DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA VIDA · 2020. 5. 25. · Purificação parcial e Caracterização Agradecimentos Ana Cardoso 2015 iii ... 1 1.1. Fungi ... DTT – Dithiothreitol E-64

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA VIDA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA

UNIVERSIDADE DE COIMBRA

Hidrolases de Agrocybe aegerita e Macrolepiota procera:

Purificação parcial e Caracterização

Dissertação apresentada à Universidade de

Coimbra para cumprimento dos requisitos

necessários à obtenção do grau de Mestre em

Bioquímica, realizada sob a orientação científica

do Professora Doutora Paula Veríssimo

(Universidade de Coimbra)

Ana Catarina Martins Cardoso

2015

“Transportai um punhado de terra todos os dias e fareis uma montanha.”

(Confúcio)

Ana Cardoso 2015 i

Agradecimentos

Ana Cardoso 2015 ii

Hidrolases de Agrocybe aegerita e Macrolepiota Procera: Purificação parcial e Caracterização Agradecimentos

Ana Cardoso 2015 iii

Em primeiro lugar quero agradecer a Associação BLC3 pelo apoio fornecido

durante a concretização deste trabalho recebido pelo projecto Value Mycology-

Technology Truficulture (ValueMicotecTruf/24845/2011) pelo COMPETE (Programa

Operacional Factores de Competitividade) integrado no QREN (Quadro de Referência

Estratégico Nacional) e do fundo Europeu FEDER (Fundo Europeu de

Desenvolvimento Regional).

Um agradecimento especial à professora Paula por me ter acolhido no

laboratório e por ter possibilitado o desenvolvimento da minha tese nesta área. Obrigada

pela orientação, apoio e confiança que depositou em mim, que me fez crescer como

pessoa e profissional.

À Doutora Mariza Azul pela disponibilidade, colaboração dada que tornaram

possível a realização deste trabalho.

À Sofia e à Rita um muito obrigada pelo carinho e pela amizade. Obrigada pela

paciência e pelas conversas e boa disposição que ajudaram muito e me deram forças

para este percurso.

As minhas meninas Daniela F., Patricia, Mafalda, Kátia, Daniela C. e ao menino

André S. por tornarem este percurso académico único, pela união e amizade.

À minha prima Cátia, priminho Tomás e ao Daniel pelo apoio, conversas e

brincadeiras que revitalizaram os meus fins de semana.

Ao André por ser estar sempre ao meu lado quando mais preciso, por me ajudar

a esquecer os problemas e a aproveitar as coisas simples da vida.

À minha avó, aos meus padrinhos e tios pelo apoio e incentivo recebido ao longo

destes anos por sempre acreditarem em mim, e pela força que me deram.

Aos meus pais e à minha irmã pelo apoio incondicional na superação dos

obstáculos e pelo carinho que me deram, por me incentivarem na realização dos meus

sonhos. Obrigada por estarem sempre ao meu lado e por serem a melhor família do

mundo. Vocês são o meu bem mais precioso.

Ana Cardoso 2015 v

Resumo

Ana Cardoso 2015 i

Hidrolases de Agrocybe aegerita e Macrolepiota Procera: Purificação parcial e caracterização Resumo

Ana Cardoso 2015 vii

Cogumelos são reconhecidos como uma fonte promissora de novas proteínas.

Várias proteínas com características únicas foram isoladas, incluindo enzimas

lignocelulolíticas, lectinas, proteases, inibidores da protease e hidrofobinas. Fungos

decompositores (sapróbios) como Agrocybe aegerita e Macrolepiota procera produzem

hidrolases para degradar o material lignocelulósico e celulolítico. Para degradar estes

polímeros dispõem de um sistema enzimático complexo, composto por enzimas que

podem ser secretadas, enzimas intracelulares e membranares.

O micélio é a estrutura responsável por algumas funções importantes dos fungos,

como a respiração, absorção, excreção e reprodução. Para além de fixar o substrato, o

micélio tem como função a digestão extracelular. A digestão extracelular é conseguida

pela secreção de proteínas para o meio envolvente, as hidrolases são algumas das

proteínas secretadas pelos micélios. Desta forma o micélio é um alvo para a

investigação de proteínas. O estudo da modificação das condições do meio de cultura é

importante no sentido de se criarem as condições necessárias para a secreção de

proteínas com interesse biotecnológico.

Neste sentido foi feita uma caracterização do perfil proteico a uma dimensão e

caracterização da actividade enzimática da secreção e do micélio de A. aegerita e

M. procera ao longo de 10 dias de cultura O 8º dia foi tempo de cultura ideal em que a

quantidade de proteína e actividade enzimática eram as ideais para ambas as espécies.

Também foi feita uma estimulação da secreção de hidrolases pela adição de

serradura de acácia e eucalipto e borras de café na proporção de 40 g/l. No entanto a

nível das secreções não se verificou incrementos de actividade específica. Apenas a

serradura de acácia parece ter estimulado o micélio de M. procera, levando a um

aumento da actividade de algumas proteases e a um aumento de β-glucosidases.

As proteínas presentes nas secreções foram concentradas por vários métodos no

sentido de aumentar a quantidade de proteína e a actividade. As metodologias com

melhores resultados foram a liofilização para a secreção de M. procera e a precipitação

com sulfato de amónia para a secreção de A. aegerita. Porém, a quantidade de proteína e

de actividade permaneceram baixas e insuficientes para a purificação de enzimas de um

modo rentável.

Hidrolases de Agrocybe aegerita e Macrolepiota Procera: Purificação parcial e caracterização Resumo

Ana Cardoso 2015 viii

Uma vez que a concentração de proteína e actividade enzimática das secreções

foi baixa, e insuficiente para a purificação de hidrolases, a separação de proteases foi

realizada a partir do micélio. Deste material foram purificadas parcialmente proteases

do tipo serínico e metaloaminopeptidases por cromatografia de exclusão molecular e

cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose

Ana Cardoso 2015 ix

Summary

Ana Cardoso 2015 i

Hidrolases de Agrocybe aegerita e Macrolepiota Procera: Purificação parcial e caracterização Summary

Ana Cardoso 2015 xi

Mushrooms are recognized as a promising source of novel proteins. Several

proteins were isolated with unique features, including lignocellulolytic enzymes, lectins,

proteases, proteases inhibitors and hydrophobins. Decomposer fungi (saprobes) as

Agrocybe aegerita and Macrolepiota procera produce hydrolases to degrade

lignocellulosic and cellulolytic material. To degrade these polymers, they have a

complex enzyme system, composed of enzymes that can be secreted, intracellular

enzymes and membranar enzymes.

Mycelium is the structure responsible for some important functions of fungi,

such as breathing, absorption, excretion and reproduction. In addition of the ability to

fix the substrate, mycelium has extracellular digestion function. The digestion is

achieved by the extracellular secretion of proteins into the surrounding environment;

hydrolases are some of the proteins secreted by mycelium. Thus, the mycelium is a

target for investigation of proteins. The study of the modification of the culture medium

conditions is important in order to create necessary conditions for the secretion of

proteins with biotechnological interest.

In this study was performed a characterization of one dimension protein profile

and characterization of the enzymatic activity of the secretion and mycelium extract of

A. aegerita and M. procera over 10 days of culture. The optimum cultivation time was

at 8th day wherein the amount protein and enzymatic activity were found optimal for

both species.

We also stimulate the secretion of hydrolases by the addition of acacia and

eucalyptus sawdust and coffee grounds at a ratio of 40 g/l. However, increments of

hydrolase specific activity in secretion was not observed. Acacia sawdust appears to

have stimulated M. procera mycelium, leading to an increased activity of some

proteases and an increase in β-glucosidase activity.

Proteins present in secretion were concentrated in terms of quantity and activity.

The best results were found to lyophilization of M. procera secretion and precipitation

with ammonium sulfate of A. aegerita secretion. However, the amount of protein and

activity remained low and insufficient for the purification of enzymes in a cost effective

manner.

Hidrolases de Agrocybe aegerita e Macrolepiota Procera: Purificação parcial e caracterização Summary

Ana Cardoso 2015 xii

Once protein concentration and enzymatic activity of the secretion was low and

insufficient for purification of hydrolases, the separation of proteases was performed

from mycelium. From this material, a partial purification of serine like proteases and

metalloaminopeptidases was achieved by size exclusion chromatography and

hydrofobic interaction chromatography with Phenyl Sepharose matrix.

Ana Cardoso 2015 xiii

Índice

Ana Cardoso 2015 xiv

AGRADECIMENTOS ................................................................................ I

RESUMO .................................................................................................... V

SUMMARY ................................................................................................IX

ÍNDICE ................................................................................................... XIII

LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................. XIX

LISTA DE FIGURAS ........................................................................ XXIII

LISTA DE TABELAS ....................................................................... XXXV

INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1

1.1. Fungi ..................................................................................................................... 3

1.2. Basidiomicota ....................................................................................................... 3

1.3. Moléculas biologicamente activas presentes em Basidiomicotas .................... 5

1.4. Vantagens das proteínas de Basidiomicetes ...................................................... 5

1.5. Aplicações das proteínas de basidiomicotas ...................................................... 6

1.5.1. Medicina ........................................................................................................ 6

1.5.2. Indústria ...................................................................................................... 12

1.6. Agrocybe aegerita e Macrolepiota procera ........................................................ 18

1.7. Micélio ................................................................................................................ 20

1.8. Estimulação da secreção de hidrolases ............................................................ 21

OBJECTIVOS ........................................................................................... 23

MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 27

2.1. Amostragem ....................................................................................................... 29

2.2. Cultura de micélio ............................................................................................. 29

2.2.1. Cultura em meio sólido .............................................................................. 29

2.2.2. Cultura em meio líquido ............................................................................ 30

2.2.3. Tempos de crescimento .............................................................................. 31

2.2.4. Estimulação da secreção de hidrolases ..................................................... 31

2.3. Métodos de extracção ........................................................................................ 32

2.3.1. Extracto do micélio..................................................................................... 32

2.3.2. Tratamento do meio de cultura sem micélio ............................................ 33

2.4. Quantificação proteica ...................................................................................... 33

2.5. Caracterização Bioquímica ............................................................................... 33

2.5.1. Perfil proteico – SDS-PAGE...................................................................... 33

2.5.1.1. Revelação por Coomassie Brilliant Blue R250 ................................. 34

2.5.1.2. Revelação com Nitrato de Prata ........................................................ 34

2.5.2. Zimografias ................................................................................................. 35

2.5.2.1. Detecção de proteases ......................................................................... 35

2.5.2.2. Detecção de xilanases, endoglucanases e quitinases ........................ 36

2.5.2.3. Revelação com Congo Red ................................................................. 36

2.5.2.4. Revelação com Calcofluor White ...................................................... 36

2.5.3. Ensaios enzimáticos .................................................................................... 37

2.5.4. Identificação da classe de proteases por inibição específica ................... 38

2.6. Métodos de concentração .................................................................................. 40

2.6.1. Precipitação com sulfato de amónia ......................................................... 40

2.6.2. Liofilização .................................................................................................. 40

2.6.3. Centricons ................................................................................................... 41

2.6.4. TCA-Acetona .............................................................................................. 41

2.7. Métodos cromatográficos .................................................................................. 41

2.7.1. Cromatografia de troca iónica .................................................................. 41

2.7.2. Cromatografia de Exclusão Molecular .................................................... 42

2.7.3. Cromatografia de afinidade ...................................................................... 42

2.7.4. Cromatografia de interacção hidrofóbica ................................................ 43

RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................. 45

3.1. Avaliação do perfil enzimático da secreção e micélio de Agrocybe aegerita e

Macrolepiota procera ao longo do tempo. ................................................................... 49

3.1.1. Crescimentos ............................................................................................... 49

3.1.1.1. Macrolepiota procera ........................................................................... 50

3.1.1.2. Agrocybe aegerita ................................................................................. 58

3.1.2. Suplementação do meio de cultura ........................................................... 66

3.1.2.1. Macrolepiota procera ........................................................................... 67

3.1.2.2. Agrocybe aegerita ................................................................................. 72

3.1.3. Concentração das secreções de A. aegerita e Macrolepiota procera ....... 78

3.1.3.1. Concentração da secreção de Macrolepiota procera ........................ 78

3.1.3.2. Concentração da secreção de Agrocybe aegerita .............................. 83

3.2. Fraccionamento do micélio de A. aegerita ....................................................... 89

CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS .................................. 117

BIBLIOGRAFIA ..................................................................................... 121

Lista de abreviaturas

Ala-AMC – Alanine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide

AMC – Methyl-Coumaril-7-Amide

Arg-AMC – Arginine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide

BSA – Bovine Serum Albumin (albumina sérica bovina)

BzArg-AMC – Benzoyl-Arginine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide

CMC – carboximetilcelulose

DTT – Dithiothreitol

E-64 - trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guanidino)butane

EDTA – Ethylenediaminetetraacetic acid

EM – exclusão molecular

FIP - fungal immunomodulatory proteins (proteínas fúngicas

imunomoduladoras)

FPLC - Fast Protein Liquid Chromatography (Cromatografia líquida a pressão

moderada)

Leu-AMC – Leucine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide

Lys-AMC – Lysine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide

Met-AMC – Methionine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide

MU - 4-Methylumbelliferone

MUC - 4-Methylumbelliferyl beta-D-cellobioside

MUG – 4-Methylumbelliferone-β-D-Glucopyranose

MU-NAG - 4-Methylumbelliferone-N-Acetyl-Glucosaminide

MUP – 4-Methylumbelliferone-Phosphate

PFBloc - 4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride

Phe-AMC – Phenylalanine-4-Methyl-Coumaryl-7-Amide

PSA – potato saccharose agar

PSB – potato saccharose broth

RIP - ribosome inactivating proteins (proteínas inactivadoras de ribossomas)

RPM – Rotações por minuto

SA – Sulfato de amónia

SDS – Sodium Dodecyl Sulphate

SDS-PAGE – Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TCA – ácido tricloroacético

TCM – tubo de centrífuga com membrana

TEMED – N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine

TLCK – Tosyl lysine Chloromethyl Ketone

TPCK - Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone

Ana Cardoso 2015 xxiii

Lista de figuras

Ana Cardoso 2015 i

Figura 1 - Basídio – estrutura de reprodução sexuada que é caraterística dos fungos

que pertencem ao filo Basidiomicota. Adaptada de

http://mycostra.free.fr/initiation/generalites.htm .............................................................. 4

Figura 2 – Macrolepiota procera – Adaptado de:

http://www.stridvall.se/fungi/gallery .............................................................................. 19

Figura 3 – Agrocybe aegerita – Adaptado de:

http://www.funghiitaliani.it/?showtopic=16802. ............................................................ 20

Figura 4 – Repicagem da cultura em meio sólido .................................................. 30

Figura 5 - Repicagem da cultura em meio líquido ................................................. 31

Figura 6 – (A) SDS-PAGE 12,5 % a uma dimensão do micélio e secreção de

Macrolepiota procera. (P) Padrão, (1) 1,1 µg de PSB, (2) 0,3 µg de secreção do 4º dia,

(3) 2,3 µg extrato do micélio do 4º dia, (4) 0,4 µg de secreção do 5º dia, (5) 3,3 µg de

extrato do micélio do 5º dia, (6) 0,3 µg de secreção do 6º dia, (7) 3,1 µg de extrato do

micélio do 6º dia, (8) 0,3 µg de secreção do 8º dia, (9) 3,7 µg de extrato do micélio do

8º dia, (10) 0,2 µg de secreção do 10º dia, (11) 2,9 µg de extrato do micélio do 10º dia.

(B e C) zimografia de gelatina 12,5% (1) 0,8 µg de PSB, (2) 0,3 µg de secreção do 4º

dia, (3) 1,8 µg extrato do micélio do 4º dia, (4) 0,3 µg de secreção do 5º dia, (5) 2,4 µg

de extrato do micélio do 5º dia, (6) 0,2 µg de secreção do 6º dia, (7) 2,3 µg de extrato

do micélio do 6º dia, (8) 0,2 µg de secreção do 8º dia, (9) 2,8 µg de extrato do micélio

do 8º dia, (10) 0,1 µg de secreção do 10º dia, (11) 2,1 µg de extrato do micélio do 10º

dia.O SDS-PAGE foi revelado pelo método de Nitrato de prata e as zimografias pelo

método de Coomassie Blue. ........................................................................................... 51

Figura 7 - Perfis das actividades enzimáticas da secreção e do micélio de M.

procera, com diferentes tempos de crescimento. A actividade específica para os

substratos AMC (pmol AMC/min/µg) e MU (pmol MU/min/µg) representa a média de

duas experiências independentes desvio padrão para A e B e uma única experiência para C. ............................................................................................................................. 53

Figura 8 - Perfil proteico do extrato do carpóforo do cogumelo comestível

Macrolepiota procera em gel 12,5% SDS-PAGE e zimograma 12,5% acrilamida co-

polimerizado com 1mg/ml de gelatina. (P) Padrão, (1) SDS-PAGE, (2) Zimografia com

gelatina. Estão 154,98 ug proteína total nos poços 1 e 2. Retirado de Coelho 2014. ..... 56

Figura 9 – Perfil da actividade enzimática do extrato aquoso do carpóforo de M.

procera com substratos AMC (A) e MU (B). O substrato preferencial é aquele que

apresenta um maior valor de actividade específica (pmol AMC/min/µg). Os resultados

representam a média de três experiências independentes ± SEM. Retirado de Coelho

2014. ............................................................................................................................... 57

Figura 10 - SDS-PAGE 12,5 % (A e B) do micélio e secreção de A. aegerita. (P)

Padrão (1) 0,5 µg de secreção do 4º dia, (2), 0,4 µg de secreção do 5º dia, (3) 0,4 µg de

secreção do 6º dia, (4) 0,4 µg de secreção do 8º dia, (5) 0,3 µg de secreção do 10º dia,

(6) 1,4 µg de extrato do micélio com 4 dias, (7) 1,5µg de extrato do micélio com 5 dias,

(8) 2,9 µg de extrato do micélio com 6 dias, (9) 7,4 µg de extrato do micélio com 8 dias,

(10) 3,1 µg de extrato do micélio com10 dias. (C) Zimografia de gelatina a 1 mg/ml

copolimerizada em gel de acrilamida a 12,5% da secreção de Agrocybe aegerita. (1)

0,3 µg de secreção do 4º dia, (2), 0,3 µg de secreção do 5º dia, (3) 0,3 µg de secreção do

6º dia, (4) 0,3 µg de secreção do 8º dia, (5) 0,3 µg de secreção do 10º dia, (6) 1,1 µg de

extrato do micélio com 4 dias, (7) 1,2µg de extrato do micélio com 5 dias, (8) 2,2 µg de

extrato do micélio com 6 dias, (9) 5,6 µg de extrato do micélio com 8 dias, (10) 2,4 µg

de extrato do micélio com10 dias. .................................................................................. 59

Figura 11 - Perfis das actividades enzimáticas da secreção e micélio de A. aegerita,

com diferentes tempos de crescimento. A actividade específica para os substratos

AMC (pmol AMC/min/µg) e MU (pmol MU/min/µg) representa a média de duas

experiências independentes ± desvio padrão. ................................................................. 61

Figura 12 - Actividade residual do extrato do micélio liofilizado de A. aegerita

relativo ao substrato Phe-AMC. O controlo consiste em 100% da actividade do extrato

com Phe-AMC A actividade residual consiste na média de três experiências

independentes desvio padrão. ..................................................................................... 63

Figura 13 - Perfil proteico do extrato do carpóforo do cogumelo comestível

Agrocybe aegerita em gel 12,5% SDS-PAGE e zimograma 12,5% acrilamida co-

polimerizado com 1mg/ml de gelatina. (P) Padrão, (1) SDS-PAGE, (2) Zimografia com

gelatina. Estão 26,175 ug proteína total nos poços 1 e 2. Retirado de Coelho 2014. ..... 64

Figura 14 - Especificidade do substrato-MU do extrato do carpóforo de Agrocybe

aegerita. O substrato preferencial é aquele que apresenta maior valor de actividade

específica (pmol MU/min/µg). Os resultados representam a média de 3 experiências

independentes ± SEM. Retirado de Coelho 2014. .......................................................... 65

Figura 15 - Actividade residual do extrato do carpóforo de A. aegerita relativo ao

substrato Phe-AMC. O controlo consiste em 100% da actividade do extrato com Phe-

AMC A actividade residual consiste na média de três experiências independentes desvio padrão. Retirado de Coelho 2014. ....................................................................... 66

Figura 16 – (A) SDS-PAGE 12,5 % do micélio e secreção de Macrolepiota

procera em condição de suplementação. (P) Padrão, (1) extrato do micélio com 8 dias

em PSB, (2) 0,4 µg da secreção em PSB, (3) extrato do micélio em PSB + serradura de

acácia, (4) 3,0 µg da secreção em PSB + serradura de acácia, (5) 2,2 µg de PSB +

serradura de acácia, (6) 2,0 µg de PSB + serradura de eucalipto, (7) 1,9 µg de secreção

em PSB + serradura de eucalipto, (8) extrato do micélio em PSB + serradura de

eucalipto. (B) zimografia de gelatina 12,5% do micélio e secreção de Macrolepiota

procera em condição de suplementação. (1) extrato do micélio com 8 dias em PSB,

(2) 0,3 µg da secreção em PSB, (3) extrato do micélio em PSB + serradura de acácia,

(4) 2,2 µg da secreção em PSB + serradura de acácia, (5) 1,7 µg de PSB + serradura de

acácia, (6) 1,5 µg de PSB + serradura de eucalipto, (7) 1,4 µg de secreção em PSB +

serradura de eucalipto, (8) extrato do micélio em PSB + serradura de eucalipto. ......... 68

Figura 17 – Perfis das actividades enzimáticas da secreção de M. procera, em

condições de suplementação. A actividade específica para os substratos MU (pmol

MU/min/µg) representa a média de duas experiências independentes ± desvio padrão 70

Figura 18 - Perfis das actividades enzimáticas totais da secreção e do micélio de

M. procera, em condições de suplementação. A actividade total para os substratos

AMC (pmol AMC/min) e MU (pmol MU/min) representa a média de duas experiências

independentes ± desvio padrão ....................................................................................... 71

Figura 19 - (A) SDS-PAGE 12,5 % zimografia de gelatina 12,5% (B) do micélio e

secreção de A. aegerita em condição de suplementação. (P) Padrão, (1) 0,2 µg de

secreção em PSB, (2) 5,9 µg de extrato do micélio com 8 dias em PSB, (3) 3,2 µg de

secreção em PSB + borras de café, (4) 4,7 µg de extrato do micélio em PSB + borras de

café, (5) 3,2 µg de secreção em PSB + serradura de acácia, (6) 1,5 µg de extrato do

micélio em PSB + serradura de acácia, (7) 2,5 µg de secreção em PSB + serradura de

eucalipto, (8) 1,7 µg de extrato do micélio em PSB + serradura de eucalipto. (B)

zimografia de gelatina 12,5% do micélio e secreção de A. aegerita em condição de

suplementação. (P) Padrão, (1) 0,2 µg de secreção em PSB, (2) 4,4 µg de extrato do

micélio com 8 dias em PSB, (3) 2,4 µg de secreção em PSB + borras de café, (4) 3,5 µg

de extrato do micélio em PSB + borras de café, (5) 2,2 µg de secreção em

PSB + serradura de acácia, (6) 1,1 µg de extrato do micélio em PSB + serradura de

acácia, (7) 1,8 µg de secreção em PSB + serradura de eucalipto, (8) 1,3 µg de extrato do

micélio em PSB + serradura de eucalipto. ...................................................................... 73

Figura 20 - Perfis das actividades enzimáticas da secreção de A. aegerita, em

condições de suplementação. A actividade específica para os substratos AMC (pmol

AMC/min/µg) e MU (pmol MU/min/µg) representa a média de três experiências

independentes ± desvio padrão. ...................................................................................... 76

Figura 21 - Perfis das actividades enzimáticas do micélio de A. aegerita, em

condições de suplementação. A actividade específica para os substratos AMC (pmol

AMC/min/µg) e MU (pmol MU/min/µg) representa a média de três experiências

independentes ± desvio padrão. ...................................................................................... 77

Figura 22 - (A) SDS-PAGE 12,5 % da secreção de M. procera concentrada por

precipitação com sulfato de amónia e liofilização. (P) Padrão, (1) 0,8 µg de PSB, (2) 1,0

µg de PSB precipitado com SA, (3) 3,4 µg de PSB liofilizado, (4) 0,2 µg de secreção de

M. procera, (5) 0,3 µg de secreção de M. procera precipitada com SA, (6) 4,6 µg de

secreção de M. procera liofilizada. (B) Zimografia de gelatina 12,5% da secreção de M.

procera concentrada por precipitação com sulfato de amónia e liofilização. (P) Padrão,

(1) 0,6 µg de PSB, (2) 0,7 µg de PSB precipitado com SA, (3) 2,9 µg de PSB

liofilizado, (4) 0,1 µg de secreção de M. procera, (5) 0,3 µg de secreção de M. procera

precipitada com SA, (6) 3,4 µg de secreção de M. procera liofilizada. ......................... 79

Figura 23 - (A) SDS-PAGE 12,5 % secreção de M. procera concentrada com

centricon (com linha de corte de 30 kDa). (P) Padrão, (1) 0,2 µg de secreção de M.

procera, (2) 8,1 µg de secreção parte superior da membrana do centricon, (3) 0,2 µg de

secreção parte inferior da membrana do centricon, (4) 0,8 µg de PSB, (5) 1,1 µg de PSB

parte superior da membrana do centricon, (6) 0,1 µg de PSB parte inferior da membrana

do centricon. Zimografia de gelatina 12,5% (B) da secreção de M. procera concentrada

com centricon (com linha de corte de 30 kDa). (P) Padrão, (1) 0,1 µg de secreção de M.

procera, (2) 6,1 µg de secreção parte superior da membrana do centricon, (3) 0,1 µg de



do centricon. ................................................................................................................... 80

Figura 24 – Perfis das actividades enzimáticas da secreção de M. procera, após

concentração por precipitação com sulfato de amónia, liofilização e filtração com

centricon. A actividade específica para os substratos MU (pmol MU/min/µg) representa

uma única experiência. ................................................................................................... 81

Figura 25 - Perfis das actividades enzimáticas da secreção de M. procera, após

concentração por matrizes DEAE (A) e CM (B). A actividade específica para os

substratos MU (pmol MU/min/µg) representa uma única experiência. ......................... 82

Figura 26 - SDS-PAGE 12,5 % (A) e zimografia de gelatina 12,5% (B) da

secreção de M. procera concentrada pelo método TCA-acetona. (P) Padrão, (1) PSB, (2)

PSB precipitado com TCA-acetona, (3) secreção de M. procera, (4) secreção de M.

procera precipitado com TCA-acetona. ......................................................................... 83

Figura 27 – (A) SDS-PAGE 12,5 % da secreção de A. aegerita concentrada por

precipitação com sulfato de amónia e liofilização. (P) Padrão, (1) 0,8 µg de PSB, (2) 1,0

µg de PSB precipitado com SA, (3) 3,8 µg de PSB liofilizado, (4) 0,2 µg de secreção de

A. aegerita, (5) 1,2 µg de secreção de A. aegerita precipitada com SA, (6) 4,4 µg de

secreção de A. aegerita liofilizada. (B) Zimografia de gelatina 12,5% da secreção de

A. aegerita concentrada por precipitação com sulfato de amónia e liofilização. (P)

Padrão, (1) 0,6 µg de PSB, (2) 0,7 µg de PSB precipitado com SA, (3) 2,9 µg de PSB

liofilizado, (4) 0,2 µg de secreção de A. aegerita, (5) 0,9 µg de secreção de A. aegerita

precipitada com SA, (6) 3,3 µg de secreção de A. aegerita liofilizada. ......................... 84

Figura 28 - (A) SDS-PAGE 12,5 % da secreção de A. aegerita concentrada com

centricon (com linha de corte de 30 kDa). (P) Padrão, (1) 0,2 µg de secreção de A.

aegerita, (2) 3,2 µg de secreção parte superior da membrana do centricon, (3) 0,1 µg de



do centricon. (B) Zimografia de gelatina (1mg/ml) copolimerizada em gel 12,5% de

acrilamida da secreção de A. aegerita concentrada com centricon (com linha de corte de

30 kDa). (P) Padrão, (1) 0,2 µg de secreção de A. aegerita, (2) 2,4 µg de secreção parte

superior da membrana do centricon, (3) 0,1 µg de secreção parte inferior da membrana

do centricon, (4) 0,6 µg de PSB, (5) 0,8 µg de PSB parte superior da membrana do

centricon, (6) 0,1 µg de PSB parte inferior da membrana do centricon. ........................ 85

Figura 29 - Perfis das actividades enzimáticas da secreção de A. aegerita, após

concentração através da precipitação com sulfato de amónia, liofilização e centricon. A

actividade específica para os substratos AMC (pmol AMC/min/µg) representa a média

de quatro experiências independentes ± desvio padrão para a secreção, duas

experiências independentes ± desvio padrão para a concentração com sulfato de amónia

e uma experiência independente ± desvio padrão para a liofilização e concentração com

centricon. A actividade específica para os substratos e MU (pmol MU/min/µg)

representa a média de duas experiências independentes ± desvio padrão para a secreção,

uma experiência independente ± desvio padrão para a precipitação com sulfato de

amónia e liofilização. ...................................................................................................... 86

Figura 30 - Perfis das actividades enzimáticas da secreção de M. procera, após

concentração por matrizes DEAE e CM. A actividade específica para os substratos MU

(pmol MU/min/µg) representa uma única experiência. .................................................. 87

Figura 31 - SDS-PAGE 12,5 % (A) e zimografia de gelatina 12,5% (B) da

secreção de A. aegerita concentrada por precipitação com TCA. (P) Padrão, (1) PSB,

(2) PSB precipitado com TCA-acetona, (3) secreção de A. aegerita, (4) secreção de A.

aegerita precipitado com TCA-acetona. ........................................................................ 88

Figura 32 – A) Cromomatografia de troca catiónica com a matriz UNIsphere S, em

FPLC e actividade total – um volume de 10 mL de extrato forma adicionados à matriz

(1 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio pH 7,0 a um fluxo de 1,5

ml/min. A eluição das proteínas foi feita com tampão 30 mM fosfato de sódio com 1M

NaCl a pH 7,0. Foram recolhidas fracções de 3 ml. A actividade total das proteínas no

estrato para com o substrato Phe-AMC e a grande absorvância a 280 nm localizada no

não ligado indicam que a proteína não ligou à matriz. B) ampliação da absorvância da

parte do cromatograma que corresponde à eluição. ....................................................... 90

Figura 33 - Cromomatografia de troca aniónica com a matriz DEAE, em FPLC e

actividade total – um volume de 8,5 mL de extrato forma adicionados à matriz (1 cm3)

equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio pH 7,0 a um fluxo de 1,5 ml/min. A

eluição das proteínas foi feita com tampão 30 mM fosfato de sódio com 1M NaCl a pH

7,0. Foram recolhidas fracções de 3 ml. A actividade total das proteínas no estrato para

com o substrato Phe-AMC e a grande absorvância a 280 nm localizada no não ligado

indicam que a proteína não ligou à matriz. B) ampliaçãoda absorvância da parte do

cromatograma que corresponde à eluição. ..................................................................... 91

Figura 34 – Zimografia com gelatina a 12,5% (A) do extrato do micélio de A.

aegerita incubado a diferentes pH’s e actividade específica dos extratos (B) sujeito a

valores de pH distintos com substratos AMC em ensaio enzimático a pH 6,0 – Em A) as

tiras 4, 5, 6, 7 e 8 correspondem a encubações do gel a pH 4, 5, 6, 7 e 8

respectivamente. B) Actividade específica do extrato sujeito a diferentes pH’s e

encubado 10 minutos antes da adição dos substratos com tampão a pH 6 (2µl de extrato

em 198 µl de tampão 30 mM fosfato de sódio pH 6,0). A actividade específica para os

substratos AMC (pmol AMC/min/µg) representa uma única experiência. .................... 93

Figura 35 - Cromomatografia de exclusão molecular com a matriz Superdex 200

pg 16/600, em FPLC e actividade total – um volume de 3 mL de extrato foi adicionado

à matriz (120 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio, 0,1 M Na Cl, pH

8,0 a um fluxo de 1,0 ml/min. Foram recolhidas fracções de 3 ml. A actividade total das

proteínas no ensaio para com o substrato Phe-AMC indica que as fracções com mais

actividade saem 80 minutos depois da injecção da amostra a que corresponde às

fracções F27 a F30. ......................................................................................................... 95

Figura 36 – Perfis das actividades enzimáticas do extrato de A. aegerita, e fracções

com mais actividade da exclusão molecular. Os ensaios enzimáticos foram feitos com

100 µl de cada uma das amostras. A actividade total (pmol AMC/min) foi determinada

com os substratos Met, Phe e Leu-AMC. Cada uma das barras representa uma única

experiência. ..................................................................................................................... 96

Figura 37 – SDS-PAGE a 12,5 % das fracções da exclusão molecular com a matriz

Superdex 200 pg 16/600 do extrato de A. aegerita – cada um dos poços está identificado

com o número da respectiva fracção. ............................................................................. 97

Figura 38 - Cromomatografia de troca aniónica com a matriz DEAE, em FPLC

com pool (F27 a F30) da exclusão molecular e actividade total – a pool da exclusão

molecular foi diluida na proporção de 1ml de pool para 3 ml de tampão. 22 ml da pool

diluida foram colocados na matriz DEAE (1 cm3) equilibrada com tampão 30 mM

fosfato de sódio pH 8,0 a um fluxo de 1,5 ml/min. A eluição foi feita com tampão 30

mM fosfato de sódio, 1 M NaCl pH 8,0. Foram recolhidas fracções de 3 ml. A

actividade total das proteínas no ensaio para com o substrato Phe-AMC indica que as

fracções com mais actividade saem no não ligado. B) ampliação da absorvância da parte

do cromatograma que corresponde à eluição. ................................................................ 98

Figura 39 - SDS-PAGE a 12,5 % das fracções da pool de F27 a F30 separadas por

troca aniónica com a matriz DEAE – cada um dos poços está identificado com o

número da respectiva fracção. As fracções a partir da 9, não apresentam bandas

reveladas por nitrato de prata.......................................................................................... 98

Figura 40 – (A) SDS-PAGE a 12,5% (B) e actividade total com substratos AMC

do extrato do micélio de A. aegerita tratado com n-hexano ou 1% de SDS – (1) extrato,

(2) extrato + 1% SDS, (3) extrato tratado com n-hexano 1:1 parte aquosa e (4) fase

hidrofóbica. B) Actividade específica para os substratos AMC (pmol AMC/min/µg)

representa uma única experiência. .................................................................................. 99

Figura 41 - Cromomatografia de troca aniónica com a matriz DEAE, em FPLC

com extrato a pH 9 tratado com n-hexano e actividade total – 1 ml da pool diluida foram

colocados na matriz DEAE (1 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio pH

8,0 a um fluxo de 1,5 ml/min. A eluição foi feita com tampão 30 mM fosfato de sódio, 1

M NaCl pH 8,0. Foram recolhidas fracções de 3 ml. A actividade total das proteínas no

ensaio para com o substrato Phe-AMC indica que as fracções com mais actividade saem

no não ligado. B) ampliação da absorvância da parte do cromatograma que corresponde

à eluição. ....................................................................................................................... 100

Figura 42 – SDS-PAGE a 12,5% e zimografia de gelatina das fracções da pool da

cromatografia de troca catiónica com a matriz DEAE – cada um dos poços está

identificado com o número da respectiva fracção. ....................................................... 101

Figura 43 – SDS-PAGE 12,5 %, zimografia de gelatina e ensaios enzimáticos com

Phe-AMC das fracções da cromatografia de afinidade com Phenyl-Sepharose. 1ml de

extrato foi colocado na matriz Phenyl-Sepharose (1 cm3) equilibrada com tampão 30

mM fosfato de sódio pH 8,0. A eluição foi feita com 2M ureia. (P) padrão, (1) não

ligado, (2) lavagem 1, (3) lavagem 2, (4) lavagem 3, (5) 1ª eluição, (6) 2ª eluição, (7) 3ª

eluição, (8) extrato. Actividade total para os substratos AMC (pmol AMC/min)

representa uma única experiência. ................................................................................ 102

Figura 44 - SDS-PAGE 12,5 %, zimografia de gelatina e ensaios enzimáticos com

Phe-AMC das fracções da cromatografia de interação hidrofóbica com Phenyl-

Sepharose. 1ml de extrato a 2M de sulfato de amónia foi colocado na matriz Phenyl-

Sepharose (1 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio, 2M sulfato de

amónia, pH 8,0. A eluição foi feita com tampão 30 mM fosfato de sódio pH 8,0. (P)

padrão, (1) não ligado, (2) lavagem 1, (3) lavagem 2, (4) lavagem 3, (5) 1ª eluição, (6)

2ª eluição, (7) 3ª eluição, (8) proteínas que precipitaram pela adição de 2 M sulfato de

amónia a extrato. Actividade total para os substratos AMC (pmol AMC/min) representa

uma única experiência. ................................................................................................. 103

Figura 45 - SDS-PAGE 12,5 %, zimografia de gelatina e ensaios enzimáticos com

Phe-AMC das fracções da cromatografia de interação hidrofóbica com Phenyl-

Sepharose. 1ml de extrato a 1M de sulfato de amónia foi colocado na matriz Phenyl-

Sepharose (1 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio, 1M sulfato de

amónia, pH 8,0. A eluição foi feita com tampão 30 mM fosfato de sódio pH 8,0. (P)

padrão, (ÑL) não ligado, (L1) lavagem 1, (L2) lavagem 2, (L3) lavagem 3, (E1) 1ª

eluição, (E2) 2ª eluição, (E3) 3ª eluição. Actividade total para os substratos AMC (pmol

AMC/min) representa uma única experiência. ............................................................. 104


pg 16/600, em FPLC e actividade total – um volume de 4 mL de extrato foi adicionado

à matriz (120 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio, 0,1 M Na Cl, pH

8,0 a um fluxo de 1,0 ml/min. Foram recolhidas fracções de 3 ml. A actividade total das

proteínas no ensaio para com o substrato Phe-AMC indica que as fracções com mais

actividade saem perto dos 80 minutos de eluição (fracções F27 a F29). Os ensaios

enzimáticos foram feitos com 50 µl de amostra. Actividade total para os substratos

AMC (pmol AMC/min) representa uma única experiência. ........................................ 106

Figura 47 - SDS-PAGE 12,5 %, zimografia de gelatina das principais fracções da

cromatografia de exclusão molecular e de interação hidrofóbica com Phenyl-Sepharose.

Foram colocados 4 ml de extrato na exclusão molecular. 6,5 ml da pool formada pelas

fracções F27, F28 e F29 foram postos a 1M de sulfato de amónia e colocados em

contacto na matriz Phenyl-Sepharose (1,5 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato

de sódio, 1M sulfato de amónia, pH 8,0. A eluição foi feita com tampão 30 mM fosfato

de sódio pH 8,0. (P) padrão, (Ext) extrato, (TCM) centricon, (Pool) conjunto das

fracções F27 a F29 da exclusão molecular, (SA), Pool com 1M de sulfato de amónia,

(ÑL) não ligado, (L1) lavagem 1, (L2) lavagem 2, (L3) lavagem 3, (L4) lavagem 4, (5)

lavagem 5, (E1) 1ª eluição, (E2) 2ª eluição, (E3) 3ª eluição, (E4) 4ª eluição, (E5) 5ª

eluição. Actividade total para os substratos AMC (pmol AMC/min) representa uma

única experiência. ......................................................................................................... 107

Figura 48 – Actividades específicas com os substratos Met-AMC, Phe-AMC e

Leu-AMC da pool da exclusão molecular com 1M de sulfato de amónia a pH 8,0 (50 µl

no ensaio) e não ligado, lavagens e eluições (100 µl) da cromatografia de interação

hidrofóbica. Os ensaios foram feitos com 50 de pool da exclusão molecular com 1 M

sulfato de amónia (pool E.M. + SA) e 100 µl das restantes amostras. Actividade

específica para os substratos AMC (pmol AMC/min/µg) representa a média de duas

experiências para a pool e pool SA e uma única experiência para as restantes amostras

analisadas. ..................................................................................................................... 108


pg 16/600, em FPLC e actividade total – um volume de 3,6 ml de extrato foi adicionado

à matriz (120 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódioa um fluxo de 1,0

ml/min. Foram recolhidas fracções de 3 ml. A actividade total das proteínas no ensaio

para com o substrato Phe-AMC indica que as fracções com mais actividade saem perto

dos 80 minutos após a injecção da amostra (fracções F27 a F30). Os ensaios

enzimáticos foram feitos com 100 µl de amostra. Actividade total para os Phe-AMC

(pmol AMC/min) representa uma única experiência. .................................................. 109

Figura 50 - SDS-PAGE 12,5 %, das principais fracções da cromatografia de

exclusão molecular e de interacção hidrofóbica a pH 6. Foram colocados 4 ml de extrato

na exclusão molecular. 4 ml da pool formada pelas fracções F27, F28 e F29 foram

postos a 1M de sulfato de amónia e colocados em contacto na matriz Phenyl-Sepharose

(1,5 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio, 1M sulfato de amónia, pH

6,0. A eluição foi feita com tampão 30 mM fosfato de sódio pH 6,0. (P) padrão, A) 25 a

31 correspondem às fracções de E.M., B) (pool) pool da exclusão molecular a pH 6,

(SA) pool da exclusão molecular com 1 M sulfato de amónia, (pp) precipitado formado

após adição de 1M sulfato de amónia à pool, (ÑL) não ligado da phenyl sepharose, (L)

lavagem, C) (E) eluição. Actividade total para os Phe-AMC (pmol AMC/min)

representa uma única experiência. ................................................................................ 110

Figura 51 – Actividades totais com os sustratos Met-AMC, Phe-AMC, Leu-AMC

e Arg-AMC das fracções da cromatografia de interacção hidrofóbica com a matriz

Phenyl Sepharose a pH 6,0. 2 ml de pool da E.M. a 1M de sulfato de amónia foram

colocados na matriz Phenyl-Sepharose (1 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato

de sódio, 1M sulfato de amónia, pH 6,0. A eluição foi feita com tampão 30 mM fosfato

de sódio pH 6,0. (E) corresponde a fracção eluida. Actividade total para os substratos

AMC (pmol AMC/min) representa uma única experiência. ........................................ 111


pg 16/600, em FPLC e actividade total – foram injectados 4 ml de extrato de micélio

liofilizado na matriz (120 cm3) equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio, 0,1 M

Na Cl, pH 8,0 a um fluxo de 1,0 ml/min. Foram recolhidas fracções de 3 ml. A

actividade total das proteínas no ensaio para com o substrato Phe-AMC indica que as

fracções com mais actividade saem perto dos 80 minutos após a injecção da amostra

(fracções F27 a F29). Os ensaios enzimáticos foram feitos com 50 µl de amostra.

Actividade total para os substratos AMC (pmol AMC/min) representa uma única

experiência. ................................................................................................................... 112

Figura 53 - SDS-PAGE (A e D), zimografia (B e E) e gel nativo (C e F) a 12,5 %

das principais fracções da cromatografia de exclusão molecular e de interacção

hidrofóbica a pH 6. Foram colocados 4 ml de extrato de micélio liofilizado na exclusão

molecular. 2 ml da pool formada pelas fracções F28, F29, F30 e F31 foram postos a 1M

de sulfato de amónia e colocados em contacto na matriz Phenyl-Sepharose (1,5 cm3)

equilibrada com tampão 30 mM fosfato de sódio, 1M sulfato de amónia, pH 6,0. A

eluição foi feita com tampão 30 mM fosfato de sódio pH 6,0. (P) padrão, A) B) e C) os

números correspondem às fracções respectivas da exclusão molecular, (pool) pool das

fracções F28 a F31 de E.M., (SA) pool a 1M de sulfato de amónia, (PP) precipitado da

pool E.M. após adição de 1M de sulfato de amónia. D) E) e F) (ÑL) fracção que não

ligou à matriz hidrofóbica, (L) lavagens, (E) eluições. ................................................ 113

Figura 54 – Actividade residual do extrato de A. aegerita relativo ao substrato Phe-

AMC. O controlo consiste em 100% da actividade do extrato com Phe-AMC A

actividade residual consiste na média de três experiências independentes desvio padrão. .......................................................................................................................... 114

Figura 55 - Actividade residual do das fracções da exclusão molecular relativo a

substratos AMC. A actividade de F29 foi testada com Arg-AMC e as actividade de F30

a F32 foram testadas com Phe-AMC. Os controlos consistem em 100% da actividade de

F29 com Arg-AMC e 100% da actividade F30, F31 e F32 com Phe-AMC. A actividade

residual consiste na média de três experiências independentes desvio padrão. ....... 114

Figura 56 – Zimografias para a detecção de endoglucanases, xilanases e quitinases

das principais fracções da cromatografia de exclusão molecular e de interação

hidrofóbica com Phenyl-Sepharose. (Ext) extrato, (27) fracção 27 da E.M., (28) fracção

28 da E.M., (29) fracção 29 da E.M., (30) fracção 30 da E.M., (31) fracção 31 da E.M.,

(Pool) conjunto das fracções F30 a F32 da exclusão molecular, (SA) Pool com 1M de

sulfato de amónia, (ÑL) não ligado, (L1) lavagem 1, (L6) lavagem 6, (E1) 1ª eluição,

(E2) 2ª eluição, (E3) 3ª eluição, (E4) 4ª eluição, (E5) 5ª eluição, (E6) 6ª eluição. ...... 116

Ana Cardoso Ana Cardoso 2015 xxxv 2015 xxxv

Lista de tabelas

Ana Cardoso Ana Cardoso 2015 i 2015 i

Tabela 1 - Proteínas Fúngicas Imunomoduladoras e respectivas acções

proporcionadas pela interação com sistemas vivos. ......................................................... 8

Tabela 2 - Algumas Lectinas de Basidiomicetes. .............................................. 10

Tabela 3 - Proteínas Inactivadoras de Ribossomas ............................................ 11

Tabela 4 - Lacases e potenciais aplicações biotecnológicas. ............................. 14

Tabela 5 - Tirosinases e potenciais aplicações biotecnológicas ........................ 16

Tabela 6 - Proteases de basidiomicetes e suas actividades. ............................... 18

Tabela 7 - Factores ambientais que afectam alguns aspectos do crescimento de

basidiomicotas em cultura e a rentabilidade do processo. .............................................. 21

Tabela 8 – Suplementação do meio de cultura. ................................................. 32

Tabela 9 – Zimografias em gel de poliacrilamida. ............................................ 35

Tabela 10 – Detecção de hidrolases com substratos Methyl-Coumaril-7-Amide

(AMC). ........................................................................................................................... 38

Tabela 11 – Detecção de hidrolases com substratos 4-methylumbelliferone

(MU). .............................................................................................................................. 38

Tabela 12 - Inibidores específicos de proteases ................................................. 39

Tabela 13 – Concentração da proteína dos micélios e secreções de Macrolepiota

procera (µg/ml) ao longo do tempo de crescimento. ..................................................... 50

Tabela 14 – Concentração da proteína dos micélios e secreções de Agrocybe

aegerita (µg/ml) ao longo do tempo de crescimento...................................................... 59

Tabela 15 - Concentração da proteína (µg/ml) das secreções do 8º dia de

crescimento de M. procera em condição de suplementação. ......................................... 68

Tabela 16 - Concentração da proteína (µg/ml) das secreções do 8º dia de

crescimento de A. aegerita em condição de suplementação. ......................................... 72

Tabela 17 - Concentração da proteína (µg/ml) da secreção de M. procera. ...... 78

Tabela 18 - Concentração da proteína (µg/ml) da secreção de A. aegerita. ...... 83

Ana Cardoso 2015 1

Introdução

Hidrolases de Agrocybe aegerita e Macrolepiota procera: Purificação parcial e caracterização Introdução

Ana Cardoso 2015 3

1.1. Fungi

Os fungos são eucariontes, aeróbios obrigatórios ou facultativos, com

reprodução sexuada ou assexuada. Podem ser unicelulares ou pluricelulares.

Apresentam células com reforço celulósico externo, como nas algas e vegetais, porém é

comum a presença de depósitos de quitina, polímero frequentemente encontrado em

animais.

Estes organismos são quimiotróficos e secretam enzimas responsáveis pela

degradação de uma ampla variedade de substratos orgânicos. Estas enzimas levam à

produção de nutrientes solúveis, que são então absorvidos passivamente ou capturados

na célula por transporte activo. (Rai and Ahlawat 2002).

Os fungos têm características morfológicas e fisiológicas, que os tornam capazes

de se adaptar ao meio onde se desenvolvem, quer sejam parasitas, saprotróficos, ou

simbiontes. Estas interacções específicas estabelecidas entre espécies, bem como a

competição por recursos e defesa contra organismos patogénicos e predadores,

dependem criticamente da produção de biomoléculas activas (Carlsson, Edman et al.

2012).

1.2. Basidiomicota

O filo Basidiomicota, ao qual pertencem os basidiomicetes constitui cerca

de 34 % de todas as espécies de fungos conhecidas (Harms, Schlosser et al. 2011) de

entre as quais alguns dos fungos vulgarmente conhecidos como cogumelos. Os

organismos do filo basidiomicota, de um modo geral, são identificados pela produção

de basídios que são estruturas microscópicas produtoras de esporos encontradas nos

corpos de frutificação dos fungos basidiomicota. Um basídio, geralmente, produz quatro

esporos, chamados basidiosporos; o número pode variar de dois a oito esporos (Figura

1).


Ana Cardoso 2015 4

Figura 1 - Basídio – estrutura de reprodução sexuada que é

caraterística dos fungos que pertencem ao filo Basidiomicota. Adaptada de

http://mycostra.free.fr/initiation/generalites.htm

Os cogumelos basidiomicotas estão presentes na alimentação praticamente deste

os primórdios da existência do homem. À 3300 anos antes de Cristo, o homem já usava

basidiomicetes como alimento funcional (Piptoporus betulinus) e como utensílio para

acender fogueiras (Fomes fomentarius) (Stephenson 2010). Os gregos acreditavam que

os cogumelos davam força para as batalhas, os chineses viam-nos como o “elixir da

vida” devido às suas propriedades terapêuticas, os mexicanos utilizavam alguns

cogumelos alucinogénicos em cerimónias religiosas. Estes organismos também

inspiraram histórias como os fairy rings (cogumelos crescem em círculo) e a

bioluminiscência (Chang 1992; Stephenson 2010).

Nos países do Oriente o cultivo de cogumelos basidiomicetes tem uma longa

tradição, especialmente na China, onde essa prática começou a cerca de 600 anos antes

de Cristo. Os países orientais já usam os cogumelos para fins de alimentação e de

profilaxia há centenas de anos com bons resultados. Na Europa, o cultivo de cogumelos

começou na França no século XVII. A nível mundial, esta prática ganhou novas

dimensões com o evoluir das técnicas de produção e da aceitação destes como alimento

com excelentes propriedades nutritivas e terapêuticas (Kues and Liu 2000).

Com o surgir de novas técnicas de produção de basidiomicetes e possibilidade

de obtenção de proteínas em grandes quantidades e a custos baixos, a medicina


Ana Cardoso 2015 5

ocidental começou por se mostrar interessada na obtenção de novas biomoléculas. Desta

forma, se começou a caracterizar as propriedades terapêuticas do organismo e a

fraccionar, purificar e caracterizar os seus componentes.

A procura de novas biomoléculas que sejam capazes de revolucionar a medicina

e a indústria é fundamental. Os basidiomicetes já provaram ser úteis em muitas

aplicações médicas e biotecnológicas (Erjavec, Kos et al. 2012).

1.3. Moléculas biologicamente activas presentes em

Basidiomicotas

As substâncias bioactivas que podem ser isoladas a partir de basidiomicotas

podem ser divididas em três grupos:

Metabolitos secundários – ácidos, terpenóides, polifenóis, sesquiterpenos,

alcalóides, lactonas, esteróides, agentes quelantes, análogos nucleotídicos e

vitaminas;

Proteínas;

Polissacarídeos de alto peso molecular, incluindo os polissacaropeptídeos e

proteoglicanos.

1.4. Vantagens das proteínas de Basidiomicetes

Os basidiomicotas são ricos em proteínas e, além disso, estas têm características

particulares e diferentes das proteínas de organismos de outros reinos, os que as torna

únicas e potencialmente vantajosas a nível biotecnológico.

A grande vantagem das proteínas dos cogumelos é serem diferentes das

proteínas de origem microbiana, animal e de plantas. Outra vantagem é a de

apresentarem baixa especificidade catabólica. A baixa especificidade na indústria é algo

que pode ser vantajoso, devido a sua versatilidade. Na medicina, a capacidade da

mesma proteína manifestar acções distintas, como por exemplo, ter a capacidade de

funcionar como antifúngico, antiviral e anticancerígeno é igualmente importante. Esta

pluripotência pode se dever ao facto de uma dada proteína desempenhar várias tarefas


Ana Cardoso 2015 6

no basidiomicota. Para além disto, os basidiomicotas têm várias proteínas que exibem

uma estabilidade térmica e de pH considerável, apesar de não serem organismos

extermófilos. Além do mais se forem obtidas apartir de cogumelos comestíveis parte-se

do princípio que são seguras para a saúde humana (Erjavec, Kos et al. 2012).

1.5. Aplicações das proteínas de basidiomicotas

1.5.1. Medicina

Na medicina, há um crescente interese pelas proteínas de origem fúngica, devido

as suas propriedades antivirais, antibacterianas, antifúngicas, antiparasítica,

anticancerígenas, antioxidantes, imunomoduladoras, entomopatogénica, nematotóxicas

entre outras (Wasser 2002; Tateno and Goldstein 2003; Lindequist, Niedermeyer et al.

2005; Zhang, Cui et al. 2007; Karaman, Jovin et al. 2010; Wong, Ng et al. 2010; Alves,

Ferreira et al. 2012; Wang, Gu et al. 2013). Nesse sentido procura-se purificar,

concentrar e comercializar na forma de fármacos. Além disto, os cogumelos

basidiomicotas apresentam um conteúdo nutritivo bastante apelativo, com baixas

calorias, ausência de colesterol e uma excelente fonte de proteínas (Miles and Chang

2004). A extração e purificação dos componentes bioactivos destes organismos para a

produção de fármacos é algo bastante recente e que está a dar os primeiros passos, e

grande parte dos trabalhos publicados incide sobre as propriedades de extratos. Talvez a

tendência para se fazer estudos com os extratos se prenda com a identificação de

propriedades terapêuticas associadas ao consumo do organismo e de que modo é que

este consegue exercer a sua acção num contexto da medicina alternativa, sendo isto

evidente por grande parte desses estudos serem realizados por investigadores orientais.

De entre as várias proteínas, que manifestam um potencial farmacológico, e com

possível emprego na medicina, destacam-se as proteínas fúngicas imunomoduladoras

(lectinas e FIP - fungal immunomodulatory proteins), as proteínas inactivadoras de

ribossomas (RIP - ribosome inactivating proteins) e algumas proteínas antibacterianas e

antifúngicas.

Os basidiomicetes têm agentes que podem funcionar como imunomoduladores,

não só regulando o crescimento e estimulação das células do sistema imunitário, mas


Ana Cardoso 2015 7

também activando macrófagos e linfócitos (Chang, Chien et al. 2007). Os

imunomoduladores naturais têm tido grande atenção por parte dos investigadores como

alternativa aos que são actualmente usados como medicamentos químicos uma vez que

os últimos exibem um alto risco. Os imunomoduladores provenientes destes cogumelos

exibem actividades estimuladoras dos sistemas imunológico inato e adaptativo. No geral

os imunomoduladores de cogumelos podem ser divididos em quatro grupos a) lectinas

imunomoduladoras, b) terpenóides imunomoduladores, c) FIP e d) polissacarídeos

imunomoduladores (El Enshasy and Hatti-Kaul 2013).

As FIPs são proteínas que fazem o targeting das células imunes e podem

funcionar como adjuvantes, estimulando o sistema imunitário. Existem algumas

proteínas imunomoduladoras de cogumelos documentadas na literatura disponível,

sendo que algumas delas estão indicadas na Tabela 1. As FIP apresentam diversas

funções podendo exercer funções ao nível do sistema imunitário, activando a imunidade

inata e adaptativa, podem evitar o aparecimento de metásteses e suprimem a invasão

tumoral e em alguns casos promover a aglutinação de hemácias de alguns tipos

sanguíneos.

As lectinas são proteínas não imunes que ligam especificamente a carbohidratos

na superfície de células. Pensa-se que estas proteínas possam desempenhar um papel

importante na dormencia, crescimento e morfogénese, mudanças morfológicas na

sequência de infecções parasíticas e reconhecimento molecular durante o estádio inicial

do desenvolvimento das micorrizas (Wang, Ng et al. 1998). Em outros organismos,

manifestam a capacidade de aglutinarem células e exibem características moleculares e

fisiológicas únicas incluindo diversidade na estrutura, glicosilação e especificidade por

carbohidratos (Xu, Yan et al. 2011). É a família de proteínas mais estudada nos

cogumelos e possuem uma actividade antiproliferativa, antitumor e actividade

imunomoduladora. Podem ainda ser usadas no diagnóstico, para detectar alterações de

glicosilação, transformações malignas, progressões tumorais, metásteses, doenças

neurodegenerativas e infecções. A Tabela 2 enumera algumas lectinas não enzimáticas e

respectivas acções.


Ana Cardoso 2015 8

Tabela 1 - Proteínas Fúngicas Imunomoduladoras e respectivas

acções proporcionadas pela interação com sistemas vivos.

FIP

Nome da

proteína Organismo Propriedades Referência

app Auricularia

polytricha

Capacidade de aglutinar as células vermelhas do

sangue de rato.

Activa esplenócitos de murinos, aumentando a sua

proliferação e secreção de IFN-γ. Também aumenta a

produção de NO e TNF-α

Não apresenta citotoxicidade in vitro

(Sheu, Chien et

al. 2004)

gmi Ganoderma

microsporum

Suprime a invasão tumoral mediada por EGF e

também a metástase

Inibição do crescimento invasivo das células A549

mediado por EGF

(Lin, Sheu et al.

2010)

gts Ganoderma

tsugae

Promove a progressão do ciclo celular de fase G0/G1

para a fase S

Induz a expressão de IFN-γ

(Hsiao, Huang et

al. 2008)

vvo Volvariella

volvacea

Estimula a proliferação máxima de linfócitos no

sangue periférico em humanos

Capaz de aglutinar os glóbulos vermelhos de ratos

In vivo, a administração repetida reduziu reação

Arthus induzida por BSA em ratinhos

Aumenta selectivamente a expressão da transcrição

de IL-2, IL-4, o IFN-γ, TNF-α, linfotoxina e receptor

de IL-2 (efeitos imunomoduladores via regulação de

citocinas)

(Hsu, Hsu et al.

1997)

FIP-fve Flammulina

velutipes

Activa a imunidade inata e adaptativa e induz a

actividade anti-tumoral contra carcinoma

hepatocelular murino

Activador de linfócitos T em humanos

Capacidade tumoricida de macrófagos peritoneais e

esplenócitos específicos contra as células de

hepatoma BNL

(Chang, Hsieh et

al. 2010)

As proteínas RIP são enzimas que inactivam ribossomas eliminando um ou mais

resíduos de adenosina do RNA ribossomal. São estudadas devido as suas propriedades

tóxicas e pelo seu potencial terapêutico no cancro e actividade antiviral, desta forma


Ana Cardoso 2015 9

apresentam várias bioactividades como inibição da transcriptase reversa do HIV-1,

propriedades antifúngicas e antiproliferativa (Tabela 3).

Os cogumelos são organismos que possuem mecanismos de protecção contra

ofensas externas, sendo que as proteínas podem contribuir para essa acção protectora.

Algumas proteínas e péptidos com actividades antimicrobianas como a lentin (Ngai and

Ng 2003), pleurostrin (Chu, Xia et al. 2005), trichogin (Guo, Wang et al. 2005),

agrocybin (Ngai, Zhao et al. 2005) e ganodermin (Wang and Ng 2006), são exemplos de

antifúngicos explorados em corpos frutados de cogumelos.


Ana Cardoso 2015 10

Tabela 2 - Algumas Lectinas de Basidiomicetes.

Lectinas

Nome da proteína Organismo Propriedades Referência

Inocybe lectin Inocybe

umbrinella

Hemaglutinina

Inibição da transcriptase reversa de HIV-1

Inibe a proliferação de células tumorais,

incluindo as células de hepatoma HepG2 e

células do cancro da mama MCF7

(Zhao, Wang et

al. 2009)

Lectin RLL Russula lepida

Hemaglutinina

Termoestável

Exibe actividade antiproliferativa em células

de hepatoma HepG2 e células do cancro da

mama MCF-7 em humanos

(Zhang, Sun et

al. 2010)

Pleurotus

citrinopileatus

lectin

Pleurotus

citrinopileatus

Hemaglutinina

Termoestável

Actividade anti-tumoral em ratinhos

portadores de sarcoma 180

Resposta mitogénica em esplenócitos de

murino in vitro

Inibição da transcriptase reversa de HIV-1

(Li, Liu et al.

2008)

VVL Volvariella

volvacea

Estimula a expressão de citocinas Th1 e a

actividade proliferativa dos esplenócitos de

rato

Rápida expressão de CD69, CD25, NFAT,

IL-2, e PCNA, levando a uma rápida

proliferação de lifócitos

Activação e proliferação celular são

mediados através de uma via dependente de

cálcio

(Sze, Ho et al.

2004)

CNL Clitocybe

nebularis

Hemaglutinina

Exerce uma actividade anti-proliferativa

específica para as células T de leucemia

humana (através da ligação a receptores de

carbohidratos humano)

(Pohleven,

Obermajer et al.

2009)


Ana Cardoso 2015 11

Tabela 3 - Proteínas Inactivadoras de Ribossomas

RIP

Nome da


Flammulin Flammulina

velutipes

Capazes de inibir a tradução livre de células

em um sistema de lisado de reticulócitos de

coelho

(Wang and Ng

2000)

Marmorin Hypsizigus

marmoreus

Inibição da proliferação das células do

hepatoma Hep G2 e de células do cancro da

mama MCF-7,

Inibição da actividade da transcriptase reversa

de HIV-1

Inibição da tradução no sistema de lisado de

reticulócitos de coelho

(Wong, Wang et al.

2008)

Lyophyllin Lyophyllum

shimeji

Inibição da tradução em reticulócitos de coelho

Inibição da absorção de timidina por

esplenócitos de murídeo

Teratogenecidade (anormalidades embrionárias

durante o período de organogénese em ratos)


de HIV-1

(Lam and Ng 2001;

Wong, Ng et al.

2010)

Hypsin Hypsizigus

marmoreus

Termoestável (60% da actividade inibidora da

tradução foi retida após aquecimento a 100 ° C

durante 10 min)




de HIV-1

Actividade antiproliferativa contra células de

leucemia de rato e células de leucemia e de

hepatoma humano

(Lam and Ng 2001)

Volvarin Volvariella

volvacea



Actividade de desoxirribonuclease em SV-40

Forte efeito abortivo em ratos

(Yao, Yu et al.

1998)


Ana Cardoso 2015 12

1.5.2. Indústria

Os processos industriais resultam na produção de muitos compostos indesejáveis

e que são prejudiciais para os organismos vivos e para o ambiente devido ao consumo

exacerbado de energia e materias primas. Os processos enzimáticos são conhecidos pela

sua especificidade, rapidez e por frequentemente levarem, relativamente ao processos

convencionais, a uma redução da quantidade materia prima necessária. Para além disso,

contribuem para a redução de energia necessária, reacções secundárias indesejadas, e

necessidade de água. (Jegannathan and Nielsen 2013).

As enzimas provenientes de fungos têm vindo a ser integradas ao nível

industrial, uma vez que são adequadas para desempenhar inúmeras tarefas. Podem ser

usadas para complementar detergentes de loiça e roupa (hidrolases e proteases), em

pastas de dentes (lisozima e peroxidases), pastilhas (lacases), na indústria dos têxteis

(amilases, pectinases, catalases, celulases), tratamento das águas (laccases, tirosinases),

na produção e tratamento do couro (proteases e lipases), na indústria do papel (xilanases

e lipases), na reciclagem do papel (amilases e celulases), na indústria alimentar

(xilanases, glucanases, lacases, tirosinases, proteases, lipases). (Østergaard and Olsen

2011).

Estes são alguns exemplos de sectores que empregam as enzimas provenientes

de fungos para a realização de tarefas diversas, e cujos resultados se mostraram bastante

satisfatórios face aos métodos anteriormente utilizados. Apesar da esmagadora maioria

dos exemplos apresentados serem de proteínas de fungos inferiores, as enzimas de

fungos superiores, podem ser aplicadas em situações semelhantes, caso as suas

propriedades assim o permitam. Para isso é necessário ter em conta as condições sob as

quais estas vão estar sujeitas, os substratos que irão processar, os produtos a serem

formados e possíveis reacções secundárias. Muito ainda precisa ser feito para que se

criem as condições necessárias para que possam entrar na indústria. No entanto, existem

já alguns estudos em que para além de identificar e purificar proteínas de cogumelos

basidiomicotas, se tenta encontrar uma aplicação práctica.

As enzimas envolvidas na degradação da lignocelulose são dos grupos de

enzimas de fungos superiores mais estudadas. As proteínas de basidiomicetes são

catalisadores altamente eficientes (algumas são capazes de actuar num leque vasto de

substratos), e podem ser uma alternativa aos métodos industriais convencionais por não


Ana Cardoso 2015 13

levarem a formação de subprodutos tóxicos. Além disso, podem ser obtidas em grandes

quantidades (Seo, Sharma et al. 2003). Os fungos de podridão branca (white-rot fungi)

têm a capacidade de degradar completamente a lenhina, têm sido bastante estudados

uma vez que podem decompor e mineralizar organopolutantes semelhantes a esta

(Pointing 2001). Algumas proteínas desses cogumelos destacam-se, como é o caso das

lacases, peroxidases, tirosinases, hidrofobinas e proteases.

As Lacases proteínas presentes em vários organismos (proteínas ubíquas). Nos

fungos essas enzimas participam na esporulação, produção de pigmentos, na patogénese

de plantas, na formação do corpo frutado e na degradação de lenhina. As lacases

provenientes dos fungos são oxidases com cobre no local activo, e têm a capacidade de

oxidar um grande conjunto de compostos orgânicos aromáticos (Rivera-Hoyos,

Morales-Álvarez et al. 2013). Estas enzimas têm a particularidade de resistirem a

grandes variações de pH e temperatura, podendo ser utilizada para a conversão de

compostos recalcitrantes provenientes da actividade fabril, como no caso da industria

têxtil, na descoloração de corantes azo (Ma, Zhuo et al. 2014) ou na indústria do papel

(Sahoo and Gupta 2005). Na Tabela 4 estão descritos algumas das aplicações e estudos

realizados com lacases de basidiomicotas.


Ana Cardoso 2015 14

Tabela 4 - Lacases e potenciais aplicações biotecnológicas.

Lacase

Indústria

alvo

Nome da


Celulose e

papel -

Trametes

versicolor

Deslignificação da celulose de

eucalipto

Perto de 60% de poupança de dióxido

de cloro, com propriedades de

resistência da pasta de papel

branqueada, semelhantes aos obtidos

após o branqueamento convencional

(Gamelas,

Pontes et al.

2007)

Cosméticos Flac1 Flammulina

velutipes

Flac1 é induzida por pH alcalino

Pode ser aplicado a um sistema de

coloração de cabelo, sem o uso de

H2O2 que é irritante

(Saito, Ikeda

et al. 2012)

Alimentar MnP, LiP

e lacase

Phanerochaete

chrysosporium

Redução de polifenóis clarificação de

sumos

(Gassara-

Chatti, Brar et

al. 2013)

Têxtil - Ganoderma

sp.En3

Descoloração do corante azo

sulfonados Reactive Orange 16

(Ma, Zhuo et

al. 2014)

As Peroxidases são comuns a vários organismos e catalizam uma variedade de

reacções na presença de peróxidos como, por exemplo, o peróxido de hidrogénio

(Hamid and Khalil ur 2009), que se comporta como aceitador de electrões (Torres,

Bustos-Jaimes et al. 2003). Tem um grande potencial na destoxificação de solos, tal

como a lacase. As peroxidases têm a capacidade de degradar organopoluentes cuja

estrutura seja semelhante à da lenhina e também a capacidade de catalisar a oxidação de

compostos orgânicos e compostos não fenólicos. Já foram identificados, algumas

peroxidases como as peroxidases versáteis (Chen, Yao et al. 2010), peroxidases de

lenhina (LiP) e as peroxidases dependentes de manganês (MnP) (Chandrasekaran, Choi

et al. 2014). Já foram feitos estudos no sentido de encontrar mediadores redox que

aumentem a actividade de enzimas como a peroxidase e a lacase na capacidade de

degradar compostos recalcitrantes (Rao, Scelza et al. 2014). Têm-se desenvolvido

estratégias para aumentar a hidrofobicidade e rigidez levando a um aumento da

termoestabilidade, da actividade enzimática, da afinidade por substratos hidrofóbicos e

tolerância a solventes orgânicos, quer pela fixação destas enzimas a superfícies, pela


Ana Cardoso 2015 15

produção de nanopartículas com proteína adsorvida a superfície entre outras (Torres,

Bustos-Jaimes et al. 2003).

A tirosinase é uma enzima da superfamília das oxidases (Seo, Sharma et al.

2003) que apresenta funções multi-catalíticas (monofenol oxidase, difenolase e a

oxidação de 5,6-dihidroxiindole a 5,6-dihidroxiquinona) (Hu, Liu et al. 2014). As

tirosinases provenientes de cogumelos têm sido amplamente utilizadas na investigação,

na procura de inibidores para tirosinases humanas envolvidas no desenvolvimento de

doenças dermatológicas associadas à hiperacumulação de melanina e a algumas doenças

neurodegenerativas como a doença de Parkinson (Liu, Wu et al. 2012). As tirosinases

de cogumelos podem ser usadas como modelo, uma vez que é provável que os

inibidores competitivos para esta enzima possam também inibir a tirosinase humana.

Tem a vantagem de ser de fácil obtenção uma vez que está disponível no mercado e a

custos baixos (Alijanianzadeh, Saboury et al. 2012). Além disto, a tirosinase está

associada ao desenvolvimento da cor escura em frutos, legumes e fungos, após a

colheita, o que leva geralmente a uma perda de qualidade desses produtos devido a uma

degradação mais rápida destes (Liu, Wu et al. 2012). Esta actividade indesejável em

alguns alimentos não se extende a todos, pois esta é importante ao nível da produção de

passas, cacau e chá, onde contribui para o aparecimento de propriedades organolépticas

importantes (Seo, Sharma et al. 2003). Pode também ser aplicada na produção de

L-Dopa através de uma técnica de imobilização de enzima, sendo uma possível

alternativa aos métodos comuns de produção (Algieri, Donato et al. 2012). Também se

mostrou útil na remoção de compostos fenólicos de águas residuais (Xu and Yang 2013)

e no desenvolvimento de biosensores de alta sensibilidade e selectividade (Fiorentino,

Gallone et al. 2010). Algumas das possíveis aplicações desta enzima estão apresentadas

na Tabela 5.


Ana Cardoso 2015 16

Tabela 5 - Tirosinases e potenciais aplicações biotecnológicas

Tirosinase

Indústria alvo Nome da


Tratamento de

águas tirosinase -

Imobilização para a remoção de

compostos fenólicos de águas

residuais

Conversões completas atingidas

dentro de 0,5-3 h num reactor

descontinuo

(Xu and Yang

2013)

Indústria

Farmaceutica tirosinase -

Imobilização num reactor de

membrana contínua

Alta estabilidade ao longo de

30 h

Produtividade 22,54 mg L-1 h-1

Ideal para um reactor a larga

escala

(Algieri, Donato

et al. 2012)

Biosensor tirosinase Agaricus

bisporus

Detecção e semi-quantificação

de poluentes fenólicos

Enzima imobilizada numa

membrana

Tolera pH4-10 e temperatura 5-

25ºC

Suporta várias concentrações de

sal

1 mês de validade

(Russell and G.

Burton 1999)

As hidrofobinas são um grupo de proteínas únicas no reino fungi. São proteínas

pequenas anfipáticas que são secretadas para o meio exterior pela extremidade em

expansão do micélio durante periodos de carência de nutrientes, ou stress fisiológico.

Têm a capacidade de alterar a tensão da água, sendo que este fenómeno permite, à hifa

em crescimento, atravessar a interface entre a água e o ar. Em solução as hidrofobinas

podem se apresentar na forma monomérica embora seja mais provável, aquando a sua

concentração é bastante elevada, se agruparem em dímeros e trímeros na interface entre

a água e o ar dando origem a um filme. Estes filmes apresentam propriedades

importantes como a de ser anfipático, elástico, robusto, entre outras. As hidrofobinas


Ana Cardoso 2015 17

também podem ser usadas como agente para mascarar o paladar de fármacos ou

probióticos com um gosto desagradável, ou como um agente emulsionante na indústria

alimentar (Cox and Hooley 2009). Estas características fazem destas proteínas únicas,

com um grande potencial a nível biotecnológico e em aplicações médicas podendo

funcionar como revestimento de superfícies em instrumentos cirúrgicos, implantes

médicos e em catéteres promovendo a biocompatibilidade, uma vez que reduzem a

ligação não específica de proteínas (Erjavec, Kos et al. 2012).

As proteases são uma classe de enzimas que funcionam nos principais processos

fisiológicos, como a degradação de biomoléculas, modificação enzimática, regulação da

expressão gênica, morte celular e nutrição entre outros. Estes processos são essenciais e

ubíquos em todos os organismos desde procariotas a eucariotas e estão estritamente

regulados para assegurar que apenas sejam activados na célula no momento em que isso

seja necessária (Wang, Liu et al. 2012). Muitas proteases são únicas dos basidiomicetes,

desta forma estes cogumelos são uma fonte de proteases inexploradas e também de

inibidores. Já são conhecidas muitas proteases dos cogumelos, no entanto pouco se fez

para além da purificação parcial destas e uma caracterização sem vista a uma potencial

aplicação (Tabela 6). Para além das proteases, é importante a investigação da presença

de inibidores nos extratos, como por exemplo, os inibidores de peptidases (Dunaevsky,

Popova et al. 2014). Já foram caracterizados inibidores de proteases cisteínicas e

serínicas diferentes das presentes em animais e plantas. Ainda não foram identificados

até a data inibidores de proteases asparticas e metaloproteases. Neste sentido, trabalhos

devem ser feitos uma vez que a ini

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DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA VIDA · 2020. 5. 25. · Purificação parcial e Caracterização Agradecimentos Ana Cardoso 2015 iii ... 1 1.1. Fungi ... DTT – Dithiothreitol E-64