DANIELY XAVIER SOARES PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE …repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/249381/1/Soares... · 2018. 8. 26. · Carla, Ana Carolina, Bruna Campos, Eduardo,

i

DANIELY XAVIER SOARES

PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS MULTIRESPOSTAS: TRATAMENTO QUIMIOMÉTRICO

CAMPINAS 2014

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

DANIELY XAVIER SOARES

PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS MULTIRESPOSTAS:TRATAMENTO QUIMIOMÉTRICO

ORIENTADOR: PROF. DR. ROY EDWARD BRUNS CO-ORIENTADOR: PROFA. DRA. IEDA SPACINO SCARMINIO

TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO

INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM CIÊNCIAS.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR DANIELY XAVIER SOARES, E ORIENTADA PELO PROF.DR. ROY EDWARD BRUNS.

______________________ Assinatura do Orientador

CAMPINAS 2014

vii

“Que coleção de cicatrizes você tem? Nunca se esqueça de quem lhe deu as melhores. E seja

grato. Nossas cicatrizes têm o poder de nos

fazer lembrar que o passado foi real.”

Hannibal Lecter

http://pensador.uol.com.br/autor/hannibal_lecter/

ix

AGRADECIMENTOS

Embora uma tese seja, pela sua finalidade acadêmica, um trabalho

individual, há contribuições de natureza diversa que não podem e nem devem

deixar de ser realçados. Por essa razão, desejo expressar os meus sinceros

agradecimentos:

Aos meus pais por tudo apoio e por me permitirem escolher.

Ao meu irmão pela amizade e por ser minha fonte de inspiração.

Ao Professor Dr. Roy Edward Bruns, meu orientador, pela competência

científica, correções e sugestões relevantes feitas durante a orientação.

Pela paciência e atenção.

À Professora Dra. Ieda Spacino Scarminio, minha co-orientadora, pela

competência científica e orientação, bem como pela disponibilidade.

À Professora Dra. Isabel Jardim, por toda ajuda e contribuição para o

resultado final desta tese, pela atenção e disponibilidade.

Aos Professores Dr. Ronei Poppi e Dr. Fábio Gozzo, por sempre

estarem dispostos a tirar dúvidas e pela atenção.

Ao Dr. Alexandre Ferreira Gomes: namorado, amigo e companheiro

que sempre me estimula a crescer científica e pessoalmente. Pelas

inúmeras conversas sobre assuntos diversos, pelas correções e

x

comentários na tese. Acima de tudo, pelo inestimável apoio, pela

paciência e compreensão.

Aos amigos de todas as horas: Hector Koolen, Dr. Clécio Klitzke e

Adriana Godoy.

Aos amigos que conquistei no Instituto de Química: Giovana, Aline,

Carla, Ana Carolina, Bruna Campos, Eduardo, Arnaldo, Bruna Zucoloto,

Nicolas, João, Dr. Maurício (Cabuloso), Maurício (Xanxeré), Dr. Marcelo

(P2), Luana, Jandyson, Lívia, Wagner e Klécia e aos muitos outros que

também estão em meu coração.

A Dra. Márcia Breitkreitz, IAPAR e Arnaldo pela contribuição com os

conjuntos de dados.

A todo Instituto de Química, professores, técnicos e funcionários.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pelo apoio no desenvolvimento do trabalho.

Mais uma vez, a todos os meus sinceros agradecimentos.

xi

SÚMULA CURRICULAR (2010-2014)

Daniely Xavier Soares

Data de nascimento: 24/06/1985 Endereço eletrônico: [email protected]

Formação Acadêmica

2010 – 2014 Doutorado em Ciências (Química Analítica) Título: “Planejamento e otimização de processos

multirespostas: tratamento quimiométrico”

Instituto de Química – Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP), Campinas, SP

Orientador: Prof. Dr. Roy Edward Bruns

Agência Financiadora: Capes

2008 – 2010 Mestrado em Química Título: “Comparação de procedimentos de extração

de material vegetal para otimizar o rendimento de

metabólitos secundários”

Departamento de Química – Universidade Estadual

de Londrina (UEL)

Orientador: Profa. Dra. Roy Edward Bruns

Agência Financiadora: Capes

2004 – 2007 Licenciada em Química Universidade Estadual de Goiás (UEG)

2006 – 2007 Iniciação Científica em Química Analítica Título: “Avaliação das características físico-química

do leite ultrapasteurizado (UHT)”

Orientador: Profa. Ms. Tatiana de Oliveira Zuppa

Universidade Estadual de Goiás (UEG)

1. Produção Científica

mailto:[email protected]

xii

SOARES, D. X.; Scarminio, I. S.; Bruns, R. E. Mixture designs for

exploring class diversity and metabolite fingerprinting: An efficient column

chromatographic strategy. Analytica Chimica Acta, 2011.

Silva, A. F.; Soares, D. X.; Faria, S. H. D. M.; Bruns, R. E. . Basis set

selection for the calculation of the IR fundamental intensities for 1,1-

C2H2F2 and F2CO. Journal of Molecular Structure, 2011.

2. Experiência Didática

2014 - CH5 serviços em análise instrumental: Ministrou o curso de

planejamento de experimentos.

2013 - Participação no Programa de Estágio Docente (PED) do Instituto de

Química da UNICAMP, nível C, por um semestres, na disciplina QG108

(Química Geral Teórica).

2013 - Universidade Federal de Santa Maria: Ministrou o curso de

planejamento de experimentos.

2012 – Faculdade Oswaldo Cruz: Professora de quimiometria do curso de pós-

graduação em analise instrumental.

3. Apresentação de trabalhos em eventos

2014 - 37° Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. Trabalho:

Identificação dos isômeros eritrartina e 11-metoxi-erisodina através dos

espectros UV-VIS e cálculos teóricos

2013 - V Congresso da BrMass. Trabalho: Simplex centroid design

optimization for the extraction of the alkaloids in erisotrina of flowers

Erythrina speciosa Andrews.

2012 - XIII Chemometrics in Analytical Chemestry Conference.

Trabalho: Multiple criteria decision making for chromatographic and

electrophoretic separations.

2011 - 16° Encontro Nacional de Química Analítica.

Trabalhos: a) Análise multi-way dos dados CLAE-DAD da fração básica de

Erythrina speciosa Andrews. b) Análise quimiométrica e planejamento

experimental para avaliação dos espectros UV-Visível de extratos de plantas

medicinais.

2010 - 33º reunião Anual da Sociedade Brasileira de química. Trabalhos:

(a) Comparação de dois procedimentos cromatográficos de coluna aberta pata

análise de extratos das folhas de Erythrina speciosa Andrews. (b)

Planejamento estatístico de misturas em cromatografia liquida para a busca da

impressão digital de extrato de Erythrina speciosa Andrews.

xiii

RESUMO “Planejamento e otimização de processos multirespostas: tratamento

quimiométrico”

Foram estudados três parâmetros cromatográficos: tempo de retenção,

resolução e largura dos picos, em cromatogramas obtidos para uma mistura de

onze agrotóxicos. Ajustes de modelos de regressão foram construídos e

validados por ANOVA. Devido a sua simplicidade, os resultados obtidos para

tempo de retenção foram usados em um programa interativo para estudar as

separações como função de todo domínio experimental do planejamento

simplex centróide. Um planejamento de misturas envolvendo três solventes

(etanol, diclorometano e hexano) foi usado para avaliar a extração de

alcalóides em Erythrina speciosa. Resultados diferentes foram observados

para os extratos da flor, caule e folha, evidenciando que perfis de alcalóides

distintos podem ser obtidos a partir de diferentes partes da planta. Modelos de

regressão foram construídos e validados por ANOVA para dois alcalóides

(tentativamente identificados por espectrometria de massas como eritrartina e

11-metoxi-erisodina, isóbaros em m/z 330, e erisotrina em m/z 314, com base

em literatura prévia). A análise das componentes principais foi aplicada ao um

conjunto de dados de absorbância de folhas de quatro cultivares de café (IPR-

59, CAT, 027 e 083) obtidos entre 350-1100 nm por um espectroradiômetro

portátil LI_COR 1800. Esta análise somente conseguiu discriminar espectros

obtidos na face adaxial e abaxial das folhas. Como estes dados seguem um

planejamento fatorial para quatro fatores (irrigação, estratos extremos, pontos

cardeais e face) valores de efeitos foram determinados para absorbância em

três comprimentos de onda estratégicos, 520, 554 e 650 nm, que são

importantes para a quantificação de conteúdos de clorofilas e antocianinas.

xv

ABSTRACT “Design and multiresponse optimization of processes: chemometric

treatments”

Three chromatographic separation criteria were evaluated: retention time,

resolution and peak width, in chromatograms obtained from a mixture of

eleven pesticides. Regression models were constructed and validated by

ANOVA. The use of the interactive program proved to be a valuable tool for

studying peak separation behavior for the entire experimental domain of the

simplex centroid design. Three solvents (ethanol, dichloromethane and

hexane) and their binary and ternary mixtures were evaluated as extraction

media for alkaloids in Erythrina speciosa. Different results were obtained

between extracts of flowers, stems and leaves, showing that distinct alkaloid

profiles can be obtained from different sources within the plant. Regression

models were constructed and validated by ANOVA for two alkaloids

(tentatively identified by MS as erytrartine and 11-methoxy-erisodine, isobaric

ions of m/z 330, and erysothrine of m/z 314, based on previous literature).

Principal component analysis was applied to data sets of absorbance values for

leaves of four coffee cultivars (IPR-59, CAT, 027 and 083) obtained between

350 – 1100 nm by a LI_COR 1800 portable radioespectrometer. This analysis

was only able to discriminate between spectra of the abaxial and adaxial faces

of the leaves. Since the spectral data were consistent with a factorial design for

four factors (irrigated/field water, superior/inferior strata, cardinal points and

face) effect values for absorbance were calculated at four strategic

wavelengths, 520, 554 and 650 nm that are important for quantifying

chlorophyll and anthocyanin contents of coffee.

xvii

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS.............................................................................................XIX

LISTA DE FIGURAS...........................................................................................XXIII

LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................XXVII

INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................. 1

CAPITULO 1 - OTIMIZAÇÃO CROMATOGRÁFICA POR MÉTODO

COMPUTACIONAL INTERATIVO ............................................................. 13

1.1. Introdução..............................................................................................13

1.1. Parte experimental .................................................................................19

1.2. Tratamento multivariado ...................................................................... 21

1.3.1.Tempo de retenção .................................................................................21

1.3.2. Resolução.............................................................................................. 23

1.3.3. Larguras da base ...................................................................................27

1.4. Programa Computacional ......................................................................29

1.5. Conclusões 1..........................................................................................32

CAPITULO 2 – OTIMIZAÇÃO DO SOLVENTE EXTRATOR DE

ALCALÓIDES NAS FLORES, CAULE E FOLHAS DE ERYTHRINA

SPECIOSA ANDREWS .................................................................................35

2.1. Introdução .............................................................................................35

2.2. Experimental .........................................................................................41

2.2.1. Material botânico..................................................................................42

2.2.2. Preparação das amostras e extratos.......................................................43

2.2.3. Análises por UHPLC-ESI-MS..............................................................44

xviii

2.3. Resultados e Discussão..........................................................................44

2.3.1. Analise dos extratos das flores ..............................................................46

2.3.2. Analise dos extratos do caule ................................................................61

2.3.3. Analise dos extratos das folhas .............................................................71

2.4. Identificações das estruturas de alcalóides erytrinicos por cálculos

teóricos...................................................................................................85

2.5. Conclusões 2 .........................................................................................87

CAPITULO 3 - OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES PARA ABSORÇÃO

NAS FOLHAS DE CULTIVARES DE CAFÉ ..............................................91

3.1. Introdução ...............................................................................................91

3.2. Dados .......................................................................................................94

3.3. Tratamento multivariado .........................................................................96

3.4. Conclusões 3 ..........................................................................................108

xix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1. Tempos de retenção para os agrotóxicos analisados em cada ponto

do planejamento experimental e sua replica em minutos.................................21

Tabela 1.2. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média

quadrática dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e

media quadrática do erro puro (MQep) dos modelos de tempo de retenção....22

Tabela 1.3. Valores de resolução para os pares de picos com base no

cromatograma obtido no ponto central............................................................25

Tabela 1.4. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média


média quadrática do erro puro (MQep) para modelos de resolução................26

Tabela 1.5. Valores de largura da base para os picos cromatográficos de cada

agrotóxico estudado ........................................................................................28

Tabela 1.6. Valores de média quadrática da regressão (MQR) média


média quadrática do erro puro (MQep) para modelos de largura da bas.........29

Tabela 2.1. Planejamento simplex centróide com os valores de α, β, e π para

cada mistura.....................................................................................................45

Tabela 2.2. Valores de m/z encontrados nos extratos das flores de Erythrina

speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex

centróide. Cada símbolo * representa o número de vezes que cada valor de

m/z foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos

com tempos de retenção distintos....................................................................49

Tabela 2.3. Intensidades totais dos espectros de massas dos m/z pares obtidos

com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o número de

picos com m/z par para cada cromatograma....................................................50

xx

Tabela 2.4. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático as

intensidades de m/z 330 para as misturas do planejamento simplex

centróide...........................................................................................................52

Tabela 2.5. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático as


centróide...........................................................................................................55

Tabela 2.6. Valores de m/z encontrados nos extratos do caule de Erythrina


centróide. Cada símbolo # representa o número de vezes que cada valor de



Tabela 2.7. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos

com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o numero de

picos com massa par para cada cromatograma ...............................................63

Tabela 2.8. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos

com a extração baseada num planejamento simplex centróide com pontos

axiais e o número de picos com massa par para cada

cromatograma.................................................................................................. 64

Tabela 2.9. Valores de m/z encontrados nos extratos das folhas de Erythrina


centróide. Cada símbolo ▲ representa o número de vezes que cada valor de



Tabela 2.10. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides

obtidos com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o

número de picos com m/z par para cada cromatograma .................................73

Tabela 2.11. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides

obtidos com a extração baseada num planejamento simplex centróide com

xxi

pontos axiais e o número de picos com m/z par para cada

cromatograma...................................................................................................75

Tabela 2.12. Análise de variância para o ajuste do modelo cúbico especial as


centróide...........................................................................................................75

Tabela 2.13. Valores de m/z encontrados em cada mistura de solvente nas

diferentes partes da planta analisadas. Múltiplos símbolos indicam mais de um

pico cromatográfico com tempos de retenção distintos para a mesma

m/z....................................................................................................................82

Tabela 2.14. Comparação entre as frequências de absorção das transições pi-

pi*, obtidas experimentalmente e teoricamente ..............................................87

Tabela 3.1. Planejamento fatorial 24 para analise das folhas dos cultivares

com a latitude variando nos pontos cardeais .................................................100

Tabela 3.2. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm e

650nm para o cultivar IPR-59, com os valores de significância e erro padrão

para cada efeito .............................................................................................101

Tabela 3.3. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm e

650nm para o cultivar CAT, com os valores de significância e erro padrão

para cada efeito .............................................................................................102

Tabela 3.4. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520nm, 554nm e

650nm para o cultivar 027, com os valores de significância e erro padrão para

cada efeito .....................................................................................................103

Tabela 3.5. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520nm, 554nm e

650nm para o cultivar 083, com os valores de significância e erro padrão para

cada efeito .....................................................................................................104

Tabela 3.6. Planejamento fatorial 24 para análise das folhas dos cultivares

com a longitude variando nos pontos cardeais ..............................................105

Tabela 3.7. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm, e

650 nm para os quatro cultivares estudados...................................................106

xxiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas

matrizes............................................................................................................. 7

Figura 1.1. Sistema de natureza desconhecida com j respostas e k fatores ...13

Figura 1.2. Esquema de otimização multi resposta para fase móvel em

cromatografia...................................................................................................17

Figura 1.3. Planejamento simplex centróide utilizado para determinação das

composições de FM a serem utilizadas. ACN = ACN:H2O 30:70 (v/v); MeOH

= MeOH:H2O 45:55 (v/v); THF = THF:H2O 30:70 (v/v) ...............................20

Figura 1.4. Cromatograma obtido na separação de onze agrotóxicos

empregando coluna SGE C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm),

volume de injeção 10 μL, FM 1/3 ACN:H2O 30:70 (v/v), 1/3 MeOH:H2O

45:55 (v/v), 1/3 THF:H2O 30:70 (v/v), totalizando uma mistura final de

ACN:MeOH:THF:H2O 10:15:10:65 (v/v), vazão 1,0 mL/min, detecção em

210 nm e temperatura ambiente. Agrotóxicos: 1 = imazetapir, 2 = simazina,

3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =

bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin ....................................24

Figura 1.5. Representação gráfica do cálculo da largura da base para os picos

cromatográficos de cada agrotóxico estudado.................................................27

Figura 1.6. ACN:H2O 30:70 (v/v) do planejamento (a), cromatograma

simulado pelo programa computacional; (b) cromatograma experimental;

(c)cromatograma simulado. Ordem de eluição: 1 = imazetapir, 2 = simazina,


bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin ....................................30

Figura 2.1. Componentes basicos de um espectrometro de massas................39

Figura 2.2. Procedimentos experimental empregado na analise da planta

Erythrina speciosa..........................................................................................42

Figura 2.3. Planejamento simplex centróide, onde as proporções x1= etanol

(Et); x2= diclorometano (Dm); x3 = hexano (Hx). (a) Representação gráfica

das misturas do planejamento simplex centróide e (b) proporção numérica das

misturas do planejamento simplex centróide...................................................43

Figura 2.4. Cromatograma total de íons das flores de Erythrina speciosa com

a mistura (etanol:diclorometano:hexano (0.33;0.33;0.33(v/v)) ......................47

xxiv

Figura 2.5. Valores de intensidade para m/z 330 de acordo com as misturas

do planejamento simplex centróide ............................................................50

Figura 2.6. Alcalóides tentativamente identificados no gênero Erythrina,

observados por ESI (+)-MS como íons em m/z 330, sendo (a) eritrartina,

previamente reportada em Erithrina speciosa como composto majoritário2 e

(b)11-metoxi-erisodina, previamente identificado em Erythrina

lysistemon26......................................................................................................51

Figura 2.7. Superfície de resposta aplicada as intensidades referentes a m/z

330 de acordo com o planejamento simplex

centróide...........................................................................................................53

Figura 2.8. Estrutura para m/z 314, tentativamente identificada em Erythrina

speciosa como erisotrina2.................................................................................54

Figura 2.9. Valores de intensidade para m/z 314 de acordo com as misturas

do planejamento simplex centróide ...........................................................54

Figura 2.10. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os

picos.................................................................................................................57

Figura 2.11. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons

no tempo de retenção de nove minutos para as sete misturas do planejamento

simplex centróide das flores de Erythrina speciosa .......................................59

Figura 2.12. Perfis cromatográficos para os extratos das flores obtidos nas

diferentes misturas de solventes com base no planejamento simplex

centróide...........................................................................................................60

Figura 2.13. Gráfico dos loading das componentes principais 1 e 2 obtidos

com as flores da Erythrina speciosa ...............................................................61

Figura 2.14. Valores de intensidades para m/z 314 de acordo com o

planejamento simplex centróide ...............................................................63

Figura 2.15. Planejamento simplex centróide com valores médios de

intensidades para m/z 314 em suas respectivas misturas ................................65

Figura 2.16. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons

para o caule de acordo com a planejamento simplex centróide ......................66

Figura 2.17. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 2 para os

dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa ..........................................68

Figura 2.18. Gráfico dos scores para cromatogramas totais de íons das flores e

caule de acordo com o planejamento simplex centróide .................................69

xxv

Figura 2.19. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do

planejamento simplex centróide para o caule da planta e o cromatograma total

de íons em hexano puro para as flores em negrito ..........................................70

Figura 2.20. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do

planejamento simplex centróide para as flores com o cromatograma em obtido

em hexano puro em negrito .............................................................................71

Figura 2.21. Valores de intensidades para m/z 314 de acordo com o

planejamento simplex centróide ...............................................................74

Figura 2.22. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os picos com

m/z 314 ............................................................................................................76

Figura 2.23. Gráfico dos scores CP1xCP3 para os dados dos cromatogramas

totais de íons obtidos nas folhas da Erytrina speciosa ....................................78


dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa ..........................................79

Figura 2.25. Gráfico dos scores dados das flores, caule e folhas da planta na

projeção CP1xCP2xCP3 .................................................................................80


dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa .....................................81

Figura 2.27. Estrutura clássica de alcalóides eritrinicos ...........................85

Figura 2.28. Estruturas da (A) eritrartina e (B) 11-metoxi-erisodina, alcalóides

eritrínicos identificados tentativamente por MS como íons de m/z

330..................................................................................................................86

Figura 3.1. Curva de rflectância de folhas verde e saudável típica.................93

Figura 3.2. Esquema de analises para cada cultivar com as combinações

possíveis dos fatores estudadas ..................................................................95

Figura 3.3. Gráfico dos scores da CP1xCP2 para os cultivares de café com

todos os espectros irrigados e não irrigados, onde os símbolos separam as

amostras irrigadas das amostras não irrigados .........................................97

Figura 3.4. Gráfico dos escores para o conjunto de dados irrigado e não

irrigado nos quatro cultivares analisados ........................................................98

Figura 3.5. Gráfico dos 32 espectros de absorbância para os quatro cultivares

de cafés irrigados e não irrigados. Em vermelho temos os espectros obtidos na

face abaxial e em preto os espectros obtidos na face adaxial nos comprimentos

de onda de 350 até 1100nm............................................................................107

xxvii

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA Análise de variância

ACN Acetonitrila

Am Ametrina

At Atrazina

Be Bentazona

Ca Carbaril

CAT Catuaí IAC 99

Ci Cianazina

Cx Carboxim

Dm Diclorometano

Et Etanol

FM Fase móvel

Hx Hexano

IAPAR Instituto Agronômico do Paraná

IPR-59 IAPAR 59

Im Imazetapir

In Intensidade

Iz Imazaquim

Me Metsulfuron

MeOH Metanol

MQep Media quadrática do erro puro

MQfaj Média quadrática da falta de ajuste

MQR Média quadrática da regressão

m/z Razão massa/carga

PCA Analise de Componentes Principais

Rs Resolução

Si Simazina

THF Tetrahidrofurano

TIC Cromatograma totais de íons

UPLC Cromatografia liquida de ultra eficiência

v/v Volume/volume

α Acidicidade

β Basicidade

π Dipolaridade

027 Etiópia IAPAR 027

083 Etiópia IAPAR 083

xxviii

1

1. Introdução geral

O uso de computadores para analisar dados químicos cresceu

drasticamente nos últimos vinte anos, em parte devido aos recentes avanços em

hardware e software1. Cada vez mais fica evidente nos diversos segmentos da

química o crescimento científico e também tecnológico devido ao uso de

recursos computacionais, a química analítica não foge a esta regra. Na área de

química analítica, a aquisição de dados atingiu um ponto bastante sofisticado

com interface de instrumentos aos computadores produzindo uma enorme

quantidade de informação, muitas vezes complexa e variada. Uma das

características mais interessantes dos modernos instrumentos é o número das

variáveis que podem ser medidas em uma única amostra. Diante desse cenário,

os químicos analíticos se deparam com conjuntos de dados que podem oferecer

diversos tipos de informações, sendo importante ter como alternativas algumas

ferramentas matemáticas e estatísticas que possam extrair um maior número de

informações do conjunto de dados de forma criteriosa e científica2,3,4. Tais

ferramentas matemáticas e estatísticas também podem diminuir drasticamente o

tempo necessário para extrair informações relevantes com confiabilidade a

partir de grandes conjuntos de dados.

Um novo termo foi introduzido na química e denominado quimiometria,

que é uma área especificamente destinada à análise de dados químicos de

natureza multivariada. A quimiometria pode ser definida com um ramo da

química que se utiliza da matemática e da estatística de forma a obter resultados

mais satisfatórios possíveis e fornecer conhecimentos sobre os sistemas

químicos5. Esse termo surgiu pela primeira vez em 1971, quando o Professor

Svante Wold (Umea University, Suécia) criou a palavra Kemometri das

2

combinações suecas Kemo e metri. Neste mesmo ano, sugeriu a palavra

equivalente do inglês chemometrics. Em 1972 Svante Wold criou o primeiro

grupo de quimiometria. Em 1973, o primeiro artigo com o termo chemometrics

foi publicado. Em 10 de junho de 1974 a Sociedade Internacional de

Quimiometria, do inglês International Chemometrics Society foi fundada por

Svante Wold (Umea University) e Bruce R. Kowalski (University of

Washington). Em 1975 os dois primeiros artigos contendo o termo

chemometrics em seus títulos foram publicados pelo Grupo de Pesquisa em

Quimiometria do Professor Bruce R. Kowalski, sendo que estes artigos

definiram a quimiometria como uma nova disciplina da Química. Em 1976

aconteceu o primeiro Simpósio de Quimiometria6, 7.

O avanço da quimiometria veio no século 21 pelo fato de várias empresas

de desenvolvimento de software terem promovido métodos de construção de

equipamentos hifenados e mais avançados, abrindo muitas opções para

melhoria de dados analíticos. Assim, a quimiometria passou a ter um papel

importante na química analítica. Diversas contribuições da quimiometria no

tratamento de dados analíticos estão presentes na literatura, seja em dados

espectroscópicos, cromatográficos, eletroforéticos, entre outros8.

A análise multivariada envolve a análise de dados que consiste em

númerosas variáveis medidas a partir de um número de amostras. O objetivo da

análise multivariada de dados é determinar todas as variações na matriz de

dados de estudo. Assim, ferramentas quimiométricas tentam encontrar as

relações entre as amostras e as variáveis em um determinado conjunto de

dados9.

Em sistemas multivariados, a conversão da resposta instrumental no dado

químico de interesse requer a utilização de técnicas de estatística multivariada,

álgebra matricial e análise numérica. Essas técnicas são apontadas, atualmente,

3

como a melhor alternativa para a interpretação de dados e para a aquisição do

máximo de informação sobre o sistema10.

Encontrar as melhores condições para uma dada medida requer

procedimentos de otimização e encontrar as melhores respostas pode ser um

trabalho difícil já que diversas respostas simultâneas podem ser geradas em um

grande conjunto de dados. Pode-se definir otimização como sendo um processo

baseado em instruções que permitam obter o melhor resultado de uma dada

situação. Cientificamente, estas instruções são frequentemente expressas

através de métodos matemáticos que procuram maximizar ou minimizar alguma

propriedade, e obtenção das condições de controle otimizadas11, 12.

Dentre as atividades habituais em química analítica que envolvem

otimização estão13:

a) O desenvolvimento de novos métodos de análise e o melhoramento ou

adaptação de métodos já estabelecidos, estudando-se as variáveis que exibem

efeitos significativos na resposta e que podem ser ajustadas para melhorar a

eficiência do método.

b) O melhoramento do desempenho de instrumentos analíticos

complexos, por acerto simultâneo dos vários parâmetros instrumentais até que a

resposta ótima seja obtida.

c) O ajuste do modelo matemático para os dados experimentais, de tal

modo que a equação teórica represente verdadeiramente os valores

experimentais.

Os procedimentos tradicionais de otimização consistem em estudar cada

fator separadamente. Esse tipo de otimização conduz a um grande número de

experimentos que têm que ser executados, tornando-se um processo demorado e

caro. Em tais casos, uma abordagem multivariada ao problema pode ser

utilizada. Ela baseia-se na utilização de um conjunto mínimo de experimentos

4

que permite a variação e avaliação simultânea de todos os fatores estudados. Há

vários planejamentos de experimentos que se aplicam à otimização, reduzindo o

número de experimentos e fornecendo informações que conduzem à

otimização, entre eles estão: fatorial completo e fracionado, Plackett-Burman,

composto central, Box-Behnken e o simplex centróide14,15.

Por poderem ser usados em diferentes tipos de análises, os planejamentos

mais usuais são os planejamentos fatoriais e o planejamento de misturas tipo

simplex centróide. Com o planejamento fatorial é possível o estudo simultâneo

dos efeitos que vários fatores podem ter sobre a otimização de um processo.

Sua aplicação determina quais fatores tem importância sobre a resposta e como

o efeito de um fator varia de acordo com o nível dos outros fatores16. Os efeitos

são as quantidades diferenciais expressas com uma mudança de resposta

quando o nível de um ou mais fatores são alterados. As interações são a força

motriz em muitos processos de otimização de forma que, sem o uso do

planejamento fatorial, algumas interações importantes podem permanecer

escondidas, e a otimização global não pode ser alcançada. Um dos mais simples

tipos de planejamentos fatoriais utilizados no trabalho experimental é aquele

que tem dois níveis (2k). Num planejamento fatorial 2k, a cada fator podem ser

atribuídos dois níveis: baixo (-1) e alto (+1). Se k fatores são considerados,

então um minímo de 2k medições são realizadas numa análise fatorial17.

Nos planejamentos com misturas, muito aplicados nesta tese, as

propriedades estudadas dependem da proporção dos componentes da mistura e

não da quantidade de cada componente da mistura18. Nesse caso, as variáveis

não são independentes, ou seja, se o nível de uma variável muda significa que o

nível de alguma outra variável também irá mudar, já que a proporção ente elas é

a característica de interesse e o total da mistura corresponde a 100%k. Assim

temos a seguinte restrição19:

5

(1)

de forma que Xi é a proporção dos componentes na mistura e q é o número de

componentes da mistura. Com três componentes (q=3) o espaço da mistura é

um triângulo, chamado simplex, onde os vértices correspondem à composição

dos componentes puros, ou seja, 100% de um componente simples. Nas arestas

estão as misturas binárias em mesma proporção e o centro do triângulo

corresponde à mistura na mesma proporção dos três componentes da mistura. A

mesma ideia pode ser aplicada para q=4, onde a figura geométrica seria um

tetraedro. Maiores números de componentes da mistura levam a figuras mais

difíceis de serem visualizadas, dificultando o processo de otimização já que o

planejamento de misturas explora todo o espaço da figura geométrica20.

Na etapa de avaliação dos resultados dos experimentos, técnicas como a

análise de variância (ANOVA) e a utilização de equações de regressão

encontram larga aplicação. Para estudar o efeito da composição da mistura na

variável resposta de um ensaio, podem-se utilizar modelos matemáticos, que

fazem uso da resolução de equações pelo método dos mínimos quadrados para

encontrar soluções que expressem o comportamento de uma variável

dependente em função da proporção de cada fator estudado. Em geral, utilizam-

se modelos lineares, quadráticos ou cúbicos que usam o mesmo número de

ensaios que o número de coeficientes que se quer estimar21, 22.

Em geral, os modelos usados em planejamentos de mistura são o

quadrático e o cúbico especial. O polinômio cúbico especial é uma forma

reduzida do polinômio de terceiro grau que contém informações sobre as

misturas de todos os componentes. Com q=3 componentes, por exemplo, os

modelos quadráticos e cúbicos especiais, respectivamente são23:

6

= β1X1 + β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + (2)

= β1X1+ β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + β123X1X2X3 + (3)

Onde y representa a função resposta dos dados experimentais; X1, X2 e

X3 são variáveis de mistura que correspondem às proporções dos componentes

estudados, e β representa os parâmetros estimados. A partir das respostas

experimentais e dada a forma do modelo estima-se o vetor dos parâmetros β, de

forma que o modelo se ajuste adequadamente aos dados. O vetor β é o resultado

da operação matricial apresentada na equação 4:

(4)

O teste mais geral de ajuste do modelo aos dados é o teste F de análise de

variância, que verifica a significância do modelo como um todo. Através do

modelo ajustado, pode-se realizar a otimização da variável de resposta de

interesse, isto é, obter a combinação de variáveis de controle que propiciará a

melhor resposta do sistema com o qual se está trabalhando com o menor custo.

Para extrair o máximo de informações dos resultados de um experimento

químico, um grande número de variáveis está envolvida24. Muitas vezes, apenas

parte dessas variáveis contém informações relevantes e a maioria das variáveis

adiciona pouco ou quase nada à interpretação dos resultados em termos

químicos. A redução de variáveis através de critérios objetivos, que permita

dizer quais são as variáveis de interesse contendo maior informação, pode ser

alcançada através da Análise de Componentes Principais (PCA), que permite

explorar os resultados obtidos por meio de análises químicas com intuito de

verificar a existência de similaridade entre as amostras.

7

A PCA é um método que tem por finalidade básica a redução de dados a

partir de combinações lineares das variáveis originais. Na PCA, a

decomposição é calculada através da diagonalização da matriz XtX ou XXt. A

matriz X (n x p), formada por n objetos e p variáveis é decomposta no produto

de duas matrizes menores, equação 5:

X = T x P’ + (5)

no qual T é a matriz dos scores das componentes principais, P é a matriz

loadings (pesos) das componentes principais, e é a matriz dos resíduos. O

sobrescrito t indica a transposta da matriz e q é um escalar que indica o número

de componentes principais que descreve a maior parte da variância dos dados.

Este procedimento está representado esquematicamente na Figura 125.

Figura 1. Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas matrizes.

Após os cálculos, os resultados são utilizados para interpretar a

distribuição das amostras num gráfico bidimensional das componentes

principais e posteriormente identificar e julgar a importância das variáveis

originais escolhidas, pois as variáveis originais com maiores valores de

loadings na combinação linear das componentes principais são as mais

importantes do ponto de vista estatístico26.

q

.

p p

n

X

n

q

T

P t

n

p

= +

8

Os chamados dados brutos, ou seja, dados obtidos diretamente de uma

análise podem apresentar diversas fontes de variação. Isso causa irregularidades

sistemáticas na linha de base, ruídos instrumentais ou unidades e magnitudes.

Antes da realização do tratamento multivariado pode ser necessário um pré-

processamento para remover fontes indesejáveis de variações que podem afetar

as variáveis do conjunto de dados como um todo.

Essa etapa é muito importante para os resultados obtidos no tratamento

multivariado. Os principais pré-processamentos são o centrado na média, que

subtrai de cada elemento da linha a média de sua respectiva coluna; o

escalonamento, onde cada elemento fica na mesma escala fazendo com que

cada variável fique com o mesmo peso; auto-escalonamento, que centraliza os

dados na média e faz o escalonamento, deixando as variáveis com média zero e

desvio-padrão igual a um. Outros pré-processamentos vem sendo utilizados

como, por exemplo, a derivação. Essa etapa deve ser avaliada com cuidado e a

decisão de qual pré-processamento deve ser coerente com a natureza dos dados.

Para isso é muito importante ter conhecimento aprofundado sobre o sistema em

estudo27.

Tendo em vista a complexidade dos dados analíticos e a importância de

condições que levem a melhores resultados, com extração do maior número de

informações possível, ferramentas quimiométricas foram aplicadas a dados

multirespostas para estudar e otimizar os fatores que levam as melhores

respostas. Foram utilizados planejamentos fatoriais e de misturas com o

objetivo de eliminar fatores que não afetam os resultados e chegar a condições

que levem ao máximo em cada conjunto de dados.

No capítulo 1 o objetivo geral foi utilizar planejamento de misturas para

otimizar separações cromatográficas. Modelos de regressão foram construídos e

9

usados num programa computacional interativo para investigar a separação

cromatográfica em todo domínio experimental.

No capítulo 2 o objetivo geral foi a aplicação de planejamento de

misturas para otimizar o solvente extrator na planta medicinal Erythrina

speciosa e avaliar a influência de misturas de solventes na extração de

alcalóides, principais constituintes da planta, e identificar similaridades nas

extrações por PCA.

No capítulo 3 o objetivo geral foi utilizar planejamentos fatoriais para

avaliar a influência dos fatores na absorção de clorofila e antocianinas em

cultivares do café para otimizar as melhores condições de absorção. Um estudo

exploratório dos dados experimentais foi feito por PCA.

_____________________________________________________________

1 CORREIRA, P. R. M.; FERREIRA, M. M. C. Reconhecimento de padrões por métodos

não supervisionados: explorando procedimentos quimiométricos para tratamento de dados

analíticos. Química Nova. 30, 481-487, 2007. 2 SAVORANI, F.; RASMUSSEN, M. A.; MIKKELSEN, M. S.; ENGELSEN, S. B. A

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International. 54, 1131–1145, 2013. 3 KANIU, M. I.; ANGEYO, K. H.; MWALA, A. K.; MANGALA, M. J. Direct rapid

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X-ray fluorescence and scattering spectrometry. Analytica Chimica Acta. 729, 21-25, 2012. 4 ORLANDINI, S.; GOTTI, R.; FURLANETTO, S. Multivariate optimization of capillary

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10,1016/j.jpha.2013.12.001, 2014.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000326701200534Xhttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000326701200534Xhttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000326701200534Xhttp://www.sciencedirect.com/science/journal/01697439http://www.sciencedirect.com/science/journal/01697439

10

8 ALI, K.; IQBAL, M.; FORTES, A. M.; PAIS, M. S.; KORTHOUT, H. A. A. J.;

VERPOORTE, R.; CHOI, H. Y. Red wines attenuate TNF production in human histiocytic

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141, 3124–3130, 2013. 9 PLATIKANOV, S.; RODRIGUEZ-MOZAZ, S.; HUERTA, B.; BARCELÓ, D.; CROS,

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http://www.sciencedirect.com/science/journal/03014797http://www.sciencedirect.com/science/journal/03014797/140/supp/Cjavascript:LinkDetalhes(parent.hiddenFrame.modo_busca,500,4,202786,1,'resultado',1);

11

22 LANDSHEER, J.; WITTENBOER, G. V. D.; MAASSE, G. H. Additive and

multiplicative effects in a fixed 2x2 design using ANOVA can be difficult to differentiate:

Demonstration and mathematical reasons. Social Science Research. 35, 279–294, 2004. 23 VOINOVICH, D.; CAMPISI, B.; PHAN-TAN-LUU, R. Experimental Design for

Mixture Studies. Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis.

Elsevier, 2009. 24 CORREIRA, P. R. M.; FERREIRA, M. M. C. Reconhecimento de padrões por

métodos não supervisionados: explorando procedimentos quimiométricos para tratamento de

dados analíticos. Química Nova. 30, 481-487, 2007. 25 GE, Z. Quality prediction and analysis for large-scale processes based on multi-level

principal component modeling strategy. Control Engineering Practice. 31, 9-23, 2014. 26 YUDTHAVORASIT, S.; WONGRAVEE, K.; LEEPIPATPIBOON, N. Characteristic

fingerprint based on gingerol derivative analysis for discrimination of ginger (Zingiber

officinale) according to geographical origin using HPLC-DAD combined with

chemometrics. Food Chemistry. 158,101-111, 2014. 27 PARENTE, A.; SUTHERLAND, J. C. Principal component analysis of turbulent

combustion data: Data pre-processing and manifold sensitivity. Combustion and Flame. 160,

340–35, 2013.

13

Capitulo 1 - Otimização cromatográfica por método

computacional interativo

1.1. Introdução

Um dos problemas mais comuns para o experimentalista é determinar a

influência de vários fatores ou variáveis sobre as respostas ou propriedades de

um sistema. A Figura 1.1 descreve um sistema de natureza desconhecido com j

respostas ou propriedades que serão otimizadas manipulando os níveis de k

fatores ou condições experimentais.

Figura 1.1. Sistema de natureza desconhecida com j respostas e k fatores.

O grande desafio na otimização de sistemas químicos é simultaneamente

tratar muitas respostas. As condições experimentais que melhoram algumas

respostas muitas vezes resultam em piora nos valores de outras respostas.

Existem dois métodos sendo usados em química para otimizar sistemas

14

multirespostas. Ambos são baseados em modelos empíricos obtidos dos

resultados de um planejamento experimental1. Um dos métodos consiste na

sobreposição das curvas de níveis de superfícies para cada resposta investigada.

O pesquisador visualmente tenta achar regiões dentro do domínio experimental

para as quais todas as respostas têm valores aceitáveis. O segundo utiliza a

função de desejabilidade de Derringer e Suich. Esta função consiste de um

produto das desejabilidades individuais de cada resposta. Utilizando os modelos

empíricos que estão armazenados no computador, um algoritmo computacional

faz uma busca para as condições experimentais que maximiza a desejabilidade

global. Além de ser de uso difícil para o experimentalista e de exigir a escolha

dos valores de vários parâmetros abstratos, sua aplicação requer a especificação

de um alvo que nem sempre é fácil de definir 1.

A otimização em cromatografia é um grande passo para funcionamento

ótimo da técnica, porém é complicado achar uma condição cromatográfica que

atinja todos objetivos da análise. Um fator complicado é que os objetivos da

otimização cromatográfica podem variar consideravelmente de um caso para

outro. Por exemplo, pode ser necessária a separação de todos ou apenas de

alguns picos relevantes em um cromatograma complexo.

Um problema de interesse contínuo em cromatografia líquida é o

desenvolvimento de procedimentos práticos para otimizar processos de

separação2. Neste caso, a composição e valor de pH da fase móvel são de suma

importância bem como outros fatores, como tipo de coluna e química da fase

estacionária, temperatura, etc. Métodos multivariados de otimização baseados

em conceitos estatísticos tem bastante sucesso na otimização do sistema

extrator, bem como da fase móvel em cromatografia líquida de alta eficiência2,3.

Primeiro, porque as interações entre os fatores somente podem ser descobertas

usando-se estratégias multivariadas. Segundo, os parâmetros calculados para

15

modelos multivariados são mais precisos do que as medidas individuais usadas

para determinar o modelo. Terceiro, planejamentos multivariados economizam

experimentos. As otimizações são alcançadas usando menor tempo, menos

materiais e de uma maneira bem mais segura. O pesquisador pode sistematizar

seu trabalho usando métodos multivariados de forma bem mais objetiva do que

usando métodos convencionais de otimização 4,5.

O estado da arte em separações de picos em cromatografia líquida inclui

a utilização de modelos estatísticos obtidos de resultados de planejamentos de

experimentos para descrever como os sinais analíticos se comportam como

função das condições cromatográficas como composição da fase móvel, tipo e

temperatura da coluna, fluxo da fase móvel entre outras. As primeiras tentativas

nesse sentido envolveram o uso de funções objetivas que combinam

informações de vários pares de picos e tentam descrever a separação global de

um cromatograma. Mais de que uma dúzia de funções objetivas foram

propostas e revisadas na literatura na tentativa de otimizar as separações

cromatográficas6,7.

Diferentes critérios têm sido sugeridos na literatura para avaliar a

qualidade das separações cromatográficas. Os critérios de otimização que

descrevem adequadamente a qualidade da separação estão entre os fatores

essenciais que determinam a aplicabilidade dos procedimentos. A resolução é

critério o mais clássico de otimização8.

A resolução entre dois picos consecutivos é frequentemente escolhida

como um critério elementar na construção de funções de resposta. A resolução

de dois picos adjacentes é habitualmente definida como uma função da largura

de cada pico na base (ou a metade da altura) e a diferença nas distâncias de

retenção para os picos de interesse. Embora esta descrição possa ser aplicada, a

mesma não é usual quando há sobreposição e assimetria de picos, que

16

constituem perfis bastante comuns no caso da separação de misturas

complexas9.

A resolução pode ser calculada a partir da distância que separa os pontos

máximos dos picos (dR) e da média das larguras de suas respectivas bases (wb):

(1.1)

Quando a resolução é 1, os dois picos são razoavelmente separados. Um

valor de resolução de 1,25 é suficiente para fins quantitativos e acima de 1,5

têm-se separação completa10. Quando se pretende otimizar a resolução de

apenas dois picos, a expressão para a resolução entre os dois picos é bastante

simples. O problema se torna mais difícil quando se tenta descrever a resolução

global de um cromatograma de componentes múltiplos11.

A desvantagem no uso do critério resolução em sistemas cromatográficos

é que existem várias resoluções de pares de picos que precisam ser otimizadas

simultaneamente. Mais do que isto várias mudanças de ordem de eluição são

observadas complicando o processo de otimização das separações de misturas.

Idealmente seria mais conveniente utilizar tempos de retenção como critério

cromatográfico para otimização. Além de simplificar a modelagem para

amostras que apresentam inversão de picos, no caso dos tempos de retenção os

modelos estatísticos devem ser mais precisos do que aqueles para resoluções,

porque o tempo de retenção depende do comportamento de um pico só ao invés

de um par de picos. Mas para a otimização com metodologia conhecida, no

caso, para a função de desejabilidade é necessário um valor alvo para cálculo da

função, que não pode ser expresso em termos de tempos de retenção12.

17

A resolução também apresenta limitações. Trata-se de um critério não

normalizado, que restringe as possibilidades de combinações de valores

elementares e torna a interpretação mais difícil. Refere-se a par de picos, em

vez de picos individuais, o que implica em restrição quando o objetivo não é

separação de todos os componentes, mas a resolução de alguns compostos

particulares. A atribuição de valores é problemática quando a ordem de eluição

é alterada, por exemplo, com a mudança da composição da fase móvel13. A

Figura 1.2 descreve um planejamento tipo simplex centróide para a composição

da fase móvel, onde os valores das resoluções são representados por superfícies

de respostas que, quando sobrepostas, podem alcançar uma única região

otimizada, desde que os máximos individuais estejam nas mesmas regiões de

cada figura. Porém, em dados cromatográficos, isso se torna complicado, pois

nem sempre a região otimizada individualmente será a mesma para todos os

compostos analisados.

Figura 1.2. Esquema de otimização multiresposta para fase móvel em

cromatografia líquida.

Em otimização multiresposta, Figura 1.2, as variáveis são avaliadas

simultaneamente em relação a mais de uma resposta. Isso implica na

determinação do ponto na superfície de resposta onde em relação aos critérios

estabelecidos as respostas apresentem melhor desempenho ao mesmo tempo.

18

Os poucos métodos disponíveis para otimizar várias respostas

cromatográficas simultaneamente como sobreposição de superfícies de

respostas e o método de desejabilidade de Derringer e Suich que são úteis em

termos de resolução entre pares de picos e retenções relativas. Infelizmente isto

não é possível usando tempos de retenção porque as propriedades a serem

otimizadas dependem das localizações de mais do que um pico.

Devido à importância dos critérios de separação cromatográfica, foram

comparados três parâmetros: tempo de retenção, resolução e largura na base dos

picos com o objetivo de comparar as precisões de modelos obtidos de

planejamentos de experimentos. Isso permitirá avaliar a viabilidade do uso de

modelos de tempo de retenção juntamente com a computação gráfica na

otimização multiresposta de sistemas cromatográficos. Tendo em vista as

vantagens em fazer modelagem estatística usando tempos de retenção, que trata

picos individuais, o desenvolvimento de um método de otimização por

simulação dos comportamentos de picos cromatográficos com mudanças nas

condições cromatográficas foi utilizado.

A simulação foi feita com base em um programa de computação gráfica

desenvolvido na Universidade Estadual de Londrina pelo Professor Doutor

Carlos Alberto Paulinetti da Camara. Através do ponteiro do mouse escolhe-se

um conjunto de condições dentro do domínio experimental já investigado por

planejamento de experimentos. Os valores das condições cromatográficas serão

substituídos nos modelos estatísticos onde o tempo de retenção de todos os

picos cromatográficos de interesse é calculado. Esses tempos são então exibidos

graficamente na tela de computador. O usuário manipula o mouse dentro do

domínio experimental até conseguir obter um cromatograma simulado que

satisfaça os objetivos previamente definidos, como a maximização das

resoluções de todos os picos.

19

1.2. Parte experimental

O conjunto de dados cromatográficos utilizado foi obtido em

experimentos realizados no laboratório da Professora Doutora Isabel Cristina

Sales Fontes Jardim, no Instituto de Química da Universidade Estadual de

Campinas.

Uma mistura complexa envolvendo onze agrotóxicos foi analisada por

cromatografia liquida de alta eficiência com detector do tipo arranjo de diodos.

A mistura de agrotóxicos foi composta de imazetapir (Im), imazaquim (Iz),

ametrina (Am), cianazina (Ci), simazina (Si), atrazina (At), bentazona (Be),

carbaril (Ca), carboxim (Cx), tiofanato metílico (Tm) e metsulfuron (Me). Essa

mistura de agrotóxicos apresentou problemas de sobreposição de picos em

trabalhos anteriores14.

Um planejamento simplex centróide foi empregado para a fase móvel. Os

três modificadores orgânicos mais usados em cromatografia líquida em fase

reversa são acetonitrila, metanol e tetrahidrofurano, que correspondem

respectivamente aos pontos 1, 2 e 3 do planejamento, Figura 1.3. A água foi

usada para ajustar as misturas de forma que os três solventes apresentassem

mesma força cromatográfica.

As condições cromatográficas foram: temperatura ambiente, eluição

isocrática (acidificada a pH 3 com ácido fosfórico) de 1 mL/min. Foram

utilizadas duas colunas recheadas com as seguintes fases estacionárias: SGE

C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm) e Thermo Hypersil ODS

C18 (4,6 x 150 mm, partículas de 5 µm). As corridas foram realizadas

empregando-se um cromatógrafo a líquido marca Shimadzu, constituído de

auto injetor com amostragem programada de 10 µL, modelo SIL-10AF;

bombas de alta pressão, tipo recíproca, pistão duplo, modelo LC-10AT;

https://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CBwQFjAA&url=http%3A%2F%2Fdgp.cnpq.br%2Fbuscaoperacional%2Fdetalhepesq.jsp%3Fpesq%3D7627341680778347&ei=FJLWU8-sE-HO8AGmsIGgAQ&usg=AFQjCNHkxPETUqEkx4h1c4hgtjIAxz0StQ&bvm=bv.71778758,d.b2U

20

detector espectrofotométrico de arranjo por diodos, cela do injetor de 8 µL de

volume, 10 mm de caminho óptico, modelo SPD-M10AVP; sistema de

aquisição de dados: microcomputador, com software de aquisição de dados

cromatográficos Class VP; forno para coluna, modelo CTO-10AS; controlador

de sistema SCL-10 A.

Figura 1.3. Planejamento simplex centróide utilizado para determinação das

composições de FM a serem utilizadas. ACN = ACN:H2O 30:70 (v/v); MeOH

= MeOH:H2O 45:55 (v/v); THF = THF:H2O 30:70 (v/v).

Para cada coluna foram gerados dois conjuntos de dados, nos quais a

composições (v/v) de fase móvel dos vértices do planejamento simplex

centróide foram:

1) ACN:H2O (30:70); MeOH:H2O (45:55); THF:H2O (30:70).

2) ACN:H2O (55:45); MeOH:H2O (70:30); THF:H2O (50:50).

Foram gerados dois conjuntos de dados, utilizando as mesmas condições

cromatográficas com exceção da coluna, que foi variada entre a coluna SGE e

a coluna Thermo descritas acima. Porém, os experimentais não foram uteis

para fins de previsão, pois apresentaram falta de ajuste para praticamente todos

21

os agrotóxicos. Como alternativa, o conjunto de dados apresentados nos

cálculos foi gerado por Marcia Breitkreitz14 com uma coluna SGE (idêntica à

descrita acima) nas condições de fase móvel 1 demonstrada acima.

1.3. Tratamento multivariado

1.3.1. Tempo de retenção

Os tempos de retenção para cada agrotóxico analisado, em todas as

misturas do planejamento e suas réplicas, são apresentados da Tabela 1.1:

Tabela 1.1. Tempos de retenção, em minutos, para os agrotóxicos analisados

em cada mistura do planejamento experimental e sua réplica em minutos. ACN MeOH THF Im Si Iz Am Ci Tm Me At Be Ca Cx

1 0 0 9,75 10,41 11,30 11,30 13,86 14,82 17,70 18,43 20,00 6,41 22,15

0 1 0 11,97 13,60 19,60 9,53 11,97 13,60 22,28 22,25 15,73 9,46 15,17

0 0 1 9,25 9,91 13,93 10,50 18,78 7,68 15,46 15,50 9,60 5,01 12,20

0,5 0,5 0 12,20 15,45 17,81 12,20 16,20 18,35 22,76 22,75 20,20 10,07 20,20

0,5 0 0,5 8,45 7,28 10,80 9,15 14,87 8,45 15,27 14,40 11,85 5,37 13,27

0 0,5 0,5 8,94 6,89 12,89 8,94 17,37 8,34 15,83 15,13 11,21 4,97 12,48

0,33 0,33 0,33 5,74 9,17 8,10 12,60 9,17 16,02 9,67 16,04 16,02 13,27 14,02

1 0 0 9,26 9,73 10,65 10,65 12,85 13,56 18,47 17,15 18,40 6,08 20,45

0 1 0 12,20 13,25 10,03 9,95 12,72 14,02 22,20 22,16 15,92 9,51 15,40

0 0 1 9,35 6,87 14,76 10,67 19,54 7,64 15,98 15,96 9,73 4,90 12,44

0,5 0,5 0 12,45 16,10 18,69 12,45 16,79 19,22 23,66 23,68 21,08 9,84 21,08

0,5 0 0,5 8,83 7,57 11,71 9,62 15,92 9,15 14,38 15,25 12,54 5,52 14,04

0 0,5 0,5 9,22 7,06 13,89 9,22 18,26 8,60 15,13 15,79 11,67 5,03 12,97

0,33 0,33 0,33 5,63 9,26 8,09 13,01 9,26 16,51 9,75 16,53 16,51 13,59 14,42

22

Com as respostas de tempo de retenção para cada um dos agrotóxicos

foram construídos modelos de regressão para obter uma relação que nos

permitisse prever estes valores de tempo de retenção como função dos valores

de proporções dos solventes. Primeiramente foi aplicado o modelo linear,

porém a análise de variância utilizada para testar o ajuste do modelo no nível de

95% de confiança apresentou equação inadequada para representar

precisamente os dados.

O modelo quadrático foi avaliado quanto ao ajuste dos dados no nível de

95% de confiança e os resultados da ANOVA para esse teste estão apresentados

na Tabela 1.2, assim como o teste para significância da regressão.

Tabela 1.2. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média quadrática

dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e media

quadrática do erro puro (MQep) dos modelos de tempo de retenção. Agrotóxico MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*

Imazetapir 10,55 1,46 1,44 0,02 7,20 72,00

Simazina 5,40 0,65 0,61 0,04 8,24 14,36

Imazaquim 26,06 4,60 3,86 0,74 5,67 5,21

Ametrina 13,87 10,80 3,98 6,82 1,28 0,58

Cianazina 3,10 1,28 1,21 0,07 2,43 16,94

Tiofanato 13,47 1,20 0,87 0,33 11,22 2,62

Metsulfuron 38,62 7,01 6,79 0,22 5,51 30,80

Atrazina 0,40 7,90 1,21 6,69 0,05 0,18

Bentazona 27,40 2,44 2,14 0,29 11,25 7,28

Carbaril 39,85 2,32 2,02 0,30 17,20 6,76

Carboxin 32,65 2,24 1,90 0,34 14,58 5,58

*Valor de F para significância dos resultados dado por MQR/MQr e para

falta de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de

95% de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.

A razão MQfaj/MQep é usada para avaliar se o modelo está ou não bem

ajustado as observações. Valores altos dessa razão significam maior falta de

23

ajuste. O valor dessa razão é comparado com o valor de F tabelado com os

graus de liberdade correspondentes, que nesse caso é 1 e 7.

O valor de F 1,7 é 5,59 e com base na Tabela 1.2, o imazetapir, a simazina,

a cianazina e metsulfuron apresentaram falta de ajuste no nível de 95% de

confiança. A bentazona e o carbaril estão bem próximos do valor tabelado, já o

imazaquim, ametrina, tiofanato, atrazina e o carboxin apresentaram valores

menores ao valor de Ftab para o modelo quadrático.

No nível de 95% de confiança F5,8 é 3,69. Nesse caso a regressão é

estaticamente significativa se MQR/MQr > 3,69. Com base na Tabela 1.2,

apenas a ametrina, cianazina e a atrazina não apresentam significância

estatística da regressão, porém nenhuma razão tem valor altamente

significativo.

Os dados foram testados em relação ao ajuste com o modelo linear,

porém ocorreu falta de ajuste para todos os agrotóxicos. O modelo cúbico

especial também foi testado, mas não apresentou resultados mais satisfatórios

do que o modelo quadrático.

Para testar modelos mais superiores é necessário um número bem maior

de experimentos e as funções assim obtidas teriam comportamentos complexos

e dificilmente seriam representadas por polinômios de baixa ordem. Como

resultado os modelos estatísticos determinados para tempos de retenção não

representaram precisamente os resultados experimentais.

1.3.2. Resolução

Muitos problemas que assolam tradicionais funções cromatográficas de

resposta ou de critérios de separação podem ser atribuídos às sobreposições de

picos, situação em que dificilmente se obtém informações suficientes quanto ao

24

número de componentes, grau de pureza e de sobreposição de pico a partir de

uma única resposta no cromatograma16.

No caso da mistura de agrotóxicos o uso da resolução tornou-se

complicado devido à enorme inversão de picos de um ponto do planejamento

simplex centróide em relação aos outros. A ordem de eluição obtida no

cromatograma do ponto central foi tomada como base para os possíveis pares

de picos e esta ordem pode ser vista na Figura 1.4.

5 10 15 20 25

40

60

80

100

120

140

160

180

2001/3ACN:1/3MeOH:1/3THF

6+8+9

11

10

4

7

2+5

31

Inte

nsid

ade d

e a

bsorb

ância

Tempo / min

Figura 1.4. Cromatograma obtido na separação de onze agrotóxicos

empregando coluna SGE C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm),

volume de injeção 10 μL, FM 1/3 ACN:H2O 30:70 (v/v), 1/3 MeOH:H2O 45:55

(v/v), 1/3 THF:H2O 30:70 (v/v), totalizando uma mistura final de

ACN:MeOH:THF:H2O 10:15:10:65 (v/v), vazão 1,0 mL/min, detecção em 210

nm e temperatura ambiente. Agrotóxicos: 1 = imazetapir, 2 = simazina,


bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin.

25

A Tabela 1.3 agrupa os valores de resolução para cada par de picos,

calculados de acordo com a equação 1. Os pares de picos seguindo a ordem da

Figura 1.4 e seus valores de resolução estão na Tabela 1.3.

Tabela 1.3. Valores de resolução para os pares de picos usando como base a

ordem de eluição do cromatograma obtido no ponto central. ACN MeOH THF 1 e 3 3 e 2 2 e 5 5 e 7 7 e 4 4 e 10 10 e 11 11 e 6 6 e 8 8 e 9

0 1 0 9,30 -1,45 3,46 8,08 -8,08 20,08 4,96 -19,04 9,00 1,50

1 0 0 9,00 -2,54 -5,19 9,42 11,47 -7,15 -1,15 -6,23 1,38 21,46

0,5 0,5 0 4,38 5,54 2,77 -6,69 14,54 -9,92 6,00 15,23 -4,38 -3,23

0 0,5 0,5 13,15 -7,62 0 14,08 -1,15 5,54 0 -9,23 2,77 12,46

0 0 1 4,38 2,77 1,62 -1,62 5,31 2,54 3,23 3,69 2,08 -3,23

0,5 0 0,5 4,45 4,71 0 -1,25 10,39 -3,92 3,00 11,54 -2,31 -3,12

0,33 0,33 0,33 5,42 2,54 0 1,13 6,97 1,43 1,62 4,73 0 0

1 0 0 8,31 -0,92 3,00 6,92 -6,92 18,00 4,85 -17,77 8,31 1,62

0 1 0 9,46 -3,69 -5,77 9,46 13,85 -9,00 -1,15 -7,39 -2,31 21,46

0 0 1 4,62 5,77 2,77 -6,92 16,62 -11,77 6,23 16,62 -4,85 -3,46

0,5 0,5 0 13,85 -8,54 0 15,69 -1,15 5,31 0 -9,69 2,77 13,15

0,5 0 0,5 4,85 2,77 1,85 -0,92 5,77 2,08 3,23 4,38 2,08 -3,46

0 0,5 0,5 4,85 4,85 0 -1,38 12,23 -5,08 3,00 12,23 -2,54 -3,23

0,33 0,33 0,33 5,54 2,77 0 0,92 7,62 1,38 1,85 4,85 0 0

Os valores de resolução para todos os pontos do planejamento simplex

centróide foram submetidos a análise de variância ANOVA para testar o ajuste

do modelo quadrático aos dados. A Tabela 1.4 apresenta os valores para estimar

a significância da regressão e da falta de ajuste no nível de 95% de confiança.

Para testar a falta de ajuste, o valor tabelado de F 1,7 foi 5,59. Com base

na Tabela 1.4, a maioria dos pares de picos apresentou falta de ajuste. Os pares

1-3, 3-2, 2-5, 5-7 apresentaram alto valor de MQfaj/MQep indicando que o

modelo quadrático não se ajusta aos dados. Os pares 4-10, 10-11, 11-6 e 6-8

não apresentaram falta de ajuste. E os pares 7-4 e 8-9 têm valores calculados

próximos do valor tabelado podendo ser ajustados ao modelo quadrático.

26

Tabela 1.4. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média quadrática

dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e média

quadrática do erro puro (MQep) para modelos de resolução. Pares de picos MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*

1 -3 26,80 5,74 5,59 0,15 4,67 37,05

3 - 2 55,39 11,53 11,34 0,19 4,80 61,28

2 - 5 20,05 0,66 0,62 0,04 30,37 14,52

5 - 7 132,93 13,81 13,48 0,32 9,63 41,59

7 - 4 157,97 9,53 8,44 1,10 16,58 7,70

4 - 10 239,66 0,91 0,03 0,91 263,36 0,03

10 - 11 15,93 0,01 0,04 0,09 1592,55 0,48

11 - 6 363,07 1,39 0,96 0,43 261,20 2,22

6 - 8 43,54 1,59 0,57 1,03 27,38 0,55

8 - 9 225,23 0,49 0,46 0,04 459,66 10,40

*Valor de F para significância dos dados dado por MQR/MQr e para falta

de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de 95%

de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.

A regressão é estaticamente significativa se MQR/MQr > 3,69. Com base

na Tabela 1.4, todos os pares de picos apresentam significância estatística da

regressão.

As variáveis em questão, proporções de acetonitrila, metanol e

tretrahidrofurano, exercem influência sobre a resposta do cromatograma.

Mudando-se a composição da fase móvel, a separação da mistura analisada

também muda. As misturas binárias entre esses solventes também tem efeito

significativo diante da resposta cromatográfica. Um modelo mais complexo

poderia ser testado, visando melhorar a falta de ajuste e significância da

regressão, porém seria necessária uma grande quantidade de experimentos.

27

1.3.3. Largura da base

O tempo de retenção e a resolução são regularmente aplicados para

avaliar a qualidade do cromatograma obtido, já os valores referentes à largura da

base, ou seja, a distância entre as tangentes traçadas nas laterais do pico, não são

comumente usados, mas de qualquer maneira foram testados para avaliar a falta

de ajuste e a significância da regressão. Isso é importante porque além de simular

o tempo de retenção de cada pico no programa computacional também é

necessário prever a largura dos picos para se ter uma indicação da separação real

entre os picos.

A Tabela 1.5 contém os valores de largura da base dos picos

cromatográficos para cada agrotóxico presente na mistura estudada. Esses valores

foram obtidos pela subtração: X2 – X1, como representado na Figura 1.5:

Figura 1.5. Representação gráfica do cálculo da largura da base para os picos

cromatográficos de cada agrotóxico estudado.

28

Tabela 1.5. Valores de largura da base para os picos cromatográficos de cada

agrotóxico estudado. ACN MeOH THF Im Si Iz Am Ci Tm Me At Be Ca Cx

1 0 0 0,44 0,66 0,6 0,76 0,76 0,76 0,75 0,69 0,81 1,11 0,92

0 1 0 0,46 0,65 0,71 1,15 0,64 0,44 0,53 0,71 1,10 1,43 1,43

0 0 1 0,3 0,91 0,48 0,84 0,66 0,68 0,54 0,78 0,82 0,94 0,53

0,5 0,5 0 0,53 0,91 1,57 1,73 0,91 1,57 1,73 1,73 1,20 1,21 1,21

0,5 0 0,5 0,30 1,14 0,44 0,56 1,20 1,10 1,14 0,62 1,08 0,66 0,54

0 0,5 0,5 0,30 0,66 0,40 0,98 0,66 0,56 0,38 0,70 0,76 0,59 0,98

0,33 0,33 0,33 0,34 1,01 0,41 1,36 1,01 1,30 1,01 1,30 1,30 1,36 0,43

1 0 0 0,50 0,47 0,50 0,78 0,78 0,63 0,69 0,65 0,86 1,09 0,71

0 1 0 0,93 0,92 0,93 1,06 0,93 0,92 0,93 1,49 1,10 1,37 1,37

0 0 1 0,51 0,87 0,44 0,75 0,76 0,81 0,47 0,87 0,78 0,87 0,51

0,5 0,5 0 0,47 0,86 1,39 2,02 0,86 1,39 2,02 2,02 1,09 1,14 1,14

0,5 0 0,5 0,35 1,19 0,37 0,47 1,19 1,20 1,19 0,65 1,20 0,70 0,56

0 0,5 0,5 0,29 0,59 0,36 0,69 0,59 0,65 0,42 0,77 0,84 0,67 0,42

0,33 0,33 0,33 0,36 1,07 0,46 1,16 1,07 1,07 1,07 1,07 1,07 1,16 0,46

Com base na Tabela 1.6, podemos observar que os valores maiores que

MQR/MQr > 3,69 são poucos e que nenhuma das medidas de largura de base

apresentou um grande valor de significância estatística no nível de 95% para o

modelo quadrático, portanto não sendo muito úteis para fins de previsão.

O valor tabelado de F 1,7 é 5,59. Com base na Tabela 1.6, a falta de ajuste

foi alta apenas para os agrotóxicos imazaquim e carbaril. Os demais

agrotóxicos apresentaram valores de MQfaj/MQep baixos, indicando o bom

ajuste ao modelo quadrático.

29

Tabela 1.6. Valores de média quadrática da regressão (MQR) média quadrática

dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e média

quadrática do erro puro (MQep) para modelos de largura da base. Agrotóxico MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*

Imazetapir 0,05 0,02 0,00 0,02 2,25 0,04

Simazina 0,11 0,02 0,01 0,01 5,11 1,39

Imazaquim 0,34 0,17 0,17 0,01 1,98 22,99

Ametrina 0,48 0,04 0,02 0,02 13,59 1,12

Cianazina 0,09 0,02 0,01 0,01 5,45 1,30

Tiofanato 0,27 0,03 0,00 0,03 10,36 0,01

Metsulfuron 0,58 0,11 0,09 0,02 5,36 4,87

Atrazina 0,07 0,02 0,02 0,01 3,19 2,65

Bentazona 0,46 0,06 0,00 0,05 8,23 0,02

Carbaril 0,14 0,35 0,35 0,00 0,38 79,25

Carboxin 0,29 0,16 0,13 0,03 1,79 5,05

*Valor de F para significância dos dados dado por MQR/MQr e para falta

de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de 95%

de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.

Portanto, independente dos critérios usados para modelos de regressão, o

sistema cromatográfico estudado mostrou-se complexo e de difícil separação.

Sendo o tempo de retenção o critério mais simples por tratar os picos de forma

individual, os resultados obtidos foram usados para simular a separação

cromatográfica no programa computacional.

1.4. Programa Computacional

A escolha e validação dos modelos que foram usados na simulação

usando o programa computacional foram definidos pelos resultados das

ANOVA das regressões para tempos de retenção. Para isso, foram utilizados os

tempos de retenção dos onze agrotóxicos analisados estatisticamente de acordo

com o planejamento simplex centróide. Após inserir os coeficientes dos

30

modelos da regressão no programa, com o ponteiro do mouse foi simulada a

separação dos 11 compostos e a separação simulada foi então comparada com

os cromatogramas reais obtidos em cromatografia liquida de alta eficiência em

fase reversa (Figura 1.6).

(a)

31

(b)

5 10 15 20 25

0

20

40

60

80

100

11

10

9

876

4+5

3

2

1

Inte

nsid

ade d

e a

bsorb

ância

Tempo / min

(c)

Figura 1.6. ACN:H2O 30:70 (v/v) do planejamento (a), cromatograma simulado pelo programa computacional; (b) cromatograma experimental; (c)

cromatograma simulado. Ordem de eluição: 1 = imazetapir, 2 = simazina,


bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin.

Para exemplificar, observamos à similaridade do comportamento

experimental com o obtido pelo programa computacional (Figura 1.5) em

32

relação à separação e ordem de eluição dos agrotóxicos analisados no ponto

indicado pela seta que corresponde a ACN: H2O. Essa similaridade nos

permitiu avaliar todo espaço do simplex e em cada ponto obter a separação

simulada. Assim, todas as combinações possíveis de misturas de fase móvel

podem ser avaliadas.

1.5. Conclusões 1

De acordo com o estudo realizado no capitulo 1 concluímos que:

1) A resolução e tempo de retenção mostraram a mesma dificuldade em

ajustar um modelo matemático aos dados experimentais. Ambos os

parâmetros cromatográficos apresentaram falta de ajuste para vários

agrotóxicos presente na mistura.

2) A maioria dos modelos para largura dos picos não mostraram falta de

ajuste significativa e também uma branda dependência em mudanças no

domínio experimental, ou seja, não apresentaram significância na

regressão. Isto significa que podemos ter menos preocupação com a

largura dos picos em tentativas de prever informações cromatográficas.

3) Mesmo utilizando um método cromatográfico isocrático de separação,

uma boa separação cromatográfica foi obtida com o planejamento de

misturas, pois os picos que não f

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