hp como o CD163

são induzidos pela citocina pro-inflamatória de fase aguda: IL-6. A coordenada indução de ligando

e receptor é um mecanismo que visa aumentar a depuração de Hb .

A terapêutica com corticosteróides induz a expressão de CD16341,47-49 à superfície dos

monócito/macrófagos, e facilita a endocitose da Hb através deste receptor e induz a síntese de

HO-1.

A HO, é um potente enzima anti-inflamatório e anti-oxidante, que está envolvido primáriamente

na degradação do heme em biliverdina, monóxido de carbono (CO) e Ferro livre. Tem sido

sugerido que a HO seja um enzima citoprotector através da actividade anti-oxidante da biliverdina

e o seu metabolito bilirrubina, assim como o CO .

.


52

6.14.TOLERÂNCIA, DOENÇA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA Hp

Figura 18: Interacção entre o sistema imune inato e adaptativo; inflamação aguda e crónica

na asma alérgica.

Neste esquema (Figura 18) está demonstrada a interacção entre as células DCs e as células

TCD4+(Tconvencionais)50-67durante a inflamação aguda e o crescente número de iTregs na

inflamação crónica .

As iTregs e nTregs inibem a capacidade apresentadora de Ag pelas Dcs 50,52,53,54,56,58e assim

contrabalançam a polarização Th1 e Th2.

A diferenciação das células Dcs sob condições locais de infecção, inflamação (alérgica por

exemplo), ou tumoral pode originar células Dcs basais (DC1 e Dc2) diferentes em resposta aos

factores locais capazes de polarizar as células T num sentido Th1 ou Th2 (possível associação com

os polimorfismos da Hp e diferente polarização das Dcs).

A asma atópica 68resulta de uma inflamação das vias aéreas desencadeada por alergénios do

ambiente. Os sintomas incluem a sibilância, dispneia e tosse, diminuição do calibre das vias aéreas


53

e/ou hipereactividade brônquica.A inflamação alérgica desenvolve-se em 2 etapas: a 1ª após

exposição ao alergénio consiste na desgranulação e libertação de histamina, e mediadores pré-

formados e neo-formados, incluindo citocinas que levam à broncoconstrição e hipersecreção de

muco. As células envolvidas nesta primeira fase são sobretudo mastócitos activados pela IgE

específica do alergénio. A segunda fase mais tardia e que dura mais tempo, deve-se a diferentes

moléculas: várias citocinas, quimiocinas, derivados do ácido araquidónico, enzimas como as

metaloproteases e moléculas de adesão e envolve outros tipos de células.

A asma alérgica é uma doença multifacetada, controlada activamente por células efectoras Th2 e

Th17 que aumentam a inflamação das vias aéreas, enquanto que as Tregs são anti-inflamatórias.

As células Tregs-T reguladoras, têm como principal função o controlo das doenças auto-imunes e

doenças inflamatórias como a alergia51.

As nTregs s desenvolvem-se no timo e dão origem a células com vida longa e específicas de auto-

antigénios com o objectivo de prevenir reacções auto-imunes.As iTregs induzidas/adaptativas

desenvolvem-se em condições de exposição subóptima a antigénios e/ou co-estimulação

As células T reguladoras (Tregs) são críticas na manutenção da homeostasia imunológica. As

células Tregs mantém um controlo supressivo nas outras células do sistema imunológico.

As céluilas iTreg extratímicas geradas durante a inflamação, ajudam a limitar a progressão da

doença. Durante a inflamação causada pela doença alérgica (asma por exemplo) as iTregs (Th3,

Tr1) surgem com o objectivo de controlar as acções deletérias das Th2.As células iTreg são

originadas à periferia, são distintas das nTreg e contribuem para a tolerância imunológica.Esta

geração das iTregs pode estar condicionada por Dcs que se encontrem num ambiente mais

favorável à polarização Th2 dado pelo polimorfismo da Hp.

Tem sido demonstrado que a indução de tolerância passa também pelo aparecimento de células

Tregs. Embora nem todas as células expressem Foxp359,60 a ausência de Foxp3 compromete a

tolerância imunológica.

O entendimento progressivo da natureza e mecanismos das Tregs61-65 mudou o conceito de

tolerância imunológica, para deixar de ser a ausência de reactividade imunológica e passar a ser

um processo regulado que requer células específicas e presença de mediadores. Este conceito é

indispensável na tolerância em relação ao próprio e contra antigénios inócuos ubiquitários,

impedindo o aparecimento de doenças autoimunes e alergias respectivamente.


54

As Tregs têm um importante papel na resposta fisiológica aos alergénios ao suprimirem as células

Th1 e Th2 específicas do alergénio, a produção de IgE pelas células B, e directa ou indirectamente

as células efectoras da alergia: eosinófilos, basófilos e mastócitos.

As células Tregs também estão envolvidas na inflamação crónica, ao interagirem com as células

residentes, tendo particular importância no remodelação que acompanha a asma.Este66 novo

entendimento sobre a tolerância aos alergénios veio inclusive abrir novas janelas terapêuticas

tendo como alvo as células Tregs, tanto na prevenção da doença alérgica como na doença alérgica

já estabelecida.

6.15.PAPEL DAS DCs NA ORIGEM DAS iTregs

O aparecimento das células iTreg depende de uma adequada apresentação pelas APCs

num ambiente rico em TGF-β e IL-2. As Dcs que são um grupo heterogénio de células com

capacidade de apresentar antigénios, estão presentes em diferentes tecidos e

condicionadas pelo ambiente em que se inserem que por sua vez está dependente de

diferentes susceptibilidades genéticas individuais entre elas o polimorfismo da Hp.As Dcs

podem adquirir ou não determinadas capacidades que as tornam capazes e gerar ou não

iTregs. A deplecçao de células Dcs, leva à diminuição de células Treg Foxp3+ e aumenta a

resposta Th1 e Th17.


55

Figura 19: A resposta imune na asma

Após o contacto com o alergénio69 as células epiteliais libertam citocinas (Figura 19) que

recrutam eosinófilos(EO) e mastócitos (MC) assim como citocinas e mediadores proteicos como a

Hp( e seus polimorfismos genéticos/fenótipos) que activam as DCs. As DCs reconhecem,

processam e apresentam o alergénio às células Th2 e Th17 específicas do alergénio as quais

libertam citocinas que activam mais EOs, MCs, células B, neutrófilos(NU) e monócitos (MO). A

ligação cruzada entre a IgE específica do alergénio (produzido pela células B) na superfície dos Eos

e MCs que leva á libertação de citocinas e mediadores solúveis que promovem a

broncoconstrição.As Tregs específicas do alergénio libertam citocinas inibitórias que previnem a

activação das DCs, e das células Th1, Th2 e Th17.

O padrão de hereditariedade da doença alérgica é o de uma complexa doença poligénica em que

as interacções entre os genes e o ambiente, fortemente têm influenciado o desenvolvimento da

doença alérgica, e as mudanças de estilo de vida que se têm operado no mundo ocidentalizado,

em muito têm contribuído para a elevada prevalência da doença alérgica.Estudos epidemiológicos


56

recentes puseram em evidência que a mudança de padrão de exposição microbiana das crianças

no mundo ocidental poderá ser um factor determinante na “epidemia de alergia”-Hipótese da

Higiene- apesar da sua base imunológica ainda ser controversa.

Segundo a hipótese “da higiene”12, a ausência de estimulação da via Th1 da resposta imune

adaptativa, iria implicar uma prevalência da resposta adaptativa Th2.

A hipótese de menos estimulação adaptativa Th1 como explicação da alergia por diminuição de

patogénicos, tem por base o estilo de vida ocidentalizado com diminuição da estimulação da

imunidade inata e diminuição da IL-12 que é dos mais importantes polarizadores Th1.Sob estas

circunstâncias a resposta imune adaptativa em relação a antigénios (alergénios)”inócuos”

ambientais desvia-se para um perfil Th2.

A hipótese de diminuição da regulação, como explicação do aumento da alergia, advém de um

ambiente mais estéril durante a infância reduzir a estimulação das células Treg, levando a um

aumento das respostas Th1 e Th2 e consequente aumento das doenças autoimunes e atopia.

Será o aumento da prevalência da alergia segundo a teoria da Higiene, menos desvio Th1, menos

supressão imunológica ou ambos?

Um modelo menos simplista, ilustra os eventos imunológicos que podem ocorrer como

consequência da diminuição da sobrecarga microbiana durante a infância. Diminui a produção de

IL-12 pelas DCs, diminuindo a polarização Th1, com ausência da produção de IFN gama. No

entanto a a baixa polarização Th1 causada por baixa da IL-12 pode ser balanceada pelo aumento

da activação das células Th1 como resultado da diminuição da estimulação das Tregs.A diminuição

da IL-12 e consequente IFN-gama e diminuição da estimulação das Tregs, pode favorecer a

resposta Th2 aos alérgenos explicando a “epidemia” de alergia. Este tipo de resposta imunológica

pode ser amplificada ou não consoante os doentes expressem um fenótipo Hp1-1 ou Hp2-70-72.


57

6.16.POLUIÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE INDIVIDUAL ASSOCIADA AO POLIMORFISMO DA Hp

A asma alérgica 73é uma doença inflamatória crónica das via aéreas, caracterizada por uma

inflamação eosinofílica, hipersecreção de muco e hiperreactividade brônquica. Tendo uma

fisiopatologia complexa, está bem reconhecido que se trata de uma doença Th2 mediada, e que

esta polarização Th2 se deve a distintos factores, por um lado o papel importante das células APC

(células apresentadoras de antigénio) ao processarem os alergénios ambientais. A própria

poluição como 74-76 as partículas de exaustão diesel (DEP), induzem stress oxidativo nas células

dendríticas (DCs) que já pode estar ou não aumentado por uma susceptibilidade genética

individual condicionada pelo polimorfismo da Hp. Esta mudança no estado de equilíbrio redox

interfere com a capacidade dos Toll like receptors(TLRs) e seus agonistas de provocarem nas DCs a

expressão de receptores de amadurecimento (CD86,CD54 entre outros) assim como a produção

de IL-12 que faz a ligação da Imunidade inata com a adaptativa. Esta perturbação de

funcionamento das DCs é acompanhada por diminuição de IFN gama e aumento da IL-10 nas

células T específicas do Ag. A base molecular desta perturbação do funcionamento das Dcs está na

activação de uma via de sinalização do factor 2 relacionado com o factor nuclear eritróide2 (NF-E2-

related factor 2) que suprime a produção de IL-12.Esta alteração na produção de IL-12 pelas DCs é

um factor adjuvante na explicação do aumento da doença alérgica em zonas de maior poluição. O

estado pró-oxidativo dos DEP pode interferir com a polarização Th1 favorecendo tal como os

alérgenos, e o polimorfismo da Hp, uma polarização Th2.

6.17.STRESS OXIDATIVO E POLARIZAÇÃO MACROFÁGICA

Os macrófagos 77são capazes de suprimir as células T pela produção de ROS levando ao

aparecimento de células Tregs de forma ROS-dependente. Desta forma os macrófagos são cruciais

para suprimirem a resposta T em situações em que esta resposta T está exacerbada. Os

macrófagos M2 são mais eficientes a produzirem ROS que os M1.

O complexo da NADPH-oxidase dos fagócitos consiste em várias proteínas fagócito-oxidase(phox)

que geram ROS78após activação. Os ROS não só estão envolvidos na defesa contra

microorganismos como na imunoregulação. A ROS derivada dos macrófagos induz os Tregs

periféricos, como foi demonstrado em modelos com inibidores da NADPH-oxidase.


58

As ROS, não são só lesivas e mediadoras do stress oxidativo , mas também podem ter funções

imunoreguladoras especialmente se produzidas em baixa quantidade.Sabe-se que tanto as

doenças auto-imunes como a alergia se podem dever a Tregs que não actuam de forma eficiente .

As Tregs podem ser induzidas por ROs e diminuir a resposta imunológica exacerbada Th1 ou Th2.

A cadeia α da Hp é polimórfica com dois alelos co-dominantes: Hp*1 e Hp*2 que originam 3

variantes genotípicas e fenotípicas: Hp1-1(dímero)86 kDa, Hp2-1(polímero linear) e Hp2-2 (

polímero cíclico) 170-900 kDa.

No caso do Hp*1 há uma melhor depuração da Hb e menos stress oxidativo do que com

Hp*2.Verificou-se em estudos feitos na aterosclerose de doentes diabéticos Hp2-2 , existir mais

ferro dentro e fora dos macrófagos na placa aterosclerótica também porque há diminuição da

expressão do CD163 nestes doentes (Hp2-2).O ferro derivado da Hb é redox activo, e tanto a Hb

livre como os complexos Hp-Hb podem captar NO.Todos estes factores que levam a que haja

sobrecarga de ferro podem levar a um aumento do stress oxidativo e diminuição da

disponibilidade do NO que poderá desta forma interferir na asma brônquica e favorecer

fenómenos aterotrombóticos em indivíduos Hp2-2 ( 2 a 5 x mais sobretudo se forem diabéticos).

6.18.PAPEL DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS NA RESPOSTA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA

Hp

As células dendríticas(DCs) 79representam uma população heterogénea de células APCs . as células

percursoras, movem-se na corrente sanguínea até aos tecidos periféricos. Estas DCs imaturas

podem capatar os antigénios (Ags) e migrar para os orgãos linfóides. Convertidas em DCs maduras

estão capazes de interagir com as células T naive (Th0) e iniciar uma resposta imunológica

adaptativa.




exemplo ), ou tumoral pode originar células Dcs basais diferentes em resposta aos

factores locais (possível associação com os polimorfismos da Hp e diferente polarização

das Dcs).


59

Tanto a defesa como a resposta imune patológica residem numa interacção concertada entre os

diferentes processos imunológicos. O sistema imune inato não específico do Ag, incluindo

neutrófilos, monócitos/macrófagos, células natural killer(NK), complemento e interferão,

rápidamente intervém no reconhecimento do antigénio ou na lesão tecidular.

O sistema imune adaptativo por seu lado desenvolve células específicas do Ag: Th, linfócitos T

citotóxicos, e memória imunológica, representando grande diversidade de clones específicos do

Ag.

Este sistema altamente sofisticado tem de ser “instruído” por células capazes de reconhecer e

processar o Ag apresentando-o de forma eficiente a células T e B . Esta ligação fundamental entre

o sistema imune inato e adquirido é feita sobretudo atrvés das células DCs.

Como potentes apresentadorsa de antigénio (APCs) as células dendríticas (DCs), têm um papel

fundamental na indução da reacção alérgica. São essenciais na apresentação do Antigénio (Ag) em

células Thelper préviamente sensibilizadas, levando , no caso do pulmão, a inflamação crónica

eosinofílica das vias aéreas.

Nos doentes alérgicos ao Derp2 p,ex., a apresentação do antigénio pelas DCs derivadas dos

monócitos leva a um aumento de 4-12 vezes das células T quando comparados com controlo.Este

tipo de resposta imunológica pode ser amplificada ou não consoante os doentes expressem um

fenótipo Hp1-1 ou Hp2-2.

6.19.IgE , RECEPTOR DA IgE , RESPOSTA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA Hp

O receptor de baixa afinidade para a IgE CD23 80-82expressa-se em várias células incluindo células

B, macrófagos/monócitos(M2a), eosinófilos, células foliculares dendríticas e células epiteliais do

intestino.As vias sinalizadoras que decorrem da activação do CD23 nos diferentes tipos celulares é

diferente: nos monócitos está envolvido na fagocitose, enquanto que nas células B tem um papel

na regulação da IgE e associação com doença alérgica.

Os níveis de IgE elevados são comuns na resposta inflamatória da doença alérgica e em certas

parasitoses.Para haver a libertação dos mediadores da reacção alérgica, é indispensável haver a

ligação cruzada entre os receptores FcεRII/CD23 para a libertção de TNFalfa, radicais de oxigénio,

IL-6 e tromboxano B2, numa via que é dependente da produção de óxido nítrico. Desta forma

verifica-se que a libertação de citocinas pela IgE da reacção alérgica está associada à transdução


60

através da via do NO, L-arginina dependente, podendo também estar associado aos diferentes

genótipos de Hp.

O desenvolvimento da inflamação IgE dependente ,é feita em 3 fases sucessivas. O período inicial

está relacionado com as DCs, que está presente em qualquer tecido periférico, capazes de após

amadurecimento migrar para os gânglios linfáticos e apresentar os péptidos imunogénicos aos

linfócitos T naive. Após esta primeira etapa de sensibilização, em caso de novo contacto com

alérgenos , a fase inflamatória surge rapidamente: activação de mastócitos, influxo maciço de

eosinófilos, neutrófilos e fagócitos mononucleados. Todas estas fases estão sob a influência de

diferentes subpopulações linfocitárias: TCD4+ com perfil pró-alérgico Th2, Treg induzidas do tipo

:T CD4+CD25+FOXp3+(Tr1). A 3ª fase diz respeito ao processo de reparação, ou no caso de

repetidas exposições alergénicas, a remodelação como o que é observado nas asmas mais severas.

A alergia não é mais do que uma resposta imunológica aberrante perante alergénios ambientais,

enquanto o não-atópico, perante os mesmos alergénios desenvolve tolerância natural.

A IgE ao ligar-se aos receptores de baixa afinidade CD23 dos macrófagos M2a pode ser um factor

adicional na polarização Th2 tal como o polimorfismo da Hp.

6.20.Hp NA NEO-ANGIOGÉNESE , NA MIGRAÇÃO CELULAR E REMODELAÇÃO

Outro papel importante é a formação de neo-vasos em condições normais e patológicas.Desta

forma abrange situações variadas como embriogénese, neoplasias, cicatrização e doença

inflamatória crónica.A formação de neo-vasos envolve a dissolução da membrana basal, seguida

de migração celular, alinhamento, proliferação e diferenciação em estruturas tubulares e nova

membrana basal.A estimulação da angiogénese é outra função conhecida da Hp. Os niveis mais

elevados nas doenças inflamatórias crónicas83 pode ter um importante papel na reparação

tecidual.Surpreendentemente Hp 2-2 é mais angiogénica que os outros genótipos.

Os macrófagos são células chave reguladoras da Imunidade Inata e adaptativa, e são os

mediadores essenciais das reacções inflamatórias crónicas.Os macrófagos têm como função

primordial, a indução da tolerância, imunidade tumoral, aterosclerose, cicatrização, etc..Depois de

recrutados para o local de lesão, os macrófagos são activamente envolvidos na fagocitose dos

restos celulares, modulação da resposta inflamatória, angiogénese e proliferação dos

fibroblastos.Adicionalmente os Macrófagos produzem componentes da matriz extracelular(ECM) e


61

podem afectar a degradação da ECM através da produção de metaloproteinases da matriz e os

seus inibidores.Durante o seu recrutamento os macrófagos encontram vários sinais que dirigem a

sua diferenciação para distintos fenótipos. Os macrófagos activados pela via clássica (M1) surgem

na resposta a estímulos pró-inflamatórios, como as citocinas Th1(p.ex. IFN gama)e produtos

bacterianos (LPS). A activação dos M1 é caracterizada pela secreção de citocinas pró-inflamatórias

como o TNF-alfa, interleucina-1 (IL-1), IL-6 e IL-12, e a expressão de receptores Fcg, I, II, III, um

surto oxidativo e profunda actividade anti-microbiana.Os macrófagos da via alterna: M2 são

activados por citocinas Th2 como: IL-4,IL-10, IL-13 e TGF-beta, ou com mediadores anti-

inflamatórios como os glucocorticóides84,85.

Há estudos que demonstram que a Hp, se expressa na parede arterial e está envolvida no

remodelação arterial ao interferir com a matriz extracelular inibindo as gelatinases e promovendo

a migração celular86 .

A degradação proteolítica e a síntese da matriz de colagénio extracelular e migração celular, são

passos críticos do remodelação tecidular nos processos normais e patológicos, incluindo a

inflamação, invasão tumoral e metastização. A espessura da parede arterial é sobretudo

determinada pelo colagénio fibrilhar (I e III) localizado na adventícia.A migração dos fibroblastos

da adventícia e células musculares lisas da média também é importante no remodelação arterial.

Este mecanismo de migração de células da adventícia ou média para a intima, é fundamental na

aterosclerose e no remodelação.

A Hp está envolvida na migração celular e remodelação que envolvam angiogénese e

reestruturação da matriz extracelular através das gelatinases e colagenases, sendo secretada em

pequenas quantidades pela célula muscular lisa e sobretudo pelos fibroblastos da adventícia87,88,89.

No LBA (lavado bronco-alveolar) dos asmáticos foi referida a existência de uma isoforma

glicosilada Hp-galectina 8, por oposição à Hp-galectina 3 que também existe em saudáveis, que

poderia estar relacionada com os progenitores de fibroblastos90.

A Hp, é uma PFA que se considera estar envolvida na reparação tecidular, sendo produzida por

fibroblastos e células inflamatórias.Pode-se constatar que os níveis de Hp aumentam no LBA dos

doentes asmáticos quando comparados com os controlos saudáveis.Este aumento de Hp é


62

também acompanhado pela diferenciação dos percursores de fibroblastos em fibroblastos, dando

à Hp um papel relevante no remodelação das vias aéreas do doente asmático.

A remodelação das vias aéreas é um dado proeminente na asma brônquica, e é caracterizado por

reparação tecidular aberrante, levando a alterações estruturais e diminuição da função

respiratória.Os fibroblastos, têm um importante papel no remodelação das vias aéreas ao

modularem a reparação tecidular. Os corticóides que se utilizam para tratar a asma afectam

sobretudo a resposta imunológica associada à asma e interferem pouco no processo de

remodelação per se.Vários estudos referem que após o contacto com os alergénios no doente

asmático há recrutamento de percursores de fibroblastos circulantes-fibrócitos associados à

inflamação alérgica.

Com estes estudos veio-se por em evidência de que um estado inflamatório facilitaria a

diferenciação de células progenitoras dos fibroblastos em fibroblastos activos, pondo em

evidência o papel da Hp na remodelação das vias aéreas dos asmáticos.

A Hp como glicoproteína de fase aguda, aumenta durante a lesão tecidular, inflamação e infecção

tendo um papel relevante na modulação da resposta imunológica.A Hp é um tetrâmero com duas

cadeias alfa e duas beta.

Os domínios beta são idênticos, mas os alfa surgem em duas formas alélicas 1 e 2.É possível ser

homozigótico para estes domínios alfa, com 2 domínios alfa-1 (Hp1-1)ou alfa-2(Hp2-2) e os

heterozigotos têm um de cada domínio alfa1 e 2(Hp2-1). Os elevados níveis de Hp, fibroblastos e

eosinófilos no LBA em doentes com asma pôe em destaque o papel desta proteína e da

inflamação no recrutamento destas células. As diferentes isoformas de Hp têm diferentes

propriedades fisiológicas e anti-oxidantes. A Hp2-2 está mais associada a aterosclerose e DCV, por

um processo semelhante à remodelação da asma

Vários estudos têm estabelecido uma correlação entre níveis elevados da Hp (como aqueles que

são observados com o genótipo Hp1-1) e a inflamação das vias aéreas e a hiperreactividade

brônquica.

Também foi demonstrado que a Hp aumenta em células específicas como os macrófagos

alveolares e eosinófilos em tecidos pulmonares inflamados mas não em pulmão normal. Tem sido

atribuído à Hp papel no recrutamento dos fibroblastos derivados das vias aéreas, durante o


63

processo de reparação tecidual. Estes fibroblastos com elevada capacidade de produção de matriz

extracelular no lumen das vias aéreas poderá ter consequências na fibrose sub-epitelial da

doença asmática.Os possíveis factores envolvidos no recrutamento destes fibroblastos para as vias

aéreas poderão ser moléculas envolvidas na angiogénese e outras citocinas/quimioquinas

libertadas pelo epitélio respiratório e células inflamatórias dentre as quais se encontra Hp que é

um factor de migração celular envolvido na angiogénese.A descoberta destes fibroblastos e

eosinófilos no LBA que acompanham os níveis mais elevados de Hp, traduzem uma inflamação

mais grave, podendo traduzir uma fase mais evolutiva da doença91-101.

6.21.A HAPTOGLOBINA E A ASMA ALÉRGICA -DOENÇA Th2

O papel protector anti-oxidante dado pela Hp é dependente de genótipo; a proteína codificada

pelo genótipo Hp 1-1 confere poder anti-oxidante superior ao da Hp 2-2

Para além do papel anti-oxidante, a Hp tem um importante papel imunoregulador, através do

receptor CD163 nos macrófagos M2, e do perfil de citocinas libertado após endocitose do

complexo Hp-Hb.

A Hp é também um excelente supressor da proliferação T. Os macrófagos activados pela

fagocitose do complexo Hp2-2-Hb através do receptor CD163 desviam a resposta Thelper para um

perfil Th1 enquanto os macrófagos activados pela fagocitose do complexo Hp1-1-Hb produzem

citocinas Th2.

O balanço desta resposta celular T é particularmente importante no espaço extravascular, através

da expressão local de Hp, minimizando a lesão tecidular.

No espaço extravascular, as DCs, respondem a sinais de alerta (stress oxidativo entre outros) e

interagem com antigénios/alergénios8,9,11.

A imunidade inata é o grande orquestrador da resposta imunológica e manutenção da tolerância.

A activação do sistema immune inato mediado pelos alergénios é feito através de actividade

proteolítica, ligação a receptores de reconhecimento padrão, mimetismo molecular com

complexos sinalizadores moleculares dos TLRs, actividade ligante com lípidos e potencial

oxidativo.


64

A asma alérgica é uma doença inflamatória em que predomina um tipo de resposta Th2 das vias

aéreas. A asma aparece como uma falha nos mecanismos imunoreguladores a nível do epitélio

respiratório.

Segundo a hipótese “da higiene”12, a ausência de estimulação da via Th1 da resposta imune

adaptativa, iria implicar uma prevalência da resposta adaptativa Th2.

Os avanços na área da Imunologia vêm focalizar a atenção no papel central da Imunidade inata

como grande “orquestrador” da resposta imunológica e da manutenção da tolerância11.

Esta activação do sistema immune inato através das células apresentadoras de antigénio (APCs)

em que intervêm a a Hp e o receptor CD163 ( marcador dos macrófagos M2) pode ser considerado

um factor adicional na polarizaçãoTh2 da resposta alérgica, tal como fazem os alergénios.Podendo

activar o sistema imune inato das mucosas induzindo um influxo celular que origina uma

polarização Th212.

A Hp é uma potente proteína anti-inflamatória capaz de inibir a explosão respiratória e aumentar

o cálcio intracelular nos neutrófilos. Suprime a proliferação T, B e modula os macófagos. Suprime a

função linfocitária na resposta a mitogénios.Interfere na resposta Th1 que produzem IL-2, IFN

gama e forte resposta IgG favorecendo a resposta celular, enquanto os TH2 produzem IL-4,

5,6,10, 13 e IgE predominando a resposta humoral e eosinofilica.

Para alguns autores a Hp modula o balanço Th1/Th2.Smark demonstrou o papel imunoregulador

das PFA102,103. No caso da Hp além da interacção com os macrófagos da via alterna através do

receptor CD163, também suprime a síntese de TNF alfa. Para alguns autores a Hp além de se ligar

ao CD163 também se liga a neutófilos, macrófagos, células NK, células B através do CD11b/CD18 e

CD22.

O receptor CD163 dos monócitos-macrófagos , funciona como receptor que se liga e internaliza o

complexo Hb-Hp. A Hp é um excelente supressor da proliferação das células T. Os macrófagos

activados pela fagocitosedo Hp2-2:Hb através do receptor CD163 desviam a resposta para um

perfil Th1 enquanto os macrófagos activados pela fagocitose do complexo Hp1-1:Hb, desviam para

uma resposta Th2.

O balanço desta resposta T é particularmente importante no espaço extravascular, através da

expressão local de Hp, minimizando a lesão tecidular.

No espaço extravascular as células dendríticas respondem a sinais de alerta(strees oxidativio, p

.ex.) e interagem com alergénios/antigénios.


65

A ligação do complexo Hb-Hp ao CD163 é dependente de cálcio e de alta afinidade .A Hb liga-se

com maior afinidade a Hp 2-2 mas este é menos eficiente no clearing da Hb devido ao facto de

serem proteínas com maior peso molecular.

Após internalização do complexo Hp-Hb, a Hb é metabolizada e o heme tóxico é convertido em

metabolitos pela heme-oxigenase.

O CD163 é expresso exclusivamente em células da linhagem monócito. O CD163 é sintetizada

como um glicoproteína de 130 kDa cadeia simples, transmembranar pertencente à superfamília

dos receptores capturadores da superfamília rica em cisteína (SRCR), consistindo em 9 segmentos

capturadores extracelulares ricos em cisteína e uma pequena cauda citoplasmática existindo em 3

variantes.tem alguma homologia com CD5, CD6. O mRNa e proteina do CD163 são induzidos pelos

glucocorticoides IL6 e IL-10. Em contraste TNF alfa, IFN gama e LPS actuam como moduladores

negativos da expressão de CD163. Apesar de estarem presentes na superfície dos macrófagos, o

derramamento contínuo da porção extracelular leva a grandes quantidades de receptor solúvel no

plasma que constitui um estímulo inflamatório.

A função primordial do CD163 é a remoção dos complexos Hp-Hb, no entanto também tem um

papel na sinalização intracelular. A activação do CD163 na superfície celular leva a uma cascata

sinalizadora dependente da tirosina-cinase resultando na mobilização de cálcio, síntese de

trifosfato inositol e secreção de Il-6 e GM-CSF. Outros estudos implicam a caseina cinase II(CKII)

que leva à secreção de IL-6 e que a proteína cinase C (PKC) pode ter um papel na sinalização

mediada pelo CD163. IL-6 e IL-10 aumentam Hp e CD163. A regulação de CD163 por agentes pro-

inflamatórios e anti-inflamatórios após ligação ao CD163 sugere que este possa ter um papel na

imunomodulação e papel anti-inflamatório

Sendo a Hp um ligando para os mastócitos/macrófagos pode ter um papel importante no processo

de activação destas células (Hp1- perfil Th2 e níveis mais elevados de Hp sérica, e Hp2 -perfil Th1 e

níveis mais baixos de Hp sérica).

A haptoglobina (Hp), uma alfa2-sialoglicoproteina10 (proteína de fase aguda), conhecida pela sua

capacidade de se ligar à hemoglobina (Hb) livre, formando um complexo com a Hemoglobina,

fazendo a lise em globina e grupo heme. O grupo heme, por sua vez, dissocia-se em bilirrubina e

ferro livre. Depois da Haptoglobina se ligar à Hb, parte é captada pelo fígado que recicla o Ferro, o

heme e os aminoácidos contidos na hemoglobina. Existem duas vias de escoamento do complexo

Hp-Hb. O 1º é no hepatócito (90%) e o 2º através do receptor CD163 3nos monócitos-macrófagos .


66

A proteína Hp é composta de subunidades α e β , as cadeias β não sofrem variação genética, o

mesmo não se passando com as cadeias α .O locus da haptoglobina no cromossoma 16q22, é

polimórfico para a cadeia α6. Assim, a cadeia α da Hp é polimórfica com 2 alelos major, co-

dominantes: Hp*1 e Hp*2, originando 3 variantes genotípicas: Hp1-1 (dímero), Hp2-1 (polímero

linear), Hp2-2 (polímero cíclico). Cada uma das formas fenotípicas , tem diferente afinidade para a

hemoglobina, diferente resistência ao stress oxidativo e diferente papel imunoregulador. Além do

seu papel antioxidante, a haptoglobina, estabelece uma função imunoreguladora, através do

receptor CD 163 dos macrófagos, e do perfil de citocinas libertados após endocitose do complexo.

Sabe-se também que durante uma reacção alérgica, se produz muita hemoglobina livre que se liga

à haptoglobina. O alelo 1- Hp*1- tem maior poder anti-oxidante; por outro lado o alelo 2- Hp*2 -

está associado a maior stress oxidativo.

Mais recentemente, comprovou-se que o gene da Haptoglobina se expressa nos macrófagos

alveolares e nos eosinófilos do pulmão em que exista doença inflamatória.

Sabendo que o polimorfismo genético da Haptoglobina (Hp), pode ser um factor polarizador da

resposta Th2 dos doentes asmáticos atópicos, pois os macrófagos activados pela fagocitose do

complexo Hp2-2:Hb, através do receptor CD163, desviam a resposta T helper para um perfil Th1,

enquanto os macrófagos activados pelo complexo Hp1-1:Hb geram citocinas Th21, pretende-se

avaliar a relação que existe com a asma e o controlo desta doença.


67

7.OBJECTIVOS DO ESTUDO

Em doentes asmáticos (controlados e não controlados) (com idades superiores a 7 anos)

quando comparados com o grupo controlo de dadores saudáveis de sangue:

1) Avaliar as frequências alélicas e genotípicas da Hp no grupo controlo e no grupo de

doentes asmáticos e dentro dos asmáticos entre controlados e não controlados.

2) Determinar os níveis de Hp nos controlos e asmáticos.

3) Estabelecer a relação entre o genótipo da Hp e fenótipo intermédio/endótipo

(níveis de Hp) no doente asmático e compará-lo com o grupo controlo.

4) Verificar se a relação genótipo de Hp e fenótipo intermédio/endótipo (níveis de

Hp) está relacionada com a gravidade da asma (comparar asmáticos controlados

com não controlados).


68

8.MATERIAL E MÉTODOS

TIPO DE ESTUDO: ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO , CASO/ CONTROLO

Grupo em estudo: Doentes asmáticos da Consulta de Alergologia do CHLN- HSM; n=114

Grupo controlo: dadores de sangue saudáveis; n=50

Caracterização da amostra: A amostra é constituída por doentes asmáticos controlados e não

controlados e grupo controlo de dadores de sangue saudáveis. Para uma potência de 90% e com

p<0.05, com uma frequência alélica na população controlo de 30-40% e com OR >1.5 estima-se

uma amostra que se aproxime dos 170-180 indivíduos104.

Consentimento informado: foi assinado por todos os doentes .

Os participantes são: o grupo controlo com 50 dadores voluntários de sangue, saudáveis, e 114

doentes asmáticos do Serviço de ImunoAlergologia do Hospital de Santa Maria-CHLN. O

diagnóstico de asma foi classificado de acordo com as linhas de orientação do Global Initiative for

Asthma (GINA)105,tendo em conta a natureza episódica da dispneia, pieira, tosse, opressão

torácica, frequência dos sintomas, limitação ou não da actividade diária, existência ou não de

sintomas nocturnos, frequência das exacerbações, utilização de medicação de alívio, valor do FEV1

e PEF e variabilidade diária dos mesmos.

A definição de doentes com asma não controlada e de doentes com asma controlada foi

realizada através da avaliação do nível de controlo da asma, por um instrumento validado: Asthma

Control Questionnaire - ACQ7 O cut-point considerado é o da prática clínica 0.75 (para os que

tiverem idade> 17 anos), e PAQLQ Pediatric Asthma Quality of Life Questionnaire–VERSÃO

Portuguesa by Juniper (7-17 anos)(<4 implica asma não controlada)106 .

Esta avaliação foi realizada após a selecção dos doentes, e submissão a um período de 8 semanas

(3 consultas) de optimização terapêutica de acordo com as linhas de orientação( guidelines) do


69

GINA. Os doentes que ao fim destas 8 semanas mantiverem pelo menos um indicador de asma

não controlada no último mês [utilização frequente da medicação de alívio, despertares nocturnos

provocados pela asma, pieira/dispneia frequente com limitação das actividades diárias,

exacerbações que motivaram recorrer ao Serviço de Urgência, FEV1 <80% e não haver melhoria ou

piorar, o score (Asthma Control Questionnaire) - ACQ-7 ou PAQLQ], serão classificados como

tendo asma não controlada. Os restantes doentes serão considerados como controlados.

Os critérios de exclusão são: os indivíduos que não aceitem participar no estudo; a não adesão à

terapêutica anti-asmática (avaliada através do preenchimento do patient diary card-Asthma

Clinical Research Network); a existência de outras co-morbilidades que possam interferir na

gravidade da doença respiratória; a existência do diagnóstico de Doença Pulmonar Obstrutiva

Crónica ou outra doença pulmonar; tabagismo; os doentes com infecção HIV, parasitados ou com

outro tipo de infecção, com anemia, com insuficiência renal ou com doença hepática crónica.

Todos os participantes asmáticos são caracterizados relativamente a variáveis sócio-

demográficas (raça; sexo; idade; país de origem;local de residência; profissão; anos de

escolaridade;), história clínica, longevidade da doença asmática , ausência de outra patologia

pulmonar e outros critérios de exclusão; prova de provocação inalatória inespecífica com

metacolina positiva ou prova de broncodilatação positiva ; testes cutâneos, IgE total, RAST e ISAC,

FeNO

A condição de asma controlada e não controlada foi relacionada com: a) o tipo de alergenos a

que estão sensibilizados Testes cutâneos em Prick realizados de acordo com as recomendações da

Academia Europeia de Alergologia e Imunologia Clínica(EAACI) usando a bateria de alergenos da

ALK-Abello. Soro salino como controlo negativo e histamina 10 mg/ml como controlo positivo.Os

testes cutâneos são considerados positivos se pelo menos um alergeno tiver uma pápula com

mais de 3 mm de diâmetro após subtracção do controlo negativo;- b) gravidade da asma

(Intermitente e Persistente: ligeira/moderada/grave) conforme as normas do GINA para níveis de

gravidade da asma após período de optimização terapêutica (Controlada/Parcialmente

controlada/Não Controlada) ; c) classificação das exacerbações de asma segundo as normas do

GINA (ligeira, moderada, severa e paragem respiratória iminente); d) FEV1 e PD20 na prova de

provocação inalatória inespecífica com metacolina segundo as normas da ATS .A prova de

provocação inalatória é realizada com metacolina, administrada através de um dosímetro


70

M.E.F.A.R. MB3, com um débito de aerosol de 39μL/5 nebulizações, o doente inala cada

concentração de metacolina 5 vezes seguidas desde o volume residual até à capacidade pulmonar

total. A função respiratória é medida 3 minutos após a inalação de cada dose de metacolina

através de manobras de expiração forçada com espirómetro. Considera-se o teste terminado

quando pela primeira vez se medir uma redução de FEV1 ≥20% ou após a inalação da última dose

de metacolina. A dose de metacolina que provocar uma redução do FEV1=20%(PD20 FEV1) é

calculada através de interpolação linear dos dois últimos pontos da curva de dose-resposta.; e)

níveis de IgE total medida por imuno-ensaio fluoroenzimático(Pharmacia, Uppsala, Sweden e

específica RAST- Teste in vitro-RadioAlergoAbsorvente- para detecção de Anticorpos IgE

específicos circulantes no soro-EIA(Imunoensaio) (Pharmacia, Uppsala, Sweden) ; f) Óxido nítrico

no ar exalado-doseamento de óxido nítrico do ar exalado durante 6 segundos com Nioxmino

.ADULTOS: Feno (ppb) < 5 ;5–25(Improvável);;; 25–50(Presente mas moderada); >50(significativa);

CRIANÇAS: Feno (ppb) < 5 ;5–20(Improvável);;; 20–35(Presente mas moderada); >35(significativa)-

g) consumo de beta2 miméticos de curta(Salbutamol; Terbutalina) e longa acção (Salmeterol;

Formoterol) ; h) qual o corticóide inalado(Dipropionato de Beclometasona; Budesonido/

Budesonido suspensão prara nebulização;Fluticasona/Fluticasona nebules e dose; i) administração

de anti-colinérgicos/Parasimpaticolíticos (Brometo de ipratrópio; tiotrópio) ; j) Metilxantinas

(aminofilina; teofilina); l) antagonistas dos receptores dos leucotrienos(montelucaste;zafirlucaste)

; m)Corticóides orais(Prednisona; Prednisolona;Metilprednisolona; Deflazacort; Betametasona) ;

n)Anticorpo monoclonal anti-IgE(IgG1k)(Omalizumab) ; o)existência(activa /no passado) ou não de

imunoterapia específica;p)níveis de ECP no sangue periférico e contagem de eosinófilos.

A determinação do polimorfismo genético da haptoglobina é realizada a partir da Hp plasmática,

por electroforese em gel de poliacrialmida (PAGE) 4,7% em solucão tampão TRIS-HCl 0.504M, pH

8.9. As amostras para aplicação no gel (10μL) são preparadas utilizando sacarose 40% (p/v), Hb

28,2mg/mL e plasma, na proporção de 3:2:4, para um volume final de 45μL. Para a coloracão das

bandas resultantes da electroforese é usado o método da coloração por contacto, usando o-

dianisidina 16mM em ácido acético 50% (v/v) e, posteriormente, peróxido de hidrogénio 0,6%

(v/v).Os fenótipos de Hp são determinados por electroforese em gel de poliacrilamida, sendo-lhe

atribuído o correspondente genótipo (Figura 20).


71

Figura 20: Fenótipos da Haptoglobina em gel de poliacrilamida

Os níveis de Haptoglobina são determinados por nefelometria- (BN ProSpec da Siemens Helthcare

Diagnostics).

Avaliação estatística: Para determinar se a diferença entre os valores médios de haptoglobina é

significativa entre os grupos, utilizou-se o teste t de Student para amostras independentes

(paramétrico) ou o equivalente não paramétrico,Man-Whitney. Para estudar a associação entre

níveis de Haptoglobina codificada e outras variáveis qualitativas, usou-se o teste do Qui-Quadrado,

assim como para avaliar as diferenças entre frequências alélicas e de genótipos entre grupos. Para

comparar os níveis de Haptoglobina entre os diferentes grupos definidos pelos genótipos utilizou-

se um teste paramétrico ANOVA depois de verificados os pressupostos da normalidade e

homogeneidade das variâncias e testes pos-hoc ou teste não paramétrico de Kruskal Wallis se os

pressupostos do teste paramétrico não se verificarem. Para avaliar o risco (Odds ratio) de

associação com os diferentes genótipos e de ter asma não controlada neste grupo de doentes, foi

utilizada a regressão logística.


72

Foi utilizado o software estatístico PASW versão 18 para análise estatística dos dados

estabelecendo-se um nível de significância de p< 0.05.

NOME DA VARIÁVEL TIPO DE

VARIÁVEL METODOLOGIA ESTATÍSTICA

HAPTOGLOBINA QUANTITATIVA Análise Descritiva (média±sd)+boxplots.

Teste T Student para amostras independentes para

comparar grupo controlo com asmáticos , ou

equivalente não paramétrico Man-Whitney.

ANOVA para avaliar diferenças da Hp por genótipo

por grupo e por idade codificada ou equivalente

não paramétrico Kruskal Wallis

HAPTOGLOBINA

CODIFICADA

Qualitativa Teste Qui-quadrado para avaliar a associação entre

a hp e as restantes variáveis qualitativas.

Teste Qui-quadrado para avaliar as diferenças

entre frequências alélicas e de genótipos entre

grupos.

IDADE CODIFICADA Qualitativa

GÉNERO Qualitativa

ASMA

CONTROLADA/NÃO

CONTROLADA

Qualitativa

ALERGIA(SIM/NÃO) Qualitativa

GENÓTIPO Qualitativa

ASMA

CONTROLADA/NÃO

CONTROLADA

Qualitativa Regressão logística para avaliar o risco de asma

não controlada associada aos diferentes genótipos.

Quadro 1: Quadro de variáveis


73

9.RESULTADOS

9.1.ALELOS E GENÓTIPOS 9.1.1.CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO EM ESTUDO-Quadro 2

Conforme apresentado no Quadro-2, foram estudados 114 doentes asmáticos da consulta de

Alergologia do CHLN-HSM EPE, com asma controlada e não controlada.70 do sexo feminino e 44

sexo masculino, com idades entre 7 e 86 anos( x±SD: 41±18) 110 caucasianos e 4 não caucasianos;

98 atópicos e 16 não atópicos; 45 com asma não controlada e 69 com asma controlada.

Foram comparados com um grupo de 50 dadores de sangue saudáveis. 45 sexo feminino; 5 sexo

masculino, com idades compreendidas :19-78 anos. ( x±SD: 50±13).

CONTROLO ASMÁTICOS

GÉNERO n % n %

F 45 90,0 70 61,4

M 5 10,0 44 38,6

IDADE

<15 - 0,0 11 9,6

>=15 e <=30 5 10,0 27 23,7

>30 45 90,0 76 66,7

RAÇA

caucasiana 110 96,5

não caucasiana 4 3,5

ALERGIA

Sim 98 86,0

não 16 14,0 ASMA

ncontrol 45 39,5

control 69 60,5

Quadro 2: CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO EM ESTUDO


74

9.1.2. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS POR GRUPO- Quadro 3

Conforme apresentado no Quadro-3, pelo teste estatístico do Qui-Quadrado não há diferenças

estatisticamente significativas na distribuição das frequências genotípicas quando comparadas

controlos e asmáticos p=0,270.

A frequência do alelo 1 no grupo de asmáticos é de 0,43; do alelo 2 é 0,57. A frequência do alelo 1

no grupo controlo é 0,39; do alelo 2 é 0,61. Pelo teste estatístico do Qui-Quadrado não há

diferenças estatisticamente significativas na distribuição das frequências alélicas quando

comparadas controlos e asmáticos p=0,581.

Frequências genotípicas Frequências Alélicas

n(%) Hp1-1 Hp 2-1 Hp 2-2 Hp*1 Hp*2

Controlos 50 5(10%) 29(58%) 16(32%) 0,39 0,61

Asmáticos 114 22(19,3%) 54(47,4%) 38(33,3%) 0,43 0,57

Valor de p 0,270 0,581

Quadro 3: COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS POR GRUPO


75

9.1.3 .COMPARAÇÃO DO RISCO DE ASSOCIAÇÃO DE UM GENÓTIPO ENTRE CONTROLO E

ASMÁTICOS - Quadro 4

Conforme apresentado no Quadro-4, pelo teste estatístico de regressão logística não há diferenças

estatisticamente significativas na associação de risco (OR) com os genótipos estudados quando

comparados controlos com asmáticos p>0,05.

Genótipos Controlos

n=50(%)

Asma

n=114(%) OR IC Valor de p

2.2 16(32%) 38(33,3%) 1

2.1 29(58%) 54(47,4%) 0,784 [0,375;1,640] 0,645

1.1 5(10%) 22(19,3%) 1,853 [0,597;5,753] 0,420

Quadro 4: COMPARAÇÃO DO RISCO DE ASSOCIAÇÃO DE UM GENÓTIPO ENTRE CONTROLO E

ASMÁTICOS


76

9.1.4 . COMPARAÇÃO DO RISCO DE ASSOCIAÇÃO DE UM GENÓTIPO ENTRE ASMAS CONTROLADAS

E NÃO CONTROLADAS- Quadro 5

Conforme apresentado no Quadro-5, pelo teste estatístico de regressão logística não há diferenças

estatisticamente significativas na associação de risco (OR) com os genótipos estudados quando

comparados asmas controladas com não controladas p>0,05.

Genótipos Hp

Asma

controlada

n=69

Asma não

controlada

n=45

OR IC Valor de p

2.2 22 16 1

2.1 34 20 0,809 [0,346;1,889] 0,784

1.1 13 9 1,051 [0,382;3,651] 0,856

Quadro 5: GENÓTIPOS DE HAPTOGLOBINA POR NÍVEL DE CONTROLO DE ASMA.


77

9.1.5 . COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS NOS ASMÁTICOS POR GÉNERO - Quadro

6


estatisticamente significativas na distribuição das frequências genotípicas quando comparados

controlos e asmáticos p=0,144.

GENÓTIPO

SEXO MASCULINO

n=44(%)

SEXO FEMININO

n=70(%) Valor de p

Hp1-1 12(27,3%) 10(14,3%)

0,144 Hp 2-1

21(47,7%) 33(47,1%)

Hp 2-2 11(25%) 27(38,6%)

Quadro 6:COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS NOS ASMÁTICOS POR GÉNERO


78

9.1.6 . COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS NOS ASMÁTICOS POR GRUPO ETÁRIO

- Quadro 7


estatisticamente significativas na distribuição das frequências genotípicas quando comparadas por

grupo etário p=0,390.

GENÓTIPO IDADE<15

n=11(%)

>=15 IDADE

<=30

n=27(%)

IDADE>30

n=76(%) Valor de p

Hp1-1 4(36,4%) 5(18,5%) 13(17,1%)

0,390 Hp 2-1

6(54,5%) 12(44,4%) 36(47,4%)

Hp 2-2 1(9,1%) 10(37,0%) 27(35,5%)

Quadro 7:COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS NOS ASMÁTICOS POR GRUPO ETÁRIO

9.1.7. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR ALERGIA NOS ASMÁTIICOS

- Quadro 8

Conforme apresentado no Quadro-8, pelo Teste estatístico do Qui-Quadrado não há diferenças


asmáticos alérgicos e não alérgicos p=0,091.


79

GENÓTIPO

ALERGIA-SIM

n=98(%)

ALERGIA-NÃO

n=16(%) Valor de p

Hp1-1 22(22,4%) 0(0%)

0,091 Hp 2-1

44(44,9%) 10(62,5%)

Hp 2-2 32(32,7%) 6(37,5%)

Quadro 8:COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR ALERGIA NOS ASMÁTIICOS

9.1.8. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR ASMA CONTROLADA E NÃO

CONTROLADA - Quadro 9



asmáticos controlados e não controlados p=0,877.

GENÓTIPO

ASMA

CONTROLADA

n=69(%)

ASMA NÃO

CONTROLADA

n=45(%)

Valor de p

Hp1-1 13(20,0%) 9(18,8%)

0,877 Hp 2-1

34(44,4%) 20(49,3%)

Hp 2-2 22(35,6%) 16(31,9%)

Quadro 9: COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR ASMA CONTROLADA E NÃO

CONTROLADA


80

9.1.9. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR RAÇA NOS ASMÁTIICOS - Quadro 10



caucasianos e não caucasianos p=0,545.

GENÓTIPO

CAUCASIANOS

n=110(%)

NÃO-

CAUCASIANOS

n=4(%)

Valor de p

Hp1-1 22(20,0%) 0(0%)

0,545 Hp 2-1

51(46,4%) 3(75,0%)

Hp 2-2 37(33,6%) 1(25,0%)

Quadro 10: COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR RAÇA NOS ASMÁTIICOS


81

9.2.ENDÓTIPO/FENÓTIPO INTERMÉDIO: Níveis de Haptoglobina 9.2.1.CONTROLOS

9.2.2.ASMÁTICOS

9.2.3. COMPARAÇÃO ENTRE CONTROLOS E ASMÁTICOS

9.2.CARACTERIZAÇÃO POR NÍVEIS SÉRICOS DE Hp(mg/dL) DA POPULAÇÃO EM ESTUDO-

Quadro -11

Conforme apresentado no Quadro-11, na população controlo(n=50) os níveis séricos de Hp no

grupo controlo foram : minímo :40,10, máximo: 293,00 e x± SD:137,87±51,40; os níveis séricos

de Hp no grupo de asmáticos foram : minímo :9,00, máximo: 320,00 e x± SD:125,13±50,95.

n MINIMO MÁXIMO SD

CONTROLO 50 40,10 293,00 137,87 51,40

ASMÁTICOS 114 9,00 320,00 125,13 50,95

Quadro 11: CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO EM ESTUDO POR NÍVEIS SÉRICOS DE Hp


82

9.2.1.a NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NO GRUPO CONTROLO - Figura 21 e Quadro 12

Conforme apresentado na Figura 21 e Quadro 12 , pelo teste estatístico de ANOVA depois de

verificados os pressupostos da normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se que,

não há diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por

genótipo no grupo controlo p=0,196.

Figura 21: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NO GRUPO CONTROLO

p= 0,196


83

GENÓTIPO n Minimo Máximo SD

1.1

haptoglobina

5 149,00 186,00 175,80 15,78

2.1

haptoglobina

29 40,10 293,00 136,54 53,46

2.2

haptoglobina

16 47,80 224,00 128,40 51,48

Quadro 12: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NO GRUPO CONTROLO

9.2.1.b. NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NO GRUPO CONTROLO - Figura 22 e

Quadro 13

Conforme apresentado na Figura 22 e Quadro 13, pelo teste estatístico de t de Student depois de

verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que, não há diferenças estatisticamente

significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por grupo etário no grupo controlo

p=0,338.


84

Figura 22: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NO GRUPO CONTROLO

Idade n Minimo Máximo x SD

>=15 IDADE <=30 5 97,00 157,00 127,76 23,08

>30 45 40,00 293,00 138,99 53,67

Quadro 13: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NO GRUPO CONTROLO


85

9.2.2.a - NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NOS ASMÁTICOS - Figura 23 e Quadro 14

Conforme apresentado na Figura 23 e Quadro 14, pelo teste estatístico de ANOVA depois de

verificados os pressupostos da normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se

que,há diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por

grupo etário no grupo de asmáticos p=0,000. Depois de efectuados os testes pos-Hoc verificou-se

que era significativamente diferente nos níveis de Haptoglobina dos que expressam os genótipos

Hp 2-2 ( mais baixos)e os outros genótipos (Hp 1-1 e Hp2-1-mais elevados) (p=0,000).

Figura 23: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NOS ASMÁTICOS

Genótipos

p=0,000

p=0,000


86

Genótipo n Minimo Máximo SD

1.1 haptoglobina 22 47,00 238,00 146,09 47,36

2.1 haptoglobina 54 45,00 320,00 137,37 49,58

2.2 haptoglobina 38 9,00 209,00 95,60 41,93

Quadro 14- NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NOS ASMÁTICOS

9.2.2.b - NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS - Figura 24 e Quadro 15


verificados os pressupostos da normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se

que,há diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por

grupo etário no grupo de asmáticos p=0,003. Depois de efectuados os testes pos-Hoc verificou-se

que era significativamente diferente entre o grupo etário<15 e >30anos (p=0,008).


87

Figura 24: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS

Idade n Minimo Máximo x SD

<15 haptoglobina 11 45,00 161,00 87,45 38,89

>=15 e <=30 haptoglobina 27 9,00 238,00 111,00 48,43

>30 haptoglobina 76 27,00 320,00 135,60 50,05

Quadro 15: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS

p=0,008


88

9.2.2.c - NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS -

Figura 25 e Quadros 16 e,17 e 18.


verificados os pressupostos da normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se que,

não há diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por

genótipo no grupo etário<15 anos nos asmáticos p=0,996.

Pelo Teste estatístico de ANOVA, Figura 25 e Quadro 17, depois de verificados os pressupostos da

normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se que,há diferenças estatisticamente

significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por genótipo no grupo etário≥15 e ≤ 30

anos nos asmáticos p=0,02. Depois de efectuados os testes pos-Hoc verificou-se que era

significativamente diferente nos níveis de Haptoglobina dos que expressam os genótipos Hp 2-2 (

mais baixos)e os genótipos Hp 1-1 (p=0,002) e Hp2-1 (p=0,034) (mais elevados) .

Pelo Teste estatístico de ANOVA, Figura 25 e Quadro 18, depois de verificados os pressupostos da

normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se que,há diferenças estatisticamente

significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por genótipo no grupo etário>30 anos nos

asmáticos p=0,000. Depois de efectuados os testes pos-Hoc verificou-se que era

significativamente diferente nos níveis de Haptoglobina dos que expressam os genótipos Hp 2-2 (

mais baixos)e os genótipos Hp 1-1 (p=0,001) e Hp2-1 (p=0,000) (mais elevados) .


89

Figura 25: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS

Idade<15 n Minimo Máximo x SD

1.1 haptoglobina 4 47,00 161,00 86,25 52,82

2.1 haptoglobina 6 45,00 160,00 100,6 46,8

2.2 haptoglobina

(89mg/dL)

1

Quadro 16 : NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS

p=0,002

p=0,029

p=0,001

p=0,000 p>0,05

Genótipo


90

Idade>=15 e <=30 n Minimo Máximo x SD

1.1 haptoglobina 5 109,0 238,0 158,0 55,06

2.1 haptoglobina 12 80,0 168,0 121,7 30,9

2.2 haptoglobina 10 9,00 134,0 74,7 38,18

Quadro 17: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS

Idade>30 n Minimo Máximo x SD

1.1 haptoglobina 13 110,00 200,00 159,92 27,53

2.1 haptoglobina 36 71,00 320,00 150,83 50,51

2.2 haptoglobina 27 27,00 209,00 103,59 41,97

Quadro 18: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS

9.2.2.d. NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR RAÇA NOS ASMÁTICOS - Figura 26 e Quadro 19


verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatisticamente

significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por raça no grupo de asmáticos(p=0,363).


91

Figura 26: NÌVEIS DE HAPTOGLOBINA POR RAÇA NOS ASMÁTICOS

Raça n Minimo Máximo x SD

cauc haptoglobina 110 9,00 320,00 124,30 50,75

ncauc haptoglobina 4 71,00 209,00 148,00 58,75

Quadro 19: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR RAÇA NOS ASMÁTICOS

p>0,05


92

9.2.2.e. NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GÉNERO NOS ASMÁTICOS - Figura 27 e Quadro 20


verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatísticamente

significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por género no grupo de

asmáticos(p=0,288).

Figura 27: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GÉNERO NOS ASMÁTICOS

p>0,05

Género


93

Género n Minimo Máximo x SD

F haptoglobina 70 9,00 320,00 129,17 53,36

M haptoglobina 44 27,00 238,00 118,70 46,73

Quadros 20: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GÉNERO NOS ASMÁTICOS


94

9.2.2.f. - NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR EXISTÊNCIA DE ALERGIA NOS ASMÁTICOS - Figura 28 e

Quadro 21



significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por existência ou não de alergia no grupo

de asmáticos(p=0,388).

Figura 28: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR EXISTÊNCIA DE ALERGIA NOS ASMÁTICOS

p>0,05


95

Alergia n Minimo Máximo x SD

sim haptoglobina 98 9,00 320,00 126,80 51,83

não haptoglobina 16 43,00 174,00 114,87 45,27

Quadro 21: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR EXISTÊNCIA DE ALERGIA NOS ASMÁTICOS


96

9.2.2.g. - NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR NÍVEL DE CONTROLO DA ASMA - Figura 29 e Quadro 22


verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatisticamente

significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por nível de controlo da asma(p=0,264).

Figura 29: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR NÍVEL DE CONTROLO DA ASMA

p>0,05


97

Caso n Minimo Máximo x SD

ncontrol haptoglobina 45 33,00 320,00 131,75 56,64

control haptoglobina 69 9,00 207,00 120,81 46,79

Quadro 22: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR NÍVEL DE CONTROLO DA ASMA 9.2.3.a - COMPARAÇÃO DOS NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA ENTRE CONTROLOS E ASMÁTICOS -Figura

30 e Quadro 23



significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina entre o grupo controlo e

asmáticos(p=0,144).

Figura 30: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO

p= 0,144


98

n x SD

haptoglobina CONTROLO 50 137,86 51,39

ASMATICOS 114 125,13 50,95

Quadro 23: : NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO

9.2.3.b - COMPARAÇÃO DOS NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO -Figura 31 e

Quadro 24



significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para

o genótipo Hp1-1(p=0,184).

Pelo Teste estatístico de t de Student depois de verificados os pressupostos da normalidade

verificou-se que,não há diferenças estatísticamente significativas na distribuição dos níveis de

Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para o genótipo Hp2-1(p=0,944).


verificou-se que, há diferenças estatísticamente significativas na distribuição dos níveis de

Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para o genótipo Hp 2-2(p=0,018).


99

Figura 31: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO

Genótipo n x SD

1.1 haptoglobina CONTROLO 5 175,80 15,78

ASMATICOS 22 146,09 47,36


ASMATICOS 54 137,37 49,58


ASMATICOS 38 95,60 41,93

Quadro 24: : NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO

p=0,018

p>0,05

p>0,05

Genótipos


100

9.2.3.c -COMPARAÇÃO DOS NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO E POR GRUPO DE

CONTROLO E ASMÁTICOS Figura 32 e Quadro 25



significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para

o grupo etário≥15 e ≤ 30 anos(p=0,459).


verificou-se que,não há diferenças estatísticamente significativas na distribuição dos níveis de

Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para o grupo etário> 30 anos(p=0,727).

Figura 32: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO E POR GRUPO DE CONTROLO E

ASMÁTICOS

p>0,05

p>0,05


101

Idade n x SD

>=15 e <=30 haptoglobina CONTROLO 5 127,76 23,08

ASMATICOS 27 111,00 48,43

>30 haptoglobina CONTROLO 45 138,98 53,67

ASMATICOS 76 135,60 50,05

Quadro 25: : NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO E POR GRUPO DE CONTROLO E

ASMÁTICOS


102

10.DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

A distribuição das frequência alélicas Hp*1 e Hp*2 e das frequências genotípicas (Hp 1-1 , Hp 2-1 ,

Hp 2-2 ) não apresenta diferenças estatísticamente siginificativas entre o grupo de doentes

asmáticos e grupo controlo (p>0,05):Quadro3.

Neste grupo de doentes estudados não observámos relação entre a susceptibilidade genética dada

pelos polimorfismos da Hp e a doença asmática alérgica,como foi anteriormente referida por

outros autores10, o que pensamos poder estar relacionado com as diferenças na população de

doentes estudados ( nesse caso foi estudada uma população de 291 crianças com asma e 1956

indivíduos no grupo controlo).

Na história recente de evolução do genoma humano e a pressão exercida pela interacção agente-

hospedeiro pode levar à associação entre determinados perfis genéticos e o fenótipo distante-

doença (asma bronquica p.ex.)1.

Os diferentes genótipos também não parecem estar associados ao risco de se ter asma brônquica

quando comparados com o grupo controlo:Quadro 4 , ou da asma poder estar ou não controlada,

e portanto ser de maior gravidade dentro do grupo de asmáticos (p>0,05):Quadro 5.

Dentro dos asmáticos, a distribuição de genótipos também não é estatísticamente diferente entre

sexo masculino e feminino: Quadro 6 , por grupo etário: Quadro 7 , alérgicos e não alérgicos:

Quadro 8, não-controlados e controlados: Quadro 9 e por raça: Quadro 10 (p>0,05).


103

A associação entre genótipo e endótipo/fenótipo intermédio, neste caso marcador bioquímico:

níveis de Hp,aproxima a susceptibilidade genética individual da doença ( Figura 33).

Figura 33: Relação genótipo com os fenótipos aos vários níveis biológicos

A Hp como proteína de fase aguda4,8,20 pode estar envolvida não só na etiopatogenia como na

resposta à terapêutica da asma bronquica.A maior parte da Hp é produzida no fígado e outra parte

tem origem tecidular, estando os seus níveis dependentes por um lado da depuração feita pelo

CD163 e por outro das variantes genotípicas ,associadas aos receptores dos glucocorticóides,

TNFα, IL-6, sintase do óxido nítrico, entre outros.

No grupo controlo não há diferenças estatísticamente significativa dos níveis de Haptoglobina por

genótipo Figura 21 e Quadro 12 e por grupo etário (p>0,05): Figura 22 Quadro 13.

Stress oxidativo

Hp 1.1

Hp2.1

Hp 2.2

Haptoglobina (Hp)

sCD163

CD163 Hiper

reactividade

bronquica

NO exalado

Inflamação

alérgica(Th2)

ASMA

BRONQUICA

ALÉRGICA

Bioquímicos

Imunogenéticos

FénótiposGenótipos

Intermédios

(marcador

subclínico/

endótipo)

Distante

Factores

ambienciaisFactores Ambientais

Asma Brônquica

Alergica e

não alergica

Stress oxidativo

Hp 1.1

Hp2.1

Hp 2.2

Haptoglobina (Hp)

sCD163

CD163 Hiper

reactividade

bronquica

NO exalado

Inflamação

alérgica(Th2)

ASMA

BRONQUICA

ALÉRGICA

Bioquímicos

Imunogenéticos

FénótiposGenótipos

Intermédios

(marcador

subclínico/

endótipo)

Distante

Factores

ambienciaisFactores Ambientais

Asma Brônquica

Alergica e

não alergica


104

Em comparação com o grupo controlo verificou-se que os asmáticos têm sempre níveis mais

baixos de Hp sendo essa diferença apenas significativa nos genótipos Hp2-2: Figuras 30-32

Quadros 23-25.

Este dado vem de encontro ao que outros autores107 já defenderam, de que nos asmáticos e na

doença respiratória em geral, os níveis de Hp estaria mais baixos do que nos indivíduos saudáveis ,

e que esta proteina pode actuar como antagonista natural da activação do sistema immune. Por

outro lado os macrófagos de indivíduos com genótipo Hp2-2 têm menor expressão de CD163, o

que facilita a acção oxidante do ferro-hémico e pode também condicionar os níveis de Hp

circulante.

Estando estes doentes a fazer terapêutica anti-asmática, a expressão local da Hp pode estar

alterada pela acção dos glucocorticóides108 , e outros fármacos anti-asmáticos.

Nos asmáticos os níveis de Hp não apresentam diferenças estatísticamente significativas entre

asma controlada e não controlada: Figura- 29 e Quadro- 22 (p>0,05), alérgicos e não alérgicos :

Figura-28 e Quadro- 21 (p>0,05), sexo masculino e feminino: Figura- 27 e Quadro- 20 (p>0,05), por

raça: Figura- 26 e Quadro- 19 (p>0,05), mas é estatisticamente diferente entre idade> 30 anos e

<15 anos : Figura- 24 e Quadro 15 ( p<0.05).

Nos asmáticos os níveis de Hp apresentam diferenças estatísticamente significativas por genótipo

(p=0,000) Figura-23 e Quadro14.

Os Hp 2-2 apresentam níveis mais baixos de proteína circulante quando comparados com Hp 2-1

e Hp 1-1:Figura- 25 e Quadros 16,17,18, e a diferença é estatísticamente significativa (p=0.000 ).

Em doentes com idade ≥15 anos os níveis de Hp são diferentes por genótipo (p<0.05): 1-1 e 2-1

diferem do 2-2. Em doentes com idade <15 anos os níveis de Hp não são diferentes entre os

genótipos(p>0,05). Numa análise pos-hoc o genótipo Hp 2-2 mostrou-se um factor independente

associado aos níveis mais baixos de Hp, assim como a idade. Os indivíduos mais jovens têm níveis

mais baixos , que poderá estar relacionado com a duração da doença asmática e a necessidade de

mais tempo para se expressar o endótipo/fenótipo intermédio que se associa à doença asmática.


105

Muitos autores têm referido que o genótipo Hp1-1 está associado a níveis mais elevados de Hp e a

um perfil Th2, enquanto que os genótipo Hp2-2 se associa com níveis de Hp mais baixos e um

perfil Th11,8,10.

A Hp como proteína de fase aguda aumenta após a libertação de IL-6, TNF-α, glucocorticóides e

catecolaminas. Esta relação entre o polimorfismo genético da Hp e o fenótipo

intermédio/endótipo (níveis de Hp) nos indivíduos com mais tempo de evolução da doença,

apresentando os que expressam alelo 1, níveis mais elevados de Hp, poderá traduzir uma resposta

mais intensa ao stress, com maior produção de PFA como a Hp, que possam interferir de forma

diferente no sistema imune inato e condicionar uma diferente polarização da resposta imune

adaptativa na asma alérgica.

As células dendríticas derivam de um percursor comum às células macrofágicas, fazem parte do

sistema mononuclear fagocítico,e são responsáveis pela apresentação do antigénio às células T

naive.Durante a apresentação do Ag as Dcs perante um ambiente de citocinas e outras proteínas

polarizadoras Th2( como a Hp1-1 que polariza os macrófagos para M2, e outras citocinas como a

IL-4 polarizadoras de resposta Th2) reforçam a polarização Th2 enquanto as nTregs e iTregs

inibem a capacidade apresentadora de antigénio das Dcs e diferenciação Th2 ( associada à

presença de IL-4) ou Th1( associada à presença de IL-12)109.

As Dcs derivadas dos macrófagos, podem induzir resposta imune adaptativa mas pouco se sabe

àcerca da diferenciação e polarização a determinado ambiente pró-inflamatório110 (como aquele

que pode ser proporcionado pelos diferentes polimorfismos da Hp).

Os monócitos, são células periféricas circulantes percursoras das Dcs mieloides (DC1s)- na

presença de GM-CSF e IL-4,e percursoras de macrófagos na presença de M-CSF.As Dcs

mieloides/MDDCs /Dc1, são polarizadoras Th1( através da IL-12).

As Dcs plasmocitóides (pDc ou Dc2s) são distintas das Dcs mieloides e podem ser polarizadoras

Th0 ou Th2 quando num ambiente de citocinas pró-Th2 como a IL-4 ( eventualmente Hp1-1 que

polariza no sentido Th2 os macrófagos que a fagocitam).


106

No entanto a activação T após infecção viral das Dcs plasmocitóides pode levar à produção de IFN

gama e pouca IL-4. Assim se conclui que a polarização T pelas Dcs varia de acordo com os sinais

presentes na altura da activação (papel do polimorfismo da Hp e dos alergénios na polarização

Th2-ligação da susceptibilidade genética e ambiente de citocinas e outras proteínas polarizadoras

das Dcs a favorecerem a polarização Th2).




exemplo), ou tumoral pode originar células Dcs basais diferentes em resposta aos factores locais.

A diferença que se observa neste grupo de doentes asmáticos nos níveis de Hp por genótipo e que

não se verifica no grupo controlo, poderá estar relacionada com o facto da estimulação crónica

imunológica e de inflamação alérgica a ela associada permitirem estabelecer uma relação mais

directa entre génótipo/endótipo-fenótipo intermédio.

Os níveis mais baixos de Hp nos indivíduos que são homozigóticos para o alelo 2 poderá estar

associado a maior risco de doença cardiovascular e outras co-morbilidades que poderão

comprometer o prognóstico destes doentes91,93,96,97,100,101.

A Hp pode interferir de várias formas na asma alérgica se por um lado é mais ou menos eficaz na

resposta oxidativa, disponibilização de ROS18, NO19, interfere na angiogénese84-86 , com a LO e

COX23 , interfere como adipocina29,30 nos indivíduos obesos, por outro tem um papel importante

ao condicionar a tolerância que se pode estabelecer em relação aos alergénios ao favorecer a

polarização M2 1,3,6,10caso se trate de homozigóticos Hp1-1. Como à superfície dos macrófagos M2

além do receptor da Hp também existe o receptor para a IgE80-82, a polarização Th2 pode ser

“facilitada” de acordo com a maior expressão desses receptores para os alergénios. Além disso a

inflamação crónica na asma é importante e a Hp através do seu polimorfismo pode interferir

directamente na remodelação arterial e muscular e indirectamente através das Dcs pode interferir

na geração de novas células iTreg que controlam a inflamação Th2 e que também contribuem para

a remodelação das vias aéreas e inflamação crónica da asma alérgica.


107

Esta susceptibilidade individual dada pelos polimorfismos da Hp pode condicionar a resposta

imunológica aos alergénios e à inflamação crónica que caracteriza a doença asmática, assim como

a hipereactividade brônquica68 , a progressão da doença para a cronicidade assim como o

prognóstico de outras co-morbilidades associadas como a hipertensão17 e doença cardiovascular

aterosclerótica.

As diferenças nos níveis de Hp associadas ao grupo etário e em relação ao grupo controlo vêm pôr

em destaque que esta associação genótipo/endótipo/doença necessita de um certo tempo de

progressão da doença para que se possa relacionar a susceptibilidade genética individual, com o

fenótipo intermédio/ marcador subclínico, que traduza as complexas interacções que

acompanham a progressão para a cronicidade das doenças.

Para clarificar mais detalhadamente a relação entre as vias metabólicas da doença asmática, o seu

perfil genótipico individual, associação com marcador bioquímico -fenótipo intermédio/endótipo,

e interacção com o ambiente, na convergência para um enfoque na doença asmática com

diferentes graus de gravidade/controlo, penso que seria importante aumentar o número de

doentes e de indivíduos do grupo controlo estudados e detalhar o estudo do metabolismo do

Ferro nestes doentes .

Como perspectivas futuras , por um lado o papel na resposta alérgica e associação a diferentes co-

morbilidades associadas ao polimorfismo da Hp e a sua relação genótipo/fenótipo já descrita

anteriormente, e por outro lado o possível papel na Medicina do seu receptor: CD16344,45, que

dado ser um receptor endocítico, pode ser um alvo para administração de fármacos e terapêutica

regenerativa, ligados ao complexo Hp-Hb. Durante a endocitose do complexo Hp-Hb, o receptor é

internalizado voltando depois à superfície, podendo este processo ser aproveitado para transporte

de fármacos anti-cancerígenos e proteínas. Também se associarmos a isso ,a curta semi-vida dos

macrófagos e a sua presença em muitos tecidos tornar-se-ia num alvo interessante para

terapêutica regenerativa:introduzir fármacos/genes em regiões de lesão tecidular.


108

11.BIBLIOGRAFIA

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CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA …repositorio.ul.pt/bitstream/10451/8395/1/668029_Tese.pdfséricas de Haptoglobina. À Dra. Joana Freitas pela disponibilidade para o estudo dos