Criopreservação de Oócitos e

Embriões

5ª Aula:

Priscila Marques Moura de LeonDoutoranda PPGB, Médica Veterinária

Outubro, 2011

Universidade Federal de Pelotas

Graduação em Biotecnologias

Manipulação de Gametas e Embriões

Criopreservação• Conceito:

Criopreservação é um processo onde células ou tecidos biológicos sãopreservados através do congelamento a temperaturas muito baixas,geralmente −196 °C.

• Objetivo:

suspensão do metabolismo e a manutenção das característicasbiológicas por um longo período de tempo, mantendo a viabilidade

celular;

� Este processo requer a adição de substâncias que protegem as células

durante o congelamento e descongelamento, os Criprotetores;

* A Criobiologia estuda os efeitos de baixas temperaturas em células,tecidos e organismos vivos.

Criopreservação• Histórico:

– Polge et al., 1949: congelamento de sêmen utilizando glicerol;

– Audrey Smith, 1952: estudo da exposição de oócitos mamíferos a baixas

temperaturas;

– Whittingham et al., 1972: realizaram os primeiros estudos mostrando que o

congelamento lento de embriões de camundongo nas fases iniciais de clivagem, na

presença de dimetil-sulfóxido (DMSO), seguido de um processo lento de

descongelamento, não afetava a sobrevida dos embriões e seu futuro

desenvolvimento.

– Whittingham, 1977: descrição de alterações estruturais de membrana durante o

congelamento;

– Trounson & Mohr, 1983: gestação após criopreservação de embriões humanos.

– Chen, 1986: gestação proveniente de oócito humano criopreservado;

– Vajta et al., 1998: criopreservação ultra-rápida (vitrificação) de oócitos bovinos;

Aplicações da Criopreservação

de Oócitos e Embriões

• Armazenamento de material genético – Biobancos

• Comercialização Nacional e Internacional de Oócitos e Embriões

• Auxilia Programas de Melhoramento Genético Animal

• Aplicação na Produção in vitro de Embriões

• Aplicação em Programas de Transferência de Embriões

• Coadjuvantes no Tratamento da Infertilidade

• Preservar espécies em extinção

* Medicina → Infer�lidade e Reprodução

* Veterinária → Melhoramento Gené�co e Reprodução

• Armazenamento de material genético – Biobancos

• Comercialização Nacional e Internacional de Oócitos e Embriões

• Auxilia Programas de Melhoramento Genético Animal

• Aplicação na Produção in vitro de Embriões

• Aplicação em Programas de Transferência de Embriões

• Coadjuvantes no Tratamento da Infertilidade

• Preservar espécies em extinção

* Medicina → Infer�lidade e Reprodução

* Veterinária → Melhoramento Gené�co e Reprodução

• Resfriamento: é um método simples, onde se mantém os embriões a temperatura entre 0 e 4°C durante 24 a 72 horas antes da transferência:– Utilizado em alevinos a fim de transporte e comercialização;

– Utilizado em embriões bovinos para transporte e transferência;

• Congelamento: método de conservação a -196°C durante um período indeterminado. Técnicas são classificação de acordo com a taxa de resfriamento:– Congelamento lento: taxa de resfriamento entre 0,5 – 1,6°C/min

– Congelamento Rápido: taxa de resfriamento entre 17 – 30°C/min

– Congelamento Ultra-rápido: Vitrificação (mais utilizado atualmente)

• Resfriamento: é um método simples, onde se mantém os embriões a temperatura entre 0 e 4°C durante 24 a 72 horas antes da transferência:– Utilizado em alevinos a fim de transporte e comercialização;

– Utilizado em embriões bovinos para transporte e transferência;

• Congelamento: método de conservação a -196°C durante um período indeterminado. Técnicas são classificação de acordo com a taxa de resfriamento:– Congelamento lento: taxa de resfriamento entre 0,5 – 1,6°C/min

– Congelamento Rápido: taxa de resfriamento entre 17 – 30°C/min

– Congelamento Ultra-rápido: Vitrificação (mais utilizado atualmente)

Métodos de Criopreservação

• Exemplos de Protocolos de Criopreservação:

• Congelamento Lento: a velocidade de congelamento é de 0.3°C porminuto do "seeding" até aproximadamente -80°C, antes demergulhar o material em nitrogênio líquido. A duração docongelamento variará de 3,5 a 4 horas. O descongelamento é feitona velocidade de 10°C por minuto.

• Congelamento Rápido: a velocidade de congelamento é de 0.3°Cdo "seeding" até -30°C. A duração do congelamento situa-se entre 2a 2,5 horas. O descongelamento é feito na velocidade de 30°C porminuto. O equipamento usado nestes procedimentos é um"freezing" programável.

• Congelamento Ultra-rápido e Vitrificação: a velocidade decongelamento será de 2500°C por minuto. A duração docongelamento ficará entre 2 a 3 minutos, e a velocidade dedescongelamento > 300°C por minuto.

* Para manter a viabilidade celular após longo período de estocagem embaixas temperaturas, as células vivas são submetidas a um estado de

redução do metabolismo, permanecendo por um período de tempoindefinido, e após são resgatadas com viabilidade.

* Para manter a viabilidade celular após longo período de estocagem embaixas temperaturas, as células vivas são submetidas a um estado de

redução do metabolismo, permanecendo por um período de tempoindefinido, e após são resgatadas com viabilidade.

Princípios da Criobiologia

• Fatores essenciais para a sobrevivência celular:

� tipo e concentração dos agentes crioprotetores (desidratação celular,

baixam ponto de congelamento e estabilidade de membrana);

� taxa de resfriamento da temperatura durante o congelamento;

� manutenção da temperatura de estocagem;

� procedimento de descongelamento;

� remoção de crioprotetores após descongelamento;

• Fatores essenciais para a sobrevivência celular:

� tipo e concentração dos agentes crioprotetores (desidratação celular,

baixam ponto de congelamento e estabilidade de membrana);

� taxa de resfriamento da temperatura durante o congelamento;

� manutenção da temperatura de estocagem;

� procedimento de descongelamento;

� remoção de crioprotetores após descongelamento;

Agentes Crioprotetores

* Agentes crioprotetores são solventes orgânicos utilizados nas soluções crioprotetoras e são compostos muito hidrófilos;

• Propriedades:

– alta solubilidade em soluções salinas aquosas

– baixo peso molecular para rápida e completa penetração na célula

– baixa toxicidade

– alta estabilidade em temperaturas reduzidas

• Estão divididos em:

1) Penetrantes ou Intracelulares: crioprotetores de baixo peso molecular, como: dimetilsulfóxido (DMSO), propanodiol, etilenoglicol, glicerol, metanol e butanodiol;

2) Não-penetrantes ou Extracelulares: crioprotetores de maior peso molecular, como: galactose, glicose, sacarose e trealose, polivinilpirrolidona(PVP), álcool polivinílico (PVA) e albumina sérica bovina (BSA)

Agentes Crioprotetores Intracelulares

• Mecanismo de ação:

� Interagem com as modificações da membrana que ocorrem durante oprocesso de criopreservação, penetram na membrana celular eestabilizam proteínas intracelulares, evitando o rompimento damembrana celular durante o congelamento;

� baixam o ponto de congelamento da solução, situação em que as célulassofrem formação letal de gelo intracelular;

� aliviam o efeito das altas concentrações de solutos (eletrólitos), intra eextracelular;

� atuam como um tampão hiperosmótico, diminuindo os efeitos de altasconcentrações de moléculas nas células desidratadas;

• Mecanismo de ação:

� Interagem com as modificações da membrana que ocorrem durante oprocesso de criopreservação, penetram na membrana celular eestabilizam proteínas intracelulares, evitando o rompimento damembrana celular durante o congelamento;

� baixam o ponto de congelamento da solução, situação em que as célulassofrem formação letal de gelo intracelular;

� aliviam o efeito das altas concentrações de solutos (eletrólitos), intra eextracelular;

� atuam como um tampão hiperosmótico, diminuindo os efeitos de altasconcentrações de moléculas nas células desidratadas;

Agentes Crioprotetores Intracelulares

• O Etilenoglicol (EG) tem sido utilizado em diversos protocolos para acriopreservação de oócitos e embriões em várias espécies, devido ao seubaixo peso molecular quando comparado a outros crioprotetores.Proporciona rápida entrada e saída na célula durante o período deequilíbrio e rehidratação.

* O EG possui a vantagem de ser menos tóxico do que outros crioprotetores.

• DMSO → composto orgânico que possui uma elevada capacidadehigroscópica decorrente de sua afinidade pelo hidrogênio.

* O DMSO vem sendo utilizado com sucesso na criopreservação de oócitos e

embriões. A formação de gelo intracelular ocorre entre -40°C e -50°C;

→ A adição de 20% de Soro Fetal Bovino (SFB) ao meio de criopreservação

de oócitos e embriões previne e minimiza os efeitos tóxicos dos

crioprotetores.

• O Etilenoglicol (EG) tem sido utilizado em diversos protocolos para acriopreservação de oócitos e embriões em várias espécies, devido ao seubaixo peso molecular quando comparado a outros crioprotetores.Proporciona rápida entrada e saída na célula durante o período deequilíbrio e rehidratação.

* O EG possui a vantagem de ser menos tóxico do que outros crioprotetores.

• DMSO → composto orgânico que possui uma elevada capacidadehigroscópica decorrente de sua afinidade pelo hidrogênio.

* O DMSO vem sendo utilizado com sucesso na criopreservação de oócitos e

embriões. A formação de gelo intracelular ocorre entre -40°C e -50°C;

→ A adição de 20% de Soro Fetal Bovino (SFB) ao meio de criopreservação

de oócitos e embriões previne e minimiza os efeitos tóxicos dos

crioprotetores.

Agentes Crioprotetores Extracelulares

• Mecanismo de ação:

• atuam por meio de mecanismo osmótico, promovendo adesidratação celular e impedindo a formação de cristais de gelo nointerior da célula

• Bloqueiam a formação de cristais de gelo

• Exemplos:

� Sacarose

� Copolímero X-1000

� Copolímero Z-1000

* Sacarose atua como um tampão osmótico, mantém constante a concentraçãodo meio extracelular, regula a velocidade de entrada da água e saída docrioprotetor, evitando o choque osmótico.

• Mecanismo de ação:

• atuam por meio de mecanismo osmótico, promovendo adesidratação celular e impedindo a formação de cristais de gelo nointerior da célula

• Bloqueiam a formação de cristais de gelo

• Exemplos:

� Sacarose

� Copolímero X-1000

� Copolímero Z-1000

* Sacarose atua como um tampão osmótico, mantém constante a concentraçãodo meio extracelular, regula a velocidade de entrada da água e saída docrioprotetor, evitando o choque osmótico.

SUPERCOOL X-1000 ICE BLOCKER

* Citocalasina-B (micotoxina que se liga às proteínas) é utilizada para estabilizarcomponentes do citoesqueleto, tornando-os mais flexíveis e menos susceptíveis àcrioinjúrias, torna também a membrana plasmática menos rígida e mais elástica .

Soluções Crioprotetoras� O sucesso da criopreservação da célula depende da

velocidade do congelamento e da composição da solução crioprotetora;

� Quanto mais rápido for o congelamento mais concentrada são as soluções Crioprotetoras;

� Protocolos utilizam 1, 2 ou 3 soluções em concentração

crescente de crioprotetores;

• Exemplo de composição:

� Etilenoglicol

� DMSO

� Sacarose

� Soro Fetal Bovino

� PBS ou TCM-199

Vitrificação• Conceito:

• A vitrificação é uma técnica de criopreservação que envolve rápidas

taxas de resfriamento e aquecimento em presença de concentrações

muito altas de crioprotetores, prevenindo assim a formação de cristaisde gelo, e diminuindo as crioinjúrias causadas a célula;

• Este método é aplicado à Oócitos e Embriões;

• Apesar da breve exposição dos oócitos as soluções de vitrificação, asaltas concentrações de crioprotetores podem causar danos às célulasdevido a sua toxicidade química;

• Protocolo é baseado na breve exposição à soluções com altaconcentração de crioprotetor (aumentadas em 40% na relaçãopeso/volume) seguida da imersão direta em nitrogênio líquido.

• Conceito:

• A vitrificação é uma técnica de criopreservação que envolve rápidas

taxas de resfriamento e aquecimento em presença de concentrações

muito altas de crioprotetores, prevenindo assim a formação de cristaisde gelo, e diminuindo as crioinjúrias causadas a célula;

• Este método é aplicado à Oócitos e Embriões;

• Apesar da breve exposição dos oócitos as soluções de vitrificação, asaltas concentrações de crioprotetores podem causar danos às célulasdevido a sua toxicidade química;

• Protocolo é baseado na breve exposição à soluções com altaconcentração de crioprotetor (aumentadas em 40% na relaçãopeso/volume) seguida da imersão direta em nitrogênio líquido.

Vitrificação• Trounson & Sjöblom, 1988: descreveram a obtenção de gestações após

a transferência de embriões humanos criopreservados em altasconcentrações de DMSO (3.5M) e sucrose (0.25M), por 2 a 3 minutos,com subseqüente conservação em nitrogênio líquido. Odescongelamento foi rápido na temperatura de 37°C.

* A alta velocidade de resfriamento/aquecimento resulta em uma rápidapassagem através da temperatura perigosa (redor de 0°C), minimizando ascrioinjúrias;

• Vantagens da Vitrificação:

� não requer o uso da aparelhagem de congelamento;

� alta velocidade na execução;

� metodologia é simples e barata;

� tem sido relatada melhores taxas de sobrevivência, principalmentepara a criopreservação de oócitos e embriões em estágios iniciais dedesenvolvimento;

• Trounson & Sjöblom, 1988: descreveram a obtenção de gestações apósa transferência de embriões humanos criopreservados em altasconcentrações de DMSO (3.5M) e sucrose (0.25M), por 2 a 3 minutos,com subseqüente conservação em nitrogênio líquido. Odescongelamento foi rápido na temperatura de 37°C.

* A alta velocidade de resfriamento/aquecimento resulta em uma rápidapassagem através da temperatura perigosa (redor de 0°C), minimizando ascrioinjúrias;

• Vantagens da Vitrificação:

� não requer o uso da aparelhagem de congelamento;

� alta velocidade na execução;

� metodologia é simples e barata;

� tem sido relatada melhores taxas de sobrevivência, principalmentepara a criopreservação de oócitos e embriões em estágios iniciais dedesenvolvimento;

• Congelador programável – Bio-Cool

• Geladeira: meios, soluções e hormônios

• Botijão de nitrogênio líquido

• Microscópio e Estereomicorcópio

• Capela de fluxo laminar

• Micropipetas e ponteiras

• Palhetas e seladores

• Placas de cultivo

Equipamentos para a Criopreservação

Bio-Cool Controlled Rate Freezer

DB1 Embryofreeze - The UltimateEmbryo Freezer

Botijão de Nitrogênio Líquido

Palhetas para envase de oócitos e embriões

Kit Vitrificação de Embriões Bovinos

Kit Vitrificação de Oócitos e EmbriõesVitrificação de Embriões Equinos

Kit Vitrificação de Embriões Equinos

Laboratório de Criopreservação de Oócitos e Embriões

Etapas da Criopreservação

• O processo de criopreservação envolve as seguintes etapas:

1) Adição de Agentes Crioprotetores;

2) Resfriamento, indução da formação de gelo e Congelamento;

3) Estocagem em Nitrogênio Líquido (-196°C);

4) Descongelamento;

5) Remoção das Soluções Crioprotetoras;

• O processo de criopreservação envolve as seguintes etapas:

1) Adição de Agentes Crioprotetores;

2) Resfriamento, indução da formação de gelo e Congelamento;

3) Estocagem em Nitrogênio Líquido (-196°C);

4) Descongelamento;

5) Remoção das Soluções Crioprotetoras;

Etapas da Criopreservação

1) Adição de Agentes Crioprotetores:

• O período de exposição aos agentes crioprotetores é uma etapaextremamente importante no processo de criopreservação, pois permiteque a célula entre em equilíbrio em relação as concentrações extra eintracelulares;

• O tempo de exposição deve ser suficiente para causar a desidratação esem provocar toxicidade celular;

1) Adição de Agentes Crioprotetores:

• O período de exposição aos agentes crioprotetores é uma etapaextremamente importante no processo de criopreservação, pois permiteque a célula entre em equilíbrio em relação as concentrações extra eintracelulares;

• O tempo de exposição deve ser suficiente para causar a desidratação esem provocar toxicidade celular;

Etapas da Criopreservação

2) Resfriamento e indução da formação de gelo e congelamento:

• Durante o resfriamento, à medida que a temperatura decresce da fisiológica 37 -39°C para 0 °C, a célula atinge um estado de super-resfriamento, ocorrendo a formação de gelo no meio extracelular.

• No congelamento lento: a célula super-resfriada perde água devido a pressão de vapor da água na célula exceder àquela do exterior celular congelado. Com a progressiva redução da temperatura, a água se difunde do interior das células para a solução extracelular e é convertida em gelo na superfície das células. A célula pode sofrer choque osmótico.

* Quando o potencial hídrico das células parcialmente desidratadas iguala-se àquele do gelo extracelular, um equilíbrio é estabelecido e uma desidratação adicional não ocorrerá.

• No congelamento rápido: a desidratação por congelamento não ocorre, as células se tornam cada vez mais super-resfriadas e a solução intracelular congela-se, formando cristais de gelo intracelulares;

* Seeding: indução da formação extracelular de gelo, evitando o super-resfriamento. Utilizado no congelamento lento, com objeto de metal a -196°C;

2) Resfriamento e indução da formação de gelo e congelamento:

• Durante o resfriamento, à medida que a temperatura decresce da fisiológica 37 -39°C para 0 °C, a célula atinge um estado de super-resfriamento, ocorrendo a formação de gelo no meio extracelular.

• No congelamento lento: a célula super-resfriada perde água devido a pressão de vapor da água na célula exceder àquela do exterior celular congelado. Com a progressiva redução da temperatura, a água se difunde do interior das células para a solução extracelular e é convertida em gelo na superfície das células. A célula pode sofrer choque osmótico.

* Quando o potencial hídrico das células parcialmente desidratadas iguala-se àquele do gelo extracelular, um equilíbrio é estabelecido e uma desidratação adicional não ocorrerá.

• No congelamento rápido: a desidratação por congelamento não ocorre, as células se tornam cada vez mais super-resfriadas e a solução intracelular congela-se, formando cristais de gelo intracelulares;

* Seeding: indução da formação extracelular de gelo, evitando o super-resfriamento. Utilizado no congelamento lento, com objeto de metal a -196°C;

* A desidratação celular continua durante o processo de resfriamento até ocongelamento na temperatura de – 30 °C.* A desidratação celular continua durante o processo de resfriamento até ocongelamento na temperatura de – 30 °C.

Etapas da Criopreservação

3) Estocagem em nitrogênio líquido:

• Terminado o processo de congelamento o material biológico será armazenado em nitrogênio líquido (-196 °C)

• Nesta etapa não são observados efeitos deletérios se mantida a temperatura constante.

4) Descongelamento:

• A taxa de aquecimento utilizada para o descongelamento é um ponto crítico do processo de criopreservação, pois pode a recristalização com formação de gelo intracelular, reduzindo a viabilidade celular;

• O descongelamento deve ocorrer o mais rápido possível (275°C/min), em banho-maria a 37°C ;

• O gelo extracelular derrete e penetra na membrana celular reidratando a célula;

3) Estocagem em nitrogênio líquido:

• Terminado o processo de congelamento o material biológico será armazenado em nitrogênio líquido (-196 °C)

• Nesta etapa não são observados efeitos deletérios se mantida a temperatura constante.

4) Descongelamento:

• A taxa de aquecimento utilizada para o descongelamento é um ponto crítico do processo de criopreservação, pois pode a recristalização com formação de gelo intracelular, reduzindo a viabilidade celular;

• O descongelamento deve ocorrer o mais rápido possível (275°C/min), em banho-maria a 37°C ;

• O gelo extracelular derrete e penetra na membrana celular reidratando a célula;

Etapas da Criopreservação

5) Remoção das soluções crioprotetoras:

• Os crioprotetores são removidos através de sucessivas lavagensapós o descongelamento;

• A solução crioprotetora deve ser removida devido a toxicidadecelular dos agentes crioprotetores a temperatura ambiente;

• Deve ser evitado o descongelamento em meio com baixaconcentração de cioprotetor ou na sua ausência, pois irá causarrompimento celular devido a entrada brusca de água no interiorda célula;

5) Remoção das soluções crioprotetoras:

• Os crioprotetores são removidos através de sucessivas lavagensapós o descongelamento;

• A solução crioprotetora deve ser removida devido a toxicidadecelular dos agentes crioprotetores a temperatura ambiente;

• Deve ser evitado o descongelamento em meio com baixaconcentração de cioprotetor ou na sua ausência, pois irá causarrompimento celular devido a entrada brusca de água no interiorda célula;

Água extracelular congela, no momento em que a célula se aproxima do ponto de congelamento, removendo o líquido extracelular.

A formação de cristais de gelo extracelular acarreta um aumento de osmolaridade

Com o desiquilíbrio osmótico, a água é retirada da célula para o compartimento extracelular, ocasionando uma diminuição do volume celular por desidratação.

Uma adequada desidratação celular depende da velocidade do congelamento de forma a não provocar uma lise da célula.

Avaliação da Criopreservação

• Para a avaliação da eficiência dos protocolos de congelação, diferentes técnicas podem ser empregadas isoladamente ou em associação:

� Morfologia;

� Microscopia eletrônica e análise ultra estrutural;

� Viabilidade e Desenvolvimento no Cultivo in vitro;

� Coloração para Viabilidade de Membrana (Live/Dead; Iodeto de Propídeo, Diacetato de Fluoresceína e Hoescht 33342)

� Teste de TUNEL (detecção de apoptose)

� ROS (Espécies Reativas de Oxigênio)

• Para a avaliação da eficiência dos protocolos de congelação, diferentes técnicas podem ser empregadas isoladamente ou em associação:

� Morfologia;

� Microscopia eletrônica e análise ultra estrutural;

� Viabilidade e Desenvolvimento no Cultivo in vitro;

� Coloração para Viabilidade de Membrana (Live/Dead; Iodeto de Propídeo, Diacetato de Fluoresceína e Hoescht 33342)

� Teste de TUNEL (detecção de apoptose)

� ROS (Espécies Reativas de Oxigênio)

Avaliação Morfológica:

Avaliação da Criopreservação

• A técnica de TUNEL:

– terminal deoxynucleotidil tranferase-mediated deoxyuridinetriphosphate biotin nick end-labeling

– Esta técnica é utilizada para avaliar a fragmentação do DNA e detecção do grau de apoptose

– Técnica emprega uma enzima (transferase deoxynucleotidil

terminal) para adicionar nucleotídeos aos fragmentos das fitas de DNA quebradas nas células apoptóticas.

• A técnica de TUNEL:

– terminal deoxynucleotidil tranferase-mediated deoxyuridinetriphosphate biotin nick end-labeling

– Esta técnica é utilizada para avaliar a fragmentação do DNA e detecção do grau de apoptose

– Técnica emprega uma enzima (transferase deoxynucleotidil

terminal) para adicionar nucleotídeos aos fragmentos das fitas de DNA quebradas nas células apoptóticas.

Teste de TUNEL:

Reactive Oxygen Species (ROS):

Viabilidade Celular:

* Determina presença de lesões de membrana

Métodos de Vitrificação

• As técnicas de congelamento de embriões diferem pelas

seguintes variações:

1. tipo e concentração dos crioprotetores utilizados;

2. velocidades de congelamento;

3. tempo de exposição a solução crioprotetora;

4. tipo de envase ou suporte físico;

5. velocidade de descongelamento.

• As técnicas de congelamento de embriões diferem pelas

seguintes variações:

1. tipo e concentração dos crioprotetores utilizados;

2. velocidades de congelamento;

3. tempo de exposição a solução crioprotetora;

4. tipo de envase ou suporte físico;

5. velocidade de descongelamento.

Métodos de Vitrificação

• Técnica Convencional em palhetas de 0,25mL:

• Esse método de vitrificação utiliza palhetas francesas de 0,25ml. O padrão máximo de congelamento/aquecimento é 2000°C/min;

* 67% de re-expansão e 53% de eclosão em embriões bovinos;

• Método de OPS:

• Vajta et al., 1997: chamada de Open Pulled Straw foi desenvolvida para embriões bovinos e suínos;

• Nesta técnica as palhetas de 0,25ml são esticadas e cortadas ao meio, produzindo duas OPS.

• Atualmente: 2-3 µL contendo os oócitos (2 a 4) ou embriões (1 a2);

• Neste método a taxa de resfriamento é de 20.000°C/min;

• O aquecimento é realizado pela colocação da ponta aberta diretamente na placa contendo o meio aquecido (1 a 2 seg.);

* São descritas taxas de 25% de produção de blastocistos a partir de oócitos

vitrificados, e 70% e 94% de embriões bovinos viáveis nos dias 6 e 7,

• Técnica Convencional em palhetas de 0,25mL:

• Esse método de vitrificação utiliza palhetas francesas de 0,25ml. O padrão máximo de congelamento/aquecimento é 2000°C/min;

* 67% de re-expansão e 53% de eclosão em embriões bovinos;

• Método de OPS:

• Vajta et al., 1997: chamada de Open Pulled Straw foi desenvolvida para embriões bovinos e suínos;

• Nesta técnica as palhetas de 0,25ml são esticadas e cortadas ao meio, produzindo duas OPS.

• Atualmente: 2-3 µL contendo os oócitos (2 a 4) ou embriões (1 a2);

• Neste método a taxa de resfriamento é de 20.000°C/min;

• O aquecimento é realizado pela colocação da ponta aberta diretamente na placa contendo o meio aquecido (1 a 2 seg.);

* São descritas taxas de 25% de produção de blastocistos a partir de oócitos

vitrificados, e 70% e 94% de embriões bovinos viáveis nos dias 6 e 7,

OPS:

Métodos de Vitrificação

• Cryoloop:• este método consistiu em usar como suporte físico para congelar os embriões

mamíferos, um pequeno laço de náilon de aproximadamente 20 µm de largura e 0,05 – 0,07 mm de diâmetro, permitindo a adição de um volume de aproximadamente 1 a 2 µL de solução crioprotetora.

• A descongelação foi realizada colocando-se o “Cryoloop” na placa de petri em contato com a solução de desvitrificação e reidratação previamente aquecida.

• Técnica de vitrificação em grades de microscopia eletrônica de

transmissão:• Consistiu na utilização de grades de microscopia eletrônica de transmissão como

suporte físico para os embriões ou oócitos, mantendo as estruturas em um pequeno volume de solução crioprotetora. As grades foram mergulhadas diretamente em nitrogênio líquido, atingindo taxas de resfriamento superiores a 20.000°C por minuto.

• A desvitrificação e a reidratação dos embriões foram feitas em cinco etapas. As grades saiam diretamente do nitrogênio líquido para uma placa de petricontendo meio de cultivo com 0,5 M de sacarose, a uma temperatura de 37°C.

• Cryoloop:• este método consistiu em usar como suporte físico para congelar os embriões

mamíferos, um pequeno laço de náilon de aproximadamente 20 µm de largura e 0,05 – 0,07 mm de diâmetro, permitindo a adição de um volume de aproximadamente 1 a 2 µL de solução crioprotetora.

• A descongelação foi realizada colocando-se o “Cryoloop” na placa de petri em contato com a solução de desvitrificação e reidratação previamente aquecida.

• Técnica de vitrificação em grades de microscopia eletrônica de

transmissão:• Consistiu na utilização de grades de microscopia eletrônica de transmissão como

suporte físico para os embriões ou oócitos, mantendo as estruturas em um pequeno volume de solução crioprotetora. As grades foram mergulhadas diretamente em nitrogênio líquido, atingindo taxas de resfriamento superiores a 20.000°C por minuto.

• A desvitrificação e a reidratação dos embriões foram feitas em cinco etapas. As grades saiam diretamente do nitrogênio líquido para uma placa de petricontendo meio de cultivo com 0,5 M de sacarose, a uma temperatura de 37°C.

Métodos de Vitrificação

• Vitrificação em Superfície Sólida (SSV):• A superfície sólida serve de base para a vitrificação, formada por um cubo oco

de metal que tem sua superfície forrada por uma folha de papel alumínio. Ocubo foi colocado dentro de uma caixa de isopor contendo nitrogênio líquidopara que ficasse parcialmente submerso, para atingir temperaturas entre -150 e -180°C. Em seguida, os oócitos foram depositados juntamente com asolução de vitrificação na superfície, formando uma gota de 1 a 2 µL desolução, sendo a gota vitrificada instantaneamente;

• Para serem armazenadas por longos períodos, as gotas vitrificadas foramcolocadas em criotubos de 1 mL previamente resfriados em nitrogênio;

• A taxa de sobrevivência de embriões caprinos foi de 39%;

• Método de vitrificação em micropipetas de vidro - GMP:• teve como objetivo substituir a palheta de OPS por uma palheta que

não flutuasse em nitrogênio líquido e que tivesse os diâmetros interno eexterno menores, melhorando as taxas de condutividade de temperaturadurante o resfriamento.

• Vitrificação em Superfície Sólida (SSV):• A superfície sólida serve de base para a vitrificação, formada por um cubo oco

de metal que tem sua superfície forrada por uma folha de papel alumínio. Ocubo foi colocado dentro de uma caixa de isopor contendo nitrogênio líquidopara que ficasse parcialmente submerso, para atingir temperaturas entre -150 e -180°C. Em seguida, os oócitos foram depositados juntamente com asolução de vitrificação na superfície, formando uma gota de 1 a 2 µL desolução, sendo a gota vitrificada instantaneamente;

• Para serem armazenadas por longos períodos, as gotas vitrificadas foramcolocadas em criotubos de 1 mL previamente resfriados em nitrogênio;

• A taxa de sobrevivência de embriões caprinos foi de 39%;

• Método de vitrificação em micropipetas de vidro - GMP:• teve como objetivo substituir a palheta de OPS por uma palheta que

não flutuasse em nitrogênio líquido e que tivesse os diâmetros interno eexterno menores, melhorando as taxas de condutividade de temperaturadurante o resfriamento.

Solid Surface Vitrification

Métodos de Vitrificação

• Método de vitrificação em Microgotas:• Os oócitos e a solução de vitrificação foram depositados em uma pipeta

de Pasteur inclinada e a cerca de 15 cm do nitrogênio líquido. O conteúdo dapipeta formou uma gota de aproximadamente 6 µL, que caiu diretamente emnitrogênio líquido e foi vitrificada. Depois as gotas foram retiradas, com oauxílio de uma pinça e colocadas em criotubos previamente resfriados.

* Após a desvitrificação e cultivo, 83% dos embriões de camundongos

atingiram o estágio de blastocisto.

• Método de vitrificação em hemi-palhetas (“Hemi Straw”):• Foi desenvolvido para criopreservar blastocistos humanos produzidos in vitro. A

técnica consistiu na utilização de uma palheta de 0,25mL cortada ao meio nosentido longitudinal, como suporte físico para os embriões.

• no máximo 2 blastocistos e 0,3 µL de meio foram transferidos emergulhados em nitrogênio líquido. Após a imersão, a hemi palheta foicolocada no interior de uma palheta previamente resfriada, lacrada eretornada para o nitrogênio líquido;

• A descongelação dos embriões foi realizada em soluções contendoconcentrações decrescentes de sacarose (0,5; 0,25 e 0,125 M)

• Método de vitrificação em Microgotas:• Os oócitos e a solução de vitrificação foram depositados em uma pipeta

de Pasteur inclinada e a cerca de 15 cm do nitrogênio líquido. O conteúdo dapipeta formou uma gota de aproximadamente 6 µL, que caiu diretamente emnitrogênio líquido e foi vitrificada. Depois as gotas foram retiradas, com oauxílio de uma pinça e colocadas em criotubos previamente resfriados.

* Após a desvitrificação e cultivo, 83% dos embriões de camundongos

atingiram o estágio de blastocisto.

• Método de vitrificação em hemi-palhetas (“Hemi Straw”):• Foi desenvolvido para criopreservar blastocistos humanos produzidos in vitro. A

técnica consistiu na utilização de uma palheta de 0,25mL cortada ao meio nosentido longitudinal, como suporte físico para os embriões.

• no máximo 2 blastocistos e 0,3 µL de meio foram transferidos emergulhados em nitrogênio líquido. Após a imersão, a hemi palheta foicolocada no interior de uma palheta previamente resfriada, lacrada eretornada para o nitrogênio líquido;

• A descongelação dos embriões foi realizada em soluções contendoconcentrações decrescentes de sacarose (0,5; 0,25 e 0,125 M)

Hemi Straw:

Criopreservação de Embriões

• Técnicas de criopreservação tem sido aplicadas a embriões: humanos, bovinos, ovinos, caprinos, suínos, equinos e murinos;

• Os embriões de melhor qualidade devem ser selecionados para a criopreservação :– Embrião perfeito para o estágio considerado, blastômeros são

uniformes quanto ao tamanho e coloração, citoplasma não é granular, zona pelúcida é regular;

• Vantagens:• O embrião já contém o genoma completo, podendo ser diretamente

transferido para uma receptora;• Permite armazenar embriões excedentes da produção in vitro de

embriões;• Forma barata de exportar e importar alto padrão genético;

• Técnicas de criopreservação tem sido aplicadas a embriões: humanos, bovinos, ovinos, caprinos, suínos, equinos e murinos;

• Os embriões de melhor qualidade devem ser selecionados para a criopreservação :– Embrião perfeito para o estágio considerado, blastômeros são

uniformes quanto ao tamanho e coloração, citoplasma não é granular, zona pelúcida é regular;

• Vantagens:• O embrião já contém o genoma completo, podendo ser diretamente

transferido para uma receptora;• Permite armazenar embriões excedentes da produção in vitro de

embriões;• Forma barata de exportar e importar alto padrão genético;

Criopreservação de Embriões :

Forma de envase do embrião para congelamento.

Eldridge-Panuska et a., 2005.

• Oócitos maturos x Imaturos;

• Acredita-se que o fuso tubular do oócito maduro é sensível para as mudanças de temperatura e não disjunções de cromátides podem ocorrer durante o processo de congelamento, resultando em aneuploidias após a fertilização;

• Liberação de grânulos corticais que levariam a um endurecimento da zona pelúcida;

* Oócitos humanos criopreservados com "cumulus" possuiam maior

sobrevidade (54%) do que aqueles sem essa camada celular (27%),

sendo os níveis de fertilização de 44% versus 25%, respectivamente

para com e sem cumulus;

• Oócitos maturos x Imaturos;

• Acredita-se que o fuso tubular do oócito maduro é sensível para as mudanças de temperatura e não disjunções de cromátides podem ocorrer durante o processo de congelamento, resultando em aneuploidias após a fertilização;

• Liberação de grânulos corticais que levariam a um endurecimento da zona pelúcida;

* Oócitos humanos criopreservados com "cumulus" possuiam maior

sobrevidade (54%) do que aqueles sem essa camada celular (27%),

sendo os níveis de fertilização de 44% versus 25%, respectivamente

para com e sem cumulus;

Criopreservação de Oócitos

• Fatores Complicantes na Vitrificação:

• Complexidade Estrutural COC;

• Baixa proporção área de Superfície:Volume;

• Baixa permeabilidade da Membrana Plasmática;

• Quantidade de Lipídio do oócito (equino e suíno);

• Consequências da Vitrificação:

• Danos ao DNA;

• Ruptura do Citoesqueleto, microtúbulos e microfilamentos;

• Diminuição do nível de GSH;

• Endurecimento e fraturas da Zona Pelúcida;

• Danificação Mitoncodrial e Enzimática;

• Ruptura das junções GAP das células do cumulus;

• Fatores Complicantes na Vitrificação:

• Complexidade Estrutural COC;

• Baixa proporção área de Superfície:Volume;

• Baixa permeabilidade da Membrana Plasmática;

• Quantidade de Lipídio do oócito (equino e suíno);

• Consequências da Vitrificação:

• Danos ao DNA;

• Ruptura do Citoesqueleto, microtúbulos e microfilamentos;

• Diminuição do nível de GSH;

• Endurecimento e fraturas da Zona Pelúcida;

• Danificação Mitoncodrial e Enzimática;

• Ruptura das junções GAP das células do cumulus;

Criopreservação de Oócitos

Variáveis que afetam o sucesso da criopreservação

� idade das doadoras;

� qualidade dos embriões;

� Método de Criopreservação;

� Solução Criprotetora;

� Fatores espécie-específicos;

� Relação Superfície:Volume;

� Oócitos: estágio de maturação e presença das células do

cumulus;

http://www.youtube.com/watch?v=lHYIg3NeKRc

Vídeo – Vitrificação Oócitos em Hemi-Palhetas