DEHIDROERGOSTEROL: UN ARTEFACTO GENERADO DURANTE … · gunos hongos como Suillus luteus (8), Panellus serotinus (9), Saccharomyces cerevisiae (10), Grifola frondosa (11), Scleroderma

DEHIDROERGOSTEROL: UN ARTEFACTO GENERADO DURANTEEL PROCESO DE EXTRACCIÓN DE ESTEROLES EN EL HONGO

Pleurotus sajor-caju

DEHYDROERGOSTEROL: AN ARTIFACT GENERATED DURING

EXTRACTION OF STEROLS FROM

Pleurotus sajor-caju

Augusto Rivera*, Héctor Jairo Osorio**, Jaime Ríos-Motta*, Ivonne J. Nieto*

y Cilia Marilu Laverde

Recibido: 15/09/05 – Aceptado: 12/12/05

RESUMEN

Durante el estudio químico de la fracciónesterólica del hongo Pleurotus sajor-caju

se estableció que el dehidroergosterol (er-gosta-5,7,9(11),22-tetraen-3-ol) presenteen el extracto posiblemente no es un pro-ducto natural sino un artefacto producidodurante el proceso de extracción de los es-teroles con cloroformo. Este hecho seatribuyó a la presencia de sustancias fenó-licas en el extracto.

Palabras clave: Pleurotus sajor-caju,cultivo de hongos, esteroles, dehidroer-gosterol, ergosterol.

ABSTRACT

During the extraction of sterolic fractionof Pleurotus sajor-caju was establishedthat dehydroergosterol (ergosta-5,7,9(11), 22-tetraen-3-ol) present in the ex-

tract is possibly not a natural product butan artifact produced during the process ofextraction of sterols with chloroform.This was attributed to the presence ofphenolic substances in the extract.

Key words: Pleurotus sajor-caju, cul-ture of fungi, sterols, dehydroergosterol,ergosterol.

INTRODUCCIÓN

Durante los continuos estudios de cuanti-ficación de la fracción de esteroles enhongos macromicetos medicinales y/oalimenticios colombianos como posiblesfuentes de vitamina D2, y teniendo encuenta que en el proceso de beneficio delcafé, la principal agroindustria colombia-na, existe un problema medioambientalocasionado por las aproximadamente 2ton/ha de pulpa de café y de madera secaproveniente del zoqueo de los cultivos de

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REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA, VOLUMEN 34, No. 2 DE 2005

* Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia. Ciudad Universitaria. Bogotá,D. C., Colombia. Correo electrónico: [email protected]

** Departamento de Física y Química, Universidad Nacional de Colombia, sede Manizales. Manizales, Colombia.

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cafeto que se generan anualmente en lascerca de 8x105 ha que abarcan los cultivos(1), algunas soluciones propuestas parareducir el impacto ambiental de estos de-sechos contemplan considerarlos comosustratos en el cultivo de varios hongos,entre los cuales se han ensayado con éxitoalgunos del género Pleurotus, por ejem-plo P. ostreatus y P. sajor-caju, hongoscomestibles con un valor nutricional simi-lar a la leche y la carne (2).

Algunas investigaciones relacionadascon el cultivo de P. sajor-caju han permi-tido establecer que se desarrolla muy bienen sustratos de pulpa de café, aserrín deltallo de cafeto (1, 3), paja de cebada, ras-trojos de fríjol, de haba y sus mezclas(5-7); igualmente, que el contenido de er-gosterol varía de acuerdo con el medio decultivo empleado y sus condiciones. Eneste sentido, se decidió cuantificar el con-tenido de ergosterol presente en la frac-ción esterólica de P. sajor-caju cultivadoen tres sustratos provenientes de laagroindustria del café: pulpa de café, ase-rrín de tallo y su mezcla 1:1, para estable-

cer su potencialidad de uso como materiaprima en la industria o como fuente notradicional de alimentación. La eleccióndel mejor medio de cultivo se realizó conbase en los resultados de eficiencia bioló-gica, definida como la relación entre elpeso de los cuerpos fructíferos y el pesoinicial del sustrato seco.

Mediante los análisis por CG-EM sedeterminó que las respectivas fraccionesesterólicas son pobres en esteroles, puessólo contienen tres de estos compuestosen cantidades aceptablemente buenas: er-gosterol (ergosta-5,7,22-trien-3-ol) 1,dehidroergosterol (ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3-ol) 2 y un triterpeno que seidentificó como ergosta-3,5,7,9(11),22-pentaeno 3. Aunque es conocido que elergosterol es el constituyente principal delos hongos superiores (4), la presencia dedehidroergosterol no es común y sólo seha aislado en la fracción esterólica de al-gunos hongos como Suillus luteus (8),Panellus serotinus (9), Saccharomyces

cerevisiae (10), Grifola frondosa (11),Scleroderma aurantium (12) y Chlorella

vulgaris (13), un alga en la cual tambiénse comprobó la presencia de ergosterol.De otra parte, mediante experimentos deCG-EM en P. sajor-caju se pudo estable-cer que la concentración de 1 en los ex-tractos clorofórmicos de la fracción este-rólica experimentaba cambios con eltiempo.

Este hecho experimental llevó a reen-focar los estudios para establecer las cau-sas de estas variaciones en el contenido de1 y 2 presentes en los extractos clorofór-micos de los cuerpos fructíferos del hon-go Pleurotus sajor-caju cultivados en lossustratos antes mencionados.

Se pudo comprobar que el ergosterol 1se transforma en dehidroergosterol 2 yque esto lo ocasionan, muy seguramente,los compuestos fenólicos presentes en elextracto clorofórmico de los esteroles.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material de estudio

Para el cultivo del hongo Pleurotus sa-

jor-caju en los distintos sustratos se siguióla metodología desarrollada en el CentroNacional de Investigaciones del Café (Ce-nicafé) (14) y el cultivo se llevó a cabo allímismo. Cenicafé se ubica en el municipiode Chinchiná, Caldas, Colombia, a 500”de latitud norte y 7536” de longitud oeste,a una altitud de 1.310 m.s.n.m., tempera-tura promedio anual de 21,4 ºC, humedadrelativa media de 81,0% y precipitaciónanual de 2.399,9 mm.

La pulpa seca de café, el aserrín de ta-llo del cafeto (Coffe arabiga, var. Colom-bia) y una mezcla 1:1 de éstos, se usaroncomo sustratos para el cultivo del hongo.A cada sustrato se le agregó 0,1% de car-bonato de calcio y, tras homogenizar ínti-mamente, se empacaron en sendos costa-les de fibra sintética, que se mantuvierondurante 10 días en canecas de plástico, altérmino de los cuales se sacaron, se dejóescurrir por gravedad el exceso de aguade los sustratos, y se procedió al cultivodel hongo P. sajor-caju siguiendo la me-todología desarrollada por Cenicafé (14).

Una vez desarrollados los cuerposfructíferos, lo que ocurrió 20 días des-pués de inocular la semilla del hongo, secosecharon periódicamente teniendo encuenta su madurez (calculada por el diá-

metro del pileo) mediante el método detorsión en el estípite. El material fúngicocosechado se secó en estufa de convec-ción a 40 oC y después se dividió finamen-te empleando un molino con cuchillasplásticas y se envasó y almacenó adecua-damente para su análisis posterior.

Extracción y separaciónde la fracción esterólica

Simultáneamente, una muestra seca ymolida (5 g) de cada uno de los hongoscosechados en los diferentes sustratos sesometió a maceración con cloroformo(6x10 mL). Cada extracto se concentró apresión reducida hasta sequedad, y deesta manera se obtuvieron los extractosclorofórmicos (EC) de los hongos culti-vados: en pulpa de café (86,7 mg), en ase-rrín de tallo del cafeto (97,1 mg) y en sumezcla 1:1 (65,0 mg).

A cada uno de los EC se adicionaron0,505 mg de estigmasterol como estándarinterno y se redisolvieron con 3 mL de éterde petróleo 40-60. A continuación, en sen-das columnas de cromatografía se some-tieron a partición usando como fase esta-cionaria silica gel para columna (Merck)de 0,062-0,200 mm y como fase móviléter de petróleo 40-60 (EP) y acetato deetilo desde EP=100 hasta EP=70. Paracada columna se reunieron las fraccionesesterólicas y se eliminó el disolvente a pre-sión reducida. Así se obtuvieron las mez-clas de esteroles totales que pesaron: pulpade café, 46,0 mg; aserrín de tallo del cafe-to, 41,8 mg, y su mezcla 1:1, 39,3 mg,que se analizaron y cuantificaron por latécnica combinada CG-EM.

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Equipos, métodos y análisis

Los análisis por cromatografía de gasesacoplada a espectrometría de masasCG-EM se realizaron en un cromatógrafode gases Hewlett-Packard, modelo 6890,con un detector selectivo de masas Hew-lett-Packard, modelo 5973, y una colum-na HP5-MS (30 m de largo y 0,33 mm dediámetro interno) y con una velocidad deflujo de gas de arrastre (He) de 1,2mL/min. Una alícuota de 2 L de la respec-tiva fracción esterólica se inyectó con di-visión (1:4,9). El programa de tempera-tura se mantuvo durante 1 min en 200 oC,con una rata de 4 oC/min hasta 300 oC, du-rante 10 min, y el tiempo total de análisisfue de 24,79 min. Las condiciones para eldetector fueron: 70 eV, impacto electró-nico, rango de masas entre 33 y 550 m/z:EM voltaje (A-tune 200V), frecuencia debarrido 20 Hz y temperatura 230 oC; pa-trón estigmasterol con tiempo de reten-ción promedio de 21,68 min.

Los compuestos presentes en las frac-ciones esterólicas se cuantificaron porCG-EM empleando el método de adiciónde estándar interno (8). La pureza se regis-tró por el programa HPCHEM y el área decada uno de los picos fue autointegradamediante el mismo programa. La cuantifi-cación se realizó por comparación y usan-do el método de áreas normalizadas.

En las tres fracciones esterólicas se ha-llaron los mismos tres compuestos 1-3que se identificaron con base en el análisisde sus espectros de masas corroboradocon la base de datos de la biblioteca WileyRegistry of Mass Spectral Data (15).

Ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3-ol)1, C28H44O, 1 tR = 20,94 min. EM(IE) 70eV, m/z (int. rel.):396[M+ (55,2)];

337[M+-59 (37,9)]; 363[M+-CH3-H2O(100)]; 271[M+-cadena lateral (16,1)];253[M+-cadena lateral-H2O (43,7)].

Dehidroergosterol (ergosta-5,7,9 (11),22-tetraen-3-ol) 2, C28H42O, tR = 20,33min EM(IE) 70 eV, m/z (int. rel.):394[M+ (21,8)]; 376[M+ - H2O (62,8)];361[M+ - CH3- H2O (8,4)]; 267[M+ -ca-dena lateral-2H (5,7)]; 251[M+ -cadenalateral-H2O (100)].

Ergosta-3,5,7,9(11),22-pentaeno 3 C28

H40, tR = 17,21 min EM(IE) 70 eV, m/z(int. rel.): 376[M+(62,8)]; 251[M+-cadenalateral (100)]; 236[M+-cadena lateral-CH3

(17,4)]; 209 [fisión anillo D (18,0)]; 155[fi-sión anillo C (25,6)].

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La producción del sustrato siguiendo elmétodo y la formulación descritos (14)permitió disponer de un medio adecuadopara el crecimiento del micelio y el desa-rrollo de las fructificaciones en condicio-nes ambientales de P. sajor-caju, y se ob-tuvo la mayor eficiencia biológica, enporcentaje, para el hongo cultivado en lamezcla pulpa de café:aserrín de tallo(88,4%), seguido del cultivado en pulpade café con un 69,5%, valores que con-cuerdan con los obtenidos para otros cul-tivos del mismo hongo tanto en residuosdel café como en otros subproductosagroindustriales, pero son muy superio-res a los obtenidos cuando el cultivo de P.

sajor-caju se efectuó en desechos de cul-tivo de algodón, o sorgo, solos o mezcla-dos (41,4%, 6,8% y 35,2%, respectiva-mente) (6). En el cultivo en aserrín deltallo la eficiencia biológica sólo alcanzó29,8%, valor similar al obtenido (27,3%)

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en cultivos empleando los desechos fibro-sos de la cáscara de coco (6).

Al efectuar el triplicado de los análisis6h después del duplicado, se observó quelas cantidades de ergosterol 1 y dehi-droergosterol 2 habían sufrido variacio-nes: disminuyó la de 1 y aumentó la de 2,sin que se observara ningún cambio en elárea relativa de 3. En la Figura 1 se pre-senta la variación en el tiempo de la rela-

ción de áreas entre ergosterol y dehi-droergosterol.

Como se puede deducir de los datosgraficados, se presentó un notorio au-mento en la concentración relativa de 2con respecto a 1. Aunque la transforma-ción fotoquímica de 1 hasta vitamina D2 5pasando por precalciferol 4 (Esquema 1)(16) es conocida desde mucho tiempoatrás, la oxidación de 1 hasta 2 en un ex-

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Figura 1. Variación de la relación de áreas entre ergosterol 1 y dehidroergosterol 2.

Esquema 1. Transformación fotoquímica de ergosterol en vitamina D2.

tracto clorofórmico de los cuerpos fructí-feros de un hongo no fue hallada en la lite-ratura revisada.

Para verificar si esta oxidación era ge-nerada o no por sustancias presentes en elmedio, se realizaron las mismas medicio-nes para una solución clorofórmica deuna muestra patrón de ergosterol. En nin-gún caso se observó la presencia del dehi-droergosterol 2, lo que permite concluirque la transformación a dehidroergoste-rol es consecuencia de sustancias presen-tes en los extractos.

Salmones y col. (17), en un trabajo re-ciente sobre hongos del género Pleurotus,evidenciaron la capacidad de estos Basi-diomicetos para biodegradar cafeína ycompuestos fenólicos, durante sus estu-dios en muestras de Pleurotus {P. dja-

mor, P. ostreatus y P. pulmonarius} quefueron cultivadas en pulpa de café y pajade trigo. En ese trabajo, los autores com-probaron la disminución de la concentra-ción de ese tipo de sustancias en los me-dios de cultivo, durante la maduración delos cuerpos fructíferos. Adicionalmente,se ha demostrado la existencia de com-puestos fenólicos en extractos de hongostanto comerciales como silvestres (18,19, 20) y, además, que la concentraciónde fenoles depende del disolvente usado.En estos trabajos (18, 19) también se eva-luaron las propiedades antioxidantes delos hongos estudiados, mismas que estánestrechamente relacionadas con el conte-nido de fenoles totales. Osorio (21) en susestudios de la composición química delhongo P. sajor-caju demostró que estehongo incorpora cafeína desde el mediode cultivo, lo cual demostró la capacidadde este hongo para incorporar nutrientesdel medio.

Con base en lo anterior, se planteó lahipótesis de que en el proceso de extrac-ción de los esteroles algunos o todos loscompuestos fenólicos también podríanser extraídos y, en consecuencia, ser losresponsables de la transformación de 1 en2. Para verificar esta hipótesis se efectuóuna serie de experimentos consistentes enadicionar pequeñas cantidades de hidro-quinona a soluciones de concentraciónvariable de un patrón de ergosterol. Elefecto fue la aparición de 2 al cabo de 6 hde agregado el fenol. Esto demostró quemuy probablemente 2 no es un productonatural proveniente del metabolismo deP. sajor-caju, sino un artefacto. Ahorabien, estos resultados no son de ningunamanera extraños pues los esteroles sonsusceptibles de oxidarse y en la literaturase encuentran varios ejemplos de oxida-ción de esta clase de compuestos conagentes fácilmente reducibles. Por ejem-plo, Brown y Turner (22) informaron so-bre el uso de quinonas para la dehidroge-nación de neoergosteroles. Esta dehidro-genación ocurre por la abstracción de io-nes hidruros, lo que genera un carboca-tión. En el ergosterol, las posiciones alíli-cas más activas para que ocurra estaabstracción serían H-4, H-9 o H-14; lasmás favorecidas son H-9 y H-14 dado elcarácter terciario frente al secundario deH-4; además el producto final de esta oxi-dación sería el 3-ceto derivado, pasandopor un intermediario tipo enol, que noestá de acuerdo con los resultados obteni-dos en este trabajo. La mayor estabilidaddel sistema trieno conjugado �

5,7,9(11)

frente al sistema �5,7,14 favorece la gene-

ración del dehidroergosterol frente a suisómero, pasando por un intermediarioiónico tipo carbocatión 7, el cual sufreluego la eliminación de H+ y produce el

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doble enlace entre los carbonos 9 y 11. Enel Esquema 2 se presenta un posible me-canismo para la conversión de ergosterol1 en dehidroergosterol 2.

CONCLUSIONES

El valor nutricional de los hongos cultiva-dos en desechos agroindustriales del cafépuede verse afectado por la presencia depolifenoles, ya que éstos pueden generaruna disminución del contenido de ergos-terol, lo cual hace necesario que se deter-mine el contenido de estas sustancias en elmedio y que se prevea la posible disminu-ción del contenido de ergosterol, ya quela degradación hasta dehidroergosterolhace que el hongo sea descartado comouna posible fuente de vitamina D2.

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