Curso CG Final

Cromatografia Gasosa

Bruno Carius Garrido Pesquisador-tecnologista em Metrologia e Qualidade


da teoria básica ao desenvolvimento de métodos


Gênese da cromatografia

- Primeiros trabalhos por Runge em 1834 (spot tests), mais tarde Goppelsroeder e Schönbein

- Day (1897-1903) – análises de petróleo por fluxo ascendente em colunas empacotadas

- Tswett (1906-1907) – Separação de pigmentos vegetais em coluna aberta com fase

estacionária

-

- Kuhn (1931), Tiselius (1940), Wilson (1940), Tiselius (1941), Martin & Synge (1941)

- Martin e cols. - 1944 – Cromatografia em papel

- Cremer (1951) - Cromatografia gás-sólido

- James & Martin (1952) – Cromatografia gás-líquido

- Glueckauf (1955) – Primeira equação para a relação entre HETP e tamanho de partícula e

difusão

- Van Deemter e cols. – Desenvolveu a teoria cinética pela simplificação do trabalho de Lapidus

e Ammundson para uma função Gaussiana


O que é cromatografia?

Técnica de separação de componentes de uma mistura baseada

em diferentes graus de interação dos componentes da mistura

com uma fase estacionária e uma fase móvel



Classificação das técnicas cromatográficas

Pela natureza das fases:

Cromatografia Fase Móvel Fase Estacionária Tipo*

Gasosa (CG) Gás Líquido Gás-líquido

Sólido Gás-sólido

Líquida (CL) Líquido Líquido Líquido-líquido

Sólido Líquido-sólido

Supercrítica (CS) Fluido supercrítico Líquido

Sólido

* Denominações ultrapassadas



Pelo suporte da fase estacionária:

- Planar:

• Em camada delgada (CCD)

• Em papel (CP)

- Coluna

Pelo fluxo da fase móvel:

- Unidimensional

- Bidimensional

- Radial

Pela natureza da fase móvel (Cromatografia Líquida)

- Fase normal

- Fase reversa



Pelo tipo de interação responsável pela separação:

- Adsorção

- Partição

- Exclusão

- Complexação (troca iônica)

- Afinidade (imunoafinidade (CIA), bioafinidade)

Pela pressão (Cromatografia em coluna):

- Normal

- Média pressão

- Média pressão (tipo flash)

- Alta pressão (CLAE)

Pelo objetivo da separação:

- Analítica

- Preparativa (ou semi-preparativa)

- Extrativa ou para pré-tratamento da amostra (EFS)


Cromatografia Gasosa (CG)

- A cromatografia gasosa com o emprego de colunas capilares pode ser denominada

cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR)


Pergunta

Eletroforese é um tipo de cromatografia?


Parâmetros cromatográficos e seus símbolos


Principais parâmetros cromatográficos e seus símbolos


Principais parâmetros cromatográficos e seus símbolos


A resolução cromatográfica

A resolução cromatográfica é o parâmetro cromatográfico de maior importância

Uma resolução igual a 1,5 ou maior garante a

separação em linha de base de dois sinais

cromatográficos, permitindo boas medidas de

área e altura dos sinais.


O desafio da cromatografia:

Ter a resolução adequada no menor tempo

possível!


Equação fundamental da resolução cromatográfica

Eficiência

Seletividade

Retenção

Sem retenção não há

separação! Principal parâmetro

para uma separação

na cromatografia

líquida

Principal parâmetro

para uma separação

na cromatografia

gasosa devido a ser

intrinsecamente

grande


Importância da eficiência em CG

- A cromatografia gasosa de alta resolução produz bandas muito estreitas e de volume

muito baixo – Alta eficiência!

- Isso permite a separação de muitos componentes em tempos de corrida

relativamente baixos

- De maneira geral, a resolução cromatográfica em CG depende menos da

seletividade do que a cromatografia líquida

- Parâmetros que influenciam a seletividade em CG: química da fase estacionária e

temperatura

- Parâmetros que influenciam a seletividade em HPLC: química da fase estacionária,

solvente orgânico na fase móvel, pH da fase móvel, tipo e concentração do tampão

na fase móvel, presença e tipo de reagente de pareamento iônico



HPLC

CG

Bandas em azul com mesma seletividade e fator de retenção similar



HPLC

Bandas em azul com mesma seletividade e fator de retenção similar

CG


Se a seletividade e a retenção são tão semelhantes,

porque a resolução resultante é tão diferente nesses

cromatogramas?



HPLC

Sinais em azul com mesma seletividade e fator de retenção similar

CG


A eficiência é determinante nessa separação!

Mas o que é a eficiência???


Teoria cinética da cromatografia gasosa


Toda separação

cromatográfica resulta na

separação de moléculas de

compostos diferentes, mas

o efeito colateral é uma

leve separação entre

moléculas do mesmo

composto – Fenômeno de

alargamento de bandas

A eficiência é a medida do alargamento das bandas, estamos lembrados?


Alargamento de bandas em cromatografia gasosa

O alargamento das bandas cromatográficas em cromatografia gasosa se deve

principalmente a três efeitos:

- Difusão longitudinal (Ordinary diffusion): Refere-se à difusão que ocorre sempre

que há uma região de alta concentração adjacente a uma região de baixa

concentração. A difusão ocorre no nível molecular, resultando do movimento de

moléculas após a colisão.

- Difusão por turbilhonamento (difusão de eddy): “Efeito dos caminhos múltiplos”.

- Desequilíbrio local (Local nonequilibrium) : Desequilíbrio que ocorre na coluna

devido ao perfil de concentração variável ao qual cada diferente área da coluna está

exposta.









Difusão de eddy


Efeito de desequilíbrio local








Alargamento de bandas




- Conhecida como equação de Van Deemter, onde:

λ = constante adimensional característica do empacotamento, sendo menor que

1 para empacotamentos regulares

dp = diâmetro das partículas em centímetros

γ = fator de correção para padrões irregulares de difusão

Dg = difusividade molecular real

u = velocidade linear aparente

k = fator de capacidade

df = diâmetro efetivo de filme na fase líquida

Dl = difusibilidade do soluto na fase líquida

- O primeiro termo corresponde à geometria do empacotamento, o segundo à

difusão longitudinal na fase gasosa e o terceiro ao processo de resistência à

transferência de massa.




- O termo A é característico do tamanho de partícula e da qualidade do

empacotamento de uma coluna e só pode ser reduzido alterando-se o

empacotamento.

- As colunas capilares permitem a eliminação do termo A, visto que não possuem

múltiplos caminhos para que ocorra a difusão de eddy


- O termo B é uma medida da difusão molecular

- Pode ser reduzido pela redução da difusividade molecular.

- Difusividade molecular - depende da natureza do vapor e da temperatura e pressão do

sistema.

- Maior em gases de baixa massa molecular (H2, He) do que em gases de massa molecular

mais elevada (N2, CO2).

- Considerando apenas isso, escolheríamos esses gases (N2, CO2) para CG.

- Há outros efeitos a considerar – Tipo de detector, viscosidade do gás

- Além disso, esse termo é dividido por u na equação – aumentamos u para reduzir o seu

efeito

- O aumento de u dá mais peso ao termo C – considerar o balanço – depende do tipo de

coluna – maior ou menor resistência à transferência de massa!


A grande vantagem da CGAR

O que faz da CGAR a técnica analítica mais utilizada em química?

Sua altíssima eficiência intrínseca mencionada

anteriormente conseguida pela eliminação do termo A

da equação de van Deemter pelo uso de colunas

capilares!


A grande vantagem da CGAR


FE líquida

SUPORTE Sólido inerte

poroso

Tubo capilar de material inerte

Separação de C14, C15 e C16 (1, 2 e 3) em

coluna empacotada (esquerda) e coluna capilar (direita)


CGAR como Método Analítico

Vantagens

Excelente poder de resolução;

Análise de dezenas de substâncias em uma única amostra;

Alta sensibilidade (10–12 g);

Injeção de pequena quantidade de amostra;

Excelente técnica quantitativa.

Limitações

Análise de substâncias voláteis e termicamente estáveis;

Uso de derivados para obtenção de volatilidade.


Radler & Nunes, 2003


- Sistema cromatográfico – Só é capaz de promover separação!

- Voltando:


Técnicas de introdução de amostras em CG


- Em cromatografia gasosa o coração (ou calcanhar de Aquiles) é a injeção da

amostra pois após a entrada da amostra na coluna, só é possível separá-la – Não se

junta moléculas em um sistema cromatográfico!

- Requisitos iniciais:

• Compostos voláteis

• Termicamente estáveis

- O que fazer se meus compostos de interesse não são voláteis e/ou termicamente

estáveis?

• Injeção na coluna a frio (cold on-column)

• PTV

• Derivatização


- Relembrando volatilidade:

• Massa molecular

- Quanto maior a massa, menor a pressão de vapor

• Interações intermoleculares

- Interações carga-carga > carga-dipolo > ligação hidrogênio > dipolo-dipolo >

dipolo-dipolo induzido > van der Waals

- Lembrar da estereoquímica (E- e Z-) e seu efeito duplo dependendo do tamanho da

molécula.


- Derivatização pode aumentar dramaticamente a volatilidade e a estabilidade de

compostos

- A derivatização mais comum é a sililação – Reagentes mais comuns: MSTFA e

BSTFA

- Existem diversas outras reações de derivatização: Acilação, alquilação, formação

de derivados cíclicos, derivatizações quirais.

- Na prática, o procedimento de derivatização deve visar a substituição de grupos

funcionais mais polares por outros de menor polaridade, reduzindo a força das

interações intermoleculares – Atenção para a massa!

- Uma boa revisão sobre as principais derivatizações usadas em CG está em: Segura

et al., 1998 – J. Chromatogr. B.


Amostragem em CG

- As amostras de interesse podem ser gasosas, líquidas ou sólidas

- Em todos os casos, deve-se garantir uma amostragem representativa e

homogênea

- A coluna suporta apenas amostras gasosas – conversão para líquidos e sólidos


Amostragem em CG - Gases

- Existem diversas formas de se introduzir uma amostra gasosa em CG:

cilindros, bolsas herméticas, seringas herméticas e válvulas

- A amostra pode ser inserida diretamente na coluna ou via injetor convencional

(p.ex.: split/splitless)

- A amostragem de Headspace também é usada para análise do gás sobre uma

amostra líquida ou sólida (voláteis)


Amostragem em CG - Sólidos

- Muito rara - mais comum: solubilização da amostra sólida em solvente

adequado para posterior análise

- A amostragem de sólidos se limita basicamente à análise dos seus voláteis –

Headspace ou análise por vaporização térmica programada


Amostragem em CG - Líquidos

- Forma mais comum de amostragem em CG

- Uso de seringa – Manual ou automaticamente

- Aplica uma pequena alíquota de amostra na forma líquida para posterior

vaporização

- Idealmente: Líquidos voláteis

- Líquidos menos voláteis podem ser usados – on-column e PTV

- A expansão dos líquidos ao passar para o estado gasoso deve ser considerada

- O aquecimento necessário em muitos injetores também deve ser levado em

conta – degradação térmica da amostra


Amostragem em CG – Líquidos – Injeção Manual

- Consiste literalmente na injeção manual com uma seringa

- Duas técnicas principais podem ser usadas: Injeção com agulha fria e injeção

com agulha aquecida

- Basicamente a injeção consiste dos seguintes passos:

• Limpeza da seringa

• Retirada de amostra com volume cuidadosamente medido

• Injeção


Amostragem em CG – Líquidos – Injeção Manual com agulha fria

- Inserir a agulha até o fim no injetor

- Rapidamente pressionar o êmbolo da

seringa para injetar o líquido

- Retirar a seringa

- Vantagem: Injeção rápida

- Desvantagem: Discriminação de

substratos pouco voláteis (condensação na

agulha) e baixa repetitividade.

Analito volátil

Analito pouco volátil


Amostragem em CG – Líquidos – Injeção Manual com agulha aquecida

- Inserir a agulha até o fim no injetor

- Permitir tempo suficiente para que a

agulha seja aquecida (3 – 5 s)

- Rapidamente pressionar o êmbolo da

seringa para injetar o líquido

- Aguardar cerca de 15 – 20 s e retirar a

seringa

- Vantagens: Injeção muito reprodutível e

praticamente sem discriminação dos pouco

voláteis

- Desvantagem: Injeção demorada

Analito volátil

Analito pouco volátil


Amostragem em CG – Líquidos – Técnica de Air Gap ou lacuna de ar

- Usada para evitar a discriminação de substratos pouco

voláteis

- Sugar amostra acima do volume pretendido e devolver até o

mesmo

- Após retirar a alíquota de amostra do vial, preenchemos a

seringa com ar (2 vezes o volume de amostra)

- Promover a injeção com agulha fria ou aquecida

- Vantagens: Evita a perda de voláteis antes da injeção, evita a

discriminação e ajuda a promover a transferência completa

de amostra: repetitividade melhorada


Amostragem em CG – Líquidos – Técnica de Solvent flushing ou

lavagem com solvente

- Usada para evitar a discriminação de substratos polares

- Sugar solvente, ar, amostra e mais ar

- Promover a injeção com agulha fria ou aquecida

- Vantagens: Todas da injeção com lacuna de ar. Evita

discriminação de substratos polares que estejam adsorvidos

no vidro ou na agulha.


Sistemas de Injeção

- Promover propriamente a introdução da amostra na coluna

- O tipo mais antigo de injeção em CGAR é a injeção com divisão de fluxo

(Split)

- Outro tipo muito comum (geralmente associado) é a vaporização sem divisão

de fluxo (Splitless)

- Outros tipos também muito comuns são a vaporização com temperatura

programada (PTV) e a injeção na coluna a frio (cool on-column)


O injetor split/splitless

- Bloco metálico aquecido com 3 entradas e 3 saídas (basicamente)

- Revestido com um tubo de vidro chamado encamisamento de vidro (liner) –

proteger a amostra de degradação em contato com o metal aquecido

Coluna Seringa

Septo Purga do septo

Entrada de Gás Saída do divisor de fluxo

Encamisamento de vidro

Câmara de vaporização


O injetor split/splitless

- Permite fazer injeções com divisão de fluxo (Split) e sem divisão de fluxo

(Splitless)

- O que determina o tipo de injeção a ser feita é a natureza da amostra


A injeção com divisão de fluxo (Split)

- É a forma mais antiga de

introdução de amostras em

colunas capilares

- Volume de vapor gerado no

injetor – geralmente da ordem de

0,5 a 1 mL

- Fluxo na coluna da ordem de 1

mL/min

- Efeito de alargamento no tempo

- Usa-se a divisão de fluxo para

evitar esse alargamento

Coluna

Divisor de fluxo

1 minuto para

esvaziar o injetor



Coluna (1 mL/min)

Divisor de fluxo (10 mL/min)

5,45 segundos para

esvaziar o injetor!



Pergunta:

Um equipamento de CG sabe medir fluxo de gás?

Resposta:

Não!



- O que determina o fluxo de gás de arraste na coluna é a diferença de pressão

entre a cabeça da coluna (no injetor) e o detector – Importante informar o

detector e dimensões da coluna corretamente!

Ex.:

- Coluna de 0,25 mm DI e 30 m para fluxo 1 mL/min a 140°C, P = 16,5 psi

- Coluna de 0,32 mm DI e 30 m para fluxo de 1 mL/min a 140°C, P = 7,6 psi

- Se uso uma coluna de 0,32 mm DI e informo para o equipamento que é uma

0,25 mm DI, tento colocar 1 mL/min na coluna mas terei 2,7 mL/min!

- A mesma consideração vale para o comprimento da coluna – Medir!

- Como medir a coluna: lembrar da geometria! Circunferência = 2.π.r



- Desvantagem imediata: Perda de sensibilidade – Joga mais amostra pra fora do

que pra dentro do sistema

- Necessidade de pré-concentração da amostra

- A princípio esse tipo de injeção não é recomendado para análise de traços

- Vantagem imediata: Forma mais rápida de transferência de uma amostra para a

coluna em CGAR – Sinais mais estreitos

- Discriminação e divisão não linear – Sempre manter o injetor extremamente

limpo!

- Troca de septos a cada 30-50 injeções, liner a cada 100 injeções e limpeza do

corpo do injetor a cada 200 injeções (sempre que abaixar a temperatura – liner e

septo)


A injeção sem divisão de fluxo (Splitless)

- Desenvolvida por acaso por Grob em 1969

- Análise de uma mistura de esteróides em split

- Grob esqueceu-se de abrir a válvula no momento da injeção e abriu mais tarde –

Cromatograma com sinais grandes e bem formados para uma amostra muito

diluída



- A estrutura do injetor é exatamente a

mesma do split

- A injeção é feita com o divisor de fluxo

totalmente fechado

- A amostra só pode ir para a coluna

- Após um curto período (chamado de

tempo de amostragem; geralmente de

30-60 s), a válvula é totalmente aberta –

limpar o injetor

- Alargamento no tempo vai acontecer

- Alargamento no espaço pode acontecer

Coluna

Divisor de fluxo



- Alargamento no tempo – Devido simplesmente ao grande tempo que se leva

para transferir a amostra do injetor para a coluna

- Alargamento no espaço – Efeito de alagamento com amostra líquida de uma

parte da coluna – analitos se espalham no solvente

- A injeção em splitless requer o uso de um mecanismo de reconcentração

(focalização) de amostra

- Os mais usuais: Efeito de solvente e captura a frio

- É a técnica de injeção mais comum para análise de traços em matrizes

complexas


Técnicas de reconcentração – Captura a frio

- A técnica da captura a frio é usada para analitos pouco voláteis

- Temperatura do forno ~ 90°C abaixo do PE do analito e ~ 40°C acima do PE

do solvente

- Na coluna o solvente permanecerá no estado gasoso, sendo carreado

- O analito passará para o estado líquido sendo capturado pela fase móvel

- Após algum tempo (1,5 – 2 min) inicia-se a rampa de temperatura do forno

para eluição dos analitos


Técnicas de reconcentração – Efeito de solvente

- Requer o uso de uma lacuna de retenção (retention gap)

- Temperatura do forno ~ 30°C abaixo do PE da amostra (solvente + analitos)

- Toda a amostra será condensada rapidamente na saída do injetor –

alargamento no espaço

- Redução drástica de volume – cerca de 100 x menor – Acelera a saída da

amostra do injetor

- Nunca fazer isso na coluna! Usar lacuna de retenção


Técnicas de reconcentração – Efeito de solvente

- Assim como na captura a

frio, começa-se a

programação de

temperatura

- O solvente começa a

evaporar, concentrando os

analitos

- Ao chegar na fase

estacionária, os analitos

estão concentrados e

prontos para serem

eluídos

Coluna Lacuna

FE

Amostra

Gás de arraste

Gás de arraste

Gás de arraste

Gás de arraste


Técnicas de injeção - Splitless

- Tanto na injeção com divisão de fluxo quanto na injeção sem divisão é

possível realizar uma injeção pulsada (pulsed split ou pulsed splitless)

- Aplica-se um pulso de pressão (cerca de 3 x a pressão normal) durante a

injeção a fim de acelerar a saída da amostra do injetor

- Essa técnica aumenta a sensibilidade da análise e gera picos muito mais

estreitos e simétricos

- O efeito é sentido muito mais fortemente na injeção em splitless pois no split

a saída da amostra do injetor já é rápida


Técnicas de injeção – Liners para split e splitless


Técnicas de injeção – Cool on column – Injeção na coluna a frio

- Apesar de serem os mais utilizados, os injetores split/splitless possuem a

desvantagem de necessitarem da volatilização da amostra em alta

temperatura – Degradação térmica das amostras

- Para os casos de analitos termolábeis, pode-se utilizar a injeção na coluna a

frio (cool on-column)

- É o único tipo de injetor onde a amostra não precisa passar por uma câmara

adicional, sendo depositada diretamente na porção inicial da coluna

- Além da degradação, evita problemas de discriminação

- Toda a amostra atinge a coluna – Principal vantagem, mas também principal

desvantagem



- Os injetores on-column

podem ter um septo ou

uma válvula de

isolamento

- Abaixo, encontra-se a

coluna

- A seringa especial com

agulha de pequeno

diâmetro é inserida pelo

guia de agulha, até a parte

interna da coluna

- As seringas com agulha

de metal podem ser

usadas manualmente ou

com autoamostradores

para colunas com DI de

0,53; 0,32 ou 0,25 mm



- A injeção na coluna a frio é a mais repetitiva e reprodutiva entre as diferentes

injeções para CG

- Geralmente a temperatura do injetor é controlada juntamente com a temperatura do

forno

- Por ser uma injeção que não sofre de discriminação, pode ser usada como controle

na otimização de outras técnicas

- Assim como na injeção em splitless, é necessário que se use um mecanismo de

reconcentração da amostra devido ao alargamento no espaço


Técnicas de injeção – Vaporização com temperatura programada - PTV

- Desenvolvido no fim da década de 1970, baseado no injetor splitless

- O injetor splitless apresenta suas maiores desvantagens devido ao fato de ser um

injetor aquecido

- O injetor PTV permite a injeção de amostras em split ou splitless com o corpo do

injetor resfriado

- É considerado o mais versátil dos injetores em CG

- Permite a injeção de grandes volumes de amostra (até 100 µL)



- A estrutura do injetor é muito

semelhante à de um

split/splitless, exceto pela

entrada adicional de gás de

resfriamento (Ar, CO2 ou

N2(l))

- O corpo do injetor, assim

como os liners tem massa

menor, para permitir seu

rápido resfriamento/

aquecimento

- O injetor pode operar nos

modos de split/splitless a

quente, split/splitless a frio ou

splitless a frio para grandes

volumes



- Para split/splitless a quente, a operação é exatamente igual à do injetor clássico

- A injeção split/splitless a frio pode ser vantajosa para transferência de compostos

termicamente instáveis

- Nesse caso, a amostra é depositada no liner como um líquido, evitando a

evaporação imediata do solvente, sendo então aquecida em uma taxa programada

para sua transferência para a coluna de maneira similar ao split/splitless clássico

- Essa injeção reduz/elimina os problemas de discriminação na agulha

- O aquecimento controlado da amostra reduz os problemas de degradação térmica



- A injeção splitless a frio para grandes volumes é a grande inovação do PTV

- Nesse tipo de injeção, um grande volume (até 100 µL) é inserido no injetor (todo

de uma vez ou em várias pequenas injeções) a frio com a purga do split aberta

- Geralmente se utiliza um liner empacotado a fim de suportar melhor a grande

quantidade de líquido

- Utiliza-se uma temperatura na qual haja evaporação do solvente, mas não dos

analitos

- Após a evaporação de cerca de 95% do solvente a purga do split é fechada para

promover a transferência do material para a coluna em temperatura programada

- Assim como no splitless, após algum tempo a purga é aberta novamente para

limpar o injetor

- As mesmas considerações de alargamento e reconcentração que se aplicam ao sless



- Como o PTV promove uma injeção a frio que também utiliza um liner, oferece

várias vantagens: ideal para misturas com ampla faixa de ebulição, injeção de

grandes volumes e grande versatilidade

- A grande versatilidade é também a maior desvantagem: o PTV é de longe o injetor

mais complexo para CG

- Existe menos informação na literatura sobre o uso do PTV e o equipamento tem

maior custo


Colunas capilares em CG – fases estacionárias e outros parâmetros


Colunas capilares em CG

- Marcel Golay é considerado o inventor das colunas capilares, após seus trabalhos

nas décadas de 1950 e 1960. As colunas propostas por ele foram chamadas de

WCOT (Wall Coated Open Tubular)

- As colunas capilares (ou tubulares abertas) de sílica fundida (FSOT) foram

introduzidas em 1979

- Esse desenvolvimento, em conjunto com a criação de novas fases estacionárias

quimicamente ligadas específicas para colunas de sílica contribuíram para sua larga

aceitação

- Após a introdução das mesmas, houve um rápido declínio no uso de colunas

empacotadas em CG

- Diversas são as vantagens das colunas capilares: separações com resolução muito

maior, tempo de análise reduzido, necessidade de menor volume de amostra e

menores limites de detecção



- As colunas capilares

modernas são capazes de

resolver misturas de mais de

1000 componentes

- A escolha da coluna ideal

para o trabalho a ser

realizado deve levar em

conta os seguintes fatores:

fase estacionária, diâmetro

interno, espessura de fase e

comprimento da coluna

- Quanto menor o diâmetro

interno, maior a eficiência da

coluna



- A consideração prática para escolha do diâmetro interno é que a capacidade da

coluna diminui com a diminuição do diâmetro, ou seja, amostras muito

concentradas necessitam de colunas de maior diâmetro

- Para amostras complexas – usar sempre o menor diâmetro possível

- Ao usar colunas de grande diâmetro com EM, atenção ao fluxo

- As colunas de 0,10 mm DI podem gerar a mesma resolução em um tempo muito

menor – a pressão será muito maior



- Quanto à espessura de filme:

• Maior espessura, aumenta a capacidade da coluna e a retenção – maior tempo de

análise

• Quanto maior a espessura de filme, menor a eficiência da coluna

• Exceção, compostos muito voláteis podem ter baixa resolução com filmes muito

finos

• Quanto menor a espessura do filme, menor será a temperatura de eluição dos

compostos, logo filmes finos se aplicam bem a compostos pouco voláteis



- Quanto ao comprimento da coluna

• Deve-se ter em mente que a resolução é proporcional à raiz quadrada do número de

pratos teóricos (ou tamanho) da coluna

• Dobrar o tamanho de uma coluna aumenta em 1,4 x a resolução, mas dobra o tempo

de análise



- Seleção da fase móvel:

• O nitrogênio é o gás de arraste que

pode, teoricamente, gerar a melhor

eficiência cromatográfica

• O uso do nitrogênio, entretanto

requer velocidades lineares muito baixas,

sacrificando o tempo de análise

• O gás com a melhor relação velocidade/eficiência é o hidrogênio

• Por ser um gás muito perigoso e, no passado, incompatível com EM, o gás mais

utilizado é o He


Colunas capilares em CG - Escolha da fase estacionária

• A escolha da fase estacionária é muito menos importante em CG (existem menos de

100 fases diferentes) do que em CLAE (centenas de fases)

• Ainda assim, a escolha da fase estacionária é um dos principais fatores que

influenciam a seletividade em CG

• Para a separação em CG, deve-se usar a regra “semelhante dissolve semelhante”, ou

seja, escolhemos uma fase que “dissolva” os analitos

• Importante: Muita interação em CG é ruim!

• Importante 2: Fases polares em geral têm menor eficiência e estabilidade



- Usar sempre a fase estacionária mais apolar capaz de promover a separação

desejada

- Fases apolares são mais resistentes a água, oxigênio e outros oxidantes

- Fases apolares são mais inertes, sangram menos e têm melhor eficiência

- Nas fases apolares a separação ocorre basicamente pelos pontos de ebulição.

Aumentar o conteúdo de fases trifluoropropil, cianopropil ou fenil gera mais

interações dipolares

- As separações de compostos que têm diferentes forças para realizar ligações

hidrogênio como os álcoois, aldeídos, aminas e ácidos geralmente são melhores em

colunas com fase estacionária de poli-etilenoglicol ou semelhantes



- Na prática, cerca de 90% das análises em CG podem ser feitas utilizando-se uma

coluna 100% poli-dimetilsiloxano ou 5% fenil, 95% poli-dimetilsiloxano

- Os polisiloxanos são as fases estacionárias mais utilizadas em CG, devido à sua alta

estabilidade química e térmica e por oferecerem excelente difusividade aos solutos

- Estrutura do 100% poli-dimetilsiloxano:

- Os polisiloxanos substituídos podem ser representados:

- Onde os R´s podem ser CH3, fenil, CH2CH2CF3 ou

CH2CH2CH2CN e “x” e “y” representam o percentual de

uma unidade de repetição no polímero

- Ex: DB-1301 (6% cianopropilfenil–94% dimetilpolisiloxano, R1 = CH2CH2CH2CN,

R2 = fenil, R3 e R4 são metilas; X = 6% e Y = 94%



- Após os polisiloxanos, as fases mais comuns são os polietilenoglicóis de estrutura

geral:

- Disponíveis em diversas massas moleculares com denominações como Carbowax,

FFAP, etc.

- São as fases ideias quando se necessita de uma seletividade alternativa, além de

ideais para separação de álcoois, aminas, ácidos etc.

- Sua principal desvantagem é a instabilidade térmica – temperaturas máximas na

faixa de 225°C

- Além disso, água e oxigênio podem ser prejudiciais


Colunas capilares em CG - Fases recomendadas para diferentes aplicações:




Detectores em CG


Detectores em CG – Propriedades iniciais

- Características de ruído – Ruído químico, ruído

elétrico

- O ruído é calculado como a média entre o ponto mais

baixo e mais alto da linha de base em um período de

tempo

- Há diferentes tipos de ruído: ruído rápido (curta

duração), ruído de longa duração e deriva

- O ruído rápido é de alta frequência (maior do que

àquela do sinal de interesse), enquanto o ruído de

longa duração é exatamente o oposto

- A deriva é a inclinação do envelope de ruído em

função do tempo, sendo normalmente causada por

sangramentos e outros problemas semelhantes



- Uma das características mais observadas na detecção cromatográfica é a relação

sinal-ruído – Representa a probabilidade de que um pico em uma linha de base

ruidosa represente um sinal de analito

- Uma razão sinal-ruído de 2 indica probabilidade de 95%, enquanto uma relação

S/R = 2,65 indica probabilidade de 99%



- Como estimar a relação S/R:

1 – Definir o envelope de ruído (entre L1 e L2)

2 – Identificar o ruído médio (C)

3 – Medir a altura do pico (S2: de C a D2)

4 – Calcular a relação

Para um sinal ruidoso (S1), deve-se calcular

uma altura média (D1)



- Sensibilidade: quanto o sinal varia para dada variação de massa – Geralmente dada

pela inclinação da curva de calibração – Não confundir com capacidade de detecção

– Tem a unidade da resposta do detector por unidade de concentração ou massa (ex:

mV/pg)

- Limite de detecção – Expressa a capacidade de detecção – Geralmente corresponde

à concentração capaz de gerar um sinal com relação S/R = 3, ou seja, é a

concentração na qual o detector é capaz de dar uma resposta com 99% de

probabilidade de um pico representar um sinal da amostra

- Faixa dinâmica – Faixa que vai do LD até a concentração na qual um aumento na

concentração não promove aumento de sinal – Sua faixa mais relevante é a faixa

linear que é a faixa na qual a sensibilidade (inclinação) é constante

- Detectores universais, seletivos e específicos





Detectores em CG – Detector de condutividade térmica (DCT ou TCD)

- Detector universal e não destrutivo

- Baseia-se na medição de diferença na

condutividade térmica entre uma célula

analítica e uma célula de referência

- A passagem de um composto pela célula

de referência causa uma alteração na

condutividade térmica, desbalanceando a

ponte de Wheatstone

- Um potenciômetro refaz o balanceamento

da ponte e a corrente necessária será

traçada no cromatograma, gerando um

sinal


Detectores em CG – Detector de condutividade térmica

- Características:

• Detectabilidade mínima (LD): 10-9 g (1 ng)

• Resposta: Universal

• Linearidade: 104 (limitada)

• Estabilidade: Moderada

• Limite de temperatura: ~400°C

• Gases: Carreador (geralmente Hélio) e Makeup: O mesmo do carreador


Detectores em CG – Detector de ionização por chamas (DIC ou FID)

- Detector seletivo e destrutivo

- Baseia-se na criação de íons pela queima

de um composto hidrocarbônico em uma

chama neutra

- A criação dos íons permite a passagem de

corrente elétrica entre dois eletrodos (o

Jet e o eletrodo coletor), gerando um sinal

elétrico que é traçado no cromatograma

- É o detector mais usado em CG


Detectores em CG – Detector de ionização por chamas

- Características:

• Detectabilidade mínima (LD): 10-11 g (10 pg)

• Resposta: Somente para compostos contendo carbono orgânico (o sinal é reduzido

de acordo com a presença de átomos eletronegativos)

• Linearidade: 107 (faixa linear muito ampla)

• Estabilidade: Excelente

• Limite de temperatura: ~400°C

• Gases: Carreador (Hélio ou Hidrogênio), mistura combustível e comburente (ar e

hidrogênio) e Makeup: (hélio ou nitrogênio)


Detectores em CG – Detector de ionização por chamas (DIC ou FID)

- Compostos que geram pouca ou nenhuma resposta no FID:

- A otimização dos fluxos de gás é importante:

- Makeup deve ser aproximadamente igual a hidrogênio +

carreador


Detectores em CG – Detector de captura de elétrons (DCE ou ECD)


- Uma fonte radioativa (63Ni) emite partículas β:

- Esses elétrons de baixa energia colidem com o gás

de arraste, liberando elétrons de mais alta energia:

- Esse fluxo de elétrons gera uma corrente entre o

corpo do detector e eletrodo coletor

- A passagem de um analito muito eletronegativo

(com poder de capturar elétrons – halogenado)

gera uma redução nessa corrente produzindo um

sinal negativo que é invertido para a saída em

forma de cromatograma


Detectores em CG – Detector de captura de elétrons (DCE ou ECD)

- Características:

• Detectabilidade mínima (LD): 10-13 g (0,1 pg)

• Resposta: Altamente seletivo para compostos contendo átomos eletronegativos

(especialmente halogenados)

• Linearidade: 103 - 104 (faixa linear bem limitada)

• Estabilidade: Razoável – Suscetível a vazamentos no corpo do detector e a

impurezas nos gases

• Limite de temperatura: ~400° C (com emissor 63Ni) ou 220° C (com 3H)

• Gases: Carreador (Hélio ou Hidrogênio), Makeup: (nitrogênio ou 5% de metano

em argônio) – Todos os gases devem ser ultrapuros


Detectores em CG – Detector de nitrogênio e fósforo (DNP ou NPD)


- Construção muito similar ao DIC – Também pode

ser chamado de TSD (ou DTE)

- Acima do jet é colocada uma pérola de rubídio

silicato envolta em uma resistência

- Quando aquecida, essa pérola emite elétrons

termo-iônicos que formam o sinal de fundo

- O fluxo de H2 usado é muito menor do que em um

FID e é insuficiente para sustentar uma chama, o

que se forma na verdade é um plasma que passa

pela pérola aquecida

- Esse plasma, em contato com a pérola aquecida,

promove a combustão parcial dos efluentes da

coluna

- Os produtos de combustão parcial contendo

nitrogênio e fósforo são adsorvidos na pérola,

fazendo com que aumente a densidade de elétrons

produzidos pela mesma, gerando o sinal

cromatográfico


Detectores em CG – Detector de nitrogênio e fósforo (DNP ou NPD)

- Características:

• Detectabilidade mínima (LD): 10-11 g (10 pg)

• Resposta: Seletivo para nitrogênio e fósforo

• Linearidade: 106 (faixa linear ampla)

• Estabilidade: Excelente, desde que as temperaturas e fluxos de gases sejam bem

controlados. A pérola tende a se degradar com o tempo e o sinal será reduzido

• Limite de temperatura: ~400° C

• Gases: Carreador (Hélio ou Hidrogênio), mistura combustível e comburente (ar e

hidrogênio) e Makeup: (hélio ou nitrogênio)


Detectores em CG – Espectrômetro de massas

- O espectrômetro de massas opera sob vácuo

- Existem diferentes fontes de ionização (EI, CI, APGC) e diferentes analisadores

(Quadrupolo, setor magnético, TdV, ion trap 3D, QqQ...)

- Cada combinação fonte-analisador é um sistema diferente

- O EM não é somente um “detector” para cromatografia, sendo a própria

espectrometria de massas uma área muito ampla

- Nesse curso: abordagem extremamente simples limitada a características simples

- Usado como detector para CG pode ser universal ou seletivo e é destrutivo


Detectores em CG – Espectrômetro de massas

- Características:

• Detectabilidade mínima (LD): 10-12 g (1 pg) em SIM e 10-9 (1 ng) em SCAN

(quadrupolo simples – detectabilidade pode ser menor com outro analisador)

• Resposta: Universal (podendo ser seletivo com SIM)

• Linearidade: 106 (Faixa linear ampla)

• Estabilidade: Excelente

• Limite de temperatura: ~350° C na linha de transferência e na fonte

• Gases: Para EI – nenhum; CI – metano ou amônia


Detectores em CG

- Temperatura do detector:

- A temperatura de qualquer detector sempre deve ser cerca de 15-20 °C acima da

temperatura máxima de coluna usada no método – evitar a condensação

- A chama de um FID nunca deve ser acesa em temperaturas menores que 100 °C

(recomendável 150 °C) – evitar formação de vapor d’água no detector


Análise de dados e técnicas de

quantificação em CG


Técnicas de análise e quantificação em CG

- Técnicas gerais da química analítica e outras mais específicas:

- Padronização externa

- Padronização interna

- Diluição isotópica

- Normalização de áreas

- Normalização de áreas com fator de resposta

- Adição padrão


Normalização de áreas

- É a técnica de quantificação mais simples usada em cromatografia

- Não requer o uso de padrões

- Pode ser usada com quantidade de amostra desconhecida – resultado relativo

- Resultados pouco dependentes das condições de CG

- Desvantagens: Não aplicável a todas as amostras, deve ser checada por análises

independentes, todos os componentes têm que dar picos, e todos teriam que ter o

mesmo fator de resposta


Normalização de áreas com fator de resposta

- Na verdade é como uma correção da normalização de áreas simples com melhor

exatidão

- Não requer o uso de padrões caso os Rw sejam conhecidos – se desconhecidos será

necessária uma calibração

- Pode ser usada com quantidade de amostra desconhecida – resultado relativo

- Resultados pouco dependentes das condições de CG – inclusive fatores de resposta

- Desvantagens: Não aplicável a todas as amostras, deve ser checada por análises

independentes, todos os componentes têm que dar picos.


Padronização externa

- Consiste na comparação de uma amostra problema com uma amostra controle com

concentração conhecida

- Requer o uso de um padrão para preparo do controle – pode ser feita uma curva de

calibração – recomendado!

- A quantidade de amostra deve ser conhecida

- Resultados totalmente dependentes das condições de CG – Amostra e controles

devem ser analisados em sequência – exatidão muito melhor do que normalização

- Só o pico do composto de interesse é necessário

- Desvantagens: massa (ou volume) de amostra deve ser conhecida, calibração é

recomendada para maior exatidão, condições de CG devem ser constantes e se

houverem muitos componentes a calibração pode ser cara e trabalhosa


Padronização externa

- Cálculos com padronização simples (admitindo volume ou massa igual entre

amostra e controle):

- Cálculos usando curva de calibração

Considerando o modelo de regressão:

y = b0 + b1x


Padronização interna

- Consiste na comparação da resposta de um componente de interesse com um

padrão adicionado à própria amostra

- Requer o uso de um padrão para preparo – padrão interno também pode ser usado

como correção do preparo da amostra

- A quantidade de amostra não precisa ser conhecida

- Resultados independentes das condições de CG

- Só o pico do composto de interesse e do PI são necessários

- Pode ser associada a uma calibração – um dos melhores métodos de quantificação

em CG

- Desvantagens: Padrão interno deve ter propriedades particulares, pode ter custo

elevado para muitas amostras



- Cálculos com padronização simples:

- Associada à calibração – construir uma curva de calibração conforme feito para a

padronização externa e adicionar o padrão interno na mesma concentração em

todos os pontos da curva e nas amostras problema

- A curva de calibração deve ser construída com concentração do analito no eixo “x”

e razão de áreas do analito/padrão interno no eixo “y”

- Para interpolar a amostra problema, usar a sua razão analito/padrão interno

- O padrão interno corrige pequenos desvios ocorridos no preparo de amostras



- Ex.: Análise de soro: Alíquota de soro – adição de padrão interno – adição de

solvente para precipitação de proteínas – centrifugação – separação do

sobrenadante – evaporação – derivatização – análise por CG-EM

- Imaginando uma curva de calibração:

Dados:

Conc. Aanalito API A/PI

5 1450 2000 0,73

10 2110 1800 1,17

15 3400 2000 1,70

20 1980 1000 1,98

30 5880 1900 3,09


Diluição isotópica - Considerada um caso especial da padronização interna na qual o padrão interno é

um isotopômero do analito

- Pode ser usada exatamente como a padronização interna: de forma simples ou

associada à calibração

- Resultados muito mais exatos – Só pode ser usada com EM

- Pode ser usada na abordagem da correspondência exata (Exact Matching

Approach)

- Nessa abordagem, preparam-se amostras controle fortificadas com o analito e o

padrão interno e estima-se a concentração da amostra problema

- Repete-se o preparo das amostras controle aproximando-se cada vez mais a sua

concentração da concentração da amostra problema até que se tornem

indistinguíveis


Diluição isotópica


Diluição isotópica - Para controles a amostras problema indistinguíveis aplica-se a seguinte equação:


Diluição isotópica

- Principais cuidados:

- O padrão interno deve ter tempo de equilibrar-se com a amostra

- Avaliar a interferência (seletividade) de ambos compostos (nativo e marcado) entre

si


Testosterone in Serum - 2.4 ng/g Spike

31

2

6

4

5

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

0.5 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5

ng

/g

1 - Matrix Standards

Isotopic Internal

Standardisation


Non-isotopic Internal

Standardisation


External Calibration

4 - Solvent Standards

Isotopic Internal

Standardisation


Non-isotopic Internal

Standardisation


External Calibration

Gravimetric Value

17%U

Work undertaken by Chris Mussell and Anna Pardos-Pardos Dados de O´Connor et al., 2012


Adição Padrão

- Método de quantificação usado quando há necessidade de preparo dos controles

em matriz e não há matriz “branca” disponível

- Ex.: Quantificação de testosterona em urina

- Prepara-se uma curva de calibração com a adição de concentrações conhecidas do

analito incluindo o ponto “zero” – sem adição

- É necessário que a faixa de concentrações estudadas exiba resposta linear

- Após a construção da curva, determina-se a concentração original por extrapolação


Adição Padrão

- A extrapolação é feita até a intercessão da curva com o eixo “x”

- Matematicamente, define-se y = 0

- Obtém-se um resultado negativo – inverte-se o sinal = concentração original na

matriz


Considerações importantes:

Análises quantitativas devem sempre que possível usar replicatas verdadeiras (3 ou

mais)

Ao construir qualquer curva de calibração, deve-se colocar todas as replicatas de cada

nível de concentração na curva, NUNCA usar o valor médio

Nunca forçar uma curva de calibração a passar pela origem


Análise qualitativa

- O tempo de retenção simplesmente não pode ser usado como critério para a

conclusão da identidade de uma substância em cromatografia

- Para dar suporte a esse tipo de conclusão: análise em diferentes fases estacionárias

(pelo menos 2)

- Análise com co-eluição

- Combinação de ambos

- Emprego de detectores seletivos

- Emprego de detectores que produzam informação estrutural (EM; EM-EM –

quanto mais seletivo, melhor)



- Importante: Lembrar-se sempre da química básica – enantiômeros só podem ser

separados em meio quiral – espectros de massas são idênticos

- Exemplos de critérios de identificação qualitativa de um composto

- Controle de dopagem: tR na amostra não pode diferenciar em mais do que 0,01 min

ou 2% de urina de referência

- Também pode ser usada a massa acurada para dar suporte às conclusões



- Para análises de alimentos e outras no âmbito da 2002/657/CE

- Pontos de identificação – mínimo para um positivo = 4 pontos


Guia prático para o

desenvolvimento de métodos


Guia prático para o desenvolvimento de métodos

- Principal objetivo do desenvolvimento de métodos em CG: obter a resolução

adequada no menor tempo possível

- O procedimento aqui apresentado parte do princípio que a amostra é totalmente

desconhecida

- Protocolo disponível em Radler & Cardoso – Química Nova 11(2) – 1988



- Condições preliminares:

- Recomendável usar uma lacuna de retenção (amostra totalmente desconhecida) –

focalização da amostra, mas principalmente proteger a coluna de compostos não

voláteis




- Usar injeção com divisão de fluxo:

Apesar de não ser o método de injeção mais recomendado para análise de traços e

para substâncias termolábeis, evita a sobrecarga da coluna e sua contaminação com

susbtâncias pouco voláteis

- Usar fase estacionária apolar:

Reduz a possibilidade de retenção de compostos muito funcionalizados, além de

permitir relacionar a ordem de eluição ao ponto de ebulição dos compostos. Também

são fases mais estáveis termicamente – preferência por polimetilsiloxanas

imobilizadas




- Comprimento, diâmetro interno e espessura de filme da coluna:

• Comprimento de 10 a 20 m

• Diâmetro interno entre 0,25 e 0,35 mm (usual 0,25 ou 0,32 mm)

• Espessura de filme entre 0,1 e 0,5 µm (depende da concentração esperada)

• Para uma amostra totalmente desconhecida, usar coluna curta (10 ou 15 m), com

diâmetro 0,25 mm e espessura de filme de 0,15 µm ou mais – minimizar a retenção

– análise rápida – detecção de compostos pouco voláteis




- Usar detector de ionização por chamas

É o detector mais adequado para análise exploratória de amostras orgânicas – Não há

problemas com relação a concentrações elevadas – é um detector bastante sensível

- Condições de análise:

• Temperatura inicial baixa para observação dos compostos voláteis – pequena

retenção da coluna com temperatura mais alta pode levar à perda dos mesmos

• Programação rápida: 10

C/min ≤ Taxa ≤ 15

C/min

• Temperatura final próxima da Tmax da coluna

• Tempo final infinito – interromper a corrida com tempo = 2 x tR do último pico





- Não há picos no cromatograma?

- Causas:

• A amostra não tem componentes volatilizáveis

• As substâncias presentes se degradaram e seus produtos ficaram absorvidos no

sistema

• O detector por ionização em chamas não responde aos compostos

• Amostra muito diluída ou detecção com pouca sensibilidade




- Soluções:

• Usar colunas com menor retenção (reduzir L, dc e E.F.)

• Usar injeção na coluna a frio para evitar a degradação no injetor

• Combinar os dois

• CLÁSSICO: Caso haja suspeita de que o DIC não seja adequado, realizar testes

para a presença de enxofre ou halogênios na amostra – lembrar que

polihalogenados não produzem sinal apreciável no DIC

• Certificar-se de que a amostra é constituída de substâncias orgânicas e que a

quantidade injetada está de acordo com a sensibilidade do detector




- Soluções:

• Caso ainda não apareçam picos, selecionar outro método de análise –

cromatografia líquida





- Há picos no cromatograma?

- Iniciar a otimização da separação

• Reduzir a velocidade de programação e observar se há melhoria da resolução

• Se tR for muito pequeno – aumentar comprimento e espessura de fase da coluna

• tR continua reduzido – aumentar a polaridade da fase estacionária (OV-31-OH;

Carbowax; cianopropilsiloxana)

• O uso dessas fases polares também é sugerido se houver suspeita de coeluição

• Observar o espalhamento dos picos com separação razoável entre eles – se houver

separação razoável, seguir para próxima etapa





- Há separação preliminar?

- Aprimorar o resultado

• Se não for necessário aprimorar – pular esta etapa

• Se for necessário – seguir o diagrama





- Há resolução adequada?

- Otimizar o tempo de análise

• Aumentar a taxa de programação para aproximar todos os picos – tentar um

método com rampas múltiplas

• Aumentar a temperatura inicial até que ela comece a prejudicar a resolução que se

considera adequada

• Aumentar a vazão do gás de arraste (velocidade linear média) – especialemente se

as substâncias eluírem na isoterma final

• Alterar as características da coluna, reduzindo o comprimento e espessura de filme





- Há muitos outros recursos que podem ser usados para otimizar um método,

baseados em outros aspectos já abordados no curso

- Esse guia visa ajudar no desenvolvimento inicial para amostras totalmente

desconhecidas

- Leituras recomendadas:






Guia prático para o desenvolvimento de métodos - Dicas práticas de utilização de CG

• Substituir septos regularmente – a cada 50 injeções – sempre que resfriar o

equipamento

• Se não tem ideia da temperatura do injetor a usar, comece em 250

C

• Use sempre gases, reguladores e tubulações adequadas

• Sempre verificar vazamentos nas linhas de gases e trocar os cilindros quando a

pressão atingir 200 psi

• Sempre que possível, purgar a coluna com gás carreador (15 – 30 min) antes de

aquecê-la

• Usar sempre a coluna mais apolar possível para a separação desejada

• Sempre que possível utilize colunas de baixo sangramento



• Sempre corte as pontas da coluna após passar por anilhas de grafite

• Se os picos iniciais forem muito largos tente usar uma coluna com espessura de

fase maior

• Inspecione e troque sempre os liners – liners sujos levam a picos deformados

• Use o liner correto para o tipo de injeção

• Se os picos estiverem deformados – troque o septo, liner e corte 0,5 m da cabeça

da coluna

• Sempre marque qual é a cabeça da coluna

• Sempre use anilhas novas



• Atenção ao corte da coluna

• Reaperte todas as conexões de uma coluna recém colocada cerca de ¼ a ½ volta

após os primeiros ciclos de aquecimento do equipamento

• Sempre use anilhas de grafite/vespel para a interface com EM

• Não desconecte uma coluna em temperatura ou pressão elevada – deixe atingir a

temperatura e pressão ambientes antes

• Antes do uso sempre condicione as colunas na temperatura máxima recomendada

pelo fabricante por cerca de 1 – 2 h

• Quando guardar uma coluna, feche suas pontas com septos – lembre de cortar pelo

menos 3 cm antes de reutilizá-las


Água em CG – Molhar a coluna,

pode?


Água em CG - A água é considerada um solvente menos que ideal em

CG

- Problemas: grande volume de expansão de vapor,

molhabilidade e solubilidade baixas na fase estacionária,

problemas em detectores como o DIC, danos químicos à

fase estacionária ...

- Mas...

- Em alguns casos injetar água é inevitável (como usando

um purge-and-trap) ou é mais conveniente do que fazer

uma longa extração com solvente


Água em CG - Os problemas com a introdução de água em CG começam no injetor – grande

volume de expansão – facilmente pode causar backflash

- Na coluna - baixa molhabilidade na fase estacionária – Grob e cols.: não há uma

fase estacionária que possa ser molhada pela água e, ao mesmo tempo,

suficientemente desativada para uma boa cromatografia – uma parte da água pode

passar como líquido pela coluna – alargamento e divisão de bandas

- Usando temperaturas iniciais do forno acima de 100

C – bons resultados

- Muita água sendo eluída pode apagar a chama do DIC, reduzir a sensibilidade do

DCE

- Nota de aplicação Agilent – fases quimicamente ligadas (tipo DB) - testes antes e

após 1000 injeções de água


Água em CG

- Injeção em split – A injeção sem divisão de fluxo iria levar a um backflash elevado

- Foram testadas 2 temperaturas para a corrida: 60 °C e 130 °C

- Após 1000 injeções em cada temperatura, nenhuma das fases quimicamente ligadas

sofreu danos – testes de Grob repetidos e resultados idênticos

- Uma fase não ligada foi gradualmente perdida – não recomendável o uso com água


Testes de avaliação de colunas capilares


Avaliação de colunas capilares

- As colunas capilares modernas possuem alta inércia e eficiência

- A pequena quantidade de fase estacionária, no entanto, pode fazer com que essas

características se percam rapidamente

- Pequenas quantidades de impureza presentes nas amostras ou no gás carreador

- Quaisquer alterações no desempenho da coluna só podem ser percebidas (a tempo

de uma ação corretiva) com testes de desempenho

- Os testes existentes consistem em uma injeção de padrões selecionados com

características específicas e avaliação do cromatograma resultante



- As colunas capilares modernas possuem alta inércia e eficiência

- A pequena quantidade de fase estacionária, no entanto, pode fazer com que essas

características se percam rapidamente

- Pequenas quantidades de impureza presentes nas amostras ou no gás carreador

- Quaisquer alterações no desempenho da coluna só podem ser percebidas (a tempo

de uma ação corretiva) com testes de desempenho

- Os testes existentes consistem em uma injeção de padrões selecionados com

características específicas e avaliação do cromatograma resultante

- Existem diferentes misturas-teste para uso nesses testes que também podem ser

feitos em diferentes condições experimentais



- Informações que se deseja (com um único teste): características de adsorção,

eficiência de separação, comportamento ácido-base e espessura de filme líquido

- A metodologia apresentada aqui foi extraída de Cardoso & Radler – Química Nova,

1986 – por sua vez extraída basicamente dos trabalhos de Grob

- A mistura-teste inclui componentes ácidos, básicos, neutros, hidroxilados e

carbonilados a fim de avaliar a interação da coluna com diferentes grupos

funcionais



Composição da mistura-teste


Ordem de eluição da mistura-teste em diferentes fases estacionárias


Ordem de eluição da mistura-teste em diferentes fases estacionárias



Diferentes pares

com a mesma

função (ver A e

am)


- Há casos em que a redução de um sinal não indica um problema ne desempenho

da coluna

-

- Ex: ácido 2-etil-hexanóico (S) em colunas apolares e C10-C12 em fases polares

com filmes delgados (<0,1 μm)

- Esses picos serão deformados – problema causado pela insolubilidade dos

compostos na fase estacionária na concentração usada

- Nem todas colunas conseguem nota dez em todo o teste, mas isso não as

desqualifica

- Uma coluna com característica ácida pode ser usada para separação de alcanos,

ésteres, aldeídos, cetonas etc.

- Cuidado com a neutralidade aparente de uma coluna!


- Para uso diário, se os problemas estão concentrados nos indicadores mais

sensíveis: D, S e am provavelmente não haverá problemas na maioria das

situações

- Quanto mais inerte for a coluna, maior será a sua vida útil e melhor ela será para

análises quantitativas, garantido repetitividade


- Outra informação retirada do teste é a eficiência da coluna

- Medida pelo número de separação (Trenzahl – Tz)

- Sendo ∆tR a diferença de tempo de retenção entre dois picos e W1/2 as larguras

em meia altura

- No teste, calcula-se o Tz para dois pares de picos: E10/E11 e E11/E12 e tira-se a

média


- Valores típicos de Tz:


- Por fim, o teste permite o cálculo da espessura de filme da coluna

- Esse cálculo é importante no diagnóstico de possíveis problemas ocorrendo na

coluna – sangramento, oxidação das extremidades, redistribuição da fase etc.

- Mede-se a temperatura de eluição do E12 e então calcula-se a diferença entre

essa temperatura e a temperatura padronizada para aquela fase (dada nas tabelas

anteriores)

- Medir a temperatura de detecção e subtrair o tempo morto

- Usa-se o normograma para o cálculo


- Normograma:


- Procedimento prático:

1 – Colocar a coluna em equipamento com injetor split e detector de ionização por

chama e resfriar o forno a uma temperatura menor que 40 °C (ou colocar 40 °C

como temperatura inicial do forno)

2 – Ajustar a pressão de entrada e a razão de split para obter para o metano um tR =

3,5 s/m (ou ajustar o sistema para uma velocidade linear média de 28,5 cm/s) +/- 5%

3 – Configurar a programação de temperatura em função do tamanho da coluna: 10

m: 2,5 °C/min e 50 m: 0,5 °C/min

4 – Injetar a mistura padrão de modo que aproximadamente 2 ng de cada

componente cheguem à coluna (ex: 1μL com split 1:20)

5 – Na faixa provável de saída de E12 (110-140 °C), fazer duas aotações com a

temperatura medida naqueles instantes


- Procedimento prático:

6 – Ao final da cromatografia inter- ou extrapolar a temperatura de eluição do E12

7 – Desenhar a linha dos 100% que passa pelos picos dos dois n-alcanos e dos três

ésteres

8 – Expressar a altura dos demais picos como uma porcentagem da distância entre a

linha de base e a linha dos 100%

9 – Determinar o TZ – média de E10/E11 e E11/E12

10 – Determinar a espessura do filme comparando a temperatura determinada na

etapa 6 com os valores de referência da tabela e usar a diferença no normograma

para cálculo da espessura de filme.


Dúvidas?

Questões práticas, teóricas, aplicações específicas...


Obrigado!

Bruno

R: 3095

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