CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES - UENF - … · Experimento I FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais..... 50 Experimento II FIGURA 1 ... conduzidos pelo abade

Dedicatória

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU

ISABEL CANDIA NUNES DA CUNHA

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES

BOTUCATU - SÃO PAULO 2002

Dedicatória

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU

ISABEL CANDIA NUNES DA CUNHA

CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES

Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Botucatu, para a obtenção do título de Doutor em Reprodução Animal.

Orientadora: Profª. Ass. Drª. Maria Denise Lopes

BOTUCATU - SÃO PAULO 2002

Dedicatória

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SULAMITA SELMA CLEMENTE COLNAGO Cunha, Isabel Candia Nunes da Criopreservação do sêmen de cães / Isabel Candia Nunes da Cunha. – 2002. Tese (doutoramento) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2002. Orientadora: Maria Denise Lopes 1. Cão – Sêmen - Criopreservação

CDD 636.708245 Palavras-chave: Sêmen; Cão; Criopreservação

Dedicatória

os meus pais Estevão e Maria e aos meus

irmãos André e Bruno, que me apoiaram e

incentivaram a cada passo da minha

caminhada, dedico.

A

Dedicatória

gradeço especialmente à Profª Ass. Drª.

Maria Denise Lopes pela amizade, apoio e

orientação, sem os quais este trabalho não se

realizaria.

A

Agradecimentos

Agradecimentos

realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta ou

indireta de muitas pessoas. Manifesto minha gratidão a todas elas e de forma

particular:

À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP, Câmpus

de Botucatu e Departamento de Reprodução Animal e Radiologia

Veterinária, pelas oportunidades concedidas.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

pelo subsidio do projeto e pela concessão da bolsa de estudos.

Ao Professor Frederico Ozanam Papa, pelas correções e sugestões, sempre

pertinentes.

À Professora Fernanda Landim Alvarenga, pela amizade e pela orientação

quanto à realização do teste de reação acrossômica.

À Professora Carmem Estefânia Serrra Neto Zúccari pelo apoio e auxilio

durante as sessões de fotografia e pelas longas horas de discussão, sempre

muito prazerosas.

A

Agradecimentos

Ao Professor Nereu Carlos Prestes pela sua disponibilidade e auxílio durante

as correções finais e por compartilhar inúmeras risadas nos últimos nove anos.

Ao Departamento de Clínica Veterinária, pelo empréstimo do microscópio de

fluorescência.

Ao Professor Adalberto José Crocci pela assessoria estatísca do Experimento I.

Ao Professor Paulo Roberto Curi pela assessoria estatística dos

Experimentos II, III e IV.

Às bibliotecárias Rosemary Cristina da Silva e Luciana Pizzani pela revisão

das referências bibliográficas e sugestões.

Aos Professores, Residentes e Funcionários do Departamento de

Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, pelo afeto e apoio ao longo

destes anos.

À pós-graduanda Fabiana Ferreira de Souza pela ajuda incondicional

durante a realização de todas as fases deste trabalho.

A todos os integrantes do Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais

e Silvestres por trabalharem para que nossa especialidade seja reconhecida e

aprimorada.

A todos os colegas de Pós-graduação, pelo agradável convívio e sugestões

sempre pertinentes.

Agradecimentos

Às grandes amigas Denise, Elaine, Maria Célia, Érika e Juliana por serem,

acima de tudo, .

A todos que colaboraram direta ou indiretamente na realização deste trabalho

Amigas

Epígrafe

“O futuro não nos traz nem nos dá nada.

Nós é que, para construí-lo, devemos dar-lhe tudo.”

Simone Weil

Sumário

Sumário Lista de Figuras .................................................................................. 12

Lista de Tabelas .................................................................................. 13

1. Introdução e Revisão Geral _____________________________ 16

1. Introdução ................................................................................... 17

2. Revisão Geral ............................................................................. 20

2.1. Membranas Espermáticas .................................................. 20

2.2. Estrutura e Composição da Membrana Plasmática ........... 21

2.3. Respostas da Célula Espermática à Baixas Temperaturas 27

2.4. Interações dos Componentes dos Diluidores com a Célula

Espermática .......................................................................

31

2. Experimento I ________________________________________ 41

1. Revisão de Literatura .................................................................. 42

1.1. O ejaculado Canino ............................................................. 42

1.2. A centrifugação ................................................................... 44

2. Material e Método ....................................................................... 47

2.1. Animais ................................................................................ 47

2.2. Coleta do Sêmen ................................................................ 47

2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 48

2.4. Procedimentos experimentais ............................................. 49

2.5 Métodos Estatísticos Utilizados............................................. 51

3. Resultados .................................................................................. 52

4. Discussão ................................................................................... 55

3. Experimento II ________________________________________ 58

1. Revisão da Literatura .................................................................. 59

2. Material e Método ....................................................................... 64

2.1. Animais ................................................................................ 64

2.2. Coleta do Sêmen ................................................................. 64

2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 65

Sumário

2.4. Procedimentos Experimentais ............................................. 66

2.5. Métodos Estatísticos Utilizados ........................................... 69

3. Resultados .................................................................................. 70

4. Discussão ................................................................................... 74

4. Experimento III _______________________________________ 77

1. Revisão da Literatura .................................................................. 78

2. Material e Método ..................................................................... 81

2.1. Animais ................................................................................ 81

2.2. Coleta do Sêmen ................................................................. 81

2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 82



3. Resultados .................................................................................. 87

4. Discussão ................................................................................... 90

5. Experimento IV _______________________________________ 94

1. Revisão de Literatura .................................................................. 95

2. Material e Método ..................................................................... 102

2.1. Animais ................................................................................ 102

2.2. Coleta do Sêmen ................................................................. 102

2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 103



3. Resultados .................................................................................. 110

4. Discussão ................................................................................... 114

6. Conclusões __________________________________________ 120

7. Referências Bibliográficas ______________________________ 122

8. Anexos ______________________________________________ 135

9. Resumo _____________________________________________ 143

10. Abstract ____________________________________________ 147

Lista de Figuras

Lista de Figuras Experimento I FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais........ 50 Experimento II FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais........ 68 Experimento III FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais........ 84 Experimento IV FIGURA 1 - Espermatozóides caninos corados com Fitc-PNA

(emitindo fluorescência verde) e pelo PI (emitindo fluorescência vermelha). a – reação acrossomal verdadeira, b - falsa reação do acrossomo c – espermatozóides lesados..............................................

105 FIGURA 2 - Esquema de formação dos grupos experimentais ....... 108

Lista de Tabelas

Lista de Tabelas

Experimento I TABELA 1 - Valores médios de motilidade espermática (%) do

sêmen de cães, nos os 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002...............................................................................

52 TABELA 2 - Valores médios de vigor espermático (escore de 0-5)

do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002...............................................................................

53 TABELA 3 - Valores medianos da aglutinação espermática do

sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002...............................................................................

53 TABELA 4 - Porcentagem média de células espermáticas íntegras

transformadas em arc sen √x (em rad) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após as centrifugações (M1). Botucatu, 2002.....................................................

54 Experimento II TABELA 1 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de

cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002...............................................................................

70 TABELA 2 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de

cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos grupos tratados com meio TRIS Botucatu, 2002..............................................................

71 TABELA 3 - Mediana do vigor espermático (escore de 0-5) do

sêmen de cães avaliado antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002. ............................................................

72 TABELA 4 - Mediana da porcentagem de células íntegras no

sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002..............................................................

73

Lista de Tabelas

Experimento III TABELA 1 - Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen

canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.........

87

TABELA 2 - Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do

sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002..............................................................

88 TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas

espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002............................................

89 Experimento IV TABELA 1- Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen

canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002..............................................................

110 TABELA 2- Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do

sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002..............................................................

110 TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas

espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos.Botucatu, 2002..................................

110

Lista de Tabelas

TABELA 4 - Medianas da qualidade do movimento espermático

descrito por motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade média (VAP) e linearidade do movimento (LIN) avaliada após 30 minutos da descongelação. Botucatu, 2002..................

112 TABELA 5 - Mediana da porcentagem de células espermáticas de

cães lesadas (Ls) e com reação do acrossomo verdadeiras (Rv) após a descongelação.Botucatu, 2002...............................................................................

113

Introdução e Revisão Geral

16

1. Introdução e Revisão Geral


17

1. INTRODUÇÃO

O interesse na reprodução dos cães, tanto com objetivo

de melhoramento e difusão de diferentes raças ou como modelo

experimental para a preservação de canídeos silvestres, desponta como

um vasto campo para os pesquisadores da atualidade.

Para que tais objetivos sejam atingidos com sucesso faz-

se necessário o aprimoramento de biotecnologias de avaliação,

manipulação e conservação do sêmen dos canídeos, assim como, o

conhecimento e controle do ciclo estral, com desenvolvimento de métodos

precisos para a detecção da ovulação e de técnicas acessíveis e menos

cruentas para o depósito do sêmen no trato genital da fêmea.

Os primeiros animais prenhes por inseminação artificial

(IA) foram cães, inseminados com sêmen a fresco, em estudos

conduzidos pelo abade Lazzaro Spallanzani no ano de 1780, na Itália,

provenientes desta experiência deu-se o nascimento de três produtos

vivos e normais (Mies Filho, 1987).

Elias Ivanov, após os trabalhos pioneiros de Spallanzani,

demonstrou que a fecundação era possível mesmo quando se

substituíam os líquidos produzidos pelas glândulas anexas masculinas por

um soro artificial. O mesmo autor, prosseguindo os estudos sobre

reprodução, esclareceu o papel do frio na conservação do sêmen extra-

organismo (Mies Filho, 1987).

A primeira gestação decorrente de IA com sêmen canino

preservado em leite pasteurizado e refrigerado por 7 dias, foi descrita por

Harrop (1954). A refrigeração é um processo de preservação do sêmen a


18

uma temperatura de 5ºC por um período determinado indicado em alguns

casos como, quando o macho e a fêmea encontram-se em lugares

distintos de difícil acesso, ou nos casos de impedimento legal da entrada

de animais em outro estado ou país, antes de um determinado período de

observação (Cunha, 1997; Johnston et al., 2001).

O sucesso na congelação de sêmen canino foi descrito

por Rowson (1954). Coincidentemente, Seager (1969) anunciou a

primeira prenhez, resultante de uma inseminação artificial com sêmen

congelado em cães.

Estudos realizados com sêmen congelado de cães

demonstraram que, aparentemente, o espermatozóide descongelado não

apresenta a mesma motilidade e vigor do sêmen fresco ou refrigerado,

conseqüentemente, sua sobrevivência no trato genital feminino é reduzida

(Gill et al., 1970; Oettlé, 1986; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989; Morton e

Bruce, 1989; Rota et al., 1995; England e Ponzio, 1996; Gabaldi e Lopes,

1998; Peña et al., 1998; Johnston et al., 2001).

Rotineiramente, o sêmen congelado é utilizado para a

inseminação artificial em outras espécies como a bovina, eqüina, ovina e

caprina, e, na maioria delas, o sêmen descongelado é depositado no

útero, evitando desse modo, a barreira cervical, o que não ocorre na

espécie canina, onde o sêmen é normalmente depositado no fundo da

vagina (Morton e Bruce, 1989; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989).

As técnicas de preservação de sêmen em baixas

temperaturas, causam diminuição da fertilidade, devido principalmente, as

lesões estruturais e funcionais dos espermatozóides advindas do estresse

térmico (Morton e Bruce, 1989; Jasko, 1994).

O estudo da complexa estrutura e funcionamento da

membrana plasmática (MP) é um dos passos mais importantes para o


19

entendimento das interações das células espermáticas com o meio que as

circunda e ainda para que se minimizem os efeitos deletérios causados

pelas alterações provocadas por diminuição ou aumento da temperatura,

alterações no pH e na osmolaridade (Watson, 1981; Gennis, 1989).

O caráter bioquímico dos componentes dos meios

diluidores, a maneira como interagem com os espermatozóides e a

possibilidade de sua metabolização ou até, os possíveis efeitos adversos

aos espermatozóides devem ser minuciosamente avaliados.

A técnica de preservação mais estudada no sêmen dos

canídeos é a congelação, porém, existem ainda algumas dificuldades

encontradas na padronização desta metodologia, devido principalmente,

às particularidades inerentes a esta espécie.

Em vista do exposto é que tivemos como objetivo deste

trabalho estudar e avaliar o efeito de diferentes etapas da criopreservação

do sêmen canino dando-se principal enfoque a:

Verificar o efeito do processo de centrifugação sobre

a qualidade do sêmen canino (experimento I).

Verificar o efeito de diferentes períodos de equilíbrio e

momentos de glicerolização sobre o sêmen canino

(experimento II).

Verificar o efeito de diferentes períodos de equilíbrio e

diluidores na congelação do sêmen canino

(experimento III).

Verificar o efeito de três diferentes diluidores sobre o

sêmen canino descongelado sob dois diferentes

protocolos (experimento IV).


20

2. REVISÃO GERAL

2.1. MEMBRANAS ESPERMÁTICAS

O estudo detalhado da estrutura e função das membranas

espermáticas torna-se extremamente necessário quando objetivamos

empregar, com êxito, biotécnicas de preservação espermática.

Todas as células - procariontes ou eucariontes - são

circundadas por uma membrana plasmática (MP) que define a delimitação

da célula, separando seu conteúdo do meio que a circunda. Por servir de

barreira seletiva, a MP determina a composição do citoplasma celular

(Cooper, 1996), e, tem, papel fundamental na maioria dos fenômenos

celulares (Singer e Nicolson, 1972).

Segundo descrito por Singer e Nicolson (1972), o modelo

básico das membranas biológicas segue a organização estrutural de:

bicamada de fosfolipídios com proteínas associadas (Gennis, 1989;

Cooper, 1996). O mesmo modelo é também verificado nas membranas

espermáticas (Watson, 1981; Watson, 1995).

Nos espermatozóides, o duplo folheto não é,

simplesmente, uma bicamada passiva de membrana lipídica em que

receptores recebem seus sinais moleculares específicos, mas sim, uma

estrutura altamente especializada, assumindo um papel ativo na

capacidade fertilizante, recebendo sinais e modificando-se ao longo do

processo de espermatogênese, trânsito e armazenagem no epidídimo,

ejaculação, depósito no trato genital feminino e, finalmente, capacitação e


21

penetração do oócito (Bayard, 1982; O´Rand, 1982; Holt, 1995; Watson,

1995; Lenzi et al., 1996).

O padrão definitivo de lipídeos dos espermatozóides de

um ejaculado só é estabelecido após sua maturação epididimária (Holt,

1984; Watson, 1995; Lenzi et al., 1996). Holt (1984) sugeriu que, além

das modificações da superfície celular, relatadas como de maior

importância neste processo, ocorrem ainda modificações no interior da

MP dos espermatozóides durante sua passagem pelo epidídimo como

modulação da fluidez, da permeabilidade e da mobilidade das proteínas

integrais das membranas.

Fatores externos às células espermáticas, tais como,

alterações na composição, pH, temperatura e osmolaridade do meio que

as circunda, podem provocar alterações irreversíveis em suas membranas

limitando a função fertilizante dos espermatozóides (Gennis, 1989;

Watson, 2000).

2.2. ESTRUTURA E COMPOSIÇÃO DA MEMBRANA PLASMÁTICA

Lipídeos

Uma grande variedade de lipídeos pode constituir a MP

de uma célula e a razão para a existência de tal diversidade parece estar

diretamente ligada à função específica que cada membrana exercerá. A

heterogeneidade em sua constituição, levando a uma especificidade de

função, é o fator mais intrigante quanto à composição das membranas

biológicas (Gennis, 1989).


22

As principais classes lipídicas encontradas na MP dos

espermatozóides de mamíferos e de aves não são diferentes daquelas

encontradas em outras células animais, e incluem, primariamente,

fosfolipídios, glicolipídios e esteróis. Contudo, a maioria das espécies

moleculares dentro dessas classes lipídicas são também particulares dos

espermatozóides e apresentam proporções variando substancialmente

com o estágio de maturação e desenvolvimento desta célula e ainda com

as espécies animais (Parks e Graham, 1992; Watson, 1995).

Os fosfolipídios são constituintes de grande parte das

membranas espermáticas, sendo responsáveis por cerca de 60 a 70%

dos lipídeos totais de um ejaculado (Watson, 1981). São moléculas

anfipáticas constituídas por duas cadeias de ácidos graxos hidrofóbicos

ligados a um grupo fosfato que constitui a cabeça hidrofílica (Gennis,

1989; Cooper, 1996).

Devido ao fato das caudas dos ácidos graxos serem

dificilmente solúveis em água, os fosfolipídios, espontaneamente, formam

uma bicamada quando em solução aquosa, com suas caudas

hidrofóbicas voltadas para o interior da membrana, e seus grupos polares

da cabeça, expostos para os dois lados, em contato com a solução

aquosa (Cooper, 1996).

Em adição aos fosfolipídios, a MP das células animais

contém ainda glicolipídios e colesterol. Membranas diferentes podem

conter quantidades distintas destes constituintes, diferindo em seus

comprimentos e graus de saturação. Em combinação, estes parâmetros

são importantes na determinação das propriedades dinâmicas das

membranas (Widnell e Pfenninger, 1990).

Os glicolipídios são encontrados exclusivamente no

folheto externo da MP, com a porção glicosilada exposta na superfície


23

celular. Estes são, relativamente, o menor componente, constituindo cerca

de 2% dos lipídeos totais da MP (Cooper, 1996).

O colesterol por outro lado, é o maior componente da MP

de células animais, estando presente nas mesmas quantidades molares

que os fosfolipídios (Cooper, 1996). A quantidade de colesterol

encontrada na membrana espermática varia entre suas diferentes partes

(e.x., a taxa de colesterol/fosfolipídio da membrana espermática é maior

do que a da membrana acrossomal), entre as espécies animais e ainda

varia entre indivíduos de uma mesma espécie (Gennis, 1989; Amann e

Graham, 1993; Holt, 1995; Cross, 1998).

Devido a sua estrutura de espiral rígido, o colesterol

exerce uma função distinta na estrutura da membrana. Este, sozinho, não

pode agrupar-se e formar uma bicamada, mas está inserido na bicamada

de fosfolipídios, com seu grupo polar hidroxil voltado para a cabeça do

grupo fosfolipídio (Cross, 1998; Cooper, 1996). O colesterol tem

importante papel na regulação da estabilidade e da permeabilidade da MP

(Yeagle, 1985), sendo que o efluxo de colesterol da MP dos

espermatozóides é o primeiro passo para o início do processo de

capacitação (Seki et al., 1992).

Cross (1998) relatou que a taxa colesterol/fosfolipídio

existente na membrana espermática exerce importante papel regulador do

processo de capacitação espermática, e que, trocas de colesterol por

fosfolipídios entre a MP e o meio externo, diminuindo o conteúdo de

colesterol, e aumentando, com isso sua fluidez, desencadeiam a reação

do acrossomo por: diminuir a microviscosidade da MP , diminuir a adesão

entre os fosfolipídios e, talvez, permitir um maior influxo de cálcio para a

célula espermática. Todos estes seriam passos inespecíficos que

intermediariam a fusão da membrana plasmática com a membrana


24

acrossomal externa, processo fusogênico conhecido por reação do

acrossomo.

Cross (1998) considerou ainda que a MP de um

espermatozóide recém ejaculado é incapaz de sofrer a reação do

acrossomo por estar, de alguma maneira, “congelada” pela alta

quantidade de colesterol em sua estrutura.

Dependendo da temperatura, o colesterol exerce efeitos

distintos sobre a fluidez da membrana. Em altas temperaturas, o

colesterol interfere no movimento das cadeias de ácidos graxos dos

fosfolipídios, tornando a parte interna da membrana menos fluida,

reduzindo a permeabilidade à pequenas moléculas. Em baixas

temperaturas contudo, o colesterol exerce efeito contrário por interferir

nas interações entre as cadeias de ácidos graxos, prevenindo a

membrana dos efeitos da refrigeração e mantendo a sua fluidez (Cooper,

1996).

A organização estrutural em forma de bicamada é

essencial para que as funções primordiais da MP sejam cumpridas, esta

conformação, composta de duas dimensões fluidas, permite que

moléculas individuais, lipídeos ou proteínas encontrem-se livres para

movimentos de rotação ou ainda para a movimentação lateral através da

membrana (Gennis, 1989; Cooper, 1996).

Proteínas

Enquanto os lipídeos são os elementos estruturais

fundamentais das membranas, as proteínas são responsáveis por

intermediar e realizar suas funções específicas (Cooper, 1996).


25

Quanto a sua massa, a MP é constituída de

aproximadamente 50% de lipídeos e 50% de proteínas, com as porções

de carboidrato dos glicolipídios e das glicoproteinas constituindo 5 a 10%

(Singer e Nicolson, 1972; Widnell e Pfenninger, 1990; Amann e Graham,

1993; Cooper, 1996). Por serem as proteínas muito maiores que os

lipídeos, esta porcentagem corresponde a aproximadamente uma

molécula de proteína para cada 50 a 100 moléculas de lipídeos (Cooper,

1996).

Segundo Amann e Graham (1993), embora uma grande

parte destas proteínas sejam histonas envolvidas no acondicionamento

de DNA, outras estão envolvidas com enzimas do acrossomo, receptores

da MP, elementos de funcionalidade da membrana (transporte de íons e

carboidratos) e estruturas do citoesqueleto (dando formato à cabeça ou

provendo os filamentos da cauda).

Singer e Nicolson (1972) distinguiram duas classes de

proteínas associadas à membrana, chamando-as de proteínas periféricas

e integrais à membrana. As proteínas periféricas não estão inseridas no

interior hidrofóbico da bicamada lipídica, em vez disso, encontram-se

indiretamente associadas com as membranas através de interações

protéicas, que, freqüentemente, envolvem ligações iônicas que se

desfazem por pH extremo ou frente a altas concentrações de sais. As

proteínas integrais à membrana só podem ser liberadas por tratamentos

que rompam a bicamada de fosfolipídios.

Muitas das proteínas integrais são chamadas

transmembrana, por apresentarem vários mergulhos na bicamada de

fosfolipídio, desta forma, apresentam porções expostas para os dois lados

da membrana. Assim como os fosfolipídios, as proteínas transmembrana

são moléculas anfipáticas, com suas porções hidrofílicas expostas para o

meio aquoso, dos dois lados da membrana. Algumas destas proteínas


26

mergulham somente uma vez na membrana, outras realizam múltiplos

mergulhos (Cooper, 1996).

As proteínas e os fosfolipídios não são tão hábeis em se

movimentar de um folheto para o outro da bicamada, por estarem

inseridos em uma camada fluida, tanto os lipídeos como as proteínas são

capazes de se difundir, com muita facilidade lateralmente através da

membrana (Cooper, 1996).

Ainda assim nem todas as proteínas são capazes de

difundir-se livremente pela MP. Em alguns casos, a mobilidade das

proteínas da membrana é restrita por associações com o citoesqueleto.

Com intenção de manter funções distintas, algumas vezes a mobilidade

das proteínas da MP pode ser restrita a domínios apropriados da

superfície celular (Cooper, 1996).

Imediatamente após a espermiogênese, o

espermatozóide recém formado possui 3 áreas maiores de domínio em

sua MP: cauda posterior, cauda anterior e conjunto da cabeça (Bartles,

1995). Em uma divisão futura, o domínio do conjunto da cabeça da MP

dos espermatozóides divide-se em cabeça anterior e cabeça posterior,

após sua passagem pela rete testis e pelo epidídimo (Holt, 1984; Bartles,

1995).

Glicocálice

Como já descrito anteriormente, a porção extracelular das

proteínas da MP geralmente é glicosilada, com a porção carboidrato

exposta na face externa da MP, conseqüentemente, a superfície da célula

é coberta por uma camada de carboidratos, conhecida como glicocálice,

formada por oligossacarídeos de glicolipídios e glicoproteinas

transmembrana (Cooper, 1996).


27

Uma parte da função dos glicocálices é de proteger a

superfície celular. Além disso, os oligossacarídeos dos glicocálices

servem de marcadores para uma grande variedade de interações

celulares (Cooper, 1996).

Amann e Graham (1993) citaram a presença do

glicocálice na superfície da membrana espermática. Afirmaram, ainda,

que muitas das proteínas da superfície externa da MP dos

espermatozóides contêm cadeias de carboidratos que tendem a formar

um campo de carga negativa e a atrair, e ligar-se, negligentemente, a

outras proteínas do meio que os circunda. Devido a este material

adsorvido, o aspecto externo da região do glicocálice dos

espermatozóides pode variar, dependendo da sua situação ou do meio

em que ele se encontra.

2.3. RESPOSTAS DA CÉLULA ESPERMÁTICA Á BAIXAS TEMPERATURAS

A congelação e a posterior descongelação, com a

manutenção de todas as funções vitais, é um desafio alcançado com

sucesso por alguns microorganismos da natureza (Mazur et al. 1972).

O resfriamento leva a célula a um estado de quiescência,

reduzindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição nos gastos

energéticos e na produção de catabólitos tóxicos, contribuindo para a

preservação celular. Da mesma maneira que a congelação pode diminuir

ou paralisar algumas reações bioquímicas celulares, ela pode, também,

acelerar outras, levando a danos ou mesmo a morte celular (Mazur et al.

1972, Watson, 1981; Watson, 1995; Holt, 2000).


28

Todos estes efeitos podem se apresentar de maneira

diferente entre as várias espécies animais, entre indivíduos de uma

mesma espécie e ainda entre os compartimentos do espermatozóide,

como o acrossômico ou o mitocondrial (Watson, 1995; Holt, 2000; Kirk,

2001).

De acordo com Jasko (1994), as técnicas de preservação

do sêmen em baixas temperaturas, como a refrigeração ou a congelação,

causam uma diminuição da fertilidade, devido às injúrias ocorridas nas

células espermáticas, advindas do choque térmico.

O termo Estresse Térmico ou Choque Térmico define

um conjunto de alterações ocorridas nos espermatozóides dos mamíferos

quando resfriados rapidamente da temperatura corpórea até temperaturas

próximas a 50C, que tem como consequência um decréscimo irreversível

da motilidade espermática, mudanças na bioquímica e no funcionamento

das células espermáticas incluindo: diminuição da taxa da glicólise, da

respiração celular e da frutólise, aumento na degeneração do ácido

desoxirribonucléico e liberação de material intracelular (Amann e Graham,

1993; Jasko, 1994; Zúccari, 1998; Holt, 2000; Watson, 2000).

A maioria das alterações causada pelo estresse térmico

se inicia na membrana espermática (Jasko, 1994, Holt, 2000). A alteração

da temperatura, assim como alterações de osmolaridade, pressão ou pH

podem determinar mudanças na estrutura e organização da bicamada de

fosfolipídios (Gennis, 1989).

A redução de temperatura de 37ºC a valores próximos de

4-5ºC pode levar ao rearranjo de alguns fosfolipídios semelhantes dentro

da bicamada, que podem agrupar-se e assumir configuração hexagonal

do tipo II, na qual, as cabeças polares hidrofílicas dos fosfolipídios se

agrupam formando micelas, com suas caudas hidrofóbicas voltadas para

o lado externo. Com este rearranjo as propriedades básicas da membrana


29

biológica, como permeabilidade seletiva e difusão lateral de proteínas,

não são mantidas alterando a funcionalidade da membrana em questão

(Watson, 1981; Gennis, 1989; Parks e Graham, 1992; Amann e Graham,

1993; Jasko, 1994; Watson, 1995; Holt, 2000; Watson, 2000).

Watson (2000) citou ainda que outros elementos da

bicamada de fosfolipídios podem ser extremamente afetados pela queda

da temperatura, um exemplo seria a mobilidade das proteínas integrais

que poderá ser restrita pelo efeito da fase transicional dos lipídios, o que

levará a uma alteração em suas atividades, especialmente aquelas

proteínas dependentes de sua modulação estrutural para a manutenção

de suas funções, como é o caso das proteínas formadoras dos canais

iônicos.

A regulação do influxo de cálcio é claramente afetada pelo

resfriamento, sendo indiscutivelmente, uma das mais graves alterações

em termos de função espermática, e, em alguns casos, esta alteração

pode ser incompatível com a viabilidade espermática. A entrada de cálcio

na célula durante o resfriamento, mimetizando o que ocorre

fisiológicamente durante a capacitação, contribui para o inicio das reações

fusogênicas entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal

externa. Watson (2000) relatou a existência de uma grande similaridade

entre os danos verificados na MP durante a congelação e as alterações

verificadas após a reação do acrossomo, este autor considerou uma a

versão desorganizada da outra.

Segundo a revisão de Watson (2000) existem ainda

alguns elementos do citoesqueleto espermático sensíveis a alterações de

temperatura, como é o caso dos filamentos de actina. O mesmo autor

relatou que a despolimerização da F-actina é uma das etapas necessárias

para permitir a aproximação da MP e da membrana acrossomal externa,

promovendo a exocitose acrossomal e que, talvez, esta possa ser uma


30

das explicações para a fusão desorganizada das membranas após o

resfriamento e a criopreservação dos espermatozóides.

Com o declínio constante da temperatura, as células

estarão expostas à temperatura de congelação (abaixo de 0ºC), e com

isto, as células espermáticas serão expostas a alterações de

osmolaridade do meio que as circunda. A água presente no meio

extracelular encontra-se sob a forma de solução, com a congelação de

parte desta água, a saturação de solutos aumenta, tornando hipertônico o

meio externo. Neste momento, para que um equilíbrio osmótico seja

atingido, ocorre um efluxo de água da célula a ser congelada para o meio

externo. Esta tentativa da célula em equilibrar o meio que a circunda pode

levá-la a sofrer um efeito deletério devido a grande desidratação e a

exposição a um meio extremamente saturado. Este efeito é chamado de

Efeito de Solução e é considerado um dos pontos críticos no processo

de congelação das células espermáticas (Mazur et al. 1972; Watson,

1981; Watson, 1995; Holt, 2000).

Quando se congela uma célula lentamente, existe tempo

hábil para que uma grande quantidade de água migre da célula

espermática para o meio extracelular, na tentativa de reverter os danos do

efeito de solução. Neste caso, é imprescindível que a descongelação se

faça também lentamente, para que os volumes de água sejam

reequilibrados antes da total descongelação, evitando que grandes

alterações do volume celular provoquem lesão da membrana

espermática, por outro lado, se a congelação se dá rapidamente não

ocorre uma grande alteração no volume de água no interior da célula e

microcristais de gelo serão ali formados. A descongelação neste caso

deve ser realizada também de maneira rápida, pois, se esta é realizada

de maneira lenta a água intracelular se descongela em um momento em

que existe ainda temperatura baixa o suficiente para haver uma

recristalização da água recém descongelada. Se isto acontecer, grandes


31

cristais, advindos da recristalização se formarão, expondo a célula ao

risco de sofrer perfurações por estes grandes cristais de gelo (Mazur et al.

1972, Watson, 1981, Watson, 1995, Holt, 2000).

Watson (1995) afirmou ainda que a habilidade em

suportar o choque térmico é adquirida pelos espermatozóides durante sua

passagem pelo epidídimo e que esta capacidade de suportar flutuações

de temperatura está diretamente relacionada com as mudanças nos

lipídios das membranas espermáticas que ocorrem neste momento. Este

mesmo autor sugeriu ainda que alterações tanto na freqüência das

ejaculações, como no tempo do trânsito epididimário e da exposição dos

espermatozóides aos fluidos epididimários, podem ser uma explicação em

potencial, para diferenças de congelabilidade entre ejaculados de um

mesmo indivíduo.

Um dos aspectos de maior questionamento dentro dos

estudos da criopreservação é saber quando as alterações ocorrem, se

durante o congelamento ou se no descongelamento. Existem evidências

sugestivas de que células congeladas podem ser danificadas pela

descongelação e este efeito tem sido atribuído, principalmente, à

recristalização dos microcristais durante uma descongelação inapropriada

(Watson, 1995).

2.4. INTERAÇÕES DOS COMPONENTES DOS DILUIDORES COM A CÉLULA ESPERMÁTICA

Um protocolo de preservação adequado deve manter o

potencial fertilizante das células espermáticas que deverão, ao final de

todo o processo, apresentar a vitalidade necessária para atingir o local da

fertilização e estarem aptas a concluir a capacitação e a reação

acrossômica, que constituem o estágio final de maturação espermática e


32

possibilitam a fecundação de um oócito (Watson, 1995; Rota, 1998; Ström

Holst, 1999; Peña, 2000).

Tanto para a refrigeração como para a congelação do

sêmen, diluidores são utilizados com o intuito de proteger os

espermatozóides de todos os efeitos críticos do processo de congelação.

Para tanto, deverão ser adicionadas, aos diluidores, macromoléculas

como lipoproteínas e fosfolipídios que atuarão como estabilizadores da

MP e como crioprotetores. Deveremos ainda fornecer fonte de nutrientes

para o metabolismo espermático e meio tampão para a manutenção do

pH. O desenvolvimento de um meio diluidor está sempre voltado para a

obtenção de uma boa estabilização dos componentes da MP (Parks e

Graham, 1992; Jasko, 1994).

Holt (2000) em sua revisão afirmou existirem diferenças

na composição lipídica da MP entre espécies, raças e ainda entre

indivíduos da mesma espécie, sendo talvez, a explicação para que um

mesmo meio diluidor confira maior ou menor proteção aos

espermatozóides de um determinado indivíduo. Watson (2000) e Kirk

(2001) consideraram os indivíduos como “bons congeladores” e “maus

congeladores”, e estas duas classes se diferenciam pela capacidade dos

indivíduos em tolerar os efeitos deletérios da criopreservação.

Açúcares

Os açúcares têm sido incluídos nos diluidores para

conservação de sêmen a baixas temperaturas como substrato de energia

endógena, como componente osmótico e como agente crioprotetor

(Farstad, 1996; Peña, 1997; Holt, 2000; Johnston et al., 2001).


33

O espermatozóide, como outras células, é capaz de metabolizar os hidratos de carbono mediante um mecanismo oxidativo ou aeróbico (do qual restam como resíduo CO2 e H2O), ou por mecanismo anaeróbico (de degradação incompleta), na qual a quebra dos carboidratos estaciona na fase do ácido lático, que se acumula (Pérez e Pérez, 1994).

Rigau et al. (2001), partindo do princípio de que os espermatozóides podem metabolizar tanto a glicose como a frutose, avaliaram os efeitos destas duas hexoses sobre o padrão de motilidade espermática em cães. Os autores concluíram que a frutose induz um padrão de motilidade mais rápido e mais linear que a glicose e especularam ainda que a incubação em presença de glicose resultou em padrão de motilidade semelhante àquele verificado em espermatozóides caninos hiperativados.

Os di e trissacarídeos, não metabolizáveis pelos espermatozóides, exercem ainda um efeito crioprotetor em função de seu alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico atuando como substitutos de eletrólito. Não possuem capacidade de penetrar a membrana quando a concentração de solutos é elevada e dão melhores resultados quando acrescidos à fração glicerolizada do extensor (Salisbury e Vandemark, 1978).

Além de suas propriedades coligativas, os açúcares exercem efeito crioprotetor interagindo diretamente com a membrana. Estas interações envolvem ligações de hidrogênio dos grupos hidroxil dos açúcares com o grupo fosfato localizados na cabeça dos fosfolipídios. Por restaurar o percentual de água ao redor dos grupos polares da cabeça dos fosfolipídios, os açúcares podem prevenir os danos causados pela desidratação extrema que pode ocorrer com a congelação (Holt, 2000). Geralmente, os dissacarídeos (sucrose, trealose) são mais efetivos em estabilizar a bicamada do que os monossacarídeos (De Leeuw, 1993).


34

Gema de ovo

Desde que Phillips e Lardy (1940) descobriram os efeitos

benéficos da gema de ovo na conservação dos espermatozóides, muitos

estudos foram realizados para elucidar a origem da indiscutível “ação

benéfica” que este produto oferece aos espermatozóides na condução da

conservação “in vitro”.

O principal efeito protetor da gema do ovo parece ocorrer

pela diminuição dos efeitos negativos do choque frio estabilizando as

membranas espermáticas (Holt, 2000). Watson (1979) demonstrou que

uma lipoproteína de baixa densidade encontrada na gema de ovo é o

fator ativo que protege a célula espermática do choque frio, porém o

mecanismo pelo qual este efeito se dá permanece obscuro.

Watson (1981) demonstrou que a gema de ovo pode

conferir diversos graus de proteção aos espermatozóides de diferentes

espécies animais, sendo que a explicação para esta observação seja

devido, principalmente, à comprovação da existência de distintas

composições lipídicas das MP entre as espécies animais.

Devido às recentes necessidades de controle de doenças

e ainda, para se evitar o uso de meios diluidores compostos por

substância biológicas existe um crescente desejo dos pesquisadores em

encontrar um substituto bioquimicamente estável para a gema de ovo,

porém, até o presente, devido, principalmente, à falta de dados sobre o

mecanismo exato de como a gema do ovo interfere na estabilização das

membranas espermáticas, este substituto ainda não foi encontrado (Holt,

2000).


35

Leite

O emprego do leite como meio diluente de sêmen foi

primeiramente demonstrado por Donne em 1837. Segundo Hoffman

(1905) o leite era um líquido orgânico com importante propriedade

biológica para a conservação dos espermatozóides por possuir certa

capacidade tampão, ação bactericida, viscosidade adequada para a

manutenção dos espermatozóides no meio líquido com abundância de

carboidratos que seriam utilizados pelos espermatozóides na produção de

energia.

Em 1950, Koelliker comprovou a eficácia do leite na

criopreservação de sêmen e afirmou que duas substâncias eram

responsáveis por esta característica: a lactose, que age como elemento

energético, e proteínas que são substâncias capazes de potencializar a

atividade cinética dos espermatozóides.

Cunha (1997) e Johnston et al. (2001) verificaram a

possibilidade da utilização de um diluidor a base de leite desnatado e

glicose, rotineiramente utilizado na espécie eqüina, para a refrigeração e

transporte do sêmen canino.

Glicerol

A adição de crioprotetores ao meio diluidor é essencial

para a sobrevivência das células espermáticas após os processos de

resfriamento, porém os crioprotetores podem acarretar danos às células

(Parks e Graham, 1992).

Muito são os compostos de ação crioprotetora que são

tradicionalmente classificados como tendo ação intra ou extracelular.

Dentro do grupo de ação intracelular, se incluem o glicerol, o


36

dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol, propanodiol, butanodiol, metanol. A

ação protetora destes crioprotetores é atribuída a suas propriedades

coligativas e ligantes com água, diminuindo o ponto crioscópio

intracelular, e, portanto, aumentando a quantidade de água que

permanece no estado líquido sob baixas temperaturas, diminuindo a

concentração intracelular de solutos e reduzindo os danos do efeito de

solução (Peña, 1997; Holt, 2000).

Desde que Polge et al. (1949) demonstraram a eficácia do

glicerol, ele foi considerado o crioprotetor universal sendo a substância

mais amplamente empregada na congelação de sêmen, incluindo a

espécie canina (England, 1992).

Durante o processamento do sêmen ocorrem bruscos

movimentos de água e de crioprotetores em uma célula espermática,

sendo possível que movimentos similares ocorram também em cada

compartimento espermático. Este movimento de água através da

membrana é influenciado, principalmente, pela existência de defeitos na

membrana plasmática e pela composição e estrutura da bicamada lipídica

(Hammersted e Graham, 1990; Peña, 1997).

A primeira conseqüência da adição do glicerol em um

meio isotônico é uma alteração de volume celular devido a uma rápida

saída de água intracelular (enrugamento celular), seguido por um lento

retorno ao volume original à medida que o crioprotetor penetra na célula

(Hammersted e Graham, 1990; Peña, 1997).

Hammersted e Graham, 1990, descobriram que a

exposição de células a um meio diluidor com concentração de 0,5 M de

glicerol pode criar uma concentração intramembrana de 1mM de glicerol,

logo, por alterar a composição da membrana espermática, o glicerol pode

ainda alterar as propriedades básicas da MP por induzir mudanças no


37

acondicionamento de fosfolipídios e ainda alterar a estabilidade e a

permeabilidade a água.

A fusogenicidade da membrana e o padrão de respostas

induzidas por sinais extracelulares podem ser alterados devido a estas

mudanças causadas pela inclusão do glicerol à membrana espermática,

podendo este fato contribuir para a diminuição da sobrevivência

espermática posterior ao processo de congelação/descongelação e

acelerar a capacitação espermática (Watson, 1995).

Segundo England (1992) a concentração de glicerol

utilizada para a congelação do sêmen de cão varia de 4 a 11%, sendo

que, segundo Watson (1979), a concentração ótima de glicerol em um

meio diluente representa um equilíbrio perfeito entre o efeito protetor e o

efeito tóxico do glicerol.

O grupo dos agentes extracelulares inclui as proteínas,

açúcares de elevado peso molecular, polivinilpirrolidona, etc. Atuam

através de mecanismo osmótico promovendo a desidratação celular

durante a congelação e impedindo a formação de grandes cristais de gelo

no interior da célula (Peña, 1997; Holt, 2000).

Tampões

O contínuo metabolismo espermático, produzindo como

resultado grandes quantidades de catabólitos tóxicos, acarreta num

aumento do ácido lático no meio extracelular. Este acúmulo pode causar a

morte dos espermatozóides devido a drásticas alterações do pH no meio

extracelular. Daí a necessidade de adição de tampões ao meio diluidor

(Pérez e Pérez, 1994; Farstad, 1996; Holt, 2000).


38

O fosfato foi primeiramente testado para este fim, porém o

citrato de sódio, introduzido por Salisbury em 1940, adaptou-se melhor a

esta finalidade. O citrato de sódio aumenta a capacidade de diluição da

gema de ovo ao meio líquido, fenômeno que favorece sobremaneira a

ação da gema sobre os espermatozóides. Este fenômeno é

particularmente notável no que diz respeito ao choque frio e, com o

emprego do citrato de sódio, se obtém um aumento no tempo de

sobrevivência dos espermatozóides (Pérez e Pérez, 1994).

Tampões devem ser utilizados para a manutenção do

balanço iônico e do pH no diluidor (Johnston et al., 2001). Substâncias de

poder tampão, incluindo citrato de sódio, TRIS

(trishidroximetilaminometano) ou TES, têm sido utilizados com sucesso na

preservação de gametas de canídeos (Farstad, 1996, Rota, 1998, Holt,

2000; Peña, 2000; Johnston et al., 2001).

Aditivos

Espécies reativas de oxigênio (H2O2; O2-,-OH, ROOH,...) e

os antioxidantes têm demonstrado um importante papel na fertilidade e na

infertilidade. Algumas evidências diretas ou indiretas levam a crer que em

vários momentos da criopreservação do sêmen estas espécies são

formadas. O controle do nível das espécies reativas de oxigênio pela

inclusão de antioxidantes ou pelo uso de condições que reduzam a

oxidação durante a congelação tem sido descrito (Papa et al., 1993;

Bilodeau et al., 2001).

Vários aminoácidos, entre eles a glicina, têm sido

incluídos na preservação do sêmen (Papa et al., 1993; Ball, et al., 2001;

Bilodeau et al., 2001). De acordo com Papa et al. (1993) a ação da glicina

ainda não está totalmente esclarecida, mas sabe-se, que esse


39

aminoácido participa na síntese de enzimas antioxidantes (Gluthation

Peroxidase), inibindo a formação de radicais livres e, conseqüentemente,

protegendo a membrana celular da oxidação.

Segundo Bicudo (1993), a adição de glicina e OEP ao

meio citrato-gema melhorou o vigor espermático assim como aumentou a

retenção de acrossomo após a congelação do sêmen bovino.

A adição de diferentes compostos detergentes, como o

Equex STM paste ou o Orvus ES paste ambos tendo como fração ativa o

SDS (dodecil sulfato sódico) em diluentes de congelação parece ser

benéfica para várias espécies, incluindo a espécie canina (Rota et al.,

1997; Holt, 2000; Peña, 2000).

O SDS é um detergente aniônico do grupo alquil iônico,

solúvel em água, que age desnaturando proteínas de membrana, e que,

quando em altas concentrações, pode solubilizar completamente

membranas biológicas. A natureza da proteção exercida pelo SDS não é

completamente conhecida, sugere-se que o efeito do SDS possa ser

exercido diretamente no meio extracelular, solubilizando as lipoproteínas

da gema do ovo e aumentando, desta forma, seu potencial de proteção

(Holt, 2000; Peña, 2000).

Rota et al. (1997) incluíram o Equex STM paste ao seu

diluidor para o sêmen de cão e constataram sua ação benéfica aos

espermatozóides. Os mesmos autores, em acordo com o citado

anteriormente, sugeriram que a fração ativa do Equex, o SDS, deve estar

envolvida com a solubilização e a ativação de componentes da gema de

ovo.

Peña (2000) constatou que o Equex, quando utilizado em

diluidores para o sêmen canino, exerceu um efeito protetor sobre as

membranas espermáticas e sugeriu que o SDS possa ter reduzido a fase


40

de transição lipídica e/ou protegido o funcionamento de bombas iônicas

dos espermatozóides.

Peña (2000) alertou para o fato de que a exposição

prolongada dos espermatozóides ao SDS ou às lipoproteínas da gema de

ovo tratadas pelo SDS, pode conferir um excesso de fluidez às

membranas espermáticas indicando que seu efeito benéfico é

dependente do tempo de exposição e da concentração deste no meio

diluidor.

Experimento I

41

2. Experimento I

Experimento I

42

EFEITO DO PROCESSO DE CENTRIFUGAÇÃO SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN CANINO

1. REVISÃO DE LITERATURA

Os ejaculados caninos apresentam oscilações

significativas de volume e concentração espermática devido,

principalmente, a grandes variações de tamanho entre animais e entre as

diferentes raças (Cunha, 1998).

Para que se determine um protocolo de congelação na

espécie canina, onde alguns fatores como: a concentração espermática

por palhetas e a concentração de crioprotetor por célula espermática

sejam constantes, faz-se necessário que esta variação de volume do

ejaculado canino seja minimizada.

A centrifugação é uma das formas propostas na literatura

para se padronizarem essas variações e manter constantes o volume e a

concentração espermática sem que se verifique influencia negativa sobre

as células espermáticas (Papa, 1987; Lopes e Papa, 1998; Kirk, 2001).

1.1. O ejaculado canino

Segundo Heidrich (1977), foi Freiberg em 1935 o pioneiro

a identificar o fracionamento no ejaculado do cão. Chamou a primeira

fração de uretral ou pré-espermática, a segunda, de fração rica em

espermatozóides, e a terceira, de fração prostática ou pós-espermática.

A primeira fração ou pré-espermática apresenta um

aspecto aquoso, cujo pH varia de 6,2 a 6,5 e um volume entre 2,4 ± 1,8ml

Experimento I

43

(Johnston, 1991; Silva et al., 1996, Peña, 1997). England e Allen (1992)

sugeriram que as frações pré-espermática e pós-espermática são

originadas na próstata.

A segunda fração ou espermática apresenta um aspecto

de cremoso a aquoso e sua coloração fisiológica varia de branco

opalescente ao marfim, o pH situa-se entre 6,3 a 6,6 e o volume médio

varia de 0,5 a 3,5 ml (Gunzel-Apel, 1994).

A última fração do ejaculado é de origem prostática e

apresenta um aspecto aquoso e seu pH oscila entre 6,5 e 7,0. O volume é

diretamente proporcional à atividade secretória da glândula prostática e

sua média é de 6,48 ± 4,32ml (Morton e Bruce, 1989; Aguiar et al., 1994).

O fluido prostático é produzido continuamente nos machos

caninos não castrados e reflui retrógradamente para a bexiga ou é

eliminado pelo orifício externo da uretra em quantidades variando de

pequenas gotas até muitos mililitros, dependendo do tamanho prostático

(Johnston et al., 2000)

A próstata é a única glândula acessória em cães, e seu

tamanho e seu peso são dependentes da idade, raça e peso corpóreo (Di

Santis et al., 2001).

O volume de um ejaculado canino está diretamente ligado

à quantidade de líquido prostático. A próstata canina, assim como a

humana, tende a aumentar com o avanço da idade, como resultado de

uma Hiperplasia Prostática Benigna. A maioria dos animais não castrados

e com mais de cinco anos apresentam a próstata aumentada de volume e

posicionada na região abdominal (Johnston, 2000; Di Santis, 2001).

Rota et al. (1995) descreveram os efeitos prejudiciais do

plasma seminal sobre a membrana plasmática dos espermatozóides

bovinos e em seu estudo com sêmen canino, concluíram que a adição de

Experimento I

44

extensores aumentaria o número de células espermáticas com membrana

plasmática íntegra.

A freqüência de coletas apresentada por Feldman e

Nelson (1996) é de uma coleta a cada 48 horas, ou de uma coleta ao dia

durante 3 dias consecutivos e um repouso de 2 dias, ou, ainda, duas

coletas ao dia e repouso de 2 dias, podendo ocorrer um aumento na

concentração total de espermatozóides após alguns dias de repouso

sexual.

Alguns experimentos de congelação do sêmen canino,

sem a eliminação da primeira e da terceira fração, têm sido propostos.

Porém os dados obtidos até o presente sugerem que a utilização

unicamente da fração espermática gera melhores resultados (Peña,

1997). A utilização da centrifugação como forma de eliminar a primeira e a

terceira fração tem sido realizada em alguns protocolos de preservação

do sêmen canino (Lopes e Papa, 1998; Held, 1997).

1.2. A centrifugação

England e Allen (1992) citaram um efeito deletério da

primeira e da terceira fração do ejaculado canino sobre as características

espermáticas. Explicaram ainda que, na cobertura natural, o tempo de

contato do espermatozóide com estas frações é reduzido, diminuindo este

efeito. Os mesmos autores pesquisaram o efeito da incubação dos

espermatozóides caninos diluídos na primeira e terceira frações do

ejaculado e afirmaram existir um declínio no número de espermatozóides

morfologicamente normais, decorrentes dos efeitos deletérios dessas

frações.

Papa et al. (1981) demonstraram que a centrifugação é

um método adequado para o nivelamento da grande variação de

Experimento I

45

qualidade e quantidade de ejaculados eqüinos, e que diversas forças e

tempos de centrifugação não apresentaram efeito negativo sobre a

motilidade espermática, nem sobre a sobrevivência dos espermatozóides,

avaliada por meio de coloração supra vital. Estes autores observaram

efeito positivo da centrifugação sobre a motilidade espermática, além de

que sua intensificação não depreciou a qualidade do sêmen “in vitro”

durante o teste de termorresistência a 5ºC e a 37ºC.

Vários autores têm sugerido com êxito a centrifugação de

sêmen canino antes da criopreservação (Held, 1997; Rota, 1998; Strom

Holst, 1999; Peña, 2000). Lopes e Papa (1998) verificaram uma melhora

da qualidade espermática do sêmen de cão descongelado no grupo onde

foi realizada a centrifugação prévia ao processo de congelação.

Jasko (1994) sugere ainda que vários diluidores podem

ser utilizados para pré-diluir o sêmen durante a centrifugação e que este

passo garante uma boa proteção à célula espermática durante este

processo. O mesmo autor sugere a utilização de um meio diluidor à base

de leite desnatado para a realização de tal procedimento.

O leite pasteurizado foi o primeiro diluidor descrito para a

refrigeração do sêmen em cães (Harrop, 1954). Devido a sua composição

e capacidade tampão, diluidores à base de leite, assim como aqueles à

base de gema de ovo têm sido amplamente difundidos para conservação

do sêmen em todas as espécies animais (Cunha, 1997).

A lavagem dos espermatozóides remove fatores inibidores

da capacitação e prostaglandinas, sendo a técnica mais comumente

utilizada no preparo dos espermatozóides humanos para inseminação

artificial. Técnicas avançadas de preparo dos espermatozóides, incluindo

o swin-up, swin-down, diferentes gradientes de centrifugação com Percoll,

colunas de Sephadex e de Ficoll têm sido utilizados para eliminar

espermatozóides imóveis, células brancas ou debrís dos ejaculados

Experimento I

46

humanos, e têm sido relacionadas ao aumento da porcentagem de

espermatozóides móveis no sêmen (Carrell, 1998).

Lopes e Papa (1998) afirmaram que a centrifugação do

sêmen canino em Ficoll-Paque melhora significativamente os resultados

de congelação e de descongelação em meio à base de glicina-gema para

a espécie.

O Percoll é uma suspensão coloidal de polivinilpirrolidina

(PVP) ligada a sílica e esta coligação alivia as propriedades tóxicas do gel

de sílica. A maior vantagem do Percoll é não penetrar em membranas

biológicas, além disso, suas soluções possuem baixas viscosidade e

osmolaridade. Devido ao grande tamanho de suas partículas, a

centrifugação em velocidades moderadas pode gerar um gradiente de

densidade próprio, sendo desta forma a separação desejada realizada

rapidamente (Gennis, 1989).

Amann e Graham (1993) citaram que o processo de

centrifugação do sêmen pode aumentar a peroxidação lipídica das

membranas espermáticas, porém, segundo Prakash (1998), a exposição

ao Percoll protege os espermatozóides da produção excessiva de radicais

livres, que podem causar alterações nas funções da membrana induzindo

a peroxidação lipídica.

Tendo-se em vista o exposto, o objetivo do presente

trabalho foi testar os efeitos do processo de centrifugação no sêmen

canino e comparar a pré-diluição do sêmen em meio à base de leite

desnatado e glicose, Percoll ou plasma seminal autólogo na realização

deste procedimento.

Experimento I

47

2. MATERIAL E MÉTODO

2.1. Animais

Após realização de exame clínico detalhado, coleta de

sangue para hemograma, pesquisa de Brucelose e Leptospirose, e de

sêmen para o exame andrológico foram selecionados cinco (5) cães

adultos, SRD, pesando entre 10 e 20 kg, provenientes do Biotério Central

da Unesp de Botucatu, e cinco (5) cães adultos, da raça Cocker Spaniel,

pesando entre 15 e 20 kg, provenientes de criatórios particulares da

cidade de Botucatu-SP.

Os animais provenientes do Biotério foram mantidos em

canis com solário durante a fase de coleta do sêmen, os cães de

criatórios particulares permaneceram em seus respectivos canis, com

boas condições de higiene e alimentação durante a fase experimental.

O sêmen foi coletado no próprio criatório ou no canil da

Pós Graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área

de Reprodução Animal da FMVZ-UNESP- Botucatu, para análise e

manipulação.

2.2. Coleta do Sêmen

O ejaculado completo foi coletado por meio de massagem

peniana e recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta

graduado. Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira

dentro de uma garrafa de isopor.

Experimento I

48

2.3. Exame do Sêmen

ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva.

ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN

Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram

realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de

sêmen é colocada sobre lâmina aquecida (38-40ºC) e recoberta por

lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de

fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a

motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (Colégio

Brasileiro de Reprodução Animal -CBRA, 1996) para o vigor.

Aglutinação espermática: Foi descrita como aglutinação a

observação visual e subjetiva, sob microscopia de contraste de fase, de

grupos de células espermáticas aderidas cabeça-cabeça. O resultado foi

descrito através de um escore variando de zero a três, onde:

0- não se observa aglutinação.

1- aglutinações esparsas, visualizadas em campos

isolados.

2- aglutinações esparsas, observadas em todos os

campos.

3- aglutinações muito freqüentes, em todos os campos.

Experimento I

49

Concentração espermática: Foi determinada através de

contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em

água e o número de espermatozóides expresso por ml..

Espermiograma: Foi realizado na fase de seleção de

animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10

minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et

al, 1986) foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e

os resultados expressos em porcentagem, registrados individualmente. A

classificação da patologia espermática foi feita segundo Oetllé (1988).

Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade

das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se iodeto

de propídio e carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por

Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996) (ANEXO

I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de

epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon- Episcopic Fluorescence

Attchment “EFA” HalogenLamp Set) e contadas 200 células classificadas

como: células íntegras - células emitindo fluorescência verde, células

lesadas - possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha.

2.4. Procedimentos experimentais

Foram utilizados dez (10) ejaculados completos de dez

(10) cães diferentes (n=10). Após a avaliação inicial dos parâmetros

espermáticos, o ejaculado foi dividido em três partes iguais e transferido

para tubos plásticos de centrífuga graduados e centrifugados a 800g por

15 minutos, formando os seguintes grupos (figura 1): G1 (n=10): 1\3 do

sêmen não foi centrifugado. O sêmen foi mantido em banho Maria a 37ºC,

durante a centrifugação dos outros grupos; G2 (n=10): 1\3 do sêmen foi

centrifugado em plasma seminal autólogo (PSA); G3 (n=10): 1\6 do

Experimento I

50

sêmen foi diluido 1:1 em meio à base de leite desnatado e glicose (LG)

(Kenney et al., 1975) (ANEXO II); G4 (n=10): 1\6 do sêmen foi

centrifugado sobre diferentes gradientes de Percoll® (Sigma) (ANEXO III)

(figura 1).

Diluidor

Protocolo

Plasma seminal autólogo (PSA)

Leite desnatado e glicose (LG) Percoll

Não centrifugado

G1 (1/3 do sêmen)

Centrifugado G2 (1/3 do sêmen)

G3 (1/6 do sêmen)

G4 (1/6 do sêmen)

FIGURA 1 – Esquema de formação dos grupos experimentais.

Após a centrifugação, foi descartado o sobrenadante de

todos os grupos centrifugados. Foram retirados 10µl do “pellet” para

avaliação da integridade das membranas espermáticas, através do teste

fluorescente, descrito por Cunha et al. (1996) onde os espermatozóides

foram incubados junto aos corantes fluorescentes e avaliados sob

iluminação epifluorescente (400x).

Os “pellets” foram então ressuspendidos em 2ml de LG. A

mesma quantidade do mesmo diluidor foi acrescida ao G1. Todos os

grupos foram avaliados quanto a motilidade e vigor espermático (M1).

As amostras foram mantidas em banho Maria a 37ºC.

Decorridos 30 minutos de incubação (M2), as amostras foram novamente

avaliadas quanto à motilidade e o vigor espermático.

Experimento I

51

2.5. Métodos Estatísticos Utilizados

Para as variáveis motilidade e vigor, foi utilizada a análise

de perfil, visando comparar os 4 grupos caracterizados por: G1- grupo

controle da centrifugação, G2- grupo controle dos diluidores, G3- grupo

Kenney, G4 - grupo Percoll, em cada um dos dois momentos: M1- logo

após a centrifugação, M2- após imersão das amostras centrifugadas em

banho Maria a 37ºC por 30 minutos. Também pela análise de perfil pôde-

se comparar cada grupo, os momentos através dos valores médios

observados nas amostras.

Para a variável aglutinação a comparação entre os grupos

foi feita pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, em cada momento,

e pelo teste de Friedman, utilizando os valores medianos amostrais,

compararam-se para cada grupo os momentos.

Para a variável porcentagem de células íntegras, foi

utilizada a análise de variância de um delineamento inteiramente

casualizado com 4 tratamentos (grupos) e 10 repetições. Nesta análise,

utilizou-se a transformação arc sen√% visando a normalização da

distribuição dos dados amostrais.

Experimento I

52

3. RESULTADOS

Imediatamente após a centrifugação não houve diferença

estatística significativa quanto à motilidade espermática entre os grupos.

Porém, após 30 minutos de incubação em banho Maria a 37ºC os grupos

centrifugados apresentaram-se significativamente superiores ao grupo

onde não houve centrifugação (G2=G3=G4>G1) quanto à motilidade

espermática (tabela 1).

TABELA 1- Valores médios de motilidade espermática (%) do sêmen de cães, nos os 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002.

M1 M2

G1 71aA 47aB

G2 79aA 61bB

G3 79aA 67bB

G4 74aA 63bB

para cada grupo, medias de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05)

para cada momento, medias de grupos seguidas de letras minúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05)

Em todos os grupos estudados, verificou-se diminuição

significativa da motilidade espermática após a incubação (M2< M1)

(tabela 1).

Experimento I

53

TABELA 2- Valores médios de vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002.

M1 M2 G1 3,2aA 2,aB G2 3,7aA 2,7abB G3 3,8aA 3,1bB G4 3,5aA 3bA

para cada grupo, medias de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem

estatisticamente (p>0,05) para cada momento, medias de grupos seguidas de letras minúsculas iguais não diferem

estatisticamente (p>0,05)

O vigor espermático imediatamente após a centrifugação

(M1) não diferiu significativamente entre os grupos (G1=G2=G3=G4).

Porém, quando se comparou o vigor espermático dos grupos decorridos

30 minutos de incubação, verificou-se superioridade dos grupos

centrifugados em diluidor LG (G3) e em diferentes gradientes de Percoll

(G4) (tabela 2).

Decorridos os 30 minutos de incubação não foi observada

diminuição significativa do vigor espermático no grupo centrifugado em

diferentes gradientes de Percoll (M1=M2) (tabela 2).

TABELA 3- Valores medianos da aglutinação espermática do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002.

M1 M2

G1 0A 0A G2 0A 1,5B G3 0A 0A G4 0A 1,5B

em cada grupo, mediana de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem estatisticamente (p>0,05)

Experimento I

54

Verificou-se aumento significativo de aglutinação

espermática após a incubação em banho Maria a 37ºC nos grupos

centrifugados em PSA (G2) e naqueles centrifugados em diferentes

gradientes de Percoll (G4). Não houve diferença estatística significativa

entre os grupos em nenhum dos momentos (tabela 3)

TABELA 4- Porcentagem média de células espermáticas íntegras transformadas em arc sen √x (em rad) do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após as centrifugações (M1). Botucatu, 2002.

média desvio padrão

médias originais

G1 1,38a 0,155 98,2 G2 1,43a 0,141 99,0 G3 1,41a 0,190 98,7 G4 1,38a 0,151 98,2

médias de grupos seguidos de letras iguais, não diferem estatisticamente (p>0,05).

Não se verificou diferença estatística significativa quanto à

integridade das membranas espermáticas entre os grupos estudados

imediatamente após as centrifugações (tabela 4).

Experimento I

55

4. DISCUSSÃO

Os ejaculados caninos apresentam grande variação em

seu volume devido, principalmente, à diferenças individuais. Entre

animais, esta variação deve-se à diferença de tamanho entre raças ou

mesmo devido a características individuais, como a idade ou tamanho da

próstata. Individualmente pode-se verificar diferenças de volume entre

dois ejaculados devido à atividade sexual no período da coleta ou mesmo

em conseqüência do envelhecimento deste animal. Todas as diferenças

de volume acima descritas devem-se, exclusivamente, a alterações

fisiológicas comuns e inerentes à espécie canina (Cunha, 1998).

Para que um protocolo de congelamento de sêmen seja

estabelecido, estas diferenças de volume que, conseqüentemente,

levarão a uma diferença de concentração espermática por mililitro de

ejaculado, devem ser eliminadas, possibilitando desta forma um

tratamento semelhante a cada célula espermática, no que diz respeito à

diluição, à concentração de crioprotetor no meio que a circunda, ao

envase e ao volume da dose inseminante (Papa, 1987; Lopes e Papa,

1998; Dell’aqua Junior, 2000).

Vários autores (Held, 1997; Lopes e Papa, 1998; Rota,

1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000) têm descrito metodologias de

criopreservação do sêmen canino utilizando a centrifugação como forma

de eliminar plasma seminal e padronizar o volume do ejaculado. Os dados

encontrados neste experimento concordam com estes autores, já que

verificamos que a centrifugação não alterou a qualidade espermática no

que diz respeito à motilidade e vigor espermático e à integridade das

membranas espermáticas.

Experimento I

56

A associação da retirada do plasma seminal através da

centrifugação com a adição de uma solução de centrifugação, com

propriedades protetoras e ação de tampão, pode ser uma alternativa

viável para a eliminação do plasma seminal, sabidamente deletério ao

espermatozóide canino, prolongando a sobrevida dos espermatozóides.

Após a cobertura natural o metabolismo espermático no trato genital

feminino é intenso, este acontecimento fisiológico pode ser mimetizado

em condições laboratoriais incubando-se o sêmen a uma temperatura de

37ºC por um determinado período, este aumento de metabolismo é

responsável pelo aumento da produção de catabólitos tóxicos que, em

contato com a célula espermática, induzirem danos à integridade

funcional e morfológica da célula espermática (Amann e Graham, 1993).

Verificamos que o sêmen centrifugado em Percoll ou em

LG, após incubado em LG por 30 minutos, apresentou melhor vigor

espermático que o sêmen incubado em mesmas condições e previamente

centrifugado sem solução de centrifugação ou não centrifugado.

Provavelmente, substâncias presentes nos diluidores de centrifugação

proporcionaram maior atividade tampão, antioxidante e substrato para

metabolismo (G3) ou uma melhor “lavagem” das substâncias nocivas

presentes no plasma seminal (G4) fazendo que o vigor fosse mantido por

um período mais longo.

Verificamos, porém, que, após a centrifugação em

diferentes gradientes de Percoll e a completa eliminação do plasma

seminal houve também um aumento a aglutinação cabeça-cabeça das

células espermáticas, mesmo tendo sido estes espermatozóides

acrescidos de um diluidor durante a incubação a 37ºC.

Sabendo-se que o potencial de membrana, que se reflete

como uma característica de carga elétrica positiva ou negativa à

membrana externa do espermatozóide, pode ser alterado pelos radicais

Experimento I

57

de hidrato de carbono ligados a lipídios e proteínas constituintes da

membrana (Amann e Graham, 1993) e, lembrando-se ainda, que estas

ligações podem se desfazer com certa facilidade (Gennis, 1989),

sugerimos que o Percoll possa ter realizado uma lavagem de radicais

glicosilados ligados à membrana espermática promovendo alterações de

cargas elétricas de algumas células espermáticas. Como conseqüência

deste desequilíbrio elétrico, as células espermáticas podem ter se

agregado umas as outras na dependência da característica de repulsão

ou de atração de cargas elétricas presentes em sua superfície externa.

Após a avaliação dos nossos dados verificamos que a

centrifugação do sêmen canino não afetou a qualidade do movimento

espermático e a integridade das membranas e ainda que a centrifugação

em meio à base de leite desnatado e glicose conferiu maior manutenção

da qualidade do movimento espermático durante a incubação em banho

Maria a 37°C.

Experimento II

58

3. Experimento II

Experimento II

59

EFEITO DE DIFERENTES PERÍODOS DE EQUILÍBRIO E MOMENTOS DE GLICEROLIZAÇÃO SOBRE

O SÊMEN CANINO


A principal função de uma célula espermática é a

fertilização de um óvulo, e para que isso ocorra, o espermatozóide

necessita das habilidades adquiridas a cada passo da maturação

espermática. Pode-se dizer que a maturação de um espermatozóide se

inicia nos túbulos seminíferos dos testículos, e só é finalizada, quando se

dá o encontro e a união do gameta masculino com o gameta feminino

(Watson, 1995).

Para que a preservação de uma célula espermática seja

realizada com sucesso, cada passo desta maturação celular deve ser

respeitado e viabilizado e, ainda, é necessário que cada etapa seja

realizada exatamente em seu devido momento (Kirk, 2001).

O resfriamento da célula espermática (39~25ºC até ~0ºC)

é o primeiro momento crítico dentro do processo de preservação pelo frio.

Dentro deste procedimento alterações na membrana espermática,

ocasionando danos à sua estrutura e função, podem ocorrer. Estas

modificações são conhecidas como efeito de fase transicional (Gennis,

1989; Jasko, 1994; Zúccari, 1998; Holt, 2000; Kirk, 2001).

Os espermatozóides caninos, assim como todas as outras

células são circundadas por uma membrana plasmática, que define a

delimitação da célula, separando seu conteúdo do meio externo. Da

Experimento II

60

mesma forma, como as membranas biológicas de outras células, as

membranas dos espermatozóides são extremamente especializadas às

funções a elas atribuídas (Watson, 1995).

Quando em temperatura ambiente (∼25ºC) ou próxima à

temperatura corpóre da espécie em questão, a membrana espermática,

assim como qualquer membrana biológica encontra-se em conformação

de bicamada fluida de fosfolipídios e proteínas, como descrito por Singer

e Nicolson em 1972.

Dentre os fosfolipídios integrantes da membrana existem

aqueles aos quais a conformação de monocamada seria mais adequada,

devido, principalmente, à conformação da sua cabeça polar (Gennis,

1989). Estes fosfolipídios encontram-se geralmente próximos às proteínas

integrantes das membranas. Com a diminuição da temperatura os

fosfolipídios se agrupam formando micelas dentro da membrana

espermática e, em alguns casos, quando se reaquece a membrana, os

fosfolipídios não se misturam completamente aos outros elementos,

mudando desta forma a conformação da membrana (Amann e Graham,

1993).

Para evitar ou minimizar as alterações que podem ocorrer

durante a refrigeração celular este processo deve ser realizado de

maneira controlada e agentes crioprotetores devem ser adicionados ao

meio diluidor de sêmen (Aman e Graham, 1993; Zúccari, 1998; Kirk,

2001).

A inclusão de um crioprotetor ao meio diluidor é de vital

importância para o sucesso da preservação pelo frio. O crioprotetor mais

utilizado, quando se deseja congelar sêmen canino, é o glicerol, porém o

mesmo agente de crucial importância no processo de congelação exerce

um efeito tóxico sobre a célula espermática (England, 1992, Farstad,

1996; Peña et al., 1998).

Experimento II

61

A eficácia e praticidade de um grande número de

crioprotetores permeáveis ou não às células que diminuem a formação e

o tamanho dos cristais de gelo intracelulares, têm sido testados quanto a

sua utilização no resfriamento de células espermáticas (De Leeuw et al.,

1993).

O glicerol é um crioprotetor intracelular e sabe-se que sua

principal função como crioprotetor se dá na regulação do fluxo de água

para a célula espermática controlando, desta forma, a desidratação,

minimizando o efeito de solução, que é um dos pontos críticos do

processo de congelamento celular (Peña, 1997).

Além da regulação osmótica do glicerol existem ainda

evidências de que ele se liga aos grupos hidrofílicos da cabeça dos

fosfolipídios regulando a fluidez das membranas e às proteínas integrais e

glicoproteinas causando um agrupamento das partículas

intramembranosas (Parks e Graham, 1992).

Os agentes crioprotetores intracelulares, particularmente

o glicerol, exercem seu maior papel de crioproteção durante a

cristalização (-10 ~ -15ºC), onde os efeitos de solução e de recristalização

podem afetar negativamente a morfofisiologia da célula espermática

(Zúccari, 1998; Holt, 2000), portanto, sua inclusão em um meio diluidor

pode ser realizada a temperaturas mais baixas sem que isso atrapalhe

seus efeitos benéficos.

Polge (1957) indicou que a sobrevivência espermática

pós-descongelação era superior quando o glicerol era acrescido a 5ºC.

Miller e Vandertmark (1962) demonstraram que a porcentagem de

espermatozóides móveis era maior quando o glicerol era acrescido a

temperatura de 4,5ºC ao invés de 10ºC.

Experimento II

62

O momento ideal para a adição do glicerol durante o

processo de congelação/descongelação do sêmen canino também tem

sido estudado.

Rohloff (1978) não encontrou diferença entre a adição de

um diluente glicerolizado ao sêmen canino a 25 ou a 5ºC. Fontbonne e

Badinand (1993) concluíram que o glicerol pode ser adicionado ao sêmen

canino à temperatura ambiente durante a primeira fase de diluição.

Em sua revisão, Salisbury e vandemark (1978) afirmaram

que os danos espermáticos são superiores quando a temperatura de

exposição ao glicerol é maior que 5ºC. Os mesmos autores verificaram

ainda que a motilidade e a capacidade fecundante dos espermatozóides

bovinos pós-descogelação aumentam quando existe um intervalo entre a

adição do glicerol e o início da congelação, e que esta etapa pode ser

chamada de período de equilíbrio.

England (1992) sugeriu que o sêmen de várias espécies

animais necessita de uma pausa de algumas horas antes da congelação

para que desenvolva uma máxima resistência aos efeitos do congelação

e concluiu ainda que o tempo de equilíbrio pode ser extremamente

variável de acordo com o protocolo de congelação/descongelação e ainda

de acordo com a espécie em questão.

Watson (1979) sugeriu que este tempo não é só

importante para permitir a entrada do glicerol como se acreditava

anteriormente, mas também permite que as membranas espermáticas se

acomodem ou que influxos iônicos ocorram.

England (1992) comprovou que uma curva de

resfriamento (39ºC até 4ºC) em nove minutos e um tempo de equilíbrio de

4 horas e posterior congelação/descongelação conferiu maior viabilidade

ao sêmen canino.

Experimento II

63

Rota (1997) obteve bons resultados equilibrando o sêmen

canino a 4ºC durante 60 minutos, sendo que a temperatura de 4ºC era

atingida após 45 minutos de resfriamento. Olar et al. (1989) concluíram

que a curva de refrigeração de 1 hora com um período de equilíbrio a 5ºC

de 1 hora era favorável na preservação do sêmen canino. Porém, estes

autores só conseguiram chegar a tal conclusão sobre a superioridade

desta curva após congelarem e descongelaram as amostras de sêmen.

Em vista da diversidade entre os protocolos para a

congelação do sêmen canino, que apresentam grandes diferenças entre

os tempos de equilíbrio e ainda no momento ideal para a adição do

glicerol, é que tivemos como objetivo do presente estudo: testar um

período de equilíbrio ideal para o sêmen canino congelado em um meio

diluidor á base de glicina e gema de ovo e em um outro diluidor á base de

TRIS, ácido cítrico e glicose. E ainda, verificar os efeitos da adição do

glicerol à temperatura ambiente ou a 5ºC sobre a viabilidade espermática

e sobre a integridade de suas membranas.

Experimento II

64


2.1. Animais

Foram utilizados dez cães: dois (2) SRD, um (1) Pointer,

quatro (4) Cocker Spaniel, um (1) Pastor Alemão, um (1) Dog Alemão, um

(1) Fox Terrier, sendo um SRD proveniente do Biotério Central da Unesp

de Botucatu e todos os outros cães provenientes de criatórios particulares

da cidade de Botucatu-SP. Os animais selecionados apresentaram-se em

perfeitas condições para participação neste projeto.

O cão proveniente do biotério foi mantido em canil com

solário pertencente à pós-graduação durante a fase de coleta do sêmen.

Os cães de criatórios particulares permaneceram em seus respectivos

canis. Todos os animais foram mantidos sob ótimas condições de higiene

e conforto durante a fase experimental.


pós-graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área de

Reprodução Animal da FMVZ- UNESP- Botucatu, para análise e

manipulação.


Foram realizadas trinta (30) coletas de sêmen de dez (10)

cães. Cada ejaculado completo foi coletado por meio de massagem

peniana e recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta



Experimento II

65






sêmen é colocada sobre lamina aquecida (38-40ºC) e recoberta por



motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (CBRA,

1996) para o vigor.



água e o número de espermatozóides expressos por ml.

Espermiograma: Foi realizado na fase de seleção de



al, 1986), foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e

os resultados expressos em porcentagem, e registrados individualmente.

A classificação das patologia foi feita segundo Oetllé (1988).


das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se Iodeto

Experimento II

66

de Propídio e Carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por



epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon-Episcopic Fluorescence


como: células íntegras- células emitindo fluorescência verde, células

lesadas- possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha.

2.4. Procedimentos Experimentais

Foram utilizados dez (10) cães sendo que cada cão doou

três (3) ejaculados completos em dias diferentes (n=30).

Após a avaliação inicial dos parâmetros espermáticos,

cada ejaculado foi dividido em duas partes iguais contendo cada qual 200

milhões de espermatozóides (sptz) em média. As metades foram

centrifugadas em 800g por 5 minutos diluídos 1:1 em meio à base de leite

desnatado e glicose (pH- 6,91; 330mosm).

Descartado o sobrenadante, um pellet foi ressuspendido

em 2,14 ml de diluidor Glicina-Gema (GG) sem glicerol (pH-7,0;

318mosm) (ANEXO II). Do total desta amostra, 1,07 ml foi acrescido de

0,93 ml de diluidor GG com 12,8% de glicerol, segundo Lopes e Papa

(1998) e envasados em 4 palhetas de 0,5 ml contendo em média 25

milhões de sptz cada. A outra metade da amostra (1,07 ml) foi mantida

em um tubo de centrifuga (20ml) plástico fechado.

O outro pellet foi ressuspendido em 2ml de diluidor TRIS

(ANEXO II) com 3% de glicerol (pH-6,39; 685mosm). Do total desta

mostra, 1ml foi acrescido de 1ml de diluidor TRIS com 7% de glicerol

(Rota, 1997) e envasado em 4 palhetas de 0,5ml contendo em média 25

Experimento II

67

milhões de sptz cada. A outra metade da amostra (1ml) foi mantida em

tubo de centrifuga (20ml) plástico fechado.

Neste momento foram avaliadas amostras de cada

tratamento quanto à motilidade e ao vigor espermático (M1) segundo

protocolo descrito anteriormente.

As amostras foram levadas ao refrigerador 5°C e ali

mantidas durante o período de equilíbrio designado. Foram testados

períodos de equilíbrio de 40 (n=10), 60 (n=10) ou 90 (n=10) minutos. Foi

utilizado um ejaculado diferente de um mesmo cão para o teste de cada

tempo de equilíbrio.

Desta forma foram formados 12 grupos experimentais,

sendo eles (figura 1) : G1- sêmen diluído em meio GG com glicerolização

antes dos 40 minutos de equilíbrio; G2- sêmen diluído em meio GG com

glicerolização antes dos 60 minutos de equilíbrio; G3- sêmen diluído em

meio GG com glicerolização antes dos 90 minutos de equilíbrio; G4-

sêmen diluído em meio GG com glicerolização posterior aos 40 minutos

de equilíbrio; G5- sêmen diluído em meio GG com glicerolização posterior

aos 60 minutos de equilíbrio; G6- sêmen diluído em meio GG com

glicerolização posterior aos 90 minutos de equilíbrio; G7- sêmen diluído

em meio TRIS com glicerolização total antes dos 40 minutos de equilíbrio;

G8- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total antes dos 60

minutos de equilíbrio; G9- sêmen diluído em meio TRIS com

glicerolização total antes dos 90 minutos de equilíbrio; G10- sêmen diluído

em meio TRIS com glicerolização total posterior aos 40 minutos de

equilíbrio; G11- sêmen diluído em meio TRIS com glicerolização total

posterior aos 60 minutos de equilíbrio; G12- sêmen diluído em meio TRIS

com glicerolização total posterior aos 90 minutos de equilíbrio.

Experimento II

68

Diluidor Glicina (GG) TRIS

Período de equilíbrio 40’ 60’ 90’ 40’ 60’ 90’

Glicerolização antes do equilíbrio G1 G2 G3 G7 G8 G9

Glicerolização após o equilíbrio G4 G5 G6 G10 G11 G12

FIGURA 1 – Esquema de formação dos grupos experimentais.

Para cada ejaculado coletado de cada cão, lembrando-se

que cada cão doou 3 ejaculados, foram realizados os procedimentos dos

grupos: G1, G4, G7 e G10 para um ejaculado; G2, G5, G8 e G11 para

outro ejaculado e G3, G6, G9 e G12 para um terceiro ejaculado. A

escolha do período de equilíbrio utilizado em cada ejaculado diferente de

cada cão foi estabelecida de maneira completamente aleatória.

Decorrido o período de equilíbrio designado, o grupo

diluído em GG e glicerolizado após o equilíbrio (G4, G5 ou G6) foi

acrescido de 0,93 ml do mesmo diluidor com 12,8%, de glicerol e

envasado em 4 palhetas de 0,5ml contendo 25 milhões de sptz em média

cada, ficando cada amostra com concentração final de 5% de glicerol.

O grupo diluído em TRIS com glicerolização parcial após

do equilíbrio (G10, G11 ou G12) foi acrescido de 1 ml do mesmo diluidor

com 7% de glicerol e envasado em 4 palhetas de 0,5ml contendo 25

milhões de sptz em média cada, ficando cada amostra com concentração

final de 5% de glicerol.

Todas as amostras foram então aquecidas por 10 minutos

a 37°C e avaliadas (M2) quanto à motilidade e ao vigor espermático

através de microscopia de contraste de fase e quanto à integridade das

membranas espermáticas sob microscopia epifluorescente, com o uso de

sondas fluorescentes como já descrito anteriormente.

Experimento II

69


Para a comparação entre dois momentos no mesmo

tratamento: prova não paramétrica de Wilcoxon para pequenas amostras

pareadas, com o cálculo da estatística p.

Para a comparação entre tratamentos em cada momento:

prova não paramétrica de Friedmam com o cálculo das estatísticas χ2 e p.

As estatísticas calculadas foram consideradas

significativas quando p<0,05. Nos casos em que 0,05<p<0,10 foi referida

tendência à significância, já que p é a probabilidade de erroneamente

concluir pela significância.

Experimento II

70

3. RESULTADOS

Logo após as primeiras diluições do sêmen com os

diluidores não se verificou diferença estatística significativa de motilidade

espermática entre os períodos de equilíbrio de 40, 60 ou 90 minutos entre

os tratamentos (p>0,05). Quando verificado o efeito de tratamento em

cada período de equilíbrio distinto, nos grupos tratados com diluidor TRIS,

quando a glicerolização total seria efetivada após o equilíbrio de 40 e de

90 minutos (G10 e G12), houve, no entanto, tendência à superioridade

(p<0,10) (tabela 1).

TABELA 1- Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002.

GG TRIS Glicerolização

antes do equilíbrio

Glicerolização após o equilíbrio

Glicerolização antes do equilíbrio


G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12

M1 80 80 70 80 80a 80a 80 80 80a 85* 80a 80a*

M2 70 75 70 75 70b 75b 80* 80 70b 80* 80b 70b

Para cada grupo, momentos seguidos de letras diferentes diferem estatisticamente (p<0,05). *indica tendência à superioridade entre dados em uma mesma linha (p<0,10)

Experimento II

71

Quando a motilidade espermática foi avaliada após os

períodos de equilíbrio e após a realização de todas as glicerolizações

(M2), os grupos propostos não apresentaram diferença estatística

significativa (p>0,05), porém podemos verificar que os grupos tratados

com diluidor TRIS, tendo sido estes glicerolizados totalmente antes ou

após o equilíbrio de 40 minutos (G7 e G10), apresentaram tendência à

superioridade para esta variável (p<0,10) (tabela 1).

Quando o diluidor GG foi avaliado no M2 (após o período

de equilíbrio), a motilidade espermática dos períodos de 40, 60 ou 90

minutos de equilíbrio não diferiu estatisticamente (p>0,05), tanto nos

grupos onde a glicerolização foi efetuada antes como após o período de

equilíbrio.

TABELA 2 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos grupos tratados com meio TRIS Botucatu, 2002.

G7 G8 G9 G10 G11 G12

M1 80 80 80 85 80 80 M2 80* 80* 70 80* 80* 70

*indica superioridade entre dados em uma mesma linha (p<0,05)

Quando contrastados os grupos onde o diluidor TRIS foi

utilizado, após a glicerolização total de todos os grupos (M2), tendo sido a

glicerolização realizada antes ou após o equilíbrio, os períodos de 40 e 60

minutos de equilíbrio se apresentaram estatisticamente superiores ao

equilíbrio de 90 minutos (tabela 2).

Experimento II

72

TABELA 3- Mediana do vigor espermático (escore de 0-5) do sêmen de cães avaliado antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002.

GG TRIS

Glicerolização





G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12

M1 3 3 3 4Aa 4Aa 3Aa 3 3 2 4Aa 4Aa 3Aa

M2 3A* 3A* 2A 3Ab* 2,5Ab* 2Ab 3B* 3B* 2B 3Bb* 3Bb* 2,5Bb

Para cada grupo, valores seguidos de letras minúsculas diferentes diferem estatisticamente

(p<0,05). Para um momento. valores seguidos de letras maiúsculas diferentes diferem estatisticamente

(p<0,05) * indica diferença estatística significante entre os períodos de 40, 60 e 90 minutos de equilíbrio

(p<0,05)

Verificamos diferença estatística significante entre os

valores de vigor avaliados antes e após a glicerolização para os grupos

onde esta foi realizada após o equilíbrio (G4, G5, G6, G10, G11 e G12)

(tabela 3).

Para o vigor espermático, após as primeiras diluições do

sêmen com os diluidores (M1), verificou-se uma superioridade significante

nos grupos onde a glicerolização seria realizada após o período de

equilíbrio (G4, G5, G6, G10, G11 e G12) sobre os grupos onde a

glicerolização foi efetivada antes do período de equilíbrio (G1, G2, G3,

G7, G8 e G9) (tabela 3).

Quanto ao vigor espermático avaliado após o período de

equilíbrio (M2), verificamos que os grupos tratados com o meio diluidor

TRIS apresentaram resultados significativamente superiores (p<0,05) aos

resultados apresentados pelos grupos tratados com meio GG (tabela3).

Experimento II

73

Verificamos ainda que, de maneira geral, não houve

diferença estatística significante entre os grupos que receberam a

glicerolização antes ou após o período de equilíbrio.

Houve um efeito significativo de duração do período de

equilíbrio sendo, no geral, os tempos de 40 e 60 minutos equivalentes e

significativamente superiores ao equilíbrio de 90 minutos quanto ao vigor

espermático.

TABELA 4- Mediana da porcentagem de células íntegras no sêmen de cães avaliada antes e após o período de equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 2002.

GG TRIS

Glicerolização


Glicerolização após o

equilíbrio



G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12

M2 95a 93a 82b 96a 92a 83b 96a 94,5a 90,5b 97,5a 94a 89b

Valores seguidos de letras diferentes diferem estatisticamente (p<0,05)

A porcentagem de células espermáticas íntegras sofreu

efeito de tempo, sendo que, naqueles grupos onde o período de equilíbrio

foi de 90 minutos os valores foram significativamente inferiores (p<0,05).

Quando os dados foram contrastados para verificar se

houve efeito de tratamento verificamos que aos 40 e 60 minutos de

equilíbrio os meios GG (com glicerolização antes ou após) e os meios

TRIS (com glicerolização total antes ou após) obtiveram porcentagem de

células espermáticas íntegras estatisticamente equivalentes (p>0,05).

Experimento II

74

4. DISCUSSÃO

Para que os resultados de congelação de sêmen dos

cães resultem em melhores resultados de fertilidade in vivo, vários passos

do protocolo de congelação do sêmen canino vêem sendo testados e

aprimorados (Rota, 1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000).

A glicerolização é um passo necessário na congelação do

sêmen, porém é sabido que o glicerol exerce também um efeito tóxico

sobre a célula espermática. Quando a glicerolização é realizada a 5 ºC

este efeito tóxico pode ser minimizado devido, principalmente, à

diminuição da taxa de entrada de glicerol nas células espermáticas,

levando a uma desidratação mais lenta destas células (Parks e Graham,

1992).

Em nosso experimento buscamos contrastar os efeitos da

glicerolização a 37ºC e a 5ºC e verificamos que, de uma maneira geral, a

glicerolização antes ou após o equilíbrio não apresentou diferenças

significantes para as variáveis avaliadas, concordando tanto com as

afirmativas de Fontbonne e Badinand et al.(1993), que concluíram que o

glicerol pode ser adicionado ao sêmen canino à temperatura ambiente

durante a primeira fase de diluição como com as de Rota (1998) que

indica a glicerolização a 5ºC. Devemos ressaltar, entretanto, que, em

nosso experimento, as últimas avaliações foram realizadas antes do

congelamento e descongelamento das células espermáticas.

Sabemos que as maiores injúrias celulares são causadas

no momento da congelação e descongelação das células. Segundo Holt

(2000), os efeitos deletérios da desidratação (durante a congelação) e

posterior hidratação das células espermáticas (durante a descongelação)

são as etapas críticas do processamento do sêmen podendo traduzir as

Experimento II

75

maiores alterações morfofuncionais às células espermáticas. Podemos

aqui especular que alguma diferença entre os grupos quanto ao momento

de glicerolização poderia ter sido verificada após a finalização do

processo, ou seja, após a congelação e descongelação das amostras,

como verificado por Olar (1984).

Verifica-se, na literatura atual que o tempo necessário

para que a célula espermática se estabilize em um meio diluidor é

extremamente variável entre os protocolos existentes (Olar, 1984;

England, 1992; Lopes e Papa, 1998; Rota, 1998). Este tempo depende,

principalmente, dos constituintes do diluidor e do protocolo adotado para

um determinado diluidor, porém depende ainda de características dos

espermatozóides de uma determinada espécie e do indivíduo (Rota,

1997; Holt, 2000).

Para que a congelação se torne um processo rápido e ágil

busca-se o menor tempo de equilíbrio, porém todos os benefícios

advindos deste procedimento devem ser garantidos às células

espermáticas em questão.

Em nosso experimento testamos três diferentes tempos

de equilíbrio, 40, 60 e 90 minutos. Notamos que, para a variável

motilidade espermática, quando as amostras foram equilibradas por 40

minutos (G1, G4, G7, G10), não houve diferença estatística significante

entre os valores verificados antes (M1) e após (M2) o equilíbrio (tabela 1).

Nos grupos onde a glicerolização foi realizada após o

equilíbrio, sendo ele de 60 ou de 90 minutos, verificamos um decréscimo

da motilidade durante o equilíbrio, sendo os valores de M1

significativamente maiores que os de M2. Lembramos aqui que o glicerol

exerce um efeito tóxico à célula espermática e, imediatamente após a

inclusão do glicerol, podemos claramente verificar uma alteração no

Experimento II

76

padrão de movimentação espermática advinda desta toxicidade (Watson,

1981; England, 1992).

O vigor espermático em todos os períodos de equilíbrio foi

significativamente menor quando a glicerolização foi realizada após o

equilíbrio. Provavelmente, nos protocolos aqui propostos, as células

espermáticas precisem de um tempo maior para que o influxo de glicerol

seja equilibrado e para que a célula recobre sua movimentação normal,

como recomendado por Watson (1981). Salientamos mais uma vez que a

última avaliação foi realizada imediatamente após o equilíbrio e que a

congelação e descongelação das amostras não foi realizada.

O número de células espermáticas íntegras foi maior nos

grupos onde foram realizados 40 e 60 minutos de equilíbrio sendo que,

nestes mesmos períodos de equilíbrio, não verificamos também influência

do meio diluidor sobre a integridade das células espermáticas.

Olar et al. (1989) verificaram que os efeitos de diferentes

períodos de equilíbrio sobre a motilidade espermática só foram

observados após a congelação e a descongelação do sêmen canino.

Estes autores só puderam constatar a superioridade de uma curva de

refrigeração de 1 hora com equilíbrio de 1 h sobre a de 1h com equilíbrio

de 2 horas após a descongelação das amostras.

Quando buscamos um protocolo de congelação

procuramos o mais rápido, ágil e eficiente. Tendo-se em vista estas

premissas podemos concluir que os períodos de 40 e 60 minutos foram

superiores aos de 90 minutos e que a glicerolização anterior ao equilíbrio,

em nossas condições, apresentou-se vantajosa frente a glicerolização

pós-equilíbrio, tanto pela praticidade como pela tendência dos resultados

aqui verificados, porém, como discutido acima, a avaliação da viabilidade

espermática após a congelação e descongelação das amostras fazem-se

necessárias para que os dados aqui encontrados sejam confirmados.

Experimento III

77

4. Experimento III

Experimento III

78

EFEITO DE DIFERENTES PERÍODOS DE EQUILÍBRIO E DE DIFERENTES DILUIDORES NA CONGELAÇÃO

DO SÊMEN CANINO


A globalização, processo que provocou drásticas

mudanças no cenário mundial, contribuiu para que proprietários de cães

se interessassem pelas mais diversas raças. Exemplares de muitas delas

não estão disponíveis no mercado nacional, a mesma realidade é

enfrentada em outros países.

A congelação e o transporte de gametas podem servir

para transpor barreiras de distância e tempo, viabilizando o trânsito de

sêmen de machos melhoradores ou mesmo de raças exóticas, com

menores despesas e riscos para proprietários e animais. Soma-se a este

fato, a possibilidade da utilização do cão como modelo experimental para

aperfeiçoamento de biotecnologias para a conservação de gametas de

canídeos selvagens.

Desde que Seager em 1969 relatou a 1° gestação e parto

proveniente de uma inseminação artificial (IA) com sêmen canino

congelado, várias etapas deste processo vêm sendo testadas e

aperfeiçoadas na tentativa de obtenção de melhores resultados de

fertilidade in vivo.

Estudos realizados com sêmen congelado de cães

mostraram que o espermatozóide descongelado não demonstra a mesma

vitalidade do sêmen fresco ou refrigerado, conseqüentemente, sua

Experimento III

79

sobrevivência no trato genital feminino é reduzida ( Gill et al., 1970; Olar,

1984; Oettlé, 1986; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989; Morton e Bruce,

1989; Brown, 1992; Linde-Forsberg, 1995; Rota et al., 1995; England e

Ponzio, 1996).

Apesar das dificuldades encontradas no processo de

congelação do sêmen canino, Linde-Forsberg et al. (1999) analisaram

dados de 327 inseminações artificiais realizadas de 1983 a 1995

utilizando sêmen congelado pelo método CLONE (Cryogenetic

Laboratories) e constataram taxas de nascimento maiores de 70% quando

o sêmen descongelado apresentava mais de 40% de motilidade

espermática no momento da inseminação.

O meio diluidor utilizado para a congelação do sêmen

deve fornecer energia metabolizável para que os espermatozóides

mantenham-se viáveis após o processo de descongelação, apresentar um

pH e osmolaridade compatíveis com os espermatozóides de cada

espécie, levando-se em consideração que a habilidade dos

espermatozóides em resistir a refrigeração e ao congelamento difere entre

as espécies animais (Farstad, 1996).

Para a congelação do sêmen, o diluidor deve ainda conter

um crioprotetor. O glicerol é largamente utilizado para a congelação do

sêmen dos animais domésticos, entretanto, apresenta um efeito tóxico

sobre os espermatozóides, envolvendo todas as zonas da membrana

espermática. A concentração final de glicerol usada para a congelação do

sêmen canino varia, geralmente, de 2 a 10% (Olar, 1984; Farstad, 1996,

Peña et al., 1998).

O meio diluidor à base de TRIS, Ácido Cítrico e Glicose

vem se mostrando bastante viável na refrigeração e no congelamento do

sêmen canino (Olar, 1984; Rota, 1998; Santos et al.; 1999; Strom Holst,

1999; Peña, 2000).

Experimento III

80

O meio diluidor à base de glicina - gema de ovo apresenta

excelentes resultados quando utilizado na congelação do sêmen nas

espécies bovina (Bicudo et al., 1993), equina (Papa et al., 1993), ovina

(Gonzales, 1996) e na refrigeração e congelação do sêmen canino (Lopes

e Papa, 1996; Cunha, 1997; Santos et al., 1999).

A utilização de um diluidor denominado M9, composto de

33% de meio Merck-gema (Martin et al., 1979), 33% de meio à base de

leite desnatado e glicose (Kenney et al., 1975) e 33% de DME (Sigma)

acrescido de glicerol até a concentração final de 5%, melhorou os

resultados de congelação do sêmen eqüino (Neves Neto, et al. 1999;

Dell’Aqua Junior, 2000).

De acordo com Watson (1979) e Jasko (1994), antes da

congelação, os espermatozóides devem permanecer um determinado

período de tempo a uma temperatura de equilíbrio, para que ocorra

diminuição do metabolismo espermático e para que iniciem as interações

com os componentes do meio diluidor antes do estresse do

congelamento, diminuindo, dessa forma, os riscos de um choque térmico.

O período de equilíbrio ideal pode variar para cada espécie animal e para

cada diluidor utilizado (Chacur, 1996).

Tendo em vista a diversidade de protocolos para a

congelação do sêmen canino tivemos como objetivo no presente

experimento: verificar os efeitos de dois diferentes períodos de equilíbrio

com uma mesma curva de resfriamento e três diferentes diluidores sobre

a motilidade e o vigor espermáticos e sobre a integridade das membranas

do sêmen canino congelado e descongelado a 370C por 30 segundos.

Experimento III

81


2.1. Animais

Foram utilizados cinco (5) cães sendo: três (3) SRD, um

(1) Weimaraner e um (1) Pointer. Os cães SRD foram provenientes do

Biotério Central da Unesp de Botucatu e os outros cães provenientes de

criatórios particulares da cidade de Botucatu-SP. Os animais selecionados

apresentaram-se em boas condições para participação neste projeto.

Os cães provenientes do biotério foram mantidos em canil

com solário pertencente a pós-graduação durante a fase de coleta do

sêmen. Os cães de criatórios particulares permaneceram em seus

respectivos canis. Todos os animais foram mantidos sob ótimas

condições de higiene e alimentação durante o experimento.


pós-graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área de

Reprodução Animal da FMVZ UNESP-Botucatu, para análise e

manipulação.


Foram realizadas duas coletas de sêmen de cada cão,

sendo as coletas de um mesmo cão realizadas em dias diferentes (n=10).

Cada ejaculado completo foi coletado por meio de massagem peniana e

recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta graduado.

Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira dentro de

uma garrafa de isopor.

Experimento III

82






sêmen é colocada sobre lamina aquecida (38-40ºC) e recoberta por




1996) para o vigor.




Espermiograma: Foi realizada na fase de seleção de



al, 1986), foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e

os resultados expressos em porcentagem, registrados individualmente. A

classificação das patologia foi feita segundo Oettlé (1988).




Experimento III

83






lesadas- possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha.


Foram coletados dez ejaculados e avaliados segundo os

parâmetros acima descritos, cada amostra de sêmen foi dividida em 3

amostras idênticas. Cada amostra foi acrescida na proporção de 1:1 de

meio à base de leite desnatado e glicose (Kenney, 1975) (pH 7,26; 355

mOSM) e centrifugada por 5 minutos a 800g. Após a eliminação do

sobrenadante, os grupos foram acrescidos dos meios diluidores sob os

seguintes protocolos:

Glicina Gema –Um “pellet” foi ressuspendido em 2,4ml

de meio Glicina-Gema de ovo (GG) sem glicerol (pH 7; 285 mOSM) e

decorridos 5 minutos acrescido de 1,6 ml de GG com 12,8% de glicerol e

envasado em 4 palhetas de 0,5ml, ficando esta amostra com 5% de

glicerol em sua concentração final (Lopes e Papa, 1998).

Tris - O segundo “pellet” foi ressuspendido em 2ml de

meio TRIS, Ac.Cítrico e Glicose (TRIS) com 3% de glicerol (pH 6,10; 788

mOSM) e decorridos 5 minutos acrescido de 2ml de TRIS com 7% de

glicerol e envasado em 4 palhetas de 0,5ml, ficando esta amostra com 5%

de glicerol em sua concentração final (Rota,1997).

Experimento III

84

M9 - Um terceiro “pellet” foi ressuspendido em 4 ml de M9

(33% Merck-gema, 33% Kenney, 33% DME, 5% glicerol na solução final)

(Dell’Aqua Junior, 2000) (ANEXO II) e envasado em 4 palhetas de 0,5ml,

ficando esta com 5% de glicerol em sua concentração final.

Amostras tratadas sob cada protocolo foram avaliadas

quanto à motilidade e vigor espermático através de microscopia de

contraste de fase e, imediatamente após, levadas ao refrigerador

computadorizado MINITUB programado para a temperatura de 5ºC. A

temperatura de 5ºC foi atingida em média após 20 minutos de

refrigeração, sendo este período nomeado Curva de Refrigeração (CR).

Para cada grupo, um ejaculado de cada cão foi

manipulado como descrito e posteriormente mantido a 5ºC por 40 (n=5)

ou 60 minutos (n=5), sendo este período denominado Período de

Equilíbrio (PE).

Desta forma, foram formados 6 grupos quanto ao

tratamento das amostras de sêmen (figura 1), sendo eles: G1 – congelado

em GG após CR de 20 minutos e PE de 40 minutos; G2 - congelado em

GG após CR de 20 minutos e PE de 60 minutos; G3 - congelado em TRIS

após CR de 20 minutos e PE de 40 minutos; G4 - congelado em TRIS

após CR de 20 minutos e PE de 60 minutos; G5 - congelado em M9 após

CR de 20 minutos e PE de 40 minutos;G6 - congelado em M9 após CR de

20 minutos e PE de 60 minutos.

Diluidores

Protocolos

GG Tris M9

CR de 20’ PE de 40’ G1 G3 G5

CR de 20’ PE de 60’ G2 G4 G6

FIGURA 1 – Esquema da formação dos grupos experimentais

Experimento III

85

Após o PE (40 ou 60 minutos), 2 palhetas de cada grupo

foram levadas a um isopor contendo 5 cm de nitrogênio líquido (N2) e

mantidas a 4 cm deste durante 20 minutos. Decorrido este tempo, as

palhetas foram mergulhadas no N2 raquiadas e armazenadas em botijões

apropriados.

O conteúdo das 2 outras palhetas de cada grupo foi

levado diretamente do PE ao banho Maria 37ºC por 10 minutos e avaliado

(M1) quanto à motilidade e vigor espermáticos.

As palhetas armazenadas foram posteriormente (> 24

horas) descongeladas a 37ºC por 30 segundos e avaliadas (M2) quanto à

motilidade e vigor espermáticos e integridade das membranas

espermáticas.

As amostras descongeladas foram ainda mantidas em

banho Maria a 37ºC durante 1 hora para teste de longevidade

espermática e após este período reavaliadas (M3) quanto à motilidade e

vigor espermáticos e integridade das membranas espermáticas.





Para a comparação entre 3 momentos no mesmo

tratamento: prova não paramétrica de Friedman para amostras

dependentes, com o cálculo das estatíticas χ2 e p.



Experimento III

86


significativas quando p< 0,05. Nos casos em que 0,05<p<0,10 foi referida



Experimento III

87

3. RESULTADOS

TABELA 1 – Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.

G1 G2 G3 G4 G5 G6 M1 80Aa 80Aa 70Ba 80Ba 70Ba 80Ba M2 50ab 40ab 40ab 30ab 50ab 40ab M3 30b 20b 20b 10b 20b 40b

Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05) Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05) não houve diferença estatística significativa quando se comparou os dois PE (p>0,05)

Verificamos que houve decréscimo da motilidade

espermática após o processo de descongelação para todos os grupos,

sendo que, ao final do teste de longevidade (M3) todas as amostras

apresentaram motilidade espermática significativamente diminuída frente

aos valores iniciais (p<0,05) (tabela 1).

Quando comparados os dados obtidos em cada

momento, verificamos que não houve diferença significante na motilidade

espermática após a descongelação e após o teste de longevidade, porém,

imediatamente após o período de equilíbrio, a motilidade espermática dos

grupos diluídos em GG apresentaram valores significativamente mais

elevados (p<0,05) (tabela 1).

Experimento III

88

TABELA 2 - Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.

Grupos G1 G2 G3 G4 G5 G6 M1 3Aa 2Aa 2Ba* 2Ba 3Aa 3Aa* M2 2ABab 2ABab 2Ba* 1Bab 2Aab 3Aa*

M3 1b 1b 0a* 1b 0b 2a*

Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05). Letras minúsculas seguidas do símbolo * representam tendência estatística (p<0,10). não houve diferença estatística significativa quando se comparou os dois PE (p>0,05)

Na tabela 2, observa-se que as amostras congeladas com

TRIS (G3 e G4) apresentaram resultados significativamente inferiores

após a descongelação, porém, após o teste de longevidade (M3), não se

observou diferença estatística significativa entre os grupos (p>0,05).

Observa-se ainda que, verificando-se o vigor dentro de um mesmo grupo,

houve tendência à manutenção do vigor espermático após o período de

equilíbrio, descongelação e após teste de longevidade (M1 = M2 = M3)

(p<0,10) nos grupos onde o sêmen foi congelado com TRIS com PE de

40 minutos (G3) e com M9 com PE de 60 minutos (G6).

Experimento III

89

TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.

Grupos G1 G2 G3 G4 G5 G6

M2 46Aa 35Aa 37Aa 43Aa 60Ba 50Ba M3 36Ab 25Aa 32Aa 40Ab 62Ba 50Ba

Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística (p<0,05). Letras minúsculas diferentes em uma mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05). não houve diferença estatística significativa quando se comparou os dois PE (p>0,05)

Na tabela 3, verificou-se que os dois grupos congelados

com meio o M9 (G5 e G6) apresentaram-se significativamente superiores

(p<0,05) após a descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3).

Observa-se ainda que os grupos G2, G3, G5 e G6

mantiveram, significativamente equivalentes, as porcentagens de células

espermáticas íntegras entre os momentos M2 e M3 (p<0,05).

Experimento III

90

4. DISCUSSÃO

A utilização do sêmen congelado de canídeos será um

grande passo na criação nacional, possibilitando a difusão do sêmen de

machos melhoradores de raças, e ainda, servindo de seguro biológico na

preservação de espécies ameaçadas de extinção.

O resfriamento leva a célula a um estado de quiescência,

diminuindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição dos gastos

energéticos e diminuição na produção de catabólitos tóxicos, contribuindo

para a preservação celular (Mazur, 1970, Watson, 1981, Watson, 1995,

Holt, 2000).

As técnicas de preservação do sêmen em baixas

temperaturas podem provocar a diminuição da fertilidade devido,

principalmente, às injúrias ocorridas aos espermatozóides durante o

processo de resfriamento (fase de transição), congelação e

descongelação (efeito de solução e recristalização) (Jasko, 1994, Zúccari,

1998; Holt, 2000; Kirk, 2001). A alteração da temperatura, assim como

alterações de osmolaridade, pressão ou pH podem determinar mudanças

irreversíveis na estrutura e organização das membranas espermáticas

(Gennis, 1989).

A avaliação seqüencial da motilidade espermática obtida

após o período de equilíbrio (M1), descongelação (M2) e após o teste de

longevidade (M3) corroboram com estas afirmações, sendo verificado um

decréscimo significativo destes valores no decorrer destes processos em

todos os grupos.

Experimento III

91

O vigor espermático das amostras congeladas com TRIS

com PE de 40 minutos e congeladas com M9 com PE de 60 minutos não

apresentaram decréscimo significativo após o descongelamento e o teste

de longevidade. O G3 apresentou resultados significativamente inferiores

quando comparado aos outros grupos em M1 e em M2, logo, esta

manutenção do vigor espermático é menos significativa para este grupo.

Ao contrário deste fato, em G6, onde se utilizou o M9 como diluidor com

60 minutos de PE, verificou-se uma superioridade sobre os outros grupos,

tanto no M1 como em M2, além de ter havido a manutenção dos valores

durante o processo de equilíbrio, descongelação e longevidade.

Podemos afirmar que houve uma maior manutenção da

viabilidade espermática no G6. O M9 é um diluidor rico em aminoácidos e

tampões que funcionam tanto como crioprotetores como antioxidantes e

são, provavelmente, estes componentes que conferem a ele maior poder

de proteção quanto aos efeitos adversos das alterações de temperatura.

Os dados aqui encontrados são concordantes com os obtidos por Neves

Neto (1999) e Dell’Aqua Junior (2000) que obtiveram melhores resultados

de congelação para o sêmen eqüino congelado neste diluidor.

Os efeitos deletérios da refrigeração da célula podem se

apresentar de maneira diferente entre as diferentes espécies animais,

entre indivíduos e ainda entre os compartimentos de um espermatozóide,

como o acrossômico ou o mitocondrial (Garner et al., 1999, Holt, 2000).

O sêmen de várias espécies animais necessita de uma

pausa de algumas horas antes da congelação para que desenvolva uma

máxima resistência aos efeitos adversos da criopreservação. Watson

(1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a

entrada do glicerol como se acreditava anteriormente, mas este tempo

permite que as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos

iônicos ocorram.

Experimento III

92

Na literatura atual existem vários protocolos para a

congelação do sêmen canino, dentre eles, vários são os períodos de

equilíbrio propostos (Olar, 1984; England, 1992; Rota, 1998; Santos,

1999).

Após a avaliação estatística de nossos dados,

observamos que os dois períodos de equilíbrio propostos (40 ou 60

minutos) não influenciaram estatisticamente os dados avaliados. No

Experimento II, observamos a superioridade dos períodos de equilíbrio de

40 e 60 minutos frente ao de 90 minutos. Somando-se a curva de

refrigeração de 20 minutos ao período de 60 minutos, observamos que os

mesmos têm uma duração total bastante próxima. Provavelmente aqui, a

curva de refrigeração mais rápida (20 minutos) em contraste com uma

curva de refrigeração mais longa (~45 minutos) pode ter sido benéfica à

célula espermática canina, evitando maiores danos que poderiam ter sido

causados devido aos efeitos da fase de transição, que ocorre em

temperaturas entre 20 e 5ºC.

Após o término do processo de preservação, os

espermatozóides devem apresentar uma boa motilidade para que possam

atingir o local da fertilização e penetrar o óvulo. Precisam, também,

manter a integridade de suas membranas espermáticas, para sua

posterior ligação com a zona pelúcida e membrana vitelínica, resultando

na formação do zigoto (Holt, 1995; Zúccari, 1998).

Nos grupos congelados com M9, a integridade das

membranas espermáticas foi significativamente superior após

descongelação (M2) e após o teste de longevidade (M3). Acrescenta-se,

ainda, que os G5 e G6 mantiveram significativamente estáveis a

porcentagem de membranas íntegras durante o teste de longevidade

sendo que, ao final deste, M2=M3 (p>0,05). Os aminoácidos presentes

neste diluidor podem ter interagido positivamente na manutenção das

Experimento III

93

membranas espermáticas e ainda, a presença do EDTA, um quelante do

cálcio, pode ter protegido a célula espermática de alterações de

permeabilidade que podem levar à lesão da membrana plasmática.

Podemos concluir que o M9 resultou em melhores

resultados de preservação espermática quando utilizada uma curva de

refrigeração de 20 minutos com período de equilíbrio de 40 ou 60 minutos

e descongelação em 37ºC por 30 segundos.

Experimento IV

94

5. Experimento IV

Experimento IV

95

EFEITO DE TRÊS DIFERENTES DILUIDORES SOBRE O SÊMEN CANINO DESCONGELADO SOB

DOIS DIFERENTES PROTOCOLOS


A criopreservação e suas conseqüências sobre a célula

espermática são os assuntos mais descritos e estudados pelos

pesquisadores da área de biotecnologia do sêmen. Sabemos que tanto a

refrigeração como a congelação e descongelação são eventos que

podem culminar em alterações irreversíveis da célula espermática. São

necessários ainda muitos estudos para que possamos compreender a

origem destas alterações para que, num futuro, estes efeitos deletérios

possam ser minimizados ou eliminados (Watson, 1995; Peña, 2000).

Watson (1995) afirmou que as mudanças pós-

ejaculatórias do espermatozóide no trato feminino em sua preparação

para a fusão com o oócito devem ser vistas como a continuidade no

desenvolvimento e maturação espermática, processo este que teve inicio

no epidídimo. A criopreservação implica em uma pausa neste processo

natural durante a qual o espermatozóide é “inativado”, porém, ao invés de

ser “reativado” no estágio de onde tinha parado, sua maturação é afetada

pelo processo.

Watson (1995) concluiu ainda que o processo de

criopreservação faz com que os espermatozóides se tornem mais reativos

pelo fato de suas membranas sofrerem mudanças na fluidez e tornarem-

se mais permeáveis ao cálcio. Estes fenômenos podem promover a

capacitação e reação do acrossomo, diminuindo o tempo de vida útil do

Experimento IV

96

espermatozóide, impossibilitando a futura fecundação do óvulo no local e

momento apropriado.

O meio diluidor deve proteger as células espermáticas

dos efeitos adversos de todo o processo de criopreservação. As

propriedades protetoras de um meio diluidor são atribuídas aos diferentes

componentes deste meio e da sua interação com as células espermáticas

de uma determinada espécie, e ainda, de um determinado indivíduo

(Watson, 1995; Rota, 1998; Holt, 2000).

Watson (1995) sugeriu ainda que um mesmo indivíduo

pode apresentar sua característica de congelabilidade seminal irregular, e

que esta irregularidade pode ser conseqüente de diferenças no tempo de

exposição das células espermáticas de diferentes ejaculados ao ambiente

epidídimário, que é o local onde os espermatozóides adquirem a maioria

de suas “habilidades” para suportarem as flutuações de temperatura.

Lopes e Papa (1998) compararam efeitos da

centrifugação e da congelação nos diluidores glicina e TRIS sobre a

motilidade e vigor do sêmen canino. Estes autores verificaram que houve

uma interação positiva entre a centrifugação e o congelação e concluíram

que o grupo centrifugado e congelado em meio glicina apresentou

melhores resultados.

Santos et al.(1999) avaliaram o efeito de cinco diferentes

diluidores na congelação do sêmen canino, sendo eles, TRIS-frutose-

ac.cítrico, glicina, lactose, leite desnatado e TRIS-frutose-citrato, com a

adição do glicerol em todos os casos realizada a 5ºC. Estes autores

concluíram que os diluidores TRIS-frutose-ac.cítrico e glicina

proporcionaram melhora na motilidade retilínia progressiva e vigor

espermáticos. Os autores comentaram que todos os diluidores

aumentaram a taxa de patologia espermática.

Experimento IV

97

Barnabé e Barnabé (1995) avaliaram a qualidade do

movimento e o estado acrossomal do sêmen de búfalo congelado nos

diluidores TRIS, TRIS-TES e glicina e, posteriormente, incubados em

heparina ou cafeina. Estes autores verificaram que o meio glicina

melhorou a qualidade do movimento espermático imediatamente após o

descongelamento e que o diluidor TRIS após incubação tanto em cafeína

como em heparina apresentou maiores quantidades de lesão acrossomal.

Neto Neves et al. (1999) em seus estudos sobre

congelação do sêmen eqüino concluiram que o meio M9 conferiu melhor

motilidade e vigor espermáticos frente ao diluidor Merck-Gema,

imediatamente após a descongelação e aos 60 minutos do teste de

termorresistência.

O processo de descongelamento parece ser tão deletério

aos espermatozóides quanto à congelação e os principais efeitos

adversos são atribuídos à recristalização de microcristais de gelo

intracelular, quando o descongelamento é realizado lentamente ou devido

a alterações bruscas do volume celular, quando o descongelamento se

procede muito rapidamente, além de alterações de estrutura e função da

MP ( Watson, 1981; Watson, 1995; Zúccari, 1998; Holt, 2000).

A temperatura sob a qual se descongela uma amostra de

sêmen influencia na viabilidade pós-descongelação deste sêmen, sendo,

principalmente, descritas alterações no movimento espermático e na

integridade das membranas (Ivanova-Kicheva et al., 1995; Watson, 1995;

Holt, 2000; Peña, 2000).

Um protocolo de congelação e descongelação de sêmen

deve incluir a temperatura e o período de exposição ideal, considerando-

se, para tanto, as características particulares daquele protocolo. Várias

temperaturas e tempos de exposição têm sido descritos para a

descongelação do sêmen canino, assim como inúmeros protocolos de

Experimento IV

98

congelação e descongelação (Olar, 1984; England, 1992; Rota, 1998;

Peña 2000).

Penã (2000) afirmou que a temperatura de 70ºC, por 8

segundos, melhorou os resultados de fertilidade para o sêmen canino. Em

seu experimento a autora sugeriu que o descongelamento a 37ºC, por 15

segundos, pode expor as membranas espermáticas a variações de

temperatura que induzem à reorganização de lipídeos ou à movimentação

de proteínas mais severamente que as alterações ocorridas a 70ºC por 8

segundos.

A descongelação, sob altas temperaturas com um tempo

de exposição bastante curto, tem sido preconizado para a descongelação

do sêmen canino (Olar, 1984; England, 1992; Ivanova-Kicheva et al.,

1995; Rota, 1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000) conferindo longa

viabilidade às amostras de sêmen tanto in vitro como in vivo.

Em contrapartida, os protocolos mais utilizados para

outras espécies animais, incluindo aquele preconizado pelo Ministério da

Agricultura (CBRA, 1996), indicam a descongelação de palhetas de 0,5ml

à 37ºC durante 30 segundos.

Após o processo de congelação e descongelação das

células espermáticas, testes de alta correlação com a fertilidade devem

ser realizados, para que se verifique a viabilidade dos diluidores e\ou dos

métodos de congelação utilizados (Penã, 2000; Kirk, 2001).

A avaliação da motilidade espermática, definida como o

percentual de espermatozóides móveis de um ejaculado e da intensidade

do movimento, constitui-se num parâmetro importante de avaliação da

qualidade e viabilidade do sêmen (Linde-Forsberg, 1995), porém, Blach et

al. (1989) afirmaram que alguns espermatozóides que estão móveis in

vitro podem tornar-se imóveis in vivo ou vice versa.

Experimento IV

99

O movimento retilíneo progressivo é considerado normal

em cães, e reflete uma completa habilidade e viabilidade para fertilizar o

óvulo (Mies Filho, 1987; Christiansen, 1988; Feldman e Nelson, 1996;

Rota et al., 1997).

A avaliação subjetiva do movimento espermático é muito

importante e deve ser rotineiramente realizada, no entanto, pelo fato de

ser realizada por um técnico, pode estar sujeita a um grande número de

variações, principalmente, no que diz respeito ao grau de habilidade e

experiência do avaliador (Iguer-Ouada e Verstegen, 2001).

Para que estas variações sejam minimizadas uma

avaliação computadorizada do movimento espermático pode ser

realizada. Muitas têm sido as tentativas de padronização desta avaliação

na espécie canina. Recentemente, Iguer-Ouada e Verstegen (2001)

propuseram a padronização de um avaliador computadorizado de

movimento espermático (HTR-IVOS10 analyzer, Hamilton Thorn

Research, Beverly, Mass, USA) que apresentou ótimos resultados na

avaliação de espermatozóides da espécie canina.

Utilizando-se este sistema podemos avaliar a motilidade

espermática total, motilidade total progressiva, padrão médio de

velocidade espermática (VAP), velocidade de deslocamento em linha reta

(VSL), velocidade de deslocamento curvilíneo (VCL), sobreposição do

deslocamento retilíneo e a do deslocamento curvilíneo VSL/VCL (STR) e

ainda a linearidade do movimento, ou seja a proximidade da linha de

deslocamento com uma linha linear (LIN) dos espermatozóides (Iguer-

Ouada e Verstegen, 2001).

Métodos identificadores da integridade das membranas

espermáticas têm sido utilizados na avaliação de diferentes técnicas de

conservação do sêmen (Blach et al., 1989; Harrison e Vickers, 1990;

Kumi- Diaka, 1993; Peña, 2000; Kirk, 2001).

Experimento IV

100

Segundo Cunha (1997), um dos métodos que pode ser

utilizado na verificação da integridade das membranas espermáticas de

cães é o emprego de sondas fluorescentes, sendo elas o diacetato de

carboxifluoresceína (FDA) e o iodeto de propídeo (PI). Quanto ao

mecanismo de ação, o FDA, um éster não polar e não fluorescente

atravessa a membrana plasmática e, uma vez no interior da célula, é

hidrolisado por esterases não específicas, resultando na formação de 6-

carboxifluoresceína, composto impermeável à membrana plasmática, que

emite fluorescência verde nos compartimento celulares onde há

integridade de membranas. Ao contrário, o PI, com forte afinidade aos

ácidos nucléicos, é impermeável à membrana plasmática, e, portanto, as

células com a membrana plasmática lesada, tornando possível a ligação

do PI com o DNA presente no núcleo, emite fluorescência vermelha.

O isotiocianato fluorescinado (Fitc) é uma sonda

fluorescente comum e largamente utilizada para verificação do estado

acrossomal (Penã, 2000; Kirk, 2001; LANDIM-ALVARENGA1). O Fitc deve

estar ligado a uma lecitina, que é uma proteína ou uma glicoproteina

isolada de sementes de várias plantas. Estas lecitinas se ligam

especificamente a resíduos de açúcares. As duas lecitinas mais utilizadas

na verificação de estado acrossomal são o PSA - aglutinina Pisum

sativum oriunda da ervilha e o PNA - aglutinina Arachis hypogea originária

do amendoim (Cross e Watson, 1994; Kirk, 2001).

O PSA e o PNA exibem padrões diferentes de afinidades

a açúcares, sendo que o PSA se liga manose e ao metil α - D -

glicosideos enquanto o PNA se liga a galactose. PNA liga-se

preferencialmente à membrana acrossomal externa enquanto que o PSA

se liga à matriz acrossomal (Cross, 1998, Peña, 2000; Kirk, 2001).

1. LANDIM- ALVARENGA, F. Docente do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP Botucatu

Experimento IV

101

A alteração da fluidez das membranas espermáticas

durante a capacitação propicia a fusão da membrana acrossomal externa

com a membrana plasmática, este fenômeno fusogênico é conhecido

como reação do acrossomo (Cross, 1998; Kirk, 2001).

Cross e Watson (1994) e Kirk2 utilizaram o Fitc-PNA para

verificar o estado acrossomal de espermatozóides bovinos e eqüinos,

respectivamente, e sugeriram que tal sonda fluorescente se liga a

membrana acrossomal externa quando esta exibe uma alteração de

permeabilidade. Para que se pudessem diferenciar os espermatozóides

com a total perda do acrossomo dos acrossomos intactos utiliza-se o PI

em conjunto com o Fitc PNA (Kirk2, 2001, LANDIM-ALVARENGA3).

O Fitc-PNA liga-se a resíduos de açúcares, logo, ligar-se-

á aos resíduos de açúcares presentes no meio, e ainda, a maioria das

lecitinas liga-se ao leite, gema de ovo e a outras partículas presentes no

plasma seminal (Kirk, 2001).

Com vista no exposto tivemos como objetivo deste

experimento avaliar o efeito de dois diferentes protocolos de

descongelação do sêmen canino congelado com três diferentes diluidores

sobre a qualidade do movimento espermático, integridade das

membranas espermáticas e a condição acrossomal.

2. KIRK, E Colorado State University – 2001. 3. c.f. nota 1, pág ----

Experimento IV

102


2.1. Animais

Foram coletados e processados ejaculados de nove cães,

sendo eles: um (1) SRD, três (3) Cocker Spaniel, dois (2) Weimaraner e

três (3) Rottweiller, todos eles provenientes de criatórios particulares da

cidade de Botucatu-SP. Os animais selecionados apresentaram-se em

boas condições de saúde.

Os cães permaneceram em seus respectivos canis

durante a fase experimental do projeto. Todos os animais foram mantidos

sob boas condições alimentares e de higiene durante a fase experimental.

O sêmen foi coletado no próprio criatório e transportado

imediatamente até o laboratório da Área de Reprodução Animal da FMVZ

UNESP- Botucatu, para análise e manipulação.


Foi realizada uma coleta sêmen de cada cão (n=9). O

sêmen foi coletado por meio de massagem peniana e o ejaculado

completo recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta



Experimento IV

103


ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN

Volume: Através de tubo coletor graduado. Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva. ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN



sêmen é colocada sobre lâmina aquecida (38-40ºC) e recoberta por




1996) para o vigor.




Espermiograma: Foi realizada na fase de seleção de



al, 1986) foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e

os resultados expressos em porcentagem, e, registrados individualmente.

A classificação das patologia foi feita segundo Oetllé (1988).




Experimento IV

104

Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996)(ANEXO





lesadas- possuem o núcleo emitindo fluoresncência vermelha.

Avaliação do estado acrossomal: Para avaliação do

estado acrossomal recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se

Iodeto de Propídio e Fitc-PNA, de acordo com a técnica descrita por Kirk

(2001) modificada por LANDIM-ALVARENGA4. Para a realização desta,

misturou-se 10µl da amostra a 40µl da solução de trabalho (ANEXO IV). A

avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de

epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon- Episcopic Fluorescence

Attchment “EFA” HalogenLamp Set. Foi realizada a contagem das células

espermáticas de um campo claro e, imediatamente após, este mesmo

campo foi verificado sob epifluorescência. Foram anotadas as células que

emitiam qualquer fluorescência a cada campo. No total era realizada a

contagem de 200 células em campo claro.

A classificação das células era realizada segundo descrito

por LANDIM-ALVARENGA3: reação acrossomal verdadeira – emitindo

apenas fluorescência verde (Fitc-PNA); falsa reação do acrossomo –

emitindo fluorescência verde na região acrossomal (Fitc-PNA) e vermelha

(PI); espermatozóides lesados – emitindo apenas fluorescência

vermelha (PI); espermatozóides intactos - células não coradas.

4. c.f. nota 1 pág ----

Experimento IV

105

FIGURA 1 – Espermatozóides caninos corados com Fitc-PNA (emitindo

fluorescência verde) e pelo PI (emitindo fluorescência vermelha). a – reação acrossomal verdadeira, b - falsa reação do acrossomo c – espermatozóides lesados.

a

c

b

c

Experimento IV

106


Foram coletados e processados ejaculados de nove cães,

sendo que cada cão doou 1 ejaculado. Depois de coletado, avaliado e

verificada a concentração espermática, cada ejaculado foi dividido em 3

amostras idênticas. Cada amostra foi acrescida, na proporção de 1:1, de

meio à base de leite desnatado e glicose (Kenney, 1975) (pH-7,26; 355

mOSM) e centrifugada por 5 minutos a 800g.

O sobrenadante de cada amostra foi eliminado e foram

confeccionadas 84 palhetas de 0,5ml segundo os seguintes protocolos:

Glicina Gema – Um “pellet” foi ressuspendido em diluidor

à base de glicina gema de ovo (GG) sem glicerol (pH 7; 285 mOSM) e

decorridos 5 minutos acrescido de GG com 12,8% de glicerol e envasado

em palhetas de 0,5ml, ficando este protocolo com 5% de glicerol em sua

concentração final (Lopes e Papa, 1998).

Tris - O segundo “pellet” foi ressuspendido em diluidor à

base de TRIS, acido cítrico e glicose (TRIS) com 3% de glicerol (pH 6,10;

788 mOSM) e decorridos 5 minutos acrescido de TRIS com 7% glicerol e

envasado em palhetas de 0,5ml, ficando este protocolo com 5% de

glicerol em sua concentração final (Rota, 1997).

M9 - Um terceiro “pellet” foi ressuspendido em M9 (33%

Merck-gema, 33% Kenney, 33% DME (Sigma), 5% glicerol na solução

final) (Dell’Aqua Junior, 2000) e envasado em palhetas de 0,5ml, ficando

este protocolo com 5% de glicerol em sua concentração final.

Foram envasadas 28 palhetas segundo cada protocolo,

ficando as palhetas com concentração espermática média de 33,73

milhões de sptz/ palheta.

Experimento IV

107

Amostras tratadas sob cada protocolo foram avaliadas

(M1) quanto à motilidade e vigor espermático através de microscopia de

contraste de fase e integridade das membranas espermáticas através de

sondas fluorescentes e imediatamente após, levadas ao refrigerador

computadorizado MINITUB programado para a temperatura de 5ºC. Tal

temperatura foi atingida em média após 20 minutos de refrigeração, sendo

este período nomeado Curva de Refrigeração (CR) e mantido por 40

minutos após atingirem a temperatura de 5ºC, sendo este período

denominado Período de Equilíbrio (PE).

Após o PE as palhetas foram levadas a uma caixa de

isopor contendo 5 cm de nitrogênio líquido (N2) e mantidas a 4 cm deste

durante 20 minutos. Logo após, as palhetas foram mergulhadas no N2,

raquiadas e armazenadas em botijões apropriados.

Uma amostra de cada grupo foi levada diretamente do PE

ao banho Maria 37ºC por 10 minutos e avaliada (M2) quanto à motilidade

e vigor espermáticos e integridade das membranas espermáticas, como já

descrito anteriormente.

Um total de cinqüenta e quatro (54) palhetas foram

descongeladas. As palhetas congeladas sob cada protocolo eram

descongeladas aos pares, sendo sempre descongeladas seis palhetas de

um mesmo animal. Uma das palhetas era descongelada a 37ºC por 30

segundos e outra palheta descongelada a 72ºC por 8 segundos. Foram

formados os seguintes grupos (figura 2) : G1 - congelado em GG e

descongelado a 37ºC por 30 segundos; G2 - congelado em GG e

descongelado a 72ºC por 8 segundos; G3 - congelado em M9 e

descongelado a 37ºC por 30 segundos; G4 - congelado em M9 e

descongelado a 72ºC por 8 segundos; G5 - congelado em TRIS e

descongelado a 37ºC por 30 segundos; G6 - congelado em TRIS e

descongelado a 72ºC por 8 segundos.

Experimento IV

108

Meio GG M9 Tris 30 segundos a 370C G1 G3 G5 8 segundos a 720C G2 G4 G6

FIGURA 2 – Esquema da formação dos grupos experimentais

Uma palheta de cada grupo foi avaliada quanto à motilidade e vigor espermático e integridade das membranas espermáticas entre 5 a 10 minutos após o descongelamento (M3).

As amostras foram mantidas em banho Maria 37ºC e, decorridos 30 minutos, em média, do descongelamento, foi realizada a avaliação da qualidade do movimento espermático através de avaliação computadorizada (Hamilton Thorn Research – IVOS 10) sendo verificados os parâmetros: motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), padrão médio de velocidade(VAP) e linearidade(LIN).

As amostras foram mantidas em banho Maria a 37ºC por 1 hora após o descongelamento para o teste de longevidade espermática e, após este período, reavaliadas (M4) quanto à motilidade e vigor espermáticos, integridade das membranas espermáticas.

Posteriormente foram descongeladas 30 palhetas. Estas palhetas foram descongeladas de modo a formar cinco amostras de cada grupo acima descrito (figura 2) e realizada a avaliação do estado acrossomal.

Para avaliação do estado acrossomal utilizou-se o Fitc-PNA em conjunto com PI. O Fitc-PNA fluoresce em verde a membrana acrossomal externa dos espermatozóides onde existe alteração de permeabilidade e o PI fluoresce em vermelho as células espermáticas com a membrana plasmática lesada. As células foram avaliadas e contadas como descrito inicialmente.

Experimento IV

109





Para a comparação entre 3 momentos no mesmo

tratamento: prova não paramétrica de Friedman para amostras

dependentes, com o cálculo das estatíticas χ2 e p.




significantes quando p<0,05. Nos casos em que 0,05<p<0,10 foi referida



Experimento IV

110

3. RESULTADOS

TABELA 1 – Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.

G1 G2 G3 G4 G5 G6

M1 70 70 80 80 80 80 M2 70 70 60 60 70 70 M3 40 50 40 50 50 40 M4 20 10 10 30 10 10

Avaliando-se a análise estatística das medianas da

motilidade espermática verificamos que não houve diferença estatística

significante entre os grupos em nenhum dos momentos avaliados

(p<0,05). Existe, no entanto, um decréscimo da motilidade após o

processo de descongelação e o teste de longevidade (tabela 1).

TABELA 2 - Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.

G1 G2 G3 G4 G5 G6

M1 3A 3A 3A 3A 2B 2B M2 3B 3B 3A 3A 2C 2C M3 1 2* 2 2 1 2* M4 1A 1A 0A 1A 0AB 1AB

Letras maiúsculas diferentes entre os grupos em uma mesma linha indicam diferença

estatística entre diluidores para cada temperatura (p<0,05) *indica tendência superioridade entre as duas temperaturas de descongelação para um

diluidor (0,05<p<0,10).

Experimento IV

111

A análise estatística dos dados apontou que não houve

diferença estatística para o vigor espermático entre os grupos (p>0,05),

porém, foram verificadas tendências estatísticas (tabela 2).

Quando foi verificado o efeito do diluidor em cada

momento isolado, descongelados em uma mesma temperatura, ou seja,

G1xG3xG5 e G2xG4xG6, verificamos que G1=G5≤G3, logo, verificou-se

tendência à superioridade do M9 logo após o descongelamento a 37ºC.

Quando foram contrastados os grupos descongelados a 72ºC, verificamos

que G2=G4=G6. Podemos ainda dizer que existe tendência dos grupos

G2, G4 e G6, ou seja, descongelados à temperatura de 72ºC, a

apresentarem os valores mais altos do vigor logo após o

descongelamento (tabela 2).

O vigor espermático após o teste de longevidade também

não diferiu estatisticamente entre os grupos, porém, houve tendência

(0,05<p<0,10) dos diluidores glicina gema e M9 a apresentar os maiores

valores após o teste de longevidade, sendo que dentre estes dois grupos,

o G4 (M9 descongelado a 72ºC) foi o que apresentou maiores valores

(tabela 2).

TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas espermáticas (%) do sêmen canino congelado e descongelado avaliadas após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002.

G1 G2 G3 G4 G5 G6 M1 86 86 87 87 91 91 M2 82 82 86 86 81 81 M3 53 57 53 62 59 62 M4 34B 37B 28Ba 39ABb 46A 44A

Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística entre diluidores para cada temperatura (G1 x G3 x G5) e (G2 x G4 x G6) (p<0,05).

Letras minúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística entre temperaturas para cada diluidor (G1xG2), (G3xG4) e (G5xG6) (p<0,05).

Experimento IV

112

Não houve diferença estatística significante entre os

grupos após a diluição (M1), período de equilíbrio (M2) após a

descongelação (M3) quanto à porcentagem de células com membrana

espermática integra (p>0,05) (tabela 3).

Após o teste de longevidade espermática (M4) verificou-

se superioridade dos grupos congelados em TRIS, tanto quando

comparados os grupos descongelados a 37ºC (G1 = G3 < G5) como

quando comparados os grupos descongelados a 72ºC (G2 < G6) (G4 é

intermediário). Quando comparadas as descongelações a 37ºC e a 72ºC,

ou seja, G1 x G2, G3 x G4 e G5 x G6, verificou-se menor porcentagem de

células integras quando o grupo congelado em M9 foi descongelado a

37ºC (G3 < G4), sendo as outras comparações estatisticamente

equivalentes (tabela 3).

TABELA 4 – Mediana da qualidade do movimento espermático descrito por motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP), velocidade média (VAP) e linearidade do movimento (LIN) avaliada após 30 minutos da descongelação. Botucatu, 2002.

G1 G2 G3 G4 G5 G6

MT 20A 24A 16B 17B 11B 23B MP 10A 22A* 10B 9B 3B 11B* VAP 83,4 89,6AB* 72 78,4B 73,7 79,2B* LIN 62A 71A* 68A 64B 57B 61C*

Letras maiúsculas diferentes em uma mesma linha indicam diferença estatística entre diluidores para cada temperatura (G1 x G3 x G5) e (G2 x G4 x G6) (p<0,05).

* em uma mesma linha indicam superioridade estatística entre temperaturas de descongelação para cada diluidor (G1xG2), (G3xG4) e (G5xG6) (p<0,05).

Experimento IV

113

Quanto à análise estatística da qualidade do movimento espermático, decorrida em média 30 minutos após a descongelação, verificamos que os grupos congelados em GG foram superiores aos outros estudados quanto à motilidade total e à motilidade progressiva e à linearidade e ainda apresentaram tendência à superioridade para a velocidade média (VAP). Quando comparamos a temperatura de descongelamento entre o mesmo diluidor, podemos verificar que para os grupos congelados em GG (G1 e G2) a descongelação a 72ºC apresentou resultados superiores para motilidade progressiva e linearidade do movimento, e ainda, quanto a motilidade total e a velocidade média houve tendência à superioridade do grupo G2, apresentando este sempre os mais altos resultados comparados a todos os outros grupos (tabela 4).

TABELA 5 – Mediana da porcentagem de células lesadas (Ls) e com reação do acrossomo verdadeiras (Rv) após a descongelação do sêmen canino. Botucatu, 2002.

G1 G2 G3 G4 G5 G6 Rv 8 8 0 1 10* 22,5* Ls 7,5 16 0 0,5 1 1

• *indica significa diferença estatística significativa

Quando avaliamos estatisticamente o estado do acrossomo verificamos que não houve diferença estatística significante quanto à quantidade de células lesadas após a descongelação entre os grupos estudados (tabela 5).

Os grupos congelados com TRIS tanto descongelado a 37ºC por 30 segundos como a 72ºC por 8 segundos (G5 e G6) apresentaram uma quantidade significativamente maior de células com reação verdadeira de acrossomo (tabela 5).

Experimento IV

114

4. DISCUSSÃO

O resfriamento, congelação e descongelação preservam a

célula espermática, porém inúmeros danos são verificados após a

descongelação (Mazur, 1970, Watson, 1981, Watson, 1995, Holt, 2000).

Comprovamos que houve uma diminuição de viabilidade espermática

após a congelação e descongelação (C/D), com diminuição de motilidade

e vigor espermático e da integridade das membranas espermáticas em

todos os grupos estudados após a C/D, a despeito do meio diluidor

utilizado ou da temperatura em que se realizou a descongelação.

Para que a congelação de um ejaculado se realize com

sucesso é necessária a adição de um diluidor que ajude a estabilizar o

metabolismo celular e que ainda preserve a célula de sofrer,

precocemente, a capacitação ou uma forma desorganizada da reação do

acrossomo. O meio diluidor deve também permitir um ambiente favorável

para a conservação da integridade e função de todos os compartimentos

espermáticos e ainda, da MP dos espermatozóides (Watson, 1995;

Watson, 2000).

Quando avaliamos os meios diluidores descongelados em

cada temperatura distintamente, verificamos que não houve diferença

estatística entre os grupos quanto à motilidade e que, quanto ao vigor

espermático houve tendência estatística de superioridade do M9

descongelado a 37ºC frente aos outros grupos descongelados nesta

mesma temperatura, concordando com os achados do Experimento III.

A formação de espécies reativas de oxigênio é um dos

fatores que age negativamente sobre a célula espermática durante o

processo de refrigeração e congelação do sêmen (Cunha, 1997; Bilodeau,

2001).Cunha (1997) concordou com Papa et al. (1993) que concluiram

Experimento IV

115

que a glicina exerce função de antioxidante quando presente no meio

diluidor. Este aminoácido está presente no diluidores GG e M9.

O diluidor M9 além da glicina possui uma gama de outros

aminoácidos em sua composição, entre eles a cisteina que, como descrito

por Bilodeau et al. (2001), é um precursor intracelular da glutationa, que,

por sua vez, é um antioxidante capaz de reagir e anular diretamente

espécies reativas do oxigênio. Esta maior proteção exercida pelo meio M9

pode ser responsável por esta melhora no vigor espermático no grupo G3

frente ao G1 e G5.

Podemos dizer que estes achados concordaram com os

de Santos et al. (1999) que afirmaram que o GG e o TRIS resultaram em

resultados estatisticamente equivalentes de motilidade e vigor

espermático para o sêmen canino descongelados a 37ºC por 30

segundos.

Verificamos, no entanto, superioridade estatística quanto

à porcentagem de membranas íntegras nos grupos congelados com TRIS

após o teste de longevidade (M4), tanto nos grupos descongelados a

37ºC (G1=G3≤G5) como nos grupos descongelados a 72ºC (G2≤G4≤G6).

Entretanto, nos grupos congelados com meio TRIS,

verificou-se, também, uma diminuição significativa da linearidade do

movimento espermático após a descongelação, tanto no grupo

descongelado com 37ºC como no descongelado com 72ºC. Observamos

ainda uma quantidade significativamente maior de células exibindo reação

do acrossomo verdadeira nestes mesmos grupos após a descongelação

(G5 e G6).

Rigau et al. (2001) avaliaram o efeito da glicose e o da

frutose sobre o padrão de motilidade do sêmen canino. Estes autores

concluíram que a frutose produz um movimento espermático mais rápido

Experimento IV

116

e linear enquanto a incubação em glicose induz a movimentos oscilatórios

semelhantes aos verificados após a hiperativação espermática. O meio

TRIS contém apenas glicose em sua constituição enquanto o GG possui

frutose e glicose. O que pode justificar a diferença de padrão de

motilidade entre estes dois meios.

O EDTA, que está presente no M9, é um quelante de

cálcio (Graham, 1996), sendo assim, a concentração do cálcio em

presença desta substância no meio é diminuída. A entrada de cálcio na

célula espermática leva à capacitação espermática que, por conseguinte,

induzirá movimentos oscilatórios assim como desencadeará uma série de

alterações que culminará na reação do acrossomo (Cross, 1998). O meio

M9 provavelmente exerceu uma maior proteção às células espermáticas,

diminuindo os risco do inicio do processo de capacitação.

Podemos aqui especular que o diluidor TRIS, nas

condições utilizadas neste experimento, não foi tão eficaz quanto o GG e

o M9 em proteger o metabolismo espermático e as membranas

espermáticas, permitindo o inicio do processo de capacitação, uma vez

que, algumas das características observadas com o desencadeamento

deste processo são: o aumento do influxo de cálcio com alteração do

padrão de movimento espermático (alteração linearidade do movimento) e

ainda um aumento da fluidez da membrana acrossomal externa sem que

tenha havido a ruptura da membrana plasmática externa (reação

acrossomal verdadeira), explicando ainda, a maior quantidade de células

espermáticas íntegras presentes nos grupo G5 e G6 quando comparado

aos demais (Cross, 1988; Holt, 2000).

Podemos comparar os resultados aqui encontrados com

aqueles encontrados por Barnabé e Barnabé (1995), que verificaram

maior grau de lesão acrossomal ao sêmen bubalino congelado em TRIS

após incubação tanto em heparina como em cafeína.

Experimento IV

117

O teste de verificação do estado acrossomal utilizando-se Fitc-PNA e PI sob microscopia de epifluorescência não tinha sido ainda descrita para a espécie canina. O Fitc-PNA liga-se a radicais glicosilados que são expostos na membrana acrossomal externa com alteração de permeabilidade, que pode ser considerado um dos eventos precursores da reação do acrossomo (Cross, 1998; Kirk5), permitindo assim, a avaliação qualitativa do estado do acrossomal de uma amostra de sêmen.

Entretanto, o Fitc-PNA liga-se também a resíduos de açúcares presentes nos meios diluidores, e ainda, a maioria das lecitinas liga-se ao leite, gema de ovo e a outras partículas presentes no plasma seminal dificultando a avaliação (Kirk, 2001). Considerando-se este fato, a realização de centrifugação e lavagem das amostras de sêmen antes da realização desta avaliação, que não foi realizada neste experimento e que poderia evitar a coloração de resíduos de diluidores como no caso da figura 1, deveria ser ponderada.

Devemos ainda ressaltar que a avaliação do estado acrossomal em nosso experimento foi realizada apenas em parte dos animais estudados (30 palhetas, tendo sido estas provenientes de 5 dos 9 doadores). Conhecendo-se a existência de uma diversidade de resposta individual frente a um protocolo ou diluidor, e de acordo com a classificação dos animais em “bons congeladores” ou “maus congeladores”, segundo a capacidade de diferentes animais em suportar melhor as adversidades decorrentes do processo de criopreservação, descrita por Watson (1995) e por Kirk (2001), a reavaliação de todos os grupos com um número maior de animais deve ser considerada.

Os grupos congelados em GG conservaram melhor MT, MP, VAP e LIN após a descongelação, estes achados concordam com os de Lopes e Papa (1998) e com os de Barnabé e Barnabé (1995) e ainda com as conclusões de Rigau (2001), já que este é o meio diluidor GG é o único que leva frutose em sua composição. Verificamos ainda que o grupo

5. c.f. nota 2 pag. ----

Experimento IV

118

congelado com GG e descongelado a 72ºC apresentou sempre a melhor qualidade de movimento espermático.

O protocolo de um diluidor deve observar todas as necessidades espermáticas e corroborar para que a finalização de sua maturação se dê em momento e local adequados, garantindo que a qualidade fecundante de uma amostra de sêmen seja preservada (Watson, 1995).

Faz-se necessário, portanto, o estudo detalhado das diferentes etapas do processo de congelação e descongelação frente a cada diluidor, espécie e em alguns, casos indivíduos (Watson, 1995; Rota, 1998; Holt, 2000).Um dos passos a ser avaliado neste processo é a temperatura de descongelação.

Vários autores vêm sugerindo que a descongelação do sêmen canino a altas temperaturas com curto período de exposição proporciona melhores resultados de viabilidade e fertilidade; este fato deve-se, provavelmente, a diminuição dos riscos de recristalização de microcristais intracelulares que podem ocorrer durante uma descongelação lenta (Olar, 1984; England, 1992; Ivanova-Kicheva et al., 1995 Penã, 2000). Após a avaliação estatística dos dados do vigor espermático, observamos a tendência a superioridade (0,05<p<,10) das amostras onde a descongelação foi realizada a 72ºC por 8 segundos nos grupos congelados em GG e em TRIS. Após o teste de longevidade não se verificou diferença entre os grupos quando avaliadas as temperaturas de descongelação em cada diluidor (G1=G2) (G3=G4) (G5=G6).

Quanto à integridade das membranas avaliada entre as diferentes temperaturas de descongelação em um mesmo meio verificamos que não houve diferença estatística significativa entre as temperaturas ou entre os meios diluidores após a diluição das amostras, PE e descongelação. Verificamos que, após o teste de longevidade, as amostras congeladas em meio M9 e descongeladas a 72ºC eram

Experimento IV

119

superiores aquelas descongeladas a 37ºC. Como já discutido anteriormente, o meio M9 é rico em aminoácidos que exercem um poder antioxidante, além da presença do EDTA, que é um quelante de cálcio e inibe, desta forma alterações da membrana decorrentes do influxo de cálcio. Estas propriedades, provavelmente, propiciaram uma maior proteção às células espermáticas integras por um período maior.

Foi observada grande diferença quanto aos valores verificados pela avaliação da motilidade subjetiva e a avaliação computadorizada das amostras de sêmen. Provavelmente tal fato ocorreu devido ao tempo decorrido entre a avaliação subjetiva da motilidade (primeiro item a ser avaliado imediatamente após as descongelações) e a avaliação computadorizada do movimento espermático (último item a ser observado, geralmente 30 minutos após as descongelações). Um decréscimo de ~45% na motilidade espermática após 60 minutos de incubação do sêmen canino banho Maria a 37ºC foi também descrito por Rigau et al. (2001).

A avaliação computadorizada da qualidade do movimento espermático corroborou com os resultados até agora verificados. Verificamos que a motilidade progressiva (MP) a velocidade média (VAP) e a linearidade do movimento (LIN) foram maiores com a descongelação a 72ºC, nos grupos onde o diluidor GG ou TRIS foram utilizados.

De uma maneira geral, o movimento espermático apresentou-se superior para o grupo congelado em meio Glicina Gema e descongelado a 72ºC por 8 segundos (G2), porém, testes in vivo de fertilidade deverão ser realizados para que os resultados destas avaliações in vitro sejam comprovadas.

A partir dos resultados obtidos neste experimento, concluímos que as células espermáticas caninas descongeladas a 72ºC por 8 segundos apresentaram um maior somatório de bons resultados quanto aos testes de viabilidade espermática in vitro aqui empregados.

Conclusões

120

6. Conclusões

Conclusões

121

Baseando-se nos achados encontrados nos quatro

experimentos realizados podemos concluir que:

O processo de centrifugação não alterou a qualidade

do sêmen canino.

Os períodos de equilíbrio de 40 e 60 minutos foram

superiores quanto a qualidade espermática, quando

as avaliações foram realizadas antes da congelação

das amostras.

A glicerolização anterior ao equilíbrio, em nossas

condições, apresentou-se vantajosa frente à

glicerolização pós-equilíbrio.

O diluidor M9 foi favorável quando se realizou a

descongelação a 37ºC por 30 segundos.

A descongelação a 72ºC por 8 segundos foi, de uma

maneira geral, favorável ao sêmen canino congelado

segundo os protocolos propostos e as variáveis

testadas.

As células espermáticas congeladas em meio glicina

gema e descongeladas a 72ºC por 8 segundos

apresentaram um maior somatório de bons

resultados.

Os meios diluidores utilizados comportaram-se de

maneira diferente em dependência do protocolo de

criopreservação empregado.

Referências Bibliográficas

122

7. Referências Bibliográficas


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Anexos

135

8. Anexos

Anexos

136

ANEXO I – Descrição da Técnica Fluorescente para Verificação da Integridade de Membranas

Misturou-se 10µl da amostra de sêmen a 40µl da solução

de trabalho. A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em

microscópio de epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon- Episcopic

Fluorescence Attchment “EFA” HalogenLamp Set) e contadas 100 células

classificadas como:

∗ Células Integras- células emitindo apenas

fluorescência verde.

∗ Células Lesadas- células espermático com o núcleo

emitindo fluorescência vermelha.

• PREPARO DAS SOLUÇÕES ESTOQUE DOS CORANTES UTILIZADOS:

a- Solução Estoque de Fluoresceína:

6-carboxifluoresceína diacetato 9,2mg

DMSO 20ml

b- Solução Estoque de Iodeto de Propídio:

iodeto de propídio 10mg

solução fisiológica 20ml

Anexos

137

c- Solução de Formaldeído:

Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica.

A solução de trabalho foi sempre preparada no momento

da avaliação microscópica, e constituía- se de: .

Sol. Est. Fluoresceína 20µl

Sol. Est. Iodeto de Propídeo 10µl

Sol. Formaldeído 10µl

Citrato de Sódio 3% 0,96ml

Anexos

138

ANEXO II - Preparo dos meios diluidores

Meio à base de leite desnatado (Kenney et al., 1975): Leite desnatado (Molico) 2,4g

Glicose (PÁ) 4,9g

Bicarbonato de sódio 0,75ml

Gentamicina 20mg

H2O bidestilada q.s.p. 1000 ml

pH 6,8 - 7,2

osmolaridade 350-375 mosm

Meio à base de glicina - gema (Bicudo et al., 1993). solução A Glicose 0,6g

Frutose 0,6g

H2O bidestilada q.s.p. 40ml

solução B Citrato de sódio 1,0g

Glicina 0,47g

H2O bidestilada q.s.p. 40ml

As soluções A e B eram aquecidas separadamente até

94ºC, durante 15 minutos. Em seguida aguardava-se o resfriamento até

aproximadamente 40ºC.

Anexos

139

Solução final glicina (Meio I)

solução A 40ml

solução B 40ml

Penicilina G sódica 0,033g

Estreptomicina 100mg

OEP 0,4ml

Gema de Ovo 20ml

pH 6,95

osmolaridade 300 mosm

Meio M9 (Dell’Aqua Junior, 2000)

Para cada 300ml de meio:

Solução I – Merck Gema (Martin et al., 1979)

Fração A glicose anidra 6g

citrato de sódio 0,375g

EDTA 0,370 g

Bicarbonato de Sódio 0,120g

Penicilina G Potássica 100.000UI

Sulfato de Estreptomicina 0,1g

Água bidestilada (q.s.p.) 25 ml

Fração B Lactose 11g

Água bidestilada (q.s.p.) 50ml

Anexos

140

Fração C gema de ovo 20ml

Orvus est Paste (OEP) 0,8ml

Total A+B+C = 95ml

Prepara-se a fração A e a fração B separadamente, junta-

se as duas e acrescenta-se a gema de ovo e o OEP.

Solução II (Kenney et al., 1975)

Total - 95ml

Solução III Dulbeecco’s Modified Eagle’s Médium

(DME) (Sigma n°D-1152) 1,74g

Bicarbonato de sódio10% 2,5ml

Glicose anidra 1,8g

Água bidestilada (q.s.p.) 95ml

Mistura-se as soluções I, II e II, homogeniza-se bem e

acrescenta-se 15 ml de Glicerol a solução final.

Meio diluidor TRIS (Rota, 1997) TRIS 2,4g

Acido cítrico 1,4 g

Glicose 0,8g

Benzilpenicilina sódica 0,06g

Sulfato de estreptomicina 0,1g

Gema de ovo 20ml

Equex STM Paste 1ml

Água destilada (q.s.p.) 100ml

Anexos

141

ANEXO III - Preparo dos Diferentes Gradientes de Percoll®

Nove partes de Percoll® (Sigma) foram diluídas em uma

parte de solução NaCl 1,5N. Esta solução foi chamada de Solução de

Trabalho (ST).

Foram realizadas duas outras diluições: a primeira

contendo 45% de ST e 55% de solução de HanK´s (Hank´s H1387 +

HEPES H0763 + água destilida q.s.p.) e uma segunda, contendo 90% de

ST e 10% de solução de Hank´s.

Os tubos cônicos de centrífuga foram montados na

seguinte ordenação: ½ parte da solução de Percoll® a 90% ao fundo, ½

parte da solução de Percoll® a 45% ao meio e 1 parte de sêmen na

superfície.

Anexos

142

ANEXO IV- Preparo das soluções estoque dos corantes utilizados para a

coloração de Fitc-PNA e PI:

a- Solução Estoque de Fitc PNA:

FITC labelled (L 7381, SIGMA) 1mg

PBS 1ml

b- Solução Estoque de Iodeto de Propídio:

iodeto de propídio 10mg

solução fisiológica 20ml

c- Solução de Formaldeído:

Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica.

A solução de trabalho foi sempre preparada no momento

da avaliação microscópica, e constituía-se de:

Sol. Est. Fitc PNA 20µl

Sol. Est. Iodeto de Propídeo 10µl

Sol. Formaldeído 10µl

Citrato de Sódio 3% 0,96ml

Fotos: MICROSCÓPIO AXIOSKOP da Carl Zeiss - para

campo claro, contraste de fase e epi-fluorescência, com campo visual de

20 mm. Conjunto de filtros de fluorescência 09 para excitação azul 450-

490 nm e conjunto de filtros 15 para excitação verde H 546. Equipamento

de microfotografia MC 80 para filmes de 35 mm.

Resumo

143

9. Resumo

Resumo

144

Criopreservação do sêmen de cães

Para verificar o efeito de algumas etapas do processo de criopreservação

sobre a qualidade do sêmen canino foram realizados quatro

experimentos: Experimento I - com objetivo de testar os efeitos do

processo de centrifugação no sêmen canino e comparar a pré-diluição do

sêmen em meio à base de leite desnatado e glicose, Percoll ou plasma

seminal autólogo na realização deste procedimento. Foram utilizados 10

ejaculados caninos, que, após análise inicial, foram divididos em quatro

amostras e centrifugados durante 15 minutos a 800g, sendo: G1- sêmen

não foi centrifugado, G2: centrifugado em plasma seminal autologo; G3:

centrifugado diluido em meio à base de leite desnatado e glicose (LG);

G4: centrifugado sobre diferentes gradientes de Percoll®. Após a

centrifugação e ressuspensão dos grupos em meio LG, foram avaliados a

motilidade, vigor e aglutinação espermática através de microscopia de

contraste de fase, e a integridade das membranas espermáticas sob

microscopia de epifluorescência. O processo de centrifugação não causou

danos aos espermatozóides caninos. Os grupos foram então mantidos em

banho-maria a 37ºC por 30 minutos e novamente avaliada a motilidade,

vigor e aglutinação espermática; o grupo centrifugado em meio à base de

leite desnatado e glicose mostrou-se o mais viável após este

procedimento. Experimento II: com o objetivo de testar um período de

equilíbrio ideal para dois diluidores do sêmen canino e de verificar os

efeitos da adição do glicerol a temperatura ambiente ou a 5ºC foram

coletados 30 ejaculados de 3 cães, e, após análise e processamento

inicial, um dos “pellets” foi tratado com o diluidor TRIS (TRIS, glicose,

ac.cítrico) com 3% de glicerol e o outro em um diluidor GG (glicina –

gema). A metade do volume estendido em TRIS com 3% de glicerol foi

acrescida de TRIS com 7% de glicerol e envasado em 4 palhetas de

0,5ml. A outra metade do volume estendido em TRIS com 3% de glicerol

e mantida em um tubo plástico. A metade do volume estendida em GG foi

Resumo

145

acrescida do mesmo diluidor glicerolizado de modo a ficar com 5% de

glicerol em concentração final e envasado em 4 palhetas de 0,5ml. A

outra metade do volume estendido em GG foi mantida em um tubo

plástico. Amostras de cada grupo foram avaliadas quanto motilidade e

vigor espermático através de microscopia de contraste de fase e levadas

ao refrigerador a 5°C. Foram testados períodos de equilíbrio de 40, 60 ou

90 minutos. Foi utilizado um ejaculado diferente de um mesmo cão para o

testar cada tempo de equilíbrio. Após o equilíbrio, o grupo não

glicerolizado ou o que não foi completamente glicerolizado antes do

equilíbrio foram tratados segundo a mesma metodologia descrita para os

grupos já glicerolizados. As amostras foram avaliadas quanto a motilidade

e o vigor espermático e a integridade das membranas. Concluimos que o

equilíbrio 90 minutos proporcionou os piores resultados, quando as

avaliações foram realizadas antes da congelação das amostras e, que a

glicerolização anterior ao equilíbrio, em nossas condições, apresentou-se

vantajosa frente a glicerolização pós-equilíbrio. Experimento III: com

objetivo de verificar os efeitos de dois diferentes períodos de equilíbrio

com uma mesma curva de resfriamento e três diferentes diluidores na

congelação do sêmen canino descongelado a 37ºC por 30 segundos

foram coletados dez ejaculados de cinco cães, sendo estes,

seqüencialmente, processados sob seis diferentes protocolos. Uma

amostra de cada grupo foi levada ao banho Maria 37ºC por 10 minutos

imediatamente após o período de equilíbrio (PE) e avaliada quanto a

motilidade e vigor espermáticos. Após o PE as palhetas foram congeladas

horizontalmente, 4cm acima do nitrogênio líquido, em caixa de isopor.

Palhetas de cada grupo foram descongeladas a 37ºC por 30 segundos e

avaliadas quanto a motilidade e vigor espermáticos, integridade das

membranas espermáticas. Foi realizado teste de longevidade espermática

mantendo as amostras em banho Maria a 37ºC, por 60 minutos e após

verificada a motilidade e vigor espermáticos, integridade das membranas

espermáticas. Após avaliação estatística dos dados observou-se que os

Resumo

146

diferentes períodos de equilíbrio não influenciaram os dados avaliados.

Os grupos congelados com M9 apresentaram maior porcentagem de

membranas integras pós-descongelação e pós-teste de longevidade.

Experimento IV: Com objetivo avaliar o efeito de dois diferentes

protocolos de descongelação do sêmen canino congelado com três

diferentes diluidores foram coletados e processados ejaculados de nove

cães e processados sob três diferentes protocolos. Uma amostra de cada

grupo foi levada ao banho Maria 37ºC por 10 minutos imediatamente após

o período de equilíbrio e avaliada quanto à motilidade e vigor

espermáticos. Após o PE as palhetas foram congeladas horizontalmente,

4cm acima do nitrogênio líquido, em caixa de isopor. Duas palhetas

processados sob cada um dos três protocolos foram descongeladas,

sendo uma a 37ºC, por 60 minutos e outra a 72ºC por 8 segundos

formando 6 grupos. Neste momento foram avaliados a motilidade e o

vigor espermático, a avaliada a qualidade do movimento espermático

através de avaliação computadorizada, a integridade das membranas

espermáticas e a verificação do estado acrossomal através de teste

fluorescente com as sondas FDA e PI, e Fitc-PNA e PI. A longevidade

espermática foi verificada mantendo-se amostras dos grupos em banho

Maria a 37ºC e após verificada a motilidade e vigor espermáticos,

integridade das membranas espermáticas. Concluímos que a

descongelação a 72ºC foi favorável e que células espermáticas

congeladas em meio glicina gema e descongeladas a 72ºC apresentaram

um maior somatório de bons resultados quanto aos testes de viabilidade

espermática in vitro aqui empregados.

Abstract

147

10. Abstract

Abstract

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Canine semen cryopreservation

To evaluate several steps of dog semen criopreservation we held four different studies. Study 1: The aim of this was evaluate a canine semen centrifugation and to compare utilization of milk plus glucose extender (MG), Percoll or autologous seminal fluid during the centrifugation. Ten adult male dogs were used in this study. After an initial evaluation, each canine ejaculate was divided in four samples, each one sample centrifuged for 15 minutes 800g. The four groups were: G1- not centrifuged, G2- centrifuged without extender, G3- centrifuged in MG extender 1:1 and G4- centrifuged in two different Percoll gradient concentration. After centrifugation, all groups were diluted in MG. At this time, all groups were evaluated for motility and agglutination by phase-contrast microscopy. The samples were also evaluated for spermatic membrane integrity by fluorescence microscopy. The centrifugation procedures did not induce damage to canine spermatozoa. After centrifugation, all samples were kept in 37ºC water for 30 minutes and reevaluated for motility and agglutination using same methods. G2 group was more viable them the three other groups evaluated in this research. Study 2: In this study we evaluate different equilibration periods and the best moment for glycerol addition in two extenders used in different protocols to freeze canine semen. Three ejaculates from each of ten dogs were collected, analyzed, divided in two equal parts, and centrifuged. One pellet was suspended in 2.14 ml glycine-egg yolk extender (GG) without glycerol, half of this semen sample (1.07 ml) was mixed with 0.93ml of GG containing 12.8% glycerol. The identical procedure was used in the other half of semen sample (1.07 ml) after equilibration period. The other pellet was suspended in 2 ml TRIS-glucose-citric acid extender (TRIS) containing 3% glycerol; half of this semen sample (1 ml) was mixed with 1ml of TRIS containing 7% glycerol. The identical procedure was used in the other half of semen sample (1 ml) after equilibration period. Semen samples treated differently were held at 5°C to equilibrate for 40, 60 or 90

Abstract

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minutes. For all samples, progressive motility and vigour of movement were evaluated subjectively before and after equilibration period and plasmatic membrane integrity was evaluated after equilibration period using fluorescent dyes. The conclusion was that, for tested extenders and without freeze-thaw step, the 90 minutes period of equilibration was inferior to freeze dog semen. Study 3: Ten dogs ejaculate were taken. Each ejaculate was divided and mixed in three different extenders and processed under six protocols. After that, one sample of each group was warmed in 37ºC water bath during 10 min. At this time, the spermatic motility, vigour and plasma membrane integrity were evaluated (M1). The samples were frozen in a Styrofoam box 4 cm above liquid nitrogen. The straws were thawed at 37ºC for 30 sec and the spermatic motility; vigour and plasmatic membrane integrity were evaluated (M2). Plasmatic membrane, spermatic motility and vigour were evaluated after 1-hour incubation at 37ºC (M3). Statistics data showed that different equilibrations time did not have effect on froze-thawed canine semen. The best plasmatic membrane integrity was obtained after thawing canine semen with M9 extender. Study 4: Nine dogs ejaculate were taken. Each ejaculate was divided and mixed in three different extenders. A sample under each protocol was analyzed (M1) and held at 5°C to equilibrate for 60 minutes. After that, samples of each protocol were warmed in 37ºC water bath during 10 min and analyzed (M2) to spermatic motility, vigour and plasma membrane integrity. The samples were frozen in a Styrofoam box 4 cm above liquid nitrogen. A straw under each protocol were thawed at 37ºC for 30 sec and another at 72ºC for 8 sec and the spermatic motility; vigour and plasmatic membrane integrity were evaluated (M3). At this time, acrossomal status was verified using Fitc-PNA stain. Plasmatic membrane, spermatic motility and vigour were evaluated after 1-hour incubation at 37ºC (M4). Statistics data showed that different higher temperature have positive effect on froze-thawed canine semen. The best results were taken when canine semen was frozen in GG diluent and thawed 72ºC for 8 sec.

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