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DANIELA CRISTINA CEZARETTO
CONTROLE DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA
DE MEDICAMENTOS
CENTRO UNIVERSITÁRIO DA FUNDAÇÃO DE ENSINO OCTÁVIO BASTOS
SÃO JOÃO DA BOA VISTA, SP, 2005
DANIELA CRISTINA CEZARETTO
CONTROLE DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA
DE MEDICAMENTOS
Nome do orientador: Eliana P. Chagas
Monografia apresentada como requisito da
disciplina Trabalho de Conclusão de Curso,
do Curso de Ciências Biológicas UniFeob –
São João da Boa Vista – SP.
CENTRO UNIVERSITÁRIO DA FUNDAÇÃO DE ENSINO OCTÁVIO BASTOS
SÃO JOÃO DA BOA VISTA, SP, 2005
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nós professores abaixo assinados, declaramos que a monografia
apresentada pela aluna Daniela Cristina Cezareto, apresentada no dia 04 de
novembro de 2005, foi aprovada.
BANCA EXAMINADORA
Professora Pós - Doutora Eliana Pereira Chagas ORIENTADOR
Marco Antonio Roqueto MEMBRO DA BANCA
Professor Mestre Mauríio José Cividini Matthiesen MEMBRO DA BANCA
AGRADECIMENTOS
Primeiramente à minha mãe, por ter me auxiliado a transpor as inúmeras dificuldades
encontradas ao longo da minha graduação, pela confiança e incentivo.
A toda minha família pela colaboração e participação durante a realização deste trabalho.
À professora e amiga Dr. Eliana Pereira Chagas que com grande satisfação me orientou
neste trabalho e a quem devoto a mais sincera e efetiva admiração e respeito.
À UniFEOB e a todos os formandos da 2ª Turma do Curso de Ciências Biológicas, às
minhas eternas e inseparáveis amigas de trabalho Cristiane Cipola, Natalia Gonçalves e em
especial minha querida amiga Mariana Suppia, companheiras de incontáveis momentos, os
quais me recordarei para o resto da minha vida...
“Meninas sem vocês minha vida universitária não seria a mesma...vocês são muito
especiais!!!”
Um agradecimento muito especial à Professora, Ex-coordenadora do Curso e muito amiga
Msc. Daniela F. C. Jacobucci e seu marido e professor Dr. Giuliano Jacobucci, que
infelizmente tiveram que nos abandonar no final do curso.
“Dani e Giuliano....sentimos muitas saudades”.
Aos que embora não citados, contribuíram de alguma forma para a realização deste
trabalho.
SUMÁRIO
1. RESUMO....................................................................................................................... 6
2. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 7
3. CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS........................................ 9
3.1. A INDÚSTRIA FARMACÊUTICA E AS POLÍTICAS DE SAÚDE E DE MEDICAMENTOS.......................................................................................................... 12
4. ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS 15
4.1. AMOSTRAGEM....................................................................................................... 15
4.2. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA ............................................................................ 16
4.3. MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS..................................... 16 4.3.1.Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade (pour
plate) ........................................................................................................................... 16 4.3.2. Em Meio Sólido, Com Semeadura Da Amostra Em Superfície ........... 17 4.3.3. Membrana Filtrante ......................................................................................... 17
4.4. PESQUISA DE PATÓGENOS ESPECÍFICOS ....................................................... 18
4.5. MÉTODOS RÁPIDOS.............................................................................................. 18
5. ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS ESTÉREIS...... 20
5.1. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS......................................................................... 21
5.2. OBTENÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS.............................................................. 22
5.3. PROCESSOS ESTERILIZANTES .......................................................................... 22
5.4. TESTE DE ESTERILIDADE .................................................................................. 23 5.4.1. Amostragem ....................................................................................................... 24 5.4.2. Preparo da Amostra ......................................................................................... 25
5.5. MÉTODOS DE INOCULAÇÃO ............................................................................. 26 5.5.1. Inoculação Direta ............................................................................................. 26 5.5.2. Inoculação Indireta ou Filtração................................................................... 28
5.6. CONTROLE DA EFICIÊNCIA DE ESTERILIZAÇÃO ......................................... 33
6. TESTE DE PIROGÊNIO .......................................................................................... 36
6.1. ENDOTOXINAS ..................................................................................................... 37
6.2. NÍVEIS PIROGÊNICOS.......................................................................................... 38
6.3. PIROGÊNIOS DE FONTES DISTINTAS .............................................................. 39
6.4. PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO ............................................................ 40 6.5. TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO ............................................... 41 6.5.1. Fundamento do Método ................................................................................. 42 6.5.2. Modelo Animal................................................................................................. 42 6.5.3. Amostra .............................................................................................................. 44 6.5.4. Coelho................................................................................................................. 45
6.6. DETERMINAÇÃO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS POR MÉTODO IN VITRO ............................................................................................................................... 46 6.6.1. Mecanismo de Reação .................................................................................... 47 6.6.2. Ponto Final de Gelificação ............................................................................ 47
6.7. OUTROS MÉTODOS............................................................................................... 48
7. CONCLUSÃO............................................................................................................. 50
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 52
9. ANEXO: ...................................................................................................................... 56
6
1. RESUMO
A expressão “Controle de Qualidade de Medicamentos” abrange todos os princípios
que devem ser seguidos pelos fabricantes e autoridades governamentais para garantir que a
medicação que os médicos e o público recebem seja inócua e eficaz. A importância do
controle de medicamentos pode ser evidenciada se pensarmos que nossa própria vida
depende deles.
Visando a obtenção de produtos de qualidade, toda indústria farmacêutica deve,
além de seguir as boas práticas de fabricação, possuir laboratórios de controle de qualidade,
onde devem ser executadas análises empregando-se processos físicos, químicos e
biológicos, com a finalidade de assegurar e confirmar a qualidade do produto fabricado.
Alguns dos problemas de produção e controle de medicamentos são regulamentados por
legislação especifica.
A qualidade microbiana de medicamentos deve ser definida frente a diversos
fatores, entre os quais, de elevada importância, o fato de ser consumido por pessoas
debilitadas por vezes inclusive imunodrepimidas. Cargas microbianas muito elevadas
podem também facilmente comprometer a estabilidade do produto.
O objetivo deste trabalho é compilar informações sobre o controle da qualidade
microbiológica de medicamentos, e os testes que são realizados no controle da qualidade.
Deve se levar em consideração o fato de haver uma grande escassez de literatura específica
sobre o assunto.
7
2. INTRODUÇÃO
A expressão “Controle de Qualidade de Medicamentos” abrange todos os princípios
que devem ser seguidos pelos fabricantes e autoridades governamentais para garantir que a
medicação que os médicos e o público recebem seja inócua e eficaz. A importância do
controle de medicamentos pode ser evidenciada se pensarmos que nossa própria vida
depende deles (SANTORO, 1988).
A preocupação relativa à qualidade, quando associada à atividade produtiva, foi
sempre aspecto inerente ao ser humano, que busca aperfeiçoar, desenvolver, superar
limites, independente da atividade que exerça, a fim de atender aos anseios da sociedade
como consumidora (PINTO et al., 2000).
O órgão responsável pela fiscalização das boas práticas de fabricação é a Secretaria
Nacional de Vigilância Sanitária, da qual fazem parte a Divisão Nacional de Alimentos
(DINAL), a Divisão de Cosméticos (DICOP), a Divisão de Substâncias Domésticas
(DISAD) e a Divisão de Medicamentos (DIMED). Toda a regulamentação sobre
medicamentos está baseada na Lei n° 6.360, de 23 de setembro de 1976, com o Decreto n°
79.094 de 5 de janeiro de 1977. A atuação desta legislação no comércio se faz sobre o
produtor e o consumidor (ANVISA, 2005).
Visando a obtenção de produtos de qualidade, toda indústria farmacêutica deve, além
de seguir as boas práticas de fabricação, possuir laboratórios de controle de qualidade, onde
devem ser executadas análises empregando-se processos físicos, químicos e biológicos,
com a finalidade de assegurar e confirmar a qualidade do produto fabricado. Alguns dos
problemas de produção e controle de medicamentos são regulamentados por legislação
específica (BPF, 1990).
Os produtos submetidos à vigilância sanitária, respeitando suas particularidades,
devem ser produzidos, armazenados, transportados e dispensados de forma a apresentarem
segurança necessária para o uso e consumo. Considera-se neste caso, que os medicamentos,
os fitoterápicos, os insumos farmacêuticos, cosméticos, saneantes e outros produtos devem
respeitar limites microbianos (PINTO et al., 2000).
O limite microbiano de medicamentos e seus insumos pode se constituir em ausência
8
absoluta de formas viáveis (estéreis) ou sua presença em grandezas definidas, restritas ou
não a determinadas cepas microbianas para produtos não estéreis. (PINTO et al., 2000).
A qualidade microbiana de medicamentos deve ser definida frente a diversos fatores,
entre os quais, de elevada importância, o fato de ser consumido por pessoas debilitadas por
vezes inclusive imunodrepimidas. Cargas microbianas muito elevadas podem também
facilmente comprometer a estabilidade do produto. Conseqüências deste comprometimento
estão associadas à perda da eficácia terapêutica, seja por degeneração do princípio ativo,
seja por alteração de parâmetro físico fundamental para sua atividade, como por exemplo, o
pH. Aspecto igualmente importante consiste na alteração das propriedades físico-quimicas
que podem indiretamente afetar a ação terapêutica, comprometendo a biodisponibilidade do
produto, assim como a aceitação pelo consumidor (ANSEL et al., 2000).
Fatores essenciais para que se atinjam níveis adequados de qualidade microbiológica
no produto terminado envolvem as fontes diretas de contaminação, acarretadas por fluidos
gasosos, água, demais matérias primas e material de acondicionamento. Ainda existem
fontes indiretas como decorrentes de procedimentos de limpeza, de instalações
inadequadas, manipuladores não paramentados ou submetidos a exames médicos
periódicos, equipamentos com limpeza adequada, particularidade nos pontos críticos e sem
procedimentos validados (SILVA, 1997).
O objetivo deste trabalho foi compilar informações sobre o controle da qualidade
microbiológica de medicamentos, e sobre os testes que são realizados no controle da
qualidade. Considerando-se o fato de haver uma grande escassez de literatura específica
sobre o assunto.
9
3. CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS
Em 1962, um Congresso nos Estados Unidos começou a exigir dos fabricantes que
fossem empregados métodos adequados para a boa fabricação de medicamentos. Ficou
estipulado que as empresas farmacêuticas fossem instaladas em locais satisfatórios, com
equipamentos adequados, pessoal bem capacitado, que cada lote de medicamento fosse
preparado de acordo com a fórmula modelo detalhada, que fossem aplicados os controles
devidos durante o processo de fabricação, analisados os produtos terminados e efetuado
minucioso controle em relação ao acondicionamento, embalagem e rotulação dos
medicamentos (SANTORO, 1988).
A qualidade é algo que se obtém como resultado da consideração de todos os fatores
que, de uma maneira ou de outra, entra na concepção, desenvolvimento, produção,
distribuição e uso dos fármacos. Atualmente é cada vez maior a preocupação de assegurar-
se a ministração de medicamentos eficazes. Dentre os conceitos de qualidade, devem ser
considerados alguns parâmetros:
- Conteúdo do princípio ativo dentro dos limites experimentais;
- Uniformidade do conteúdo em cada dose;
- Ausência de contaminantes, incluindo a contaminação cruzada com outros
fármacos;
- Manutenção da potência, eficácia terapêutica e aspecto até o momento do uso;
- Liberação do ingrediente ativo, de tal maneira exercida a máxima
disponibilidade biológica (SILVA, 1997).
O departamento e controle de qualidade não fornecem somente laudos de análise, mas
tem a competência de especificar normas e colaborar nos setores de compras, almoxarifado,
produção, formulação, acondicionamento, embalagens e vendas (SILVA, 1997).
Na década de 1960, dois movimentos ocasionaram grande influência na indústria
farmacêutica. O primeiro, das ações regulatórias, agrupadas sob a denominação de “Boas
Práticas de Fabricação”, introduziram a confiabilidade do processo produtivo. A adoção
deste sistema de trabalho era maciça em grande parte dos países. Paralelamente, a
engenharia de qualidade tomava ênfase, carregando consigo o conceito de Controle Total
10
de Qualidade, ficando explícito que a qualidade de produtos não é alcançada por inspeção,
mas deve ser construída durante o processo de fabricação. O conceito de controle total de
qualidade de produtos farmacêuticos e cosméticos consiste no esforço organizado de uma
empresa, no sentido de projetar, produzir, manter e assegurar as características,
especificadas em cada produto distribuído para comercialização (PINTO et al. 2000).
O segundo movimento desta década, também de elevado impacto, foi decorrente da
influência japonesa, cujo aprendizado sobre a qualidade, levado extremamente a sério,
provocou a busca do “defeito zero”, além de introduzir diferentes ferramentas auxiliares,
como os cinco S: seiri (organização), seiton (arrumação), seisô (limpeza), seiketsu (asseio)
e shitsuke (disciplina), sendo este último o mais difícil de atingir, caracterizando-se por ser
o estágio em que a assimilação do conceito é tal que todos os “S” são aplicados de maneira
automática, quase mecânica. Vale ressaltar ainda o Diagrama de Ishikawa, de espinha de
peixe ou ainda causa – efeito, em que aspectos de motivação, gerenciamento, materiais,
métodos, máquinas e manpower (instrução, habilidade, treinamento, disponibilidade de
pessoal) são exaustivamente investigados no sentido de solução de problemas (CAMPOS,
1992).
Pelo exposto pode-se observar que os problemas mais importantes do controle de
qualidade de medicamentos são a identificação, pureza, estabilidade, legitimidade,
dosagem, absorção e o aparecimento de novas substâncias ativas (SANTORO, 1988).
Convém ressaltar, que a qualidade do medicamento é fator promocional para
obtenção do lucro, assim como evitar ações judiciais em função de problemas decorrentes
da má qualidade (SILVA, 1997).
Os produtos que apresentam substâncias que possam causar danos ao consumidor sob
condições normais de uso, são chamados de produtos contaminados e podem ser por
microrganismos ou não. (NICOLETTI et al, 1997).
Para atingir bom nível de qualidade microbiana nos produtos farmacêuticos é
fundamental que se conheçam as fontes e os mecanismos responsáveis por esta
contaminação. Os contaminantes microbianos presentes nas matérias primas serão
invariavelmente transferidos ao produto, acrescidos dos microrganismos oriundos de
equipamentos e ambientes produtivos, dos operadores envolvidos e dos materiais das
embalagens (LIPTON & JEREMIAH, 1994).
11
No caso dos medicamentos, as matérias primas geralmente empregadas se constituem
de pós-sintéticos, com baixa carga microbiana, porém, aquelas de origem natural podem
conter elevadas cargas microbianas (FERREIRA, 2002).
A multiplicação de contaminantes ocorre rapidamente em espaços como juntas e
válvulas, onde a água e resíduos do produto se acumulam, ocasionando contaminação
persistente e de difícil eliminação, resultando em distintos níveis de risco na dependência
do tipo de produto. A situação é preocupante pois residuais de água podem permanecer
nestes espaços, propiciando o crescimento microbiano e subseqüente contaminação
endotóxica causada por endotoxinas (FERREIRA, 2002).
Embora a contaminação ambiental seja às vezes considerada menos importante, há
evidências de que a transferência de microrganismo do ambiente para o produto ocorra
quando inexistem condições adequadamente controladas. Contaminantes ambientais de
paredes secas compreendem principalmente bacilos Gram positivos, cocos e fungos.
Bactérias Gram negativas são mais susceptíveis aos procedimentos de secagem, porém
números reduzidos podem persistir por períodos consideráveis de tempo. Em áreas úmidas
como pias e drenos, ocorre acúmulo de Pseudomonas e Acinetobacter que não apenas
sobrevivem, mas se proliferam nestas condições. Contaminação aérea principalmente
associada à poeira e às escamas da pele, se constituem em veículos de esporos bacterianos e
cocos (PRISTA et al.,1995).
A contaminação derivada dos operadores é normalmente significante. Durante
atividades normais, a perda de escamas da pele é da ordem de 104 escamas por minuto. Os
contaminantes por elas transportados são micrococos não patogênicos, e estafilococos, mas
também podem se constituir de Staphylococcus aureus como parte da microbiota normal.
Outras bactérias como a Salmonella e Escherichia coli, embora não constituintes da
microbiota, podem estar transitoriamente associados à pele, na dependência dos hábitos de
higiene dos operadores (PRISTA et al.,1995).
Os materiais de acondicionamento de matérias-primas devem ser limpos, além de
adequadamente planejados, para efetivamente proteger o produto. Outro aspecto a
considerar é a contaminação durante o uso ou estocagem do produto(PRISTA et al.,1995).
A capacidade de um microrganismo em promover o processo de deterioração
depende da sua capacidade em produzir enzimas adequadas. O risco maior no caso de
12
produtos farmacêuticos reside na extrema versatilidade de caminhos bioquímicos dos
microrganismos, possibilitando a síntese de enzimas degradativas. Conseqüências que
advêm da degradação enzimática podem ser a queda na potência, redução da
biodisponibilidade, formação de pigmentos e odores que tornam o produto inaceitável pelo
usuário. A atividade microbiana pode também resultar na produção de toxinas ou na
degradação do próprio sistema conservante (BPF, 1990).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária, através da Gerência Geral de Inspeção
de Medicamentos e Controle de Produtos, vem constatando a inexistência, no país, de uma
literatura técnica que sistematize os ensaios, processos e materiais utilizados por
Laboratórios de Controle da Qualidade e Controle da Produção, no sentido de uniformizar
as metodologias empregadas, nas análises de controle de medicamentos (ANVISA, 2005).
3.1. A INDÚSTRIA FARMACÊUTICA E AS POLÍTICAS DE
SAÚDE E DE MEDICAMENTOS
O processo industrial farmacêutico é complexo, vinculando-se às políticas industrial,
científica tecnológica e de saúde. É um processo que exige investimentos em pesquisa e
desenvolvimento na produção e no controle de qualidade dos produtos, aquisição de
substâncias, armazenagem e distribuição dos produtos, entre outros fatores. Para essas
ações empregam-se altas tecnologias, mão de obra qualificada em diversas funções e altos
investimentos financeiros, inclusive em propaganda (PORTO & FREITAS, 1997).
Por ocuparem lugar de destaque no sistema de saúde e no tratamento das doenças,
tanto nos países industrializados como nos países em desenvolvimento, os medicamentos
exigem uma política nacional específica. Esta política deve estruturar-se de acordo com as
necessidades de cada país e é fundamental para garantir eficácia, segurança, qualidade,
informação e aspectos de custos e preços dos medicamentos, além de se mostrar importante
para assegurar a utilização adequada desses produtos por parte da classe médica e
farmacêutica (BONFIM & MERCUCCI, 1997).
Em 1995, a Organização Mundial da Saúde (OMS) recomendou que o Estado devesse
garantir a disponibilidade de acesso eqüitativo, assim como a utilização adequada dos
13
medicamentos e preconizou para a formulação e acompanhamento de política de
medicamentos de cada país, uma ampla parceria entre governos – representando o interesse
público – e os demais atores do processo: os que utilizam ou irão utilizar medicamentos, os
prescritores, os dispensadores e os que fazem, comercializam, distribuem e vendem os
medicamentos. Estão ainda incluídos nessa parceria as universidades, os institutos
especializados de pesquisa e instrução, as instituições que formam pessoal na área médica,
biológica, odontológica, de enfermagem e farmácia, as escolas de preparação de pessoal de
nível médio e de agentes comunitários de saúde, as organizações desvinculadas do governo,
como associações de profissionais, grupos de consumidores, indústria farmacêutica
(preferivelmente suas representações no país ou internacionais) e as representações
jurídicas. Verifica-se, portanto, que é necessária a participação de diversos atores para o
estabelecimento de uma política de medicamento mais adequada à realidade de uma
determinada população (BONFIM & MERCUCCI, 1997).
Na indústria farmacêutica são detectados riscos para o meio ambiente, para o
consumidor e para o profissional envolvido no processo produtivo. Para o meio ambiente,
decorrem do armazenamento de grande quantidade de produtos químicos que podem ser
tóxicos, explosivos e inflamáveis. Explosão ou incêndio provocados pelos produtos
químicos podem gerar uma combinação de substâncias perigosas, resultando em nuvem
tóxica que afetaria não só os trabalhadores de uma indústria, mas também a comunidade
vizinha e, dependendo da sua extensão, atingiria dimensão catastrófica. O descarte de
produtos químicos também se constitui em um problema grave pelos riscos que podem
gerar para a comunidade (BONFIM & MERCUCCI, 1997).
Sobre os riscos tecnológicos ambientais, PORTO & FREITAS (1997) comentam
sobre a expansão, em nível mundial, da capacidade de produção, armazenamento,
circulação e consumo de substâncias químicas. Explicam que a lógica de desenvolvimento
industrial e inovações tecnológicas no ramo químico vêm possibilitando um crescimento
dos riscos numa velocidade bem maior do que a capacidade científica e institucional de
analisá-los e gerenciá-los. Os autores acrescentam ainda que, nos países de economia
semiperiférica como o Brasil, somam-se aos riscos decorrentes da própria industrialização
as fragilidades sociais, institucionais e técnicas, que acentuam a vulnerabilidade dessas
sociedades frente aos riscos tecnológicos ambientais.
14
Para os consumidores, os riscos resultam tanto de efeitos adversos dos produtos como
da qualidade do seu preparo, indicação ou administração correta, entre outros. Podem-se
ampliar esses riscos para a sociedade devido ao estímulo ao consumo de medicamentos por
parte da industria farmacêutica privada – ávida de lucros – que, para isso, investe de forma
maciça em propagandas junto ao público e, em especial, ao médico (PORTO & FREITAS,
1997).
15
4. ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE
PRODUTOS NÃO ESTÉREIS
Produtos não estéreis são aqueles nos quais se admite conceitualmente a presença de
carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as características de sua utilização. A
atenção no controle de produtos não estéreis assegura que a carga microbiana contida no
produto, seja no aspecto qualitativo ou quantitativo, não comprometa a sua qualidade final
ou a segurança do paciente. O objetivo do controle de qualidade microbiológica é
comprovar a ausência de microrganismos patogênicos e determinar o número de
microrganismos viáveis, em função do tipo de utilização do produto (PINTO et al., 2000).
4.1. AMOSTRAGEM
A amostragem a ser efetuada para investigação quanto ao atendimento aos padrões
microbianos deve ser representativa, em termos de abrangência do volume contido, do
número de unidades contenedoras, e das operações unitárias envolvendo risco de
contaminação adicional ou de crescimento microbiano. Para que se cumpra tal meta,
diferentes critérios devem ser adotados a circunstâncias específicas (ALBERT et al.,
1989).
Há que se efetuar a assepsia na área próxima à coleta de amostras, usar
preferencialmente recipientes com válvula de amostragem, ou na sua ausência, proceder à
vedação hermética subseqüente. Os recipientes devem ser de boca larga e com capacidade
para 100 g ou 100 mL. O transporte deve se dar em condições adequadas de temperatura.
No caso de líquidos, é importante que se evite o uso de pipetas ou de tubos de vidro, com
risco de quebra e liberação de fragmentos no conteúdo. Nos processos contínuos, a
segmentação como início, meio e fim do processo deve estar contemplada na amostragem.
Considerando o produto terminado, toma-se via de regra, uma duplicata da amostra,
representando início, meio e fim do processo de enchimento, admitindo que após o
fechamento do material de acondicionamento à introdução de contaminantes não exista
mais (CRISTÁLIA, 2005).
16
A quantidade de amostra a ser coletada depende das análises, inclusive com reteste. A
recomendação das principais farmacopéias, para enriquecimento na pesquisa de patógenos,
é de 10,0 g ou 10,0 mL, além da contagem total em igual quantidade (CRISTÁLIA, 2005).
4.2. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
A primeira preocupação ao preparar uma amostra consiste na verificação da atividade
antimicrobiana do produto devido à presença de conservantes na fórmula. Estes devem ser
inativados com substâncias adequadas, conforme sua natureza química. A adição de
inativantes previamente esterilizados por algum processo eficiente deve ser previamente
validada. Outro cuidado importante é o ajuste do pH do produto diluído para a faixa de
neutralidade, pois isso pode impedir o crescimento microbiano (BAIRD, 1986).
A homogeneização da amostra é fundamental no sentido de conduzir a transferência
para etapas subseqüentes de forma representativa ainda que a mesma tenha sido diluída,
empregando-se, por exemplo, solução salina peptonada (0,1%), solução tamponada (pH
7,0) ou caldo lactose. Algumas formas farmacêuticas podem exigir tratamento específico
no sentido de permitir o contato íntimo da amostra com o meio diluente. Todas as
operações empregadas de forma a possibilitar a contagem e pesquisa de microrganismo
devem ser validadas, assegurando a confiabilidade do ensaio (BAIRD, 1986).
4.3. MÉTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
4.3.1.Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade (pour
plate)
Este método consiste na transferência de 1,0 a 2,0 mL da diluição da amostra para
réplicas de placas de Petri esterilizadas. O meio de cultura esterilizado fundido e resfriado a
temperatura compatível com a fisiologia celular (45° – 48° C), em quantidade de cerca de
20 mL, é vertido sobre cada uma das placas contendo as amostras, seguido de
homogeneização com movimentos em “S” ou “8” sobre a bancada de trabalho, os quais
17
permanecem até solidificação à temperatura ambiente. Segue-se incubação das placas, em
estufa na posição invertida, 2 a 5 dias de incubação a 30° - 35° C, para bactérias e 5 a 7 dias
para fungos e leveduras. Após estes períodos as colônias são contadas como auxílio de
contadores de colônia do tipo Quebec, abrangendo o crescimento tanto na superfície,
quanto na profundidade. O número médio decorrente da réplica correspondente a uma
determinada diluição, multiplicado pelo valor da diluição dará o número de unidades
formadoras de colônias (UFC) por unidade de peso ou volume da amostra. Este método é
limitante para amostras que conferem opacidade ao meio, não permitindo a visualização
das colônias desenvolvidas após a incubação (PINTO et al., 2000).
Os meios de cultura devem ter composição completa a fim de propiciar o crescimento
de contaminantes. Para a contagem total de bactérias, os meios oficialmente recomendados
são principalmente ágar caseína-soja e ágar nutriente; para fungos, ágar Sabouraund-
dextrose e ágar batata. Os meios de cultura podem ser incorporados de antibióticos, de
acido tartárico (inibidor de crescimento bacteriano) ou de outro agente seletivo (PINTO et
al., 2000).
4.3.2. Em Meio Sólido, Com Semeadura Da Amostra Em Superfície
O meio de cultura é preparado e distribuído previamente em placas de Petri.
Empregando-se pipetas esterilizadas, volumes de 0,1 a 0,5 mL de cada diluição da amostra
considerada são distribuídos na superfície do meio de cultura já solidificado, sendo o
espalhamento efetuado com movimentos cuidadosos ou com o auxilio de um bastão de
vidro ou alça de Drigalski. Na dependência da densidade da amostra, haverá absorção total
pelo meio. A escolha do meio de cultura, condições de incubação e cálculos para
determinação de carga contaminante viável corresponde ao método descrito acima
(FISCHER et al., 1996).
4.3.3. Membrana Filtrante
Alíquotas do produto sob forma líquida ou suas diluições são filtradas através de
membranas apropriadas (0,45 µm ou 0,20 µm de poro e 47 mm de diâmetro) constituídas
de derivados celulósicos, seguindo-se a deposição de membranas, na mesma posição, sobre
18
placas contendo meio de cultura (ARAUJO & MACEDO, 2001).
Esta metodologia, vantajosa por permitir volumes elevados na amostragem e pela
acuidade, apresenta recomendação especial para amostras contendo agentes
antimicrobianos. O cálculo para determinação do número total de contaminantes viáveis é
igual ao método Pour Plate (ARAUJO & MACEDO, 2001).
4.4. PESQUISA DE PATÓGENOS ESPECÍFICOS
Conforme algumas recomendações farmacopéicas e citações técnicas mais aceitas, os
microrganismos a serem pesquisados, devido à presença indesejável nas formulações
farmacêuticas são:
• Pseudomonas aeruginosa – nas preparações tópicas, principalmente naquelas
envolvendo regiões próximas aos olhos;
• Staphylococcus aureus – nas preparações tópicas em geral;
• Escherichia coli e Salmonella sp – nas preparações orais;
Pode também ser interessante a pesquisa de outras cepas ou grupos de
microrganismos como coliformes (CRISTÁLIA, 2005).
Os procedimentos básicos sofrem pequenas distinções entre as farmacopéias de
diferentes países, entretanto, os aspectos básicos são mantidos, e a enormidade de detalhes
desmotiva o detalhamento dos processos (CRISTÁLIA, 2005).
4.5. MÉTODOS RÁPIDOS
A necessidade crescente de respostas que sejam simultaneamente seguras e ágeis na
identificação dos microrganismos tem quebrado o conformismo com as técnicas
convencionais, que várias etapas devem ser respeitadas, sempre acompanhadas de tempo de
incubação compatível com o metabolismo celular para visualização de respostas. Assim,
considerando passivamente o metabolismo microbiano, muito se tem trabalhado a questão
da resposta de forma a torná-la visível ou de forma detectável em menos tempo (FISCHER
et al., 1996).
19
Opções adicionais existem, e tendem a surgir outras, porém há que se considerar a
questão do custo-benefício da aquisição do equipamento e material de consumo, frente ao
benefício real por ele permitido (FISCHER et al., 1996).
20
5. ANÁLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE
PRODUTOS ESTÉREIS
O conceito de esterilidade refere-se à total ausência de formas viáveis de
microrganismos capazes se reproduzir. Com o conhecimento atual estatístico envolvendo
a morte microbiana, há questionamentos quanto à afirmação absoluta da esterilidade dos
produtos (PINTO et al., 2000).
Segundo as farmacopéias, a condição de esterilidade de um produto deve ser
considerada com base no fato que o mesmo tenha sido processado em condições ótimas e
que o resultado de uma amostra representativa, submetida ao teste, indique a ausência de
microrganismos viáveis (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988, UNITED STATES
PHARMACOPEIA, 1995, BRITISH PHARMACOPEIA, 1988).
A característica de esterilidade foi inicialmente requerida em produtos para uso
parenteral. Mais recentemente, após inúmeros casos de infecções advindas da terapia
oftálmica e posterior constatação da má qualidade destes produtos quanto ao aspecto
microbiano, foi exigido também, que estes medicamentos sejam estéreis. A exigência do
teste de esterilidade em pomadas oftálmicas surgiu inicialmente em países como Suécia,
Austrália e Inglaterra (SAITO et al., 1985).
Muito se tem escrito sobre as limitações do teste de esterilidade, conforme descrito nas
diferentes farmacopéias. Para uma avaliação objetiva do seu valor, há necessidade do
entendimento não apenas dos problemas microbiológicos envolvendo o próprio teste, mas
também das dificuldades encontradas na obtenção de amostras representativas de um
determinado lote. Embora seja ensaio limite, o teste de esterilidade pode ser adaptado para
fornecer informação quantitativa sobre o número e tipos de contaminantes presentes. Tais
informações são importantes ao se investigar potenciais fontes de contaminação
(FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2000).
21
5.1. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS
Há uma variedade de problemas inerentes ao próprio teste de esterilidade no que diz
respeito a vislumbrar a característica de esterilidade do produto. Uma vez que a identidade
de todos os potenciais contaminantes é desconhecida, há certamente um compromisso
quando da escolha do meio de cultura. Na prática, apenas os meios caldo caseína-soja e
caldo tioglicolato são recomendados nas edições recentes das farmacopéias britânica,
européia e americana (SAITO et al., 1985).
A natureza do produto sob teste pode se constituir em problema do ponto de vista
da amostragem. No caso de produtos oleosos, tais como pomadas oftálmicas, as células
microbianas podem estar na matriz do produto, tornando necessária a extração com um
solvente adequado, como o miristato de isopropila, ou propiciar o contato do
contaminante com fatores nutricionais do meio de cultura. De outro lado, o produto
pode apresentar em sua composição componentes (inclusive os conservantes) que
apresentam atividade antimicrobiana, e que necessitam de inativação por técnica de
diluição ou pela adição de inativador específico ao meio de cultura. Uma terceira
possibilidade, quando aplicável, consiste na separação física de células microbianas dos
compostos antimicrobianos mediante técnica de filtração em membrana. Uma membrana
filtrante de bordas hidrófobas é usada para esta finalidade, sendo lavada com diluente
estéril, por exemplo, solução salina ou água peptonada (SAITO et al., 1985).
Células microbianas expostas aos efeitos de compostos antimicrobianos são
agredidas de forma sub-letal, assim como, aquelas submetidas a processos de aque-
cimento. O teste de esterilidade falha em não incorporar mecanismos de recuperação para
estas células, porém, permite tempo para sua restauração, diferentemente dos métodos
rápidos que encontram restrição na aplicabilidade (UNITED STATES PHARMACOPEIA,
2000).
22
5.2. OBTENÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS
Diversos aspectos no âmbito produtivo ou analítico levam a que o controle dos
produtos estéreis tenha início com a avaliação das matérias-primas, passe pelo processo
produtivo, ambiente e equipamento, de forma a permitir que se assegure condições de
reduzido potencial de falha, que será então detectado num sistema analítico bem
executado. Neste momento, devem ser considerados os possíveis caminhos que
conduzem a produtos estéreis. Estes são definidos em função da característica termolábil
dos princípios ativos ou mesmo da embalagem primária, da estabilidade química, custos,
disponibilidade de sistemas pré-existentes na planta industrial entre outros (PINTO et
al., 2000).
Pode-se subdividir a produção dos estéreis em dois grandes grupos: os de
manipulação asséptica e os submetidos à esterilização após envase (térmica, química ou
irradiação). No caso de manipulação asséptica é sempre lembrado o processo de filtração
com suas peculiaridades, embora na abrangência de itens estéreis haja outras possibilidades
a se considerar (FISCHER et al., 1996).
5.3. PROCESSOS ESTERILIZANTES
Para tratar dos processos de esterilização é interessante definir o conceito de
morte associado aos microrganismos. Um microrganismo é definido como morto quando
não mais prolifera em meios de cultura onde usualmente isto ocorria: considera-se como
forma de constatação a turbidez de meios líquidos ou o surgimento de colônias em meios
sólidos. Um organismo único deve ser capaz de proliferar através de muitas gerações para
ser detectado, portanto um microrganismo que não possa se reproduzir, ou possa fazê-lo
apenas poucas gerações, pode por este critério ser considerado morto. Na prática, não se
dispõe de meio de cultura que seja ideal ao desenvolvimento de qualquer cepa
microbiana. Ademais, organismos que sobreviveram a um potencial processo letal
apresentam requisitos metabólicos específicos, podendo não ser recuperados em meios
de cultura usuais (BLACK, 2002).
23
Outra consideração a ser feita é que organismos expostos a agentes letais não
morrem todos simultaneamente. O seu número decresce exponencialmente com o tempo
de exposição; portanto a ausência de todos os organismos viáveis irá ocorrer num tempo
infinito de exposição ao agente. Esterilidade é, portanto um estado absoluto e que não
pode ser garantido. Ainda que cuidadoso planejamento do processo esterilizante seja
desenvolvido, apenas aumenta a probabilidade de sucesso no sentido da esterilidade
(PELCZAR & REID, 1997).
A inativação de microrganismos por agentes esterilizantes envolve dano irreversível de
moléculas essenciais à célula. Da mesma forma, a exposição a estes agentes pode provocar
danos ao produto. Particularmente nas formas de dosagem farmacêutica em que o risco
envolve redução da atividade terapêutica, ou outros danos específicos graves, é
freqüentemente necessário assumir um compromisso entre o nível de garantia de
esterilidade ou Sterility Assurance Levei (SAL) aceitável e o máximo efeito adverso sobre
o material (PINTO et al., 2000).
5.4. TESTE DE ESTERILIDADE
Embora a terapêutica parental tenha tido origem no século passado, o primeiro
método oficializado do teste de esterilidade foi na Inglaterra em 1932. Este teste exigia
a execução em produtos sob a forma líquida, mediante utilização do caldo peptonado e
incubação a 37° C durante cinco dias, com vistas à detecção de bactérias aeróbicas
(SAITO et al., 1985).
Mais tarde, em 1936, a USP1 XI adotou a mesma metodologia, de maneira a aumentar
a credibilidade dos resultados. Na edição seguinte, de 1942, o recurso analítico foi
modificado para permitir o desenvolvimento de microrganismos aeróbicos e
anaeróbicos, bem como de microaerófilos. Na USP XIII, a preocupação se estendeu
para detecção de fungos, utilizando-se de meio de cultura contendo mel, com
incubação a 22°- 25° C, durante quinze dias. A inovação marcante ocorreu no fim da
década de 1960, com a introdução do método de inoculação indireta da amostra, inclusive 1 USP – UNITED STATES PHARMACOPEIA.
24
com a adoção do sistema fechado na Farmacopéia Européia em 1976 e na USP de 1980.
No Brasil, a metodologia da segunda edição da Farmacopéia Brasileira era explicitas nos
mesmos moldes da USP, visto ser tradução integral da mesma. Na última edição foram
incorporados detalhes e cuidados no que diz respeito ao procedimento, mantendo-se,
porém, o período de acordo com a edição anterior, ou seja, 7 dias no caso do método
indireto (filtração) e 14 dias para o método direto (SAITO et al., 1985).
Como pode ser observado, pela evolução da metodologia, a preocupação
inerente à melhoria de teste de esterilidade visa verificar com mais segurança a
qualidade do processo esterilizante empregado durante a fabricação de medicamentos
estéreis, bem como manipulações assépticas, levando-se em consideração o
aspecto probabilístico da esterilização (SAITO et al., 1985).
5.4.1. Amostragem
Sendo o teste de esterilidade um ensaio limite, exige-se critério de amostragem
que procure oferecer segurança no resultado final, quando extrapolado ao lote. Portanto,
a retirada de amostras a serem submetidas ao teste deve estar relacionada com a fase de
processamento, visto que este ensaio complementa as informações sobre a perfeita
execução de cada processo operacional esterilizante e/ou manipulação (SAITO et. al.,
1985).
A segurança do resultado do teste será maior quanto maior for a quantidade das
amostras ensaiadas, quando outros parâmetros são obedecidos, controlados ou
comprovados como eficazes. Entretanto, como existem problemas de ordem prática e
econômica é interessante estabelecer, no critério de amostragem, quanto de cada lote
deve ser submetido ao teste (SAITO et. al., 1985).
Convém salientar que o conceito de lote ou partida é diferente do aspecto legal, devendo
referir-se ao total de unidades com igual risco de contaminação. Em se tratando de matéria-
prima, cada embalagem deve ser submetida à amostragem. Por outro lado, a abertura de
todos os frascos de matéria-prima estéril nem sempre é possível, quer sob o aspecto de
segurança, quer sob o aspecto econômico e de praticidade. Segurança, porque normalmente
trata-se de barricas, vidros ou outros tipos de recipientes lacrados e o fato de abrí-los
25
implicaria na possibilidade de introdução de contaminantes viáveis, ainda que com todos os
cuidados de amostragem (PINTO et al., 2000).
Se o teste de esterilidade for executado em produtos a granel (bulk), oriundos de
manipulação totalmente asséptica ou de filtração esterilizante, há de se efetuar amostragem
de cada recipiente, visto que cada um apresenta condição particular de risco de contaminação.
Esta amostragem deve ser criteriosa quando o produto for suspensão, além de tomar todos os
cuidados de manipulação asséptica, no sentido de não alterar a homogeneidade da dispersão.
A prova de esterilidade nesta etapa de fabricação é omitida por muitos fabricantes, preferindo
correr o risco de rejeição do produto na fase final. Outros recorrem a esta omissão
fundamentada num histórico anterior, cujas condições gerais de local de fabricação, bem
como os procedimentos padronizados na sua manipulação foram constatados como seguros
(FISCHER et al., 1996; PINTO et al., 2000).
A 24ª edição da UNITED STATES PHARMACOPEIA (2000) passa a apresentar
tabelas contendo valores mínimos de unidades a serem testados para distintos tamanhos de
lotes de injetáveis de pequeno e grande volume, antibióticos, produtos não injetáveis, e
sólidos, com particularidades para antibióticos. Também introduz tabelas indicativas de
quantidades a serem amostradas dos recipientes, no caso de produtos líquidos e sólidos.
A amostragem de ampolas esterilizadas em autoclave deve ser realizada após o
teste de vazamento ou integridade, a fim de se evitar resultado falso-positivo. Outros
cuidados devem ser observados quanto à localização do material na autoclave, visto que
pode haver zonas mortas no seu interior. Este problema torna-se muito mais crítico quan-
do se trata de injetáveis de grande volume, pois há a probabilidade de o aquecimento não
ser tão uniforme em todos os frascos de uma carga de autoclave (CRISTÁLIA, 2005).
5.4.2. Preparo da Amostra
A execução do teste de esterilidade em produtos farmacêuticos deve ser precedida
de preparação das amostras, de maneira a se evitar resultados falsos (CRISTÁLIA,
2005).
Consiste em efetuar um tratamento, visando desinfecção da superfície externa
dos frascos, ampolas, ou outros materiais de acondicionamento e ou embalagem, pelo
uso de soluções anti-sépticas voláteis ou não, tais como fenol a 5%, álcool iodado,
26
formaldeído a 5%, álcool isopropílico, etc. Este tratamento, em função da natureza da
substância e da concentração utilizada, exige um tempo de contato, que deve ser
determinado experimentalmente frente aos contaminantes mais prováveis de estarem
presentes nestas amostras. Além disto, a eficiência dessas soluções deve ser comprovada
periodicamente (CRISTÁLIA, 2005).
5.5. MÉTODOS DE INOCULAÇÃO
5.5.1. Inoculação Direta
São adotadas duas possibilidades de inoculação da amostra ao meio de cultura
sendo as razões para o emprego de uma ou outra técnica decorrentes de fatores
diversos como facilidade e disponibilidade circunstanciais, além da eficiência desejada
ou limitações de ordem econômica(LEITE, 1998).
Qualquer que seja a forma de inoculação da amostra, entretanto, é fundamental
que se avalie e comprove a não interferência ocasionando falso-negativo. Para tanto, a
prática consiste em promover inóculo de 10 a 100 unidades formadoras de colônia (UFC)
de cepas determinadas, em série de tubos de meio de cultura contendo amostra (condição
do teste), paralelamente à série de tubos sem amostra residual (representando a
capacidade promotora de crescimento do meio de cultura). A forma de comprovar a não
interferência da amostra sobre o resultado analítico, etapa fundamental para a validação
da metodologia é constatando após o tempo de incubação de sete ou quatorze dias nas
condições definidas, equivalência de turbidez entre o tubo contendo ou não amostra
(LEITE, 1998).
Este foi o método utilizado desde a oficialização inicial da prova de esterilidade em
1932 e tem sido aplicado até os dias atuais. Consiste na inoculação de quantidades ou
volumes pré-estabelecidos da amostra em volumes estipulados de diversos meios de
cultura, na forma líquida ou mediante semeadura da amostra em nutriente sólido.
Portanto, com esta técnica deve haver, de cada unidade, uma tomada de ensaio, a qual
será introduzida num tubo de ensaio ou frasco contendo meio de cultura previamente
27
esterilizado e controlado quanto à ausência de contaminação e comprovado quanto à
capacidade promotora de crescimento (SAITO et al., 1985).
Todas as farmacopéias indicam alíquotas a serem transferidas para o meio de
cultura a partir de cada unidade integrante da amostra representativa do lote.
Evidentemente que quando o volume é pequeno, de 0,5 a 1,0 mL, geralmente se
recomenda a tomada integral desta quantidade, mas conforme aumenta-se o volume
efetua-se apenas uma tomada parcial. O método de inoculação direta é simples e de fácil
execução, porém, conforme a natureza da amostra exigem-se recursos intermediários, a
fim de que o resultado do teste seja válido (CRISTÁLIA, 2005).
Amostras semi-sólidas hidrossolúveis são facilmente testadas, mediante
fluidificação das mesmas com líquidos fisiológicos. Amostras sólidas ou líquidas,
constituídas por substâncias antimicrobianas devem ser testadas mediante critérios
corretos, procurando-se impedir a interferência desta atividade intrínseca no crescimento
dos contaminantes eventualmente presentes. Enquadram-se aqui todos os produtos
contendo conservantes, por serem de dose múltipla, ou única, como nos casos dos
imunobiológicos. No caso de fármacos antimicrobianos, quando existem inativadores
específicos que sejam compatíveis com a fisiologia do microrganismo, estes devem ser
previamente neutralizados. Quando as substâncias ativas antimicrobianas não oferecem
possibilidades para inativação específica, deve-se recorrer a outros processos. A
possibilidade que se apresenta consiste na diluição prévia da amostra, de modo que a
concentração desta substância no meio de cultura seja inferior à concentração mínima
inibitória, e desta forma incorrendo na baixa representatividade de amostragem
(CRISTÁLIA, 2005).
Para segurança dos resultados do teste, após o período de incubação, recomenda-se
a comprovação da eficiência do sistema inativador pela inoculação de microrganismos
padrão. Estes em número inferior a 100 microrganismos por tubo. Podem ser
representados por Clostridium sporogenes. São ainda recomendados Sacharomyces
cerevisae e Micrococcus luteus, tendo em vista o espectro de sensibilidade ser mais
amplo (LEITE, 1998).
Quando a amostra a ser testada está sob a forma de suspensão ou se trata de pó
insolúvel no meio de cultura, este aspecto pode trazer problemas na observação, não
28
permitindo distinção entre a turvação original e a resultante do crescimento
microbiano. Neste caso, certifica-se da presença de contaminante viável mediante a sub-
cultura executada entre terceiro a sétimo dia de incubação. Esta sub-cultura pode ser
efetuada em meio líquido de mesma natureza ou também por semeadura em meio
sólido. Como alternativa pode-se recorrer à observação microscópica da suspensão, mas
é cansativa e falha (PINTO et al., 2000).
A limitação do método de inoculação direta reside na probabilidade de se aprovar
um lote contaminado, devido à amostragem restrita e risco de atividade inibitória exercida
pelo residual do produto. De forma resumida pode-se apontar como vantagens da
inoculação direta a sua simplicidade e histórico de uso, pouca manipulação, requer pouco
treinamento e caracteriza-se por baixo nível de contaminação acidental. As suas
desvantagens são baixa representatividade da amostra, consumo elevado de meios de
cultura e de vidraria, possibilidade de resíduos de agentes inibitórios, tempo de
incubação, restrição para volumes a partir de 100 mL e interferência da turbidez do
produto, embora contornável por sub-cultura ou reação físico-química
(FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2000).
5.5.2. Inoculação Indireta ou Filtração
A técnica de inoculação indireta foi introduzida em 1957 por Holdowsky e seguida
de estudos por diversos pesquisadores. Baseia-se no tratamento prévio da amostra com
solubilização ou lavagem em líquidos fisiológicos, seguida de filtração esterilizante e
inoculação da membrana filtrante ao meio de cultura. Com isto, o produto a ser testado
não entra em contato com o meio de cultura. Em 1964, esta técnica foi introduzida como
oficial, tendo sido adotada nos Estados Unidos da América do Norte, constando em USP,
além de outras farmacopéias, bem como mantida nas edições subseqüentes (UNITED
STATES PHARMACOPEIA, 1995).
Este método foi no início aplicado especificamente para substâncias antibióticas,
principalmente aquelas que não podiam ser inativadas com vistas ao teste por
inoculação direta. Em 1964, muitas vantagens do método eram mencionadas, embora
ainda não estivesse universalmente oficializado. Dados comparativos entre a inoculação
direta e indireta de antibióticos mostravam grande eficiência na detecção de
29
contaminantes viáveis nestes produtos, quando testado pelo método de filtração (PINTO
et al., 2000).
A membrana filtrante empregada é geralmente constituída de ésteres de celulose,
com diâmetro de 47 mm, de borda hidrófoba e tamanho de poro de 0,45 ± 0,02 µm.
Existe certa divergência na escolha de filtros para uso industrial e laboratorial de teste,
pois, no primeiro caso emprega-se, geralmente, o de 0,22 µm enquanto que em provas
de esterilidade o de 0,45 µm O comparativo das características das membranas de 0,22
µm e 0,45 µm apontam para a primeira uma retenção "absoluta", importante na obtenção
de filtrado estéril, porém uma vazão lenta. A membrana de 0,45 µm é ainda eficaz na
retenção de microrganismos, com a vantagem de ser também adequada para a preservação
da viabilidade, pois compatibiliza melhor com a morfologia e fisiologia celular. Daí ser a
opção de escolha para o teste de esterilidade (SAITO et al., 1985).
Os sistemas filtrantes empregados no controle de qualidade de medicamentos
podem ser múltiplos ou unitários, necessitando, basicamente, de porta-filtro e recipiente
para transferência da amostra ou líquidos de lavagem. O filtrado a ser recolhido poderá
ser coletado em frasco coletor único ou individualizado. O processo de filtração é
efetuado sob pressão negativa, com valor máximo da ordem de 70 cm de Hg e vazão
da ordem de 55 a 75 mL por minuto. Portanto, as amostras devem ser
hidrossolúveis ou solúveis em solventes apropriados (FISCHER et al., 1996).
As quantidades estabelecidas de amostra podem ser transferidas para recipiente
contendo água peptonada 0,1% a fim de proceder à dissolução e ou diluição da
mesma e submeter esta solução à filtração. A insolubilidade de alguns produtos em
água peptonada exige introdução de certos recursos. Após filtração da amostra deve
haver lavagem da membrana com solução peptonada contendo os inativadores
específicos ou solubilizantes, a fim de que quantidade residual de antibiótico não seja
transferida juntamente com a membrana, para o meio de cultura (FISCHER et al., 1996).
No caso de se empregar sistema fechado, como Steritest® ou equivalente,
dispensa a preocupação do corte ou transferência da membrana, uma vez que a mesma
está inserida no cartucho e permanece após a filtração do produto e lavagens,
recebendo então o meio de cultura sem que tenha de ser deslocada ou manuseada.
30
Esta situação constitui-se em grande vantagem de facilidade operacional e
segurança do teste (PINTO et al., 2000).
A prova de esterilidade, como qualquer outro processo analítico, impõe a necessidade
de controle do próprio teste, sendo neste caso através de controles negativo e positivo,
além do acompanhamento das condições do ambiente durante sua execução
(CRISTÁLIA, 2005).
Buscando-se resumir também para o método indireto as características negativas e
positivas, deve-se dizer que como desvantagens apresenta maior nível de manipulação e
preparações prévias exigem maior treinamento técnico, impedimento de aplicação para
suspensões, óleos, cremes e pomadas não solubilizáveis e aumenta o risco de falso-
positivos. O emprego de sistema fechado reverte à situação em alguns aspectos, trazendo
facilidade operacional, reduzindo treinamento necessário, permitindo que apenas um
analista execute o teste e minimizando falso-positivos. As suas vantagens consistem em
maior representatividade estatística, redução de falso negativos, redução no consumo de
meios de cultura e abrangência a produtos com volumes de 1,0 mL até, por exemplo, 5,0
L (CRISTÁLIA, 2005).
A finalidade do teste de esterilidade consiste em detectar microrganismos
contaminantes em produtos que já sofreram algum tratamento esterilizante, durante o
ciclo de fabricação. A partir deste estágio deve ser manipulado assepticamente, a fim de
não violar a sua esterilidade. Portanto, não é do conhecimento do analista qual é o
contaminante viável residual ou agente de recontaminação do produto, antes de efetuar o
ensaio. Por esta razão a escolha do meio de cultura é de vital importância no sentido de
oferecer condições ideais para multiplicação de microrganismos, os mais diversos, com
exigências diferentes para seu crescimento. Além disso, o contaminante foi submetido a
condições adversas quando o processo esterilizante é por morte, seja de ação química ou
física (FISCHER et al., 1996).
Atualmente, os códigos farmacêuticos adotam métodos que requerem utilização de
meios de cultura, sob a forma líquida, capazes de promover o crescimento de bactérias
mesófilas e psicrófilas, além de fungos (SILVA, 1997).
Desde a introdução inicial da metodologia em 1932, diversos nutrientes foram
propostos e adotados, através das revisões constantes das farmacopéias, sempre
31
procurando oferecer condições que abrangessem o crescimento de maior gama de
contaminantes (UNITED STATES PHARMACOPÉIA, 1995).
Estudos comparativos entre diversos meios de cultura têm demonstrado que o
meio de tioglicolato pode i n i b i r o crescimento de algumas cepas de Bacillus e
Clostridium, sugerindo sua substituição por ditionito-tioglicolato, também conhecido
como meio de Clausen. Verificou-se efeito inibitório de tioglicolato quando testado
frente a 22 cepas de Clostridium, tendo sido comprovada sua ação inibitória sobre
quase todas. Isto não aconteceu quando ditionito de sódio foi adicionado ao meio fluido
contendo ambos os gêneros, seja o inóculo sob a forma vegetativa ou esporulada,
acusando não serem afetados pela composição do meio. A toxicidade devida ao
tioglicolato pode estar sendo influenciada por outros constituintes do meio,
conseguindo-se eliminar tal ação no caso de associação ditionito-tioglicolato. Além
disto, o ditionito age como estabilizante do tioglicolato, permitindo que o meio
apresente condições ótimas para sua utilização durante dois meses, quando armazenado
em refrigerador (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1998).
A constatação da presença de leveduras e bolores em produtos estéreis teve início
em 1942, quando a USP introduziu um meio contendo mel. Modificações posteriores
foram sugeridas, aparecendo o meio de Saboraud, por sua vez com outras alterações.
Posteriormente, a mesma introduziu o emprego do meio de caseína-soja como substituto
de Sabouraud (UNITED STATES PHARMACOPÉIA, 2000).
A Organização Mundial da Saúde, em 1972, recomendava que se revisasse melhor
as especificações inerentes aos meios de cultura para teste de esterilidade, bem como se
estabelecesse prova mais sensível para os fungos, sugerindo, também, que se
efetuasse o ensaio prévio dos meios empregados para o teste de amostras
(KOROLKOVAS, 1988).
Outra preocupação inerente aos meios de cultura reside na comprovação de sua
eficácia ou capacidade promotora de crescimento, o que deve ser verificado, pelo
menos para cada lote do mesmo. Ainda, como o nosso país depende da sua
importação, há que se pensar na possibilidade de condições distintas entre diferentes
embalagens do mesmo lote, ocasionadas por transporte e ou armazenamento em
condições adversas (KOROLKOVAS, 1988).
32
De modo geral, as farmacopéias recomendam inoculação de 10 a 100 unidades
formadoras de colônias (UFC) microrganismos viáveis podendo ser de Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans, Clostridium sporogenes, Bacteroides
vulgatus, Plectridium sphenoide, entre outros. Incubar todos os tubos nas condições
idênticas do teste propriamente dito e observar o aparecimento de turvação até o sétimo
dia para um controle positivo (CRISTÁLIA, 2005).
O tempo de incubação de cinco dias, conforme o primeiro método oficial de 1932,
persistiu durante outras revisões. Entretanto em 1927, já se dava ênfase para necessidade
de sete dias para incubação a 37 °C. No decorrer das revisões farmacopéicas houve
mudanças, passando a se adotar período de sete, dez e quatorze dias de incubação.
Entretanto, a USP de 2000 amplia o tempo de incubação para 14 dias para casos de
inoculação indireta, exceto quando a esterilização térmica tenha sido empregada no
produto terminado (SAITO et al., 1985).
O resultado do teste de esterilidade, desde a época de sua oficialização, foi
fundamentado em observação macroscópica do crescimento microbiano, manifestado sob
a forma de turvação do meio líquido ou aparecimento de colônias no meio sólido. A
decisão da FDA2 é de que se um tubo apresentar contaminação deve-se proceder o reteste,
usando 40 unidades do produto. Se acusar algum crescimento deve-se efetuar o segundo
reteste, sendo que para aprovação do lote não deve haver crescimento nos tubos deste
reteste (SAITO et al., 1985).
Em se tratando de prova de esterilidade com auxílio do processo filtrante da
amostra, o controle negativo efetuado pelo menos para cada dia de trabalho, abrangendo
o ciclo de esterilização de todo material empregado no teste, tem grande importância
na interpretação do resultado. O aparecimento de turvação em qualquer dos meios de
cultura contendo a membrana deve ser motivo para novo teste. Os mesmos critérios
discutidos para caso de inoculação direta são válidos na decisão que aprova ou rejeita um
lote quanto ao teste de esterilidade (CRISTÁLIA, 2005).
Outros tipos de métodos rápidos têm sido considerados, permanecendo, entretanto
como preocupação a questão de tempo de recuperação envolvido para proliferação de
microrganismos submetidos a danos ou estresses decorrentes do próprio processo
2 FDA – Foog and Drugs Administration
33
industrial, prejudicando a manifestação da viabilidade e dessa forma conduzindo a
resultados falso-negativos (CRISTÁLIA, 2005).
5.6. CONTROLE DA EFICIÊNCIA DE ESTERILIZAÇÃO
Com o intuito de cada vez mais se assegurar a eficiência dos processos
esterilizantes, visto que o próprio teste de esterilidade numa amostra representativa
não tem condição absoluta de informação sobre a esterilidade do conjunto das unidades
submetidas ao processo, foi introduzido o uso de indicadores de esterilização (ALBERT
et al., 1989).
O emprego de indicadores físicos, químicos e biológicos é citado como recurso de
controle do processo esterilizante. Indicadores físicos baseiam-se em temperatura de
fusão dos mesmos, com alteração de cor, quando a autoclave ou o forno atinge uma
determinada temperatura. O inconveniente destes casos pode estar no fato de não
indicarem por quanto tempo o material interno esteve submetido àquela temperatura de
fusão, embora já se tenha chegado a indicadores com gradientes de coloração em função
desse tempo (BAIRD, 1986).
Evidentemente, os indicadores mais aconselhados são os biológicos. Estes são
esporos de cepas de microrganismos devidamente selecionados quanto à resistência ao
processo esterilizante. Portanto, devem ser espécies menos susceptíveis a um
determinado processo, seja físico ou químico. A utilização destes microrganismos, na
forma viável, concomitantemente à operação industrial esterilizante, dá provas mais
seguras sobre a eficácia do tratamento. Esta comprovação é verificada quando são
oferecidas aos indicadores condições adequadas para seu crescimento (BAIRD, 1986;
PINTO et al., 2000).
A ausência de crescimento é indicação de que o processo foi eficiente sobre os
microrganismos, podendo-se considerar tal fato abrangente aos contaminantes normais
do produto. Permite-se, então, afirmar que houve eficiência esterilizante do processo
empregado (BLACK, 2002).
A eficiência de um processo esterilizante pode ser medida de três maneiras: pelo
histórico do processo contendo diversos dados, pelos estudos de inativação de uma série
34
de microrganismos e pelo uso de indicadores biológicos. O primeiro método é aplicável
quando todos os parâmetros são conhecidos e estabelecidos, como ocorre na
esterilização por calor úmido. Evidentemente que estes parâmetros devem ser
estabelecidos para cada processo, mediante estudo de cinética, sendo uma das maneiras
mais indicadas a de construir curvas de inativação de diversos microrganismos,
particularmente dos mais resistentes a este processo escolhido, em função da
compatibilidade do material a ser esterilizado. Esta é a situação de maior
aplicabilidade para a liberação paramétrica dos produtos (CRISTÁLIA, 2005).
A utilização de indicadores biológicos deve ser criteriosa, inoculando-se o próprio
produto com os mesmos, de modo a assemelhar-se ao máximo à condição em que se
encontra o contaminante natural frente ao processo. É por isto que se deve conhecer o
estado de contaminação em que se encontra o produto, antes de ser submetido à
esterilização, de modo que o indicador seja, em número e resistência, superior ao viável
natural. Convém frisar que quanto maior o número de inóculos, tanto maior será a
confiabilidade do resultado (CRISTÁLIA, 2005).
A validação do método deve ser estabelecida e documentada, demonstrando
inclusive as características de exatidão, sensibilidade, especificidade e
reprodutibilidade. Inclui etapas de qualificação da instalação, operacional, do
desempenho e do método de teste (LEITE, 1998).
Quando se discutem diversos aspectos analíticos do teste de esterilidade, observa-se
que no decorrer das últimas décadas houve uma evolução na metodologia. Entretanto,
existem ainda pontos fundamentais que constituem a limitação do método, no que diz
respeito à segurança de informações. A falta de certeza absoluta quanto ao estado de
esterilidade do total de unidades pertencentes ao lote é uma questão de inferência
estatística, razão pela qual o critério de amostragem é importante (LEITE, 1998).
A probabilidade de rejeição ou aprovação de um lote industrial, fundamentada em
amostragem de 20 recipientes, apresenta chance de 67% em considerar como estéril
um lote cuja contaminação é de 2%. Por outro lado, um lote com 10% de unidades
contaminadas será seguramente rejeitado quando a amostragem abranger
100 itens (PINTO et al., 2000).
35
Em outras palavras, pode-se afirmar que com este número de amostras, a
probabilidade de aceitar o lote como isento de contaminação será zero. Logo, com
menor número de unidades tem-se pequena probabilidade de rejeição como lote
contaminado e maior possibilidade em aceitá-lo como estéril.
Outras limitações de ordem prática e econômica persistem, pois a própria metodologia,
empregada para evidenciar a presença de contaminante viável é falha, por não propiciar
abrangência necessária quanto ao crescimento de todos os tipos microbianos (PINTO et
al., 2000).
No que diz respeito ao reteste, por vezes executado sem a necessidade real, existem
sempre envolvimentos do custo do mesmo, da revisão da documentação, além do desgaste
oral e de relacionamento, e atraso nas vendas, podendo ser esta repassada a concorrentes
(CRISTÁLIA, 2005).
Devido às possíveis graves conseqüências para a empresa, mas também à questão
ética, a tomada de decisão da liberação e do reteste, deve ser feita pelo gerente da área de
controle ou garantia de qualidade, conforme o organograma da empresa, mas sempre com
ciência e compartilhando responsabilidade com o farmacêutico responsável e a alta
administração da empresa (ANSEL et al., 2000).
36
6. TESTE DE PIROGÊNIO
Embora o conhecimento científico que se tem sobre pirogênio tenha sido adquirido
nos últimos 50 anos, o estudo sobre a febre, especulações sobre suas causas,
mecanismos e efeitos são tão antigos quanto a medicina, datando de mais de 2.000 anos
atrás. Os primeiros médicos gregos visualizavam a febre mais como mecanismo
terapêutico que patofisiológico. A idéia de que a febre pudesse ter valor terapêutico
sobreviveu por séculos, sendo que inicialmente injeções intravenosas de material
pútrido eram administradas a animais em caráter experimental. Em etapa subseqüente,
preparações altamente pirogênicas preparadas de células mortas de Salmonella typhosa
foram empregadas como vacinas(PINTO et al., 2000).
Nem todos os autores viram a febre como benéfica; no início do século XIX dois
farmacêuticos franceses, Pelletier e Caventue isolaram um antipirético, a quinina. Como
resultado, estudos em animais permitiram conhecer os efeitos de pirexia e antitérmicos
(FARMACOPEIA BRASIELIRA, 1998).
Durante a última década do século XIX, Centanni conduziu estudos significantes
quanto aos agentes responsáveis pela febre. Entre outros, ele descreveu um procedimento
para isolar a toxina bacteriana responsável pela ação febril. Mantendo culturas de bactérias
Gram negativas sob autólise durante longos períodos, procedendo a filtração esterilizante
e então submetendo a fracionamento em álcool, ele obteve pó branco altamente
pirogênico, a partir de larga variedade de bactérias. Centanni foi o primeiro a reconhecer a
relação causa-efeito entre endotoxina (pirotoxina) e a febre. Ele foi também o primeiro a
demonstrar o "terceiro tipo de imunidade", posteriormente chamada de tolerância
pirogênica, evidenciada após injeções repetidas de endotoxina. (FARMACOPEIA
BRASILEIRA, 1998).
Os microbiologistas demonstraram a seguir que as endotoxinas eram encontradas
em muitas bactérias. Este trabalho foi grandemente facilitado pela descoberta de Gram
em 1884, quanto a processo de coloração que recebeu seu nome. Os investigadores
rapidamente aprenderam que endotoxinas estavam associadas exclusivamente a Gram
negativas. Na passagem do século, vários pesquisadores estavam preocupados com
febres que às vezes acompanhavam injeções, bem como outros efeitos colaterais
37
associados à administração parenteral de agentes terapêuticos. Porém a eliminação de
bactérias por esterilização térmica ou filtração não eliminava a pirogenicidade destas
preparações. O primeiro entendimento da assim chamada "febre das injeções" decorreu
das investigações relatadas por Hort e Penfold em 1912 (FARMACOPEIA
BRASIELEIRA, 1998).
Estes pesquisadores foram os primeiros a planejar e padronizar o teste de pirogênio em
coelhos. Com este teste, foram capazes de classificar bactérias em pirogênicas e não
pirogênicas, o que as correlacionava com o esquema Gram de classificação bacteriana.
Culturas mortas foram comparáveis às viáveis quanto à indução de febre. Também, estes
pesquisadores demonstraram que a pirogenicidade de água destilada era relacionada à
concentração bacteriana. Eles concluíram que uma substância termoestável era a
provável causa das febres de injeção (FARMACOPEIA BRASIELEIRA, 1998).
Os pirogênios são divididos em duas classes. Exógenos são aqueles que se originam
fora do corpo e induzem elevações térmicas quando injetados em animais e no homem.
Embora o lipopolissacarídeo (endotoxina) seja o mais significativo, há outros produtos,
de constituição química diversa, que também produzem elevação de temperatura quando
injetados sob condições apropriadas. Como fonte de pirogênio exógeno menciona-se
grande variedade de origens, desde bacteriana, de fungos e vírus, bem como
componentes de bactérias Gram negativas e de bactérias Gram positivas, assim como
pirogênios não microbianos, como alguns fármacos, esteróides, frações do plasma, e o
adjuvante sintético muramil dipéptide (PINTO et al., 2000).
O pirogênio endógeno (PE), entretanto é produzido internamente pelo hospedeiro
em resposta ao estímulo de pirogênios exógenos. O pirogênio endógeno consiste de
substância homogênea, sintetizada por diferentes células do hospedeiro após exposição ao
pirogênio exógeno, sendo considerado o mediador primário da febre (PINTO et al., 2000).
6.1. ENDOTOXINAS
As endotoxinas são complexos de alta massa molecular associados à
membrana externa de bactérias Gram negativas, e se constituem na mais significante fonte
38
de pirogênio para a indústria farmacêutica. Endotoxinas não purificadas podem conter
lípideos, carboidratos e proteínas, porém quando purificadas são denominadas de -
lipopolissacarídeos (LPS) para enfatizar sua natureza química. Por isso, como nos
produtos farmacêuticos podem ser encontradas unidades não purificadas nas fases em
processo ou nos produtos terminados, prefere-se a terminologia de endotoxinas
(BLACK, 2002).
Suas características de universalidade, relativa estabilidade térmica, e capacidade de
provocar profundas alterações fisiológicas quando administrada via parenteral tornam
sua detecção e eliminação um considerável desafio ao produtor de parenterais, de artigos
vinculados à sua administração ou de próteses (PINTO et al., 2000).
6.2. NÍVEIS PIROGÊNICOS
A questão de níveis pirogênicos torna-se crucial ao considerar os limites de libe-
ração para os produtos farmacêuticos. Em 18 de janeiro de 1980, o Bureau of Drugs
publicou um ensaio cujo título era Guidelines for Validation of the Limulus Amebocyte
Lysate Test as an End-Product Test for Human and Veterinary Injectable Drugs and
Medicai Devices. Este documento estabeleceu 50,0 pg/mL (0,5 ng/Kg) como limite
final de liberação de produtos farmacêuticos não intratecais. Posteriormente, foi
proposta redução para 35,0 pg/mL (PEARSON, 1985).
Quando considerado sob evidência científica, 100,0 pg/mL é um limite de
liberação aceitável para parenterais de grande volume e proporciona um significante
fator de segurança sobre o teste de pirogênio em coelhos, segundo a USP.
Conseqüentemente, foi sugerida a reavaliação do Bureau of Drugs no sentido do
estabelecimento de 100,0 pg/mL (1,0 ng/Kg) como limite final de liberação para
endotoxinas em parenterais de grande volume (PEARSON, 1985).
É importante ter em mente que, quando o teste oficial em coelhos foi desenvolvido,
não houve tentativas no sentido de definir os níveis de endotoxina que fossem
pirogênicos a coelhos ou humanos. Em 1956, Westphal obteve resultados indicando que
a dose pirogênica mínima de endotoxina purificada de Salmonella abortus equi por
kilograma foi comparável em humanos e coelhos. Estes resultados foram confirmados por
39
pesquisadores que reconheceram a importância de determinar a sensibilidade relativa de
coelhos e humanos a várias endotoxinas, uma vez que o teste de pirogenicidade era
feito objetivando segurança no uso de medicamento parenteral em humanos
(PEARSON, 1985).
Um trabalho do Limulus Amebocyte Lysate Task Force, desenvolvido pela Parenteral
Drug Association (PDA) permitiu obter dados importantes para a confirmação e ampliação
dos estudos anteriores, e inclusive inferir que, sob condições ótimas, a sensibilidade do
teste de pirogênio em coelhos USP se aproximava de 1,0 ng da endotoxina comercial E.
coli, podendo este valor ser tomado como ponto de referência para limites de endotoxina
em parenterais de pequeno volume. Infelizmente o trabalho não se estendeu a parenterais de
grande volume (DABBAH et al., 1980).
Os limites atualmente considerados aceitáveis para endotoxina bacteriana são: para
produtos farmacêuticos e biológicos 5 UE/Kg; radiomarcadores 2,5 UE/Kg; parenterais de
grande volume 0,5 UE/mL; água para injeção 0,25 UE/mL; drogas intratecais 0,2 UE/mL;
correlatos até 200 UE/unidade e correlatos intratecais 0,06 UE/unidade (UNITED STATES
PHARMACOPEIA, 2000).
6.3. PIROGÊNIOS DE FONTES DISTINTAS
Adicionalmente às endotoxinas de bactérias Gram negativas, uma variedade de outras
substâncias produzem reações pirogênicas. A maioria das cepas de estreptococos grupo A
produz toxinas eritrogênicas que causam avermelhamento da pele. Esta exotoxina é
comprovadamente uma potente fonte de pirogênios. Adicionalmente à produção de febre, a
exotoxina estreptocócica também desenvolve suscetibilidade ao choque endotóxico letal,
entre outros efeitos (PEARSON, 1985).
Mycobacterium tuberculosis é também produtora de duas substâncias pirogênicas,
além de ser a principal causa de tuberculose em humanos. Esta bactéria pode produzir febre
pela interação com fagócitos, granulomas reativos ou via reação sistêmica (PEARSON,
1985).
40
Embora enterotoxinas estafilocócicas estejam mais associadas com envenenamento
agudo por alimentos, são também potentes pirogênios com atividade em coelhos, a partir de
1 mg/Kg. Em adição a enterotoxina estafilocócica, outras exotoxinas pirogênicas têm sido
isoladas de Staphylococcus aureus (PEARSON, 1985).
Vírus são provavelmente responsáveis por mais episódios pirogênicos em humanos
que qualquer outro agente isolado. Leucócitos de coelhos têm sido incubados na presença
de vírus, mas os mecanismos envolvidos permanecem não esclarecidos. Injeção intravenosa
de vários tipos de vírus em animais induz a produção concomitante de pirogênio endógeno
e interferon, que eventualmente sejam coincidentes (PEARSON, 1985).
Quanto aos fungos, também têm se mostrado altamente pirogênicos quando injetados
via intravenosa em animais experimentais, permanecendo não claro o mecanismo
indutor.Devem adicionalmente ser consideradas as fontes não microbianas de pirogênio,
particularmente a indução por fármacos como alguns antibióticos e esteróides, e
polinucleotídeos como o ácido polinosinico-policitidílico (PEARSON, 1985).
6.4. PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO
A despirogenização pode ser obtida de duas formas, seja pela inativação ou remoção
das endotoxinas. A inativação pode ser obtida pela detoxificação da molécula material de
acondicionamento, os demais são extremamente específicos ou apenas se justificam em
medicamentos ou produtos biológicos de altíssimo valor agregado (PELCZAR & REID,
1997).
Deve permanecer muito fortemente sedimentada a importância de trabalhar todo o
processo produtivo em condições adequadas de higiene, dos operadores e ambiente, além
de empregar matérias primas com baixas cargas microbianas, processos validados, pessoal
qualificado e treinado. Em suma, aplicar todos os conceitos de Boas Práticas de Fabricação,
de forma que o produto seja obtido apirogênico no primeiro processamento, dispensando
preocupações quanto a reprocessos ou tratamentos adicionais (ABIFARMA, 1978).
41
Todas as etapas críticas devem ser monitoradas, por exemplo, com controles
periódicos de águas armazenadas, ainda que na condição ideal de temperatura mínima de
80 °C, sob agitação, ao menos três vezes ao dia. No caso da água recém destilada, nunca
utilizá-la sem um teste prévio quanto a endotoxinas. Da mesma forma, validar
periodicamente estufas ou túneis de despirogenização, respeitando atendimento de um
mínimo de três reduções decimais na concentração de endotoxinas (UNITED STATES
PHARMACOPEIA, 2000).
Todas as monitorações de processo, assim como testes de matérias-primas, com
particular atenção às de origem natural, e do produto terminado, devem empregar técnicas
analíticas validadas, seja com a metodologia clássica empregando coelhos ou diferentes
métodos empregando a técnica in vitro do LAL3 (CRISTÁLIA, 2005).
6.5. TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO IN VIVO
Desde 1954, tem havido congressos e simpósios em que se discutem as questões
inerentes à metodologia oficial para detecção de substâncias pirogênicas. Nestes últimos
anos a preocupação está se voltando, cada vez mais, a derivações, detalhamentos e
ampliação do método alternativo in vitro, que já ganhou confiabilidade, mas enfrenta ainda
limitações, sejam reais ou derivadas do desconhecimento. Dentro de perspectivas
realísticas, o teste de pirogênio em coelhos, apesar de delegado apenas a situações às quais
não é aplicável a metodologia alternativa, deve ser mantido. Terá sempre a seu favor a
situação privilegiada do envolvimento de toda a reação fisiológica do animal, constituindo-
se não apenas em teste de pureza para substâncias pirogênicas, mas também em teste de
segurança para os produtos injetáveis, líquidos para infusão e perfusão, materiais cirúrgicos
e descartáveis em geral (EUROPEAN PHARMACOPEIA, 1997).
3 LAL – Limulus Amebocyte Lysate
42
6.5.1. Fundamento do Método
Apesar de algumas modificações, o fundamento do método permanece o mesmo
desde sua oficialização. Alterações mais consistentes estão relacionadas com o número de
animais, a chance de reteste antes da decisão final de rejeição, melhorias nas condições
analíticas para condução do teste e outros, procurando minimizar a variação biológica e
com isto aumentando a segurança do ensaio. É um ensaio limite, com a chance de aprovar
ou rejeitar uma amostra, mediante informações obtidas de um grupo de coelhos, e que
devem atender a um nível padrão de estado febril. Cada grupo de animais recebe a injeção
intravenosa da amostra e é observado durante um período, geralmente de 3 horas
(FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1998).
Diferentes métodos oficiais farmacopeicos são semelhantes entre si, visto que
consideram o número de animais com elevação térmica acima de um valor limite,
normalmente estipulado para igual ou maior que 0,6 °C, ou a somatória de elevação térmica
individual de todos os animais testados. Portanto, a elevação térmica de pelo menos 0,6 °C
é considerada como decorrência da inoculação de dose pirogênica de material estranho.
Sendo assim, quanto maior o número de animais, tanto mais segura será a decisão, por
diminuir a variabilidade do reagente biológico. Porém, há que considerar os pontos
referentes à praticidade e custos do ensaio (CRISTÁLIA, 2005).
Quando se analisa critérios de interpretação necessária se faz à conceituação exata
sobre a elevação térmica individual dos coelhos. As farmacopéias definem este valor como
sendo a diferença entre a temperatura máxima após a injeção e a de controle, devendo ser
valor positivo, e nos casos negativos considera-se zero.
6.5.2. Modelo Animal
Entre os mamíferos experimentados como substrato biológico para a detecção de
substância pirogênicas, o coelho foi considerado animal de escolha por diversas razões.
Evidentemente que quando se pensa em utilizar a resposta hipertermizante como parâmetro
deste ensaio, será de se esperar que o sistema termoregulador da espécie animal tenha as
43
mesmas características do ser humano. Além da semelhança qualitativa será necessária,
também, a constatação da magnitude da resposta frente ao material pirogênico injetado
(PEARSON, 1985).
No que diz respeito à sensibilidade das espécies, as informações iniciais são de que
existe equivalência, desde que os coelhos sejam adultos. Por tais razões surgiu a limitação
do peso corporal mínimo, geralmente de 1,5 kg, embora a primeira metodologia tivesse
estipulado 1,0 kg. Este fato não está relacionado com a sensibilidade, mas com a
praticidade analítica. Se para injetáveis de grande volume a dose recomendada é de 10,0
mL/kg, a injeção de volumes maiores que 30,0 mL consome tempo maior que 4 minutos,
necessitando de um tempo muito grande para a inoculação de 3 a 5 animais. Por isto,
algumas raças de porte menor como a holandesa, Himalaia e polaca são preferidas. Apesar
de não atender a este requisito, utilizam-se raças albinas, com orelha bem desenvolvida,
como a neozelandesa (PEARSON, 1985).
Cuidados devem ser tomados com a colônia de coelhos que esteja recebendo,
constantemente, doses sub-pirogênicas de endotoxinas, e gradativamente tornando-se
refratária a níveis de contaminação realmente pirogênicos. Em casos de dúvida deste tipo
será aconselhável a constatação da reatividade, pelo menos de alguns deles, mediante
injeção de padrão de endotoxina, de resposta conhecida. Ou, quando possível pela inclusão
em cada grupo, de ao menos um animal não anteriormente utilizado em teste, a caráter
rotineiro (PEARSON, 1985).
As condições ecológicas do biotério de coelhos devem respeitar as exigências quanto
à faixa de neutralidade térmica da espécie, com variação inferior a ± 3 °C, com instalações
que permitam renovação de ar, além de barreiras acústicas, bem como para insetos e
roedores estranhos. No caso de se dispor de biotério de manutenção, é importante a
quarentena, para posterior introdução de animais externos à colônia para os testes. Toda
vidraria empregada para o preparo das amostras, bem como para injeção intravenosa das
amostras deve ser despirogenizada previamente, por tratamento térmico. As monografias
recomendam 30 minutos a 250 °C ou 1 hora a 200 °C. Outra opção consiste em trabalhar
com material apirogênico descartável, ao invés do convencional (CRISTÁLIA, 2005).
Em vista das informações muitas vezes conflitantes, o importante é que os animais
empregados em teste sejam sadios, e que apresentem facilidade de condicionamento para o
44
teste. Os animais permanecem presos em contendores, nos quais a imobilização se faz pela
região cervical, permitindo que cada um assuma posição sentada e cômoda, pois, a
imobilização total dos mesmos poderia induzir hipotermia ou mesmo hipertemia. A
contenção dos animais surgiu em decorrência da massificação dos testes bem como da
automatização no registro de temperatura retal, mediante inserção de par termoelétrico no
reto do animal (PINTO et al., 2000).
São sugeridos valores de oscilação térmica individual de 0,3 °C, sendo que animais
que normalmente apresentam variação maior entre duas determinações consecutivas podem
dar falso-positivo. O valor médio das determinações, para cada um, com dispersão de 0,2
°C será o limite de oscilação térmica fisiológica. Este limite será referência para o dia do
teste, pois, nesta ocasião à temperatura de controle de cada animal deverá estar
compreendida entre estes valores (PINTO et al., 2000).
6.5.3. Amostra
Sob o ponto de vista de controle de qualidade, todos os injetáveis, bem como os
equipamentos de transfusão, infusão e todos os dispositivos implantáveis ou descartáveis
empregados na terapia parenteral devem oferecer segurança ao paciente, sob o ponto de
vista de contaminantes pirogênicos. Este aspecto engloba, além da contaminação tipo
endotóxica, todo e qualquer contaminante estranho, capaz de ser detectado, pelo menos
com o teste animal. Logo, tanto injetáveis de grande e de pequeno volume devem ser
testados. Recentemente, produtos em forma de aerossol, para uso respiratório, estão sendo
testados, podendo ser englobados na mesma exigência (BPF, 1990).
Sabe-se, entretanto, que o potencial de periculosidade é maior quando se trata de
injetáveis de grande volume, ou mesmo de pequeno volume, com uso exclusivo por via
intravenosa. A diferença conceitual entre ambos varia conforme o país, sendo para alguns a
partir de 15,0 mL, enquanto que para outros de 50,0 mL. Produtos que contêm fármacos
que atuam sobre o sistema termo-regulador, inibindo o estado febril, não permitem detectar
a presença de contaminantes termogênicos. Se a reação biológica fosse apenas neste
aspecto não haveria problemas, mas devido a outras reações tóxicas desencadeadas por
pirogênio, há que estar atento para a segurança do usuário, também nesses produtos
(LACASA & VEGA, 1989).
45
Outros produtos incompatíveis com a metodologia animal são aqueles que contêm
hipnóticos, anestésicos, gluconato de cálcio, alguns antibióticos como anfotericina e
vancomicina, entre outros. Incluem-se também radiofármacos que naturalmente provocam
aumento na temperatura corporal. Nestes casos, o teste em diluentes será importante. Da
mesma forma, em radiofármacos de meia vida muito curta, o teste poderá ser realizado no
produto após o prazo de validade, a fim de obter informações de caráter preventivo para
novos lotes a serem fabricados (CRISTÁLIA, 2005).
6.5.4. Coelho
O manuseio dos animais durante o teste é fundamental para que estímulos adversos
não acarretem, principalmente, a hipersensibilidade. No dia do teste deve-se suspender o
fornecimento da alimentação, ou pelo menos durante o teste, mas o acesso à água pode ser
livre, embora geralmente isto não seja efetuado em função das restrições encontradas nas
instalações. Quando o animal é devolvido à gaiola, durante o tempo de observação, este
pode tomar água livremente. A preferência para não fornecimento da dieta desde a noite
anterior ou pela manhã, nos casos de utilizar os animais pela manhã ou pela tarde,
respectivamente, está relacionada com questões de ordem prática, pois, nos casos de manter
o par termoelétrico no reto, este pode ser expulso juntamente com a eliminação das fezes
(KOROLKOVAS, 1988).
Quanto ao horário para execução do teste, se de manhã, tarde ou noite, não existem
pesquisas neste sentido, ficando a escolha do período ideal, na dependência da demanda e
organização interna de cada laboratório. Cada animal, respeitado o período de descanso,
deve ser pesado, colocado em contendor seguindo-se a introdução do par termoelétrico.
Procede-se então a seleção dos coelhos, que consiste em determinar a temperatura corporal,
de 40 a 90 minutos antes da injeção. Conforme a monografia, este valor resulta de uma
única tomada de temperatura, ou é representado pela média de 3 determinações, a cada 30
minutos. Por sua vez, a diferença entre duas determinações consecutivas, no mesmo animal,
não deve exceder de 0,2 °C. Outra exigência é que a dispersão da temperatura de controle,
entre os animais de cada grupo, não deve ser maior que 1,0 °C, embora sejam valores
compreendidos entre 38,0 e 39,8 °C. Outras monografias exigem, simplesmente, que a
46
temperatura de controle seja inferior a 39,8 °C. Se a tomada de temperatura for contínua,
com registros gráficos durante o tempo que antecede a injeção da amostra, este recurso dará
um referencial muito mais seguro do que a determinação única ou múltipla (CRISTÁLIA,
2005).
A solução-teste deve ser injetada na veia marginal da orelha e registrar a temperatura
corporal durante pelo menos 3 horas. As determinações, no caso descontínuo, ao menos 3, a
intervalos de uma hora após a inoculação da amostra, ou em maior número, a intervalos de
tempo menor. O ideal será o registro gráfico contínuo, cujo perfil da curva oferecerá
melhores condições para a decisão final. Interpretam-se os dados experimentais, em
confronto com a monografia adotada, possibilitando a disposição final como apirogênico,
pirogênico ou duvidoso (CRISTÁLIA, 2005).
6.6. DETERMINAÇÃO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS
POR MÉTODO IN VITRO
Desde 1885, observou-se que o sangue do Limulus polyphemus, o caranguejo em
forma de ferradura de cavalo, formava um coágulo em gel sólido quando removido do
animal. Vários aspectos da coagulação foram estudados, com particular referência aos
amebócitos, a única célula circulante encontrada no sangue do Limulus. Subseqüentemente,
tomou-se conhecimento que bactérias marinhas, Gram negativas, provocavam uma doença
fulminante nos caranguejos, caracterizada por extensiva coagulação intravascular e morte.
Um derivado termoestável destas bactérias era responsável por esta coagulação
(PEARSON, 1985).
Em 1964, Levin e Bang apresentaram estudos que permitiram as seguintes
conclusões: os amebócitos eram necessários para a reação, e sua lise acelerava a reação;
quantidades de endotoxina eram inativadas na reação. Inicialmente, foi desenvolvido um
ensaio sensível para endotoxinas no plasma humano usando o material lisado do amebócito
do Limulus (PEARSON, 1985).
47
6.6.1. Mecanismo de Reação
Após Levin e Bang (apud PEARSON, 1985) demonstrarem que a atividade de
coagulação da hemolinfa do Limulus residia no amebócito, trabalho de Young (apud
PEARSON, 1985) e colaboradores estabeleceram a natureza enzimática da reação induzida
pela endotoxina. Eles concluíram que a reação é dependente da ativação de enzima de alta
massa molar pela endotoxina, que por sua vez gelifica proteínas coaguláveis de baixa massa
molar. Esta reação é crítica na definição de um ponto final no teste LAL. A enzima de
coagulação, de elevada massa molar, foi isolada a partir de lisado ativado pela endotoxina.
Estudos posteriores demonstraram que a ativação depende também de Ca2+, e outros íons
bivalentes. A proteína coagulante de baixa massa molar, estudada por Solum, foi
denominada de coagulogênio. Incluindo coagulogênio à enzima de coagulação ativada
obtida do sangue de Tuchypleus tridentatus, outra espécie de caranguejo em forma de
ferradura de cavalo, era produzido um gel protéico. As características das seqüências de
aminoácidos levam a crer que coagulogênio e fibrinogênio derivem de um ancestral
comum, sendo o primeiro um protótipo do fibrinogênio dos primatas (PEARSON, 1985).
6.6.2. Ponto Final de Gelificação
O mais simples e amplamente usado dos procedimentos para detecção de endotoxinas
baseia-se na gelificação. Volumes iguais de reagente de lisado e solução-teste (0,1 mL de
cada) são transferidos aos tubos-teste de vidro despirogenizado de 10 x 75 mm. A mistura é
então suavemente homogeneizada e a seguir incumbada em banho de água a 37 ºC por uma
hora, durante a qual os tubos não devem ser manuseados, a fim de não interferir na
gelificação. O ponto final da reação é facilmente constatado pela remoção cuidadosa e
individual dos tubos e sua inversão a 180 ºC. Se houver a presença de gel que se mantém
sólido durante a inversão, a amostra é considerada positiva para endotoxinas. Quando
conduzido desta forma, através da transformação do sistema sol em gel, o ensaio se
constitui em teste limite, levando em consideração a sensibilidade do LAL empregado.
Apresenta sensibilidade na faixa de 0,25 a 0,015 UE/mL (UNITED STATES
PHARMACOPEIA, 2000).
48
O ensaio pode ser usado para definir o nível de endotoxina de uma solução particular
do produto. Diversas diluições 1:2 em duplicata são preparadas e o ponto final
determinado. O nível de endotoxina é calculado multiplicando a recíproca da mais alta
diluição da solução com ponto final positivo pela sensibilidade do LAL. Exemplificando, se
a sensibilidade do reagente for de 0,010 ng/mL e a diluição do ponto final for 1:16, então a
concentração de endotoxina será de 0,16 ng/mL. Este critério é particularmente útil na
monitoração em processo, de materiais e da água. Permanece o método de escolha para
testes em número reduzido ou não freqüentes, para que turvem ou com expectativa de
resultado negativo (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000).
6.7. OUTROS MÉTODOS
Outras técnicas têm também sido propostas, como ensaio da microdiluição, ensaio de
LAL radiomarcado e fluorescente, todos provocando menor impacto, ao mesmo até o
momento. A automação tem sido bastante estudada, permitindo ensaios de maior
reprodutibilidade e rapidez. Interessante é a aplicação de sistema semi-automático cinético,
(o teste emprega placas, leitor tipo Elisa e Software específico) que determina alterações
seqüenciais na densidade óptica a intervalos de tempo de um minuto, permitindo o ensaio
de 176 preparações de amostras no período convencional de uma hora. São comercialmente
disponíveis preparações de reagente para esta técnica assim como equipamento,
aumentando a sensibilidade de 60 a 250 vezes com relação ao método da formação de gel.
O software automaticamente produz uma relação logarítmica entre o onset time de cada
padrão e a concentração de endotoxina correspondente (PINTO et al., 2000).
Também métodos distintos empregando LAL permitem a determinação de
endotoxinas, como por exemplo, a espectrometria de massa e radioimunoensaio. Com a
conscientização cada vez maior das indústrias farmacêuticas sobre as Boas Práticas de
Fabricação de produtos injetáveis, está se prevenindo a contaminação indevida do produto
por substâncias termogênicas. Evidentemente que dentro deste espírito consideram-se,
principal e diretamente, as fontes de contaminação microbiana. Por estas razões, diversos
estudos tentaram obter uma correlação entre pirogenicidade do produto terminado e o nível
49
de contaminação viável do produto no instante imediatamente anterior à esterilização,
porém com resultados conflitantes (PINTO et al., 2000).
Outro fator importante que deve ser levado em consideração, procurando evitar a
contaminação por pirogênio, é o tempo de manipulação e a fase de esterilização do produto,
a fim de evitar altas contagens de microrganismos viáveis, que irão acarretar concentrações
pirogênicas, em função da termoestabilidade da endotoxina. Logo, outra preocupação deve
estar voltada para a qualidade das matérias-primas, em particular aquela que esteja em
maior proporção, muitas vezes a água. Neste caso, referindo-se à água para injeções, é
muito mais fácil obtê-la apirogênica do que tentar a descontaminação do produto
(CRISTÁLIA, 2005).
Em vista dos fatos discutidos, o produtor de medicamentos deve estar atento aos
problemas que podem decorrer da qualidade inadequada dos mesmos, procurando por à
venda aqueles comprovadamente eficazes e seguros ao paciente. Por outro lado, grande foi
a evolução observada durante os últimos anos no âmbito bioanalitico, de forma a permitir
metodologia in vitro que, exceto em raras exceções, é aplicável inclusive a produtos
terminado (PINTO et al., 2000).
50
7. CONCLUSÃO
Pelo exposto pode-se observar que os problemas mais importantes do controle de
qualidade de medicamentos são a identificação, pureza, estabilidade, legitimidade,
dosagem, absorção e o aparecimento de novas substancias ativas. O controle de
medicamentos, não é, sem duvida alguma, um processo estacionário; evolui sempre, de
acordo com os problemas que vão surgindo.
A analise microbiológica de medicamentos é um fator fundamental dentro da
industria, pois com ela, os produtos comercializados estarão sempre isentos de
microrganismos patogênicos. Somente deverão ser liberados ao mercado, os
medicamentos que atendam aos limites máximos de microrganismos permitidos, sendo
estes não prejudiciais.
Segundo CORREIA (2003) a qualidade microbiana dos produtos farmacêuticos é
afetada não apenas pelos tipos e grandeza de microrganismos introduzidos durante a
fabricação, estocagem e uso, mas também depende da interação dos mesmos com a
formulação. Muitos fatores físico-químicos são fundamentais, assim como o sistema
conservante pode atuar minimizando os contaminantes a níveis não detectáveis durante a
estocagem do produto. Como os microrganismos apresentam absoluta exigência quanto à
presença de água, a atividade de água exerce efeito fundamental, embora também
formulas sólidas possam se deteriorar em decorrência de contaminantes.
Há bem pouco tempo, o controle de qualidade de medicamentos tinha a função de
avaliar a qualidade das matérias-primas e dos produtos terminados, como visto nos
estudos de SANTORO (1988). Atualmente, tem função mais ampla na industria, isto é,
orienta, discute, sugere e normaliza todos os problemas referentes à produção
farmacêutica. Dentre os objetivos do controle de qualidade está a obtenção de
medicamentos cada vez melhores, mais eficazes e seguros, menos tóxicos e mais estáveis.
Assim, deve-se ter sempre em mente que um controle da qualidade microbiológica
efetivo e atuante é extremamente necessário dentro de uma indústria, sempre priorizando
a prevenção. As análises e os métodos citados neste trabalho apenas exemplificam alguns
dos procedimentos analíticos de um controle de qualidade microbiológica de
51
medicamentos, sendo, portanto, de grande importância à utilização destes métodos
padronizados e sua realização feita por profissionais treinados e com experiência nesta
área.
52
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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perspectivas para o campo da saúde do trabalhador. Cadernos de Saúde Pública, n° 13.
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farmacêuticos. São Paulo: SCP, 1985.
SANTORO, M. I. R. M. Introdução ao controle de qualidade de medicamentos. São
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Fundação para o Remédio Popular, 1997.
USP - UNITED STATES PHARMACOPEIA, 23ª edição, 1995.
USP - UNITED STATES PHARMACOPEIA, 24ª edição, 2000.
56
9. ANEXO:
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Estágio Supervisionado - 2005
Curso de Ciências Biológicas Aluno: Daniela Cristina Cezaretto Entidade/Empresa/Instituição onde realizou os estágio: Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda Responsável/Orientador do estágio: Farm. José Carlos Stevanatto Filho Período (mm/aaaa): 04 a 07 de 2005 Tempo total do estágio (horas): 368 horas Relato das atividades desenvolvidas:
Durante o período do estágio acompanhei todas as etapas da fabricação de
medicamentos, desde a chegada da matéria prima, produção, acabamento e controle de
qualidade químico-físico e microbiológico.
A maior parte do tempo de estágio, fiquei no laboratório de microbiologia, onde
acompanhei todos os testes que são realizados neste setor. Os teste nos quais tive maior
contato foram os testes de análise microbiana de medicamentos não estéreis, medicamentos
estéreis e teste de pirogênio. Todos estes são descritos detalhadamente na minha
monografia.
Acompanhei também o tratamento e análise da água que é usada pela indústria, e os
testes que são realizados para a análise que são: pesquisa de patógenos e teste de coliformes
fecais.
Participei de auditorias internas, auto-inspeção e fiscalização da industria pela
ANVISA que é o órgão responsável pela aplicação correta das Boas Práticas de Fabricação.
