CROMATOGRAFIAHistórico

M. TSWEET (1903): Separação de misturas depigmentos vegetais em colunas recheadas com

adsorventes sólidos e solventes variados.

éter depetróleo

CaCO3

mistura depigmentos

pigmentosseparados

Cromatografia =kroma [cor] + graph [escrever]

(grego)

CROMATOGRAFIAPrincípio Básico

Separação de misturas por interação diferencial dos seuscomponentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou

sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

CROMATOGRAFIAModalidades e Classificação

FM = Líquido

FM = Gás

CromatografiaLíquida

CromatografiaGasosa (CG)

Em CG a FEpode ser:

Sólida

Líquida

CromatografiaGás-Sólido (CGS)

CromatografiaGás-Líquido (CGL)

CROMATOGRAFIA GASOSAHistórico

Presentemente:Vendas de equipamentos e acessórios para CG nos EUA

estimadas em mais de US$ 750.000.000 (1995).

1940

1950

1960

“CGS” rudimentar

CGL proposta (Martin e Synge)

Separação de ácidos orgâni-cos por CGL: primeiro cro-matógrafo (Martin e James)

Primeiro equipamento comer-cial (Griffin & George)Detector por Densidade de

Gás (Martin e James)

Detector por Ionização em Chama (McWillian e Dewar)

Detector por Captura de Eletrons(Lovelock e Lipsky)

Colunas Capilares (Golay)

CROMATOGRAFIA GASOSAAplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

Misturas cujos constituintes sejamVOLÁTEIS (=“evaporáveis”)

(para uma substãncia qualquer poder ser“arrastada” por um fluxo de um gás ela

deve ser dissolver - pelo menos parcialmente -nesse gás)

DE FORMA GERAL:CG é aplicável para separação e análisede misturas cujos constituintes tenhamPONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oCe que termicamente estáveis.

O Cromatógrafo a Gás

1

2

3

4

6

5

1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.4 - Detector.5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal.6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

Observação: em vermelho: temperatura controlada

INSTRUMENTAÇÃOGás de Arraste

Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amos-tra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTEGÁS DE ARRASTE

Requisitos:

INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento.

PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos:

oxida / hidroliza algumas FEincompatíveis com DCEH2O, O2

hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

INSTRUMENTAÇÃOGás de Arraste

Requisitos:

CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros.

COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para

melhor funcionamento.Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:

He , H2DCTDIC N2 , H2

DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4

CU

STO

PUREZAA

BC

A = 99,995 % (4.5)B = 99,999 % (5.0)C = 99,9999 % (6.0)

INSTRUMENTAÇÃOAlimentação de Gás de Arraste

Componentes necessários à linha de gás:

controladores de vazão / pressão de gás

dispositivos para purificação de gás (“traps”)

1

2

34

5

6

1 - Cilindro de Gás2 - Regulador de Pressão Primário

3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás4 - Regulador de Pressão Secundário

5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo)6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)

Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre

INSTRUMENTAÇÃODispositivos de Injeção de Amostra

Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na

coluna cromatográfica

Injeção instantânea:

Injeção lenta:

t = 0

t = x

t = 0

t = x

INSTRUMENTAÇÃOInjetor “on-column” Convencional

1

2

3

4

1 - Septo (silicone)2 - Alimentação de gás de arraste)3 - Bloco metálico aquecido4 - Ponta da coluna cromatográfica

INSTRUMENTAÇÃOInjeção “on-column” de líquidos

1 2 3

1 - Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna.

2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamenteno início da coluna.

3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.

INSTRUMENTAÇÃOParâmetros de Injeção

TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser sufi-cientemente elevada para que a amostra vapo-rize-se imediatamente, mas sem decomposição

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil

VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra

COLUNA AmostrasGasosas

AmostrasLíquidas

empacotada� = 3,2 mm (1/4”)

0,1 ml ... 50 mL0,2 �L ... 20 �L

capilar� = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 �L ... 3 �L

Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução

INSTRUMENTAÇÃOMicrosseringas para Injeção

LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 �L, 5 �L e 10 �L

êmbolo

corpo (pirex)

agulha (inox 316)

Microseringa de 10 � L:

Microseringa de 1 � L (seção ampliada):

corpo

guia

êmbolo (fio de aço soldado ao guia)

agulha

INSTRUMENTAÇÃOColunas: Definições Básicas

EMPACOTADA� = 3 a 6 mm

L = 0,5 m a 5 mRecheada com sólido pul-verizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio)

CAPILAR� = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m

Paredes internas recober-tas com um filme fino (fra-ção de �m) de FE líquida

ou sólida

INSTRUMENTAÇÃOTemperatura da Coluna

Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende

de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).

p0 = fEstrutura química

do analito

Temperatura da coluna

Temperaturada

coluna

Pressãode

vapor

Velocidadede

migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDA-MENTE (MENOR RETENÇÃO)

INSTRUMENTAÇÃOTemperatura da Coluna

TEMPER

ATUR

A DA C

OLU

NA

CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER

BOA SEPARAÇÃO EM CG

INSTRUMENTAÇÃOForno da Coluna

Características Desejáveis de um Forno:

AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA DE USO Pelo menos de Tambiente até 400oC. Sistemas criogênicos (T < Tambiente) podem ser necessários em casos especiais.

TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS DEMAIS MÓDULOS Não deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector.

TEMPERATURA UNIFORME EM SEU INTERIOR Sistemas de ventilação interna muito eficientes para manter a temperatura homogênea em todo forno.

INSTRUMENTAÇÃOForno da Coluna

Características Desejáveis de um Forno:

FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser frequente.

AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas.

TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL

A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C.

Em cromatógrafos modernos (depois de 1980),o controle de temperatura do forno é totalmente

operado por microprocessadores.

INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura

Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes)

separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAIXA:- Componentes mais

voláteis são separados- Componentes menos volá-teis demoram a eluir, saindo

como picos mal definidos

TCOL ALTA:

- Componentes mais volá-teis não são separados

- Componentes menos volá-teis eluem mais rapidamente

INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:

Consegue-se boa separação dos

componentes da amostra em menor

tempo

TEMPO

TEM

PER

ATU

RA

tINI tFIM

TINI

TFIM

R

Parâmetros de uma programação de temperatura:

TINI Temperatura Inicial

TFIM Temperatura Final

tINI Tempo Isotérmico Inicial

tFIM Tempo Final do Programa

R Velocidade de Aquecimento

INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura

Possíveis problemas associados à PLT:

VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTEA viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.

viscosidade vazão

DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida

INSTRUMENTAÇÃODetectores

Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da pas-

sagem de substâncias que não o gás de arraste

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece

como um PICO no cromatograma.

INSTRUMENTAÇÃODetectores

Mais Importantes:

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD) Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons poreluatos altamente eletrofílicos.

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD) Variação da condutividade térmica do gás de arraste.

DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DICOU FID) Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.

REGISTRODE

SINAL

ANALÓGICORegistradores XY

DIGITALIntegradores

Computadores

TEORIA BÁSICATempo de Retenção Ajustado, tR‘

tR

tM

tR’ = tR - tM

TEMPO

SIN

AL

tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in-jeção e o ápice do pico cromatográfico)

tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido(tempo mínimo para um composto que não interaja

com a FE atravesse a coluna)tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que

as moléculas do analito passam sorvidas na FE)

O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o

TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:

TEORIA BÁSICAVolume de Retenção Ajustado, VR‘

Embora não diretamente mensurável, o parâ-metro fundamental de retenção é o

VOLUME DE RETENÇÃO AJUSTADO, VR’:

vazão do gás de arraste

MRR ttt ��� x CF

VR = Volume de Retenção (volume de gás de arraste necessário para eluir um analito)

VM = Volume de Fase Móvel (volume de gás de ar-raste contido na coluna; “volume morto”)

VR’ = Volume de Retenção Ajustado (volume de gás de arraste consumido enquanto o analito está

sorvido na FE)

VR’ = f

Fatores termodinâmicos

Parâmetros dimensionais da coluna

TEORIA BÁSICAConstante de Distribuição, KC

Coluna cromatográfica: série de estágios inde-pendentes onde acontece o equilíbrio entre o analitodissolvido na fase estacionária e no gás de arraste:

Ocorre um “quase-equilíbrio” en-tre o analito sorvido na FE e dis-

solvido no gás de arraste.

� �� �M

SC A

AK �

KC = Constante de Distribuição[A]S = concentração do analito na FE

[A]M = concentração do analito no gás

MENOR RETENÇÃO !!!

Volatilidade [A]M

Afinidade pela FE [A]S

TEORIA BÁSICAFator de Retenção, k

Exprimindo o equilíbrio em termos da MASSA doanalito em cada fase, ao invés da concentração:

M

S

WWk �

FATOR DE RETENÇÃO, k: razão entre as massas de

analito contidas na FE (Ws) e gás de arraste (WM)

S

M

VV

��RAZÃO DE FASES, �:

razão entre volumes de FE e gás de arraste na coluna

O fator de retenção k depen-de da constante termodi-

nâmica de distribuição KC e da razão de fases � da coluna

TEORIA BÁSICARazão de Fases, �

Depende das DIMENSÕES da coluna:L = comprimento da colunarC = raio

da coluna

df = espessura do filme de FE

� �

fC

fC

drdr

2

2�

��rC >> df

dC / mm df / �m �

0.10 0.10 2500.20 0.11 4550.20 0.33 1520.25 0.25 2500.25 1.00 630.32 0.17 4710.32 0.52 1540.32 1.00 800.53 0.88 1510.53 2.65 500.53 5.00 27

Valores de � para colunas capilares de

dimensões típicas:

Empacotadas:5 < � < 50

TEORIA BÁSICARelações entre VR’, KC e �

VR’ pode ser definido em função de KC e ��

VR’ depende diretamente da constante de dis-tribuição do soluto entre a FE e o gás de arraste e

das dimensões da coluna.

Outra combinação

possível:

É possível estimar tanto o fator de

retenção quanto a constante de

distribuição a partir do cromatograma

TEORIA BÁSICAEficiência de Sistemas Cromatográficos

A migração umanalito pela coluna

provoca inevitavelmente o

alargamento da sua banda:TEMPO

Efeitos do alargamento excessivo de picos:Separação deficiente de analitos com retenções

próximas.

Picos mais largos e menos intensos = menor

detectabilidade

EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

TEORIA BÁSICAQuantificação da Eficiência

Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o

analito, a FE e o gás de arraste:

Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de

PRATO TEÓRICO

O número de pratos teó-ricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:

Coluna mais eficiente

tR

wb

N

TEORIA BÁSICAQuantificação da Eficiência

ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRI-CO (H) “Tamanho” de cada estágio de equilíbrio

Valores típicos de H e N:

dC df H N0.10 0.25 0.081 3703700.25 0.25 0.156 1923080.32 0.32 0.200 1500000.32 0.50 0.228 1315790.32 1.00 0.294 1020410.32 5.00 0.435 689660.53 1.00 0.426 704230.53 5.00 0.683 439242.16 10% 0.549 36432.16 5% 0.500 4000

Capilares, L = 30 m

Empacotadas, L = 2 m

Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO

maior tipicamente elas são mais eficientes

(L = comprimento da coluna)

TEORIA BÁSICAOtimização da Eficiência

A altura equivalente a um prato téorico é função da velocidade linear média do gás de arraste u:

H

uuMAX

HMIN

O valor de H pode ser

minimizado otimizando-se a vazão de gás de

arraste

Relações algébricas entre H e u:

- Colunas Empacotadas: Equação de van Deemter

- Colunas Capilares: Equação de Golay

(A, B, C = constantes)

(B, CM, CS = constantes)

FASES ESTACIONÁRIASConceitos Gerais

LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)

FElíquida

SUPORTESólido inerte

porosoTubo capilar de material inerte

SÓLIDOS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado

sobre a superfície interna do tubo (capilar)

Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é:

Entrecruzada: as cadeias poliméricas são quimicamente

ligadas entre si

Quimicamente ligadas: as cadeias poliméricas

são “presas” ao suporte por ligações químicas

FASES ESTACIONÁRIASCaracterísticas de uma FE ideal

SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.

Regra geral: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem

separados (polar, apolar, aromático ...)

FE Seletiva: separação

adequada dos constituintes da

amostra

FE pouco Seletiva: má resolução

mesmo com coluna de boa eficiência

FASES ESTACIONÁRIASCaracterísticas de uma FE ideal

AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimização da separação.

BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA Maior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra

POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases)

DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas reprodutíveis; ausência de picos “fantasma” nos cromatogramas.

FASES ESTACIONÁRIASFE Sólidas: Adsorção

O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO

A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida

ADSORÇÃO

Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)

Solutos polares

Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares deeletrons...)

FASES ESTACIONÁRIASFE Sólidas

Características Gerais:- Sólidos finamente granulados (diâmetros de par-

tículas típicos de 105 µm a 420 µm).

- Grandes áreas superficiais (até 102 m2/g).Mais usados:

Polímeros Porosos Porapak (copolímero estireno-divi-nilbenzeno), Tenax (polióxido de difenileno)Sólidos Inorgânicos Carboplot, Carboxen (carvões ativos grafitizados), Alumina, Peneira Molecular (argilamicroporosa)

GASES DE REFINARIAColuna:Carboxen-1000 60-80mesh; 15’ x 1/8”TCOL: 35oC a 225oC / 20oC. min-1

Gás de Arraste: He @ 30 ml.min-1

Detector: TCD

Principais Aplicações:- Separação de gases fixos- Compostos leves- Séries homólogas

FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas

POLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a umidade e oxidação; ainda muito importantes. Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais:Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.)

CH2 CH2OH OH

n

Estrutura Química:

AMINAS ALIFÁTICASColuna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH

TCOL: 200oC (isotérmico) Gás de Arraste: N2 @ 20 mL.min-1

Detector: FID Amostra: 0,01 �L da mistura de aminas

FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas

Maior parte das aplicações em CG modernaQuatro grandes grupos estruturais:

PARAFINAS Apolares; alta inércia química; praticamente abandonadas. Principais: esqua-lano (C30H62), Apiezon (graxas para vácuo).

POLIÉSTERES Ésteres de diálcoois com di-ácidos. Polares; altamente sensíveis a umidade e oxidação; uso em declínio. Principais: DEGS, EGA, EGS.

ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRAXOS

Coluna:5%DEGS-PS s/ Supel-coport 100/120 mesh; 6’ x 1/8”TCOL: 200oC (isotérmico)Gás de Arraste: N2 @ 20 ml.min-1

Detector: FIDAmostra: 0,5 �L de solução em clorofórmio contendo 0,5 �g de cada éster

FASES ESTACIONÁRIASFE Líquidas: Absorção

O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO

A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial)

ABSORÇÃO

Filmes espessos de FE líquida

Interação forte entre a FE líquida e o analito(grande solubilidade)

Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste

FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas

SILICONES (polisiloxanas) As FE mais em-pregadas em CG. Cobrem ampla faixa de pola-ridades e propriedades químicas diversas.

SiCH3

H3CCH3

O SiR1

R2

O SiCH3

CH3

CH3n

R1, R2 = qualquerradical orgânico

- Ligação Si-O extremamente estável = elevada estabilidade térmica e química das FE.

- Silicones são fabricados em larga escala para diversas aplicações = minimização de custo do produto + tecnologia de produção e purificação

largamente estudada e conhecida.

- Praticamente qualquer radical orgânico ou inorgânico pode ser ligado à cadeia polimérica = FE “ajustáveis” a

separações específicas + facilidade de imobilização por entrecruzamento e ligação química a suportes

FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas

Substituintes Nomes Comerciais Observações- - SE-30 OV-1 OV-101 SP-2100 mais apolares da série

pouco seletivascarborano ? - Dexsil 300GC similar a PDMS

estável até > 400oC

fenil 5 % - SE-52 SE-54 OV-3 OV-5OV-73

pouco polar

cianopropil 7% fenil 7% OV-1701 SPB-7 CP-Sil 19CB moderadamente polar

fenil 50 % - OV-17 SP-2250 HP-50+SPB-50

moderadamente polarretém aromáticos

trifluoropropil 50% - OV-210 QF-1 moderadamente polarretém compostos carbonílicos

cianopropil 50% fenil 50% OV-225 SP-2300 CP-Sil43CB

polarretem doadores de elétrons

cianopropil 100% - SP-2340 SP-2330 Silar-9 CP altamente polar

FE derivadas de polidimetilsiloxano (PDMS) por substituição de -CH3 por radicais orgânicos, em

ordem crescente aproximada de polaridade:

Diferenças entre FE de composição similar provenientes de fornecedores diferentes:

pureza, viscosidade.

FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas

Separação de pesticidas - FE = 100 % PDMS

1 - TCNB2 - Dichloram3 - Lindano4 - PCNB5 - Pentacloroanilina6 - Ronilano7 - Antor8 - pp’-DDE9 - Rovral10 - Cypermetrin11 - Decametrin

Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 �m)

TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1)

Gás de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID

Amostra: 2�L de solução dos pesticidas “on-column”

17 min

FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas

Separação de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone1 - piridina2 - 2-metilpiridina3 - 2,6-dimetilpiridina4 - 2-etilpiridina5 - 3-metilpiridina6 - 4-metilpiridina

3 minColuna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 �m)

TCOL:110oC (isotérmico)

Gás de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FID

Amostra: 0,1�L de solução 1-2% das piridinasem 3-metilpiridina

FASES ESTACIONÁRIASFamílias de FE Líquidas

Separação de fenóis - FE = fenilmetilsilicones

50% Ph

50% Me

5% Ph

95% Me

FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais

Separação de isômeros óticos:

FÁRMACOS Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.

PRODUTOS BIOLÓGICOS Distinção entre pro-dutos de origem sintética e natural (natural = normal-mente substâncias oticamente puras; sintético = mui-tas vezes são misturas racêmicas).

Propriedades físico-químicas de isômeros óticos são MUITO SIMILARES

FE convencionais não interagem diferencialmente com isômeros óticos

Separação de misturas de isômeros óticos só é possível com FE oticamente

ativas=

FE Quirais

FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais

FE oticamente ativas mais importantes:

O Si

CH3

CH2

CHCH3

CO N

H

C*

CO

H

CH CH3

CH3

NH C

CH3

CH3

CH3

Si

CH3

CH3

O

n

Chiralsil-Val

Derivados de aminoácidos:

Misturas de compostos formadores de pontes de

hidrogênio.

Organometálicos:

Separação deenantiômeros formadores

de complexos.

n

O Si

CH3

CH2

Si

CH3

CH3

O

CH2

O

O

Ni

C3F7

/ 2

Chiralsil-Metal

FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais

Derivados de ciclodextrinas alquiladas:

�-ciclodextrina:oligosacarídeocíclico quiral

Chiralsil-Dex

- Introduzidas em 1983

- Quando ligadas a cadeias de polisiloxano: uso extremamente favorável como FE líquida (viscosidade

baixa, estabilidade ...)

- Podem ser quimicamente imobilizadas nas colunas

- Colunas disponíveis comercialmente

FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais: Aplicações

Óleo essencial artificial de limão: separação de terpenos primários

1 - (+/-) �-pineno2 - sabineno3 - (+/-) �-pineno4 - (+/-) limoneno

Coluna: Rt-ßDEXsm (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm)

TCOL: 1 min a 40°C / 2°C min-1 / 3 min a 200°C

Gás de Arraste: H2 @ 80 cm.min-1 Detector: FID

FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais: Aplicações

Óleo essencial natural Essência artificial

Aroma de bergamota: distinção entre aroma natural e artificial

Coluna: Rt-ßDEXse (30 m x 0.32 mm x 0.25 µm)

TCOL: 1 min a 40°C / 4°C min-1 / 200°C

Gás de Arraste: He @ 80 cm.min-1 Detector: MS

FASES ESTACIONÁRIASFE Quirais: Aplicações

Anfetaminas: resolução dos isômeros

Coluna: Rt-ßDEXcst (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)

TCOL: 1 min a 120°C / 1,5°C min-1 / 3 min A 175°C

Gás de Arraste: He @ 25 cm.min-1 Detector: MS

COLUNAS EMPACOTADASDefinições Básicas

Tubo de material inerte recheado com FE sólida gra-nulada ou FE líquida depositada sobre suporte sólido.

MATERIALDO

TUBO

ø = 3 mm a 6 mmL = 0,5 m a 5 m

aço inoxvidro pirexníquelTEFLON

Granulometriado

recheio80 - 100 mesh 149 - 177 �m

100 - 120 mesh 125 - 149 �m

60 - 80 mesh 177 - 250 �m

MESH dp

Eficiência maximizada com:

- Diminuição de dC

- Diminuição de dp

- Recheio regular

Limitados pela resistência à passagem de gás de arraste

COLUNAS EMPACOTADASFE Líquidas: Suporte

A FE líquida deve ser disposta sobre um SUPORTE sólido

área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1

microporos regulares (~ 1 �m)

NÃO interagir com a amostra

boa resistência mecânica

Uso quase universal: TERRA DIATOMÁCEA

Esqueletos fósseis (SiO2 + óxidos

metálicos) de algas microscópicas

ChromosorbAnachrom

Supelcoport...

secagemcalcinação

fusão com sodalavagem com ácido

silanização

COLUNAS EMPACOTADASFE Líquidas: Suporte

Chromosorb - características gerais

Áre

a Su

perf

icia

l

Den

sida

de A

pare

nte

Tam

anho

de

Poro

% M

áx. d

e FE

NOME m 2 .g -1 g.ml -1�m

Chromosorb P 4,0 0,47 0,4 - 2 30Chromosorb W 1,0 0,24 8 - 9 15Chromosorb G 0,5 0,58 - 5

Ord

em c

resc

ente

de in

érci

a

Tratamentos especiais:

AW Lavado com ácido, para remoção de metais

HP ou DMCS ou HDMS Silanizados (menor adsorção)

NAW Sem lavagem com ácido

Chromosorb P Róseo, muito ativo.

Chromosorb W Branco, mais inerte que o P.

Chromosorb G Similar ao W, maior resistência mecânica

COLUNAS EMPACOTADASFE Líquidas: Carga de FE

TIPICAMENTE % FE = 1 % a 30 % do recheio

Maiores volumes de amostraMelhor blindagem dos sítios adsortivos do suporte

Melhor reprodutibilidade no preparo do recheio

Maior eficiência (�d f = �N)Menor sangria da FE com temperatura programadaSeparações rápidas e em temperaturas menores

% FE

df = f (% FE no recheio)

COLUNAS CAPILARESDefinições Básicas

Tubo fino de material inerte com FE líquida ou sólida depositada sobre as paredes internas.

MATERIALDO

TUBO

ø = 0,1 mma 0,5 mmL = 5 ma 100 m

sílica fundidavidro pirexaço inox

NylonSilcosteel

Colunas de sílica são revestidas externamente com camada de polímero (poliimida) para aumentar resistência mecânica e química

Colunas Capilares x Empacotadas:

CAP

ILAR

ES � L = � N Colunas mais eficientes

FC = 1 ... 10 mL.min-1 Controle de vazão mais difícil

� Vi Dispositivos especiais de injeção

Famílias de Colunas Capilares :

PLOT (Porous layer open tube) Camada de FE sólida presa às paredes internas

SCOT (Support coated open tube) Predes internas revestidas com material de recheio similar ao das colunas empacotadas

WCOT (Wall coated open tube) FE liquida deposida (ligada // entrecruzada) sobre as paredes internas.

COLUNAS CAPILARESDiâmetro Interno

� dC = � Eficiência

0,10 mm 0,25 mm0,32 mm 0,53 mm

1 2 3

Valores comuns:

1Colunas de altíssima eficiência (amostras

complexas, “Fast GC”); capacidade volumétrica limitada de processamento de amostra

2Diâmetros mais comuns; capacidade

volumétrica limitada de amostra requer dispositivos especiais de injeção

3Colunas “megabore”: menor eficiência, mas maior capacidade de processamento permite

uso de injetores convencionais

COLUNAS CAPILARES“Fast GC”: Colunas Capilares Finas

Destilação simulada de óleo diesel:

Coluna: HP-1 (1 m x 0.10 mm x 0.40 µm)

TCOL: 35°C / 40°C min-1 / 0,75 min A 310°C

Gás de Arraste: He @ 90 ml.min-1 Detector: FID

Além de colunas finas: necessário controle acurado de vazão (controle eletrônico de pressão)

e altas velocidades de aquecimento da coluna.

COLUNAS CAPILARESColunas Capilares: Injeção

1

2

3

45

6

1 - Septo;2 - Entrada de gás de arraste;3 - “Liner” (misturador);4 - Coluna Capilar5 - Purga de gás de arraste;6 - Válvula de controle de purga.

Baixa capacidade de processamento de amostra (sub-microlitro)

Injeção direta com microseringa muito difícil !!!

Injetores com divisão (“splitters”) Sistema pneumático despreza fração da amostra injetada

- Menor sensibilidade (boa parte da amostra é desprezada)

- Divisão da amostra raramente é uniforme (fração purgada dos constituintes menos voláteis é sempre menor)

- Ajuste da razão de divisão é mais uma fonte de erros

COLUNAS CAPILARESLarge Volume Injection (LVI)

Combinando injetores com temperatura programada, vál-vulas controladas por microprocessador e pré-colunas pode ser feita injeção de grandes volumes (> 100 ��L) de amostra

1 Colunas e injetor frios;

válvula de purga aberta (solvente é

eliminado)

2 Colunas e injetor aquecidos; válvula de purga

fechada (constituintes de

interesse transferidos para coluna analítica)

COLUNAS CAPILARESLarge Volume Injection (LVI)

Separação de PAH com LVI (Vinj = 25 �L, solução 400 ppb em CH2Cl2)

Coluna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)

TCOL: 5 min a 50°C / 20°C min-1 / 2 min A 320°C

Gás de Arraste: He @ 2 ml.min-1 Detector: FID

COLUNAS CAPILARESColunas Multicapilares

“Feixes” paralelos de colunas capilares

com dC convencional

- Eficiência próxima à das colunas convencionais- Capacidade similar à das colunas empacotadas- Colunas mais curtas: análises mais rápidas

Separação de explosivos em colunamulticapilar (OV-17,

1000 capilares x 6 m)1 - 2,6-DNT2 - 2,4-DNT3 - 2,4,6-TNT4 - 3,4,5-TNT5 - 2,3,4-TNT6 - RDX ?7 - tetryl

DETECTORESDefinições Gerais

Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluida de um analito

~ 60 detectores já usados em CG

~ 15 equipam cromatógrafos comerciais

4 respondem pela maior parte das aplicações

DCT TCDDetector por

CondutividadeTérmica

DIC FIDDetector porIonização em

Chama

DCE ECDDetector porCaptura de

Eletrons

EM MSDetector Es-

pectrométricode Massas

DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho

QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído

SIN

AL (S

)

RUÍDO (N)

= 3SN

RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra

Fontesde

Ruído

Contaminantes nos gases

Impurezas acumuladas no detector

Aterramento elétrico deficiente

DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho

LIMITE DE DETEÇÃO Quantidade de analito que gera um pico com S/N = 3 e wb = 1 unidade de tempo

Mesmo detector, nível de ruído e massa de analito MAS diferentes larguras de base:

wb

QMD = fDetector (sinal gerado, ruído)Largura do pico cromatográfico

Definindo limite de detecção como:

LD é independente da eficiência do sistema cromatográfico !

[QMD] =massa

(ng, pg ...)

[LD] = massa / tempo

(ng.s-1, pg.s-1 ...)

DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho

VELOCIDADE DE RESPOSTA Tempo decorrido entre a entrada do analito na cela do detector e a geração do sinal elétrico.

63,2% FSD

�

TEMPO

SIN

AL

Constante de Tempo, � : tempo necessário para o sinal chegar a 63,2 % FSD (full scale

deflection = fundo de escala) após a

entrada de amostra

A constante de tempo do sistema (detector + dispositivos de registro de sinal) igual ou menor a 10% da largura a

meia altura (w0.5 ) do pico mais estreito do cromatograma

� >> w0.5

t R medido > t R real

w medida > w real

Deformação no pico (cauda)

Diminuição do ruído (“damping”)

DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho

SENSIBILIDADE Relação entre o incremento de área do pico e o incremento de massa do analito

MASSA

ÁR

EA

Fator de Resposta, S: inclinação da

reta Área do pico x Massa do

analito

o mesmo incremento de massa causa um maior incremento de

áreaSensibilidadeS

Na ausência de erros determinados:

A = área do pico cromatográfico

m = massa do analito

DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho

FAIXA LINEAR DINÂMICA Intervalo de massas dentro do qual a resposta do detector é linear

MASSA

ÁR

EA

A partir de certo ponto o

sinal não aumenta mais linearmente

O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5

% da inclinação da reta na região linear:

MASSA

ÁREA

/ M

ASSA

0,95 S

1,05 S

DETECTORESClassificação

UNIVERSAIS:Geram sinal para qualquer

substância eluida.

SELETIVOS:Detectam apenas substânciascom determinada propriedade

físico-química.

ESPECÍFICOS:Detectam substâncias que

possuam determinado elementoou grupo funcional em suas

estruturas

DETECTORESDetector por Condutividade Térmica

PRINCÍPIO Variação na condutividade térmica do gás quando da eluição de um analito.

Cela de Detecção do DCT:

12

35

4

i1 Bloco metálico (aço)

2 Entrada de gás de arraste

3 Saída de gás de arraste

4 Filamento metálico (liga W-Re) aquecido

5 Alimentação de corrente elétrica para aquecimento do filamento

A taxa de transferência de calor entre um corpo quente e um corpo frio depende da

condutividade térmica do gás no espaço que separa os corpos

Se a condutividade térmica do gás diminui, a quantidade de calor transferido também diminui

- o corpo quente se aquece.

DETECTORESDetector por Condutividade Térmica

Configuração tradicional do DCT: bloco metálico com quatro celas interligadas em par - por duas passa o efluente da coluna e por duas, gás de arraste puro:

CELAS DA AMOSTRA

CELAS DE REFERÊNCIA

CO

RTE

SU

PER

IOR

CELAS DA

AMOSTRACELAS DE

REFERÊNCIA CO

RTE LATER

AL

Quando da eluição de um composto com condutividade térmica menor que a do gás de arraste puro:

Diferença de resistência

elétrica entre os filamentos de amostra e

referência

Filamentos nas celas de amostra

se aquecem

Resistência elétrica dos filamentos nas

celas de amostra aumenta

Filamentos nas celas de

referência não se aquecem

Resistência elétrica dos

filamentos nas celas de referência

fica constante

DETECTORESDetector por Condutividade TérmicaOs filamentos do DCT são montados numa ponte de

Wheatstone que transforma a diferença de resistência quando da eluição de amostra numa diferença de voltagem:

V Fonte de CC / Bateria (18 V a 36 V, típico)

F Ajuste da corrente nos filamentos

I Medida da corrente nos filamentos (100 mA - 200 mA, típico)

B1 B2 Balanceamento / ajuste de zero

R1 R2 Filamentos das celas de referência

A1 A2 Filamentos das celas de amostra

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DCT

SELETIVIDADE Observa-se sinal para qualquer subs-tância eluida diferente do gás de arraste = UNIVERSAL

SENSIBILIDADE / LINEARIDADE Dependendo da configuração particular e do analito: QMD = 0,4 ng a 1

ng com linearidade de 104 (ng - dezenas de �g)

VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE O sinal é proporcional à concentração do analito no gás de arraste que

passa pela cela de amostra.

VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE CONSTANTE DURANTE A

ELUIÇÃO

VARIAÇÃO DA VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE DURANTE A

ELUIÇÃO

Fc = 0

Com DCT, a área dos picos cromatográficos é MUITO dependente da vazão do gás de arraste !!!

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DCTNATUREZA DO GÁS DE ARRASTE Quanto maior a diferença �� entre a condutividade térmica do gás de arraste puro, �A, e do analito, �X, maior a resposta.

QUANTO MENOR A MASSA MOLECULAR DO GÁS DE ARRASTE, MAIOR A RESPOSTA

Como: (M = massa molecular)

Gás de arraste com DCT: He ou H2

outro gás

1 2

He ou H2

1 2

1 Usando He ou H2 como gás de arraste, ��é maximizado: MAIOR RESPOSTA

2 Com outros gases, eventualmente�X > �A: PICOS NEGATIVOS

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DCT

FATORES DE RESPOSTA Quanto menor a condutividade térmica do analito, maior o sinal.

Quantidades iguais de substâncias diferentes geram picos cromatográficos com áreas diferentes !!!

Os fatores de resposta dependem da condutividade térmica do analito

Mistura de quantidadesequimolares de:

Etano � � = 17,5

Clorofórmio � � = 6,0

Etanol � � = 12,7

C2H6

CHCl3C2H5OH

�X ��

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DCT

TEMPERATURAS DE OPERAÇÃO Quanto maior a diferença entre a temperatura dos filamentos e do bloco

metálico maior a resposta.

Temperatura do filamento, TF: entre 300oC e 350oC. É função da corrente de alimentação dos filamentos, i.

i TF Sinal

Limitações:- Correntes excessivas podem fundir o filamento

(Ø típicos do filamento = 20 �m)- Diminuição do tempo de vida útil dos filamentos

(oxidação por traços de O2 no gás de arraste)

Temperatura do bloco, TB: mantida tão baixa quanto possível

TB SinalLimitação:

- Temperaturas excessivamente baixas podem provocar a condensação de analitos nas celas

(erros analíticos, danos aos filamentos)

DETECTORESDCT: Aplicações

1 Separação e quantificação de compostos que não geram sinal em outros detectores (gases nobres, gases fixos)

2 Por ser um detector não-destrutivo, pode ser usado em CG preparativa ou detecção sequencial com dois

detectores em “tandem”

Coluna: CP Sil 5CB(50 m x 0.32 mm x 5 µm)

Gás de Arraste: He @ 3 ml.min-1

TCOL: 40°C Detector: DCT

1 N2 2 CH4

3 CO2 4 n-C2

5 NH3 6 n-C3

7 i-C4 8 n-C4

Separação de Gases Fixos e Hidrocarbonetos:

DETECTORESDetector por Ionização em Chama

PRINCÍPIO Formação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio

O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 não

existem íons, ela não conduz corrente elétrica.

Quando um composto orgânico elui, ele também é

queimado. Como na sua queima são formados íons, a

chama passa a conduzir corrente elétrica

DETECTORESDetector por Ionização em Chama

COLETOR

FLAME TIP

BLOCO

AR

H2

COLUNA

O ar e o H2 difundem para o interior do coletor, onde se

misturam ao efluente da coluna e queimam:

Uma diferença de potencial elétrico é aplicada entre o flame

tip e o coletor - quando se formam íons na chama, flue uma

corrente elétrica:

DETECTORESDetector por Ionização em Chama

Química da Chama de Hidrogênio:

Incandescência

Reação

Quebra

Estrutura da chamatrês regiões básicas

Região de quebra Mistura dos gases, pré-aquecimento, início da quebra das moléculas de H2, O2 e dos analitos.Zona de reação Reações exotérmicas com produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e íons CHO+ (analito).Zona de incandescência Emissão de luz por decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visível).

Queima de substâncias com ligações C-H

CH + O � CHO+ + e-

1 íon formado a cada ~105 átomos de C queimados

Queima de H2Formam-se apenas

radicais !!!

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DIC

SELETIVIDADE Seletivo para substâncias que contém ligações C-H em sua estrutura química.

(como virtualmente todas as substâncias analizáveis por CG são orgânicas, na prática o DIC é UNIVERSAL)

Compostos que NÃO produzem resposta no DIC:Gases nobres

H2, O2, N2

CO, CO2, CS2

CCl4, peralogenados

NH3, NxOy

SiX4 (X = halogênio)

H2O

HCOOH, HCHO *

SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD típicas = 10 pg a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a mg)

DIC

DCT N2

CH4

CO2

O2

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DIC

VAZÕES DE GASES Além do gás de arraste, as vazões de alimentação de ar (comburente) e

hidrogênio (combustível) devem ser otimizadas.

Gráficos Sinal x Vazão de Gases típicos:

SIN

AL

150 300 450 600 15 30 45 60

AR H2

O sinal se mantém aproximadamente constante em uma larga faixa de vazões de ar e H2

VARIAÇÕES NAS VAZÕES DE AR E H2 AFETAM APENAS MARGINALMENTE O SINAL = MAIORES

REPRODUTIBILIDADE E REPETIBILIDADE

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DIC

TEMPERATURA DE OPERAÇÃO O efeito da temperatura sobre o sinal do DIC é negligenciável.

TRATAMENTO DE SINAL Por causa da baixa magnitude da corrente elétrica gerada (pA a nA) ela deve ser amplificada para poder ser registrada.

1

23

4

Diagrama eletrônico

simplificado de um DIC

1 Flame tip / Chama / Coletor

2 Bateria ou Fonte de CC Voltagens de operação normais de 200 V a 300 V (não variável - valor depende da geometria específica do detector).

3 Amplificador Eletrométrico Deve amplificar o sinal e converter uma corrente variável em uma voltagem variável (pA � mV).

4 Saída de Registro de Sinal

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DIC

FATORES DE RESPOSTA O fator de resposta de um determinado composto é aproximadamente proporcional ao número átomos de carbono. Presença de heteroelementos

diminui o fator de resposta.

Número Efetivo de Carbonos (NEC) Prevê com ~20% de aproximação o fator de resposta de um composto.

Átomo XC alifático +1,00

C aromático +1,00C olefiníco +0,95C carbonila +0,00

O álcool prim. -0,60Cl alifático -0,12

(X = Contribuição de cada átomo ao NEC)

C2H6 � NEC = 2,00

C2H5OH � NEC = 1,40

CH3CHO � NEC = 1,00

Mistura com quantidadesequimolares de:

DETECTORESDetector de Nitrogênio - Fósforo

Modificação do DIC altamente seletiva para compostos orgânicos nitrogenados e fosforados

Pérola de sal de metal alcalino:RbCl (normal), KCl

Seletividade S para fosforados ou nitrogenados: 10.000 x - 100.000 x em relação a hidrocarbonetos similares

QMD = 0,4 pg a 10 pg (N) e 0,1 a 1 pg (P)

Pesticidas Triazínicos usando DNP:

1 Desetilatrazina2 Desisopropilatrazina3 Atraton4 Atrazina5 Trietazina6 Secbumeton7 Sebutilazina8 Simetrin9 Dipropretrina10 Dimetametrina11 Metroprotrina

(100 pg cada)

DETECTORESDetector por Captura de Eletrons

PRINCÍPIO Supressão de um fluxo de eletronslentos (termais) causada pela sua absorção por espécies eletrofílicas

Um fluxo contínuo deeletrons lentos é

estabelecido entre umanôdo (fonte radioativa

��-emissora) e um catodo.

Na passagem de uma substância eletrofílicaalguns eletrons são

absorvidos, resultando uma supressão de corrente elétrica.

DETECTORESDetector por Captura de Eletrons

12

3

4

5

1 Anôdo (fonte radioativa � - emissora)

2 Saída de gases 3 Catodo

4 Cavidade 5 Coluna cromatográfica

DETECTORESDetector por Captura de Eletrons

Mecanismo de Captura de Eletrons

1 Geração de eletrons lentos pela interação entre a ra-diação ���moléculas do gás de arraste G e molécu-las de bloqueador (“quencher”) Q

��- + G � G + + e - + e* � energia

��- + G � G* + Q � G + e - + Q � energia

2 Eletrons lentos são capturados pela espécie eletro-fílica AB

AB + e - � AB - + energia

O decréscimo na corrente elétrica fluindo pela cela de detecção é proporcional à concentração a da espécie

absorvente no gás de arraste

Ib corrente de repouso

Ie corrente na eluição do analito

K constante de captura

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DCEFONTE RADIOATIVA O anôdo deve estar dopado

com um isótopo radioativo � - ou �- emissor

Emprego universal em DCE comerciais:

3H (�-, 0,02 MeV)

Sob a forma de Ta3H3

Tdet deve ser < 225oC

Maior sensibilidade

63Ni (�-, 0,06 MeV)

Usado como 63Ni 0

Maior linearidade

Útil até ~400oC

85Kr, 90Sr, 99Tc, 147Pm, 241Am, 226RaRaramente usados:

63Ni preferido em equipamentos

modernos

- Maior durabilidade (t1/2 = 100 a x 12 a para 3H)

- Maior estabilidade térmica

- Menor risco de uso (radioatividade)

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DCE

TEMPERATURA DO DETECTOR Dependência do sinal com temperatura de operação bastante significativa

Variação de � 3oC na temperatura

Erro de ~ 10% na área dos picos

Magnitude e sinal do erro depende do composto analisado !

POLARIZAÇÃO DOS ELETRODOS Vários modos de polarização possíveis

VOLTAGEM PULSADA Menos anomalieas elétricas: maior sensibilidade e linearidade.

VOLTAGEM CONSTANTE Pouco usada modernamente - picos cromatográficos podem ser deformados.

TEMPERATURA DO DCE DEVE SER RIGIDAMENTE CONTROLADA

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DCE

GÁS DE ARRASTE Funcionamento do DCE é muito dependente da natureza do gás de arraste

MAIS USADOS:N2

Ar + 5% CH4

Geram eletrons lentos quando bom-

bardeados com ��-

O gás deve ser o mais puro possível !!!(traços de H2O e O2 comprometem o sinal do DCE)

VAZÃO DE GÁS DE ARRASTE Sinal depende dire-tamente da vazão de gás fluindo no detector

SinalF

!Adsorção de contaminantes sobre os eletrodos causa

deformação nos picos

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DCE

SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD = 0,01 pg a 1 pg (organoclorados), linearidade ~ 104 (pg a ng)

10 fg Lindano (C6H6)�-ECD HP-6890

PESTICIDAS1 tetracloro-m-xileno2 ��- BHC3 Lindano4 Heptachlor5 Endosulfan6 Dieldrin7 Endrin8 DDD9 DDT

10 Metoxychlor10 decaclorobifenila

~250 fg cada analito

O DCE É O DETECTOR PREFERENCIAL PARA ANÁLISES DE TRAÇOS DE ORGANOALOGENADOS E

SIMILARES

DETECTORESCaracterísticas Operacionais do DCE

SELETIVIDADE / FATORES DE RESPOSTA Valores de S maximizados para compostos eletrofílicos

hidrocarbonetos e esteres alifáticos, dienos

álcoois, cetonas e aldeídos alifáticos, aminas, nitrilas, mono - Cl, mono - F

enóis, oxalatos, mono - Br, di - Cl, hexa - F

tri - Cl, cloretos de ácidos, alquil - Pb, anidridos

mono - I, di - Br, tri - Cl, mono - nitro, CS2

di - I, tri - Br, poli - Cl, di - nitro, 1,2 - dicetonas,fumaratos, organo - Hg

S típicos (clorobenzeno: S = 1)

Comparando-seorganoalogenados:

I > Br > Cl > F

Terc > Sec > Prim

Tri > Di > Mono

� > � > �

trans > cis

DETECTORESDCE: Aplicações

Contaminantes em ar atmosférico - detecção paralela DIC + DCE

DIC

DCE

1, 2, 3 - Hidrocarbonetos aromáticos4, 5, 6 - Hidrocarbonetos clorados

ANÁLISE QUALITATIVAConceitos Gerais

Fontes de Informações Qualitativas

RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analitopara sua identificação

DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas

Identificação individual das espécies contidas na amostra

Determinação da identidade da amostra propriamente dita

Aplicações Qualitativas

de CG

Para análise qualitativa confiável por CG é recomendável combinação de dados

provenientes de pelo menos duas fontes

ANÁLISE QUALITATIVATempos de Retenção

t’R = fInterações analito / FE

Pressão de vapor do analitoCondições operacionais (TCOL, FC ...)

Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante

AMOSTRA

PADRÃO

Comparação decromatogramas

da amostra e de uma

solução padrão do analitosuspeito

ANÁLISE QUALITATIVATempos de Retenção

Identificação por t’R é muito pouco confiável:

Dependência com FC e TCOL Variações nestas condições afetam sensivelmente os t’R

VARIAÇÃO DE � 1% NO t’R

�TCOL = � 0,1%

�FC = � 1%

Sobrecarga na coluna Aumento excessivo na massa de material eluido deforma o pico croma-tográfico e altera o seu t’R

MAS

SA

Saturação da coluna

cromatográfica com aumento de

massa eluidaprovoca “cauda frontal” no pico

ANÁLISE QUALITATIVATempos de Retenção

Comparação de t’R usando dopagem (“spiking”) da amostra com o analito suspeito: aumento da

confiabilidade de identificação.

Amostra complexa: incerteza nos t’R

medidos pode levar a identificação errônea

Comparação com cromatograma da

amostra dopada permite identificação mais

confiável do desconhecido

ANÁLISE QUALITATIVAÍndice de Retenção de Kovàts

FUNDAMENTO Os t’R isotérmicos para uma série homóloga de compostos dependem logaritmicamente

do número de átomos de carbono na cadeia.

Separação isotérmica de uma mistura de n-alcanos

(n-C4, n-C5, ... n-C16)

Um gráfico de log(t’R) em função do número de

átomos de carbono doanalito nC é LINEAR

ANÁLISE QUALITATIVAÍndice de Retenção de Kovàts

O índice de retenção de Kovàts I para um analito é definido por:

t’R (A) Tempo de retenção ajustado do analito A

t’R (N) Tempo de retenção ajustado do n-alcano com N carbonos

t’R (n) Tempo de retenção ajustado do n-alcano com n carbonos (n = N + 1)

Ex.: um analito com I = 874 teria um tempo de retenção ajustado equivalente ao de um n-alcanohipotético com cadeia de 8,74 átomos de carbono

Interpolação logarítmica dos

t’R

ANÁLISE QUALITATIVAÍndice de Retenção de Kovàts

REPETIBILIDADE - REPRODUTIBILIDADE Os efeitos de TCOL e FC nos índices de Kovàts são pequenos

ANALITO �I/�TCHCl3 +0,02 %

CH3CH2OH -0,12 %CH3CHO -0,05 %

CH3(CO)CH3 -0,04 %

Dependência de I para algumas substâncias em

uma coluna apolar na faixa de TCOL = 70oC a

TCOl = 130oC

Identificação por índices de retenção é muito confiável que comparações baseadas em t’R

ÍNDICE DE RETENÇÀO DE KRATZ Para programação linear de temperatura a relação entre t’R e nC é linear:

cálculo dos índices de retenção é modificado

ANÁLISE QUALITATIVARetention Time Locking (RTL)

PRINCÍPIO Em cromatógrafos com: controles pneumáticos e térmicos microprocessados, injetores automáticos e colunas cromatográficas de qualidade

excepcional é possível alta repetibilidade nos t’R

CORRIDA #1

TCOL (1)

FC (1)

Coluna A

CORRIDA #2

TCOL (2)

FC (2)

Coluna B

O software RTL (Hewlett-Packard) automaticamente ajusta as condições operacionais em um segundo CG para

reproduzir os t’R obtidos em um primeiro equipamento

Cromatogramas obtidos em diferentes

equipamentos e colunas com condições

operacionais da segunda corrida ajustadas pelo

software de RTL

ANÁLISE QUALITATIVAMétodos de Detecção Qualitativos

Métodos de detecção que fornecem informações qualitativas sobre os analitos eluídos:

Cromatografia Gasosa com DeteçãoEspectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho (CG-EIV)

Cromatografia Gasosa com DeteçãoEspectrométrica de Massas (CG-EM)

Cromatografia Gasosa com DeteçãoEspectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA)

Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção

ANÁLISE QUALITATIVAEspectrometria de Massas

PRINCÍPIO A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão característico da espécie química.

1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact = EI) ou íons (chemical ionization = CI):

ABCDE + e- � ABCDE.+ + 2 e-

2 O íon formado se fragmenta:ABCDE.+ � AB. + CDE+

ABCDE.+ � AB+ + CDE.

ABCDE.+ � A+ + BCDE.

3 Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados:

ABU

ND

ÂNC

IA

MASSA / CARGA

O gráfico do número de íons formados em função da razão Massa / Carga dos íons é o ESPECTRO DE MASSAS do analito

ANÁLISE QUALITATIVAEspectrômetro de Massas

1

2

3

4

1 Câmara de Ionização Eletrons gerados por um filamento aquecido bombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) são repelidos pelo eletrodo positivo e conduzidos ao separador magnético.

2 Saída de Vácuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vácuo (natm).

3 Separador Magnético A ação do campo magnético deixa apenas íons com determinada razão Massa / Carga atravessar esta área do equipamento.

4 Detector Uma válvula fotomultiplicadora ou um fotodiodogera um sinal elétrico proporcional ao número de íons que incide sobre o elemento.

ANÁLISE QUALITATIVAEspectro de Massas

m/Z = 118

m/Z = 80

m/Z = 79

- CO

- (CO + H)

m/Z = 90

20 40 60 80 100 1200m / Z

ANÁLISE QUALITATIVAAcoplamento CG - EM

Interface cromatógrafo - espectrômetro:

CG EM

Vácuo

Separador MolecularO gás de arraste leve

(He) difunde mais rapidamente que o

analito e tende a ser drenado para o vácuo.

Câmarade Ionização

ColunaCapilar

Interface Capilar DiretaCom colunas capilares a vazão baixa de gás de

arraste pode ser drenada pelo sistema

de vácuo.

ANÁLISE QUALITATIVAAcoplamento CG - EM

Sistema de Controle e Aquisição de Dados:

É MANDATÓRIO que sistemas CG-EM sejam totalmente controlados por microcomputador.

Sistema de Controle e Aquisição de Dados:

1 Gerencia e monitora o funcionamento dos módulos deCG e EM.

2 Coleta e arquiva espectros de massa em intervalosregulares de tempo e constroi o cromatograma.

3 Após a corrida, compara espectros coletados combases de dados para identificação dos eluatos.

COMPUTADORES RÁPIDOS E COM GRANDE CAPACIDADE DE ESTOCAGEM DE DADOS

ANÁLISE QUALITATIVACG-EM: Geração do Cromatograma

Espectros de massas completos coletados e arquivados em intervalos regulares de tempo

Geração do cromatograma a partir dos espectros:

CROMATOGRAMA DE ÍONS TOTAIS (TIC = To-tal Ion Chromatogram)

Para cada espectro o número total de íons detectados na faixa de massas varrida é somado e plotado em

função do tempo, gerando o cromatograma.

MONITORAMENTO DO ÍON SELECIONADO (SIM = Single Ion Monitoring)

Seleciona-se um fragmento resultante da fragmentação da espécie de interesse. Gera-se o cromatograma

plotando-se o número de íond detectados com a massa desse fragmento em função do tempo.

TICUniversal

Similar a DIC

SIMSeletivo

Maior Sensibilidade

ANÁLISE QUALITATIVACG-EM: TIC x SIM

Aroma de polpa industrializada de cajá após extração por SPME

TICAparecem os picos correspondentes a todas substâncias

eluídas

SIM (m/z = 149)Cromatograma

construido a partir dos mesmos dados acima,

mas apenas usandofragementos com

massa = 149 (ftalatos: plastificante)

ANÁLISE QUALITATIVAIdentificação de Eluatos

TEMPO

CO

NTA

GEN

SMASSA / CARGA

CO

NTAG

ENS

1 Seleção manual ou automática do espectro de massa correspondente a um eluato.

2 Interpretação manual do espectro e / ou com-paração automática com biblioteca de espectros padrão do equipamento.

ANÁLISE QUALITATIVAIdentificação de Eluatos

Busca automática em bibliotecas de espectros: comparação estatística ( Probability Based Matching )

BIBLIOTECA DEESPECTROS

ESPECTRODESCONHECIDO

PBMLista com possíveis

candidatos + porcentagem de confiabilidade

# NOME FÓRM. %1 1-dodeceno C12H24 992 1-dodecanol C12H26O 913 ciclododecano C12H24 914 2-dodeceno C12H24 665 1-undeceno C11H22 356 8-metil-3-undeceno C12H24 32

PBM de um eluato“desconhecido”

(1-dodeceno)

LIMITAÇÕES:

Identificação pouco confiável de es-pectros muito simplesLimitada pelo tamanho da base de dados (NIST = 66.000 espectros)Diferenças entre espectros gerados por diversos EM

ANÁLISE QUALITATIVAEmissão Atômica em Plasmas

PRINCÍPIO A amostra é fragmentada num plasma, os fragmentos são excitados e emitem luz ao retornarem aos seus estados fundamentais.

1 Amostra é fragmentada ao colidir com moléculas excitadas do gás de suporte do plasma.

ABCD + Hem � A+ + B + CD + He + e-

2 Fragmentos são excitados eletronicamente.

A+ + B + CD + Hem � A+* + B* + CD* + He

3 Ao retornarem aos seus estados fundamentais os fragmentos excitados emitem luz em comprimentos de onda característicos.

A+* � A+ + h�1B* � B + h�2

CD* � CD + h�3

O MONITORAMENTO DA EMISSÃO NOS COMPRIMENTOS DE ONDAS CARACTERÍSTICOS DE CADA FRAGMENTO GERA CROMATOGRAMAS ELEMENTO-ESPECÍFICOS

ANÁLISE QUALITATIVAGeração e Sustentação de Plasmas

PLASMA Gás ionizado por aplicação de uma descarga elétrica e sustido por um campo elétrico oscilante

Eletrons da descarga elétrica colidem com o gás

gerando íons

Íons formados são acelerados pelo campo elétrico aplicado gerando continuamente mais

íons e espécies excitadas

Gás de Suporte: HÉLIO (espécies formadas tem energia suficiente para excitar átomos e fragmentos

de não metais)

Sustentação: MICROONDAS (outros tipos de campos elétricos oscilantes não mantém plasmas estáveis de

He a pressão atmosférica de forma conveniente)

ANÁLISE QUALITATIVAEspectro de Emissão Atômica

Mistura de raias de emissão atômicas e moleculares de frag-mentos do analito e raias de emissão do plasma e impurezas

200 nm 800 nm�

n-HexanoFragmentos:

C2 CNOH NH

456 nm 566 nm �

FósforoBromoCloro

Naled (C4H7Br2Cl2O4P)

ANÁLISE QUALITATIVAEsquema Típico de um CG-DEA

1 Cromatógrafo Gasoso

2 Alimentação de Gás de Suporte do Plasma (He)

3 Linha de Transferência (acoplamento CG - DEA)

4 Cavidade Ressonante (geração do plasma)

5 Lente de Focalização

6 Monocromador / Policromador

7 Detector de Luz (fotomultiplicadora / diode array)

8 Amplificação / Digitalização de Sinal

9 Computador

ANÁLISE QUALITATIVADEA: Geração de Plasma

Uma cavidade ressonante focaliza potência gerada por uma fonte de microondas no interior de uma cela de detecção por

onde passa o gás de suporte.

CELA DE DETECÇÃO

PLASMA

CABO DE ALIMENTAÇÃO

DE MICROONDAS

CAVIDADE RESSONANTE

He

Cavidade Ressonante Beenaker TM010:

Permite plasmas de He estáveis a pressão atmosférica e potências de microondas < 100 W

CELA DE DETECÇÃO Tubo de material isolante elétrico e altamente refratário (quartzo, alumina, BN)

ANÁLISE QUALITATIVAInterface CG - DEA

Plasmas de He se extinguem pela passagem de grandes quantidades de material (~ 1 � L de líquido vaporizado)

Interface para colunas empacotadas:

COLUNA

He

CELA

PURGA

VÁLVULA DIVERSORA

Antes de ser misturado ao He,

o efluente da coluna passa por

uma válvuladiversora

Quando da eluição de grandes

quantidades deanalito o fluxo da coluna é desviado

para a purga

Colunas capilares: não há necessidade de diversão.