UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAISINSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

RELATÓRIO II: ATIVIDADE 2

DISCIPLINA: Química Orgânica Experimental – QUI031

PROFESSOR: Bruno

ATIVIDADE 2 – CROMATOGRAFIA EM COLUNA: EXTRAÇÃO E

FRACIONAMENTO DE PIGMENTOS VEGETAIS

REALIZADA EM 02/10/2012

INTEGRANTES DA BANCADA 4 - TURMA: F3

Juliana Alves Martins

Monique Aline Ribeiro dos Santos

Belo Horizonte - MG

Outubro - 2012

I – OBJETIVOS

Extrair pigmentos vegetais e fracioná-los através da técnica de cromatografia de

absorção em coluna.

II – INTRODUÇÃO

i. β-Caroteno

Os carotenos são pigmentos orgânicos encontrados nas plantas e microrganismos

como algas e fungos. São essenciais para a vida e nenhum animal pode sintetizá-los, por isso

devem ser ingeridos na dieta.

O β-caroteno é um dos mais de 600 carotenoides presentes na natureza. Essa

substância é a mais abundante e eficaz provitamina A, é encontrada em diversas plantas e

frutas, tais como espinafres, brocólis, couve, chicória, agriões, papaias, mangas, carambolas,

nectarinas e pêssegos. Sendo que, o conteúdo de beta-caroteno de frutas e vegetais pode variar

dependendo da estação e do grau de amadurecimento.

Entre as propriedades biológicas do β-caroteno são: funções anti-oxidantes, que

ajudam a neutralizar os radicais livres, e ajuda a extinguir o oxigênio sinlgleto, uma molécula

reativa que é gerada na pele por exposição à luz ultravioleta e que pode induzir alterações pré-

cancerígenas nas células.

Os carotenoides podem perder alguma de sua atividade, durante o armazenamento

dos alimentos, devido à ação das enzimas e à exposição à luz e oxigênio. Além disso, a

desidratação dos vegetais e frutas também pode reduzir grandemente a sua atividade

biológica. A perda de atividade ocorre devido à presença de insaturações presentes na

molécula, conforme mostra a figura 1, que faz essa molécula ser bastante reativa. Entretanto

se os alimentos forem congelados, a estabilidade dos carotenoides é mantida.

Figura 1 – Molécula de Beta Caroteno

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Algumas das propriedades físico-químicas deste composto são: hidrofóbico,

lipofílico, insolúvel em água e solúvel em solventes orgânicos como acetona, álcool e

clorofórmio e o seu pigmento vai do amarelo ao vermelho.

ii. Clorofila

A clorofila é um grupo de pigmentos presentes nas células das plantas e algas e é

responsável pela coloração verde. Em sua estrutura molecular, conforme figuras 3 e 4, contém

magnésio e transporta oxigênio nas células da planta.

Figura 2 – Moléculas de clorofila a, b e c

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O nome clorofila foi proposta por Pelletier e Caventou, em 1818, para denominar a

substância verde que se podia extrair das folhas com o auxílio do álcool. Este pigmento é

produzidos nos cloroplastos das folhas e em outros tecidos vegetais e funciona como

fotorreceptor da luz visível utilizada no processo da fotossíntese.

A clorofila absorve muito bem a luz das regiões azuis e vermelhas, refletindo a luz

verde. As diferenças aparentes nas cores dos vegetais são devidas à presença de outros

pigmentos associados, como os carotenóides, os quais sempre acompanham as clorofilas.

Existem vários tipos de molécula de clorofila, variando de acordo com o

comprimento de onda da luz que cada uma é capaz de absorver. Outros pigmentos,

denominados pigmentos acessórios, organizam-se em conjuntos cuja função primordial é

captar a energia luminosa, para conduzi-la até a clorofila.

Quimicamente, as clorofilas a e b são álcoois diterpenóides, têm estrutura

tetrapirrólica e são ésteres, derivados de diidroporfirina, que são quelatos com um íon de

magnésio localizado centralmente. Além disso, as clorofilas possuem um álcool isoprenóide

monoinsaturado, um diterpeno e o fitol, que é esterificado com o quarto anel, e se encontra na

configuração trans. O fitol representa o lado hidrofóbico da molécula, enquanto o resto da

molécula é hidrofílico. Logo, a presença do fitol confere a clorofila uma característica apolar

e lipofílica.

iii. Cromatografia em Coluna

A cromatografia é um método físico-químico de análise para a purificação,

separação, identificação e quantificação de substâncias em uma mistura. É realizada através

da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato. Uma das fases

permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela. Durante a passagem da fase

móvel sobre a fase estacionaria, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas

fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase

estacionária, resultado em migrações diferenciais destes componentes.

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Entre os métodos de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque devido a

sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas, por

si mesma ou em conjunto com outras técnicas instrumentais. Além disso, a grande variedade

de combinações entre fases móveis e estacionárias torna esta técnica extremamente versátil e

de grande aplicação.

Na cromatografia em coluna um tubo de vidro é empacotado com material

adsorvente (fase estacionária) que pode ser sílica gel, alumina, carbonato de cálcio, óxido de

magnésio, carvão ativado, sacarose e amido. A coluna é colocada na posição vertical e a

solução dos compostos passa de cima para baixo arrastada por um ou mais solventes (fase

móvel). A eluição é feita de modo a obter frações que podem conter misturas de compostos ou

compostos puros.

A cromatografia em coluna fundamenta-se no fato de que os componentes de uma

mistura movem-se com solventes pela coluna com velocidades diferentes, dependendo de

fatores como a natureza de cada substância, a natureza do solvente e a atividade do

adsorvente. A separação dos constituintes de uma mistura é efetuada através da passagem do

solvente pela coluna e baseia-se na interação dos componentes da amostra e do solvente com

a superfície adsorvente. Isso é possível porque o adsorvente sólido ativo tem uma grande área

superficial e pelo fato de dispor inúmeros sítios polares podem se combinar reversivelmente

ou adsorver pequena concentração de substâncias através de forças de atração eletrostática. O

solvente movendo-se pela superfície do adsorvente compete com a amostra adsorvida e com o

adsorvente, e então desloca seus constituintes reversivelmente e continuamente pela coluna.

Este processo pode ser visualizado como uma competição entre a amostra, o solvente

e o adsorvente e pode ser expresso pelo equilíbrio a seguir:

O fluxo de solvente deve ser contínuo e a velocidade de eluição dos compostos

depende da natureza de cada um destes compostos. Sendo que, compostos polares ou

polarizáveis, tais como álcoois, ácidos carboxílicos, amidas, aminas, são adsorvidas mais

fortemente e eluidos menos prontamente do que compostos menos polares, tais como

compostos halogenados, aldeídos, cetonas, éteres e hidrocarbonetos. À medida que os 4

Amostra-Adsorvente Solvente Amostra-Solvente

compostos da mistura são separados, bandas ou zonas começam a ser formadas; cada banda

contendo somente um composto. Em geral, os compostos apolares passam através da coluna

com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros têm menor

afinidade com a fase estacionária. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos

os compostos da mistura, ela não se moverá. Por outro lado, se for escolhido um solvente

muito polar, todos os solutos podem ser eluídos sem serem separados. Por uma escolha

cuidadosa das condições, praticamente qualquer mistura pode ser separada. Sendo assim,

solventes pouco polares são empregados para substâncias fracamente adsorvidas enquanto

solventes polares são para aquelas fortemente adsorvidas.

A atividade do adsorvente sólido também determina a velocidade com que as

substâncias são eluidas. A atividade é determinada pelo seu conteúdo de água e pela

granulação das partículas.

Alguns solventes comumente utilizados estão listados a seguir na ordem de aumento

da polaridade.

Partindo destes princípios, pode-se realizada a extração da clorofila e o β-Caroteno

de folhas de espinafre através da cromatografia em coluna.

III – MONTAGENS E MATERIAIS UTILIZADOS

III.i. Reagentes

Coluna com torneira; Bastão de vidro;

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Hexano

Diclorometano

Clorofórmio

Éter Etílico

Acetato de Etila

Etano

Metanol

Água

Algodão;

Papel Absorvente;

Pipeta conta-gotas;

Erlenmeyer de 125,0 mL;

Proveta de 25,0 mL;

Tela de Amianto;

Tripé;

Bastão de Vidro com borracha;

Béqueres de 50,0 mL;

Almofariz com pistilo;

Suporte;

Garras e Mufas;

Espátula;

Bico de Gás;

Funil de haste longa;

Chapa elétrica.

III.i. Montagem

Figura 4 – Montagem para cromatografia em coluna

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Haste universal

erlenmeyer

garra

III – PARTE EXPERIMENTAL

III. I – PROCEDIMENTOS

i. Empacotamento da Coluna

Uma coluna de vidro foi fixada, verticalmente, em um suporte, fechou-se a

torneira e com o auxílio de um funil introduziu-se 10,0 mL de hexano. Com um

arame, foi introduzido, até a conexão do tubo com a torneira, um pequeno chumaço de

algodão.

Preparou-se uma suspensão contendo cerca de 5,0 g de sílica gel e hexano

(quantidade de hexano de forma que este ficou cerca de 5,0 mL acima da sílica), esta

foi introduzida na coluna com o auxílio de um funil e com a ajuda de um bastão de

vidro com borracha foi dadas leves pancadas na coluna para que a acomodação do

solvente ocorre de forma homogênea.

Como a coluna encheu antes da total transferência da suspensão, a

transferência foi completada simultaneamente com a retirada do eluente. Após a total

transferência da suspensão, o solvente foi recolhido até que o nível de solvente ficasse

por volta de 3,0 cm acima do topo da fase estacionária.

ii. Preparo do Extrato

Foi pesado aproximadamente 10,0 g de folhas de espinafre, removeu-se as

nervuras e ferveu estas folhas por aproximadamente 2 minutos em 100,0 mL de água

destilada.

Desprezou-se a água na pia, as folhas foram resfriadas com água gelada e

foram enxugadas utilizando papel toalha.

As folhas foram colocadas em um almofariz e adicionou-se uma mistura de

hexano e acetona 1:1. Em seguida, as folhas foram trituradas até obter um solução

verde que foi transferida para um béquer pequeno.

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No béquer contendo a solução, foi colocada duas pontas de espátula (tipo

canoa) de sílica para encorpar o extrato. Essa mistura foi colocada em uma chapa

quente, localizada na capela, para o solvente secar, sendo que, neste procedimento o

béquer foi agitado para não haver projeção.

iii. Eluição da Coluna Cromatográfica

O extrato foi adicionado no topo da coluna com o auxílio de um funil de

haste longa e a torneira foi aberta para o solvente escoar até a solução atingir o topo do

recheio, a torneira foi fechada e adicionou-se um pouco de hexano, utilizando pipeta

conta-gotas para lavar a parede da coluna. Em seguida a torneira foi aberta até o

solvente atingir novamente o topo do recheio. Este procedimento foi repetido.

Fechou-se a torneira, colocou-se o hexano até completar a coluna para

proceder a eluição. Abriu-se a coluna e recolheu o solvente até que a primeira banda

esteja bem próxima a torneira, este solvente recolhido no erlenmeyer foi chamado de

fração I. Sendo que quando o solvente contido na coluna atingia o topo do recheio foi

adicionado mais hexano para não ressecar a sílica.

Substitui-se o frasco de coleta e recolheu a fração II até o eluente perder a

cor.

Substitui-se novamente o erlenmeyr coletor, aguardou o solvente atingir o

topo do recheio, o solvente foi substituído por acetona e continuou recolhendo o

eluente até que a segunda banda esteja bem próxima a torneira, a solução contida neste

erlenmeyer foi chamada de fração III.

Substitui o frasco coletor e recolheu a fração IV. Comparou-se as cores dos

eluatos obtidos, transferiu-se as frações recolhidas para os frascos identificados na

capela.

Em seguida, remou-se o adsorvente das colunas deixando-o no local

indicado e desprezou-se todas as folhas no lixo.

IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO

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Na parte de preparo do extrato as folhas de espinafre foram fervidas para que as

substâncias solúveis em água fossem extraídas e, como as substâncias de interesse são

orgânicas, esta água foi desprezada. Já a adição de cetona e hexano seguida de maceração das

folhas foi realizada para extrair as substâncias orgânicas.

Os eluatos obtidos apresentavam as seguintes colorações:

Tabela 1: Colorações dos eluatos obtidos

Frasco 1 Incolor

Frasco 2 Levemente amarelo

Frasco 3 Incolor

Frasco 4 verde

A adição da amostra seguida do hexano, no tubo, ocorreu a separação em duas

bandas, uma de coloração verde e a outra de coloração amarela. Sendo que a substância de

coloração amarela estava na parte inferior, conforme mostra a figura 2.

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eluente

Banda 2: verde

Banda 1: amarela

Figura 4 – Coluna após a adição da amostra e hexano

O frasco coletor 1 apresentava-se incolor devido este haver basicamente hexano e,

possivelmente, traços da substância de coloração amarela, mas isto foi imperceptível a olho

nú, já que a maior parte da substância amarela ainda estava próxima à torneira da coluna.

Já o frasco 2, possuía coloração levemente amarelada. Pelo fato desta substância

possuir esta coloração, ter sido extraída com hexano, que é um solvente apolar, e pelas

estruturas moleculares apresentadas na introdução, indica que esta substância é o caroteno

que, por ser uma substância apolar, interage menos com o adsorvente e mais com o hexano,

logo, nessa competição pelo substrato, o solvente consegue interagir de forma mais eficiente e

arrasta-o pela coluna mais facilmente.

No frasco 3, a coloração também era incolor. Entretanto neste frasco pode haver

ainda traços do beta caroteno, além disso poderia haver hexano que estaria contido na parte

interior do tubo no inicio da adição de acetona, a própria acetona e possivelmente traços da

substância verde.

No tubo 4, a coloração era esverdeada. Como esta substância apresenta esta cor, foi

extraída com acetona, que é um solvente polar, e foi adsorvido mais fortemente, indica que

esta substância é a clorofila que por sua estrutura molecular ser mais polar interage mais com

a acetona, logo na competição entre o solvente e o adsorvente o primeiro conseguir interagir

mais eficientemente com a molécula e arrastá-la no tubo.

V – CONCLUSÃO

Pela técnica de cromatografia em coluna empregando sílica como adsorvente e hexano

e acetona como eluentes foi possível a extração de clorofila e caroteno. Isso foi possível

porque estas duas últimas substâncias apresentam polaridades distintas, logo foram adsorvidas

de forma diferenciada pelo adsorvente, sendo que, a sílica adsorve melhor as substâncias mais

polares. Segue-se, ainda, que a adição do eluente menos polar interagiu de forma mais

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eficiente com o β-Caroteno logo este foi extraido pimeiro. Logo após a adição da acetona foi

extraído a clorofila por esta ser mais polar e interagir melhor com a acetona.

VI - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] COLLINS, Carol H; BRAGA, Gilbert L.; Introdução a Métodos Cromatográficos, Editora

da Unicamp, 5ª Ed., Campinas, 1993, páginas 13 a 27.

[2] TEIXEIRA, Marco Antônio, Cromatografia Gás-Líquido: princípios e aplicações,

páginas 1 a 3.

[3] SHINER, Ralph. L; FUSON, Reynold C.; CURTIN, David Y; MORRILL, Terence C.;

Identificação Sistemática dos Compostos Orgânicos Manual do Laboratório; Editora

Guanabara Dois S.A., 6ª Ed., Rio de Janeiro, 1983, páginas 331 a 343.

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QUESTIONÁRIO

1) Consulte na literatura as estruturas do caroteno e das clorofilas?

As estruturas do β-Caroteno e das clorofilas são

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2) Considerando que os carotenos apresentam cores próximas do amarelo enquanto

as clorofilas são verdes, avalie as polaridades das misturas obtidas e identifique o

conteúdo das mesmas.

Como o caroteno foi extraido com hexano, e este por sua vez é um solvente apolar, o

beta caroteno é apolar. Já a clorofila foi extraida com a acetona, e sendo este um

solvente polar, conclui-se que as clorofilas são polares.

3) Correlacione a polaridade com a estrutura química dos componentes da mistura.

As clorofilas possuem 40 carbonos, sendo 2 ciclos de 6 e 11 duplas ligações

conjugadas. Isso confere à molécular um caráter apolar. Já as clorofilas possuem

quelatos de magnésio, cetonas, estéres, aldeídos e ácidos carboxílicos que confere à

molécula um caráter polar.

4) Um aluno leu rapidamente o procedimento experimental e começou esta prática,

no entanto, ao invés de utilizar inicialmente o hexano ele confundiu e começou a

coluna com acetona. Discute o que você acha desta troca de eluentes.

A troca de eluentes não irá separar as substâncias e ambas serão arrastadas pelo

solvente. Isso ocorre poque a substância menos polar é menor adsorvida, logo a

tendência é esta ser arrastada pelo solvente, mesmo a substância sendo apolar.

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Enquanto que, apesar da clorofila ser mais adsorvida, neste caso, esta competição

favorece o eluente, logo esta também será arrastada.

5) Suponha que você tenha uma mistura de três substâncias orgânicas, sendo todas

sólidas: um álcool, um hidrocarboneto saturado e uma cetona. Proponha uma

separação cromatográfica destas substâncias utilizando sílica-gel como

adsorvente e os eluentes que achar necessário.

Tendo em vista que a ordem de polaridades destas três substâncias é:

Hidrocarboneto < acetona < álcool

No caso de ser usada a cromatografia em coluna com sílica gel, o álcool será mais

adsorvido e o hidrocarboneto será menos adsorvido. Sendo assim, deve-se proceder a

eluição primeiramente com hexano, que sendo um solvente apolar, conseguirá

interagir e arrastar o hidrocarboneto. Em seguida, a eluição deve ser com éter dietílico

que é um composto não tão polar. Isso fará com que haja a extração da cetona. Por

fim, a eluição deverá ser feita com etanol, pois este é um solvente bastante polar e

conseguirá competir mais eficientemente com o adsorvente pelo substrato e o álcool

será extraído.

6) Faça uma pesquisa sobre os adsorventes que podem ser utilizados em métodos de

separação por cromatografia em coluna, mostrando qual a diferença entre eles.

Alguns dos adsorventes que podem ser usados na cromatografia em coluna são os

seguintes:

Adsorvente Comentárioa

Negro de Fumo Considerado fraco no caso de compostos com interações do

tipo ligação de hidrogênio

Silicato de Magnésio

Alumina (Al2O3) Usado comumente no caso de compostos estáveis

Sílica-Gel Usado comumente, especialmente no caso de compostos

orgânicos mais sensíveis.

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Sulfato de Cálcio

Açúcar

Celulosa em pó Adsorvente muito fraco.

Estes adsorvente foram listados em ordem do poder do poder da adsorção. A

alumina e a sílica-gel são os usados mais habitualmente. Entretanto, adsorventes de

fase invertida também existem no mercado. Logo, com estes adsorventes, os

componentes mais polares da amostra são eluídos mais rapidamente. Já a alumina

usada comercialmente pode ser ácida, básica ou neutra. Sendo que, a alumina ácida é

útil na separação de ácidos carboxílicos e aminoácidos; a básica é utilizada para a

separação de aminas.

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