DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Medicina Dentária - Mestrado Integrado – UBA 3 BC - MTBarros 1

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Medicina Dentária - Mestrado Integrado – UBA 3 BC - MTBarros

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• As vias biossintéticas das células eucarióticas são

constituídas por estruturas membranares que realizam

as funções de:

- Síntese, modificação

- libertação/transporte de proteínas solúveis e

proteínas membranares, para o seu destino

•VesículasVesículas

• 50 a 75 nm

• Origem: individualização das saliências de membranas dadoras

• Fim: fusão com membranas receptoras



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VesículasVesículas

Apresentam na sua superfície proteínas que:

- funcionam como um mecanismo molecular que leva ao encurvar da membrana e formar a vesícula

- são um mecanismo para selecção dos componentes a ser transportados

- intervêm no mecanismo molecular para direccionar a vesícula e para a ancorar à membrana alvo



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COP – “coat protein”

COP II –(RER) Golgi

COP I –(Golgi) RER Vesículas com clatrina –(TGN) destino final (endossomas, lisossomas)



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COP II – RER Golgi As vesículas COP II

contém proteína com 5

subunidades

Anticorpos contra estas

proteínas impedem a

formação das vesículas

mas não têm efeito no

transporte das vesículas

Estas vesículas são

capazes de seleccionar o

material adequado para

ser transportado



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As proteínas de cobertura ligam-

se a sequências sinal,

localizadas nos domínios

citosólicos de proteínas

integrais do RE

O terminal luminal das proteínas

integrais (transmembranares)

ligam proteínas solúveis

(proteínas de secreção) no

lúmen do RE

A proteína SarA proteína Sar- Liga GTP (guanosina trifosfato)

- Apresenta função reguladora (formação e desorganização das vesículas)

A forma inactiva contém GDP ligada. A troca de GDP por GTP, activa Sar e promove a sua ligação à membrana do RE

A ligação de Sar permite a ligação das outras proteínas de “cobertura” e posteriormente a formação da vesícula com “cobertura” COP II



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A proteína SarA proteína Sar- Liga GTP (guanosina tri-fosfato)

- Apresenta função reguladora (formação e desorganização das vesículas)

Antes da fusão das vesículas COP II com a membrana alvo, é necessário a desorganização dos componentes membranares de cobertura da vesícula e libertação destes no citoplasma

Pensa-se que a desorganização é desencadeada pela hidrólise da molécula de GTP e consequente produção da subunidade Sar-GDP, que possui menor afinidade pela membrana da vesícula

Após a dissociação da Sar-GDP da membrana, ocorre a libertação das outras proteínas de cobertura das COP II.



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Golgi RER

Estas vesículas foram descobertas

em células tratadas com moléculas

análogas à GTP, mas que não

podem ser hidrolisadas.

Nestas condições as vesículas COP

I acumulam-se nestas células

tratadas e podem ser isoladas por

centrifugação em gradiente de

densidade

Evidenciando que também estas

vesículas contém proteína capaz

de ligar GTP (ARF1) e que é

necessário hidrolisar GTP para

promover a desorganização das

proteínas de cobertura



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Retenção e Retorno de Proteínas Residentes

Se as vesículas se formarem continuamente a partir dos compartimentos membranares então como será possível manter a composição desse compartimento?

O que determina que uma determinada proteína permaneça no RE ou prossiga para o complexo de Golgi?

As proteínas permanecem num determinado compartimento por:

- retenção das moléculas residentes que são excluídas das vesículas de transporte (integrando grandes complexos de difícil incorporação em vesículas)

- retorno das moléculas “que escaparam”, para o compartimento onde normalmente residem



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Proteínas residentes no RER (lúmen e membranares)

possuem sequências sinal no C-terminal que servem como

- Sinais de Retorno, que asseguram o seu regresso ao

lúmen do RE

A dissulfeto isomerase e chaperones (proteínas solúveis

no RE) possuem a sequência Lys-Asp-Glu-Leu ou KDEL no

C-terminal.

O receptor da PRS (proteína de reconhecimento de sinal,

proteína membranar) possuí no C-terminal uma sequência

sinal de retorno – KKXX, (K=Lys e X=qualquer

aminoácido)

Retenção e Retorno de Proteínas Residentes



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O retorno das proteínas é

realizado quando as proteínas

solúveis do RE se ligam ao

receptor da sequência KDEL

(inserido na membrana do

compartimento cis-Golgi)

O receptor de KDEL vai ligar-se

às proteínas de cobertura das

COP I, e todo o complexo volta

para o RE. O receptor possui a sequência O receptor possui a sequência KKXX, pois é uma proteína integralKKXX, pois é uma proteína integral

(ARF1)



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Como uma determinada proteína,

sintetizada no RE é dirigida para um

destino celular específico?

A escolha das proteínas sintetizadas e modificadas

ocorre no TGN (Trans Golgi Network) e é também

este compartimento o responsável pela produção das

vesículas de clatrina



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Estas vesículas possuem:

- uma estrutura externa constituída pela proteína clatrina

- uma estrutura interna composta por um complexo de proteínas designadas por – adaptador.

O complexo clatrina-adaptador liga-se a um receptor membranar específico para o composto a ser transportado

Estas interacções permitem que materiais específicos do lúmen do TGN fiquem concentrados nas vesículas de clatrina



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Papel das vesículas de clatrina

Funciona como Funciona como sequência sinalsequência sinal

(manose-6-(manose-6-fosfato)fosfato)



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• Síntese em ribossomas no RER

• Fosforiladas no complexo de Golgi : adição de Pi à

manose da cadeia de açucares da N-glicosilação

• Fosforilação (sinal de reconhecimento)

• receptores de manose-6-fosfato (MPRs) são

proteínas membranares concentradas nas

projecções de clatrina do TGN. Interagem com as

proteínas lisossomais (lúmen) e com os adaptadores

(citoplasma)

• Receptores desligam-se das proteínas próximo dos

lisossomas

• Receptores retornam ao TGN para nova carga

• Existem MPRs na membrana plasmática que ligam proteínas

lisossomais do espaço extracelular



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Endereçamento das vesículas Endereçamento das vesículas para compartimentos específicospara compartimentos específicos

Fusão MembranarFusão Membranar

1. As vesículas deslocam-se ligadas a microtubulos

2. Proteínas fibrosas que estabelecem o 1º contacto entre a vesícula e a membrana alvo, via proteínas Rab que ligam GTP e que contribuem para a especificidade da ligação

3. A ancoragem por uma grande família de proteínas integrais – SNARE.



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Endereçamento das Endereçamento das vesículas para vesículas para

compartimentos compartimentos específicosespecíficos

Fusão MembranarFusão MembranarA fusão selectiva garante o endereçamento correcto

Proteínas SNARE(envolvidas no transporte vesicular)

v-SNARE (sinaptobrevina)

(localizadas nas membranas das vesículas)

• t-SNARE (Syntaxin e SNAP-

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(localizadas em membranas receptoras de diferentes compartimentos)



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Endereçamento das vesículas para compartimentos Endereçamento das vesículas para compartimentos específicosespecíficos

Fusão MembranarFusão Membranar

Uma v-SNARE numa vesícula do RE apenas deve interagir com uma t-SNARE das cisternas cis Golgi, e não com uma t-SNARE na membrana lisossomal

Recentemente foi verificado que as proteínas-GTP - Proteínas Rab- possuem um efeito de regulação no processo de fusão membranar



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Mecanismo de fusão membranarMecanismo de fusão membranarVesículas de neurotransmissoresVesículas de neurotransmissores

SNAP 25

A ligação da vesícula à membrana alvo é iniciada

pela ligação do domínio citosólico da v-SNARE ao

domínio citosólico do complexo t-SNARE/SNAP25

Formando um complexo enrolamento dos domínios

em hélice alfa das proteínas intervenientes

Uma proteina Rab (ligadora

de GTP) presente na

membrana da vesícula pode

funcionar como reguladora

ajudando o processo de

fusão membranar



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A formação do complexo de fusão necessita

da interacção das proteínas t-SNARE e v-

SNARE e hidrólise de ATP

No entanto o processo da fusão das duas

membranas ainda não se encontra complemente

esclarecido

No passo 4 e após fusão os complexos t-

SNARE/v-SNARE/SNAP25 devem dissociar-se

para que estas proteínas possam catalisar

passos posteriores de fusão

Em 5) novas vesículas contendo v-SNARE

são formadas e retornam às membranas

dadoras




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Modelo de interacção entre v e t-SNARE

conduzindo à fusão membranar

V-SNARE (sinaptobrevina)

T-SNARE (Syntaxin e SNAP-25)

Hipotético domínio

membranar

NSFNSF promove o promove o

desenrolamento das SNAREsdesenrolamento das SNAREs




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A toxina do tétano e do

botulismo actuam como

proteases das SNAREs




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A membrana de uma partícula viral, funde-se com a membrana do endossoma

(que a envolve)

No caso do vírus da influenza, o pH acídico do endossoma causa alterações

conformacionais na glicoproteína de cobertura do vírus (HA-hemaglutinina),

expondo péptidos de fusão muito hidrofóbicos, os quais são inseridos no

interior da membrana das vesículas endocíticas

A inserção de várias HA activadas, conduz à fusão do vírus com as membranas

do endossoma, num processo conduzido por vários outros intermediários.

Fusão membranarFusão membranarFusão do vírus Fusão do vírus

influenzainfluenzacom células animaiscom células animais

HA1 (3)

HA1 (3)



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Um dos percursos finais do

transporte celular

A libertação dos produtos de

secreção (grânulos de secreção)

requer fusão membranar (entre a

membrana do grânulo e a

membrana plasmática)

A fusão das membranas cria uma

abertura (poro de fusão)

permitindo a libertação do

conteúdo do grânulo para o

espaço extracelular – exocitose.

Este processo é desencadeado por

um aumento local de Ca2+.



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A face luminal da membrana

da vesícula integra-se na

superfície externa da

membrana plasmática

A face citosólica da

membrana da vesícula

integra-se na superfície

interna da membrana

plasmática



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Modelo de fusão de membranasAs proteínas de cada uma das

membranas em fusão entram em

contacto

E formam um poro que pode dilatar-

se

As bicamadas de lípido das duas

membranas fundem-se assim que

as moléculas de lípido se difundem

ao longo das superfícies

hidrofóbicas criadas entre as

proteínas (de fusão) que delimitam

o poro de fusão



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Organitos Digestivos Possuem 50 ou mais enzimas hidrolíticas: fosfatases, nucleases, proteases, (colagenases), polissacaridases, enzimas lipolíticas,...

Os produtos de baixo MW, resultantes da digestão podem ser transportados através da membrana lisossomal, para o citoplasma

Todas as enzimas lisossomais são activas a pH acídico (4.6) -hidrolases acídicas.

Este pH é mantido por H+-ATPase presente nas membranas

A membrana é protegida do ataque proteolítico pois possui proteínas integrais acídicas e muito glicosiladas



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A função principal relaciona-se com a digestão de compostos vindos do meio extracelular – fagossomas.

São os lisossomas das células fagocíticas os responsáveis pela inibição (baixo pH e espécies de oxigénio reactivas), de microrganismos ingeridos e sua posterior digestão

Função na fertilizaçãoO acrossoma do espermatozóide contém enzimas lisossomais que vão digerir a superfície do óvulo e permitir a entrada do espermatozóide

Remodelação dos organitos celulares, autofagia - autofagolisossomas

Corpo residual – sem actividade de digestão

Grânulos de lipofucsina – permanecem no citoplasma



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Entrada de material extracelular de dimensões e

características que não permite a sua passagem através da

membrana ou de transportadores membranares

Vesículas formadas por dobras ou invaginação da

membrana

• Fagocitose – partículas

• Endocitose - fluidos, solutos dissolvidos ou

macromoléculas em suspensão



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FagocitosFagocitosee Vesículas

1-2 m de diâmetro

Células específicas (células fagocíticas)•Entrada e posterior degradação das partículas num lisossoma



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ProtecçãoProtecção

Células fagocíticas - macrófagos, neutrófilos

• Organismos invasores, células danificadas, glóbulos vermelhos velhos

• As partículas a serem fagocitadas são reconhecidas por receptores na superfície das células fagocíticas (macrófagos)

• A fagocitose é facilitada pela cobertura da superfície da partícula a ingerir por opsoninas

• Vesícula fagocítica funde posteriormente com um lisossoma

FagocitosFagocitosee



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Neutrófilo

Levedura



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Endocitose Vesículas

0,1 a 0,2 m de diâmetro

1)1) Entrada não específicaEntrada não específica de fluidos extracelulares

- Qualquer molécula pequena ou grande, presente no

fluído entra na célula

- Em certos tipos de células pode servir para a conversão de membrana plasmática (celular) em membrana citoplasmática (RE)



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2)2) Entrada específicaEntrada específica de macromoléculas

extracelulares e que se encontram em baixa

concentração no fluído extracelular – mediada por

receptores

- hormonas

- factores de crescimento

- enzimas

- proteínas do plasma

• receptores localizados em “coated pits” de

clatrina

Endocitose



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Via endocítica

MPR-receptor da manose-6-fosfato

A via endocítica começa com a organização de uma

rede de microtúbulos e vesículas – endossomas:

- endossomas primários na periferia da célula

- endossomas tardios , próximos do núcleo

Distinguem-se de acordo com a sua densidade, pH e

composição em proteínas (podem ser separados por

centrifugação)

. O material que entra por endocitose é transportado em

vesículas endocíticas até aos endossomas primários,

onde são redistribuídos.



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Via endocítica

. Material dissolvido e ligandos, são

transferidos para os endossomas tardios, em

vesículas transportadoras específicas

. Proteínas integrais das membranas das

vesículas, ficam concentradas em

compartimentos tubulares dos endossomas

primários – centros de reciclagem.

. As moléculas que atingem os endossomas

tardios fundem-se posteriormente com

lisossomas.

a- maturação dos endossomas tardios em

lisossomas

b- fusão dos endossomas com lisossomas

já existentes

c- transporte por vesículas



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Estrutura da Clatrina

Organização estrutural

da clatrina e adptador,

das vesículas de

endocitose

Nas vesículas originadas

no TGN o adaptador tem

composição diferente mas

muito semelhante



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•Receptors that use clathrin-coated vesicle endocytosis have unique peptide signal

•Signal is: Phe-Arg-X-Phe-Arg-X-TyrTyr

•This signal mediates adaptin binding

•Adaptin in turn binds to individual clathrin molecules



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a

dc

b

Endocitose mediada por receptores

Cobertura de Clatrina

Vesículas CobertasDe Clatrina



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•Coat seen on inner side of cell membrane

•This is EM evidence for the occurrence of RME

•Similar for LDL, yolk protein uptake



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Estrutura da Clatrina

Composta por 3 cadeias

leves e 3 cadeias pesadas

Dispõem-se numa estrutura

de 3 braços – Triskelion

Esta estrutura permite

construir diferentes

organizações poligonais

(hexágonos/pentágonos)



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Papel das “coated pits”

As vesículas endocíticas de

clatrina necessitam para a

sua formação de uma

proteína adicional, uma

proteina que liga GTP –

Dinamina

Esta proteína organiza-se

em pequenas hélices que

se dispõem em colar em

torno da vesícula.

Esta proteína estrutural é

capaz de gerar forças

mecânicas

Análogo não hidrolisável



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Papel das “coated pits”

Invaginações membranares Invaginações membranares

cobertas facilitam a cobertas facilitam a

entrada de proteínas entrada de proteínas

membranares integrais e membranares integrais e

respectivos ligandos respectivos ligandos

associadosassociados



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LDLLDLss e Metabolismo do Colesterol e Metabolismo do Colesterol

Implicação fisiológica de endocitose mediada por receptores

Prémio Nobel - Brown e Goldstein

Esta doença é caracterizada por níveis elevados de colesterol no

sangue, levando à formação de placas de aterosclerose e

ataques cardíacos prematuros

O colesterol é usado pelas células animais como constituinte

das suas membranas biológicas e como percursor das hormonas

esteróides

É uma molécula hidrofóbica que é transportada no sangue

integrando um complexo de lipoproteína – LDL “Low-Density

Lipoproteín”, Lipoproteína de Baixa Densidade.



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LDLLDLss e Metabolismo do Colesterol e Metabolismo do Colesterol

Implicação fisiológica de endocitose mediada por

receptores



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•Familial Hypercholesterolemia (FH):Familial Hypercholesterolemia (FH): high levels of blood cholesterol and other characteristics

•Leads to an increase in blood LDL (cholesterol)

•Risk of Atherosclerosis & Heart Disease

•Atherosclerosis: buildup of cholesterol deposits lead to plaques & clog arteries

•Contributes to heart attacks at early age

•One human mutation is due to a defect in LDL receptor (e.g., in adapter binding site; can't form coated pit for LDL uptake) which causes the buildup of LDL particles at the cell surface leading to plaque formation

The following diagram shows how a single amino acid change in the receptor results in the inability of the receptor-ligand complex for form a clathrin coat. This prevents uptake of the complex leaving it at the cell surface. Continual build-up of the complexes leads to plaque formation.



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ribonucleoproteínas



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