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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Agrícola
Dissertação
Criopreservação de sêmen de galos
Guilherme Martino van der Laan
Pelotas, Novembro 2007.
Guilherme Martino van der Laan
CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN DE GALOS
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Pelotas, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Agrícola, para a obtenção do título de Mestre em
Ciências (área de conhecimento: Reprodução
Animal).
Orientador: Dr. João Carlos Deschamps, M.V., PhD .
Co-Orientador: Dra. Denise Calisto Bongalhardo, M.V., PhD.
Pelotas Rio Grande do Sul – Brasil
Novembro, 2007
Dados de catalogação na fonte: Patrícia de Borba Pereira Bibliotecária CRB10/1487
V217c Van der Laan, Guilherme Martino Criopreservação de sêmen de galos / Guilherme
Martino van der Laan;. – Pelotas : Ufpel, 2007. 56p. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Agrícola. Centro de Biotecnologia. Universidade federal de Pelotas, Pelotas,2007. 1. Galos 2.Criopreservação. 3.LDL 4. Sêmem I.Deschamps, João Carlos orientador II. Bongalhardo, Denise Calisto CDD 636.5
Banca Examinadora: Prof. Dr. João Carlos Deschamps (Orientador – FV/UFPel)
Profa. Dra. Denise Calisto Bongalhardo (IB/UFPel)
Prof. Dr. Thomaz Lucia Junior (FV/UFPel)
Prof. Dr. Márcio Nunes Corrêa (FV/UFPel)
Prof. Dr. Tiago Collares (IB/UFPel)
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me guiado durante toda minha trajetória de
vida.
À Universidade Federal de Pelotas, em especial ao Centro de Biotecnologia
por me proporcionarem todas as condições para a realização deste projeto para a
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Ao orientador João Carlos Deschamps pelo esforço em disponibilizar todo o
necessário para realização do trabalho.
Ao diretor e funcionários do Biotério Central e do Conjunto Agrotécnico
Visconde da Graça (CAVG) por nos proporcionarem estrutura e materiais
necessários para o desenvolvimento do projeto.
Em especial gostaria de agradecer a Profa. Dra. Denise Calisto Bongalhardo
por todo ensinamento técnico, colaboração e incondicional auxílio para a finalização
desta dissertação.
Aos alunos da graduação que contribuíram imensamente para a realização
deste trabalho, Ciciane, Éder e Rossana, vocês estão de parabéns!
Agradeço também aos grandes amigos e colegas da pós-graduação em
Veterinária e Biotecnologia: Priscila De Leon, Elisa Santos, Gissele Rambo, Eduardo
Xavier, Marcelo Vieira, Rafael Tonieto, Carine Corcini, Vinícius Campos, Marta
Amaral e Tiago Colares, pela troca de experiências e por toda ajuda que todos, de
uma maneira ou de outra, o fizeram.
E agradeço com muito amor e muita gratidão à minha família, Pai, Mãe, Ana
e Ane. A minha paixão da vida, Beta, pelo amor, compreensão, apoio incansável e
auxílio indispensável durante este período.
...mais uma etapa vencida!
À vocês,
MUITO OBRIGADO!
“O que realmente importa na vida não
são os objetivos a que nos propormos,
mas os caminhos que seguimos para
alcançá-los.”
Peter Bamm
vi
Resumo
VAN DER LAAN, Guilherme Martino. Criopreservação de sêmen de galos. 2007. 56f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A adição de diluentes ao sêmen de aves é uma prática rotineiramente empregada em programas de inseminação artificial para melhorar o manejo de machos geneticamente superiores. A fertilidade do sêmen fresco normalmente decai 1 hora após a coleta, por isso a necessidade do uso de diluentes e temperaturas hipotérmicas para o armazenamento do sêmen por períodos mais prolongados. A Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL), extraída da gema de ovo, tem sido utilizada na composição de diversos diluentes de sêmen para mamíferos, porém, ainda não tinha sido avaliada a sua aplicação em diluentes de resfriamento para sêmen de aves. Em relação ao congelamento, diversos métodos foram desenvolvidos ao longo dos anos. Uma das alternativas é o uso da Dimetilacetamida (DMA) como crioprotetor. Os melhores resultados obtidos com DMA ocorrem quando o sêmen é submetido ao congelamento ultra-rápido na forma de pellets e a um rápido descongelamento à 60ºC. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de protocolos de preservação de sêmen de galos, enfocando o uso de Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDL) como um componente do diluente para resfriamento, e a Dimetilacetamida (DMA) como crioprotetor interno para o congelamento. Para isto, foi verificado o efeito da adição de diferentes níveis de lipossomas de LDL na composição do diluente de resfriamento, sobre as características de qualidade do sêmen resfriado à 5°C. Também foi avaliada a qualidade do sêmen congelado utilizando DMA como crioprotetor, envasado em palhetas ou pellets, e descongelados em três diferentes temperaturas. Os resultados obtidos nestes estudos nos permitiram concluir que: a adição de lipossomas de LDL ao diluente de resfriamento mantém a qualidade geral dos espermatozóides quando adicionado na proporção de 6%; sugerindo que melhorias na fertilidade podem ser obtidas desde que seja respeitado um limite de adição desta lipoproteína ao diluente; a temperatura corporal (40˚C) foi a mais apropriada para descongelamento de sêmen criopreservado com DMA; e ainda, o envase em palhetas é mais eficiente em relação ao pellet. Esta última observação é de grande valor, visto que o armazenamento do sêmen em palhetas é mais adequado por razões sanitárias, e mais conveniente para a identificação dos ejaculados, especialmente para a aplicação a campo de bancos genéticos. Palavras-chave – criopreservação, dimetilacetamida, resfriamento, lipossomas, LDL, diluentes.
Abstract
VAN DER LAAN, Guilherme Martino. Roosters Sperm Cryopreservation. 2007. 56f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Agrícola. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Adding extenders to poultry semen is currently used in artificial insemination programs to optimize the management of genetically superior males. Fresh semen fertility usually declines after 1 hour of collection, raising the need to use diluents and low temperatures to store semen for longer periods. Low density lipoprotein (LDL), extracted from the egg yolk, is used as a component of various mammalian semen diluents, however its application on poultry semen has not been evaluated. Regarding cryopreservation, different methodologies have been developed during the past years. One alternative is to use dimethylacetamide (DMA) as a cryoprotectant. The best results with DMA are obtained when semen is subjected to ultra-fast freezing, in pellets, and to a fast thawing at 60ºC. The objective of this work was to establish protocols to preserve rooster sperm, focusing on the use of LDL as a component of the refrigeration diluent, and on DMA as a internal cryoprotectant for freezing. To reach these objectives, the effect of adding different levels of LDL liposomes to the cooling diluent, upon the quality characteristics of semen refrigerated at 5°C, was evaluated. The quality of semen frozen with DMA, packed in straws or pellets, and thawed in three different temperatures was also evaluated. The results obtained allow to conclude that: adding 6% of LDL liposomes to the cooling diluent preserves the general sperm quality, suggesting that improvements on fertility could be obtained if a limit in lipoprotein supplementation is imposed; body temperature (40˚C) is most suitable for thawing sperm frozem with DMA; and packing sperm in straws is more efficient than packing in pellets. This last observation is of great value, since storing semen in straws is more appropriate due to sanitary reasons, and more convenient for ejaculates identification, especially for field application of genetic banks. Key words – cryopreservation, dimethylacetamide, resfrigeration, liposomes, LDL, diluents.
LISTA DE FIGURAS
Artigo 2.1
Figura 1 - Motilidade do sêmen de galos submetidos aos tratamentos com
diferentes níveis de lipossomas de LDL. ..............................................
26
Figura 2 - Regressão linear da motilidade do sêmen resfriado a 5˚C, por
tratamento, em função do tempo de acondicionamento a 5˚C. ............
27
Figura 3 -
Figura 4 -
Figura 5 -
Regressão linear para Integridade de membrana espermática, por
tratamento em função do tempo de acondicionamento a 5˚C. ...........
Número de furos na membrana perivitelina interna do ovo (IPVL) de
galinha, penetrada por espermatozóide de galo....................................
Fotos tiradas em microscópio de campo escuro (aumento – 400X)
dos furos típicos realizados pelos espermatozóides incubados com a
membrana perivitelina interna do ovo (IPVL). Grupo controle (A) e
tratamento T6 (B), não diferem estatisticamente entre eles..................
29
30
31
Artigo 2.2
Figura 1 -
Figura 2 -
Médias e erro padrão para motilidade (E) e penetração espermática
(D) de sêmen de galos descongelados em três diferentes
temperaturas..........................................................................................
Médias e erro padrão para Penetração Espermática (furos/mm2) de
sêmen de galos, armazenados em palhetas ou em pellets, e
descongelados em três diferentes temperaturas. ...............................
44
Figura 3 - Médias e erro padrão para Motilidade (%) de sêmen de galos,
armazenados em palhetas ou em pellets, e descongelados em três
diferentes temperaturas. .....................................................................
45
Figura 4 - Médias e erro padrão para Integridade de (E) e Penetração
Espermática (D) do sêmen congelado em pellets e palhetas. ..............
45
44
LISTA DE TABELAS
Artigo 2.1
Tabela 1 - Médias e erro padrão para Motilidade espermática do sêmen de galos
resfriado a 5˚C, nos diferentes tratamentos por período de
estocagem. ..........................................................................................
25
Tabela 2 - Percentual de Integridade de Membrana (médias e erro padrão) por
tratamento e período de estocagem. .................................................
28
Tabela 3 - Penetração espermática em IPVL (n˚ de furos por mm2) nos
tratamentos...........................................................................................
30
SUMÁRIO
1 Introdução Geral.......................................................................................... 2 Artigos
2.1 Efeito da lipoproteína de baixa densidade (LDL) no resfriamento do
sêmen de galo (Gallus gallus).......................................................................
12
17
2.1.1 Introdução ............................................................................................ 20
2.1.2 Materiais e Métodos ............................................................................ 22
2.1.2.1 Animais ............................................................................................. 22
2.1.2.2 Extração do LDL / Preparo dos Lipossomas .................................... 22
2.1.2.3 Diluente ............................................................................................ 23
2.1.2.4 Coleta de Sêmen .............................................................................. 23
2.1.2.5 Avaliação dos ejaculados ................................................................ 24
2.1.2.6 Análise estatística ............................................................................ 25
2.1.3 Resultados .......................................................................................... 25
2.1.4 Discussão ........................................................................................... 30
2.1.5 Referências ........................................................................................ 32
2.2 Comparação entre forma de envase e temperatura de descongelamento
de sêmen de galos congelado com dimetilacetamida (DMA)...........................
2.2.1 Introdução ...........................................................................................
2.2.2 Materiais e Métodos ...........................................................................
2.2.2.1 Animais ............................................................................................
2.2.2.2 Coleta de Sêmen e Diluição .............................................................
2.2.2.3 Procedimentos de congelamento .....................................................
2.2.2.4 Procedimentos de descongelamento ...............................................
2.2.2.5 Teste da qualidade do sêmen ..........................................................
2.2.2.6 Análise estatística ............................................................................
2.2.3 Resultados ..........................................................................................
2.2.4 Discussão ...........................................................................................
2.2.5 Referências .........................................................................................
35
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3 Conclusões...................................................................................................
4 Considerações finais..................................................................................
Referências...................................................................................................
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52
12
1 INTRODUÇÃO GERAL
A identificação e a seleção de reprodutores com características de valor
econômico para a indústria de aves é dependente de seleção genética (AMANN,
1999). Neste processo, os machos são considerados mais importantes do que as
fêmeas, visto que um macho pode gerar, por ano, uma progênie muito maior do que
uma fêmea. Portanto, melhorias na progênie são adquiridas com mais eficácia
através da seleção de um número pequeno de machos com alto potencial genético
(HAMMERSTEDT, 1999).
Na indústria de perus, o uso de inseminação artificial é o meio mais eficiente
para obtenção de progênie (ETCHES, 1996; DONOGHUE et al., 1998; DONOGHUE,
1999). Inseminação artificial também é utilizada na indústria de aves de postura
(ETCHES, 1996), enquanto na indústria de aves de corte a monta natural ainda é
usada exclusivamente. Entretanto, devido à intensa seleção de machos pelas
características de crescimento e eficiência de processamento, a inseminação
artificial poderá ser obrigatória na indústria de aves de corte, a exemplo do que
ocorreu com a indústria de perus (REDDY, 1995).
Benefícios oriundos da inseminação artificial incluem a eliminação de
incompatibilidade física ou comportamental entre machos e fêmeas, a eliminação do
estresse associado com a alimentação inadequada dos galos, a seleção de machos
baseada na qualidade do ejaculado (SINGH, 1999) e a maximização do número de
pintinhos produzidos por um único macho, visto que esta técnica é capaz de
aumentar em até 10 vezes o número de pintinhos produzidos, por ejaculado, em
comparação com a monta natural (AMANN, 1999).
A adição de diluentes ao sêmen, além de maximizar o uso do ejaculado,
diminui os custos da inseminação artificial (CHRISTENSEN, 1995) e por este motivo,
vários diluentes têm sido desenvolvidos e vem sendo utilizados comercialmente.
Entretanto, a preservação do sêmen de galos, diluído por mais de 24 horas, resulta
em diminuição da fertilidade (BAKST; CECIL, 1992). Melhorias na habilidade de
preservação do sêmen seriam benéficas, não somente para aumentar o potencial de
13
uso da inseminação artificial (BLESBOIS; GRASSEAU, 1998), mas também pela
perspectiva promissora da comercialização de sêmen em nível industrial (BAKST;
CECIL, 1992).
Para a preservação do sêmen por longos períodos, é necessária a adição de
crioprotetores ao diluente. Vários crioprotetores vem sendo testados na tentativa de
congelar o sêmen de aves (LAKE; RAVIE, 1984; TSELUTIN et al., 1995; WISHART,
1997), sendo que o glicerol tem sido o mais efetivo no que se refere à proteção da
célula espermática (MAEDA et al., 1984; DONOGHUE; WISHART, 2000).
Hammerstedt e Graham (1992) discutiram as vantagens e desvantagens
relacionadas ao uso do glicerol como crioprotetor em aves. Dois problemas
persistentes são: seu efeito contraceptivo quando no trato da fêmea, e danos
sofridos pelo espermatozóide durante a sua remoção (GILL et al., 1996). O efeito
contraceptivo do glicerol ainda é desconhecido, mas pode estar relacionado com o
choque osmótico que ocorre dentro do oviduto; provavelmente o influxo de água na
célula hiperosmótica seja mais rápido que o efluxo de glicerol, provocando o
rompimento da membrana espermática (LAKE; RAVIE, 1984). Portanto, a remoção
do glicerol antes da inseminação torna-se fundamental para que se obtenha
fertilidade (BUSS, 1993; VAN VOORST; LEENSTRA, 1995; IAFFALDANO;
MELUSSI, 2003). A lavagem do sêmen descongelado com Accudenz mostrou-se o
melhor método para remoção do glicerol quando comparado com a remoção por
diálise ou por centrifugação em gradiente de densidade de Percoll (LONG;
KULKARNI, 2004), entretanto a fertilidade obtida por este método ainda é baixa.
Como alternativa, o efeito protetor conferido pela dimetilacetamida (DMA) e
a possibilidade de usar o sêmen sem que a mesma seja removida antes da
inseminação, são vantagens que encorajaram o uso deste crioprotetor para o
congelamento do sêmen de aves (LAKE; RAVIE, 1984). Segundo Challah et al.
(1999), a fertilidade obtida com sêmen congelado com DMA é comparável àquela
obtida com sêmen fresco, especialmente quando armazenado na forma de pellets
(TSELUTIN et al., 1999). Quando este crioprotetor é utilizado, a porcentagem de
espermatozóides viáveis aumenta quando é feito o resfriamento rápido ao invés do
resfriamento lento, sendo que quanto maior a taxa de DMA, maior a viabilidade do
espermatozóide (BLANCO et al., 2000).
14
Independentemente do crioprotetor utilizado, a diminuição na fertilidade
observada após inseminação com sêmen armazenado é atribuída aos danos na
membrana do espermatozóide (DONOGHUE et al., 1996; MAEDA et al., 1986).
Motilidade, viabilidade e integridade morfológica do espermatozóide de galos
(MAHAPATRA et al., 1994) e perus (DOUARD; HERMIER; BLESBOIS, 2000)
diminuem durante armazenagem do sêmen. Embora Bakst e Sexton (1979) sugerem
que as glicoproteínas de membrana envolvidas nos processos de reconhecimento e
ligação do gameta não sejam afetadas pela criopreservação, foi observado que um
menor número de espermatozóides é capaz de hidrolizar a membrana perivitelina
interna do ovo (ALEXANDER et al., 1993; DONOGHUE, 1996).
Os danos na membrana são atribuídos principalmente à formação de cristais
de gelo que ocorre durante o processo de congelamento e descongelamento. A
velocidade destes processos afeta o tamanho e o local de maior formação dos
cristais (dentro ou fora da célula), que por sua vez determinam o grau de prejuízo à
membrana. A formação de cristais de gelo pode ser evitada através de uma troca
ultra-rápida de temperatura, quando a água irá formar uma estrutura única, mas
instável, semelhante ao vidro (HAMMERSTEDT, 1995).
A baixa fertilidade observada após estocagem in vitro do sêmen, contrasta
com a habilidade do espermatozóide em manter sua capacidade de fertilização após
várias semanas armazenado in vivo, dentro das glândulas hospedeiras de
espermatozóides da fêmea. Provavelmente estas glândulas possuem mecanismos
especiais que auxiliam na sobrevivência do espermatozóide, como mecanismos
para estabilização das membranas e inibição da motilidade e da atividade
enzimática (BAKST; CECIL, 1992). Existem suposições de que, a sobrevivência do
espermatozóide nas glândulas hospedeiras, seja dependente da modulação lipídica
das membranas através de mecanismos semelhantes à adição de lipossomas:
vesículas membranosas liberadas das extremidades das microvilosidades da
superfície apical das células epiteliais glandulares, com comportamento semelhante
à lipossomas, contribuiriam para a manutenção da membrana plasmática do
espermatozóide armazenado na glândula (BAKST, 1993).
Os fosfolipídios predominantes no sêmem fresco de aves são: a
fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina (RAVIE; LAKE, 1985; PARKS; LYNCH,
1992; BLESBOIS et al., 1997; BLESBOIS; LESSIRE; HERMIER, 1997; CEROLINI et
15
al., 1997a, 1997b), que diminuem drasticamente em resposta à criopreservação
(BLESBOIS et al., 1997), concomitantemente com diminuição da motilidade do
espermatozóide e da fertilidade. A diminuição no conteúdo de fosfolipídios pode ser
explicado pela lise de fosfolipídios, seguida por metabolismo endógeno, ou por uma
combinação complexa de lise, metabolismo e peroxidação (DOUARD; HERMIER;
BLESBOIS, 2000).
A fusão de lipossomas mostrou-se benéfica para a preservação de
espermatozóides de bovinos (GRAHAM; FOOTE, 1987), ovinos (HOLT; NORTH,
1988) e suínos (HE, 1997; HE; BAILEY; BUHR, 2001). Em aves, foi demonstrado
que o uso de proteolipossomas contendo principalmente fosfatidilcolina e
fosfatidiletanolamina (40% de cada) promove incrementos na motilidade e
viabilidade do espermatozóide de galos após quatro horas de armazenamento à
temperatura ambiente (BONGALHARDO; BUHR, 2002).
Um componente comumente utilizado em diluentes de sêmen é a gema de
ovo. A maioria das propriedades da gema do ovo são atribuídas ao seu conteúdo de
lipoproteínas de baixa densidade (LDL), cujos principais fosfolipídios são a
fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina (ANTON et al., 2003). De acordo com
Bergeron et al. (2004), a membrana do espermatozóide incorpora fosfolipídios e
colesterol da LDL. Lipoproteínas de alta densidade (HDL) estão presentes no
plasma seminal de aves, entretanto LDLs não foram detectadas (BLESBOIS;
HERMIER, 1990). Estes autores demonstraram que a substituição do plasma
seminal por uma solução contendo HDL de aves, em concentrações fisiológicas, não
alterou a fertilidade do sêmen de galo armazenado a 4°C por 24 horas, entretanto
concentrações maiores de HDL foram prejudiciais ao espermatozóide. A adição de
LDL aos diluentes para congelamento mostrou-se benéfica para os espermatozóides
de eqüinos (MARTIN, 2005) e caninos (VARELA JR, 2005). Trabalhos enfocando o
uso de LDL nos diluentes de sêmen de aves não foram encontrados.
O objetivo geral desta dissertação foi a melhoria da qualidade do sêmen de
galos, seja ele resfriado ou congelado. Para alcançar este objetivo, foi fundamental a
compreensão das modificações que ocorrem no espermatozóide após a coleta,
durante resfriamento e congelamento do sêmen; desenvolver alternativas para
combater a degradação do espermatozóide decorrente do processo de
criopreservação; e utilizar técnicas de maneira objetiva e confiável através de testes
in vitro, para avaliar o potencial de fertilização do sêmen processado.
16
Os objetivos específicos foram: 1) o desenvolvimento de diluentes de
resfriamento compostos com diferentes concentrações de Lipossomas de LDL; 2)
comparar a qualidade do sêmen congelado utilizando Dimetilacetamida como
crioprotetor, armazenados em pellets ou palhetas e descongelados e 3 diferentes
temperaturas; 3) avaliação da qualidade do espermatozóide através de testes de
viabilidade, motilidade e penetração na membrana perivitelina interna do ovo, antes
e após o processamento, para identificar possíveis alterações no potencial de
fertilização do mesmo.
17
2.1 ARTIGO
“Efeito da lipoproteína de baixa densidade sobre a qualidade do sêmen resfriado de galos”
18
EFEITO DA LIPOPROTEÍNA DE BAIXA DENSIDADE SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN RESFRIADO DE GALOS
Van der Laan, G.M.1; Marten, C.P.2; Oliveira, E.B.2; Deschamps, J.C.1; Bongalhardo, D.C.3
1Laboratório de Reprodução Animal, Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, Brasil;
2 Graduandos da Faculdade de Medicina Veterinária – UFPEL; 3 Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, Brasil.
RESUMO
A preservação de sêmen de aves diluído e resfriado por mais de 24 horas resulta em diminuição da fertilidade. O presente estudo teve como objetivo obter melhorias na preservação de sêmen de galos, através da adição de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) ao diluente de resfriamento. A metodologia empregada na pesquisa baseou-se na avaliação do sêmen submetido a testes de motilidade (MOT), integridade de membrana (IM) e penetração espermática (PE), por um período de 5 dias após a adição de 0, 6, 8 e 10% de lipossomas de LDL ao diluente Beltsville Poultry Semen Extender (BPSE). Logo após a coleta, foi feito um pool de sêmen, que foi dividido em 4 alíquotas. Cada alíquota foi então diluída com BPSE (1:1, vol:vol) contendo 0% (controle), 6, 8 e 10% de lipossomas de LDL. As amostras foram então resfriadas a 5°C por 5 dias, sendo que a qualidade do sêmen foi verificada antes do resfriamento (0 hora) e após 24, 48, 72 e 96 horas de resfriamento. Após 5 repetições, observou-se que a adição de lipossomas no tratamento T6 não foi diferente (P>0,05) ao tratamento T0 (controle) para MOT, enquanto que o tratamento T10 apresentou os menores valores (45.2 ± 2,8), diferindo significativamente dos grupos T0 e T6 (66.1 ± 2,3 e 63.6 ± 2,9 respectivamente). Com relação ao tempo de resfriamento, observou-se uma diminuição significativa (P<0,05) em MOT e VIG após 24h de resfriamento, enquanto que IM e PE mantiveram constante durante as 96 horas de resfriamento. Ao analisar o efeito de tratamento dentro de tempo de resfriamento, observou-se que IM teve médias mais altas nos tratamentos T6 e T8 (81.4 ± 1,7 e 82.7 ± 1,3) , porem não diferiram estatisticamente dos tratamentos T0(controle) e T10 (73.0 ± 2,5 e70.5 ± 4,1 respectivamente). Os presentes resultados demonstram que a adição de Lipossomas de LDL ao diluente de resfriamento de sêmen de galos manteve a qualidade dos espermatozóides no tratamento com
19
adição de 6% de LDL, em relação ao tratamento controle. Sugerem também que melhorias na fertilidade podem ser obtidas, desde que seja respeitado um limite de adição desta lipoproteína ao diluente. Palavras-chave – galos, integridade de membrana, resfriamento, lipossomas, LDL, diluentes.
20
ABSTRACT
Preservation of diluted poultry semen for more than 24 hours results in decreased fertility. The present study aimed to obtain improvements in rooster semen preservation by adding low density lipoproteins (LDL) to the cooling extender. The methodology used was based on the evaluation of sperm motility (MOT), membrane integrity (MI), and sperm penetration (SP) for a period of 5 days after adding LDL liposomes to Beltsville Poultry Semen Extender (BPSE). After collection, semen was pooled and split into 4 aliquots. Each aliquot was diluted with BPSE (1:1, vol:vol) containing 0% (control), 6, 8, and 10% of LDL liposomes. Samples were refrigerated at 5°C for 5 days, and semen quality was evaluated before cooling (hour 0) and after 24, 49, 72, and 96 hours of refrigeration. After 5 repetitions, it was observed that MOT in T6 treatment did not differ (P>0.05) from the T0 (control), while T10 showed the lowest values (45.2 ± 2.87), being significantly different from T0 and T6 (66.1 ± 2.35 and 63.6 ± 2.90, respectively). Regarding refrigeration time, a significant decrease (P<0.05) in MOT and VIG after 24h was observed, while MI and SP remained constant during the 96 hours of cooling. When analyzing treatment effect within refrigeration time, it was observed that MI had higher values at T6 and T8 (81.4 ± 1.7 and 82.7 ± 1.3), but they were not statistically different from T0 and T10 (73.0 ± 2.5 and 70.5 ± 4.1, respectively). The present results allow to conclude that adding 6% of LDL liposomes to the cooling diluent preserves the general sperm quality, suggesting that improvements on fertility could be obtained if a limit in lipoprotein supplementation is imposed. Key words – rooster, membrane integrity, refrigeration, liposomes, LDL, diluents. 1. Introdução
Sêmen resfriado de aves vem sendo progressivamente utilizado em
programas de inseminação artificial, para aperfeiçoar o manejo de machos
geneticamente superiores. Dessa forma, produzindo maior quantidade e qualidade
de pintos, gerando o máximo de retorno econômico para a indústria avícola.
No entanto, a habilidade fertilizante do sêmen fresco armazenado in vitro
usualmente decai em até 1 hora após a coleta. Para armazenar sêmen de galos por
períodos superiores a 24 horas (BLESBOIS; SEIGNEURIN, 1997), é necessário o
uso de um diluente salino tamponado e de equilibrada osmolaridade, e ainda, usar
21
temperaturas hipotérmicas entre 2 e 5°C para limitar a dissipação excessiva de
energia, na intenção de reter o metabolismo e a capacidade de fusão dos gametas
(CLARKE; SEXTON; OTTINGER, 1982).
Um dos crioprotetores externos mais utilizados em diluentes é a gema de
ovo. Esta é associada com aumento na habilidade fertilizante do espermatozóide
quando presente em diluentes de sêmen (DUNN; BRATTON; COLLINS, 1950;
SHANNON e CURSON, 1983), em razão de possuir em sua constituição a
lipoproteína de baixa densidade (LDL), cujos principais fosfolipídios são a
fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina (ANTON et al, 2003). Um dos possíveis
mecanismos de proteção atribuído à LDL seria a sua associação com a membrana
espermática do espermatozóide (BERGERON et al, 2004; WATSON, 1981).
Foulkes (1977) e Graham e Foote (1987) sugerem que a LDL pode-se aderir
à membrana da célula espermática durante o processo de preservação espermática.
Segundo Anton et al.(2003), a LDL forma uma película interfacial entre ácidos
graxos e a água. Além disto, Bergeron et al. (2004) descreveram que a LDL
promove um seqüestro da maior parte das proteínas presentes no plasma seminal,
formando um complexo, de modo que estas não fiquem disponíveis para atuarem na
membrana. Desta forma, a LDL confere a célula espermática uma maior resistência
ao choque térmico por redução dos efeitos nocivos das proteínas do plasma seminal
na membrana espermática.
A adição de LDL aos diluentes para congelamento ou resfriamento de
sêmen mostrou-se benéfica para espermatozóides de eqüinos (MARTIN, 2005),
bovinos (PACE, 1974, GRAHAM; FOOTE, 1987), suínos (DEMANIOWICZ;
STRZEZEK, 1996) e caninos (VARELA JUNIOR, 2005). Trabalhos enfocando o uso
de LDL nos diluentes de sêmen de galos não foram conduzidos.
O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da adição de lipossomas de LDL
na composição do diluente de resfriamento, sobre as características de qualidade do
sêmen de galos, refrigerados a 5°C.
22
2. Materiais e Métodos
Neste estudo foi avaliada a adição de Lipossomas de LDL ao diluente
Beltsville Poultry Semen Extender (BPSE) (SEXTON, 1977) em 4 tratamentos: um
controle (T0) sem adição de lipossomas de LDL ao diluente, e outros 3 tratamentos
com respectivamente 6 (T6), 8 (T8) e 10% (T10) de lipossomas de LDL ao diluente
BPSE.
A metodologia empregada na pesquisa baseou-se na avaliação do sêmen
submetido aos tratamentos, resfriado a 5°C em câmara fria pelo período de 5 dias. A
qualidade do sêmen foi verificada através de testes de motilidade (MOT),
integridade de membrana (IM) e penetração espermática (PE) nas subseqüentes 0,
24, 48, 72 e 96 horas de resfriamento. Foram realizadas 5 repetições destes
tratamentos.
2.1 Animais
Um total de 15 galos de Linhagem Embrapa–051 (Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária) originada do cruzamento das raças Plymouth Rock White e
Rhode Island Red, foram usados neste estudo no Laboratório de Reprodução
Animal do Centro de Biotecnologia da UFPEL. Os animais foram alojados em
gaiolas individuais, alimentados com ração contendo 2850 Kcal de energia, 12,5 %
de proteína bruta, 3,34% de gordura, 3,54% de fibra, 0,67% de fósforo e 1% de
cálcio, tendo acesso ad libitum a esta ração e a água.
2.2 Extração do LDL / Preparo dos Lipossomas
Para a extração da Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL) da gema de ovo
tomou-se como base o método desenvolvido por Moussa et al. (2002).
Foram coletados ovos frescos de galinhas poedeiras provenientes do
Conjunto Agrotécnico Visconde da Graça (CAVG – UFPel). Os ovos foram
quebrados manualmente e a gema separada da clara (albúmen). Cada gema foi
cuidadosamente rolada em papel filtro para a remoção da chalaça e traços de claras
aderidos a membrana vitelina. Esta membrana foi então rompida com a ajuda de
uma agulha, e a gema coletada em um Becker resfriado em gelo.
23
A fração plasmática da gema é separada por adição de solução salina (0,17
M NaCl), sendo diluída duas vezes (peso/peso) e misturada por 1 hora, de acordo
com McBee e Cotterill (1979). Após homogeneização, a solução foi centrifugada por
45 minutos a 7.840 RPM, em temperatura de 4°C. O sobrenadante foi centrifugado
novamente para a completa remoção de grânulos, e, mantido a 4°C. O plasma foi
então misturado a 40% de Sulfato de Amônia por 1 hora para precipitação. O pH do
plasma foi fixado e controlado a 8.7 e a temperatura fixada a 4°C, em seguida foi
centrifugado a 7.840 RPM por 45 minutos, o que separou o sobrenadante do
sedimento.
O sobrenadante foi então dializado por pelo menos 8 horas com água
destilada para eliminar o sulfato de amônia. Após a completa eliminação do sulfato
de amônia, a solução foi novamente centrifugada (7.840 RPM por 45 minutos) e
coletado o sobrenadante, rico em LDL.
Para o preparo dos Lipossomas, a solução resultante da extração do LDL foi
submetida a sonicação por 30 minutos (Sonicador SERCON LU-5), a uma
freqüência de 60 kHz e temperatura ambiente. Desse modo, a solução de
Lipossomas de LDL ficou pronta para ser incorporada ao diluente.
2.3 Diluente
O diluente de resfriamento BPSE foi preparado com 5g de frutose, 0,34g de
cloreto de magnésio, 0,64g de citrato de potássio tribásico, 4,30g de acetato de
sódio, 8,67g de glutamato de sódio, 1,95g de TES, 0,65g de fosfato de potássio
monobásico e 12,70g de fosfato de potássio dibásico para 1 litro de água destilada,
com o pH ajustado para 6,5 e osmolaridade 353 mOsm/kg H2O (SEXTON, 1977).
Nos tratamentos foram adicionados ao diluente BPSE 0% (controle), 12, 16 e 20%
de lipossomas de LDL, resultando na solução final com 0, 6, 8 e 10 % após a adição
do sêmen na proporção (1:1, vol:vol).
2.4 Coleta de Sêmen
A coleta de sêmen era realizada rotineiramente 3 vezes por semana através
de massagem abdominal (BURROWS e QUINN, 1937). As amostras eram usadas
24
sem seleção conforme quantidade, apenas excluindo-se aquelas que apresentavam
contaminação por sangue ou resíduos cloacais.
2.5 Avaliação dos ejaculados
Logo após a coleta, foi feito um pool de sêmen, transferindo os ejaculados
para um tubo Falcon (graduado) de 15 ml onde foi verificado o volume total obtido,
sendo a concentração espermática avaliada por meio de contagem de células
espermáticas em Câmara de Neubauer.
O pool de sêmen foi dividido em 4 alíquotas, e cada uma foi então diluída
com BPSE (1:1, vol:vol) contendo os respectivos tratamentos. As amostras eram
manipuladas apenas uma vez ao dia para as avaliações, e prontamente levadas ao
resfriamento para evitar maiores oscilações de temperatura.
A motilidade (percentagem de células móveis) e vigor (0 – 5) foram
analisadas em cada tratamento através de microscópio óptico, utilizando
aproximadamente 10μl de sêmen em lâmina sob lamínula, a temperatura ambiente.
A integridade de membrana foi avaliada através do corante SYBR-14 + PI
(Live/Dead Sperm Viability), o qual prediz o potencial fertilizante de amostras de
sêmen (SEIGNEURIN; BLESBOIS, 1995). Esta análise foi realizada em todas as
etapas deste estudo. Antes de cada avaliação as amostras foram ajustadas,
adicionando 10μl de sêmen de cada tratamento em tubos eppendorf contendo 500μl
de diluente BPSE, previamente identificados. Imediatamente, adicionou-se o SYBR-
14 e PI nestas amostras. O procedimento foi realizado em uma sala escura, para
proteger os corantes do contato direto com a luz.
Utilizou-se microscópio de fluorescência (Olympus BX-51) para a contagem
de células viáveis, após incubação das amostras no escuro, em temperatura
ambiente por 15 minutos. Um total de 200 células espermáticas foram contadas em
cada lâmina, categorizando-as como viáveis (verdes) e não viáveis (coloração
vermelha ou dupla coloração). O resultado foi expresso em percentagem de células
viáveis.
A penetração espermática foi estimada in vitro através da técnica de
incubação do espermatozóide com a membrana perivitelina interna do ovo (IPVL) de
galinha, conforme descrito por Robertson e Wishart (1997). O sêmen analisado foi
diluído à 5 x 107 sp/ml e incubado em banho-maria à 40°C por 10 min. As
25
membranas foram colocadas em pocinhos contendo 600 μl de Dulbecco’s Eagle’s
Medium (MEM), modificado com HEPES, aquecido à 40°C. Após, foi transferido 200
μl do sêmen para os pocinhos contendo MEM e IPVL (concentração final de 1,25 x
107 sp/ml) e incubado por 5 minutos em banho-maria à 40°C com agitação. As
membranas foram então lavadas com cloreto de sódio à 1% para remoção dos
espermatozóides. As lâminas foram preparadas e observadas ao microscópio de
campo escuro (Olympus BX-41). Três campos de cada lâmina foram fotografadas
para contar o número de furos visíveis, feitos pelos espermatozóides na IPVL por
mm2.
2.6 Análise estatística
Os dados foram analisados utilizando o programa Statistix® (2003). Para
motilidade, se utilizou Análise de Variância (ANOVA). Para a análise do teste de
penetração espermática utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis para dados não
paramétricos, enquanto que para a análise de integridade de membrana os dados
foram transformados para arco-seno, e realizado ANOVA. As médias foram
comparadas por Teste LSD, utilizando a probabilidade P< 0,05.
3 Resultados
Os efeitos da adição de diferentes níveis de lipossomas de LDL sobre a
motilidade (MOT), das células espermáticas estão demonstradas na Tabela 1.
Tabela 1. Médias e erro padrão para Motilidade espermática do sêmen de galos resfriado a 5˚C, nos diferentes tratamentos por período de estocagem.
Trat (%) 0h 24h 48h 72h 96h
T0 77.5 ± 4.5 a 67.0 ± 2.7 a 69.5 ± 4.4 a 58.5 ± 4.7 a 58.0 ± 5.7 a T6 75.5 ± 4.4 a 65.5 ± 6.1 a 68.5 ± 3.6 a 56.5 ± 6.4 a 52.0 ± 7.4 a T8 72.5 ± 3.5 a 58.5 ± 4.7 ab 53.0 ± 5.6 b 49.0 ± 6.6 ab 43.5 ± 7.9 ab
T10 61.0 ± 2.0 b 50.5 ± 4.1 b 45.5 ± 5.3 b 38.0 ± 6.6 b 31.0 ± 4.9 b a, b Letras diferentes, na mesma coluna, representam diferença P<0,05.
26
Os tratamentos T0 e T6 não diferiram (P>0,05) em nenhum momento durante
os 5 dias de experimento para Motilidade. Os grupos T8 e T10 apresentaram
resultados inferiores comparados aos grupos T0 e T6. Apesar de a diferença
apresentada pelo grupo T8 na 0 hora não ser significativa às 24, 72 e 96h, este
tratamento diferiu do controle. O T10 sempre demonstrou os valores mais baixos
para motilidade, diferindo dos grupos T0 e T6, nos momentos 0, 24, 48, 72 e 96h de
resfriamento à 5˚C.
Após o resfriamento, observou-se que a motilidade diminuiu após 0, 24, 48,
72 e 96h em todos os tratamentos. Na Figura 1, podemos observar a queda da
motilidade espermática ao longo do experimento e destacar a diferença entre os
tratamentos T0 e T10, com valores inferiores para o tratamento T10.
Figura 1. Motilidade do sêmen de galos submetidos aos tratamentos com diferentes níveis de lipossomas de LDL.
Através da regressão linear (Figura 2) fica evidenciado que á medida que
aumenta o tempo de acondicionamento do sêmen a 5˚C, a motilidade decresce.
Ainda, quanto maior a concentração de lipossomas de LDL no diluente do sêmen,
menor é a motilidade espermática ao passar do tempo.
27
Figura 2. Regressão linear da motilidade do sêmen resfriado a 5˚C, por tratamento, em função do tempo de acondicionamento a 5˚C. T0 (BPSE - grupo controle): Motilidade = 80,35 – 4,75(h) – R2 = 0,849; T6 (BPSE adicionado de 6% LDL): Motilidade = 80,4 – 5,6(h) – R2 = 0,885; T8 (BPSE adicionado de 8% LDL): Motilidade = 75,55 – 6,75(h) – R2 = 0,929; T10 (BPSE adicionado de 10% LDL): Motilidade = 66,95 – 7,25(h) – R2 = 0,989.
A percentagem de células viáveis no teste de Integridade de Membrana
indicado pelo método SYBR-14 + PI, não diferiu significativamente (P>0,05) entre os
tratamentos T0, T6, T8, e T10, em qualquer dos períodos de avaliação.
Tabela 2. Percentual de Integridade de Membrana (médias e erro padrão) por tratamento e período de estocagem (dados transformados para arco-seno).
Trat (%) 0h 24h 48h 72h 96h
T0 80.2 ± 4.55 79.4 ± 5.37 70.2 ± 5.4 68.6 ± 4.0 66.6 ± 7.8 T6 81.8 ± 6.29 80.6 ± 3.41 81.4 ± 3.32 80.0 ± 4.13 83.2 ± 2.95 T8 87.0 ± 2.28 84.0 ± 2.91 81.0 ± 3.89 82.4 ± 2.0 79.4 ± 3.12 T10 82.4 ± 2.67 69.6 ± 9.24 65.6 ± 11.8 67.0 ± 9.13 68.0 ± 12.2
28
Na regressão linear para integridade de membrana (Figura 3), podemos
observar a tendência dos tratamentos T6 e T8 com a maior porcentagem de células
íntegras no teste de IM, com médias respectivas de 81.4% e 82.7%. Para os
tratamentos T0 e T10, a porcentagem média de IM foi 73.0% e 70.5%
respectivamente, ainda que ligeiramente mais baixa, não foram significativamente
diferentes dos valores obtidos nos tratamentos T6 e T8.
Figura 3. Regressão linear para Integridade de membrana espermática, por tratamento em função do tempo de acondicionamento a 5˚C. T0 (BPSE - grupo controle): Integridade de membrana = 84,4 – 3,8(h) – R2 = 0,897; T6 (BPSE adicionado de 6% LDL): Integridade de membrana = 80,74 – 0.22(h) – R2 = 0,080; T8 (BPSE adicionado de 8% LDL): Integridade de membrana = 87,8 – 1,68(h) – R2 = 0,829; T10 (BPSE adicionado de 10% LDL): Integridade de membrana = 79,94 – 3,14(h) – R2 = 0,533.
A penetração espermática foi verificada ao longo de todo o processo deste
trabalho. Os tratamentos não apresentaram diferença significante entre eles
(P>0,05) para os diferentes momentos de análise das amostras (tab.3). Na Figura 4,
podemos observar a média de furos categorizadas, para os 4 diferentes tratamentos.
A diferença dos furos na membrana entre os tratamentos pode ser visto na Figura 5.
29
Tabela 3. Penetração espermática em IPVL (n˚ de furos por mm2) nos diferentes tratamentos. Trat (%) 0h 24h 48h 72h 96h
T0 31.8 ± 7.83 41.7 ± 26.3 82.0 ± 27.9 53.0 ± 37.7 26.1 ± 8.4 T6 110.4 ± 50. 13.8 ± 7.0 19.7 ± 3.6 11.3 ± 2.4 18.2 ± 4.7 T8 97.9 ± 36.6 15.9 ± 5.7 19.0 ± 4.1 15.2 ± 5.0 9.7 ± 1.6
T10 98.9 ± 69.8 9.0 ± 1.7 24.4 ± 5.7 14.5 ± 3.9 9.8 ± 4.1
Figura 4. Média de furos (furos/mm2) na membrana perivitelina interna do ovo (IPVL) de galinha, penetrada por espermatozóide de galo.
30
Figura 5. Fotos tiradas em microscópio de campo escuro (aumento – 400X) dos furos típicos realizados pelos espermatozóides incubados com a membrana perivitelina interna do ovo (IPVL). Grupo controle (A) e tratamento T6 (B), não diferem estatisticamente entre eles.
4 Discussão
O mecanismo que promove a proteção do espermatozóide pela Lipoproteína
de Baixa Densidade (LDL) ainda é discutido. Uma das hipóteses é que o LDL fica
associada com a membrana espermática, estabilizando-a (WATSON, 1975;
FOULKES, 1977; MCDONALD, FOULKES, 1981). Outra hipótese sugere que os
fosfolipídios presentes na LDL protegem o sêmen formando um filme protetor na
superfície da membrana espermática (QUINN ET AL., 1980), ou repondo os
fosfolipídios que são perdidos ou danificados durante o processo de criopreservação
(FOULKES et al., 1980; GRAHAM, FOOTE, 1987). Bergeron e Munjunath (2006)
propuseram um novo mecanismo de proteção do espermatozóide pelo uso do LDL,
tendo em vista a descoberta que as proteínas do plasma seminal (BSP) formam
complexos estáveis com a LDL. Em ejaculados não diluídos, os espermatozóides
são continuamente expostos a elevadas concentrações de proteínas BSP e
contínua remoção lipídica, resultando em diminuição da resistência do
espermatozóide ao choque térmico e congelamento. A LDL tem condições de se
ligar a maior parte das proteínas BSP, desde que o ejaculado seja diluído poucos
minutos após a coleta em diluentes contendo a LDL. Assim, a LDL pode oferecer
proteção às células espermáticas pela redução dos efeitos nocivos que as proteínas
do plasma seminal exercem sobre a membrana espermática.
Os resultados apresentados neste experimento demonstram que a adição de
Lipossomas de LDL ao diluente de resfriamento de sêmen de galos manteve a
qualidade dos espermatozóides no tratamento com adição de 6% de LDL, em
relação ao tratamento controle. Observou-se um efeito negativo em relação a alta
quantidade de LDL presente no diluente, pois o tratamento 10% apresentou valores
inferiores em relação aos outros tratamentos, em todas as avaliações (MOT, VIG, IM
e PE).
No teste de motilidade, ficou evidenciado a medida que aumenta o tempo de
acondicionamento do sêmen a 5˚C, a motilidade decresce, como pode ser visto na
31
regressão linear da figura 2. Este resultado já era esperado pois quando o sêmen é
armazenado in vitro por mais de 24 horas, maiores são os problemas com fertilidade
(DONOGHUE; WISHART, 2000).
Nossos resultados não indicam uma influência significativa entre os
tratamentos com diferentes níveis de LDL sobre a Integridade de Membrana (IM). Na
figura 4 podemos observar o gráfico de regressão linear onde fica evidente que os
tratamentos T2 (6%) e T3 (8%) tiveram melhores médias de células íntegras
comparados aos outros grupos. Ainda, o Tratamento 2 (6%) foi o único apresentou
uma tendência em permanecer constante a porcentagem de células viáveis (íntegras)
ao longo das horas de resfriamento, enquanto que T1, T3 e T4 apresentaram uma
tendência decrescente entre 0 e 96 horas. Segundo Chalah e Brillard (1998), SYBR
14 + PI é o método mais adequado para verificar a Integridade de Membrana de
sêmen fresco e resfriado (>0˚C) de aves.
Através do teste de Penetração Espermática, se pode obter uma estimativa
da fertilidade individual ou de um grupo de aves, por meio da avaliação do número de
furos na membrana interna (IPVL) de ovos frescos (BRAMWELL et al.,1995). Este
tipo de teste serve para mostrar a função in vivo do sêmen, e ainda, a avaliação do
número de furos na membrana é uma análise simples (WISHART, 1995).
No teste de penetração espermática, não foram observadas diferenças
estatísticas entre os tratamentos. No gráfico da figura 5, podemos observar que
apesar de não diferirem entre eles, o grupo controle foi o melhor tratamento, seguido
pelo T2 e T3 com a média de furos/mm2 bem semelhantes, e por último o T4, com os
menores valores para PE. Assim como no teste de motilidade, observou-se o efeito
negativo em relação à proporção de Lipossomas de LDL ao diluente, sendo
inversamente proporcional o nível de LDL e o número de furos na membrana no teste
de PE.
Os resultados obtidos nestes estudos nos permitiram concluir que a adição
de lipossomas de LDL ao diluente de resfriamento de sêmen de galos mantém a
qualidade geral dos espermatozóides quando adicionado na proporção de 6%,
portanto, melhorias na fertilidade de sêmen de aves podem ser obtidas desde que
seja respeitado um limite de adição desta lipoproteína ao diluente.
32
5 Referências ANTON, M.; MARTINET, V.; DALGALARRONDO, M.; BEAUMAL, V.; DAVID-BRIAND, E.; RABESONA, H. Chemical and structural characterization of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Food Chemistry, v.83, p.175-183, 2003. BERGERON, A.; CRÊTE, M. H.; BRINDLE, Y.; MANJUNATH, P. Low-density lipoprotein fraction from hen`s egg yolk decreases the binding of the major protein of bovine seminal plasma to sperm and prevents lipid efflux from the sperm membrane. Biology of Reproduction, v. 70, P.708-717, 2004. BERGERON, A.; MANJUNATH, P. New Insights Towards Understanding the Mechanisms of Sperm Protection by Egg Yolk and Milk. Molecular reproduction and development, v.73, p.1338–1344, 2006. BLESBOIS, E.; SEIGNEURIN, F. Conservation in vitro du sperme chez les oiseaux domestiques. Journées de la Recherche Avicole, Ed INRA, v.2, p32-35, 1997. BRAMWELL, R.K.; MARK, H.L.; HOWARTH, B. Quantitative determination of spermatozoa penetration of the perivitelline layer of the hen’s ovum as assessed on oviposited eggs. Poultry Science, v.74, p.1875–1883, 1995. BURROWS, W. H.; QUINN, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. v.14, p.251-254, 1937. CHALAH, T., BRILLARD, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by Eosin-Nigrosin and dual fluorescence (SYBR-14/PI). Theriogenology, v.50, p.487–493, 1998. CLARKE, R. N.; SEXTON, T. J.; OTTINGER, M. A. Effects of holding temperature and storage time on respiratory rate, motility and fertility of chicken and turkey semen. Poultry Science, v.61, p.1912-1917, 1982. DEMANIOWICZ, W.; STRZEZEK, J. The effect of lipoprotein fraction from egg yolk on some of the biological properties of boar spermatozoa during storage of the semen in liquid state. Reproduction in Domestic Animals, n.31, p.279-280, 1996. DONOGHUE, A.M.; WISHART, G.J. Storage of poultry semen. Animal Reproduction Science, v.62, p.213-232, 2000. DUNN, H. O.; BRATTON, R. W.; COLLINS, W.J. Fertility and motility of bovine spermatozoa in buffered whole egg extenders. Journal of Dairy Science, n.33, p.434–437, 1950. FOULKES, J. A. The separation of lipoproteins from egg yolk and their effect on the motility and integrity of bovine spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, n.49,p.277-284, 1977.
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34
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35
2.2 ARTIGO
“Comparação entre a forma de envase e a temperatura de descongelamento de sêmen de galos congelado com dimetilacetamida”
Resumo apresentado no “40th Annual Meeting – Society for the Study of
Reproduction (SSR - 2007), hosted by University of Texas and the University of
Texas Health Science Center at San Antonio / USA”.
36
COMPARAÇÃO ENTRE A FORMA DE ENVASE E A TEMPERATURA DE DESCONGELAMENTO DE SÊMEN DE GALOS CONGELADO COM
DIMETILACETAMIDA
Van der Laan, G.M.1; Miranda, R.C.2; Castro, T.F.2; Marten, C.P.2; Oliveira, E.B.2;
Deschamps, J.C.1; Bongalhardo, D.C.3
1Laboratório de Reprodução Animal, Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, Brasil;
2 Graduandos da Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Brasil ; 3 Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas, Brasil
RESUMO Uma alternativa ao uso de glicerol como crioprotetor de sêmen de galos é a utilização de Dimetilacetamida (DMA). Os melhores resultados obtidos com DMA ocorrem quando o sêmen é rapidamente congelado na forma de pellets e submetido a um rápido descongelamento à 60ºC. Porém, o congelamento em palhetas ainda é o método mais apropriado para armazenar sêmen e a exposição do mesmo a temperaturas mais altas que a temperatura corporal fisiológica durante o descongelamento pode causar danos ao espermatozóide. O presente trabalho visou avaliar a qualidade do sêmen de galos congelado com DMA, envasado em palhetas e em pellets e descongelado a três temperaturas. Após a coleta, foi feito um pool de sêmen, que foi dividido em duas alíquotas e equilibrado à 5ºC por 10 min. Um minuto depois da adição de DMA, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 ml e mergulhado em nitrogênio líquido. Os pellets foram feitos pipetando-se 25µl de sêmen diretamente em nitrogênio líquido. As palhetas foram descongeladas em banho-maria a 5, 40 e 60ºC. Os pellets foram colocados em tubos Eppendorf contendo diluente de Lake’s a temperaturas de 5, 40 e 60ºC. Após descongeladas as amostras foram mantidas a temperatura ambiente para análises. A motilidade (MOT) foi avaliada de forma subjetiva ao microscópio, a integridade de membrana (IM) através das sondas fluorescentes SYBR-14 e PI, e a penetração espermática (PE), através da incubação do sêmen com a membrana perivitelina interna (MPI) do ovo. A análise de variância mostrou que existem diferenças nas temperaturas de descongelamento para MOT e PE, sendo que MOT à 40 e à 60 foram superiores à 5ºC (35,8 ± 5,8, 25,4 ± 7,1, e 15,0 ± 5,0% respectivamente, P<0,05), e PE à 40 foi superior à 60 e 5ºC (14,2 ± 2,6, 6,3 ± 1,2, e 6,8 ± 1,1 furos/mm2 , respectivamente, P<0,05). Quando o sêmen foi envasado em palhetas, PE foi significativamente maior do que em pellets (11,9 ± 2,0 vs. 6,5 ± 0,9 furos/mm2, P<0,05), o mesmo ocorrendo
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para IM (20,3 ± 1,8 vs. 9,0 ± 1,0, P<0,05). Não houve interação entre forma de envase e temperatura de descongelamento em nenhum dos parâmetros analisados. Estes resultados indicam que a temperatura corporal é a mais apropriada para descongelamento de sêmen criopreservado com DMA, e que o envase em palhetas é uma alternativa ao invés do método de pellets. Palavras chaves – Sêmen de galo, criopreservação, dimetilacetamida, motilidade espermática.
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COMPARISON AMONG THAWING TEMPERATURES OF ROOSTER SPERM FROZEN WITH DIMETHYLACETAMIDE
ABSTRACT
Protecting rooster sperm with dimethylacetamide (DMA) is an alternative to the use of glycerol. The best results obtained with DMA occur when sperm is fast-frozen in pellets and fast-thawed at 60°C. However, straws are still the most suitable method for storing semen, and subjecting sperm to temperatures higher than the physiological body temperature could have deleterious effects on its function. The present work aimed to evaluate quality of rooster semen frozen with DMA, packed in straws and pellets, and thawed at 3 temperatures. After collection, semen was pooled, split in two aliquots, and kept at 5°C for 10 min. One min after addition of DMA, semen was packed into 0.25 ml straws, which were plunged into liquid nitrogen; and pellets were formed by dropping 25 μl of semen directly into liquid nitrogen. Straws were thawed with swirling motion into ice bath (5°C) or water bath (40 and 60°C). Pellets were placed into tubes containing Lake’s diluent at 5, 40, or 60°C. After thawing, samples were maintained at room temperature for analyses. Motility (MOT) was measured subjectively at microscope and the ability of sperm to penetrate the egg was performed incubating sperm diluted at 1.25 x 109 sp/ml with egg’s inner-perivitelline layer (IPVL) squares for 5 min at 40°C. IPVL was spread in slides and the number of hydrolyses holes (HOLES) made by the sperm in 1 mm2 was counted. Analysis of variance showed that there was difference among thawing temperatures; in MOT, 40 and 60°C was superior to 5°C (35,8 ± 5,8, 25,4 ± 7,1, and 15,0 ± 5,0% respectively, P<0,05) and in PE, 40 was higher than both 60 and 5°C (14,2 ± 2,6, 6,3 ± 1,2, e 6,8 ± 1,1 holes/mm2, respectively, P<0,05). Sperm penetration (PE) and Membrane Integrity (IM) were affected by packing method, with straws being superior to pellets (11,9 ± 2,0 vs. 6,5 ± 0,9 holes/mm2, P<0,05) and (20,3% ± 1,8 vs. 9,0% ± 1,0, P<0,05) respectively. There was no difference (P > 0.05) between packing methods in MOT or interaction between packing and temperature in any parameter. These results indicate that body temperature is more suitable for thawing DMA cryopreserved sperm, and that packing semen in straws could be an alternative to the pellet storage method.
Keywords: rooster sperm, cryopreservation, dimethylacetamide, sperm motility.
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1 Introdução A criopreservação de sêmen em animais domésticos é a biotécnica
reprodutiva mais utilizada para difundir material genético, manter a conservação da
biodiversidade genética e aperfeiçoar o manejo da inseminação artificial.
A criopreservação de sêmen em aves domésticas tem sido estudada
extensivamente com o passar dos anos. Métodos utilizando diferentes tipos de
diluentes e crioprotetores como Glicerol, Dimetilsulfóxido (DMSO), Dimetilacetamida
(DMA), condições de congelamento, tipos de armazenamento do sêmen, e
procedimentos para descongelamentos foram desenvolvidos (LAKE, 1986;
BELLAGAMBA et al., 1993).
Hammerstedt & Graham (1992) discutiram as vantagens e desvantagens
relacionadas ao uso do glicerol como crioprotetor em aves. Dois problemas
persistentes são o seu efeito contraceptivo quando no trato da fêmea, e os danos
sofridos pelo espermatozóide durante a sua remoção (GILL et al., 1996). O efeito
contraceptivo do glicerol ainda é desconhecido, mas pode estar relacionado com o
choque osmótico que ocorre dentro do oviduto (LAKE; RAVIE, 1984). Portanto, a
remoção do glicerol antes da inseminação torna-se fundamental para que se
obtenha fertilidade (BUSS, 1993; VAN VOORST; LEENSTRA, 1995; IAFFALDANO;
MELUSSI, 2003). A lavagem do sêmen descongelado com Accudenz Gradient
Centrifugation (MCLEAN et al., 1998) mostrou-se o melhor método para remoção do
glicerol quando comparado com a remoção por diálise ou por Percoll Density
Gradient Centrifugation (LONG; KULKARNI, 2004), entretanto a fertilidade obtida por
este método ainda é baixa.
O efeito protetor conferido pela Dimetilacetamida (DMA) e a possibilidade de
usar o sêmen sem que a mesma seja removida antes da inseminação, são
vantagens que encorajaram o uso deste crioprotetor para o congelamento do sêmen
de aves (LAKE; RAVIE, 1984). Segundo Challah et al. (1999), a fertilidade obtida
com sêmen congelado com DMA é comparável àquela obtida com sêmen fresco,
especialmente quando armazenado na forma de pellets (TSELUTIN et al., 1999).
O armazenamento do sêmen congelado (pellet/palheta) é um importante
ponto a ser considerado quando se busca aperfeiçoar o método de criopreservação.
Isto devido ao número de variáveis envolvidas ao método de congelamento, no qual
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irão interagir (MORTIMER et al., 1976; SEXTON, 1979; LAKE; RAVIE, 1984;
LATORRE et al., 1988).
O objetivo do presente estudo foi comparar a qualidade do sêmen congelado
de galos (Gallus gallus) utilizando a Dimetilacetamida (DMA) como crioprotetor,
envasado em palhetas ou em forma de pellets, e descongelados em três diferentes
temperaturas.
2 Materiais e Métodos
A metodologia empregada na pesquisa baseou-se na avaliação do sêmen
submetido aos 3 tratamentos de descongelamento (5, 40 e 60˚C), em dois diferentes
tipos de envase (pellets ou palhetas). A qualidade do sêmen foi verificada através de
testes de motilidade (MOT), penetração espermática (PE) e Integridade de
membrana (IM) logo após os descongelamentos. Foram realizadas 5 repetições
destes tratamentos.
2.1 Animais
Um total de 15 galos de Linhagem Embrapa–051 (Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária – linhagem originada do cruzamento das raças Plymouth
Rock White e Rhode Island Red), foram usados neste estudo no Laboratório de
Reprodução Animal do Centro de Biotecnologia da UFPEL. Os animais foram
alojados em gaiolas individuais, alimentados com ração contendo de energia 2850
Kcal, 12,5 % de proteína bruta, 3,34% de gordura, 3,54% de fibra, 0,67% de fósforo
e 1% de cálcio, tendo acesso ad libitum a esta ração e a água.
2.2 Coleta de Sêmen e Diluição
A coleta de sêmen foi realizada conforme os procedimentos descritos por
Burrows e Quinn (1937). Foi tomado devido cuidado para impedir contaminação por
sangue ou resíduos cloacais no momento da coleta. Após formar um pool com o
sêmen coletado, foi verificado o volume final e a concentração espermática na
câmara de Neubauer. O pool foi então diluído em solução de Lake´s (LAKE, 1968)
na proporção de 1:1 (vol;vol) em temperatura ambiente. Foram retiradas amostras
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para as avaliações de Motilidade (MOT), Integridade de Membrana (IM) e
Penetração Espermática (PE).
O sêmen diluído foi então dividido em duas alíquotas iguais rotuladas de
“Pellets” e “Palhetas”, e resfriadas a 5˚C por 10 minutos na câmara fria.
2.3 Procedimentos de congelamento
Ao estarem equilibradas as amostras a 5˚C na câmara fria, foi adicionado o
DMA na concentração final de 6% para ambas alíquotas. Após homogeneizadas
lentamente, foram equilibradas a 5˚C por 1 minuto para serem envasadas.
O sêmen da primeira alíquota foi transferido para palhetas de 0,25 ml e
seladas. As palhetas foram submetidas a 1 minuto ao vapor de nitrogênio (3 cm
acima do nível do N2), para então serem colocadas diretamente dentro do líquido de
Nitrogênio.
Com a segunda alíquota, foram formados os pellets a partir de 25 μl de
sêmen lançados diretamente no nitrogênio líquido. Os pellets foram armazenados
dentro de Cryotubos®, e então estocados dentro do botijão de nitrogênio.
2.4 Procedimentos de descongelamento
• Palhetas
Para o descongelamento, as palhetas foram submetidas a três diferentes
tratamentos: Tratamento 1 (banho de gelo a 5˚C), tratamento 2 (banho-maria a
40˚C), e tratamento 3 (banho-maria a 60˚C). As palhetas foram mergulhadas e
manualmente agitadas por 30 segundos em cada tratamento. Após descongeladas,
as palhetas foram rapidamente abertas nas duas extremidades, e o sêmen
transferido para tubos Eppendorf® contendo o diluente Lake´s (1:1, vol:vol), e
posteriormente submetidos a avaliação.
• Pellets
Os pellets também foram submetidos aos mesmos três tratamentos. Para o
descongelamento, os pellets foram transferidos dos Cryotubos® para tubos
Eppendorf® contendo diluente de Lake´s (1:1, vol:vol) nas temperaturas de 5, 40 e
60˚C (tratamentos), e manualmente agitados dentro do banho de gelo ou no banho-
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maria. Imediatamente após o descongelamento, os tubos ficaram expostos a
temperatura ambiente para a análise do sêmen.
2.5 Teste da qualidade do sêmen
A motilidade (percentagem de células móveis) foi analisada em cada
tratamento através de microscópio, utilizando aproximadamente 10μl de sêmen em
lâmina sob lamínula, a temperatura ambiente.
A habilidade fertilizante do sêmen foi estimada in vitro pelo teste de
Penetração Espermática (PE), através da técnica de incubação do espermatozóide
com a membrana perivitelina interna do ovo (IPVL) de galinha, conforme descrito por
Robertson e Wishart (1997). As membranas são colocadas em pocinhos contendo
600 μl de Dulbecco’s Eagle’s Medium (MEM), modificado com HEPES, aquecido à
40°C. O sêmen a ser analisado é diluído à 5 x 107 sp/ml e incubado em banho-maria
à 40°C por 10 min. Após, transfere-se 200 μl do sêmen para os pocinhos contendo
MEM-IPVL (concentração final de 1,25 x 107 sp/ml) e incuba-se por 5 minutos em
banho-maria à 40°C com agitação. As membranas são então lavadas com cloreto
de sódio à 1% para remoção dos espermatozóides. São preparadas em lâminas e
observadas ao microscópio de campo escuro (Olympus BX-41). Fotografam-se três
campos de cada lâmina e conta-se o número de furos visíveis, feitos pelos
espermatozóides na IPVL por mm2.
A integridade de membrana foi determinada através do corante SYBR-14 +
PI, o qual prediz o potencial fertilizante de amostras de sêmen (SEIGNEURIN;
BLESBOIS, 1995). O corante SYBR-14 é um marcador de ácido nucléico que
permeia apenas em membranas intactas, corando o DNA (verde fluorescente),
enquanto que o Iodeto de Propidium (PI) também cora DNA, porém apenas em
células com lesão de membrana (vermelho fluorescente = célula não viável).
Antes de cada avaliação as amostras são ajustadas, adicionando 5μl de
sêmen de cada tratamento em tubos Eppendorf® contendo 500μl de diluente Lake´s,
previamente identificados. Imediatamente, adiciona-se o SYBR-14 + PI nestas
amostras. Procedimento realizado em uma sala escura, protegendo os corantes do
contato direto com a luz. Utilizou-se microscópio de fluorescência (Olympus BX-51)
para a contagem de células, após incubação das amostras no escuro, em
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temperatura ambiente por 15 minutos. Um total de 200 células espermáticas foram
contadas em cada lâmina, categorizando-as como viáveis (verdes) e não viáveis
(coloração vermelha ou dupla coloração), e o resultado expresso em percentagem
de células viáveis ou íntegras.
2.6 Análise estatística
Os dados foram analisados através do programa Statistix® (2003). As
porcentagens de motilidade, integridade de membrana e os valores de penetração
espermática foram examinados por análise de variância (ANOVA), e as médias
comparadas por Teste de Tukey, utilizando a probabilidade p < 0,05.
3 Resultados
Nas nossas condições laboratoriais, podemos demonstrar que existem
diferenças significativas (P<0,05) entre diferentes temperaturas de
descongelamento, e também, entre métodos de envase de sêmen congelado.
A percentagem de células espermáticas móveis foi maior antes do
congelamento (90 a 100%) do que após o descongelamento, apresentando médias
de 23.9 ± 6,2 e 26.9 ± 4,1 para pellets e palhetas, respectivamente. A motilidade do
sêmen descongelado a 40°C e a 60°C foram superiores à 5°C (35,8 ± 5,8; 25,4 ±
7,1; e 15,0 ± 5,0% respectivamente, P<0,05), como demonstra o gráfico da figura 1.
O número de furos na membrana (IPVL) do teste de penetração espermática
foi significantemente mais alto quando o sêmen foi descongelado a 40°C (14.2 ± 2,6)
do que a 5°C (6.8 ± 1,1) ou a 60°C (6.3 ± 1,2) (Figura 1).
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Figura 1. Médias e erro padrão para motilidade (E) e penetração espermática (D) de sêmen de galos descongelados em três diferentes temperaturas.
Após os descongelamentos, o sêmen envasado em palhetas demonstrou
uma média superior para PE (P<0,05) em relação ao pellet (Figura 2), enquanto que
para MOT essas médias não foram diferentes entre elas (Figura 3).
Figura 2. Médias e erro padrão para Penetração Espermática (furos/mm2) de sêmen de galos, armazenados em palhetas ou em pellets, e descongelados em três diferentes temperaturas.
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Figura 3. Médias e erro padrão para Motilidade (%) de sêmen de galos, armazenados em palhetas ou em pellets, e descongelados em três diferentes temperaturas.
Não houve interação (P>0,05) entre as variáveis temperatura de
descongelamento e método de envase do sêmen.
As amostras envasadas em palhetas demonstraram uma porcentagem
significativamente maior (P<0,05) tanto em de células íntegras (IM) (20,3 ± 1,8 vs. 9,0
± 1,0, P<0,05), como na penetração espermática (PE) (11,9 ± 2,0 vs. 6,5 ± 0,9
furos/mm2, P<0,05), comparadas ao sêmen congelado em pellets (Figura 4).
Figura 4. Médias e erro padrão para Integridade de Membrana (E) e Penetração Espermática (D) do sêmen congelado em Pellets e Palhetas.
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4 Discussão
Os principais pontos críticos que afetam o metabolismo e a estrutura celular
durante a criopreservação são: 1) a interação entre o espermatozóide e o
crioprotetor interno adicionado ao sêmen para limitar o stress pela troca de
temperatura; 2) curva da temperatura de congelamento e descongelamento; 3) o tipo
de envase para o sêmen (BLESBOIS, 2007).
Tselutin, Seigneurin e Blesbois (1999) compararam 3 crioprotetores
(Glicerol, DMA e DMSO) para congelamento de sêmen de aves, e demonstraram
que o DMSO é o crioprotetor mais tóxico, e o Glicerol, o menos nocivo à célula
espermática. No entanto, os índices de fertilidades mais elevados foram obtidos com
o DMA, porém apenas quando o sêmen foi congelado em Pellets. Amostras de
sêmen congeladas em pellets utilizando DMA resultam em índices de fertilidade
superiores comparadas a outras técnicas testadas (CHALAH, et al., 1999).
Ao contrário destes resultados, o presente estudo demonstra uma
superioridade significativa do sêmen armazenado em Palhetas em relação ao Pellet.
Os resultados dos testes de integridade de membrana, e penetração espermática
foram superiores (P<0,05) em Palhetas, enquanto que no teste de motilidade
espermática, não apresentaram diferença (P>0,05) entre os dois tipos de
acondicionamento do sêmen.
Os dados obtidos por Tselutin, Seigneurin e Blesbois (1999), e Chalah
(1999) podem ter resultado pelo uso de um utensílio específico (thermoregulate
hotplates) para o rápido descongelamento de pellets, desse modo, proporcionando
índices ideais de descongelamento comparados ao tradicional banho-maria
(utilizado neste experimento). Além disso, o melhor resultado que obtivemos com o
envase em palhetas pode ter ocorrido pela escolha das palhetas de 0,25 ml, a qual
possui a parede do plástico mais fina, permitindo a melhor troca e distribuição de
temperatura entre o nitrogênio e o sêmen, resultando em uma maior velocidade de
congelamento.
Sobre o descongelamento, obtivemos os melhores resultados para os testes
de motilidade (MOT) e penetração espermática na membrana (PE) quando as
amostras foram submetidas à temperatura de descongelamento à 40˚C, comparadas
com 5˚ e 60˚C. Estes resultados obtidos em nossas condições laboratoriais diferem
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das condições padrão, em que são usados o congelamento ultra-rápido com DMA
em pellets, e descongelamento ultra-rápido a 60˚C (TSELUTIN et al., 1999;
CHALLAH et al., 1999).
Na Holanda, o método tradicional de congelamento-descongelamento ultra-
rápido com DMA foi otimizado e combinado com o envase em Palhetas. Esta
adaptação é usada hoje como referência para o banco genético local de
reprodutores (WOELDERS; ZUILBERG; HIEMSTRA, 2006). Estas combinações de
técnicas adotadas neste país concordam com os resultados que obtivemos em
nossos experimentos.
Portanto, com os resultados obtidos neste estudo, concluímos que a
temperatura corporal (40˚C) é mais adequada para descongelar sêmen
criopreservado com DMA. Ainda, o envase em palhetas é mais eficiente em relação
ao pellet por razões sanitárias e segurança, e ainda, mais conveniente para a
identificação dos ejaculados, especialmente para a aplicação a campo desses
bancos genéticos.
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3 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos nestes estudos nos permitiram concluir que:
- A adição de lipossomas de LDL ao diluente de resfriamento de sêmen de
galo mantém a qualidade geral dos espermatozóides quando adicionado na
proporção de 6%;
- Melhorias na fertilidade do sêmen podem ser obtidas desde que seja
respeitado um limite de adição de lipossomas de LDL ao diluente de resfriamento;
- A temperatura corporal (40˚C) é a mais apropriada para descongelamento
de sêmen criopreservado com DMA em nossas condições laboratoriais;
- O envase em palhetas é mais eficiente em relação ao pellet. Esta
observação é de grande valor, visto que o armazenamento do sêmen em palhetas é
mais adequado por razões sanitárias, e mais conveniente para a identificação dos
ejaculados, especialmente para a aplicação a campo de bancos genéticos.
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4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O aperfeiçoamento das técnicas de conservação de sêmen para aves pode
ter um impacto significante na indústria avícola. O desenvolvimento de novas
análises para avaliar a qualidade do sêmen in vivo nos dará a oportunidade de
entender o comprometimento do espermatozóide após conservação in vitro. O
desenvolvimento e pesquisas de novos diluentes, cada vez mais, está nos
conduzindo para elevados índices de eficiência em sistemas de criopreservação de
sêmen de aves.
O somatório de resultados que obtivemos durante os últimos dois anos de
pesquisa em nosso laboratório nos servem como subsídio para a continuação de
nossas pesquisas na área de criopreservação. Dessa maneira, passaremos a
próxima etapa de nosso trabalho onde nossos objetivos são mesclar estas
informações obtidas, onde passaremos a usar o DMA adicionado de 6% LDL para o
congelamento de sêmen de galo, e 40˚C como temperatura padrão para
descongelamento de palhetas de 0,25ml.
Finalizando, este período de trabalho proporcionou a integração entre o
Centro de Biotecnologia e o Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Instituto de
Biologia da Universidade Federal de Pelotas com a participação efetiva diária na
área da pesquisa com desenvolvimento de projetos, rotina laboratorial e orientação
de alunos em diferentes níveis da graduação, fatores fundamentais para
crescimento e aperfeiçoamento profissional.
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REFERÊNCIAS
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