Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à hereditariedade… · 2018. 2. 16. · NAYARA IZABEL VIANA Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à

NAYARA IZABEL VIANA

Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à

hereditariedade, fatores hormonais e o câncer de próstata

São Paulo

2017

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para obtenção

do título de Doutora em Ciências

Programa de Urologia

Orientador: Prof. Dr. Alberto Azoubel Antunes

Coorientadora: Profª. Drª. Sabrina Thalita dos

Reis Faria

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

©reprodução autorizada pelo autor

Viana, Nayara Izabel Correlação entre polimorfismos genéticosrelacionados à hereditariedade, fatores hormonais eo câncer de próstata / Nayara Izabel Viana. -- SãoPaulo, 2017. Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina daUniversidade de São Paulo. Programa de Urologia. Orientador: Alberto Azoubel Antunes. Coorientador: Sabrina Thalita dos Reis Faria.

Descritores: 1.Neoplasias da próstata2.Hereditariedade 3.Polimorfismo de nucleotídeoúnico 4.Androgênios 5.Estrogênio 6.Prognóstico

USP/FM/DBD-413/17

Dedicatória

Aos meus pais Antônio e Rozilane, com

todo meu amor e gratidão, pelo amor

incondicional e por tudo que fazem

para a realização dos meus sonhos.

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a Deus e Nossa Senhora Aparecida, pela proteção e

pelas bênçãos que me concedem todos os dias.

Ao Prof. Dr. Alberto Azoubel Antunes, meu orientador, por ter me aceitado mais

uma vez como sua aluna, assim como no mestrado. Agradeço por toda ajuda na

realização deste trabalho, por todo empenho em sempre me ajudar durante

esses anos de pós-graduação e por contribuir para o meu crescimento.

À Profª. Drª. Sabrina T. Reis, minha coorientadora, minha amiga e minha irmã.

Agradeço por ter sido a primeira mão estendida para que eu pudesse trilhar esse

caminho e realizar tantos sonhos. Obrigada pela amizade que construímos, por

ter se tornado minha irmã e por me ajudar em tudo e em todos os momentos.

Obrigada por ser meu exemplo profissional e pessoal e por me ensinar muito

mais que você imagina.

À Profª. Drª. Katia Ramos Moreira Leite, pela oportunidade única de trabalhar ao

seu lado. Agradeço por todos os momentos de aprendizado e principalmente

pelo seu carinho em nos incentivar a fazermos mais e melhor do que nós

mesmos achamos que somos capazes.

Ao Prof. Dr. Miguel Srougi, por sempre incentivar e apoiar o trabalho realizado

no LIM55. Agradeço pela oportunidade de aprender lições reais de humildade e

amor ao próximo.

A todos os funcionários da Urologia, especialmente à secretária da pós-

graduação, Elisa Cruz, pela imensa ajuda durante todo o período de doutorado

e também às secretárias Inisabete, Tereza e Aparecida, sempre dispostas e

ajudar.

Ao Iran Amorim Silva, querido amigo do laboratório, sempre disposto a ajudar e

ensinar tudo que sabe. Agradeço pelo companheirismo, pela convivência

maravilhosa e pela ajuda em tudo que preciso. É uma honra trabalhar ao seu

lado.

À Vanessa Guimarães e ao Ruan Pimenta, meus amigos queridos, com quem

posso contar em todos os momentos. Agradeço por vocês serem tão especiais,

companheiros e por sermos tão unidos. Vocês são verdadeiros presentes de

Deus na minha vida.

Aos meus amigos Me. Denis Reis Morais e Dr. Caio Moura, por serem meus

companheiros desde o início do mestrado, pelo apoio e pela ajuda durante todo

o caminho.

Aos meus queridos companheiros do LIM55: Dr. Nelson Dip, Drª. Isis Paloppi,

Dr. José Pontes Junior, Dr. Renato Fidelis, Dr. Rubens Park, Dr. Alexandre

Iscaife, Me. Juliana Camargo, Dr. Saulo Recuero. Agradeço pela amizade, pela

ajuda e por fazerem do nosso laboratório um lugar tão iluminado e especial.

À toda equipe do consultório do Prof. Miguel que se empenhou para auxiliar na

coleta das amostras dos pacientes: Prof. Dr. Alberto Antunes, Prof. Dr. Carlo

Passerotti, Dr. Adriano Nesrallah e à enfermeira Mary Elen Salles. Ao Dr. Erico

Diógenes, Dr. Renato Oyama e Daniela Janolli, também pela ajuda na coleta das

amostras.

Aos pacientes que aceitaram participar deste trabalho e gentilmente cederem

uma amostra de sangue.

Aos meus queridos pais, Antônio Viana e Rozilane Viana, agradeço por serem

tão maravilhosos e especiais. Agradeço pelo amor incondicional que nos une,

por serem meu porto seguro, por tudo que me ensinaram e ensinam, e por não

medirem esforços pela minha felicidade. Deus não poderia ter sido mais

generoso ao me abençoar como filha de vocês. Amo muito vocês.

Ao meu marido Carlos Eduardo Moura, meu grande amor e companheiro de

todos os momentos. Agradeço por incentivar todos os meus sonhos com tanta

generosidade e dedicação. Agradeço pelo amor e carinho em todos esses anos,

pela paciência, compreensão e por se empenhar pela nossa felicidade. Te amo

muito.

Ao meu querido avô José Malta de Oliveira, que torce e se alegra pelas minhas

conquistas. Aos meus avós que já não estão mais entre nós, José Afonso Viana,

Izabel Delfina Viana e Ceci Aparecida. Agradeço por todo amor que me

dedicaram e por tudo que fizeram por mim.

Aos meus tios, Paulo, João Pedro, Antônio e Roberval e às minhas tias Vera,

Maria José, Rosângela, Silvania e Luciana, por todo amor, carinho e orações.

Vocês são pessoas muito especiais na minha vida, com as quais sei que posso

contar em todos os momentos.

Aos meus primos e primas, Paula, Marcos, Otávio e Carolyna, por serem meus

irmãos de coração e pelo amor que nos une. À nossa pequena Isabella, minha

sobrinha de coração, uma princesinha que Deus nos enviou para trazer mais

amor para nossa família. Vocês são muito especiais e eu os amo muito.

Às minhas amadas amigas, Valéria, Luz Maria, Nyara, Tatiane, Karen, Taíla e

Nayara, pelo incentivo, pela torcida e pelo carinho de se fazerem sempre

presentes, apesar da distância. Vocês são essenciais na minha vida.

Ao meu afilhado Lucas Reis Faria, que amei desde o momento em que soube

da sua existência. Agradeço por você ser essa criança tão especial, que trouxe

tanto amor para nossa vida. Amo você, meu pequeno príncipe.

Ao amigo Leandro Faria, por toda ajuda durante todos esses anos. Agradeço por

termos você e a Sabrina como nossa família e por compartilharmos tantos

momentos juntos. À pequena Laura, que mesmo antes de nascer já preenche

nossa vida com mais amor e alegria. Ao Sr. Geraldo e Neuza Reis pelo carinho

de sempre comigo e com minha família.

Aos meus primos Maria da Anunciação e Irineu Bagnariolli, pela ajuda e carinho

que sempre têm conosco.

À FAPESP, pelo apoio concedido para realização deste trabalho (2012/19258-

5).

Esta dissertação ou tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação:

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver).

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.

Sumário

Lista de abreviaturas

Lista de tabelas

Lista de figuras

Resumo

Summary

1. INTRODUÇÃO............................................................................... 1

1.1 Câncer de próstata........................................................................ 2

1.2 Patogênese do Câncer de Próstata............................................... 6

1.2.1 Fatores hereditários....................................................................... 6

1.2.2 Fatores hormonais......................................................................... 11

1.2.3 Fatores de transcrição................................................................... 14

1.3 Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs)................................ 15

1.4 Justificativa.................................................................................... 18

2. OBJETIVOS................................................................................... 19

3. MÉTODOS..................................................................................... 21

3.1 Pacientes....................................................................................... 22

3.2 Polimorfismos................................................................................ 24

3.3 Extração de DNA........................................................................... 25

3.4 Análise dos genótipos.................................................................... 26

3.5 Análise estatística.......................................................................... 28

4. RESULTADOS............................................................................... 30

5. DISCUSSÃO.................................................................................. 45

6. CONCLUSÕES.............................................................................. 60

7. ANEXOS........................................................................................ 62

8. REFERÊNCIAS.............................................................................. 64

Apêndice

Lista de abreviaturas

µl – microlitro

A – Adenina

AJCC – American Joint Committee on Cancer

AR – Androgen Receptor

BRCA1 – Breast Cancer 1

BRCA2 – Breast Cancer 2

C – Citosina

CaP – Câncer de Próstata

DHT - Di-hidrotestosterona

DNA - Deoxyribonucleic Acid

ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

EN2 – Engrailed-2

ER – Estrogen Receptor

ESR2 – Estrogen Receptor 2

G – Guanina

GWAS – Genome Wide Associate Study

HCFMUSP – Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

HNF1 - Hepatocyte Nuclear Factor 1

HOXB13 – Homeobox B13

HPC1 – Hereditary Prostate Cancer 1



HPCX – Hereditary Prostate Cancer on the X

INCA – Instituto Nacional do Câncer

JAZF1 – JAZ Zinc Finger 1

KLK - Kallikrein

LIM55 – Laboratório de Investigação Médica 55

MAF – Minor Allele Frequency

MSMB - Beta-Microseminoprotein

MSR1 - Macrophage Scavenger Receptor 1

NR2C2 - Nuclear Receptor Subfamily 2 Group C Member 2

ºC – graus Celsius

OR – Odds Ratio

PCAP – Prostate Cancer Project

PCR – Polymerase Chain Reaction

PSA – Antígeno Prostático Específico

pTEN - Phosphatase and Tensin Homolog

RNaSEL – Ribonuclease L

RR – Risco Relativo

SLC22A3 - Solute Carrier Family 22 Member 3

SNP – Single Nucleotide Polymorphism

SPSS - Statistical Package for the Social Sciences

T – Timina

TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TR – Toque Retal

UTR - Untranslated Region

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Relação entre acometimento de familiares e risco de

CaP.................................................................................... 7

Tabela 2 - Características clínico-patológicas dos pacientes com

CaP e dos indivíduos do grupo controle.............................. 23

Tabela 3 - Características clínico-patológicas dos pacientes com

CaP esporádico e familiar................................................... 23

Tabela 4 - Polimorfismos selecionados para análise........................... 25

Tabela 5 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos nos

pacientes diagnosticados com CaP e nos indivíduos do

grupo controle.................................................................... 32

Tabela 6 - Distribuição dos alelos dos 13 polimorfismos entre

pacientes com CaP e grupo controle.................................. 34

Tabela 7 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos nos

pacientes disgnosticados com CaP com histórico familiar

e esporádico....................................................................... 35

Tabela 8 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em

relação ao nível de PSA pré-operatório.............................. 37


relação ao escore de Gleason na peça............................... 39


relação ao escore de Gleason na peça (3 parâmetros) ...... 41


relação à recidiva bioquímica............................................. 43

Lista de Figuras

Figura 1 - Esquematização da nova graduação proposta pela ISUP

para o CP e as curvas de sobrevida livre de recidiva de

acordo com a nova graduação.............................................. 5

Figura 2 - Sistema TaqMan®. Identificação da base com uso de

sondas marcadas com fluoróforos......................................... 28

Resumo

Viana NI. Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à hereditariedade, fatores hormonais e o câncer de próstata [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017.

INTRODUÇÃO: O Câncer de Próstata (CaP) é a sexta neoplasia mais comum

no mundo correspondendo a aproximadamente 10% do total de cânceres. No

Brasil, o CaP é a neoplasia maligna não cutânea mais comum entre os homens.

A hereditariedade é um dos principais fatores de risco do CaP, que se caracteriza

pela herança de mutações em genes de susceptibilidade de alta penetrância que

quando transmitidos aos descendentes aumentam o risco de desenvolvimento

de tumores. Os andrógenos e estrógenos influenciam o desenvolvimento,

maturação e manutenção da próstata, afetando a proliferação e a diferenciação.

Isso tem despertado grande interesse no papel desses hormônios esteroides no

desenvolvimento e manutenção tanto da próstata normal quanto maligna. Os

Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs) são variantes de risco genéticos

associados com uma série de doenças, incluindo o câncer. Considerando que a

história familiar e que os componentes hormonais constituem fatores de risco

para o desenvolvimento do CaP, acredita-se que a identificação de

polimorfismos envolvidos nesses processos possa ter um papel relevante para

auxiliar no desenvolvimento de ferramentas alternativas para a detecção precoce

e para a definição do prognóstico desta neoplasia. OBJETIVOS: Analisar

polimorfismos (SNPs) relacionados com histórico familiar e com fatores

hormonais em amostras de sangue de pacientes com CaP e em homens

saudáveis. Além disso, correlacionar os resultados da genotipagem com

parâmetros clínico-patológicos. MÉTODOS: O estudo foi composto por 185

pacientes diagnosticados com CaP, sendo 97 casos esporádicos e 72 com

histórico familiar (dois parentes de primeiro grau). O grupo controle foi composto

por 70 amostras de sangue de indivíduos saudáveis, que comprovadamente não

possuíam CaP e fazem acompanhamento com intuito preventivo. Foram

selecionados 13 polimorfismos para análise: rs10486567, rs10993994,

rs9364554, rs5945572, rs2735839, rs4430796, rs7501939, rs138213197,

rs1271572, rs2987983, rs8072254, rs4919743 e rs3808330. A genotipagem foi

realizada através da técnica de PCR em tempo real (qPCR) e correlacionada

com o histórico familiar de CaP, PSA pré-operatório, graduação histológica de

Gleason e estadiamento patológico. RESULTADOS: Analisamos a frequência

dos polimorfismos selecionados e encontramos as seguintes correlações em

nossos casos: os SNPs rs10486567 e rs9364554 aumentam a chance de

desenvolvimento do CaP enquanto que o SNP rs8072254 diminui o risco. Com

relação à hereditariedade, o SNP rs1271571 apresentou associação com o CaP

esporádico. Na comparação com os fatores prognósticos encontramos que o

SNP rs3808330 foi mais frequente em indivíduos que possuíam PSA <10; o SNP

rs7501939 foi mais frequente em indivíduos com menor escore de Gleason e

ausência de recidiva e o SNP rs5945572 foi mais frequente em indivíduos com

menor escore de Gleason na peça. CONCLUSÕES: De uma forma geral

encontramos polimorfismos que parecem ter um papel relevante no

desenvolvimento do CaP, na transmissão familiar e a fatores prognósticos. Estes

importantes polimorfismos, ainda não haviam sido estudados na população

brasileira e nosso trabalho identificou correlações ainda não demonstradas na

literatura.

Descritores: neoplasias da próstata; hereditariedade; polimorfismo de

nucleotídeo único; androgênios; estrogênio; prognóstico.

Summary

Viana NI. Correlation between genetic polymorphisms related to heredity, hormonal factors and prostate cancer [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”, 2017.

BACKGROUND: Prostate Cancer (PCa) is the sixth most common cancer

worldwide accounting for around 10% of all cancers. In Brazil, the PCa is the

most common non-skin malignancy among men. Heredity is one of the main risk

factors for PCa, which is characterized by mutations of heritage in high-

penetrance susceptibility genes that when transmitted to offspring increase the

risk of tumor development. Androgens and estrogens influence the development,

maturation and maintenance of the prostate, affect proliferation and

differentiation. This has aroused great interest in the role of these steroid

hormones in the development and maintenance of both normal and malignant

prostate. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) are variants of genetic risk

associated with a number of diseases including cancer. Considering that the

family history and hormonal components are risk factors for the development of

PCa, we believe that the identification of polymorphisms involved in these

processes may have an important role to assist in the development of alternative

tools for early detection and to define the prognosis of this cancer. OBJECTIVES:

To analyze polymorphisms (SNPs) associated with family history and hormonal

factors in patient blood samples with PCa and in healthy men. In addition, to

correlate the results of genotyping with clinical-pathological parameters.

METHODS: The study consisted of 185 patients diagnosed with PCa, divided into

97 sporadic cases and 72 with a family history. The control group consisted of 70

blood samples from healthy individuals who had no proven PCa and do it for

preventive purposes. We selected 13 polymorphisms for analysis: rs10486567,

rs10993994, rs9364554, rs5945572, rs2735839, rs4430796, rs7501939,

rs138213197, rs1271572, rs2987983, rs8072254, rs4919743 and rs3808330.

Genotyping was performed by PCR in real time (qRT -PCR) and correlated with

family history of PCa, preoperative PSA, Gleason histologic grading and

pathological staging. RESULTS: We analyzed the frequency of the selected

polymorphisms and found the following correlations in our cases: SNPs

rs10486567 and rs9364554 increase the chance of developing PCa while the

SNP rs8072254 decreases the risk. Regarding heredity, the SNP rs1271571

presented association with sporadic PCa. In comparison with the prognostic

factors we found that the SNP rs3808330 was more frequent in patients who had

PSA <10; SNP rs7501939 was more frequent in patients with lower Gleason

score and no recurrence and the SNP rs5945572 was more frequent in subjects

with lower Gleason score on the surgical specimen. CONCLUSIONS: In general

we found that polymorphisms that appear to have a relevant role in the

development of PCa in family transmission and in prognostic factors. These

important polymorphisms had not yet been studied in the Brazilian population and

our work has identified correlations yet not demonstrated in the literature.

Descriptors: prostatic neoplasms; heredity; single nucleotide polymorphism;

androgens; estrogens; prognosis.

1

1. INTRODUÇÃO

2

1.1 Câncer de Próstata

O Câncer de Próstata (CaP) é a sexta neoplasia mais comum no mundo

correspondendo a cerca de 10% do total de cânceres. A neoplasia representa

um importante problema de saúde devido à sua alta prevalência, custos

associados e mortalidade. No Brasil, o CaP é a neoplasia maligna não cutânea

mais comum entre os homens. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer

(INCA) para 2016 são estimados 61.200 novos casos da doença e estima-se que

13.772 homens tenham morrido pela doença em 2013 (1). A taxa de incidência

do CaP é cerca de seis vezes maior nos países desenvolvidos em comparação

aos países em desenvolvimento. Nos Estados Unidos foram estimados para

2017 cerca de 161.360 novos casos da doença e 26.730 mortes pela mesma (2).

Dados de sobrevivência relativa dos Estados Unidos indicam que cerca de 1 em

cada 11 (9%) pacientes com CaP irá morrer pela doença em um período de 15

anos após o diagnóstico (3).

Apesar das causas específicas de iniciação e progressão do CaP ainda

não serem totalmente conhecidas, muitas evidências sugerem que fatores

genéticos e ambientais possuem um importante papel na origem e evolução

desta neoplasia. Os fatores de risco mais comuns para o CaP são idade

avançada, grupo racial e história familiar. O CaP é diagnosticado em apenas 2%

dos homens com menos de 50 anos (4), no entanto após essa idade a incidência

e a mortalidade aumentam exponencialmente (5). Pacientes da raça negra

apresentam maior incidência de CaP e tendem a apresentar evolução mais

agressiva da doença, enquanto que asiáticos têm menor prevalência. Presença

3

de pai ou irmão com CaP antes dos 60 anos aumenta o risco em 3 a 10 vezes

em relação à população geral (6).

Além dos fatores de risco clássicos para o CaP, vários outros fatores têm

sido identificados com um papel relevante para o surgimento da doença. Alguns

estudos mostraram correlação entre o CaP e a dieta (7), obesidade (8) , atividade

física (9) e tabagismo (10), além da região onde reside e situação econômica (11,

12). Sendo assim, as diferenças nas taxas de CaP resultam da combinação entre

fatores de susceptibilidade genética e fatores de risco externos. Essas diferentes

contribuições para a incidência de CaP são refletidas nas diferentes taxas da

doença em todo o mundo. Países asiáticos como a China, têm as taxas mais

baixas. As taxas mais elevadas são encontradas na América do Norte,

especialmente na população afro-americana (13). Nos últimos anos surgiram

muitas investigações relacionadas a fatores hormonais, e ressurgiu também o

interesse em etiologias inflamatórias ou infecciosas.

O exame de toque retal (TR) e a dosagem sérica do antígeno prostático

específico (PSA) são utilizados como exames de primeira linha para evidenciar

a possibilidade da presença de neoplasia prostática, sendo o diagnóstico

realizado por biópsia com agulha (14, 15). É importante a associação da dosagem

de PSA ao TR, já que o TR tem alta especificidade (94%), porém baixa

sensibilidade (50%), assim como baixo valor preditivo positivo (21%-53%). O

valor considerado normal do PSA é menor que 2,5 ng/mL e apesar de específico

da glândula prostática, o nível de PSA no sangue se eleva não só em casos de

CaP, mas também na Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) ou prostatite (16).

4

O prognóstico do CaP depende fundamentalmente do escore de

Gleason(17) e do estadiamento patológico. O escore de Gleason baseia-se no

padrão glandular e a relação entre as glândulas e o estroma prostático e é

dividido em 5 graus histológicos (sendo o grau 1 a lesão mais diferenciada e o

grau 5 a mais indiferenciada). Em espécimes de prostatectomia radical e de

ressecção transuretral, o escore é resultado da soma do padrão mais comum

com o segundo mais comum. Já em biópsias, o escore é obtido pela soma do

padrão mais prevalente com o padrão de mais alto grau. Tumores com escore 6

são considerados de baixo grau e os tumores de escore 8, 9 e 10 são

considerados de alto grau. O escore 7 é considerado de grau intermediário e seu

comportamento é bastante variável (18). Analisando os dados da literatura que

demonstra um comportamento indolente da neoplasia Gleason 6 a Sociedade

Internacional de Patologia Urológica (ISUP) propôs um novo sistema de

graduação que classifica os tumores de 1 a 5 como exposto na Figura 1 que

apresenta grande correspondência com o comportamento do tumor (19).

5

Figura 1 - Esquematização da nova graduação proposta pela ISUP para o CP e

as curvas de sobrevida livre de recidiva de acordo com a nova graduação (19)

O estadiamento patológico segue a classificação TNM recomendada pela

AJCC (American Joint Committee on Cancer - 2010).

O tratamento do CaP inclui desde a vigilância ativa até o tratamento

sistêmico com bloqueio hormonal e quimioterapia. Para determinação do

tratamento mais adequado, vários fatores devem ser observados, tais como o

escore de Gleason, o estadiamento, a idade, a presença de comorbidades e os

possíveis efeitos colaterais do tratamento. A vigilância ativa pode ser usada

como primeira opção de tratamento em pacientes que possuem doença de baixo

risco de acordo com os critérios de D’Amico (quando a expectativa de vida é

menor que 10 anos) ou de Epstein (se menor que 20 anos) (20). Para os pacientes

com CaP de baixo risco que não são candidatos à vigilância ativa e aqueles com

risco intermediário, a opção de tratamento é a prostatectomia radical ou a

radioterapia, cujas taxas de cura são de 95% e 75% respectivamente, em 10

6

anos (21). Por outro lado, os pacientes considerados de alto risco devem ser

submetidos a um tratamento mais agressivo devido ao potencial metastático da

doença (22). Em caso de doença metastática o tratamento consiste na castração

clínica ou cirúrgica (terapia antiandrogênica), a qual é altamente efetiva na

diminuição do tumor e nos níveis séricos do PSA (23).

1.2 Patogênese do Câncer de Próstata

1.2.1 Fatores hereditários

A hereditariedade é um dos principais fatores de risco do CaP, que se

caracteriza pela herança de mutações em genes de susceptibilidade de alta

penetrância que quando transmitidos aos descendentes aumentam o risco de

desenvolvimento de tumores. O CaP associado à agregação familiar foi relatado

pela primeira vez em 1956 (24), mas a evidência definitiva para a forma hereditária

da doença apareceu em 1992, quando a primeira análise de segregação foi

concluída (25). Estudos posteriores de segregação, estudos com gêmeos e

estudos caso-controle e coorte, forneceram fortes evidências relacionadas à

predisposição genética e o CaP (26, 27), com risco crescente de 2 a 3 vezes para

os homens com história familiar da doença em um parente de primeiro grau. O

Risco Relativo (RR) é ainda maior (3 a 5 vezes mais elevado), se o parente for

diagnosticado antes dos 65 anos de idade ou se houver 2 ou mais familiares com

CaP. A história familiar é uma das indicações para o início do exame de PSA na

7

fase mais jovem para a detecção precoce do CaP (28). A tabela 1 apresenta a

relação entre o acometimento de familiares e o risco de CaP (29).

Tabela 1 – Relação entre acometimento de familiares e risco de CaP

Familiar com CaP Risco relativo Intervalo de confiança

Nenhum 1

Pai 2,17 1,90 – 2,49

Irmão 3,37 2,97 – 3,83

Parente de 1º grau com < 65 anos 3,34 2,64 – 4,23

2 parentes de 1º grau 5,08 3,31 – 7,79

Parente de 2º grau 1,68 1,07 – 2,64

Fonte: Wein AJ et al. Campbell Walsh Urology. 9ªed.2007.

Dados de 44.788 gêmeos escandinavos mostraram associação

significante entre fatores hereditários e risco de CaP, com os fatores hereditários

respondendo por 42% do risco (30). No entanto uma análise realizada em 2014

com dados desse mesmo registro de gêmeos estimou a herdabilidade de CaP

em 58% (31). Outro estudo mostrou que existe maior concordância para o

diagnóstico de CaP entre gêmeos monozigóticos que gêmeos dizigóticos (de

18% e 3%, respectivamente) em uma análise combinada de gêmeos suecos,

dinamarqueses e finlandeses (30). Em uma comparação semelhante entre

gêmeos nos Estados Unidos, as concordâncias foram, respectivamente 27,1%

e 7,1% (32).

Atualmente a definição de formas hereditárias do CaP é baseada na

distribuição e idade de início da doença numa dada família. Familiar e hereditário

8

são termos que se referem ao aumento do risco de câncer dentro das famílias,

mas não são sinônimos (33). Para fins de investigação, o CaP pode ser dividido

em três formas epidemiológicas: (1) esporádica – que ocorre aleatoriamente na

população em indivíduos que não possuem história familiar; (2) familiar –

caracterizado por agrupamento simples de doença nas famílias, por exemplo,

quando dois irmãos têm CaP e (3) hereditário – caracterizado por um padrão de

distribuição de CaP consistente com a herança mendeliana de um gene de

susceptibilidade e início precoce da neoplasia (34).

A forma familiar do CaP corresponde a aproximadamente 20% dos casos

e é definida pelo acometimento de pelo menos dois parentes de primeiro grau.

A etiologia do CaP familiar pode envolver uma variedade de mecanismos, como

a exposição familiar a fatores de risco ambientais ou alimentares, vários genes

trabalhando juntos para contribuir com a herança poligênica, ou a transmissão

de um único gene de baixa penetrância. Em uma meta-análise de estudos de

caso-controle e coortes, Jonhns e Houlston (35) concluíram que homens que

possuem história familiar de CaP têm aproximadamente 2,5 vezes mais chance

de desenvolvimento da doença. O risco se torna maior para aqueles que

possuem parentes que tiverem início precoce da doença e para aqueles que têm

mais de um parente afetado. Em um estudo italiano com 1.294 casos de CaP,

indivíduos com história familiar possuíam odds ratio (OR) de desenvolvimento

da doença de 4.0 (95% IC 2.5-6.5), e o risco foi maior quando o parente afetado

teve diagnóstico precoce, quando possuíam mais de um parente afetado ou

quando o parente em questão era o irmão (36). O padrão de herança em muitos

casos de CaP familiar é tão forte que se assemelha a um traço autossômico

dominante (37).

9

A etiologia do CaP hereditário, por outro lado, é caracterizada pela

transmissão hereditária compatível com herança mendeliana. Esse tipo de CaP

acontece em 5% dos casos, e o reconhecimento dessa hereditariedade

necessita de critérios mais estritos, por exemplo, de três parentes de primeiro ou

segundo grau acometidos ou dois parentes afetados antes dos 55 anos de idade

(34). O CaP hereditário costuma ser diagnosticado mais precocemente (cerca de

6 a 7 anos antes dos casos esporádicos) (38).

Até o momento, apenas alguns genes de risco foram identificados,

embora cerca de 40 loci tenham sido associados à susceptibilidade genética (39).

Em 1956, Morganti et al. identificaram os primeiros agregados familiares de CaP,

porém apenas em 1966, Smith et al. encontraram o primeiro gene localizado no

cromossomo 1q24-25, denominado HPC1 (Hereditary Prostate Cancer 1) (24, 40).

O gene relacionado a esse lócus foi posteriormente clonado e corresponde ao

RNASEL (RNAasel 2’-5’-oligoadenilato (2-5 A)-dependente), um gene supressor

que atua sobre a proliferação celular e apoptose induzida por interferon,

importante na degradação de células infectadas por vírus (41). Duas mutações

foram descritas neste gene, uma localizada no códon de iniciação e outra que

resulta em uma proteína truncada em duas famílias com herança HPC1, porém

são raras e seu papel no desenvolvimento do CaP parece ser pequeno (42).

Outros dois loci importantes foram identificados nesse cromossomo, o 1q42.2-

43, denominado PCAP (Predisposing for Prostate Cancer), (43, 44) e o 1p36 CAPB

(Cancer, Prostate and Brain). Outras análises de ligação identificaram algumas

alterações nos loci 16q23.2, 17p (HPC2 – Hereditary Prostate Cancer 2), 20q13

(HPC20), 8p22 (MSR1) e Xq27-28 (HPCX).

10

Os genes BRCA1 e BRCA2 também já foram descritos como genes de

suscetibilidade. O RR de CaP aumenta em homens que carregam a mutação

nesses genes de predisposição ao câncer de mama (45, 46). Além deles, no gene

NSB1 foram encontradas mutações em linhagens germinativas em uma

frequência maior nos casos de CaP que nos controles (47, 48). Essas evidências

suportam a possibilidade de que a predisposição ao CaP em alguns casos, pode

ser decorrente de mutações que ocorrem em genes associados ao reparo do

DNA.

O gene HOXB13 pertence a um grupo de genes homeobox altamente

conservados que são essenciais para a embriogênese de vertebrados. Nos

seres humanos, existem quatro conjuntos de genes HOX (A, B, C e D) em

cromossomos separados e o aglomerado HOXB está localizado na região

17q21-22. HOXB13 é altamente expresso tanto em próstata normal quanto no

CaP. A proteína HOXB13 é um fator de transcrição específico que possui 284

aminoácidos e que interage com o receptor de andrógeno e tem um papel

importante no desenvolvimento da próstata (49). Foi demonstrado também que

essas proteínas regulam as respostas celulares a andrógenos, tais como a

promoção do crescimento independente de andrógenos, em linhagens celulares

de CaP (50). Além do CaP, HOXB13 também tem se mostrado como supressor

de tumor em câncer colo retal primário (51) e como preditor de recorrência do

câncer de mama (52).

Análises por linkage de CaP hereditário detectaram um sinal significativo

na região cromossômica 17q21-22 nas populações norte-americana e finlandesa

(53, 54). Em 2012 Ewing et al. (55) sequenciando esta região, identificaram uma

11

rara, mas recorrente mutação missense rs138213197 no primeiro exon do

homeobox B13. Esta mutação foi encontrada em 1,4% dos casos de CaP e em

0,1% dos controles, e entre os casos de CaP foi mais frequente em homens com

início precoce da doença. Um estudo de confirmação que utilizou 2.443 famílias

com CaP hereditário do International Consortium for Prostate Cancer Genetics

confirmou que 48% das famílias de CaP hereditário com ascendência europeia

têm pelo menos um portador da mutação em HOXB13 (56).

Os mecanismos pelos quais a mutação G84E pode promover a

carcinogênese da próstata são desconhecidos. Uma possível alternativa pode

ser por meio da ligação entre este gene com os membros da família de proteínas

MEIS. A expressão dessas proteínas em colaboração com os genes HOX tem

sido implicada no desenvolvimento da leucemia (57).

1.2.2 Fatores hormonais

Receptor de andrógeno (AR)

Os andrógenos influenciam o desenvolvimento, maturação e manutenção

da próstata, afetando a proliferação e a diferenciação do epitélio luminal. Isso

tem despertado grande interesse no papel desses hormônios esteroides no

desenvolvimento e manutenção tanto da próstata normal quanto do câncer (58).

No CaP já estabelecido, os tumores inicialmente respondem à terapia de

deprivação de andrógenos. Além disso, resultados do Prostate Cancer

Prevention Trial mostraram que a inibição da conversão da testosterona em

diidrotestosterona (DHT) reduz a incidência de CaP em aproximadamente 25%

12

(59). Contudo, os mecanismos moleculares que envolvem os processos de

transformação neoplásica e carcinogênese envolvendo os andrógenos ainda

não estão bem estabelecidos.

O mecanismo de ação dos andrógenos sobre a próstata constitui uma

sequência integrada de eventos. Inicialmente a testosterona, que regula o

crescimento e a manutenção do epitélio prostático normal, atravessa a

membrana plasmática das células por interação hidrofóbica com os fosfolipídios

e é metabolizada no citoplasma em DHT através de uma reação catalisada pela

enzima 5 α redutase presente no envoltório nuclear (60). A DHT, um andrógeno

mais potente que a testosterona e o principal hormônio trófico da próstata, liga-

se com grande afinidade a receptores androgênicos (AR), uma proteína nuclear

que é expressa na maioria das células prostáticas, incluindo as epiteliais e as

estromais (61). Essa ligação ativa os elementos de resposta dos genes alvo,

promovendo a proliferação celular.

O gene do AR possui 8 éxons e está localizado no braço longo do

cromossomo Xq11-12. A expressão gênica do AR pode ser modulada em

múltiplos níveis por mecanismos de transcrição, pós-transcrição e pós-tradução

(62). Estudos mostram que os SNPs de risco para o CaP são mais abundantes

em regiões genômicas contendo sítios de ligação do AR e sugerem que a

sinalização alterada deste receptor pode ser um mecanismo potencialmente

importante para o desenvolvimento do CaP (63, 64). Essas mutações também

ocorrem em tumores avançados de próstata, que se tornam resistentes à terapia

hormonal (65).

13

O éxon 1 do AR possui uma área de microssatélites CAG, cujo

comprimento é inversamente relacionado à atividade transcripcional dos genes-

alvo. Assim, quanto menor a zona de polimorfismo, maior a sensibilidade ao

andrógeno. Isto pode explicar parcialmente a maior incidência e gravidade do

CaP em afro-americanos, que possuem uma sequência CAG curta, e a menor

incidência entre os asiáticos, que possuem a sequência longa. Em caucasianos,

para cada repetição CAG adicional, há uma diminuição correspondente a 3% do

risco de desenvolvimento do CaP (66). Na população brasileira repetições CAG

menores que 21 representam um RR de 2,44 para o desenvolvimento do CaP

(67). Alterações do AR através de mutações, amplificação ou superexpressão do

gene são comuns em no CaP metastático (68).

Receptor de estrógeno (ERβ)

Os estrógenos possuem efeitos diretos e indiretos sobre o crescimento e

o desenvolvimento da próstata e têm sido correlacionados também com a

iniciação e a progressão do CaP. Tradicionalmente, os estrógenos eram

considerados como fatores de proteção contra o CaP e utilizados no tratamento

da doença avançada. O tratamento consiste em um feedback negativo sobre o

eixo hipotálamo-pituitário-gonadal e também através de um efeito inibitório direto

dos estrógenos sobre o crescimento de células epiteliais da próstata. No entanto,

estudos com animais mostram que os estrógenos podem atuar como pró-

carcinógenos na próstata (69). Animais knockout de aromatase não produzem

17β-estradiol na próstata, e apesar da testosterona e da DHT elevada, não

14

desenvolvem CaP (70). Diversas evidências mostram que os estrógenos que

atuam através do receptor de estrógeno (ER) podem contribuir para a

carcinogênese e progressão do CaP. A expressão de ER é silenciada no CaP

precoce e reemerge com a progressão da doença. Os ER epiteliais podem

desempenhar um papel importante na iniciação do CaP, já que a perda potencial

de ERβ pode contribuir para a progressão da doença órgão-confinada (71). Além

disso, o reaparecimento da expressão de ERβ no CaP metastático também

sugere um papel potencial na progressão para a doença resistente à castração.

Polimorfismos no gene ER já foram relacionados a outras doenças do trato

reprodutivo masculino, tais com hipospadia (72) e infertilidade (73).

1.2.3 Fatores de transcrição

Fatores de transcrição podem ser utilizados como biomarcadores para

diagnosticar doenças, uma vez que a expressão anormal destes, leva a uma

desregulação na transcrição do DNA para o RNA mensageiro, resultando na

indução de várias doenças, entre elas o câncer. Entre os vários fatores de

transcrição conhecidos, engrailed-2 (EN2) é essencial, uma vez que contém o

domínio homeobox, que desempenha um papel chave no desenvolvimento

embrionário (74). EN2 é reconhecido como um biomarcador potencial em vários

tipos de câncer, incluindo tumores de mama, ovário, bexiga e próstata (75-77).

Especificamente no CaP, os níveis de expressão de EN2 são aumentados no

tecido e na urina e apresenta maior especificidade e sensibilidade do que o PSA

(78). Dada a importância que EN2 tem para o desenvolvimento normal da

15

próstata, a expressão irregular deste gene poderia ser um mecanismo potencial

para o desenvolvimento do CaP. Ainda não existe na literatura relatos de

polimorfismos neste gene associados ao CaP.

1.3 Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs)

Uma série de estudos de sequenciamento já identificou mais de 30

milhões de variantes genéticas em todo o genoma humano (The 1000 Genomes

Project Consortium 2010). Essas variações genéticas estruturais incluem

inserções e inversões e a maioria delas são denominadas SNPs (Single

Nucleotide Polymorphisms). O SNP é caracterizado por uma variação na

sequência de DNA que ocorre quando um único nucleotídeo (A, T, C ou G) no

genoma difere do nucleotídeo normalmente esperado. As alterações mais

frequentes no DNA são as que envolvem bases nitrogenadas de mesma

característica estrutural, ou seja, troca entre duas purinas (A/G ou G/A) ou duas

pirimidinas (C/T ou T/C) que são denominadas transições. As transversões são

substituições de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa (79). Para que uma

alteração de única base seja considerado um SNP, deve ocorrer em uma

frequência mínima de 1% em uma dada população (80). Em relação à

nomenclatura, cada SNP presente no banco de dados público dbSNP

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP) pode ser localizado por seu

identificador único, que consiste da sigla rs (que se refere a “SNP referência”) e

o do seu número serial único.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP

16

Os SNPs estão dispersos por todo o genoma humano podendo ocorrer

tanto em regiões codificadoras como não codificadoras. SNPs que ocorrem em

regiões codificadoras podem ser denominados sinônimos ou não sinônimos

(SNPns), sendo que este último ocorre quando há substituição de um

aminoácido na sequência proteica podendo haver modificações estruturais e

funcionais na proteína e, portanto, tem um maior potencial de reflexo biológico.

No entanto, a maioria dessas variantes de risco estão mapeadas em regiões não

codificantes, não alterando a sequência das proteínas (81).

Outros tipos de SNPs também são de grande importância para a fisiologia

da célula. Alguns exemplos são os SNPs localizados em regiões promotoras que

podem alterar a expressão do gene, polimorfismos localizados em sítios de

splicing que podem resultar na inserção, exclusão ou modificação do tamanho

dos éxons, podendo alterar a estabilidade do RNAm ou a própria proteína

traduzida a partir desse RNAm, SNPs que causam geração ou supressão de

códons de terminação de tradução gerando proteínas com diferentes tamanhos

e finalmente, polimorfismos em regiões regulatórias existentes nas regiões

3’UTR ou SNPs que causam adenilação alternativa ou alteração na estrutura e

estabilidade do RNA.

Estudos de associação do genoma (GWAS) identificaram mais de 4.800

variantes de risco genéticos associados com mais de 500 traços e características

humanas e também com uma série de doenças (82). Os SNPs podem servir como

marcadores genéticos para identificar estudos de ligação em famílias,

desequilíbrio de ligação em populações isoladas, bem como em análise de

associação de pacientes e controles. Para estudos de associação e linkage, os

17

SNP são comumente usados pois são fontes de variação genética comuns e

apresentam herança estável ao longo das gerações.

Em relação ao câncer, os SNPs podem estar envolvidos nas diferentes

respostas a tratamentos observados entre pacientes e também aos diferentes

níveis de risco individual de desenvolvimento de neoplasias. Estudos GWAS

encontraram mais de 90 SNPs comuns (cujas frequências do alelo menor [MAF]

foram de 5% ou mais) associados com alterações fracas ou moderadas ([OR]:

1,1 -1,3) para o desenvolvimento do CaP (39, 83-87). Em conjunto, estes SNPs

podem ser responsáveis por cerca de um terço do risco global de CaP hereditário

(84).

SNPs menos comuns (MAF 1% - 5%) e raros (MAF <1%) podem ser

responsáveis por conferir maior risco da doença do que variantes genéticas mais

comuns. Para identificar essas variantes, são necessárias abordagens

alternativas em estudos GWAS. Uma dessas abordagens tem como base

indivíduos que possuem CaP familiar ou hereditário, onde o risco genético de

herança associado com mutações menos frequentes está concentrado. As

estimativas indicam que 5 a 10% de toda a incidência de CaP por herdabilidade

é resultante dos alelos de predisposição raros (25).

Mais recentemente Liu e et al. (88) realizaram uma meta análise

combinando dados de estudos de associação GWAS e encontraram 31 SNPs

em 14 loci de risco independentes que foram considerados como sendo

impactantes na susceptibilidade do CaP, e portanto relevantes para a saúde

pública mundial.

18

1.4 Justificativa

Atualmente o CaP continua a ter uma etiologia pouco clara, que envolve

numerosas combinações entre fatores genéticos e ambientais. O curso

habitualmente longo da doença, o surgimento precoce de lesões precursoras e

sua manifestação clínica tardia dificultam seu estudo e compreensão. Diante

desses desafios, observamos que existe uma série de alterações biológicas e de

mecanismos moleculares que resultam na iniciação e progressão da doença e

que necessitam ser compreendidos. Assim, pesquisas envolvendo alterações

moleculares como os polimorfismos genéticos voltadas para a descoberta,

validação e compreensão do comportamento biológico do CaP é de fundamental

importância.

Considerando que a história familiar e que os componentes hormonais

constituem fatores de risco para o desenvolvimento do CaP, acreditamos que a

identificação de polimorfismos envolvidos nesses processos possa ter um papel

relevante para auxiliar no desenvolvimento de ferramentas alternativas para a

detecção precoce e para a definição do prognóstico desta neoplasia. A

população brasileira se caracteriza por uma grande diversidade genética, e

muitos SNPs, como o rs10486567, rs10993994, rs9364554, rs5945572,

rs2735839, rs4430796, rs7501939, rs138213197 relacionados à

hereditariedade; rs1271572, rs2987983, rs8072254, rs4919743 associados aos

fatores hormonais e rs3808330 localizado em um importante fator de transcrição,

nunca foram estudados nestes homens.

19

2. OBJETIVOS

20

Objetivo primário

Análise de polimorfismos (SNPs) relacionados com histórico

familiar, fatores hormonais e de transcrição em amostras de sangue de

pacientes com câncer de próstata e em homens saudáveis.

Objetivo secundário

Correlação da genotipagem com fatores prognósticos clássicos do

CaP e com dados clínicos: histórico familiar de CaP, PSA pré-operatório,

graduação histológica de Gleason, estadiamento patológico e recidiva

bioquímica.

21

3. MÉTODOS

22

3.1 Pacientes

Foram selecionados 185 pacientes diagnosticados com CaP, com média

de idade de 60,2 anos, que são acompanhados na clínica particular do Prof. Dr.

Miguel Srougi. Esses pacientes foram subdivididos em dois grupos de acordo

com o histórico familiar, onde foram classificados como: 1 - indivíduo com CaP

com histórico familiar (n=72) e 2 - indivíduo com CaP esporádico (n=97). O

critério de inclusão do primeiro grupo foi o paciente ter dois parentes de primeiro

grau afetados. Todos os pacientes com CaP foram tratados cirurgicamente por

prostatectomia radical.

O grupo controle foi composto por 70 pacientes que não possuem CaP.

Estes homens são acompanhados no ambulatório de Urologia do Hospital das

Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP),

pelo grupo da próstata, onde fazem acompanhamento periódico com intuito

preventivo. Os critérios de inclusão deste grupo foram: PSA abaixo de 2,5 ng/ml,

não possuir histórico familiar de CaP e ter idade superior a 60 anos.

As características clínico-patológicas dos pacientes com CaP e dos

indivíduos do grupo controle estão apresentadas na tabela 2. A tabela 3 mostra

a comparação entre as características clínico-patológicas entre os pacientes

com CaP esporádico e familiar.

23

Tabela 2 - Características clínico-patológicas dos pacientes com CaP e dos

indivíduos do grupo controle

Características Casos CaP (n = 185)

Média (Desvio-padrão)

Controles (n = 70)

Média (Desvio- padrão)

p

Idade (anos) 60,23 (8,05) 67,24 (8,87) 0,00

PSA (ng/ml) 8,38 (11,20) 1,17 (0,82) 0,00

Volume da

próstata (gramas) 40,92 (16,39) 34,62 (13,67) 0,00

Tabela 3 - Características clínico-patológicas dos pacientes com CaP

esporádico e familiar

Características CaP esporádico (n=97)


CaP familiar


p

Idade de

diagnóstico (anos) 59,90 (8,07) 60,35 (8,37) 0,73

PSA pré-

operatório (ng/ml) 8,13 (8,59) 9,7 (17,33) 0,43

Escore de Gleason – n (%)

≤ 6 22 (25,6%) 15 (26,3%)

0,63 7 29 (33,7%) 23 (40,4%)

8-10 35 (40,7%) 19 (33,3%)

Estadiamento patológico n (%)

pT2 62 (78,5%) 48 (82,8%) 0,53

pT3 17 (21,5%) 10 (17,2%)

Recidiva bioquímica n (%)

Não 66 (75%) 46 (79,3%) 0,54

Sim 22 (25%) 12 (20,7)

O sangue dos pacientes com CaP foi coletado por uma enfermeira na

clínica particular e enviado para o Laboratório de Investigação Médica da

Disciplina de Urologia (LIM55) da FMUSP. O sangue do grupo controle foi

coletado no Ambulatório de Urologia do HCFMUSP e também encaminhado para

24

o LIM55. Além do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), os

pacientes também responderam um questionário (anexo 1) referente a histórico

detalhado de câncer na família e tratamento. As amostras de sangue coletadas

foram estocadas em freezer a -80°C até o processamento. Este trabalho foi

submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo sob o nº 456/13.

Os pacientes foram subdivididos de acordo com os fatores prognósticos

do CaP. Para o PSA pré-operatório os pacientes foram classificados em dois

grupos, <10ng/ml e ≥10ng/ml. Considerando o escore de Gleason na peça, os

pacientes foram categorizados de duas formas. Na primeira os pacientes foram

subdivididos em Gleason ≤ 6 e Gleason 7-10, e na segunda em Gleason ≤ 6,

Gleason 7 e Gleason 8-10. De acordo com o estadiamento patológico, os

pacientes foram divididos em tumores pT2 (órgão-confinados) e pT3 (doença

extra-prostática). Para a recidiva bioquímica, consideramos que houve

recorrência da doença quando o PSA pós-tratamento foi maior que 0,2ng/ml.

3.2 Polimorfismos

Foram selecionados treze polimorfismos (Tabela 4) e avaliados através

da técnica de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real

(qPCR). Comparamos a frequência dos genótipos para cada um dos 13

polimorfismos entre os 185 pacientes com CaP e os 70 pacientes do grupo

controle. Para seleção dos SNPs relacionados a hereditariedade, utilizamos

como referência a meta análise realizada por Liu et al. (88). Os demais

25

polimorfismos foram selecionados através de busca na base PubMed utilizando

os termos de interesse.

Tabela 4 - Polimorfismos selecionados para análise

Fator de

associação

com o CaP

Alteração Gene -

Cromossomo Alelo

Consequência

funcional

Hereditariedade rs10486567 JAZF1 - 7 G/A Variante intrônica

rs10993994 MSMB - 10 C/T Região promotora

rs9364554 SLC22A3 - 6 C/T Variante íntrônica

rs5945572 NUDT10/11- X G/A -

rs2735839 KLK2/3 - 19 G/A Variante íntrônica

rs4430796 HNF1B - 17 A/G Variante intrônica

rs7501939 HNF1B - 17 T/C Variante intrônica

rs138213197 HOXB13 - 17 C/T Alteração missense

Receptor de

estrógeno rs1271572 ESR2 - 14 A/C Variante intrônica

rs2987983 ESR2 - 14 A/G Variante intrônica

Receptor de

andrógeno rs8072254 AR - 17 A/G Variante intrônica

rs4919743 AR - 17 A/G Variante intrônica

Engrailed-2 rs3808330 EN2 - 7 C/T Região promotora

3.3 Extração de DNA

Para análise dos polimorfismos, primeiramente foi feita a extração de DNA

das amostras enviadas, utilizando o kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen®).

Para execução deste método, as amostras foram equilibradas à temperatura

ambiente e a quantidade de 200 µl foi retirada de cada uma delas para extração.

A esse volume foram adicionados 20 µl de protease, e posteriormente 200 µl de

26

solução de lise (Buffer AL). As amostras foram então incubadas a 56ºC por 10

minutos. Os tubos foram centrifugados e foram adicionados 200 µl de etanol (96

– 100%) e as amostras foram agitadas e centrifugadas. A mistura desse passo

foi então transferida para um novo tubo contendo uma coluna fornecida pelo kit

e as amostras foram centrifugadas para passagem da mistura pela coluna. O

filtrado foi então descartado e foram realizadas etapas de lavagem da coluna

com 500 µl das soluções Buffer AW1 e Buffer AW2, respectivamente. Após as

lavagens, as colunas foram transferidas para um novo tubo, onde foram

adicionados 200 µl da solução de eluição (Buffer AE), incubadas à temperatura

ambiente por 1 minuto e centrifugadas. A pureza e concentração do DNA foram

mensuradas em espectrofotômetro Nanodrop® (ND-1000, Wilmington, EUA)

(260/280nM).

3.4 Análise dos genótipos

Realizamos a análise da detecção dos polimorfismos por qPCR de 255

amostras (pacientes), sendo 185 diagnosticados com CaP e 70 controles.

Utilizamos a técnica de identificação da base com uso de sondas marcadas com

fluoróforos (Taqman®) (figura 2).

Nessa abordagem foram utilizados primers flanqueando a região

polimórfica para amplificação dos produtos por PCR, além de duas sondas que

se anelam sobre uma pequena sequência de nucleotídeos que contém o

polimorfismo, sendo cada uma específica para um dos alelos descritos. Em uma

das extremidades de cada sonda está fixada uma molécula fluorescente (dye

reporter), e na outra uma molécula não fluorescente, denominada quencher.

27

Enquanto as sondas estão intactas, a interação entre os dye reporters e

os quenchers impede que a fluorescência seja emitida. Durante a reação de

PCR, a Taq polimerase, por sua ação exonucleásica, quebra a sonda ligada ao

fragmento, causando a liberação do dye reporter e a emissão de fluorescência.

Como apenas a sonda específica para um determinado alelo é capaz de se ligar

a ele, apenas a fluorescência emitida por ela será detectada. Cada sonda é

marcada com uma fluorescência diferente e através da leitura da fluorescência

emitida é possível determinar o genótipo da amostra. É importante citar que além

do dye reporter e da molécula quencher, uma molécula denominada MGB (Minor

Groove Binder) também está afixada à sonda, tendo a função de elevar a sua

temperatura de anelamento, permitindo uma ligação mais específica, e evitando

que ela se ligue inespecificamente à sequência correspondente ao outro alelo.

A detecção da fluorescência emitida na reação é feita por uma câmera

CCD localizada no aparelho ABI7500 (Applied Biosystems), capaz de detectar

diferentes comprimentos de onda e os genótipos são determinados de acordo

com o perfil de emissão das fluorescências ao final da reação de PCR. Os oligos

e sondas foram adquiridos da empresa Applied Biosystems.

Para amplificação dos fragmentos desejados utilizamos as seguintes

condições de reação: 5,0 l do Master Mix TaqMan, 0,25 l de primer específico

de cada polimorfismo, 2,75 l de água destilada e 2,0 l de DNA, totalizando um

total de 10 l para cada reação. Para amplificação as amostras foram submetidas

a 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto, precedidos por 2

minutos a 50°C, e 10 minutos a 95°C. O produto foi então analisado por PCR em

28

tempo real, que faz a discriminação alélica através da emissão de luz em um

comprimento de onda característico.

Figura 2 - Sistema Taqman: Identificação da base com uso de sondas

marcadas com fluoróforos. Nesta abordagem além do primer são desenhadas

um par de sondas que se anelam sobre uma pequena seqüência de nucleotídeos

que contém o polimorfismo, sendo cada uma específica para um dos alelos

descritos (polimórfico e tipo selvagem). Em uma das extremidades de cada

sonda está fixada uma molécula fluorescente (dye reporter), e na outra uma

molécula não fluorescente, denominada quencher. Enquanto as sondas estão

intactas, a interação entre os dye reporters e os quenchers impede que a

fluorescência seja emitida. Durante a reação de PCR, a Taq DNA polimerase,

por sua ação exonucleásica, quebra a sonda ligada ao fragmento, causando a

liberação do dye repórter e a emissão de fluorescência (Fonte: Reis ST)

3.5 Análise estatística

A verificação do grau de significância da comparação entre as frequências

dos genótipos observada e esperada nos grupos controle e de pacientes com

CaP foi feita pelo teste de qui-quadrado (²).

29

A frequência de 13 polimorfismos foi avaliada entre estes dois grupos, e

além disso foram feitas análises dentro do grupo de pacientes com CaP,

analisando o histórico familiar e também fatores prognósticos (PSA pré-

operatório, estadiamento patológico, Gleason da peça cirúrgica). Realizamos

também uma análise dos polimorfismos com a recidiva bioquímica dos

pacientes. Foi avaliada a força de associação entre cada um dos polimorfismos

e o grupo através do cálculo de odds ratio (OR) e seu respectivo intervalo de

confiança a 95% (IC 95%).

As análises estatísticas foram realizadas no software SPSS 19.0 para

Windows, e em toda a análise o p foi considerado significativo quando menor ou

igual a 0,05.

30

4. RESULTADOS

31

A tabela 5 mostra a frequência dos genótipos dos SNPs analisados

comparando o grupo de pacientes com CaP e o grupo controle. A tabela 6 mostra

uma análise secundária, considerando apenas a presença ou ausência dos

alelos polimórficos para identificar se o fato do indivíduo possuir um único alelo

polimórfico já é capaz de aumentar ou diminuir a predisposição à alguma

característica. Sendo assim, agrupamos os indivíduos com genótipo homozigoto

polimórfico e heterozigoto em um só grupo e os indivíduos com genótipo

homozigoto selvagem em um outro grupo.

Nessas primeiras comparações encontramos uma associação

significativa entre o polimorfismo rs10486567 e o CaP. A presença do genótipo

homozigoto polimórfico foi maior nos pacientes diagnosticados com CaP (57,1%)

comparado com o grupo controle (40%) (OR=3,00; IC: [1,26 – 7,13]), enquanto

a presença do genótipo selvagem ocorreu em 17,1% nos indivíduos do grupo

controle e em somente 8,2% dos pacientes com CaP (p=0,02) (tabela 5). O alelo

polimórfico deste SNP esteve presente em 91,8% dos pacientes com a neoplasia

aumentando o risco de desenvolvimento do CaP em 2 vezes (OR=2,33; IC: [ 1,03

– 5,26]) (p=0,03) (Tabela 6)

Com relação ao polimorfismo rs9364554, apesar de termos encontrado

uma baixa frequência do genótipo polimórfico, no grupo de pacientes com CaP

a presença desse polimorfismo foi observada em 7,1% dos pacientes, enquanto

que no grupo controle foi encontrada em somente 2,9% dos indivíduos (p=0,05)

(OR=3,10; IC: [0,67 – 14,25]), indicando que a presença desse polimorfismo em

homozigose pode estar associada ao desenvolvimento do CaP (tabela 5). O alelo

polimórfico deste SNP esteve presente em 71 pacientes com CaP (38,6%) e em

apenas 16 indivíduos do grupo controle (22,9%). A presença deste alelo aumenta

32

a predisposição a esta neoplasia em 2 vezes (OR=2,12; IC: [1,12 – 3,98])

(p=0,01) (Tabela 6).

Também encontramos uma correlação significativa na comparação dos

grupos com o polimorfismo rs8072254. Entretanto, neste caso o genótipo

homozigoto polimórfico foi mais frequente nos pacientes do grupo controle que

nos casos de CaP (45,7% versus 28,8% respectivamente), conferindo uma

proteção ao desenvolvimento desta neoplasia (p=0,03) (OR=0,48; IC: [0,23 –

1,01]).

Para os demais polimorfismos não encontramos associações

significativas de acordo com a frequência dos genótipos e alelos e o CaP.

Tabela 5 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos nos pacientes

diagnosticados com CaP e nos indivíduos do grupo controle

Alteração (ensaio)

Genótipo CaP (n) Controle

(n) Odds Ratio p

rs10486567

AA* 8,2% (15) 17,1% (12) 1 0,02

AG 34,8% (64) 42,9% (30) 1,70 [0,71 – 4,09]

GG 57,1% (105) 40% (28) 3,00 [1,26 – 7,13]

rs7501939

TT* 14,2% (26) 15,7% (11) 1 0,74

TC 44,8% (82) 48,6% (34) 1,02 [0,45 – 2,29]

CC 41% (75) 35,7% (25) 1,26 [0,54 – 2,93]

rs4430796

AA* 22,8% (42) 22,9% (16) 1 0,12

AG 54,9% (101) 65,7% (46) 0,83 [0,42 – 1,64]

GG 22,3% (41) 11,4% (8) 1,95 [0,75 – 5,05]

rs10993994

CC* 25,5% (47) 20% (14) 1 0,17

CT 44% (81) 57,1% (40) 0,60 [0,29 – 1,22]

TT 30,4% (56) 22,9% (16) 1,04 [0,46 – 2,35]

rs2735839

GG** 3,8% (7) 2,9% (2) 1 0,77

GA 95,7% (176) 97,1% (68) 0,73 [0,15 – 3,64]

AA 0,5% (1) 0 (0) 4,61 [0]

33

rs5945572

GG* 29,9% (55) 31,4% (22) 1 0,87

GA 30,4% (56) 27,1% (19) 1,17 [0,57 – 2,41]

AA 39,7% (73) 41,4% (29) 1,00 [0,52 – 1,93]

rs9364554

CC* 61,4% (113) 77,1% (54) 1 0,05

CT 31,5% (58) 20% (14) 1,98 [1,01 – 3,86]

TT 7,1% (13) 2,9% (2) 3,10 [0,67 – 14,25]

rs138213197

CC* 56% (103) 52,9% (37) 1 0,65

CT 44% (81) 47,1% (33) 0,88 [0,50 – 1,53]

TT 0% (0) 0% (0) -

rs1271572

AA* 36,4% (67) 30% (21) 1 0,62

AC 43,5% (80) 47,1% (33) 3,73 [0,13 – 1,39]

CC 20,1% (37) 22,9% (16) 5,41 [0,28 – 1,52]

rs2987983

AA* 7,6% (14) 11,4% (8) 1 0,62

AG 89,1% (164) 85,7% (60) 1,56 [0,62 – 3,91]

GG 3,3% (6) 2,9% (2) 1,71 [0,27 – 10,58]

rs8072254

AA* 26,1% (48) 20,0% (14) 1 0,03

AG 45,1% (83) 34,3% (24) 1,00 [0,47 – 2,13]

GG 28,8% (53) 45,7% (32) 0,48 [0,23 – 1,01]

rs4919743

AA* 3,8% (7) 0% (0) - 0,19

AG 86,4% (159) 92,9% (65) -

GG 9,8% (18) 7,1% (5) -

rs3808330

CC* 7,1% (13) 8,6% (6) 1 0,86

CT 22,3% (41) 20% (14) 1,35 [0,43 – 4,23]

TT 70,7% (130) 71,4% (50) 1,20 [0,43 – 3,33]

*Genótipo homozigoto selvagem

34

Tabela 6 - Distribuição dos alelos dos 13 polimorfismos entre pacientes com CaP e grupo controle.

Alteração Alelo Sem Câncer

(n)

Com Câncer

(n)

Odds Ratio p

rs10486567

A* 17,1% (12) 8,2% (58) 1,00 0,03

G 82,9% (15) 91,8% (169) 2.33 [ 1,03 – 5,26]

rs7501939

T* 15,7% (11) 14,1% (26) 1,00 0,74

C 84,3% (59) 85,9% (158) 1,13 [ 0,52 - 2,43]

rs4430796

A* 22,9% (16) 22,8% (42) 1,00 0,99

G 77,1% (54) 77,2% (142) 1,00 [ 0,52 – 1,93]

rs10993994

C* 20% (14) 25,5% (47) 1,00 0,35

T 80% (56) 74,5% (137) 0,72 [0,37 – 1,42]

rs2735839

A* 2,9% (2) 3,8% (7) 1,00 0,71

G 97,1% (68) 96,2% (177) 0,74 [0,15 – 3,66 ]

rs5945572

A* 31,4% (22) 29,9% (55) 1,00 0,81

G 68,6% (48) 70,1% (129) 1,07 [0,59 – 1,94]

rs9364554

C* 77,1% (54) 61,4% (113) 1,00 0,01

T 22,9% (16) 38,6% (71) 2,12 [1,12 – 3,98]

rs138213197

C* 52,9% (37) 56% (103) 1,00 0,65

T 47,1% (33) 44% (81) 0,88 [0,50 – 1,53]

rs1271572

A* 30% (21) 37% (68) 1,00 0,29

C 70% (49) 63% (116) 0,73 [0,40 – 1,32]

rs2987983

A* 11,4% (8) 7,6% (14) 1,00 0,33

G 88,6% (62) 92,4% (170) 1,56 [0,62 – 3,91]

rs8072254

A* 20% (14) 26,1% (48) 1,00 0,31

G 80% (56) 73,9% (136) 0,70 [0,36 – 1,38]

rs4919743

A* 0% (0) 4,3% (8) 1,00 0,07

G 100% (70) 95,7% (176) 1,04 [1,01 – 1,07]

rs3808330

C* 8,6% (6) 7,1% (13) 1,00 0,68

T 91,4% (64) 92,9% (171) 1,23 [0,45 – 3,38]

*Alelo selvagem

35

Avaliamos também a frequência dos genótipos comparada aos pacientes

diagnosticados com CaP com histórico familiar e com os pacientes com CaP

esporádico (Tabela 7). Nesta comparação, encontramos uma associação

significativa em relação ao SNP rs1271572 em que o genótipo polimórfico foi

quase 3x mais presente nos pacientes que possuíam CaP esporádico quando

comparado aos indivíduos com CaP com história familiar da doença (p=0,03)

(OR=0,29; IC: [0,11 – 0,78]). Os demais polimorfismos e a análise de alelos não

apresentaram significância estatística considerando a hereditariedade desta

neoplasia.

Tabela 7 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos nos pacientes

diagnosticados com CaP com histórico familiar e esporádico


Genótipo

Pacientes portadores

de CaP esporádico

(n)

Pacientes portadores

com histórico

familiar (n)

Odds Ratio p

rs10486567

AA* 8,2% (8) 9,7% (7) 1 0,68

AG 30,9% (30) 36,1% (26) 0,99 [0,31 – 3,10]

GG 60,8% (59) 54,2% (39) 0,75 [0,25 – 2,25]

rs7501939

TT* 17,7% (17) 11,1% (8) 1 0,43

TC 42,7% (41) 50% (36) 1,86 [0,72 – 4,83]

CC 39,6% (38) 38,9% (28) 1,56 [0,59 – 4,13]

rs4430796

AA* 25,8% (25) 20,8% (15) 1 0,54

AG 52,6% (51) 61,1% (44) 1,43 [0,67 – 3,06]

GG 21,6% (21) 18,1% (13) 1,03 [0,40 – 2,64]

rs10993994

CC* 26,8% (26) 20,8% (15) 1 0,08

CT 37,1% (36) 54,2% (39) 1,87 [0,86 – 4,09]

TT 36,1% (35) 25% (18) 0,89 [0,38 – 2,09]

rs2735839

36

GG* 5,2% (5) 1,4% (1) 1 0,22

GA 94,8% (92) 97,2% (70) 3,80 [0,43 – 33,30]

AA 0% (0) 1,4%(1) 8,07 [ - ]

rs5945572

GG* 29,9% (29) 31,9% (23) 1 0,96

GA 29,9% (29) 29,2% (21) 0,91 [0,41 – 2,00]

AA 40,2% (39) 38,9% (28) 0,90 [0,43 – 1,88]

rs9364554

CC* 58,8% (57) 63,9% (46) 1 0,62

CT 32% (31) 30,6% (22) 0,87 [0,45 – 1,71]

TT 9,3% (9) 5,6% (4) 0,55 [0,15 – 1,90]

rs138213197

CC* 50,5% (49) 61,1% (44) 1 0,17

CT 49,5% (48) 38,9% (28) 0,65 [0,35 – 1,20]

TT 0% (0) 0% (0) -

rs1271572

AA* 35,1% (34) 44,4% (32) 1 0,03

AC 39,2% (38) 45,8% (33) 0,92 [0,47 – 1,80]

CC 25,8% (25) 9,7% (7) 0,29 [0,11 – 0,78]

rs2987983

AA* 8,2% (8) 8,3% (6) 1 0,58

AG 87,6% (85) 90,3% (65) 1,02 [0,33 – 3,08]

GG 4,1% (4) 1,4% (1) 0,33 [0,02 – 3,80]

rs8072254

AA* 27,8% (27) 26,4% (19) 1 0,94

AG 43,3% (42) 45,8% (33) 1,11 [0,53 – 2,34]

GG 28,9% (28) 27,8% (20) 1,01 [0,44 – 2,30]

rs4919743

AA* 3,1% (3) 4,2% (3) 1 0,85

AG 87,6% (85) 84,7% (61) 0,71 [0,14 – 3,67]

GG 9,3% (9) 11,1% (8) 0,88 [0,13 – 5,72]

rs3808330

CC* 6,2% (6) 69% (5) 1 0,86

CT 25,8% (25) 19,4% (14) 0,67 [0,17 – 2,60]

TT 68% (66) 73,6% (53) 0,96 [0,27 – 3,33]


Os pacientes foram subdivididos de acordo com os fatores prognósticos

clássicos do CaP. Inicialmente subdividimos os pacientes de acordo com os

níveis de PSA pré-operatório em dois grupos: PSA < 10 ng/ml e pacientes com

37

PSA ≥ 10 ng/ml (Tabela 8). Nesta comparação encontramos significância

estatística apenas para o SNP rs3808330. O genótipo homozigoto polimórfico

esteve mais presente no grupo de pacientes com PSA <10ng/ml, (p=0,02)

(OR=0,18; IC: [0,05 – 0,68]). A análise considerando somente os alelos não

revelou nenhuma associação estatisticamente significativa.

Tabela 8 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em relação ao nível

de PSA pré-operatório


Genótipo PSA

<10ng/ml (n)

PSA ≥10ng/ml

(n) Odds ratio p

rs10486567

AA* 9,2% (13) 7,4% (2) 1 0,87

AG 32,4% (46) 37% (10) 1,41 [0,27 – 7,27]

GG 58,5% (83) 55,6% (15) 1,17 [0,24 – 5,74]

rs7501939

TT* 14,9% (21) 14,8% (4) 1 0,44

TC 43,3% (61) 55,6% (15) 1,29 [0,38 – 4,32]

CC 41,8% (59) 29,6% (8) 0,71 [0,19 – 2,61]

rs4430796

AA* 22,5% (32) 18,5% (5) 1 0,77

AG 55,6% (79) 63% (17) 1,37 [0,46 – 4,04]

GG 21,8% (31) 18,5% (5) 1,03 [0,27 – 3,92]

rs10993994

CC* 23,2% (33) 29,6% (8) 1 0,41

CT 47,2% (67) 33,3% (9) 0,55 [0,19 – 1,56]

TT 29,6% (42) 38% (10) 0,98 [0,34 – 2,76]

rs2735839

GG* 4,9% (7) 0% (0) 1 0,45

GA 94,4% (134) 100% (27) 3,25 [-]

AA 0,7% (1) 0% (0) 1,00 [-]

rs5945572

GG* 29,6% (42) 29,6% (8) 1 0,64

GA 28,9% (41) 37% (10) 1,28 [0,46 – 3,56]

AA 41,5% (59) 33,3%(9) 0,80 [0,28 – 2,24]

rs9364554

CC* 60,6% (86) 74,1% (20) 1 0,22

CT 31,7% (45) 25,9% (7) 0,66 [0,26 – 1,70]

38

TT 7,7% (11) 0% (0) -

rs138213197

CC* 58,5% (83) 44,4% (12) 1 0,17

CT 41,5% (59) 55,6% (15) 1,75 [0,76- 4,03]

TT 0% (0) 0% (0) -

rs1271572

AA* 34,5% (49) 37% (10) 1 0,59

AC 46,5% (66) 37% (10) 0,74 [0,28 – 1,92]

CC 19% (27) 25,9% (7) 1,27 [0,43 – 3,71]

rs2987983

AA* 7,7% (11) 11,1% (3) 1 0,53

AG 88,7% (126) 88,9% (24) 0,69 [0,18 – 2,69]

GG 3,5% (5) 0% (0) -

rs8072254

AA* 24,6% (35) 22,2% (6) 1 0,96

AG 46,5% (66) 48,1% (13) 1,14 [0,40 – 3,28]

GG 28,9% (41) 29,6% (8) 1,13 [0,36 – 3,59]

rs4919743

AA* 2,8% (4) 7,4% (2) 1 0,49

AG 86,6% (123) 81,5% (22) 0,35 [0,06 – 2,07]

GG 10,6% (15) 11,1% (3) 0,40 [0,04 – 3,27]

rs3808330

CC* 4,2% (6) 18,5% (5) 1 0,02

CT 23,2% (33) 22,2% (6) 0,21 [0,05 – 0,95]

TT 72,5% (103) 59,3% (16) 0,18 [0,05 – 0,68]


Considerando o escore de Gleason subdividimos os pacientes em dois

grupos: pacientes com Gleason ≤ 6 e Gleason 7-10. A comparação entre a

genotipagem e o escore de Gleason foi realizada para a peça cirúrgica. O SNP

rs7501939 apresentou significância estatística marginal (Tabela 9). A frequência

do genótipo homozigoto polimórfico foi maior em pacientes que apresentaram

menor escore Gleason (57,1%) comparado aos pacientes com escore de

Gleason 7-10 (36,9%) (p= 0,07) (OR=0,38; IC: [0,11 – 1,25]).

Ainda nesta comparação, encontramos que o genótipo homozigoto

selvagem do SNP rs5945572 foi mais frequente nos pacientes com escore de

39

Gleason de alto grau, enquanto que o genótipo homozigoto polimórfico foi mais

predominante nos pacientes com escore de Gleason de baixo grau (39,3% e

59,5%, respectivamente) (p=0,00) (OR=0,15; IC: [0,05 – 0,45]).

Na análise de alelos não encontramos nenhuma associação significativa

considerando o escore de Gleason.

Tabela 9 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em relação ao escore

de Gleason na peça


Genótipo Gleason ≤6

(n) Gleason >

7-10 (n) Odds Ratio p

rs10486567

AA* 7,1% (3) 9,8% (11) 1 0,65

AG 40,5% (17) 33% (37) 0,59 [0,14 – 2,40]

GG 52,4% (22) 57,1% (64) 0,79 [0,20 – 3,10]

rs7501939

TT* 9,5% (4) 16,2% (18) 1 0,07

TC 33,3% (14) 46,8% (52) 0,82 [0,24 – 2,83]

CC 57,1% (24) 36,9% (41) 0,38 [0,11 – 1,25]

rs4430796

AA* 26,2% (11) 19,6% (22) 1 0,18

AG 45,2% (19) 61,6% (69) 1,81 [0,75 – 4,39]

GG 28,6% (12) 18,8% (21) 0,87 [0,31 – 2,41]

rs10993994

CC* 16,7% (7) 29,5% (33) 1 0,25

CT 46,7% (20) 42,9% (48) 0,50 [0,19 – 1,34]

TT 35,7% (15) 27,7% (31) 0,43 [0,15 – 1,21]

rs2735839

GG* 4,8% (2) 3,6% (4) 1 0,78

GA 95,2% (40) 95,5% (107) 1,33 [0,23 – 7,58]

AA 0% (0) 0,9% (1) 8,07 [-]

rs5945572

GG* 11,9% (5) 39,3% (44) 1 0,00

GA 28,6% (12) 29,5% (33) 0,31 [0,10 – 0,97]

AA 59,5% (25) 31,3% (35) 0,15 [0,05 – 0,45]

rs9364554

CC* 54,8% (23) 63,4% (71) 1 0,52

CT 38,1% (16) 28,6% (32) 0,64 [0,30 – 1,38]

40

TT 7,1% (3) 8% (9) 0,97 [0,24 – 3,89]

rs138213197

CC* 61,9% (26) 54,5% (61) 1 0,26

CT 38,1% (16) 45,5% (51) 1,35 [0,65 – 2,80]

TT 0% (0) 0% (0) -

rs1271572

AA* 38,1% (16) 35,7% (40) 1 0,70

AC 40,5% (17) 47,3% (53) 1,24 [0,56 – 2,76]

CC 21,4% (9) 17% (19) 0,84 [0,31 – 2,25]

rs2987983

AA* 11,9% (5) 8% (9) 1 0,71

AG 87,5% (36) 88,4% (99) 1,52 [0,48 – 4,86]

GG 2,4% (1) 3,6% (4) 2,22 [0,19 – 25,72]

rs8072254

AA* 21,4% (9) 23,2% (26) 1 0,27

AG 57,1% (24) 43,8% (49) 0,70 [0,28 – 1,74]

GG 21,4% (9) 33% (37) 1,42 [0,49 – 4,07]

rs4919743

AA* 2,4% (1) 4,5% (5) 1 0,71

AG 90,5% (38) 85,7% (96) 0,50 [0,05 – 4,46]

GG 7,1% (3) 9,8% (11) 0,73 [0,06 – 8,91]

rs3808330

CC* 4,8% (2) 6,3% (7) 1 0,82

CT 21,4% (9) 25% (28) 0,88 [0,15 – 5,07]

TT 73,8% (31) 68,8% (77) 0,71 [0,14 – 3,60]


Para a comparação do escore de Gleason, incluímos mais uma análise,

dessa vez subdividindo os pacientes em três parâmetros: Gleason ≤ 6, Gleason

7 e Gleason 8-10 (Tabela 10). Nesta análise o SNP rs7501939 também

apresentou significância marginal e a relação se manteve a mesma que na

análise anterior em que a frequência do genótipo homozigoto polimórfico foi

maior em pacientes que possuem menor escore de Gleason (57,1%) comparado

aos pacientes com Gleason 7 (45,5%) e Gleason 8-10 (28,6%) (p= 0,07).

Ainda nesta comparação, encontramos que o genótipo homozigoto

polimórfico do SNP rs5945572 foi mais frequente nos pacientes com escore de

41

Gleason de baixo grau comparado aos pacientes com escore de Gleason de alto

grau (59,5% (≤6) e 37,5% (7) e 25% (8-10), respectivamente) (p=0,04).


considerando o escore de Gleason divididos em três parâmetros.

Tabela 10 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em relação ao

escore de Gleason na peça (3 parâmetros)


Genótipo Gleason ≤6

(n) Gleason 7

(n) Gleason 8-

10 (n) p

rs10486567

AA* 7,1% (3) 10,7% (6) 8,9% (5) 0,91

AG 40,5% (17) 32,1% (18) 33,9% (19)

GG 52,4% (22) 57,1% (32) 57,1% (32)

rs7501939

TT* 9,5% (4) 14,5% (8) 17,9% (10) 0,07

TC 33,3% (14) 40% (22) 53,6% (30)

CC 57,1% (24) 45,5% (25) 28,6% (16)

rs4430796

AA* 26,2% (11) 19,6% (11) 19,6% (11) 0,18

AG 45,2% (19) 55,4% (31) 67,9% (38)

GG 28,6% (12) 25% (14) 12,5% (7)

rs10993994

CC* 16,7% (7) 30,4% (17) 28,6% (16) 0,42

CT 46,7% (20) 46,4% (26) 39,3% (22)

TT 35,7% (15) 23,2% (13) 32,1% (18)

rs2735839

GG* 4,8% (2) 3,6% (2) 3,6% (2) 0,76

GA 95,2% (40) 94,6% (53) 96,4% (54)

AA 0% (0) 1,8% (1) 0% (0)

rs5945572

GG* 11,9% (5) 37,5% (21) 41,1% (23) 0,04

GA 28,6% (12) 25% (14) 33,9% (19)

AA 59,5% (25) 37,5% (21) 25% (14)

rs9364554

CC* 54,8% (23) 51,8% (29) 75% (42) 0,10

CT 38,1% (16) 37,5% (21) 19,6% (11)

TT 7,1% (3) 10,7% (6) 5,4% (3)

rs138213197

42

CC* 61,9% (26) 60,7% (34) 48,2% (27) 0,29

CT 38,1% (16) 39,3% (22) 51,8% (29)

TT 0% (0) 0% (0) 0% (0)

rs1271572

AA* 38,1% (16) 44,6% (25) 26,8% (15) 0,33

AC 40,5% (17) 41,1% (23) 53,6% (30)

CC 21,4% (9) 14,3% (8) 19,6% (11)

rs2987983

AA* 11,9% (5) 14,3% (8) 1,8% (1) 0,20

AG 87,5% (36) 82,1% (46) 94,6% (53)

GG 2,4% (1) 3,6% (2) 3,6% (2)

rs8072254

AA* 21,4% (9) 21,4% (12) 25% (14) 0,59

AG 57,1% (24) 44,6% (25) 42,9% (24)

GG 21,4% (9) 33,9% (19) 32,1% (18)

rs4919743

AA* 2,4% (1) 5,4% (3) 3,6% (2) 0,90

AG 90,5% (38) 83,9% (47) 87,5% (49)

GG 7,1% (3) 10,7% (6) 8,9% (5)

rs3808330

CC* 4,8% (2) 5,4% (3) 7,1% (4) 0,41

CT 21,4% (9) 17,9% (10) 32,1% (18)

TT 73,8% (31) 76,8% (43) 60,7% (34)


Os pacientes foram subdivididos de acordo com o estadiamento

patológico e neste caso foram divididos em tumores pT2 (órgão-confinados) e

tumores pT3 (doença extra-prostática). Nesta análise não encontramos

significância estatística entre nenhum dos SNPs analisados, tanto na

comparação com a frequência dos genótipos quanto na comparação com a

frequência de alelos.

Avaliamos a presença ou ausência de recidiva bioquímica, que foi

considerada presente quando o PSA pós tratamento foi maior que 0,2 ng/ml.

Neste caso 34 pacientes apresentaram recidiva bioquímica e 121 pacientes não

apresentaram. Dois polimorfismos foram significativamente associados com

43

esse fator. Considerando o SNP rs7501939, encontramos que o genótipo

homozigoto polimórfico foi mais frequente nos pacientes que não apresentaram

recidiva bioquímica (p=0,04) (OR=1,05; IC: [0,25 – 4,31]).

Considerando o polimorfismo rs4919743, embora o genótipo heterozigoto

tenha sido o mais prevalente nos 2 grupos, sua frequência foi maior nos

pacientes sem recidiva (90,1%) quando comparado aos pacientes com recidiva

(73,5%) (p= 0,04) (OR=0,22; IC: [0,04 – 1,20]) (Tabela 11). Para os genótipos

não foi possível construir curvas de sobrevida devido à baixa frequência do

genótipo homozigoto selvagem.


considerando recidiva bioquímica.

Tabela 11 - Distribuição dos genótipos de 13 polimorfismos em relação à recidiva

bioquímica


Genótipo

Sem recidiva

bioquímica (n)

Com recidiva

bioquímica (n)

Odds Ratio p

rs10486567

AA* 10,7% (13) 5,9% (2) 1 0,42

AG 30,6% (37) 41,2% (14) 2,45 [0,49 – 12,31]

GG 58,7% (71) 52,9% (18) 1,64 [0,34 – 796]

rs7501939

TT* 15,7% (19) 9,1% (3) 1 0,04

TC 39,7% (48) 63,6% (21) 2,77 [0,73 – 10,38]

CC 44,6% (54) 27,3% (9) 1,05 [0,25 – 4,31]

rs4430796

AA* 24,8% (30) 14,7% (5) 1 0,06

AG 51,2% (62) 73,5% (25) 2,41 [0,84 – 6,94]

GG 24% (29) 11,8% (4) 0,82 [0,20 – 3,39]

rs10993994

CC* 19% (23) 32,4% (11) 1 0,24

44

CT 47,9% (58) 41,2% (14) 0,50 [0,50 – 1,27]

TT 33,1% (40) 26,5% (9) 0,47 [0,17 – 1,30]

rs2735839

GG* 5,8% (7) 0% (0) 1 0,15

GA 94,2% (114) 100% (34) 4,81 [-]

AA 0% (0) 0% (0) -

rs5945572

GG* 30,6% (37) 38,2% (13) 1 0,06

GA 27,3% (33) 41,2% (14) 1,20 [0,49 – 2,93]

AA 42,1% (51) 20,6% (7) 0,39 [0,14 – 1,07]

rs9364554

CC* 61,2% (74) 70,6% (24) 1 0,49

CT 31,4% (38) 26,5% (9) 0,73 [0,30 – 1,72]

TT 7,4% (9) 2,9% (1) 0,34 [0,41 – 2,84]

rs138213197

CC* 58,7% (71) 55,9% (19) 1 0,77

CT 41,3% (50) 44,1% (15) 1,12 [0,52 – 2,41]

TT 0% (0) 0% (0) -

rs1271572

AA* 37,2% (45) 32,4% (11) 1 0,30

AC 42,1% (51) 55,9% (19) 0,42 [0,13 – 1,39]

CC 20,7% (25) 11,8% (4) 0,65 [0,28 – 1,52]

rs2987983

AA* 9,1% (11) 5,9% (2) 1 0,38

AG 86,8% (105) 94,1% (32) 1,67 [0,35 – 7,95]

GG 4,1% (5) 0% (0) -

rs8072254

AA* 26,4% (32) 26,5% (9) 1 0,92

AG 43,8% (53) 47,1% (16) 1,07 [0,42 – 2,71]

GG 29,8% (36) 26,5% (9) 0,88 [0,31 – 2,51]

rs4919743

AA* 2,5% (3) 8,8% (3) 1 0,04

AG 90,1% (109) 73,5% (25) 0,22 [0,04 – 1,20]

GG 7,4% (9) 17,6% (6) 0,66 [0,09 – 4,47]

rs3808330

CC* 6,6% (8) 5,9% (2) 1 0,20

CT 20,7% (25) 35,3% (12) 1,92 [0,35 – 10,46]

TT 72,7% (88) 58,8% (20) 0,90 [0,17 – 4,61]


45

5. DISCUSSÃO

46

Considerando que o CaP é a segunda principal causa de morte por câncer

na população masculina, é fundamental que os esforços se concentrem em

descobrir indivíduos propensos a desenvolver a doença. Do ponto de vista de

saúde pública, a capacidade de identificar a predisposição genética para o CaP

poderia ser uma abordagem de rastreio para a população masculina. A

identificação de indivíduos com alto risco de aparecimento precoce e agressivo

do CaP, seria ainda mais valiosa.

Neste trabalho, investigamos a frequência de 13 SNPs presentes em

genes que já foram associados ao desenvolvimento do CaP esporádico ou

familiar e também em receptores hormonais, e tentamos estabelecer uma

correlação entre estes SNPs e o desenvolvimento do CaP e também a sua

progressão. Quando comparamos a frequência dos genótipos dos SNPs

estudados entre pacientes diagnosticados com CaP e o grupo controle,

encontramos diferenças estatísticas relacionadas a 3 SNPs. O primeiro deles é

o SNP rs10486567, que está localizado no cromossomo 7, no segundo íntron do

gene JAZF1 e codifica três proteínas C2-H2 do tipo zinc finger. Em nosso

estudo, a presença do genótipo homozigoto polimórfico aumentou em três vezes

o risco de desenvolvimento do CaP. Considerando apenas a presença ou

ausência dos alelos polimórficos, este SNP manteve o resultado encontrado nas

análises de frequência dos genótipos. A presença do alelo polimórfico aumentou

a predisposição ao CaP em 2 vezes. Através da meta-análise realizada por Liu

et al. (88) este SNP emergiu como um foco de interesse para o CaP e após

análises mais detalhadas continuou apresentando associação com o risco para

a neoplasia (89), incluindo a forma familiar(90).

47

Embora a importância funcional do SNP rs10486567 ainda tenha que ser

identificada, JAZF1 é reconhecido por codificar uma proteína zinc finger

denominada cisteína 2 histidina 2 (Cys2-His2), um tipo estrutural de zinc finger

que interage com alguns metais pesados como cádmio e chumbo (91, 92).

Interações de proteínas zinc fingers com metais pesados é um dos mecanismos

propostos para a carcinogênese por metal (93-95). Proteínas zinc finger estão

envolvidas no reparo do DNA, na transcrição e na supressão de tumores. Alguns

metais pesados já foram identificados como modificadores da estrutura e função

de algumas proteínas zinc finger chaves envolvidas na carcinogênese, tais como

o supressor de tumor p53 (96) e na inibição da cadeia de reparo do DNA (97).

As proteínas codificadas por este gene são também repressoras

transcripcionais de NR2C2, que se trata de um receptor nuclear altamente

expresso no tecido da próstata e que interage com o receptor de andrógeno.

JAZF1 é também um gene que frequentemente se funde com SUZ12 em

tumores de endométrio (98). Além disso, nesses tumores ocorrem frequentes

translocações que levam a expressão quimérica de JAZF1 e JJAZ1. O

mecanismo que conduz a esse rearranjo é desconhecido mas sabe-se que isso

não ocorre em concentrações elevadas de estrógeno e progesterona, sugerindo

que esse tipo de fusão pode ocorrer de maneira hormônio dependente (99). No

entanto, um estudo recente mostrou que na presença do polimorfismo

rs10486567, a sensibilidade de JAZF1 ao andrógeno é reduzida em 56%,

sugerindo que este SNP parece ser a variante funcional mais significativa deste

locus (100).

48

Em conformidade com nossos resultados outros trabalhos também

encontraram associação entre o SNP rs10486567 e o CaP (89, 101-103). Além disso,

em um desses estudos que avaliou 1.827 homens brancos com diagnóstico de

adenocarcinoma de próstata, esse SNP também mostrou associação com

pacientes que possuíam escore de Gleason de alto grau (≥8) (101). Em outro

estudo que investigou a possível utilização de alguns loci de risco como

marcadores de mortalidade para o CaP, este SNP esteve entre os que

mostraram associação positiva para essa finalidade. No entanto neste mesmo

trabalho, esse SNP mostrou associação com casos de CaP não fatais (104). O

alelo polimórfico deste SNP também foi associado com uma diminuição

significativa do risco de recorrência bioquímica, surgimento de metástase (105) e

início precoce da neoplasia (106). Outro estudo mostrou que este polimorfismo em

combinação com outras alterações pode ter um efeito cumulativo associado com

características mais agressivas do CaP (107). Assim como encontrado em nossos

resultados, é incontestável a participação deste SNP no desenvolvimento do

CaP e na aquisição de algumas características, principalmente com relação a

agressividade da doença. Em face dessas importantes associações este SNP

merece ser alvo de investigações mais profundas em trabalhos posteriores.

Ainda comparando a frequência dos genótipos entre pacientes com CaP

e o grupo controle, o polimorfismo rs9364554 também mostrou uma possível

associação com o desenvolvimento da doença, onde a presença do genótipo

homozigoto polimórfico representa um risco três vezes maior de

desenvolvimento da neoplasia. Na análise considerando apenas a presença ou

ausência do alelo polimórfico, encontramos que o alelo variante do SNP

rs9364554 foi estatisticamente associado a presença do CaP. A presença deste

49

alelo aumenta a predisposição a esta neoplasia em 2 vezes. Este SNP está

localizado no íntron 5 do gene SLC22A3 que atua na eliminação de algumas

drogas e toxinas ambientais. Grisanzio et al. (108), mostraram que a supressão

deste gene foi capaz de alterar algumas características fenotípicas associadas

ao CaP em linhagens celulares. Essas características dizem respeito

principalmente aos eventos associados à proliferação e viabilidade celular

mostrando, portanto, que este gene provavelmente está associado à iniciação

tumoral. Este fato é corroborado pela constatação de que a expressão de

SLC22A3 é inversamente correlacionada à progressão do CaP, visto que há uma

redução da expressão deste gene à medida que a doença avança (109). Variantes

em SLC22A3 também estão associadas com câncer colo retal (110) e com

mieloma múltiplo (111).

O SNP rs9364554 está associado à diminuição da transcrição de

SLC22A3 (108) e também já mostrou associação com a progressão do CaP (112).

Na população chinesa, não houve associação entre este polimorfismo e o CaP

(113). Não existem muitos trabalhos avaliando esta alteração no CaP, e, portanto,

consideramos relevante esse dado encontrado na população brasileira, visto que

tanto a presença do genótipo homozigoto polimórfico quanto do alelo polimórfico,

podem ser suficientes para elevar a predisposição à doença.

Também encontramos uma correlação significativa na comparação dos

grupos com o polimorfismo rs8072254, neste caso a presença do genótipo

homozigoto polimórfico foi mais frequente em pacientes do grupo controle, o que

nos faz supor que em condição de homozigose esse polimorfismo pode ser

considerado um SNP protetor, entretanto a distribuição do alelo polimórfico deste

SNP foi muito semelhante entre casos e controles. O SNP rs8072254 está

50

mapeado na terceira posição no elemento de resposta a andrógenos (ARE), que

são sítios de DNA reconhecidos pelo receptor de andrógeno (AR) (114, 115).

Estudos revelaram que o alelo variante (A) deste SNP é mais permissivo à

ligação com AR quando comparado com o alelo selvagem (G). Estes resultados

também foram encontrados em estudos in vitro, utilizando luciferase, onde foi

relatado que tanto a presença do alelo variante (A) quanto a presença do alelo

selvagem (G) são permissivos à ligação com AR, no entanto a ligação com o

alelo A é significativamente mais elevada do que com o alelo selvagem G. Isso

sugere que possa existir uma maior expressão de AR em CaP, devido à ligação

com o alelo variante A do SNP rs8072254.

Quando comparamos a distribuição dos polimorfismos com os pacientes

que possuíam CaP esporádico e CaP familiar, encontramos uma associação

significativa em relação ao SNP rs1271572, que está localizado na região

promotora do receptor de estrógeno beta ou ESR2. O genótipo polimórfico desta

alteração foi quase 3x mais presente nos pacientes que possuíam CaP

esporádico quando comparado aos indivíduos com CaP com história familiar da

doença (p=0,03). Em um estudo realizado na população chinesa, a frequência

deste polimorfismo foi significativamente menor nos casos de CaP que no grupo

controle (116). Existem poucos trabalhos na literatura relacionados a este SNP e

este trabalho realizado na população chinesa parece ser o único a associar esta

alteração específica ao CaP.

A importância dos estrógenos no desenvolvimento do trato reprodutivo

masculino tem sido cada vez mais reconhecida. Os estrógenos atuam através

dos receptores de estrógenos nucleares específicos (ESRs). O receptor de

51

estrógeno β (ERβ) ou ESR2 é altamente expresso no epitélio da próstata

sugerindo um efeito direto dos estrógenos nesse órgão (117, 118). A supressão do

ESR2 em animais leva a hiperplasia ventral da próstata, indicando que esta

molécula pode desempenhar um papel antiproliferativo nesse tecido (119, 120).

Alguns estudos confirmaram os sinais antiproliferativos deste gene no CaP, onde

observaram inibição da invasão e do crescimento do tumor bem como regulação

da apoptose (121, 122). Através da regulação da apoptose, ocorre a inibição da

proliferação de células cancerosas induzidas por 17 β-estradiol (estrógeno) e da

5α-diidrotestosterona em células de CaP sensíveis a andrógeno (LNCaP) (123).

Como dito anteriormente, ESR2 e AR são localizados e amplamente expressos

no epitélio da próstata (124). A redução da expressão de ESR2 em tumores

recorrentes privados de andrógeno ou após castração reflete a dependência de

andrógenos pela expressão de ESR2 no CaP humano (125, 126).

Foram realizados alguns estudos sobre o padrão de expressão de ESR2

em tecidos da próstata normal e maligno. Na maioria dos estudos, a expressão

de ESR2 diminui à medida que aumenta a graduação de Gleason, mas a

expressão deste gene se eleva novamente em lesões metastáticas (127-129).

Essas variações na expressão de ESR2 sugerem que este gene pode regular a

carcinogênese da próstata através de genes relacionados à proliferação celular

e apoptose, levantando a possibilidade de que as variantes de ESR2 podem

alterar o risco de CaP.

Aqui, não encontramos associação entre este polimorfismo e o

desenvolvimento do CaP ou a seus fatores prognósticos, entretanto

curiosamente, encontramos associação entre este SNP e os casos de CaP

52

esporádico. Nossos resultados são inéditos na literatura, uma vez que este

polimorfismo no gene ESR2 ainda não havia sido associado ao CaP

considerando o histórico familiar e a população brasileira. São necessárias

análises genéticas adicionais para melhor caracterização desta região para de

fato garantir a funcionalidade desta alteração.

Considerando os fatores prognósticos clássicos do CaP, para os valores

de PSA pré-operatório, encontramos significância estatística apenas para o SNP

rs3808330. Encontramos maior frequência do genótipo homozigoto polimórfico

no grupo de pacientes com PSA <10ng/ml. Este SNP está localizado no gene

EN2 e nosso trabalho é o primeiro a analisar esta mutação no CaP.

Os genes Engrailed (EN) são membros de uma família de fatores de

transcrição que contém um homeodomínio e apresentam um alto grau de

conservação funcional durante o desenvolvimento embrionário e na regulação

da tradução (74). EN foi primeiramente descrito como uma mutação em

Drosophila que resultou numa falha do desenvolvimento da extremidade que

divide a asa em compartimentos anterior e posterior. Genes homólogos de EN

estão presentes em vários grupos de animais. Os vertebrados têm dois genes

engrailed, o EN1 e EN2 que são mais ou menos equivalentes funcionalmente

(130, 131).

Estudos recentes têm mostrado que EN2 pode ser clinicamente útil como

um marcador de diagnóstico específico de CaP. Atualmente os testes usados na

prática clínica para detecção do CaP, incluem a dosagem do PSA, o exame de

toque digital e a realização de biópsias, e cada um destes testes apresentam

limitações significativas (132-134). Existe uma necessidade urgente de novos

53

biomarcadores para superar as limitações para detecção do CaP. Em 2011,

Morgan et al. (78) avaliaram o papel de EN2 no diagnóstico de CaP. Foi

demonstrado que EN2 é secretado na urina por células de CaP mas não por

tecido prostático normal. A expressão de EN2 foi confirmada nas linhagens

celulares PC3, DU145 e LNCaP e em tecidos de biópsias com CaP confirmado,

pela técnica de PCR em tempo real. Por imunohistoquímica também foi

confirmada a alta expressão da proteína EN2 nos tecidos de CaP e não nos

tecidos prostáticos normais ou na neoplasia intraepitelial prostática de alto grau

(135). Os níveis de EN2 foram medidos por ELISA em amostras de urina da manhã

e neste trabalho a presença de EN2 foi associada ao CaP, com uma

sensibilidade de 66% e uma especificidade de 88,2% sem necessidade de toque

digital retal (136).

Em face das potenciais utilidades clínicas do EN2 resolvemos investigar

se polimorfismos nesse importante marcador poderia estar associado a alguma

característica do CaP. Interessantemente, o SNP rs3808330 que avaliamos se

mostrou mais presente em pacientes que possuíam níveis menores de PSA.

Como ainda não existe nenhum trabalho avaliando essa alteração associada ao

CaP, não conseguimos definir precisamente o significado desta correlação, mas

podemos postular que por esta alteração ser na região promotora talvez ela

possa estar associada com uma baixa expressão do EN2, entretanto este fato

abre perspectivas para outras investigações.

Ainda nas comparações com fatores prognósticos do CaP, encontramos

associações para o SNP rs7501939. Este polimorfismo apresentou maior

frequência do genótipo homozigoto polimórfico em pacientes que apresentaram

54

menor escore Gleason e em pacientes que não apresentaram recorrência da

doença. Este polimorfismo está localizado no cromossomo 17q12 no segundo

íntron do gene HNF1β que é um fator de transcrição. HNF1β codifica três

isoformas em seres humanos. As isoformas HNF1β (A) e HNF1β (B) parecem

ser ativadores da transcrição, ao passo que a isoforma HNF1β (C) é um

repressor de transcrição (137). Existem diferenças na expressão das isoformas de

HNF1β entre tecidos normais e malignos da próstata, onde tumores de próstata

exibem maior expressão de HNF1β isoforma (B) do que o tecido normal (138). É

possível que variantes em HNF1β contribuam para a alteração da expressão

desta isoforma no CaP. Estudos de expressão gênica embrionária, mostram que

a expressão de HNF1β ocorre durante o desenvolvimento inicial do trato

urogenital humano (139). Embora o mecanismo biológico pelo qual HNF1β pode

afetar o risco de CaP ainda não tenha sido elucidado, a expressão diferencial

deste gene tem sido associada à recorrência do CaP (140).

Polimorfismos nesse gene, foram incialmente relatados como sendo

relacionados com o CaP em um estudo de associação do genoma (GWAS) na

Islândia (141) e posteriormente foi replicado em dois estudos adicionais no Reino

Unido (142) e nos Estados Unidos (143). Além disso essas alterações estão

associadas também a infertilidade masculina (144).

Em recente trabalho de Nikolic et al. (145) realizado na população sérvia, o

alelo polimórfico do SNP rs7501939 mostrou associação com o risco de CaP e

também com hiperplasia prostática benigna, porém não foi associado com os

parâmetros de progressão do CaP. Curiosamente, no estudo de Chornokur et al.

(98), este polimorfismo também foi associado ao risco de CaP, porém

55

exclusivamente em pacientes obesos. Em outro estudo, avaliando os

polimorfismos de HNF1β no CaP e em outras malignidades tais como colo retal,

pulmão, mama, melanoma e pâncreas, o SNP rs7501939 mostrou associação

somente com o risco de CaP (146). Este polimorfismo também já apresentou

associação com o CaP hereditário e com pacientes que tiveram diagnóstico

precoce da doença (147).

Como podemos perceber muitos trabalhos associaram este polimorfismo

ao desenvolvimento do CaP, mas não aos fatores prognósticos. Aqui em nosso

trabalho não encontramos associação com o desenvolvimento desta neoplasia

mas encontramos uma associação entre este polimorfismo e ausência de

recidiva bioquímica e com escore de Gleason mais baixo.

Ainda na comparação com o escore de Gleason, encontramos que o

genótipo homozigoto polimórfico do SNP rs5945572 foi mais frequente nos

pacientes com Gleason de baixo grau. O SNP rs5945572 está localizado no gene

NUDT11 (cromossomo X) que codifica isoformas de diphosphoinositol, que

determina a taxa de fosforilação no reparo do DNA, resposta ao stress e

apoptose (148). A inibição da expressão de NUDT11 influencia fenótipos celulares

associados a propriedades relacionadas a tumores em células de CaP. Na

linhagem celular LNCaP a supressão de NUDT11 inibiu a proliferação e a

formação de colônias bem como diminuiu a viabilidade celular (108).

Em um grande estudo genome-wide envolvendo as populações islandesa,

europeia e americana, o SNP rs5945572 apresentou forte associação com o CaP

(149). Este estudo foi replicado na população africana e a mesma associação foi

encontrada (102). Esta alteração também já foi associada com o risco de CaP em

56

famílias com membros acometidos (150). Este polimorfismo, porém, não

demonstrou associação com o CaP quando avaliado na população asiática. No

entanto, em outro estudo na população americana, este SNP não só foi

associado ao risco de CaP, (149) como também com pacientes que apresentaram

recidiva bioquímica (112). Em homens com ancestralidade europeia esta alteração

apresentou associação com o aumento do risco de CaP e com a gravidade dos

sintomas do trato urinário inferior (151).

De uma forma geral encontramos que alguns polimorfismos parecem ter

um papel relevante no desenvolvimento do CaP, na transmissão familiar e com

alguns fatores prognósticos. Estes importantes polimorfismos, ainda não haviam

sido estudados na população brasileira e em vários pontos, nosso trabalho

identificou correlações ainda não demonstradas na literatura. Acreditamos que o

valor da associação entre esses SNPs e o CaP em estudos posteriores poderá

auxiliar no desenvolvimento de ferramentas alternativas que possam auxiliar na

detecção precoce e na definição do prognóstico desta neoplasia.

Utilidades clínicas e avanços no futuro

O CaP representa uma condição fenotípica com relações multigênicas. O

valor preditivo de um determinado alelo é resultado de uma combinação entre o

odds radio e a frequência do alelo na população. O odds ratio de qualquer alelo

envolvido na promoção do CaP em uma determinada população, geralmente é

muito baixo, provavelmente devido aos vários caminhos genéticos possíveis que

podem estar relacionados ao desenvolvimento da doença. Embora o risco de

57

desenvolvimento do CaP em uma população associada com qualquer mutação

alélica seja baixo, quando se trata de uma mutação conhecida, o risco pode ser

bastante elevado para os indivíduos que possuem a alteração. Devemos

considerar a possibilidade de que, mesmo em famílias com uma forte história de

CaP, o desenvolvimento da doença pode não ser devido a uma única mutação,

mas sim a uma combinação poligênica de alelos de predisposição.

Devido à heterogeneidade do CaP no geral, os testes genéticos

representam um grande desafio técnico. Ainda assim, os avanços tecnológicos

da atualidade permitem testar a presença de muito mais loci que no passado. O

sequenciamento completo do genoma é hoje uma realidade e está se tornando

cada vez mais viável comercialmente. Embora a tecnologia de sequenciamento

ainda não tenha atingido a confiabilidade nem a capacidade de interpretação

necessária para ser usada na triagem em massa, as técnicas estão melhorando

rapidamente. No momento, o PSA continua a ser a principal ferramenta para

avaliar o risco de CaP. No entanto, é provável que no futuro, os testes genômicos

irão melhorar a estratégia de diagnóstico do teste do PSA.

Diversos estudos já mostraram avanços que podem ser aliados a práticas

já estabelecidas. Em um estudo GWAS realizado na Islândia, alelos localizados

nos cromossomos 10q26, 12q24 e 19q13.33 foram associados com altos níveis

de PSA e com biópsias prostáticas negativas (152). Um outro estudo com 505

homens mostrou que diversos SNPs nos cromossomos 10 e 19 modificaram

significativamente o risk ratio para CaP e não mostraram qualquer relação com

os níveis de PSA (153). Uma avaliação similar de um painel com alguns desses

58

alelos em diferentes populações mostrou redução na necessidade de biópsias

(154).

Modelos de risco futuros úteis no ambiente clínico provavelmente irão

incorporar vários loci de risco ao invés de variantes individuais e podem ser

dependentes da origem étnica de cada paciente. A combinação entre

ferramentas genéticas e informações clínicas conduziram a geração de um novo

foco na medicina: o tratamento do câncer personalizado. Esta nova meta não

envolve somente ferramentas para a detecção do câncer com novos

biomarcadores, mas também a melhoria na eficácia das ferramentas genéticas

e nas tecnologias de sequenciamento de nova geração para pacientes com

câncer e seus familiares. Estas novas abordagens irão oferecer a possibilidade

de detecção mais precoce da patologia e um tratamento diferente ou específico,

dependendo do genótipo do indivíduo. Isso permitirá a criação de diferentes

protocolos para o tratamento de cânceres mais agressivos e a possibilidade de

realizar controles preliminares em famílias consideradas de risco. Embora muitos

passos significativos no tratamento do CaP tenham sido dados no que diz

respeito a assuntos clínicos e informações genéticas, ainda há um longo

caminho a ser percorrido.

Limitações do estudo

Nosso trabalho envolveu a análise de 13 polimorfismos associados a

fatores de risco para o desenvolvimento do CaP em 185 indivíduos

diagnosticados com a neoplasia e 70 indivíduos saudáveis. Como fatores

59

limitantes do nosso estudo destacamos o relativo pequeno número de pacientes

incluídos no trabalho, embora o mesmo tenha se baseado em outros estudos da

literatura sabemos que estudos de polimorfismos genéticos podem ter uma

amostra muito grande normalmente até captada em diversos centros.

60

6. CONCLUSÕES

61

Através das análises realizadas concluímos que os SNPs rs10486567

(JAZF1) e rs9364554 (SLC22A3) estão associados ao CaP e que seus alelos

polimórficos aumentam em 2 vezes a predisposição para esta neoplasia. O

polimorfismo rs8072254 (AR) parece exercer um efeito protetor para o CaP e o

SNP rs1271572 (ESR2) foi mais frequente no grupo de pacientes com CaP

esporádico.

Considerando os fatores prognósticos do CaP concluímos que o SNP

rs3808330 (EN2) está associado com menores níveis de PSA. O polimorfismo

rs7501939 (HNF1β) está associado a menor escore de Gleason e a ausência de

recidiva bioquímica. O SNP rs5945572 (NUDT10/11) apresentou associação

com menor escore de Gleason.

62

7. ANEXOS

63

Anexo 1. Questionário aplicado aos pacientes com CaP

Questionário

Nome: Idade:

Parentes de 1º grau com CP? ( ) sim ( ) não

Quantos?

Qual a idade aproximada que tinham quando o câncer foi descoberto?

São pacientes do Dr. Miguel Srougi? ( ) sim ( ) não

Se sim, qual o nome?

Caso possua parentes de 1º grau com CP, tem algum irmão com mais de 55 anos sem CP? ( ) sim ( ) não

Se sim, e ele também for paciente do Dr. Miguel, gostaríamos que ele participasse do estudo. Você poderia nos fornecer nome e telefone?

Atualização de endereço:

E-mail:

Fez uso de hormônios?

Fez radioterapia?

Fez uso de outros medicamentos para próstata?

Existem outros tipos de tumores na família?

64

8. REFERÊNCIAS

65

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Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à hereditariedade… · 2018. 2. 16. · NAYARA IZABEL VIANA Correlação entre polimorfismos genéticos relacionados à