Cromatografia Liquida CLAEprofessora ; adrianne mendona

O que Cromatografia ?Definio:

A cromatografia uma tcnica de separao na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase mvel e a outra estacionria.A natureza qumica e fsica dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenmeno de migrao diferencial .

O que Cromatografia a Lquido HPLC?Definio:Na tcnica de cromatografia a lquido a fase mvel um lquido e a fase estacionria um slido .O processo cromatogrfico acontece na fase lquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos.

Instrumentao para HPLC

CLAE -HPLCFase mvel(amostra)Fase estacionria(Componentes retidos)Migraes diferenciaisAnalitomov AnalitoestK = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partio

INSTRUMENTAOpumpinjectorcolumnovendetectorOne pump used to control 4 reservoirs; mixing is donebefore pump.MIXERdata processorFase mvel

Instrumentao para HPLCCOLUNA

Componentes de um Cromatgrafo a Lquido HPLCUm cromatgrafo a lquido composto de 3 partes principais :Injetor : o dispositivo que tem a funo de introduzir a amostra na fase mvel ;Coluna cromatografia : o dispositivo que tem a funo de separar os componentes da amostra ;Detector : o dispositivo que tem a funo de detectar os componentes eludos da coluna cromatogrficas

Componentes auxiliares de um HPLCBomba :

o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a presso da fase mvel ( solvente ); composta de um ou mais pisto acoplados a um sistema de vlvulas.Fornece uma alta presso.

BOMBA Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)

Opes: Simples, gradiente binrio, quaternrio

Mede a presso sobre o sistema

Manuteno preventiva (selos, pistes, check valves, etc.)

Componentes auxiliares de um HPLCVlvula de purga: o dispositivo que permite a troca rpida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno.Misturador: o dispositivo que homogeneza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluio .

Fase estacionria

Colunas CromatogrficasFases estacionrias :Slica- C8 Slica- C18 Slica- C18 ( ODS)Slica- NH2Slica- DiolSlicaTroca InicaResinas DVB-ST Sulfonadas CaResinas DVB-ST porosas

Pr-Coluna: o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analtica .Tem como objetivo reter slidos e em muitos casos reter materiais que por reaes qumicas podem precipitar sobre a fase estacionria.

SLICA (suporte + usado):

Resistncia mecnica Variedade de forma, tamanho de partculas e poros

- Instabilidade frente a fases mveis cidas ou bsicas - Superfcie no homogneaCOLUNAS CROMATOGRFICAS

SLICA GRUPOS SILANISLIVRESGEMINALVICINAISinfluenciam no grau de acidez da slica

Fase Estacionria

A fase estacionria mais utilizada composta de partculas microporosas de slica. So permeveis ao solvente e possuem uma rea superficial de varias centenas de metros por gramas.No deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.

MODIFICAO SUPERFICIAL- QUIMICAMENTE LIGADAS

- HBRIDAS

- RECOBERTAS COM POLMEROS ORGNICOS

Fases Quimicamente LigadasC18 (ODS) forteC8amostraamostraamostraC4mdiafraca

POLIMRICAS Pr-hidrlise do agente silanizante- Rede tridimensional mais espessa- Maior estabilidade- Dificuldade de controlar reaes entrecruzamento

FASES ESTACIONRIAS HBRIDAS Matriz orgnica-inorgnica- Mais estveis do que as quim. ligadas convencionais- Menor quantidade de grupos de silanis- Ultra-fast cromatografiaTetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano(RO)4Si + n(RO)3SiR + (1,5n+2)H2O SiO2 (RSiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH

RECOBRIMENTO COM POLMEROS RESISTNCIA MECNICA DA MATRIZ INORGNICA

- SELETIVIDADE E INRCIA QUMICA DOS POLMEROS ORGNICOS

- Maior recobrimento dos stios ativos do suporte- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polmeros, espessura dos filmes, rea superficial e estrutura de poros do suporte) Poli(etileno) Poli(butadieno) Poli(estireno) Poli(dimetilsiloxano) Poli(metiloctilsiloxano) Poli(metiloctadecilsiloxano) Politeres Polissacardeos Poliaminas Polinucleotdeos Poliamidas ProtenasSlicaZircniaTitniaAlumina

PRINCPIOS DE SEPARAOINTERAO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILBRIO)INTERAES DE VAN DER VALLS

LIGAES DE HIDROGNIO

INTERAES DIPOLO-DIPOLO

ATRAO ELETROSTTICA

Fases estacionriasInteraesC8PHC2van der Waalsvan der Waalsvan der Waals

Fase Estacionria

Fase Estacionria

Processo de EluioDefinio:Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionria.Srie eluotrpica Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.

Fora eluente: uma medida da energia de adsoro do solvente

Cromatografia com fase normal: Utiliza uma fase estacionria polar e um solvente menos polar.Cromatografia com fase reversa: Utiliza uma fase estacionria apolar ou fracamente polar e um solvente polar.

DETECTORES - ClassificaoUNIVERSAIS:Geram sinal para qualquersubstncia eluda.SELETIVOS:Detectam apenas substnciascom determinada propriedadefsico-qumica.Dispositivos que geram um sinal eltrico proporcional quantidade eluda de um analito

DETECTORESUVFLUORESCNCIAMSELETROQUMICOIRPOLARMETRO

mais comum, usado na CLAE. Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta. So bons para a eluio por gradiente com solventes no-absorventes.Detectores Ultra violeta:

Princpio: Absoro de luz ultravioleta ou visvel pela amostra, quando nela passa radiao eletromagntica.

Seletivo (molculas com cromforos)

Comprimento de onda () fixo

pode ser selecionado (190 600 nm)

Varredura (DAD)

Solventes tambm absorvemUltra violeta (UV-visvel):guaMeOHACNAcetonaHexanoClorofrmioTHF 190 210 200 330 200 245 215 nmSolvente

Princpio: Emisso de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiao UV

Seletivo (molculas que fluorescem)

Exemplo: Aromticos policclicos e duplas ligaes conjugadas

Mais sensvel que UV por ser emisso

Podem ser feitas reaes de derivao pr ou ps-coluna para que o analito se torne fluorescente.

Reagentes de derivatizao comuns: fluorescamina e cloreto de dansilaFluorescncia:

Detectores por ndice de Refrao:

Princpio: Mede a diferena no ndice de refrao da fase mvel e do eluente vindo da coluna

No- seletivo

Sensvel a variaes de: Temperatura Presso Fluxo Composio fase mvel

Baixa sensibilidade e difcil de estabilizar

Muito usado em cromatografia preparativaIndice de refrao:

Princpio: Determinao da massa de solutos atravs da ionizao e determinao da relao massa-carga (m/z)

Destrutivo

Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)

Interfaces de ionizao mais comuns: ESI, ApCI

Anlise de micro e macromolculas.

Alta sensibilidadeEspectrometria de massas:

MODOS DE SEPARAONORMAL

REVERSO

TROCA INICA

MODO NORMALMECANISMO DE INTERAO:ADSOROFase estacionria: + POLAR que a fase mvel

Fase mvel: mistura de solventes orgnicos Colunas: Slica, Ciano, fenil, amino

MODO REVERSOINTERAO DA PARTE NO POLAR DOSOLUTO E A FASE ESTACIONRIAHIDROFOBICIDADEFase estacionria: APOLARFase mvel: H2O, MeOH, CH3CN REA DE C SOLUTO RETENO

Tempo de Reteno e HidrofobicidadeOHOHC18 (ODS) forteInteraofraca

HidrofobicidadeSe a amostra possuiCH3CH2CH2--- : cadeia carbnica : grupo aromtico

Se a amostra possui-COOH : grupo carboxlico-NH2 : grupo amino-OH : grupo hidrxi

A hidrofobicidade ser forteA hidrofobicidade ser fraca

TROCA INICAMECANISMO DE INTERAO :ATRAO ELETROSTTICAFase estacionria: Resinas trocadoras de ons (catinicas / aninicas)

Fase mvel: Tampo (pH, , fora inica, temperatura)Aninicas: amnio quaternrio, aminasCatinicas: cido sulfnico, cido carboxlico

Microsseringas para InjeoLQUIDOS Capacidades tpicas: 1 L, 5 L e 10 Lmbolocorpo (pirex)agulha (inox 316)Obs: Seringa de HPLC

Seqncia

Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutosCondicionamento da coluna com fase mvelMonitoramento da linha de baseInjeo das amostras

PARMETROS CROMATOGRFICOSFATOR DE RETENO (k)

FATOR DE SEPARAO ()

NMERO DE PRATOS (N)

CromatogramatRtMTEMPOSINAL

Efeitos do alargamento excessivo de picos:EFICINCIA Capacidade de eluio com o mnimo de disperso do analito.

w2 na linha de baseBANDA CROMATOGRFICA

Representa a capacidade de distribuio do soluto nas fasesNo leva em conta o tempo morto da colunaFATOR DE RETENO (k)tr = tempo reteno analitoto = tempo morto da coluna

Se: t0 = 1,5 mint1 = 3,5 mint2 = 4,2 mink1 = 1,3k2 = 1,8

FATOR DE SEPARAO ()AVALIA A SELETIVIDADE

Se:

k1 = 1,3 k2 = 1,8

= 1,38 k1 = 1,3k2 = 1,8 = 1 no houve separao

NMERO DE PRATOS (N)Mede a eficincia do sistemaDepende da coluna, da amostra e do fluxo da fase mvel

Resoluo funo da Seletividade ()Eficincia da coluna (N)Fator de reteno (k)

ResoluoRs = 0.8

FASE MVEL Solvente grau HPLC (alta pureza)

Filtrao (membrana 0.45 m)

Degaseificao do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automtico)

Purgar os solventes

MODOS DE ELUIOISOCRTICO:Uma nica composio de fase mvel ao longo da corrida; a composio ds FM CONSTANTE.

GRADIENTE: - Variao da composio da fase mvel (FM) ao longo da corrida.- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)

Mudana no modificador orgnico[ MeOH/H2O ]par crtico : c,d

[ THF/H2O ]par crtico : a,b[ MeOH/THF/H2O ]

COLETA/OBTENO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)

ESTOCAGEM E PREPARAO (ESTABILIDADE)

EXTRAO:

- LQUIDO-LQUIDO - LQUIDO-SLIDO - SOXHLET - FLUDO SUPER CRTICO - EXTRAO EM FASE SLIDA (EFS / SPE)PREPARAO DA AMOSTRA

Filtrao necessria, previamente injeo, usualmente com membranas de 0.45 mm mesh para a remoo do material insolvel.

DESENVOLVIMENTO DE MTODOFixas as condies operacionais, o tempo de reteno ajustado de um analito uma constante

ANLISE QUANTITATIVAA rea do pico proporcional a massa que passa pelo detectorClculo de rea:

ANLISE QUANTITATIVASe ambos os compostosrespondessem igualmente aodetector poderamos usar a relao:

Massa A rea AMassa B rea B

No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos d reas diferentes, em funo da resposta ao detector.

PADRONIZAO EXTERNAEste mtodo baseia-se na comparao de uma certa substncia presente na amostra com seu respectivo padro.Primeiramente deve-se construir um grfico de (rea x concentrao) da substncia padro:

PADRONIZAO EXTERNA Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da rea obtida no cromatograma tira-se do grfico traado a concentrao dessa substncia na amostra. importante salientar que o grfico deve ser construdo com concentraes prximas da concentrao esperada na amostra. Outro fator muito importante que o volume injetado do padro tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razo este tipo de padronizao mais conveniente quando se utiliza vlvulas para injeo da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado. Neste mtodo no so usados fatores de correo para corrigir as reas, por haver comparao da mesma substncia

PADRONIZAO INTERNA Uma quantidade de amostra pesada juntamente com um padro de massa conhecida. Esta mistura injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a rea corrigida de cada componente que se deseja determinar com a rea corrigida do padro adicionado, do qual se conhece a concentrao.

Mx = massa do componente xMa = massa da amostraMp = massa do padroAp = rea do padroAx = rea corrigida do componente x

PADRONIZAO INTERNA A escolha do padro deve ser feita, sempre que possvel, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, no devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar prximo ou entre os picos da amostra. Deve ser tambm uma substncia pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado massa pesada Este mtodo possibilita a determinao de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes.

APLICAES

APLICAES cont

APLICAES cont

Referncias TRINDADE, Magno Aparecido Gonalves; RINALDO, Daniel; VILEGAS, Wagner and ZANONI, Maria Valnice Boldrin. Determinao de corantes marcadores do tipo azo e antraquinona em combustveis por cromatografia lquida com deteco eletroqumica. Qum. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042. AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIO DE LAVRAS, MINAS GERAIS BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thas Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jssika Mara Martins Ribeiro6

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