Cultura de células de DRG’s e transdução

viral

Faculdade de Medicina da Universidade do PortoInstituto de Embriologia e Histologia – Disciplina de Biologia Molecular e

Celular

Porto - 2004

Realizado por:

Francisco A. F. Ferro de Beça

Francisco M. Pinto da Costa

Luís F. Silva Machado

Rita M. Marinho Pires

Orientado por:

Dra. Joana Gomes

Objectivos

1. Estabelecer uma cultura de células;

O que é?É um tipo de cultura de tecidos que implica a desagregação (mecânica ou enzimática) do tecido original e em que as células são cultivadas numa camada aderente, num substrato sólido ou em suspensão em meio de cultura.

Tipos de cultura de tecidos (adaptado de Freshney, 2000).

Cultura de células

Limitações

•Necessidade de operadores experientes (com conhecimentos da técnica asséptica, etc);

•Custo do esforço e material (baixa quantidade de células produzidas para o material e esforço gasto);

•Perda de características fenotípicas;

•Necessidade do uso de marcadores devido à perda de características fenotípicas;

•Instabilidade das células (sobretudo em linhas celulares imortais).

Cultura de células

Vantagens

•Controlo das condições ambientais (pH, temperatura, concentração de O2 e CO2, etc);

•Obtenção de células com boa homogeneidade e bem caracterizadas;

•Economia de animais, reagentes, tempo, etc.

Algum do material utilizado:

Cultura de células

•Gânglios que se localizam nas raízes dorsais dos nervos raquidianos.

•Possuem sobretudo os corpos celulares de neurónios aferentes primários sensitivos.

–Neurónios pseudounipolares com 2 axonónios: sendo um dirigido à periferia para fazer a enervação sensitiva dos tecidos; e o outro para a medula espinal.

Dorsal Root Ganglions (DRG’s)

Estrutura da medula espinal (adaptado de Martin, 1989).

Neurónio de um DRG (adaptado de Kandel et al., 1985).

Actividade experimental

1ª experiência (parte 1) - Protocolo

1. Sacrificou-se um ratinho (C57 BL / 6J) e dissecaram-se os DRG’s;

2. Procedeu-se à digestão enzimática dos DRG’s com colagenase durante 3 horas;

3. Cobriram-se os poços de cultura com PORN (Poly-DL-ornitina hidrobromido) e esterilizaram-se os mesmos com luz UV;

4. Após a digestão enzimática, lavaram-se as células com meio de cultura;

5. Transferiram-se as células para para um falcon com BSA (sterile bovine serum albumin type IV) a 15% e centrifugaram-se (durante 10 min a 1000 rpm);

6. Semearam-se as células nos poços de cultura;

7. Incubaram-se durante 2 dias a 37ºC e a 5% de CO2.

1ª experiência (parte 1) - Resultados

Objectivos

1. Estabelecer uma cultura de células;

2. Infectar as células com HSV-1;

Neurónio de um DRG (adaptado de Kandel et al., 1985).

HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)

•Genoma extenso (150 Kb) e zona de inserção também (35 Kb);

•Não integra o seu genoma no da célula hospedeira;

•Infecta preferencialmente células quiescentes.

HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)

Infecção pelo HSV-1 (Adaptado de Fink et al., 1996).

Estrutura da partícula viral (Adaptado de Burton et al.,2002).

Que vantagens oferece o HSV-1 como vector sobre outros vírus?

Utilizou-se uma versão do herpes vírus alterado geneticamente para:

• Não ser replicativo;

• Não ser patogénico;

• Incluir no seu DNA uma cassete contendo a unidade transcripcional do gene codificador da GFP (Green Fluorescence Protein) .

Esquema do genoma recombinado (adaptado de Wilson et al., 1999). Transcrição em cascata do genoma do HSV

wildtype 1.

HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)

6. Incubaram-se as células com um meio de cultura com HSV-1(diluição 1/5000 – 8x102 Pfu) e durante 2h para infecção das mesmas pelo vírus;

7. Após infecção substituiu-se o meio de cultura com o vírus por novo meio e incubaram-se de novo as células;

8. Passadas 24 horas procedeu-se à fixação das células com etanol e posterior observação destas no microscópio confocal para pesquisa do sinal verde da GFP.

1ª experiência (parte 2) - Protocolo

1. Sacrificou-se um rato (Wistar) e dissecaram-se os DRG’s.

2. ...

6. Adicionou-se NGF (Nerve Growth Factor) ao meio (50 ng/mL).

7. Semearam-se as células nos poços de cultura.

8. Incubaram-se durante 5 dias a 37ºC e a 5% de CO2.

9. Incubaram-se as células com um meio de cultura com HSV-1 (com 2 diluições diferentes, uma 1/5000 – 8x102 Pfu e outra 1/2500 – 1,6x103 Pfu) durante 24h para infecção das mesmas pelo vírus.

10. Substituiu-se o meio de cultura com o vírus por novo meio de cultura e incubaram-se de novo as células durante 2 dias.

11. Procedeu-se à fixação das células em PFA (Paraformaldeído) (a 4%) e posterior observação destas ao microscópio confocal para pesquisa do sinal verde da GFP.

2ª experiência (parte 1) - Protocolo

2ª experiência (parte 1) - Resultados

2ª experiência (parte 1) - Resultados

Objectivos

1. Estabelecer uma cultura de células.

2. Infectar as células com HSV-1.

3. Verificar se as células infectadas eram de facto neurónios.

13. Seguidamente, realizou-se uma imunocitoquímica começando por se lavar duas vezes os poços com PBS (Phosphate Bufer Salive) ( 8 min cada lavagem);

14. Lavaram-se os poços com PBS-T (PBS+Triton)(durante 5min);

15. Adicionou-se uma solução de PBS+glicínia+NGS (Normal Goat Serum)(15mg glicínia em 2mL de PBS e 10% de NGS) e aguardou-se 1 hora;

16. Retirou-se a solução anterior e adicionou-se o anticorpo primário anti-Neu N, utilizando-se duas soluções (anti-Neu N em PBS + 2% NGS) com concentrações diferentes ( 1/2500 e 1/5000);

17. Incubou-se à temperatura ambiente overnight;

18. Lavaram-se os poços duas vezes com PBS e uma com PBS-T como anteriormente;

19. Adicionou-se o anticorpo secundário goat anti-mouse (goat anti-mouse em PBS com uma diluição 1/1000) e aguardou-se 1 hora;

20. Lavaram-se os poços com PBS 2 vezes (5 min cada lavagem);

21. Observou-se ao microscópio confocal para pesquisa do sinal.

2ª experiência (parte 2) - Protocolo

O protocolo usado foi o basicamente o mesmo da 2ª experiência com as seguintes alterações:

1. Voltamos a utilizar ratinhos em vez de ratos;

2. Apenas incubamos as células 3 dias antes de as infectarmos com o HSV-1;

3. Na imunocitoquímica não realizamos as lavagens com PBS-T.

3ª experiência - Protocolo

3ª experiência - Resultados

3ª experiência – Resultados

Conclusões•Foi possível estabelecer uma cultura de DRG’s viáveis ultrapassando a complexidade da técnica da cultura celular;

•Ocorreu uma transdução viral eficiente e consequente expressão da GFP nas células em cultura;

•Verificou-se que o vírus infectou neurónios bem como outras células.

•Efectuar uma contagem dos sinais para se conhecer a percentagem de células infectadas pelo HSV-1 face à percentagem de neurónios.

•Realizar novas imunocitoquimicas com outros marcadores (p.e. GFAP para certas células gliais) de forma a conhecer os outros tipos de células infectados pelo HSV-1, bem como a percentagem de infecção.

•Elaborar um novo protocolo que permita investigar se a entrada do vírus nos neurónios se processa pelos prolongamentos celulares ou se efectivamente entra pelo corpo celular.

Estratégias a seguir em trabalhos futuros

Bibliografia

Burton E. A., Fink D. J., Glorioso J. C.. “Gene delivery using herpes simplex virus vectors”. (2002) DNA and Cell Biology, 21(12):915-36.

Fink D. J., DeLuca N. A., Goins W. F., Glorioso J. C.. “Gene transfert to neurons using herpes simplex virus-based vectors”. (1996). Anual Review of Neuroscience, 19:265-87.

Freshney R.I.. “Culture of Animal Cells, a manual of basic technique”. 4th ed., (2000), Wiley-Liss. chapter 1, p. 7, fig. 1.2.

Kelly J.P.. “Anatomical Basis of Sensory Perception and Motor Coordination” in: Kandel, E.R. and Schwartz J.H. (edit). “Principles of Neuronal Science”. 2nd ed.,(1985), Elsevier. Vol 20, p. 223, fig.20-1.

Martin J.H. “Neuroanatomy, Text and Atlas”. 1st ed., (1989), Elsevier. p.8, fig. 1.4.

Mullen, R. J. Buck, C.R. Smith, A. M.. “NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates”. (1992), Developement, p.201-211.

Wilson S. P., Yeomans D. C., Bender M.A., Lu Y, Goins W.F., Glorioso J.C.. “Antihyperalgesic effects of infection with a preproenkephaline-encoding herpes simplex”. (1999) Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96:3211-3216.

Agradecimentos

À Dra. Isabel Martins por nos ter disponibilizado as amostras de HSV-1, informação sobre o mesmo e ainda pela ajuda na operação do microscópio confocal bem como na realização desta apresentação.

À Profa. Fani Neto e à Dra. Sandra Rebelo pela disponibilização do material biológico (ratinhos e ratos).