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Bastonetes gram-negativos: ecologia, sistemática e fatores de virulência Dra. Viviane Nakano Curso de Pós-Graduação em Microbiologia BMM 5753 – Bacteriologia de Anaeróbios Introdução Bactérias anaeróbias gram-negativas Gênero Porphyromonas (assacarolíticos) Gênero Prevotella (sacarolíticos) Gênero Fusobacterium Gêneros Bacteroides / Parabacteroides Gênero Mitsuokella: M. dentalis Outros gêneros: Selenomonas spp.; Centipeda spp.; Leptotrichia buccalis. Caracterização dos microrganismos Bacilos anaeróbios estritos Não esporulados, imóveis Produtores de pigmento marrom a negro (alguns) Necessitam de hemina e menadiona Habitantes da microbiota indígena bucal, intestinal e trato genito-urinário de humanos e animais. Evolução taxonômica dos anaeróbios pigmentados Bacterium melaninogenicus (1921) não fermentadores (1962) fracos fermentadores (1962) fortes fermentadores (1962) Subespécies assacharolyticus (1977) Subespécies intermedius (1977) Subespécies melaninogenicus (1977) B. assacharolyticus B. endodontalis B. gingivalis (1988) B. melaninogenicus B. denticola B. loeschii (1990) B. intermedius B. corporis (1990) Gênero Porphyromonas Gênero Prevotella Gêneros Porphyromonas Prevotella P. assacharolytica P. endodontalis P. gingivalis P. salivosa P. circumdentaria P. canoris P. cangingivalis P. cansulci P. crevioricanis P. gingivicanis P. gulae P. macacae P. levii fracos fermentadores fortes fermentadores P. corporis P. intermedia (1992) P. nigrescens (1992) P. pallens (1998) P. melaninogenica P. denticola P. loescheii P. tannerae Jousimies-Somer, 1995; Könönen et al., 1998; Fournier et al., 2001

Curso de Pós-Graduação em Microbiologia BMM 5753 … · 2012-03-27 · Bastonetes gram-negativos: ecologia, sistemática e fatores de virulência ... não fermentadores (1962)

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Bastonetes gram-negativos: ecologia,

sistemática e fatores de virulência

Dra. Viviane Nakano

Curso de Pós-Graduação em Microbiologia

BMM 5753 – Bacteriologia de Anaeróbios

Introdução

Bactérias anaeróbias gram-negativas

Gênero Porphyromonas (assacarolíticos)

Gênero Prevotella (sacarolíticos)

Gênero Fusobacterium

Gêneros Bacteroides / Parabacteroides

Gênero Mitsuokella: M. dentalis

Outros gêneros: Selenomonas spp.; Centipeda spp.;Leptotrichia buccalis.

Caracterização dos microrganismos

• Bacilos anaeróbios estritos

• Não esporulados, imóveis

• Produtores de pigmento marrom a negro (alguns)

• Necessitam de hemina e menadiona

• Habitantes da microbiota indígena bucal, intestinal e

trato genito-urinário de humanos e animais.

Evolução taxonômica dos anaeróbios pigmentados

Bacterium melaninogenicus (1921)

não fermentadores (1962)

fracos fermentadores (1962)

fortes fermentadores (1962)

Subespécies assacharolyticus

(1977)

Subespécies intermedius (1977)

Subespécies melaninogenicus

(1977)

B. assacharolyticusB. endodontalis

B. gingivalis (1988)

B. melaninogenicusB. denticola

B. loeschii (1990)

B. intermediusB. corporis

(1990)

Gênero Porphyromonas Gênero Prevotella

Gêneros

Porphyromonas Prevotella

P. assacharolyticaP. endodontalis P. gingivalis P. salivosa P. circumdentariaP. canorisP. cangingivalisP. cansulciP. crevioricanisP. gingivicanisP. gulae P. macacae P. levii

fracos fermentadores fortes fermentadores

P. corporisP. intermedia (1992)P. nigrescens (1992)P. pallens (1998)

P. melaninogenica P. denticolaP. loescheii P. tannerae

Jousimies-Somer, 1995; Könönen et al., 1998; Fournier et al., 2001

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Espécies de Porphyromonas isoladas de humanos e animais

HumanosAnimal

P. asaccharolyticaP. endodontalis P. gingivalis P. catoniae

P. cangingivalisP. canorisP. cansulciP. circumdentariaP. crevioricanisP. gingivicanisP. leviiP. macacae P. gulae P. levii-like organismsP. endodontalis-like organisms

Jousimies-Somer (1997)

Prevotella: Espécies pigmentadas e não pigmentadas

Pigmentados

P. corporisP. denticolaP. intermedia P. melaninogenica P. nigrescensP. tannera

Não Pigmentados

P. bivia P. buccaeP. buccalis P. disiens* P. heparinolytica** P. oralisP. oris P. oulorumP. veroralis P. enoecaP. zoogleoformans**

* UV vermelho-amarelado ** Reagrupados no gênero Bacteroides

Jousimies-Somer (1997).

Prevotella spp. e Porphyromonas spp.

Cultura pura

Porphyromonas spp.

Fluorescência

Prevotella spp. e Porphyromonas spp.

Coloração de Gram

Gênero Fusobacterium spp.

F. alocis

F. necrophorum subsp. funduliforme

F. necrophorum subsp. necrophorum

F. nucleatum subsp. animalis

F. nucleatum subsp. fusiformis

F. nucleatum subsp. nucleatum

F. nucleatum subsp. polymorphum

F. nucleatum subsp. vicentii

F. varium

F. ulcerans Jousimies-Somer (1997).

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Fusobacterium spp.

Cultura PuraÁgar Omata-Disraely

Fusobacterium spp.

Coloração de Gram

Família Bacteroidaceae - Gênero Bacteroides

Produtores de pigmento negro

Não produtores de pigmento negro

Assacarolíticos Sacarolíticos Bile-resistentesBile-sensíveis

Gênero Porphyromonas

Gênero Prevotella

B. capillosus Espécies intestinais: Bacteroides fragilis

Sacarolíticos

Shah e Collins (1989)

B. melaninogenicus

Shah (1992); Garrity e Holt (2001)

Porphyromonadaceae

Prevotellaceae

Família Bacteroidaceae - Gênero Bacteroides

Bacteroides fragilis (Grupo?)

Parabacteroides (distasonis e merdae)

Bacteroides gracilis (Campylobacter gracilis)

Bacteroides forsythus (Tannerella forsythia)

Bacteroides ureolyticus

Bacteroides capillosus

Gêneros Bacteroides e Parabacteroides

Bacteroidaceae

Bacteroides

Bacteroides fragilis

B. fragilis, B. vulgatus, B. ovatus, B. uniformis, B. caccae, B. thetaiotaomicron, B. eggerthii, B. stercoris.

Família

Gênero

Grupo

Espécies

“Grupo” Bacteroides fragilis

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Novas espécies do gênero Bacteroides

Song et al. (2004)

Bacteroides nordii

Bacteroides salyersae

Kitahara et al. (2005)

Bacteroides plebeius

Bacteroides coprocola

Fenner et al. (2005)

Bacteroides massiliensis*

Song et al. (2005)

Bacteroides goldsteinii

Bakir et al. (2006)

Bacteroides intestinalis

Bacteroides dorei

Bacteroides finegoldii

* Isolado de sangue de recém-nascido

Song et al. (2004)

Bakir et al. (2006) Sakamoto & Benno (2006)

Novo gênero Parabacteroides

Meio BBE

Bacteroides fragilis Bacteroides fragilis

Cultura pura

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Coloração de Gram

Grupo Bacteroides fragilis

Ecologia

Reguladores da Microbiota Intestinal e Bucal Autóctone

Produção de substâncias antagonistas

Bacteriocina

Auto-antagonismo Iso-antagonismo Hetero-antagonismo

Microbiota

Intestinal

Água contaminada (esgoto)

Abscessos

Sangue

Feridas cirúrgicas

HumanosAnimais

Microbiota

Bucal

Prevotella spp.

Porphyromonas spp.

Fusobacterium spp.

Bacteroides spp.

Prevotella spp.

Porphyromonas spp.

Fusobacterium spp.

Fatores de virulência e Patologias associadas

BACTÉRIAS

TRABALHANDO

Fatores de virulência

Adesinas* Cápsula Colagenase Protease

Edema e acúmulo de neutrófilos no sítio da infecção

Prevotella spp. e Porphyromonas spp.

*Fímbrias – fimA I, II, III, IV e V (apenas no gênero Porphyromonas)

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Prevotella spp. e Porphyromonas spp.

Patologias associadas

• Abscesso cerebral, infecções de cabeça e pescoço e endocardites

• Infecções bucais

– Gengivite

– Periodontite

– Infecções endodônticas

Periodontite

Prevotella spp. e Porphyromonas spp.

Prevotella spp. e Porphyromonas spp.

Periodontite canina

Porphyromonas spp. - animal

46 com periodontite – 38 isolados + P. gulae

28 saudáveis – 15 isolados + P. gulae

Ativação do Complemento

Fusobacterium spp.

Hidrofobicidade

Estimulação de Linfócitos

Aderência aos tecidos do hospedeiro

(adesinas e fímbrias)

Metabólitos tóxicos(H2S)

Hemolisinas

(alfa e beta)

Fatores de virulência Patologias associadas

Fusobacterium spp.

• Abscesso cerebral, meningites, infecções pélvicas, trato respiratório superior e intra-abdominais.

• Infecções bucais

– Gengivite

– Periodontite

– GUN (gengivite ulcero-necrosante)

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Fusobacterium nucleatum

Gengivite ulcero-necrosante (GUN)

Fusobacterium necrophorum

Pododermatite (caprinos e ovinos)

Dichelobacter (Bacteroides) nodosus

Fator de virulênciaEstágio da infecção

Cápsula polissacarídica

Fímbrias

Hemaglutininas

Hemolisinas

Neuraminidase

Fragilisina (Toxina)

Cápsula polissacarídica

Lipopolissacarídeo

Aminas

ADESÃO

ESTABELECIMENTO DA INFECÇÃO/DANO TECIDUAL

ANTIFAGOCITOSE

PRODUTO DO METABOLISMO

Principais fatores de virulência de Bacteroides

Lipopolissacarídeo

Componentes ausentes no LPS• 2-ceto-3-deoxioctanato (CDO) e heptose – polissacarídeo interno

• ácido 3-hidroxi-tetradecanóico – lipídio A

Madigan et al., 2010

Cápsula

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(120.000 X) (27.400 X)

Kasper (1976); Nakano (2006)

Cápsula

B. fragilis - três tipos reversíveis de cápsula:

grande, pequena e camada eletrodensa

(52.000 X)

Resistência ao soro

Reid e Patrick (1984)

Antifagocitose

Processo de adesão

Cápsula

Formação de abcessos

Fatores de virulência

Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.

Adesão de Bacteroides às células HEp-2

Nakano et al. (2008)

Adesão localizada

E. coli O127:H6

B. ovatus

B. vulgatus

B. fragilis

Adesão – Caco-2, WiDr (intestinal)

Padrão de adesão não definido

Invasão de Bacteroides e Parabacteroides às células HEp-2

B. fragilis

B. vulgatus

P. distasonis

Microscopia confocal

PI – Iodeto de Propídio (vermelho)

Marcador de DNADiOC – Iodeto diexiloxacarbocianina (verde)

Marcador de membrana celular

Nakano et al. (2008)

Fatores de virulência

Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.

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Adesão de B. fragilis em células HT-29

Pumbwe et al. (2007)

BSC: Sais biliares conjugado

BSM: Sais biliares (mistura)

Biofilme de B. fragilisAdesão de B. fragilis em células HT-29

Pumbwe et al. (2007)

Pumbwe et al. (2007)

Tratada com BSM

Tratada com BSC

Não tratada

Fímbrias

Vesículas de membrana externa

Neuraminidase

Neuraminidase (sialidase)

Cliva ácidos siálicos

(ácido N-acetil neuramínico)

células eucarióticas - imunoglobulinas

contribuiçãoNutrição Aderir, invadir e destruir tecidos

Fatores de virulência

Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.

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Neuraminidase

Eritrócitos

+

Bactéria (108 cél/ml)

+

PNA* – lectinade amendoim

=

Neuraminidase

Hemaglutinação

*Peanut Arachis hypogaeNakano et al. (2006)

1 2 3 4 5 6 7 8 bp

648

Detecção do gene nanH por Nested-PCR

nanH – apenas a espécie B. fragilis

Nakano et al. (2005)

Produção da neuraminidase e detecção do gene nanHem espécies do grupo B. fragilis isoladas de fezes

diarréicas (51) e não diarréicas (50)

Neuraminidase

Origem das Bactérias Produção Presença do gene

(n) n (%) n (%)

Pacientes (51) 42 (82,3) 29 (56,8)

Sadios (50) 43 (86) 37 (74)

TOTAL (101) 85 (84,1) 66 (65,3)

Nakano et al. (2006)

Enterotoxina

Toxina

Bacteroides fragilis (ETBF)

Animais (Myers et al., 1984)

Humanos (Myers et al., 1987)

Diarréia

Metaloprotease (Moncrief et al., 1995; Obiso et al., 1997)

Familia metzincina: fragilisina

Zinco – estaliza e potencializa

Histidina – essencial para o zinco

Metionina – integridade da ligação

Populações genéticas de Bacteroides fragilis

Padrão I (ETBF)

Padrão II (NTBF)

Padrão III (NTBF)

Região de 6-kb – BfPAI

Região de 12-kb – Região lateral

bft mpII

Região de 18-kb

Sears (2001)

DNA cromossômico

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Padrões genéticos B. fragilis não enterotoxigênico (NTBF) de humanos e bezerros

Bactérias Humanos Animais

(n) n (%) n (%)

NTBF padrão II 33 (62,2) 40 (80)

NTBF padrão III 20 (37,7) 10 (20)

TOTAL 53 (100) 50 (100)

Oliveira et al., 2005

Teste citotóxico de ETBF em células HT-29/C1

Controle ETBF

Nakano et al. (2005)Outras linhagens : Caco-2, T84

Mecanismo de ação da toxina

Tight junctionsE-caderina

BFT

Etapa 1

BFTMicrovilosidades

Zônula de oclusão

Zônula de aderênciaEtapa 2

Citocinas (IL-8) – leucócitos – reação inflamatória – efeito secretor

Etapa 3

Secreção de fluídos

Mecanismo in vivo

DIARRÉIA

Sears (2001)

Distribuição mundial de organismos ETBF associados à diarréia infantil

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

EUA It ália Bangladesh Calcut á Japão Brasil (SP) Nicaraguá Vietnam Turquia Brasil (MG) Brasil (SP)

%

Crianças com diarréia

Crianças sem diarréia

(1992) (1994) (1994) (1997) (1999) (2000) (2000) (2005) (2005) (2010) (2011)

294

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

190

bp

bft

bft-1

Detecção do gene bft (PCR) e subtipo bft-1(Multiplex-PCR)

Nakano et al. (2005)Três subtipos: bft-1, bft-2 e bft-3.

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Fatores de virulência

Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.

Inoculação intra-gástrica em camundongos isentos de germes

Colonização e patogenicidade de B. fragilis enterotoxigênicos

Nakano et al. (2006)

Alterações histopatológicas do produzidas nos camundongos

SubtiposÓrgãos

Ceco Cólon Fígado

bft-1

Edema moderado e aumento da lâmina

própria. Erosão extensiva e perda da camada superficial epitelial

bft-2Extensiva e proeminente

ulcerações. Erosões superficiais.

Edema e aumento das células da lâmina própria

Edema moderado e aumento da lâmina própria

Estrutura lobular preservada sem alterações degenerativas difusas, mas

com raros focos de células inflamatórias

Congestão difusa com poucas células inflamatórias

Nakano et al. (2006)

Aspectos histopatológicos do intestino grosso de camundongos

bft-1 bft-2

Não ETBFNakano et al. (2006)

Fatores de virulência

Sears, (2009)

Fatores de virulência

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Fatores de virulência

Bacteroides spp. e Parabacteroides spp.

Diversidade genética de ETBF humanos (AP-PCR)

Nakano et al., (2007)ATCC/GAI: bft-2

Importância clínica e patologias associadas

• Gêneros Bacteroides e Parabacteroides - microbiota

intestinal - predominantes: B. vulgatus, P. distasonis e

B. thetaiotaomicron (1010g/fezes).

• Abscessos e infecções extra-intestinais, sendo B.

fragilis a mais frequentemente.

• Infecções intestinais: associação com outros

enteropatógenos – diarréia (ETBF).

Bacteroides fragilis

Fascite Necrosante Peritonite

Abscesso hepático

Conclusões

- Anaeróbios gram-negativos predominantes e

clinicamente mais relevantes - infecções do trato

gastro-intestinal;

- São altamente heterogêneos – reclassificação;

- Apresentam elevada diversidade genética.