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Corre Zola

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  • INSTITUTO BIOLGICO

    PS-GRADUAO

    Frequncia de reaes sorolgicas para Mycoplasma gallisepticum em aves de postura de granjas comerciais localizadas no Estado de So Paulo.

    Luis de Macedo Correzola

    Dissertao apresentada ao Instituto Biolgico, da Agncia Paulista de Tecnologia dos Agronegcios, para obteno do ttulo de Mestre em Sanidade, Segurana Alimentar e Ambiental no Agronegcio. rea de Concentrao: Sanidade Animal, Segurana Alimentar e o Ambiente Orientadora: Profa. Dra. Claudia Del Fava Co-orientador: Dr. Marcos Roberto Buim

    So Paulo 2010

  • DADOS DE CATALOGAO NA PUBLICAO (CIP) Ncleo de Informao e Documentao - Biblioteca

    Instituto Biolgico Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de So Paulo

    Correzola, Lus de Macedo Freqncia de reaes sorolgicas para Mycoplasma gallisepticum em aves de postura de granjas comercias localizadas no Estado de So Paulo / Lus de Macedo Correzola. -- So Paulo, 2010. Dissertao (Mestrado) Instituto Biolgico (So Paulo). Programa de Ps-Graduao. rea de concentrao: Sanidade Animal, Segurana Alimentar e o Ambiente. Linha de pesquisa: Gesto Sanitria e Ambiental na produo animal. Orientador: Cludia Del Fava.

    Co-Orientador: Marcos Roberto Buim. Verso do ttulo para o ingls: Serologic response of commercial laying hens against Mycoplasma gallisepticum at So Paulo State. 1. Micoplasmose 2. Mycoplasma gallisepticum 3. Soroaglutinao rpida 4. Aves de postura comercial 5. ELISA (Tcnica imunolgica) I. Fava, Cludia Del II. Buim, Marcos Roberto III. Instituto Biolgico (So Paulo). Programa de Ps-Graduao IV. Ttulo

    IB/Bibl. /2010/011

  • FOLHA DE APROVAO

    Nome do candidato: Luis de Macedo Correzola

    Ttulo: Frequncia de reaes sorolgicas para Mycoplasma gallisepticum em aves de postura de granjas comerciais localizadas no Estado de So Paulo.

    Orientadora: Profa. Dra Claudia Del Fava Co-orientador: Dr. Marcos Roberto Buim

    Dissertao apresentada ao Instituto Biolgico da Agncia Paulista de Tecnologia dos Agronegcios para obteno do ttulo de Mestre em Sanidade, Segurana Alimentar e Ambiental no Agronegcio.

    rea de Concentrao: Sanidade Animal, Segurana Alimentar e o Ambiente

    Aprovada em: Banca Examinadora Assinatura:

    Profa. Dra.: CLAUDIA DEL FAVA

    Instituio: INSTITUTO BIOLGICO/SP

    Assinatura:

    Prof. Dr. FERNANDO GOMES BUCHALA

    Instituio: Coordenadoria de Defesa Agropecuria do Estado de So Paulo/SP

    Assinatura:

    Profa. Dra. SIMONE ALVES MENDES RIBEIRO

    Instituio: LANAGRO So Paulo/SP

    SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGCIOS

    INSTITUTO BIOLGICO Ps-Graduao

    Av. Cons. Rodrigues Alves 1252 CEP 04014-002 - So Paulo SP

    [email protected]

  • Dedicatria

    Dedico aos meus pais,

    Estevam e Syomara,

    na tentativa de agradecer por tudo o que me fizeram, e ainda o fazem,

    obrigado !

  • Agradecimentos

    A Dra Vera Lucia Nascimento Gonalves, pelo convvio dirio e pela generosidade

    em permitir a realizao deste trabalho. Muito obrigado!

    Ao Dr. Fernando Gomes Buchala, pelo incentivo e por reconhecer a importncia da

    realizao deste.

    A Dra Claudia Del Fava, por me acompanhar em todas as fases da realizao desta

    dissertao, com ensinamentos, orientao, entusiasmo, incentivo, e

    principalmente, apoio e amizade!

    Ao Dr. Ricardo S. Jordo, do Instituto Biolgico de So Paulo, pela confiana e

    apoio;

    Ao pessoal do Centro Avanado de Pesquisa Tecnolgica do Negcio Avcola, da

    Unidade de Pesquisa e Desenvolvimento do Instituto Biolgico, Bastos, em especial

    a Dra Nilce Soares, e ao Dr Marcos Buim, meu co-orientador, pela motivao, apoio

    e por permitirem a realizao da parte prtica neste conceituado laboratrio.

    Ao Sindicato Rural de Bastos e ao seus diretores, Shigeyuki Toyoshima e Yasuhiko

    Yamanaka, pela ajuda e suporte prestados;

    A empresa Biovet, pela doao dos antgenos para a realizao da prova de

    soroaglutinao rpida.

    A Associao Paulista de Avicultura, APA, aos Drs. Erico Pozzer e Jos Roberto

    Bottura, e a Ligia Okamura pelo incentivo e doao dos kits para a realizao da

    prova de Elisa.

  • Ao pessoal da APA /Coordenadoria de Defesa Agropecuria, em especial Dra.

    Snia Maria Martins Vitagliano, por toda ajuda e coleguismo e tambm ao Onzio

    Oliveira, Lcio Leite Filho, Kellen Trivelatto, Pedro Abreu e Souza, Daniela O. Souza

    e Fernanda Barbosa pelo incentivo e compreenso, e ao mdico veterinrio Vagner

    Watanabe, pela fundamental ajuda na colheita do material.

    Ao pessoal do Escritrio de Defesa Agropecuria de Tup, e ao seu diretor, Dr.

    Dorcelino Dezzan e, principalmente, ao Cristvo S. Altero, por todo apoio que

    recebi quando estive em Bastos e regio.

    A todos do Centro de Anlise e Diagnstico da Coordenadoria de Defesa

    Agropecuria, em especial Ldia Berling, Simone Campos, Leandro Ferreira,

    Marilza Silva Ramos e Lara B. Keid, pela ajuda, coleguismo e incentivo.

    A todos os amigos que fiz durante este curso, hoje Mestres, Marcio Macedo, Diogo

    Manzano, Talita Mikola, Priscilla Schoepps, Rana Rachid, Leandro Venditti e

    Marcelo Nishi, pelos bons momentos nas aulas compartilhadas.

    A Marianne Oliveira, por me acompanhar nesta jornada desde o inicio.

    A Aline Diniz Cabral e Mariana Vaz Rodrigues, minhas irms Del Fava, pelos

    divertidos momentos no Alojamento do Instituto Biolgico.

    A Ana Carolina Goes (Carol) e Mariana Piccolomini, pela amizade, risadas e por

    vocs serem muito bonitas.

    A Patrcia Mattiazzi, para deixar registrada a sua importncia neste e em minha vida.

    A Deus, por tudo!

  • vi

    RESUMO

    CORREZOLA, L. M. Frequncia de reaes sorolgicas para Mycoplasma gallisepticum

    em aves de postura de granjas comerciais localizadas no Estado de So Paulo. 2009.

    Dissertao (Mestrado em Sanidade Animal, Segurana Alimentar e o Ambiente)

    Instituto Biolgico.

    A micoplasmose aviria causa doena crnica respiratria, sendo considerada um dos

    principais problemas da avicultura mundial. As perdas econmicas so devidas a queda

    na produo e qualidade dos ovos, baixa eclodibilidade, alta taxa de pintos refugados,

    queda na eficincia alimentar, condenao de carcaas, alto custo com medicao

    (antibiticos), resistncia bacteriana e restries comerciais. Avaliou-se a freqncia de

    reaes sorolgicas para Mycoplasma gallisepticum em aves de postura comercial no

    Bolso de Bastos e municpio de Guatapar, importantes regies produtoras de ovos no

    Estado de So Paulo no perodo de junho e julho de 2009. Utilizou-se a prova de triagem

    soroaglutinao rpida (SAR) e o exame confirmatrio de ELISA. Os resultados da

    triagem pela SAR no total de amostras do Bolso de Bastos revelaram 88,2% (566/642)

    de reatividade, sendo para aves no vacinadas 85,5% (196/229) e vacinadas 89,5%

    (370/413). Os resultados confirmatrios pelo ELISA no Bolso de Bastos revelaram que a

    reatividade total foi 89,8% (577/642), para aves no vacinadas 97,40% (233/229) e aves

    vacinadas 85,7% (354/413) contra M. gallisepticum. No municpio de Guatapar, em todas

    as granjas amostradas as aves eram vacinadas contra M. gallisepticum e o ndice de aves

    reagentes SAR foi 76,5% (108/141) e ao ELISA 97,20% (137/141). No Bolso de

    Bastos, 84,30% (193/229) das aves no vacinadas apresentaram sororeatividade

    simultaneamente SAR e ao ELISA, porm no foram observados casos clnicos da

    infeco, podendo este elevado nvel de soroeatividade ser devido difuso de cepas

    vacinais vivas, que possuem baixa patogenicidade e imunizam as aves contra as cepas

    de campo. O grande percentual de aves imunizadas nas duas regies que foram

    reagentes simultaneamente SAR e ELISA 84,00% (465/554) ou reagentes somente ao

    ELISA 8,80% (49/554) e a ausncia de sinais clnicos indicam que houve pouca falha

    vacinal. Os elevados nveis de sororeatividade nas granjas do Bolso de Bastos e

    municpio de Guatapar, onde a avicultura comercial intensa indicam que o micoplasma

    est difundido nas granjas, sendo favorecido pelo manejo, onde todas as fases da criao

    so realizadas na mesma granja, pelo adensamento populacional e proximidade entre as

  • vii

    propriedades, onde as aves mais velhas apresentaram maior taxa de sororeatividade,

    sem sinais clnicos respiratrios. Somente por meio de estudo epidemiolgico utilizando

    isolamento do M. gallisepticum e realizando sua caracterizao e diferenciao molecular

    podero ser conhecidos os tipos de cepas que esto estimulando a resposta humoral das

    aves.

    Palavras-chave: micoplasmose; Mycoplasma gallisepticum; soroaglutinao rpida;

    ELISA, aves de postura comercial.

  • viii

    ABSTRACT

    CORREZOLA, L. M. Serologic response of commercial laying hens against Mycoplasma

    gallisepticum at So Paulo State. 2009. Dissertao (Mestrado em Sanidade Animal,

    Segurana Alimentar e o Ambiente) Instituto Biolgico.

    Avian mycoplamosis is considered one of the main problems of poultry worldwide, and it

    causes chronic respiratory illness. Economic losses are due to decrease in production and

    quality of eggs, low hatchability, high rates of culling day-old birds, decrease in feed

    efficiency, poultry carcasses condemnation, high cost with medication (antibiotics),

    bacterial resistance and commercial restrictions. It was valuated the seroreactivity of

    commercial laying hens for Mycoplasma gallisepticum at Bastos region and Guatapar

    city, two major egg producing areas at So Paulo State, Brazil, from June-July 2009.

    Seroagglutination test in plate (SAR) was used as screening test, and the ELISA as

    confirmatory test. The results by SAR in the total samples of Bastos region revealed

    88.2% (566/642) of serorectivity, being for non vaccinated laying hens 85.5% (196/229)

    and vaccinated 89.5% (370/413). The confirmatory results by ELISA test at Bastos region

    revealed a total seroreactivity 89.8% (577/642), being for non vaccinated laying hens

    97.40% (233/229) and vaccinated 85.7% (354/413). In Guatapar city, all the flocks were

    vaccinated against M. gallisepticum, and the rate of seropositivity by SAR was 76.5%

    (108/141) and by ELISA 97.20% (137/141). At Bastos region, 84.30% (193/229) non

    vaccinated hens were simultaneously reactive to SAR and ELISA, however there were no

    clinical cases of infection, and this high rate of seropositivity may be due to the diffusion of

    live vaccine strain, which have low patogenicity and immunize hens against wild strains.

    The high rate of vaccinated hens in both regions seroreactors simultaneously to SAR and

    ELISA 84.00% (465/554) or reactors only to ELISA, 8.80% (49/554), and the absence of

    clinical signs show that there was low vaccine failure. The high seroreactivity rates at

    Bastos region and Guatapar city, where the commercial poultry is intense, shows that M.

    gallisepticum is spread out in flocks, being favored by management, where all the stages

    of breeding are done at the same flock, the high population density and proximity of farms.

    The oldest hens present higher rates of seropositivity, without respiratory clinical signs.

    Only by molecular analysis it will be possible to characterize and differentiate the M.

    gallissepticum strains who are stimulating the immune response of the hens.

    Key word: mycoplasmosis; Mycoplasma gallisepticum; seroagglutination test in plate;

    ELISA test; commercial laying hens.

  • ix

    SUMRIO

    1. INTRODUO ......................................................................................................... 1

    2. REVISO DE LITERATURA ................................................................................... 4

    3 MATERIAL E MTODOS ........................................................................................ 14

    4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................... 17

    5 CONCLUSES ........................................................................................................ 34

    6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................ 35

  • x

    LISTAS DE TABELAS

    Tabela 1 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo teste de SAR no Bolso de Bastos/SP, segundo o municpio, granja, lote, idade das aves (semanas) e vacinao contra M. gallisepticum (So Paulo, 2009) ..............................................................................................................18

    Tabela 2 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum

    pelo teste de SAR no Bolso de Bastos/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009) .................................................................................................19

    Tabela 3 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum

    pelo teste de ELISA no Bolso de Bastos/SP, segundo o municpio, granja, lote, idade das aves (semanas), vacinao e valores estatsticos obtidos pelo software xCheck verso 3.3 Idexx (So Paulo, 2009).......................20

    Tabela 4 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum

    pelo teste de ELISA no Bolso de Bastos/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009) .................................................................................................21

    Tabela 5 Sororeatividade das aves no vacinadas, simultaneamente SAR e ELISA

    para o diagnstico de M. gallisepticum no Bolso de Bastos (So Paulo, 2009) ............................................................................................................22

    Tabela 6 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum

    pelo teste de SAR no municpio de Guatapar/SP segundo a granja, lote, idade das aves (semanas) e vacinao (So Paulo, 2009) .........................23

    Tabela 7 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum

    pelo teste de SAR no municpio de Guatapar/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009) ........................................................................................24

    Tabela 8 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum

    pelo teste de ELISA no municpio de Guatapar segundo a granja, lote, idade das aves (semanas), vacinao e valores estatsticos obtidos pelo software xCheck verso 3.3 Idexx (So Paulo, 2009)............................................25

    Tabela 9 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum

    pelo teste de ELISA no municpio de Guatapar/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009) ......................................................................................26

    Tabela 10 Sororeatividade das aves vacinadas, simultaneamente SAR e ELISA para o diagnstico de M. gallisepticum no Bolso de Bastos e Municpio de Guatapar (So Paulo, 2009) ......................................................................27

    Tabela 11 Clculo do qui-quadrado para a sororeatividade de aves vacinadas contra

    M. gallisepticum SAR segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos e Guatapar, SP (So Paulo, 2009) ...............................29

    Tabela 12 Clculo do qui-quadrado para a sororeatividade de aves vacinadas contra

  • xi

    M. gallisepticum ao ELISA segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos e Guatapar, SP (So Paulo, 2009) ................................30

    Tabela 13 Sororeatividade de aves no vacinadas contra M. gallisepticum SAR

    segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos, SP (So Paulo, 2009) .................................................................................................31

    Tabela 14 Sororeatividade de aves no vacinadas contra M. gallisepticum ao ELISA

    segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos, SP (So Paulo, 2009) .................................................................................................31

    Tabela 15 Comparao dos valores GMT de aves vacinadas obtidos na prova de

    ELISA para M. gallisepticum segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos, SP, segundo o teste de Tukey (So Paulo, 2009)..........32

  • xii

    LISTAS DE GRFICOS

    Grfico 01 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo teste de SAR no Bolso de Bastos/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009) ................................................................................................19

    Grfico 2 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum

    pelo teste de ELISA no Bolso de Bastos/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009) ..................................................................................................21

    Grfico 3 - Sororeatividade pelo teste de SAR em galinhas de postura comercial

    vacinadas contra o M. gallisepticum no municpio de Guatapar/SP (So Paulo, 2009) ................................................................................................24

    Grfico 4 - Sororeatividade pelo teste de ELISA em galinhas de postura comercial

    vacinadas contra o M. gallisepticum no municpio de Guatapar/SP (So Paulo, 2009) ................................................................................................26

  • xiii

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 01 - Localizao dos Municpios de Bastos e Guatapar, no Estado de So Paulo/SP (fonte: CEASP, 2009) ..................................................................14

    Figura 02 Conteno de ave para colheita de sangue por meio da puno da veia umeral ..........................................................................................................16

  • xiv

    ANEXOS

    Anexo I: Teste de Soroaglutinao Rpida em placa (SAR) (OIE, 2004).....................40

    Anexo II: Teste de ELISA...............................................................................................41

    Anexo III: Certificado Comit de tica em Experimentao Animal do Instituto

    Biolgico.........................................................................................................................43

  • xv

    ABREVIATURAS E SIGLAS

    AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

    APA Associao Paulista de Avicultura

    C Graus Celsius

    CDA-SP Coordenadoria de Defesa Agropecuria do Estado de So Paulo

    CETEA-IB Comit de tica em Experimentao Animal do Instituto Biolgico

    CV Coeficiente de variao

    DP Desvio padro

    DRC Doena Respiratria Crnica

    ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

    GMT Mdia geomtrica de ttulos

    HA Hemaglutinao

    HI Inibio da hemaglutinao

    IgG Imunoglobulina G

    IgM Imunoglobulina M

    km quilmetros quadrados

    Kpb 103 pares de bases

    mL mililitro

    nm nanmetro

    OIE Organizao Mundial de Sade Animal

    PCR Reao em Cadeia pela Polimerase

    PNSA Programa Nacional de Sanidade Avcola

    PPLO pleuro pneumonia-like organisms

    marca registrada

    SAR Reao de Soroaglutinao Rpida

    t tonelada

    UBA Unio Brasileira de Avicultura

    m micrmetro

  • 1

    1. INTRODUO

    Micoplasma a denominao trivial para os microorganismos da diviso Tenericutes e da

    ordem Mollicutes, que so caracterizados pela ausncia de parede celular, sendo o Mycoplasma

    gallisepticum (M. gallisepticum) um dos patgenos mais importantes na avicultura

    (TIMENETSKY, 2009).

    A micoplasmose aviria considerada um dos principais problemas da avicultura

    mundial, por causar doena crnica respiratria (DCR) e aerossaculite, e ser transmitida

    verticalmente pelo ovo. As perdas econmicas so devidas a queda na produo e qualidade

    dos ovos (NOORMOHAMMADI et al., 2002), baixa eclodibilidade, alta taxa de pintos refugados,

    queda na eficincia alimentar, condenao de carcaas, alto custo com medicao (antibiticos),

    resistncia bacteriana e restries comerciais (METTIFOGO; BUIM, 2009).

    Frequentemente perdas econmicas associadas infeco por M. gallisepticum so o

    resultado da interao do patgeno com outras bactrias, controle deficiente de sade e

    condies ambientais inadequadas (MUOZ et al., 2009).

    Aves doentes e portadoras so as modalidades mais importantes de fonte de infeco,

    sendo a eliminao do micoplasma atravs do ovo, com evidncias da presena do agente no

    oviduto das galinhas e smen dos galos, alm do contato direto e indireto (fmites), alimentos e

    gua contendo fezes e penas contaminadas, enquanto que na transmisso aergena esto

    envolvidos aerossis e gotculas (METTIFOGO; FERREIRA, 2007).

    Ao ser introduzido em um plantel o patgeno rapidamente disseminado para quase

    todas as aves, com diferentes graus de severidade e durao. Nos meses frios, a doena

    respiratria mais frequente e severa em aves jovens, enquanto que nas adultas est

    relacionada com queda da postura. O reservatrio natural do micoplasma so as membranas

    mucosas do trato respiratrio superior e genital de galinhas. Uma vez introduzido em uma

    granja, o micoplasma patognico de difcil eliminao, requerendo na maioria das vezes a

    eliminao de todas as aves para o sucesso da erradicao do agente. O tratamento com

    antibiticos caro e muitas vezes ineficaz, deixando resduos na carne e nos ovos e

    selecionando bactrias resistentes. Por este motivo a biosseguridade a principal forma de se

    evitar a entrada e disseminao deste patgeno nas granjas avcolas (METTIFOGO;

    FERREIRA, 2007).

    No Brasil, os estudos soroepidemiolgicos referem-se a monitoramento oficial de

    agncias de defesa sanitria em granjas de reprodutores (matrizeiro) para verificar a presena

    de anticorpos nessas aves, uma vez que a legislao brasileira exige que esta categoria de

  • 2

    plantis seja livre do M. gallisepticum (BRASIL, 1994). Existem algumas publicaes que

    avaliaram o risco que as aves de fundo de quintal representam para granjas de reprodutores,

    que so a base gentica de todo o plantel avcola brasileiro (BUCHALA et al., 2006; NUNES,

    2008). Embora esta enfermidade no seja controlada oficialmente nas granjas produtoras de

    ovos e frangos de corte, causa prejuzos econmicos: queda da postura e baixa converso

    alimentar e menor peso ao abate. Por este motivo, estudos soroepidemiolgicos para avaliar o

    grau de disseminao da micoplasmose nos plantis de aves so importantes para avaliar a

    disseminao e o impacto do M. gallisepticum na avicultura (DANELLI et al., 1999; MENDONA

    et al., 2003; RAUBER et al., 2004; SANTOS; MARN-GMEZ; PAULA, 2007; SIMAS et al.,

    2008).

    O mtodo sorolgico empregado como triagem do M. gallisepticum a Soroaglutinao

    Rpida (SAR), prova simples para monitorar o estado de sade de plantis avcolas, dotada de

    grande sensibilidade para deteco de anticorpos, porm requer especificidade para um

    diagnstico mais preciso de identificao do agente, sendo o teste confirmatrio a Inibio da

    Hemaglutinao (HI) (BRASIL, 1994) e o ELISA (MUOZ et al., 2009).

    Existem vacinas comerciais inativadas ou vivas para micoplasmas avirios As vacinas

    inativadas ou bacterinas so recomendadas por nunca apresentarem problemas de reverso

    de patogenicidade. A vacina viva recomendada para galinhas poedeiras comerciais para

    reduzir as perdas produtivas e prevenir a transmisso da infeco (NASCIMENTO, 2000).

    Tendo em vista a importncia econmica da doena e ao fato da avicultura ser um dos

    pilares do agronegcio brasileiro, ser fonte de protena barata (ovo e carne de frango), fixar o

    homem no campo e gerar empregos diretos e indiretos e as exigncias do mercado quanto aos

    produtos de origem animal sem resduos, torna-se necessria a obteno de plantis livres da

    doena e sem tratamento com antibitico, para obteno de um produto diferenciado e com livre

    aceitao no mercado, inclusive o internacional (APA, 2007).

    O Brasil ocupa o terceiro lugar na produo mundial de frangos, com 10.350.000

    toneladas de carne produzida, enquanto que o consumo per capita de ovos no Brasil cerca de

    140 ovos, bem abaixo da mdia japonesa, de 347 ovos e tambm da americana, em cerca de

    260 ovos/ano, o que indica um enorme potencial de crescimento deste segmento. A

    industrializao do ovo tambm um mercado que importante e praticamente desconhecido

    ainda do consumidor brasileiro, como o ovo vendido em p ou caixas tipo longa vida (APA,

    2007).

    Tendo em vista a representatividade econmica da avicultura de postura comercial em

    duas regies: Bolso de Bastos e municpio de Guatapar Estado de So Paulo, bem como a

  • 3

    escassez de dados relativos presena do M. gallisepticum nesta atividade, o presente trabalho

    teve como objetivos:

    Avaliar a ocorrncia de reaes sorolgicas para este patgeno utilizando dois

    testes diagnsticos, a SAR como prova de triagem e o ELISA confirmatrio.

    Estudar fatores que possam estar interferindo na resposta humoral das aves

    contra o M. gallisepticum, tais como vacinao, fase da produo e faixa etria.

  • 4

    2. REVISO DE LITERATURA

    Microorganismos do gnero Mycoplasma causam doenas em plantas, animais e no

    homem. Foram cultivados pela primeira vez em 1898 por Nocard e Roux, que isolaram pela

    primeira vez os microrganismos da pleuropneumonia bovina. Durante dcadas os micoplasmas

    foram isolados de animais e humanos, doentes ou no, tendo sido designados como pleuro

    pneumonia-like organisms (PPLO). Atualmente, os micoplasmas pertencem ordem dos

    Mollicutes por no apresentarem normalmente a parede celular e, portanto, evidenciam

    plasticidade em sua morfologia, dependendo de seu estgio fisiolgico (TIMENETSKY, 2009).

    Os micoplasmas so as menores bactrias conhecidas, assemelham-se em tamanho aos

    grandes vrus (cerca de 300 nm), so desprovidos de parede celular e por muito tempo vinham

    sendo considerados parasitos extracelulares exclusivos. Atualmente, admite-se a existncia de

    espcies com dimenses reduzidas que vo de 0,2 a 0,4 m de dimetro e um genoma de 580 a

    2,2 kpb, sendo que as espcies de micoplasmas avirios tm em torno de 1,1 kpb

    (METTIFOGO; FERREIRA, 2007).

    Segundo Danelli et al. (1999) e Buim (2007), os micoplasmas avirios possuem

    particularidades tais como:

    1 Colnias em forma de ovo-frito ou mamilar, que variam de 0,01 a 0,50 mm de dimetro,

    quando cultivados em meio slido;

    2 Crescimento para o interior do gar, iniciando na parte central da colnia;

    3 Filtrabilidade, em presena de filtros de 300-450 nm;

    4 Neutralizao em cultivo por anticorpos especficos, o que permite a sua identificao por

    soroneutralizao, cujo teste pode ser denominado de Inibio de Crescimento ou

    Inibio de Metabolismo;

    5 Incapacidade de reverso forma tpica de bactria com parede celular;

    6 Necessidade de lipdios, principalmente colesterol, para o crescimento.

    A ausncia de parede celular nos micoplasmas os torna naturalmente resistentes aos

    antibiticos que atuam impedindo a sntese da parede celular das bactrias, a exemplo das

    penicilinas (DANELLI et al., 1999; BUIM, 2007).

    As micoplasmoses avirias so enfermidades infecto-contagiosas de distribuio

    mundial, sendo que para os galinceos o agente etiolgico mais importante o M. gallisepticum,

    que est associado a doenas respiratrias crnicas e diminuio na produo de ovos

    (NASCIMENTO, 2000; KLEVEN, 1998), sendo considerada enfermidade de maior impacto

    econmico em todos os nveis da atividade avcola (METTIFOGO; BUIM, 2009).

    A micoplasmose aviria foi descrita pela primeira vez em 1905 na Inglaterra em perus,

  • 5

    sob a denominao de pneumoenterite epizotica. Na dcada seguinte recebeu a denominao

    de sinusite infecciosa dos perus e doena respiratria crnica (DRC) das galinhas, ambas

    causada por M. gallisepticum (METTIFOGO; FERREIRA, 2007).

    No Brasil, o primeiro diagnstico publicado foi no Estado de So Paulo, onde se verificou

    que a DRC ocupava o dcimo lugar entre as doenas diagnosticadas no Instituto Biolgico e

    observou-se no perodo de 1961 a 1967 sua prevalncia havia aumentado, chegando ao quinto

    lugar das doenas avirias diagnosticadas (NASCIMENTO, 2000).

    Os dados publicados sobre reaes sorolgicas ao M. gallisepticum no Brasil so

    referentes a aves de postura comercial, reprodutoras, aves de fundo de quintal (galinhas

    caipiras) e aves selvagens, mas so em pequena quantidade.

    Em poedeiras de postura comercial, Danelli et al. (1999), no Estado do Rio de Janeiro,

    realizaram em algumas granjas o teste de soroaglutinao rpida (SAR) para M. gallisepticum e

    encontraram 17% (11/64) aves sororeagentes no vacinadas. Mendona et al. (2003)

    observaram um grau significativo para a presena de M. gallisepticum em um plantel de galinhas

    poedeiras 41,7% de sororeatividade em diluio do soro igual ou superior a 1:10 na SAR.

    Rauber et al. (2004) relataram a ocorrncia de M. gallisepticum em trs granjas (A, B e C) no Rio

    Grande do Sul, utilizando o teste de SAR; nas amostras coletadas, foram sororeagente nas

    granjas A - 26% (7/27), B - 56,6% (34/60) e C - 18,1% (27/149). Santos, Marn-Gomez e Paula

    (2007) realizaram levantamento da frequncia em frangas de postura comercial no vacinadas

    em Minas Gerais e encontraram 2% (6/300) animais sororeagentes SAR. Simas et al. (2008)

    realizaram estudo sorolgico no municpio de So Jos do Vale do Rio Preto, Estado do Rio de

    Janeiro e encontraram 94% (47/50) poedeiras comerciais soroeagentes ao antgeno M.

    gallisepticum para SAR.

    Em galinhas de granjas reprodutoras, Cardoso et al. (2006) avaliaram sorologicamente

    952 lotes com idade entre seis e 65 semanas, de diversas regies do Brasil, durante os anos de

    2003 e 2004, tendo sido analisadas 139.096 amostras de soro para M. gallisepticum pela SAR,

    tendo sido todas negativas na diluio do soro 1:10. Orsi et al. (2004) realizaram estudo

    soroepidemiolgico do M. gallisepticum em plantis de aves reprodutoras de diversas regies do

    Brasil e no foram detectadas reaes sorolgicas positivas em 4212 aves pela prova de SAR.

    Em aves de fundo de quintal, Buchala et al. (2006) no Estado de So Paulo relataram a

    ocorrncia de M. gallisepticum em 30,3 % (123/406) das aves amostradas, sendo que 73%

    (11/15) dos criatrios avaliados apresentaram pelo menos uma ave sororeagente prova de

    SAR. Nunes (2008) determinou a sororeatividade de galinhas de dez propriedades no Municpio

    de So Jos do Egito, Estado de Pernambuco e 100% (124) das amostras de soro foram

  • 6

    reagentes SAR. Simas et al. (2008) realizaram estudo sorolgico no Estado do Rio de Janeiro,

    nos municpios de Carapebus, Quissam e Mag e encontraram 34% (13/38) galinhas caipiras

    sororeagentes para SAR.

    Em aves selvagens, Souza (2007) pesquisou em 82 indivduos a presena de anticorpo

    contra M. gallisepticum pela SAR e 2 (2,43%) foram positivas. As amostras foram posteriormente

    submetidas tcnica de HI e/ou PCR, sendo todas negativas. Apesar de aves selvagens

    representarem risco sanitrio avicultura industrial, a autora concluiu ser necessrio envolver

    um nmero maior de aves e locais para elucidar o real potencial de transmisso e portador das

    aves selvagens para o M. gallisepticum.

    A capacidade do M. gallisepticum causar doena influenciada por vrios fatores, dentre

    os quais virulncia da cepa envolvida, nmero de organismos presentes, via de infeco e por

    caractersticas inerentes ao hospedeiro, como espcie e idade. Os perus so mais suscetveis e,

    via de regra, a doena aparece de forma aguda e intensa nessa espcie do que nas galinhas.

    Com relao idade, os animais jovens so mais suscetveis que os adultos (BUIM, 2007).

    A morbidade em lotes de frangos em geral alta, considerando as caractersticas de

    transmissibilidade do M. gallisepticum (UBA, 2008). Por outro lado, a mortalidade, em geral,

    restringe-se a um ou 5% em poedeiras, podendo alcanar 30% em lotes de frangos ou de aves

    jovens suscetveis, principalmente se a infeco for causada por cepas de maior virulncia, ou

    se houver condies ambientais que favoream a exacerbao dos sinais clnicos (DANELLI et

    al., 1999; BUIM, 2007).

    De modo geral, os micoplasmas so organismos frgeis fora do hospedeiro e a sua

    sobrevivncia pode ser limitada a poucos dias ou horas, sob condies usuais das granjas. Em

    condies experimentais, o M. gallisepticum sobrevive entre dois a quatro dias nas penas das

    aves e trs dias no cabelo das pessoas. Em materiais orgnicos inertes como tecido, borracha,

    rao e cepilho, os micoplasmas podem permanecer viveis por at dois dias. Entretanto, se

    esses materiais estiverem protegidos por exsudatos ou em ambiente com temperatura baixa,

    possvel que esses organismos sobrevivam por perodos mais longos. Os desinfetantes

    qumicos comumente utilizados para a desinfeco de instalaes na granja ou nos incubatrios

    so efetivos contra o M. gallisepticum (amnia quaternria, compostos iodados, fenlicos, lcool)

    (NASCIMENTO, 2000).

    A transmisso de M. gallisepticum ocorre mais comumente na forma horizontal,

    diretamente de ave para ave, principalmente por meio de aerossis, ou indiretamente, por

    materiais ou substncias do meio ambiente. A transmisso tambm ocorre por meio de pssaros

    silvestres e de roedores. Alm da forma horizontal, verifica-se a transmisso vertical por meio de

  • 7

    ovos infectados (transmisso transovariana), perpetuando a infeco nos plantis, requerendo

    na maioria das vezes a depopulao do ambiente para o sucesso da erradicao do agente.

    Esse patgeno infecta o trato reprodutivo de matrizes, sendo detectado em ovidutos de galinhas

    e no smen de galos. Ao serem incubados, os ovos provenientes dessas aves iro gerar pintos

    infectados e, desse modo, a infeco por M. gallisepticum poder se disseminar potencialmente

    para vrios lotes em diferentes granjas (LEY; BERKHOFF; LEVISOHN, 1997).

    O perodo de incubao pode variar de seis a 21 dias em condies experimentais. Sob

    condies naturais difcil determinar o tempo exato de exposio (NASCIMENTO, 2000).

    As doenas classicamente conhecidas como DRC das galinhas e aerossaculite so

    causadas por M. gallisepticum. A DRC afeta o trato respiratrio superior das aves, as quais

    passam a emitir um estertor respiratrio, conhecido como ronqueira entre criadores e

    observada principalmente nas horas mais quentes do dia. Os sinais clnicos mais comuns so

    coriza, espirros, estertores midos e a respirao pelo bico aberto, em casos crnicos. Quando

    os sacos areos so tambm atingidos e apresentam depsitos de fibrina, mesmo pelo

    envolvimento de outros agentes, como vrus respiratrios e/ou Escherichia coli, tem-se usado a

    denominao de DRC Complicada (COELHO, 2006). Entretanto, as infeces inaparentes so

    as mais comuns e mais preocupantes, devido aos prejuzos que causam. As doenas causadas

    por micoplasmas podem ser agudas, mas elas so normalmente crnicas, sendo comum a

    infeco inaparente, somente evidenciada por teste diagnstico (METTIFOGO; BUIM, 2009).

    Macroscopicamente so encontradas inflamaes catarrais nas fossas e seios nasais,

    faringe, traquia e brnquios, exsudato caseoso ou fibrino-caseoso nos sacos areos; os sacos

    areos apresentam-se espessados, opacos e podem conter depsitos de fibrina, alm de reas

    de reao linfofoliculares em suas paredes. Nos casos em que h complicao com outros

    patgenos, como a Escherichia coli e viroses, as leses so mais graves e pode resultar em

    septicemias, com pericardite, peri-hepatite e doena do trato respiratrio, incluindo aerossaculite.

    Pneumonias e leses do oviduto (salpingite) tambm podem ser observadas (NASCIMENTO,

    2000; COELHO, 2006; METTIFOGO; FERREIRA, 2007; METTIFOGO; BUIM, 2009). Alm das

    complicaes respiratrias, o M. gallisepticum pode provocar leses no sistema articular. Nas

    salpingites associadas ao M. gallisepticum observa-se a presena de exsudato caseoso no

    oviduto (BUIM, 2007).

    Nas alteraes citopatolgicas por M. gallisepticum, no epitlio traqueal de galinhas,

    observa-se muco seguido de descamao do epitlio ciliado, alm de perda de clios

    (METTIFOGO; BUIM, 2009). Podem ser observados infiltrados de clulas mononucleares,

    hiperplasia das glndulas mucosas do trato respiratrio superior e as alteraes mais evidentes

    so as reaes linfo-foliculares (COELHO, 2006). No pulmo so observadas reas de

  • 8

    pneumonia intersticial, alteraes linfo-foliculares e granulomas, em menor freqncia Os sacos

    areos so os pontos mais afetados (NASCIMENTO, 2000; COELHO, 2006).

    Considerando-se as dificuldades em se isolar micoplasmas avirios, a prova de

    soroaglutinao rpida (SAR) usada como procedimento sorolgico de triagem para

    diagnosticar plantis de aves livres de micoplasmoses, por ser um teste de grande sensibilidade,

    rpido, pouco dispendioso e simples, mas que se caracteriza pela baixa especificidade devido ao

    aparecimento de falsos positivos, que devem ser confirmados pela inibio da hemaglutinao

    (HI) (CARDOSO et al., 2006; MENDONA et al., 2003; BRASIL, 1994; MENDONA et al., 2004;

    BUCHALA et al., 2006), porm, a ausncia do antgeno de HI no mercado faz com que muitos

    laboratrios adotem o ELISA como teste complementar (BUTCHER, 2009). A baixa

    especificidade da SAR tem contribudo para a falta de segurana no diagnstico das

    micoplasmoses, principalmente quando ela empregada isoladamente (MENDONA et al.,

    2003). Ahmad et al. (1988) relatam que as reaes falso positivas podem ser atribudas a

    presena de globulinas ou outro componente do soro no meio de crescimento usado na cultura

    de micoplasma para produo de antgeno para o teste SAR em placas, ou pode estar

    relacionado ao aumento do uso de vacinas inativadas (GLISSON; DAWE; KLEVEN, 1988).

    Butcher (2009) relata que falsos positivos tambm podem ser atribudos administrao de

    vacinas oleosas contra a doena de Gumboro e Coriza Aviria, soros turvos ou contaminados,

    soros congelados e depois descongelados e reaes cruzadas com outros micoplasmas.

    Existem ainda diferenas significativas na sensibilidade e na especificidade de antgenos

    (ROSALES, 1999) e deve-se considerar que h variabilidade entre as partidas dos antgenos e

    entre os procedimentos dos testes, alm de haver possibilidade de reao positiva em soros

    contaminados (METTIFOGO; BUIM, 2009).

    Conforme preconizado para SAR, se o soro proveniente de uma ave apresentar reao

    de formao de grumos (aglutininas) diluio igual ou superior a 1:10, o resultado

    considerado positivo; diluio de 1:5, deve ser considerado suspeito; e se a reao somente

    ocorrer em soro no diludo, o resultado deve ser considerado negativo. Entretanto, tem-se

    verificado na prtica que no h confiabilidade nos resultados negativos SAR e que qualquer

    aglutinao, mesmo em soro no diludo, deve ser considerada como resultado suspeito.

    Recentemente, foi comprovado que galinhas reprodutoras negativas SAR para M.

    gallisepticum, mesmo na ausncia de aglutinao em soros no diludos, estavam positivas no

    HI, isolamento e PCR. A SAR detecta principalmente anticorpos do tipo IgM, que aparecem de

    trs a cinco dias aps o inicio da infeco e que persistem por 70 a 80 dias (NASCIMENTO,

    2000). Enquanto o HI e o ELISA detectam IgG, a SAR pode detectar soroconverses dias antes

    dos outros testes, indicando infeces recentes, enquanto que altos ttulos no HI e ELISA

  • 9

    indicam infeces crnicas (BUTCHER, 2009). O HI e ELISA teste so usados como

    confirmatrio para dvidas na SAR. Eles so mais especficos e podem no detectar cepas

    heterlogas. Atualmente, o teste HI no tem sido muito utilizado devido ao fato de que o

    antgeno no disponvel comercialmente, por este motivo muitos laboratrios no usam mais o

    HI e sim o ELISA, porque se podem obter os kits padronizados no mercado (BUTCHER, 2009).

    O ELISA um diagnstico sensvel e especfico, muito utilizado em avicultura para

    monitorar populaes e deve ser realizado em lotes de aves de vrias idades. necessrio um

    plano de amostragem que permita a anlise dos dados para concluses apuradas no que diz

    respeito ao controle de sade do lote e defina estratgias relacionadas a programas de

    vacinaes, como a idade de aplicao, via e tipo de vacina utilizada (MUOZ et al., 2009).

    Em lotes que foram vacinados com duas vacinas inativadas, uma resposta imune pode

    ser detectada por ELISA no perodo de trs a quatro semanas depois da segunda aplicao.

    Esta resposta no deveria ser maior que grupos de ttulos de dois a quatro (2,0-4,0) e se os

    ttulos atingem um nvel maior, a correlao com infeco de campo precisa ser verificada.

    (MUOZ et al., 2009).

    O uso de vacina viva contra o M. gallisepticum acarreta, tipicamente, uma resposta imune

    fraca. A presena de ttulos de anticorpos elevados no ELISA indica que os grupos vacinados

    esto enfrentando um desafio de campo, sendo necessrio verificar a presena de sinais clnicos

    (BUTCHER, 2009; MUOZ et al., 2009).

    Aps a vacinao com a cepa ts-11, o ELISA o teste mais sensvel que a SAR para

    detectar anticorpos contra esta cepa vacinal (NOORMOHAMMADI et al., 2002).

    Para o isolamento, coletam-se fragmentos de tecidos lesados, exudato sinovial e ocular,

    alm de swabs da traquia, sacos areos, liquido sinovial, exudato dos seios nasais. Swabs

    da traquia ou da fenda palatina, imersos em cerca de 1,5 mL em meio lquido constituem

    excelentes espcimes, principalmente quando usados em cultivo e/ou PCR para auxiliar os

    testes de SAR e HI no monitoramento da infeco por M. gallisepticum (NASCIMENTO, 2000).

    O isolamento em meio especifico de Frey o mtodo mais seguro para o diagnstico. Em

    gar, as colnias de micoplasmas apresentam-se sob a forma tpica de ovo frito, com dimetro

    de 0,2 a 0,3mm (METTIFOGO; FERREIRA, 2007). Alguns micoplasmas so capazes de formar

    colnias em 24 horas e outros demoram at trs semanas. Geralmente, o cultivo obtido entre

    trs a 15 dias. Apesar de serem microrganismos facultativos, algumas espcies preferem a

    aerobiose e outras a microaerofilia para o primo-isolamento (NASCIMENTO, 2000;

    METTIFOGO; FERREIRA, 2007; METTIFOGO; BUIM, 2009). Os testes que confirmam a

    espcie isolada so a inibio de crescimento, imunofluorescncia direta ou indireta e a

    imunoperoxidase indireta (NASCIMENTO, 2000).

  • 10

    Wellehan et al. (2001) e Ikuta et al. (2001) demonstraram que a PCR para diagnstico do

    M. gallisepticum um mtodo mais efetivo quando comparado com a cultura, onde em 67% dos

    casos foi detectado M. gallisepticum pela PCR e apenas 33% foram positivos na cultura.

    Feberwee et al. (2005) compararam os testes de diagnsticos usando cultura, PCR e sorologias

    (SAR, ELISA, HI) e obtiveram resultados falso-positivos nos testes sorolgicos, recomendando a

    utilizao de vrias tcnicas diagnstica concomitantes.

    Nos ltimos anos, surgiram os mtodos de diagnstico biomoleculares como a

    hibridizao com sondas de DNA, a PCR e o Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de

    Restrio (RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism), uma variao da PCR que

    utiliza primers comuns a todos os micoplasmas avirios, para, a seguir, clivar o segmento

    amplificado com diferentes enzimas de restrio, obtendo assim padres definidos para cada

    espcie. Dentre as tcnicas, a PCR tem se mostrado atraente aos laboratrios por ser mais

    rpida, sensvel e especfica, atendendo demanda e s exigncias do Plano Nacional de

    Sanidade Avcola (PNSA) que j a considera um teste confirmatrio. Atualmente encontra-se

    disponvel na literatura a descrio de primers para deteco de trs espcies de micoplasma

    (M. gallisepticum; M. synoviae; M. meleagridis), que diferenciam cepas vacinais de cepas de

    campo (METTIFOGO; FERREIRA, 2007).

    Existem outras tcnicas utilizadas para a diferenciao de cepas de campo com a

    finalidade de estudos epidemiolgicos. A tcnica de DNA polimrfico (RAPD - Random

    Amplification of Polimorphic DNA) utiliza primers aleatrios para amplificar segmentos ao longo

    do DNA, enquanto que a tcnica de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado

    (AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphic) utiliza uma ou duas enzimas de restrio, alm

    de primers desenhados com seqncias que se ligam s enzimas e iro amplificar os segmentos

    clivados. Ambas as tcnicas geram padres que podem caracterizar uma cepa ou definir um

    marcador polimrfico (METTIFOGO; FERREIRA, 2007).

    Os micoplasmas so sensveis aos antimicrobianos que interferem na sntese dos

    aminocidos, cidos nuclicos e metabolismo dos lipdios. O tratamento realizado quando

    economicamente vivel e os antibiticos utilizados so os macroldeos (tilosina, espiramicina,

    quintamicina), gentamicina, tetraciclinas, tiamulina, tilmicosina (desmicosina), avilosin (3-acetil,

    4isovaleril tartataro) e as fluorquinolonas, tais como enrofloxacina e danofloxacina. O tratamento

    com antibiticos uma forma de controle da micoplasmose, mas a sua erradicao dificilmente

    ocorre. No caso de suspenso desses tratamentos, h uma reverso do quadro, pois somente a

    medicao no elimina as infeces por micoplasmas em uma granja (NASCIMENTO, 2000;

    COELHO, 2006; METTIFOGO; FERREIRA, 2007; METTIFOGO; BUIM, 2009).

    O tratamento de aves com antimicrobianos, apesar de diminuir o ndice de manifestao

  • 11

    clinica, e consequentemente, a taxa de transmisso transovariana a um nvel que pode chegar a

    ser inferior a 0,1%, no erradica os micoplasmas do plantel. Entretanto, um procedimento

    recomendado para poedeiras e frangos de corte, principalmente oriundos de plantis

    contaminados. A terapia com antimicrobianos, principalmente aqueles que se acumulam em

    altas concentraes nas membranas mucosas do trato respiratrio, como tiamulin e

    enrofloxacina, afetam o diagnstico etiolgico da micoplasmose aviria por inibir ou reduzir a

    resposta imune e por indisponibilizarem os micoplasmas do trato respiratrio superior, chegando

    em muitos casos a nveis zero de anticorpos e isolamento tanto em frango de corte quanto em

    aves de reproduo ou postura. Porm, h reverso desse quadro com a suspenso do

    tratamento. O declnio ou ausncia da reao sorolgica e da taxa de isolamento pode ser

    devido localizao intracelular do micoplasma, por presso antimicrobiana, onde no h

    reconhecimento do sistema imunolgico do hospedeiro, conforme preconizado (NASCIMENTO,

    2000).

    As medidas gerais de biosseguridade, adotadas em granjas comerciais ou reprodutoras

    so consideradas imprescindveis em qualquer esquema de controle e erradicao de uma

    doena infecciosa. Os tratamentos com antibiticos com metade ou um tero da dose podem ser

    considerados uma forma de preveno. Por outro lado, a vacinao realizada com o objetivo

    de reduzir os altos custos dos tratamentos com antibiticos, sejam eles curativos ou preventivos

    e, ao longo do tempo, minimizar as novas infeces (METTIFOGO; FERREIRA, 2007).

    Existem no mercado dois grupos de vacinas, as inativadas e as atenuadas. As vacinas

    inativadas so as mais seguras por no causarem a doena nas galinhas e em espcies mais

    suscetveis, como os perus e possibilitam a ao conjunta com antibioticos. No entanto,

    apresentam limitaes, como alto custo de produo, aplicao individual nas aves, baixa

    antigenicidade e persistncia de anticorpos vacinais (METTIFOGO; FERREIRA, 2007).

    Existem trs vacinas vivas contra o M. gallisepticum disponveis no mercado: as cepas

    Conn-F (M. gallisepticum-F), ts-11 e 6/85. A M. gallisepticum-F pode eventualmente reverter

    para a forma virulenta e induzir leses nos sacos areos de galinhas, em plantis de postura,

    confere bons nveis de proteo, deslocando as cepas de campo de M. gallisepticum ou

    diminuindo o nmero destas no trato respiratrio. A cepa ts-11 termossensvel, se multiplica

    bem no trato respiratrio superior, no causa leses nos pulmes e sacos areos, sendo capaz

    de induzir nveis bons de proteo. A cepa 6/85, quando aplicada por pulverizao, no coloniza

    a traquia de aves por um longo perodo, sua transmissibilidade baixa, alm de no interferir

    nos testes sorolgicos (METTIFOGO; BUIM, 2009).

    Somente o conjunto de medidas adotadas a mdio e longo prazo, tais como os descartes

    de lotes infectados, os tratamentos, vacinaes e normas de biosseguridade podero controlar

  • 12

    ou at erradicar a micoplasmose nos plantis (METTIFOGO; FERREIRA, 2007). Em virtude dos

    prejuzos decorrentes da convivncia com as infeces micoplsmicas, algumas estratgias de

    controle so sugeridas, como a aquisio de pintos de um dia, ou mesmo ovos frteis livres de

    M. gallisepticum para os sistemas de frango de engorda, postura e reproduo (matrizes e avs).

    Em se tratando dos estoques genticos, a condio de ave livre de micoplasma foi e continua

    sendo obtida por meio do tratamento dos ovos frteis com solues de antibitico por ovo-

    injeo e/ou ovo-imerso, ou por aquecimento (METTIFOGO; BUIM, 2009)

    De acordo com Ito et al. (2002) a principal e nica medida preventiva que pode ser

    adotada para evitar a introduo do M. gallisepticum em plantis de galinhas a adoo de

    medidas de biosseguridade. Entre elas, evitar o contato com outras espcies avirias (aves de

    vida livre, galinhas caipiras, lotes vacinados com M. gallisepticum vivo e trnsito de pessoas e

    equipamentos que possam representar meios de transporte do agente etiolgico. Conforme

    Mettifogo; Buim (2009), devido ao fato do M. gallisepticum ser transmitido verticalmente, a forma

    mais efetiva de controle e preveno a eliminao dos lotes positivos, efetuando a repopulao

    da granja com aves livres da doena.

    Dentre as principais falhas de biosseguridade, Nascimento (2000) destaca a

    multiplicidade de lotes de diferentes idades numa mesma granja, isto facilita o aparecimento de

    doenas intercorrentes e a disseminao de patgenos entre as aves do mesmo lote e entre os

    lotes. Tambm o manejo correto dos procedimentos de limpeza, desinfeco, vazio sanitrio e

    vacinao so primordiais para o adequado controle profiltico e assim reduzir a freqncia dos

    desafios e preparar o sistema imunolgico das aves para proteg-las de infeces.

    Em sistemas de produo de frango de corte, onde as aves de reposio so livres de

    micoplasma, resta ao criador a utilizao e o cumprimento das medidas de biossegurana

    preconizadas para a Avicultura e fazer uso da antibioticoterapia, caso surjam lotes com

    micoplasmose. O tratamento de frangos de corte com antibitico, quando economicamente

    vivel feito sob forma preventiva, isto , a administrao de antibitico realizada a partir dos

    primeiros dias de vida nas aves oriundas de matrizes ou avs infectadas com M. gallisepticum

    (NASCIMENTO, 2000).

    O Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA), em conformidade com o

    PNSA publicou a Instruo Normativa/SDA n 44, de 23 de agosto 2001 (BRASIL, 2001),

    estabelecendo as normas tcnicas para o controle e a certificao de ncleos e

    estabelecimentos avcolas para a micoplasmose aviria (M. gallisepticum; M. synoviae; M.

    meleagridis). Estas normas definem as medidas de monitoramento da micoplasmose em

    estabelecimentos avcolas de controles permanentes e eventuais exceto postura comercial,

    frango de corte e ratitas, que realizam o comrcio ou a transferncia nacional e internacional de

  • 13

    seus produtos, destinados reproduo e produo de aves e de ovos frteis, ficando os

    mesmos obrigados a realizarem o monitoramento de seus plantis, obedecendo s diretrizes do

    PNSA. Constatando-se positividade para M. gallisepticum ou M. synoviae em aves ou ovos

    frteis de linhas puras, bisavs e avs importadas ou nascidas no Brasil, devem ser procedidos

    o sacrifcio/abate do ncleo. No caso de matrizes, quando da positividade para M. gallisepticum

    em galinhas, deve ser realizado o sacrifcio/abate do ncleo.

    O PNSA prev que as aves reprodutoras (matrizes, avs e ncleos genticos) devem ser

    acompanhadas por monitorizao sorolgica e/ou micoplasmolgica para M. gallisepticum, M.

    synoviae e/ou M. meleagridis seguindo procedimentos epidemiolgicos de amostragem e

    periodicidade. Os testes diagnsticos utilizados no monitoramento oficial so SAR, HI e ELISA,

    alm de diagnstico microbiolgico que envolve isolamento e tipificao e/ou PCR. A

    periodicidade dos testes normalmente feita da seguinte forma: no 1 dia de vida, ou em ovos

    frteis para aves de reproduo e postura e em frangos de corte, onde se verifica a presena de

    anticorpo maternal (IgG) para M. gallisepticum , M. synoviae e/ou M. meleagridis, com a

    utilizao de teste imunolgicos (em soro ou gema) efetivos para IgG (HI e/ou ELISA), alm do

    cultivo de traquia e sacos areos de um nmero de 10 a 20 aves recm-nascidas ou cultivo de

    igual quantidade de ovos. Para aves reprodutoras, alm do diagnstico no 1 dia de vida,

    continua-se testando a intervalos no superiores a 90 dias. Adicionalmente, podem-se testar

    frangos de corte antes e durante o abate, e aves de postura comercial (BRASIL, 1994).

    Monitorizando-se as aves reprodutoras possvel detectar a infeco micoplsmica de

    forma precoce e tomar as devidas providncias antes que o problema se alastre e prejudique a

    comercializao de pintos de um dia (NASCIMENTO, 2000).

    Uma vez introduzido em uma granja, o micoplasma patognico de difcil eliminao,

    requerendo na maioria das vezes a depopulao do ambiente para o sucesso da erradicao do

    agente (METTIFOGO; BUIM, 2009).

    O diagnstico clnico diferencial deve investigar outros agentes que causam sinais

    respiratrios, dentre os quais o Haemophylus paragallinarum (coriza infecciosa), Pasteurella

    multocida, P. heamolytica, E. coli, Staphylococus spp., Stretpcoccus spp., Mycoplasma synoviae,

    doena de Newcastle, bronquite infecciosa, Influenza aviria, laringotraquete infecciosa e

    Aspergillus spp. (METTIFOGO; BUIM, 2009).

  • 14

    3. MATERIAL E MTODOS

    A colheita das amostras contou com a participao dos mdicos veterinrios da CDA e

    do convnio da Associao Paulista de Avicultura (APA). Todos trabalharam paramentados com

    equipamentos de proteo individual, como mscaras, luvas e macaco descartveis, que eram

    trocados a cada granja.

    Foram colhidas amostras de sangue de postura comercial de duas regies

    representativas do Estado de So Paulo: Bastos e Guatapar.

    Figura 01 - Localizao dos Municpios de Bastos e Guatapar, no Estado de So Paulo/SP

    (fonte: CDA, 2009)

    A regio de Bastos est localizada na regio Nova Alta Paulista, entre a latitude 2155'19"

    sul e longitude 5044'02" oeste, com altitude de 445 metros, possui rea de 170.454 km (Figura

    1) (CDA, 2009). Este municpio possui o maior plantel de galinhas de postura do pas e a maior

    produo de ovos do Brasil (CDA, 2009). Segundo a Associao Comercial e Industrial, 74% de

    sua economia gira em torno do comrcio de ovos, principal atividade local desde a dcada de

    1950. O Bolso de Bastos uma regio criada pela Resoluo SAA-27 de 30/09/2003 (SO

  • 15

    PAULO, 2003), que compreende outros 16 municpios alm de Bastos, dentre os quais Iacri,

    Osvaldo Cruz e Tup, que se caracterizam por terem na avicultura de postura sua maior fonte de

    renda. O bolso corresponde por 15% do plantel nacional de aves de postura, conta com 15

    milhes de aves e produz mais de 8,6 milhes de ovos por dia (SO PAULO, 2003). Utilizou-se

    o banco de dados do Sindicato Rural de Bastos/SP para a seleo das granjas, considerando-se

    como principal critrio a presena ou ausncia de vacinao contra micoplasmose.

    O municpio de Guatapar localiza-se na regio de Ribeiro Preto, nordeste do Estado de

    So Paulo, a uma latitude 2129'48" sul e a uma longitude 4802'16" oeste, possui uma rea de

    412.637 km (Figura 1) (CDA, 2009). A atividade principal a produo de ovos, em mdia 21

    mil dzias por dia e classifica-se como a 18. cidade brasileira em produo de ovos, segundo o

    Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica (IBGE, 2009). Utilizou-se o banco de dados da

    Cooperativa Agrcola Mombuca para selecionar as granjas neste municpio.

    Para o monitoramento sorolgico de doenas respiratrias, da CDA em Guatapar foram

    colhidas cerca de 160 amostras em 10 granjas. No Bolso de Bastos foram amostradas dez

    granjas, quatro lotes por granja, em mdia 16 aves por lote, identificando a idade das aves em

    semanas, caracterizando indivduos em incio, pico e fim de produo de ovos.

    A colheita do sangue foi realizada por puno da veia umeral, utilizando seringa

    descartvel de trs mL e agulha descartvel de 21 x 0,7mm tendo sido colhido cerca de trs mL

    de sangue de cada ave (Figura 2). Cada amostra foi identificada com o nmero do lote e nome

    da granja a qual pertencia. Estes procedimentos foram aprovados pelo Comit de tica em

    Experimentao Animal do Instituto Biolgico (CETEA-IB), registrado sob o nmero do protocolo

    CETEA 77/09, aprovado em 18 de maro de 2009 (ANEXO III).

    Figura 02 Conteno de ave para colheita de sangue por meio da puno da veia umeral.

  • 16

    Aps a coagulao do sangue e separao do soro do cogulo sanguneo foi realizado o

    teste de SAR. Uma alquota de cada soro foi armazenada individualmente em frascos do tipo

    Eppendorf e congelada em freezer -20C para a realizao da prova de ELISA.

    A metodologia utilizada para as provas de SAR e ELISA foram as preconizadas pelo

    MAPA (BRASIL, 1994) conforme anexo I. O antgeno de SAR utilizado foi o Myco-Galli Teste

    da empresa BIOVET, composto por uma suspenso inativada de M. gallisepticum cepa S-6.

    Todos os frascos eram pertencentes partida 869/08.

    O ELISA teste foi realizado utilizando kit de teste para deteco de anticorpos contra M.

    gallisepticum Flock Chek Idexx segundo fabricante (ANEXO II).

    O clculo do ponto de corte do ELISA para considerar amostras reagentes e no

    reagentes e o clculo da mdia geomtrica dos ttulos (GMT) e as demais variveis estatsticas:

    coeficiente de variao (CV), desvio padro (DP), valores mximos e mnimos foram realizados

    pelo software xCheck verso 3.3 da Idexx.

  • 17

    4. RESULTADOS E DISCUSSO

    A Tabela 1 apresenta a sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M.

    gallisepticum pelo teste de SAR, no Bolso de Bastos/SP. Constatou-se que na maioria das

    granjas vacinadas ou no havia elevada proporo de aves reagentes pela SAR 88,20%

    (566/642) (Tabela 1) e pelo ELISA 89,8% (577/642) (Tabela 3). Os lotes vacinados

    apresentaram 89,50% (370/413) de sororeatividade SAR (Tabela 2), enquanto que 97,40%

    (223/229) dos no vacinados foram reagentes ao ELISA (Tabela 4).

    importante avaliar ainda no Bolso de Bastos a resposta de cada ave considerando

    conjuntamente a SAR (triagem) e ELISA (confirmatria), pois a SAR detecta IgM e indica

    soroconverso, enquanto que o ELISA detecta IgG e infeco crnica (NASCIMENTO, 2000;

    BUTCHER, 2009). Na Tabela 5 observa-se que 84,30% (193/229) das aves no vacinadas

    apresentaram sororeatividade simultaneamente SAR e ao ELISA, indicando que a grande

    maioria dos animais estava em estgio agudo da infeco. Durante o perodo da colheita das

    amostras no foram identificadas aves com sinais clnicos de doenas respiratrias. A

    positividade e a presena de anticorpos no so, portanto indicativos de micoplasmose clnica,

    podendo ser indicativo de resposta vacinal nos lotes vacinados. Nos lotes no vacinados e

    positivos, uma hiptese a difuso de cepas vacinais dos lotes vacinados, devido ao fato das

    cepas vacinais F e ts-11 serem vivas, possurem baixa patogenicidade e colonizarem as vias

    areas superiores das aves, impedindo que as cepas patognicas de campo ocupem os

    receptores presentes no epitlio traqueal e venham assim causar a doena (METTIFOGO;

    BUIM, 2009). Na regio de Bastos e no municpio de Guatapar h uma grande concentrao de

    aves, as granjas so muito prximas e no existem barreiras fsicas que as separem. Outro fator

    que pode contribuir para a difuso das cepas vacinais nestas duas regies a criao de lotes

    de aves com idades mltiplas, sendo a fase de cria, recria e produo realizadas na mesma

    propriedade ou ento muito prximas, corroborando com Nascimento (2000), que descreve a

    multiplicidade de lotes de diferentes idades numa mesma granja como agente facilitador do

    aparecimento de doenas intercorrentes e a disseminao de patgenos entre as aves do

    mesmo lote e entre lotes. Outra hiptese para explicar a positividade dos lotes no vacinados

    que tenham se infectado com cepas de campo com baixa virulncia.

    Tabela 1 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo

  • 18

    teste de SAR no Bolso de Bastos/SP, segundo o municpio, granja, lote, idade das aves

    (semanas) e vacinao contra M. gallisepticum (So Paulo, 2009).

    Municpio Granja Lote Idade (semanas)

    Tipo e cepa vacinal

    reagente SAR

    % No reagente

    SAR %

    TOTAL amostras

    Bastos A 28 75 *Viva, F 12 75 04 25 16 32 54 Viva, F 12 75 04 25 16 42 57 Viva, F 14 87 02 12,50 16 48 82 Viva, F 16 100 0 0 16 B 41 57 Viva, F 16 100 0 0 16 35 23 No vacinado 0 0 16 100 16 24 61 Viva, F 16 100 0 0 16 12 27 No vacinado 03 18,75 13 81,25 16 C 07 57 **V ts-11 16 100 0 0 16 10 27 V ts-11 13 81,25 03 18,75 16 20 61 V ts-11 13 81,25 03 18,75 16 15 63 V ts-11 16 100 0 0 16 D 23 46 V ts-11 13 81,25 03 18,75 16 26 74 V ts-11 16 100 0 0 16 09 38 V ts-11 16 100 0 0 16 24 22 V ts-11 12 75 04 25 16 E 01 52 V ts-11 16 100 0 0 16 02 60 V ts-11 16 100 0 0 16 03 94 V ts-11 12 100 0 0 12 04 76 V ts-11 17 100 0 0 17 F 01 49 No vacinado 16 100 0 0 16 02 21,5 No vacinado 15 79 4 21 19 03 66 No vacinado 16 100 0 0 16 04 36 No vacinado 16 100 0 0 16 G 10 90 No vacinado 16 100 0 0 16 11 72 No vacinado 18 100 0 0 18 12 54 No vacinado 16 100 0 0 16 18 34 No vacinado 16 100 0 0 16

    Iacri H 01 40 Viva, F 16 100 0 0 16 02 84 Viva, F 08 50 08 50 16 03 28 Viva, F 16 100 0 0 16 04 32 Viva, F 12 75 04 25 16

    O. Cruz I 01 60 No vacinado 16 100 0 0 16 19 94 No vacinado 16 100 0 0 16 21 48 No vacinado 16 100 0 0 16 23 76 No vacinado 16 100 0 0 16

    Tup J 01 72 V ts-11 16 100 0 0 16 11 23 V ts-11 14 87,50 02 12,50 16 08 41 V ts-11 16 100 0 0 16 02 29 V ts-11 10 62,50 06 37,50 16

    TOTAL 566 88,20 76 11,80 642 * Viva F = vacina viva liofilizada cepa F

    ** V ts-11 = vacina viva liofilizada cepa ts-11

    Tabela 2 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo

  • 19

    teste de SAR no Bolso de Bastos/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009).

    SAR Vacinado

    % (subtotal)

    No vacinado

    % (subtotal)

    TOTAL

    Reagente 89,50 (370/413) 85,50 (196/229) 566

    No reagente 10,50 (43/413) 14,50 (33/229) 76

    TOTAL 413 229 642

    Grfico 01 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo

    teste de SAR no Bolso de Bastos/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009).

    0%

    10%

    20%

    30%

    40%

    50%

    60%

    70%

    80%

    90%

    100%

    10,5% 14,5%

    89,5% 85,5%

    No reagentes Reagentes

    Aves vacinadas Aves no vacinadas

  • 20

    Tabela 3 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo teste

    de ELISA no Bolso de Bastos/SP, segundo o municpio, granja, lote, idade das aves (semanas),

    vacinao e valores estatsticos obtidos pelo software xCheck verso 3.3 Idexx (So Paulo, 2009).

    Municpio Granja Lote Idade sem.

    Tipo e cepa vacinal

    POS % NEG % Total GMT DP CV

    % valorMin

    valorMx.

    Bastos A 28 75 *Viva, F 10 62,50 6 37,50 16 986 1684 87 1 5868

    32 54 Viva, F 9 56,25 7 43,75 16 1305 2455 118,1 375 10778

    42 57 Viva, F 16 100 0 0 16 4634 4085 65,1 594 16062

    48 82 Viva, F 16 100 0 0 16 8636 6374 60,8 1870 27355

    B 41 57 Viva, F 16 100 0 0 16 9561 2490 25,2 5427 15065

    35 23 No vac. 16 100 0 0 16 195 63 30,7 120 321

    24 61 Viva, F 16 100 0 0 16 9665 3659 34,3 1769 15834

    12 27 No vac. 15 93,75 1 6,25 16 189 487 25,2 1 2206

    C 07 57 **V ts-11 16 100 0 0 16 6217 3312 47,6 2233 14018

    10 27 V ts-11 13 81,25 3 18,75 16 2513 2033 60,4 324 7697

    20 61 V ts-11 15 93,75 1 6,25 16 3213 2643 67,1 714 11600

    15 63 V ts-11 16 100 0 0 16 8724 2348 25,8 3912 12517

    D 23 46 V ts-11 16 100 0 0 16 7685 2804 33,9 2149 13508

    26 74 V ts-11 16 100 0 0 16 5186 3372 53,8 1382 11663

    09 38 V ts-11 5 31,25 11 68,75 16 741 560 63 311 2537

    24 22 V ts-11 13 81,25 3 18,75 16 3146 2434 57,5 431 8515

    E 01 52 V ts-11 16 100 0 0 16 15682 6985 39,3 2617 31353

    02 60 V ts-11 16 1000 0 0 16 19359 3416 17,4 13419 24585

    03 94 V ts-11 7 58,33 5 41,67 12 2258 3073 81,2 512 9244

    04 76 V ts-11 16 94,12 1 5,88 17 9305 5535 34,7 1 24045

    F 01 49 No vac. 16 100 0 0 16 10033 5326 45,4 1519 20071

    02 21,5 No vac. 15 78,95 4 21,05 19 3482 4965 69,6 93 16391

    03 66 No vac. 16 100 0 0 16 9941 4963 41,9 648 20807

    04 36 No vac. 15 93,75 1 6,25 16 5864 3000 44 736 13812

    G 10 90 No vac. 16 100 0 0 16 13637 3147 22,4 7535 18443

    11 72 No vac. 18 100 0 0 18 10220 3227 30,2 5394 18627

    12 54 No vac. 16 100 0 0 16 13024 3918 28,9 7482 21756

    18 34 No vac. 16 100 0 0 16 7477 4715 50,3 425 18345

    Iacri H 01 40 Viva, F 16 100 0 0 16 5098 3011 52,3 2516 14485

    02 84 Viva, F 11 68,75 5 31,25 16 1639 872 47,3 707 3512

    03 28 Viva, F 11 68,75 5 31,25 16 1417 1362 69,3 101 4914

    04 32 Viva, F 11 68,75 5 31,25 16 1666 3097 92,3 215 11255

    O. Cruz I 01 60 No vac. 16 100 0 0 16 11821 7296 52,1 3832 24937

    19 94 No vac. 16 100 0 0 16 5843 4880 70 1750 23587

    21 48 No vac. 16 100 0 0 16 4519 2916 55,8 1953 12891

    23 76 No vac. 16 100 0 0 16 7361 3322 42 4221 17839

    Tup J 01 72 V ts-11 16 100 0 0 16 8792 4555 45 1192 22493

    11 23 V ts-11 12 75 4 25 16 2098 2909 80,3 93 9112

    08 41 V ts-11 16 100 0 0 16 9387 4903 46,2 3766 20729

    02 29 V ts-11 13 81,25 3 18,75 16 2361 1942 60,5 132 6895

    TOTAL 577 89,8 65 10,2 642

    *Viva F= vacina viva liofilizada cepa F

    ** V ts-11= vacina viva liofilizada cepa ts-11

  • 21

    Tabela 4 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo

    teste de ELISA no Bolso de Bastos/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009).

    ELISA Vacinado

    % (subtotal)

    No vacinado

    % (subtotal)

    TOTAL

    Reagente 85,70 (354/413) 97,40 (223/229) 577

    No reagente 14,30 (59/413) 2,60 (6/229) 65

    TOTAL 413 229 642

    14,30%

    85,70%

    2,60%

    97,40%

    0%

    10%

    20%

    30%

    40%

    50%

    60%

    70%

    80%

    90%

    100%

    No reagente Reagente

    Grfico 2 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo

    teste de ELISA no Bolso de Bastos/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009).

    Aves vacinadas Aves no vacinadas

  • 22

    Tabela 5 Sororeatividade das aves no vacinadas, simultaneamente SAR e ELISA para o

    diagnstico de M. gallisepticum no Bolso de Bastos (So Paulo, 2009).

    SAR no vacinadas

    ELISA Reagente

    % (subtotal/total)

    No reagente

    % (subtotal/total)

    TOTAL

    Reagente 84,30 (193/229) 0 193

    No reagente 1,70 (4/229) 14,00 (32/229) 36

    Total 197 32 229

    No municpio de Guatapar constatou-se que todas as granjas eram vacinadas e que

    havia elevada proporo de aves reagentes pela SAR 76,50% (108/141) (Tabelas 6 e 7) e pelo

    ELISA 97,20% (137/141) (Tabelas 8 e 9).

    Tabela 6 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo teste

    de SAR no municpio de Guatapar/SP segundo a granja, lote, idade das aves (semanas) e

    vacinao (So Paulo, 2009).

    Granja lote Idade

    (semanas) Tipo e cepa vacinal

    reagente SAR

    % No

    reagente SAR

    % TOTAL SAR

    A 07 58 *V ts-11 15 93,75 01 6,25 16

    B 12 50 V ts-11 13 81,25 03 18,75 16

    C 14 68 V ts-11 07 50 07 50 14

    D 25 35 V ts-11 11 84,62 02 15,38 13

    E 45 27 V ts-11 10 76,92 03 23,08 13

    F 04 60 V ts-11 07 50 07 50 14

    G 162 45 V ts-11 13 100 0 0 13

    H 15 47 V ts-11 09 64,29 05 35,71 14

    I 11 40 V ts-11 12 80 03 20 15

    J 5A 101 V ts-11 11 84,62 02 15,38 13

    TOTAL 108 76,50 33 23,50 141

    *V ts-11 = vacina viva liofilizada cepa ts-11

  • 23

    Tabela 7 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo

    teste de SAR no municpio de Guatapar/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009).

    SAR Vacinado

    % (subtotal)

    No vacinado

    % (subtotal) TOTAL

    Reagente

    76,50 (108/141) 0 108

    No reagente

    23,50 (33/141) 0 33

    TOTAL 141 0 141

    23,5%

    76,5%

    0%

    10%

    20%

    30%

    40%

    50%

    60%

    70%

    80%

    90%

    100%

    No reagentes Reagentes

    Grfico 3 - Sororeatividade pelo teste de SAR em galinhas de postura comercial vacinadas

    contra o M. gallisepticum no municpio de Guatapar/SP (So Paulo, 2009).

    Aves vacinadas

  • 24

    Tabela 8 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo

    teste de ELISA no municpio de Guatapar segundo a granja, lote, idade das aves (semanas),

    vacinao e valores estatsticos obtidos pelo software xCheck verso 3.3 Idexx (So Paulo,

    2009).

    *V ts-11 = vacina viva liofilizada cepa ts-11

    Granja lote Idade

    (semanas)

    Tipo e cepa vacinal

    POS % NEG % TOTAL

    GMT

    DP

    CV %

    Min.

    Mx.

    A 07 58 *V ts-11 16 100 0 0 16 6880 3166 41,6 3260 13595

    B 12 50 V ts-11 16 100 0 0 16 10660 4240 37,3 5405 23294

    C 14 68 V ts-11 14 100 0 0 14 6161 2443 36,4 2079 10395

    D 25 35 V ts-11 13 100 0 0 13 8413 3454 38,2 4688 16912

    E 45 27 V ts-11 13 100 0 0 13 7546 3609 43,3 3430 15901

    F 04 60 V ts-11 14 100 0 0 14 6630 4791 59,4 2119 17750

    G 162 45 V ts-11 13 100 0 0 13 15438 3496 22,1 11600 22270

    H 15 47 V ts-11 14 100 0 0 14 6184 2162 33,2 3316 11438

    I 11 40 V ts-11 12 80 3 20 15 3206 3391 68,7 188 10426

    J 5A 101 V ts-11 12 92,30 1 7,70 13 6395 3451 42,8 288 12856

    Total 137 97,20 4 2,80 141

  • 25

    Tabela 9 Sororeatividade de galinhas de postura comercial frente ao M. gallisepticum pelo

    teste de ELISA no municpio de Guatapar/SP, segundo a vacinao (So Paulo, 2009).

    ELISA Vacinado

    % (subtotal)

    No vacinado

    % (subtotal)

    TOTAL

    Reagente 97,20 (137/141) 0 137

    No reagente 2,80 (4/141) 0 4

    TOTAL 141 0 141

    0%

    10%

    20%

    30%

    40%

    50%

    60%

    70%

    80%

    90%

    100%

    2,80%

    97,20%

    No reagentes Reagentes

    Grfico 4 - Sororeatividade pelo teste de ELISA em galinhas de postura comercial vacinadas

    contra o M. gallisepticum no municpio de Guatapar/SP (So Paulo, 2009).

    Aves vacinadas

  • 26

    Considerando o elevado nmero de granjas que vacinam aves tanto no Bolso de Bastos

    quanto no municpio de Guatapar, avaliou-se a resposta das aves vacinadas considerando

    conjuntamente a SAR e ELISA (Tabela 10). Os dados indicam resposta humoral esperada em

    uma populao que submetida vacinao em massa com vacina viva atenuada, pelo grande

    percentual de aves imunizadas reagentes simultaneamente SAR e ELISA 84,00% (465/554)

    demonstrando que as aves possuem IgM e IgG, ou reagentes somente ao ELISA 8,80%

    (49/554), com anticorpos da classe IgG. Como no foram observados sinais clnicos respiratrios

    nas aves vacinadas, pode-se supor que houve difuso da cepa vacinal atenuada, que protegeu a

    populao contra a cepa de campo virulenta, ou infeco por cepa de campo de baixa virulncia,

    conforme exposto por Mettifogo e Buim (2008). Tambm se observou baixo percentual de aves

    vacinadas no reagentes simultaneamente ao ELISA e SAR 3,60% (20/554), o que indica que

    houve pouca falha vacinal (Tabela 10).

    Tabela 10 Sororeatividade das aves vacinadas, simultaneamente SAR e ELISA para o

    diagnstico de M. gallisepticum no Bolso de Bastos e Municpio de Guatapar (So Paulo,

    2009).

    SAR vacinadas

    ELISA Reagente

    % (subtotal/total geral)

    No reagente

    % (subtotal/total geral)

    Total

    Reagente 84,00 (465/554) 8,80 (49/554) 514

    No reagente 3,60 (20/554) 3,60 (20/554) 40

    Total 485 69 554

    Foi possvel observar nas granjas visitadas no Bolso de Bastos e municpio de

    Guatapar o grande adensamento populacional e a proximidade entre elas. O levantamento de

    banco de dados realizado no Sindicato Rural de Bastos e na Cooperativa de Guatapar, bem

    como durante a visitao das granjas para colheita de amostras mostrou que o controle da

    micoplasmose se d principalmente pela vacinao e no por medidas de biosseguridade, o

    que justifica a elevada sororeatividade total observada, que foi pela SAR 86,1% (674/783) e

    pelo ELISA 91,2% (714/783). Ito et al. (2002) reforam que a biosseguridade a principal e

    nica medida preventiva para evitar a introduo do M. gallisepticum em plantis de aves.

    No Bolso de Bastos, a maior parte das granjas amostradas utilizava vacinas vivas e a

    sororeatividade de cada lote vacinado variou de 50-100% na SAR (Tab. 6) e 31,25-100% no

    ELISA (Tabela 08). No municpio de Guatapar todas as granjas amostradas utilizavam vacinas

  • 27

    vivas e a sororeatividade de cada lote vacinado variou de 50-100% na SAR e 80-100% no

    ELISA. As aves vacinadas no sororeagentes podem estar apresentando falha vacinal ou baixa

    imunidade devido ao manejo complicado de sua aplicao (individual), baixa antigenicidade de

    algumas cepas que resulta resposta imunolgica que no protege contra a colonizao do trato

    respiratrio e o alto custo da vacina, que pode levar a uma no constante vacinao nos prazos

    devidos (METTIFOGO; BUIM, 2009). Inicialmente, a vacina inativada de M. gallisepticum induz

    uma acentuada resposta de anticorpos, porm o alto nvel desses anticorpos no se correlaciona

    com proteo efetiva e os anticorpos aglutinantes persistem aproximadamente por 12 semanas

    e interferem nos testes sorolgicos de rotina (GLISSON; DAWE; KLEVEN, 1988; METTIFOGO;

    BUIM, 2009). importante realizar a prova de ELISA para verificar o ttulo residual de anticorpos

    vacinais, bem como haverem falso-positivos na SAR e infeco crnica.

    A SAR uma prova com baixa especificidade, motivo pelo qual resultados falso-

    positivos podem ocorrer, o que tem contribudo para a falta de segurana no diagnstico das

    micoplasmoses, principalmente quando ela empregada isoladamente (CARDOSO et al.,

    2006; MENDONA et al., 2003; BRASIL, 1994; MENDONA et al., 2004; BUCHALA et al.,

    2006). As reaes falso-positivas tambm podem ser atribudas presena de globulinas ou

    outro componente do soro no meio de crescimento usado na cultura de micoplasma para

    produo de antgeno para o teste SAR (AHMAD et al., 1988). Apesar de existirem diferenas

    significativas na sensibilidade e na especificidade de antgenos de SAR (ROSALES, 1999) e

    variabilidade entre as partidas do mesmo fabricante e entre os laboratrios executores de

    diagnstico (METTIFOGO; BUIM, 2009) utilizou-se antgenos do mesmo fabricante e mesma

    partida para a SAR em todos os soros testados, o que diminuiu a possibilidade de resultados

    divergentes. Tambm foi excluda a possibilidade de haver reaes falso-positivas por soros

    contaminados (METTIFOGO; BUIM, 2009), porque foram utilizadas seringas e agulhas estreis

    para cada ave e a sorologia foi realizada to logo quando dessorado o sangue.

    Independente do sistema de produo de aves de postura comercial, a fase de

    produo de ovos possui a mesma durao, com incio na 17. e final na 72. semana (ALVES,

    2006; GARCIA, 2008). Para que pudesse ser avaliada uma provvel interferncia da fase da

    produo na sororeatividade dos lotes vacinados do Bolso de Bastos e municpio de

    Guatapar, subdividiu-se o perodo de postura em incio (17-35 semanas), meio (36 a 53

    semanas) e final, a partir da 54. semana. Houve efeito estatisticamente significativo da idade

    das aves vacinadas na sororeatividade ao M. gallisepticum, onde menos aves com idade > 54

    semanas possuem IgM (Tabela 11) e mais aves possuem IgG (Tabela 12), demonstrando

    cronicidade de infeco ou vacinao (METTIFOGO; BUIM, 2009).

  • 28

    Tabela 11 Clculo do qui-quadrado para a sororeatividade de aves vacinadas contra M.

    gallisepticum SAR segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos e

    Guatapar, SP (So Paulo, 2009).

    SAR vacinadas Fase de produo e faixa etria Reagente

    % (subtotal) No reagente % (subtotal)

    total

    Incio (17 a 35 semanas) 80,30 (98/122) 19,70 (24/122) 122

    Meio (36 a 53 semanas) 91 (111/122) 9 (11/122) 122

    Final > 54 (semanas) 69,70 (269/310) 30,30 (41/310) 310

    Total 86,3 (478/554) 13,7 (76/554) 554

    p = 0,0499 (alfa 5%) diferena estatisticamente significativa

    Tabela 12 Clculo do qui-quadrado para a sororeatividade de aves vacinadas contra M.

    gallisepticum ao ELISA segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos e

    Guatapar, SP (So Paulo, 2009).

    ELISA vacinadas Fase de produo e faixa etria Reagente

    % (subtotal) No reagente % (subtotal)

    total

    Incio (17 a 35 semanas) 81,15 (99/122) 18,85 (23/122) 122

    Meio (36 a 53 semanas) 89,85 (124/138) 10,15 (14/138) 138

    Final > 54 semanas 90,80 (267/294) 9,20 (27/294) 294

    Total 88,40 (490/554) 11,60 (64/554) 554

    p = 0,0162 (alfa 5%) diferena estatisticamente significativa

  • 29

    Houve efeito estatisticamente significativo da idade das aves no vacinadas na

    sororeatividade ao M. gallisepticum, onde mais aves com idade > 54 semanas possuem IgM

    (Tabela 13), demonstrando infeco recente, e tambm cronicidade de infeco pela IgG

    (Tabela 14), porm como no haviam aves com sinais clnicos respiratrios, pode-se supor que

    houve difuso de cepa vacinal ou de campo de baixa virulncia estimulando o sistema

    imunolgico (METTIFOGO; BUIM, 2009).

    Tabela 13 Clculo do qui-quadrado para a sororeatividade de aves no vacinadas contra M.

    gallisepticum SAR segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos, SP (So

    Paulo, 2009).

    SAR no vacinadas

    Fase de produo e faixa

    etria Reagente % (subtotal)

    No reagente % (subtotal)

    total

    Incio (17 a 35 semanas) 50,75 (34/67) 49,25 (33/67) 67

    Meio (36 a 53 semanas) 100,00 (48/48) 0 48

    Final > 54 semanas 100,00 (114/114) 0 114

    Total 85,50 (196/229) 14,50 (33/229) 229

    p < 0,0001 (alfa 5%) diferena estatisticamente significativa

    Tabela 14 Clculo do qui-quadrado para a sororeatividade de aves no vacinadas contra M.

    gallisepticum ao ELISA segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos, SP

    (So Paulo, 2009).

    ELISA no vacinadas

    Fase de produo e faixa etria Reagente

    % (subtotal) No reagente % (subtotal)

    total

    Incio (17 a 35 semanas) 92,50 (62/67) 7,50 (5/67) 67

    Meio (36 a 53 semanas) 97,90 (47/48) 2,10 (1/48) 48

    Final >54 semanas 100 (114/114) 0 114

    Total 97,40 (223/229) 2,60 (6/229) 229

    p < 0,0001 (alfa 5%) diferena estatisticamente significativa

  • 30

    Quanto mdia geomtrica dos ttulos (GMT) obtidos no ELISA para aves vacinadas,

    houve uma grande variao de valores dentro de um mesmo lote e granja no Bolso de Bastos

    (Tabela 3) e Guatapar (Tabela 8), com elevados valores dos desvios padro (DP), coeficientes

    de variao (CV) e valores mnimos e mximos. A aplicao do teste de Tukey a um nvel de

    significncia de 5% entre os valores da GMT do ELISA dos lotes de aves vacinadas no Bolso

    de Bastos e municpio de Guatapar no comprovou diferena estatstica das aves com relao

    sua fase de produo e faixa etria (p> 0,05) (Tabela 15). Considerando que aves de postura

    so vacinadas quando jovens, as reaes sorolgicas aps o uso de vacina viva no

    apresentam elevados ttulos frente ao ELISA, e a presena de ttulos elevados indica que est

    ocorrendo desafio de campo, porm como no foram observados sinais clnicos de DCR, pode-

    se levantar a hiptese de que esta resposta imunolgica humoral deve-se a infeco por cepa

    vacinal atenuada ou de campo de baixa virulncia (BUTCHER, 2009; MUOZ et al., 2009).

    Tabela 15 Comparao dos valores da GMT de aves vacinadas obtidos na prova de ELISA

    para M. gallisepticum segundo a fase de produo e faixa etria, no Bolso de Bastos e

    municpio de Guatapar, SP, segundo o teste de Tukey (So Paulo, 2009).

    Fase de produo e

    faixa etria

    No. de

    lotes

    Mdia das

    GMT

    Desvio padro

    Valor mnimo

    Valor mximo

    Intervalo de confiana 95%

    Valor p

    (alfa 5%)

    Incio (17 a 35 semanas)

    8 3645,0 2736,1 1417 8413 1357,2 a 5932,8 > 0,05

    Meio (36 a 53 semanas)

    8 7927,6 5394,6 741 15682 3416,9 a 12438 > 0,05

    Final >54 semanas

    20 6810,3 4218,7 986 19359 4835,9 a 8784,7 > 0,05

    Devido ao pequeno nmero de lotes de aves no vacinadas, no foi possvel aplicar

    teste estatstico pata avaliar se houve diferena estatstica entre a GMT dos lotes de diferentes

    granjas no Bolso de Bastos pelo teste de Tukey.

    A elevada freqncia de ocorrncia de sororeatividade das aves de postura comercial

  • 31

    para M. gallisepticum pela SAR vacinadas ou no, encontradas tanto no Bolso de Bastos -

    88,2% (566/642) quanto no municpio de Guatapar - 76,50% (108/141) se assemelha ao

    encontrado por Simas et al. (2008), no municpio de So Jos do Vale do Rio Preto, no Estado

    do Rio de Janeiro, que encontraram 94,0% (47/50) de sororeagentes SAR. Mendona et al.

    (2003) tambm observaram um grau significativo, 41,7% de sororeatividade SAR bem como

    Rauber et al. (2004), no Rio Grande do Sul, nas granjas A 26,00% (7/27), B 56,60% (34/60) e C

    18,10% (27/149) SAR. Por outro lado, alguns autores encontraram baixa freqncia de

    ocorrncia pela SAR em outras localidades, como Danelli et al. (1999), no Estado do Rio de

    Janeiro - 17,00% (11/64) das aves sororeagentes no vacinadas, e Santos, Marn-Gomez e

    Paula (2007) encontraram 2,00% (6/300).

    Pode-se comparar o nvel de disseminao das granjas de postura comercial no

    vacinadas com as aves de fundo de quintal. Buchala et al. (2006) no Estado de So Paulo

    relataram ocorrncia de 30,30 % (123/406) de aves sororeagentes ao SAR e 73,00% (11/15) dos

    criatrios apresentam pelo menos uma ave de fundo de quintal sororeagente ao SAR. Nunes

    (2008) verificou em dez propriedades no Municpio de So Jos do Egito, Estado de

    Pernambuco 100,00% (124) eram reagentes. Simas et al. (2008), nos municpios do Estado do

    Rio de Janeiro: Carapebus, Quissam e Mag encontraram 34,0% (13/38).

    Em regies onde a avicultura comercial intensa, como no Bolso de Bastos e

    Guatapar e a vacinao com cepa viva de baixa patogenicidade contra micoplasmose

    realizada, pode ocorrer grande difuso por aerossis do agente vacinal entre lotes e at entre

    granjas e acabar infectando as aves no vacinadas com cepa atenuada.

    Observa-se na tabela 1 que foram empregadas as cepas vacinais vivas ts-11 e F no

    Bolso de Bastos, enquanto que em Guatapar foi utilizada somente a cepa ts-11 (Tabela 6).

    Uma maneira de diferenciar a infeco causada por cepas de campo destas duas cepas

    vacinais realizar a multiplex PCR, que auxilia o diagnstico diferencial dos isolados e os

    estudos epidemiolgicos (METTIFOGO; BUIM, 2009).

  • 32

    5. CONCLUSES

    Os elevados nveis de sororeatividade na SAR e ELISA associados ausncia de sinais

    clnicos nas aves das granjas do Bolso de Bastos e municpio de Guatapar supem que pode

    estar ocorrendo infeco por cepas vacinais atenuadas ou de campo de baixa virulncia.

    Somente por meio de estudo epidemiolgico utilizando isolamento do M. gallisepticum e

    realizando sua caracterizao e diferenciao molecular podero ser conhecidos os tipos de

    cepas que esto estimulando a resposta humoral das aves.

  • 33

    6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

    AHMAD, I.; KLEVEN, S. H.; AVAKIAN, A. P.; GLISSON, J. R. Sensitivity and specificity of

    Mycoplasma gallisepticum agglutination antigens prepared from medium with liposomes

    substituting for serum. Avian Diseases, v. 32, n. 3, p. 519-526, 1988.

    ALVES, S. P. Uso da zootecnia de preciso na avaliao do bem estar bioclimtico de aves

    poedeiras em diferentes sistemas de criao. Piracicaba: 2006. 128p. [Tese (Doutorado em

    Agronomia). Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de So Paulo,

    Piracicaba, So Paulo].

    APA Associao Paulista de Avicultura. Pontos crticos no manejo de poedeiras. In: ANAIS

    DO CONGRESSO DE PRODUO, COMERCIALIZAO E CONSUMO DE OVOS, 5., 2007,

    Indaiatuba. Anais... Indaiatuba: APA, 2007.

    BRASIL. Programa Nacional de Sanidade Avcola. Atos legais. Portaria 193. Dirio Oficial da

    Repblica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia DF, 1