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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
DESCOLORAÇÃO DE CORANTES TÊXTEIS REATIVOS POR FUNGOS
LIGNINOLÍTICOS E POR LACASE
DAIANE CRISTINA LENHARD
Engenheiro Químico, UNIOESTE, 2004
Orientadoras: Profa Dra Célia R. G. Tavares
Profa Dra Sandra Mª G. da Costa
Profa Dra Alessandra Z. dos Santos
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Estadual de Maringá, como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química, área Desenvolvimento de Processos.
Maringá - PR - Brasil
Fevereiro de 2006
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
Esta é versão final da dissertação de Mestrado apresentada por DAIANE
CRISTINA LENHARD perante a Comissão Julgadora do Curso de Mestrado em
Engenharia Química em 10 de fevereiro de 2006.
Comissão Julgadora
Profa Dra Célia Regina Granhen Tavares Profa Dra Sandra Maria Gomes da Costa
Orientadora Co-orientadora
Profª Drª Alessandra Zacarias dos Santos
Co-orientadora
Profª Drª Rosane Peralta Profa Dra Eneida Sala Cossich
Membro Membro
iii
LENHARD, DAIANE CRISTINA
Descoloração de Corantes Têxteis
Reativos por Fungos Ligninolíticos e por
Lacase [Paraná] 2006.
XV, 68p., 29,7 cm (PEQ/UEM,
M.Sc., Engenharia Química, 2006).
Dissertação – Universidade Estadual
de Maringá – PEQ.
1. Corantes têxteis. 2. Fungos
ligninolíticos. 3. Lacase.
I. PEQ/UEM II. Título (série)
iv
Dedico esta Dissertação
à minha família.
v
O propósito do aprendizado é crescer,
e nossas mentes, diferentes de nossos corpos,
podem continuar crescendo enquanto continuamos a viver”.
Mortimer Adler
vi
Agradecimentos
Às minhas orientadoras, Célia Regina Granhen Tavares, Alessandra Zacarias
dos Santos e Sandra Maria Gomes da Costa, pela confiança e paciência em
todas as etapas da pesquisa.
Ao meu pai Hélio, à minha mãe Délia, aos meus irmãos Luana e Oziel pelo apoio
e compreensão nos momentos mais complicados. Amo vocês.
Ao meu namorado, Raul, por estar sempre comigo, com seu carinho e paciência,
nos momentos mais confusos.
Às minhas grandes amigas, Araceli, Roselene e Camila por estarem sempre por
perto nos momentos difíceis e por tornarem minha vida mais alegre e
divertida. Adoro vocês.
À Thais, Cristiane, Gisele e Érica pela amizade e carinho.
À Raquel, Fábio, Vandré, Edmilson, Luciana, Marta, Eliane e Juliana pela
amizade e por tornarem a convivência no laboratório mais divertida.
Ao Departamento de Engenharia Química e seus funcionários, especialmente à
Elenice, Luiza, Lauro e Luiz pelas ajudas cruciais e pelo apoio técnico e
material.
À CAPES pelo suporte financeiro.
À Deus.
vii
DESCOLORAÇÃO DE CORANTES TÊXTEIS REATIVOS POR FUNGOS
LIGNINOLÍTICOS E POR LACASE
AUTORA: DAIANE CRISTINA LENHARD
ORIENTADORAS: CÉLIA REGINA GRANHEN TAVARES
ALESSANDRA ZACARIAS DOS SANTOS
SANDRA MARIA GOMES DA COSTA
Dissertação de mestrado; Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química;
Universidade Estadual de Maringá; Av. Colombo, 5790, BL E46-09; CEP: 87020-900 –
Maringá – PR, Brasil, defendida em 10 de fevereiro de 2006, 68p.
RESUMO Neste trabalho a descoloração de corantes têxteis foi avaliada utilizando-se fungos
ligninolíticos e a enzima lacase. Inicialmente, foi avaliada a descoloração do corante
reativo Remazol Brilliante Blue R (RBBR) por culturas de isolados de Pleurotus
Pulmonarius, Lentinus edodes e Ganoderma lucidum em diferentes meios. Em seguida, as
descolorações de nove corantes reativos e de um efluente de lavanderia foram avaliadas,
utilizando-se a enzima lacase produzida por P. pulmonarius.
Em um primeiro teste, discos de meio sólido com cada um dos fungos foram
inoculados em tubos contendo meio mínimo com glicose e 0,5 g/L do corante RBBR. Após
15 dias de experimento verificou-se que todos as espécies estudadas degradaram o corante
em alguma proporção. No entanto, apesar do G. lucidum e do P. pulmonarius degradarem
o corante em mais de 90%, a degradação por L. edodes não passou de 20%.
Para os testes em que uma solução do corante RBBR 0,5 g/L foi inoculada com
cultura líquida dos fungos G. lucidum, L. edodes e P. pulmonarius, por 10 dias a 28ºC,
somente o G. lucidum foi capaz de degradar o corante, atingindo uma descoloração de
90%. Um teste sucessional dos fungos, na seqüência G. lucidum - G. lucidum - L. edodes,
foi avaliada nas mesmas condições, sendo que cada isolado permaneceu sete dias em
contato com a solução do corante. Uma degradação final de 78,5% foi observada no
vigésimo primeiro dia de experimento.
viii
A degradação do corante foi então avaliada em meio mínimo com glicose (1 g/L)
concentrado e diluído 1:10, 1:50 e 1:100, acrescido de 0,5 g/L do corante. As mesmas
espécies fúngicas foram utilizadas sendo que a maior descoloração observada foi de 89%
em meio mínimo com glicose concentrado utilizando-se G. lucidum.
Devido às baixas descolorações obtidas pelos isolados de P. pulmonarius e L.
edodes nos meios utilizados anteriormente, foi avaliada a adição de outros nutrientes
(extrato de malte e peptona, além da glicose) ao meio mínimo.
Os melhores resultados para P. pulmonarius e L. edodes foram observados
utilizando-se meio mínimo acrescido de 1g/L de glicose, 1g/L de extrato de malte e 0,1g/L
de peptona e 0,5 g/L de RBBR, e meio mínimo acrescido de 1g/L de extrato de malte e 0,5
g/L de RBBR. Para ambos os fungos a descoloração foi em torno de 90% utilizando-se
estes meios. Em todos os meios testados, G. lucidum descoloriu em mais de 85% o corante.
Os melhores resultados para este fungo, em torno de 96%, foram obtidos utilizando-se
meio mínimo acrescido de 0,1g/L de glicose e 0,5 g/L de RBBR, e meio mínimo acrescido
de 1g/L de extrato de malte e 0,5 g/L de RBBR.
Com base nestes resultados, um novo teste sucessional foi realizado. A mistura
reacional consistiu de meio mínimo acrescido de 1g/L de glicose, 1g/L de extrato de malte,
0,1g/L de peptona e 0,5 g/L do corante RBBR. A primeira espécie inoculada à mistura foi
P. pulmonarius, permanecendo sete dias. Em seguida, após filtração e autoclavagem do
meio, este foi inoculado com L. edodes que permaneceu por mais sete dias e em seguida,
repetiu-se o procedimento inoculando-se G. lucidum. Ao final do experimento foi
verificada uma descoloração de 69%.
Os experimentos de descoloração fúngica mostraram que os isolados de P.
pulmonarius e L. edodes necessitam de outras fontes de nutrientes além da glicose,
enquanto G. lucidum mostrou-se capaz de descolorir o corante mesmo em meio acrescido
somente de pequena quantidade de glicose.
Em uma segunda etapa do trabalho utilizou-se a enzima lacase bruta de P.
pulmonarius para descoloração dos corantes reativos: RRBB, Azul BF-R, Azul turquesa,
Azul marinho-BLE, Amarelo-3R, Amarelo-GLE, Vermelho-4B, Vermelho escarlate,
Preto, Cinza, além do efluente de uma lavanderia local. Verificou-se que todos os corantes
foram descoloridos em alguma extensão pela lacase, no entanto, os resultados de
descoloração para os corantes vermelho escarlate, vermelho 4b, amarelo 3r e cinza (em
480 nm) foram inferiores a 20%. O efluente foi descolorido em 40% pela lacase purificada.
ix
DECOLORIZATION OF REACTIVE TEXTILE DYES BY USING THE
LIGNOLITIC FUNGI AND LACASE
AUTORA: DAIANE CRISTINA LENHARD
ORIENTADORAS: CÉLIA REGINA GRANHEN TAVARES
ALESSANDRA ZACARIAS DOS SANTOS
SANDRA MARIA GOMES DA COSTA
Master Thesis; Chemical Engineering Graduate Program; State University of Maringá;
Av. Colombo, 5790, BL E46-09; CEP: 87020-900 – Maringá – PR, Brasil, presented on
10th February 2006, 68p.
ABSTRACT
In this work, textile dyes decolorization was evaluated using ligninolitic fungi and
the lacase enzyme. Firstly, the reactive dye Remazol Brilliant Blue R (RBBR)
decolorization by Pleurotus pulmonarius, Lentinus edodes and Ganoderma lucidum
cultures was evaluated using different media. Next, the decolorization of nine reactive dyes
and a laundry effluent was evaluated using the lacase enzyme produced by Pleurotus
pulmonarius.
In a first test, solid media disks of each species were inoculated in test tubes
containing minimum media and glucose, added by RBBR 0.5 g/L. After fifteen days of
experiment it was verified that all of the species degraded the dye in some extension.
Although G. lucidum and P. pulmonarius degraded the dye more than 90 %, the dye
degradation by L. edodes was about 20 %.
For the tests in which a 0.5 g/L RBBR solution was inoculated with liquid culture
of the fungi, G. lucidum, L. edodes and P. pulmonarius, for 10 days at 28ºC, only G.
lucidum was able to degrade the dye, reaching a decolorization of 90 %. A succession of
the fungi G. lucidum – G. lucidum – L. edodes was evaluated at the same conditions. Each
fungus stayed in contact with the dye solution during seven days. The final degradation
observed was 78,5 % at the twenty-first day.
Then, the dye degradation was evaluated in concentrated and diluted 1:10, 1:50 and
1:100 minimum medium and glucose (1g/L), added by RBBR 0.5 g/L. The same species of
x
fungi were used again. The best decolorization observed was 89 % using concentrated
minimum medium and glucose and the fungus G. lucidum.
Due to the low decolorization obtained using the isolate of P. pulmonarius and L.
edodes in the media previously used, the addition of other nutrients (malt extract and
peptone, besides glucose) to the media was evaluated.
The best results for P. pulmonarius and L. edodes were observed using minimum
medium added by glucose 1 g/L, malt extract 1 g/L and peptone 0.1 g/L and RBBR 0.5
g/L, and minimum medium added by malt extract 1 g/L and RBBR 0.5 g/L. For both
species the decolorization was about 90 % using these media. For all evaluated media the
dye decolorization by G. lucidum was over than 85 %. The best results, about 96 %, were
obtained using minimum media added by glucose 0.1 g/L and RBBR 0.5 g/L, and
minimum media added by malt extract 1 g/L and RBBR 0.5 g/L.
Based on these results, a new succession of the fungi was carried out. The
reactional solution consisted of minimum medium added by glucose 1g/L, malt extract1g/L
and peptone 0.1g/L and RBBR 0.5 g/L. The first fungus inoculated into the solution was P.
pulmonarius, wich remained in this medium for seven days. Next, after filtering and
autoclaving the medium, this was inoculated with L. edodes which remained in the
medium for more seven days. Then, the procedure was repeated inoculating G. lucidum. In
the end of the experiment, a decolorization of 69 % was verified.
The experiments of fungal decolorization showed that the isolate P. pulmonarius and
L. edodes needed other sources of nutrients besides glucose, while the fungal G. lucidum
was be able to decolorize the dye even in medium added by a little quantity of glucose.
In a second stage of this work, crude lacase enzyme from P. pulmonarius was used to
decolorize the reactive dyes: RBBR, Blue-BF-R, Turquoise blue, Navy blue-BLE, Yellow-
3R, Yellow-GLE, Red-4B, Scarlet red, Black, Grey, besides the effluent of a local laundry.
It was verified that all the dyes were decolorized in some extension by the crude lacase.
However, the results of Scarlet red, Red-4B, Yellow-3R and Grey (380nm) decolorization
were under 20%. The laundry effluent was decolorized in 40 % by the crude lacase.
xi
ÍNDICE
Capítulo 1 - Introdução e Objetivos .................................................................................. 1
Capítulo 2 - Revisão Bibliográfica ..................................................................................... 3
2.1 A indústria têxtil e o seu efluente ................................................................................... 3
2.2 Corantes têxteis ............................................................................................................... 6
2.3 Processos de remoção de cor de efluentes têxteis ......................................................... 10
2.4 Os fungos ....................................................................................................................... 13
2.5 Degradação de corantes e efluentes têxteis por fungos ................................................. 15
2.6 Degradação de corantes e efluentes têxteis por enzimas de fungos .............................. 25
Capítulo 3 - Materiais e Métodos .................................................................................... 31
3.1 Descoloração do corante reativo Remazol Brilliant Blue R (RBBR) por fungos
ligninolíticos ....................................................................................................................... 31
3.1.1 Corante ............................................................................................................ 31
3.1.2 Fungos ligninolíticos ........................................................................................ 31
3.1.3 Meios de cultura e preparo de inóculo .............................................................. 32
3.1.4 Ensaios de descoloração fúngica ....................................................................... 33
3.2 Degradação de corantes reativos pela lacase do fungo P. pulmonarius ........................ 35
3.2.1 Enzima .............................................................................................................. 35
3.2.2 Corantes reativos e efluente têxtil ..................................................................... 35
3.2.3 Ensaios de descoloração enzimática ................................................................. 36
3.3. Metodologia das análises realizadas ............................................................................. 36
Capítulo 4 - Resultados e Discussão................................................................................. 38
4.1 Descoloração do corante reativo Remazol Brilliant Blue R (RBBR) por fungos
ligninolíticos ........................................................................................................................ 38
4.2 Degradação de corantes reativos pela lacase do fungo P. pulmonarius ....................... 52
Capítulo 5 – Conclusões .................................................................................................... 56
xii
Capítulo 6 - Perspectivas para trabalhos futuros ........................................................... 58
Capítulo 7 - Referências bibliográficas ............................................................................ 59
Anexos ................................................................................................................................. 65
Anexo I - Determinação de Demanda Química de Oxigênio por micro método ................ 65
Anexo II - Determinação de atividade enzimática .............................................................. 67
xiii
ÌNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1– Fluxo tradicional do processo têxtil (ABRAHÃO & SILVA, 2002,
citado por OMORI, 2004).................................................................................. 5
Figura 4.1 – Resultados de redução de glicose (¦ ), redução de DQO (¦ ),
descoloração em 590nm (- ) e aumento de cor em 455nm (¦ ) para os
isolados P. pulmonarius, L. edodes e G. lucidum............................................ 38
Figura 4.2 – Descoloração de uma solução 0,5g/ de RBBR pelos isolados P.
pulmonarius (?), L. edodes (¦ ) e G. lucidum (? ). ....................................... 40
Figura 4.3 – Redução de DQO nos meios inoculados com os isolados fúngicos............... 40
Figura 4.4 – Porcentagem de descoloração do corante RBBR pela sucessão dos
fungos G.lucidum - G.lucidum - L. edodes. .................................................. 41
Figura 4.5 – Concentração de (¦ ) DQO (mg/l) e (?) glicose (mg/l)durante o
experimento de sucessão dos fungos G.lucidum - G.lucidum - L.
edodes. ........................................................................................................... 42
Figura 4.6 – Atividades enzimáticas de MnP (?), LiP (? ) e lacase (¦ ) durante os
experiemtno de sucessão dos fungos G.lucidum - G.lucidum - L.
edodes. ........................................................................................................... 43
Figura 4.7 – Descoloração do corante RBBR pelos Isolados (a) G. lucidum, (b) P.
pulmonarius e (c) L. edodes, em diferentes diluições de meio mínimo
+ glicose: (?) sem diluição; (¦ ) diluído 1:10; (? ) diluído 1:50 e
(x) diluído 1:100. ......................................................................................... 44
Figura 4.8 – Resultados de descoloração e aumento de cor do corante RBBR pelo
fungo P. pulmonarius em meio mínimo acrescido dos nutrientes: (?)
glicose 0,1g/l; (¦ ) glicose 1g/l; (? ) extrato de malte 0,1g/l; (x) extrato
de malte 1g/l; (?) peptona 0,01g/l; (?) peptona 0,1g/l; (+)glicose
0,1g/l, extrato de malte 0,1g/l e peptona 0,01g/l; (-)glicose 1g/l, extrato
de malte 1g/l e peptona 0,1g/l. ....................................................................... 46
Figura 4.9 – Resultados de descoloração e aumento de cor do corante RBBR pelo
fungo L. edodes em meio mínimo acrescido dos nutrientes: (?) glicose
0,1g/l; (¦ ) glicose 1g/l; (? ) extrato de malte 0,1g/l; (x) extrato de
malte 1g/l; (?) peptona 0,01g/l; (?) peptona 0,1g/l; (+)glicose 0,1g/l,
extrato de malte 0,1g/l e peptona 0,01g/l; (-)glicose 1g/l, extrato de
malte 1g/l e peptona 0,1g/l. ............................................................................ 46
xiv
Figura 4.10 – Resultados de descoloração e aumento de cor do corante RBBR pelo
fungo G. lucidum em meio mínimo acrescido dos nutrientes: (?)
glicose 0,1g/l; (¦ ) glicose 1g/l; (? ) extrato de malte 0,1g/l; (x)
extrato de malte 1g/l; (?) peptona 0,01g/l; (?) peptona 0,1g/l;
(+)glicose 0,1g/l, extrato de malte 0,1g/l e peptona 0,01g/l; (-)glicose
1g/l, extrato de malte 1g/l e peptona 0,1g/l. ................................................ 47
Figura 4.11 – Porcentagem de descoloração em 590nm (x) e de aumento de cor em
455nm (? ) durante o experimento de adição sucessiva dos fungos P.
pulmonarius, L. edodes e G. lucidum. ......................................................... 49
Figura 4.12 – Concentração de (? ) DQO (mg/L)e (?) glicose (mg/L) durante o
experimento de adição sucessiva dos fungos P. pulmonarius - L.
edodes - G. lucidum. .................................................................................... 50
Figura 4.13 – Atividades enzimáticas de MnP (?), LiP (x) e lacase (? ) durante o
experimento de adição sucessiva dos fungos P. pulmonarius - L.
edodes - G. lucidum. ................................................................................... 51
Figura 4.14 – Descoloração enzimática dos corantes reativos: (?) cinza (596nm), (-)
preto (596nm), (?) Azul BF-R (590nm), (+) RBBR (590nm), (x)
Amarelo GLE (403nm), (?) Azul Marinho (590nm), (¦ ) amarelo 3r
(417nm), (?) vermelho 4B (542nm), (? ) vermelho escartale (495nm)
e (?) cinza (480nm). .................................................................................... 52
Figura 4.15 – Descoloração enzimática de: (?) efluente em 625nm; (¦ ) efluente em
663nm; (?) azul turquesa em 625nm e (?) azul turquesa em 663nm. ......... 55
xv
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 3.1 – Composição do meio mínino com glicose. .................................................... 32
Tabela 3.2 – Composição do meio de extrato de malte. ..................................................... 32
Tabela 3.3 – Nutrientes adicionados ao meio mínimo........................................................ 34
xvi
LISTA DE SÍMBOLOS
DQO Demanda Química de Oxigênio
DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio
LiP Enzima lignina peroxidase
MnP Enzima manganês peroxidase
Lcc Enzima Lacase
RBBR Remazol brilliant blue-R
CCB Coleção de cultura do Instituto Botânico de São Paulo
HRV5 Violeta reativo 5
HRB38 Azul reativo 38
AVO Álcool veratrílico oxidase
ST Sólidos totais
SST Sólidos suspensos totais
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
A implementação de leis ambientais rigorosas com relação ao descarte de efluentes
coloridos, bem como a crescente conscientização sobre o impacto ambiental negativo dos
mesmos, têm sido os principais fatores para o aumento no interesse da indústria têxtil em
desenvolver tecnologias efetivas no tratamento de seus efluentes.
Dentre as águas residuárias industriais, a proveniente de indústrias têxteis e de
materiais corantes é uma das mais difíceis de tratar. Isto porque geralmente os corantes têm
origem sintética e estruturas moleculares aromáticas complexas que fazem deles mais
estáveis e difíceis de serem biodegradados (FU & VIRARAGHAVAN, 2001).
Como estes corantes são relativamente recalcitrantes à biodegradação, a remoção
de cor de efluentes em sistemas de tratamento de águas residuárias é baseado,
principalmente, em processos físicos ou químicos como adsorção, concentração,
transformação química e incineração. Estas formas de tratamento são geralmente caras,
limitando suas aplicações (BOER et al., 2004).
A grande motivação de todos os pesquisadores envolvidos em estudos de
biodegradação se expressa na busca contínua de microrganismos versáteis, capazes de
degradar, de maneira eficiente, grande número de poluentes a um baixo custo operacional
(ESCOBAR & BARNETT, 1993).
A descoloração microbiológica tem sido proposta com uma alternativa menos
dispendiosa e menos agressiva ao ambiente. Muitas bactérias e fungos têm habilidade de
descoloração e uma grande publicação de trabalhos sobre descoloração microbiológica está
disponível (GLENN & GOLD, 1983).
Fungos ligninolíticos têm sido estudados como possíveis agentes de degradação
devido ao seu sistema de biodegradação extracelular ser basicamente não-específico, fato
Introdução e Objetivos ___________________________________________________
2
que permite a degradação de misturas de substâncias recalcitrantes (KIRK & FARREL,
1987).
Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo principal a avaliação da
descoloração de corantes têxteis reativos por fungos ligninolíticos e pela enzima lacase.
Este trabalho teve os seguintes objetivos específicos:
- verificar a descoloração do corante Remazol Brilliant Blue R (RBBR) por
Ganoderma lucidum, Lentinus edodes e Pleurotus pulmonarius, em meios de cultivo com
diferentes concentrações de nutrientes;
- avaliar a sucessão destes fungos ligninolíticos para a descoloração do corante
RBBR;
- avaliar a descoloração do corante reativo RBBR, de nove corantes reativos
comerciais e de um efluente têxtil utilizando a enzima lacase produzida por Pleurotus
pulmonarius.
CAPÍTULO 2
REVISÃO
2.1 A INDÚSTRIA TÊXTIL E O SEU EFLUENTE
Os processos industriais e os despejos gerados pela indústria têxtil variam à medida
que a pesquisa e o desenvolvimento produzem novos reagentes, novos processos e novas
técnicas, e também de acordo com a demanda do consumo por outros tipos de tecidos e
cores. Numerosas operações são necessárias a fim de dar ao tecido o máximo de
propriedades, gerando assim, em cada etapa, diferentes despejos (HASSEMER & SENS,
2002).
A indústria têxtil compreende grupos diversos e fragmentos de estabelecimentos,
que produzem e/ou processam artigos relativos à produção têxtil (fibras, fios, tecidos) para,
posteriormente, serem transformados em vestuário, artigos domésticos e bens industriais.
As empresas têxteis recebem e preparam fibras; transformam fibras em fios, linhas de
costura; convertem os fios em tecidos, tingem e dão tratamentos especiais a esses materiais
em vários estágios de produção. Nesse sentido a indústria têxtil pode ser dividida em três
etapas de produção: formação de fios, formação de tecidos e processos molhados
(acabamentos) (ABRAHÃO & SILVA, 2002).
No que diz respeito à produção e ao número de trabalhadores que ocupa, a indústria
têxtil é uma das maiores do mundo, e todas se caracterizam por requerer grandes
quantidades de água, corantes e produtos químicos utilizados ao longo de uma complexa
cadeia produtiva (SANIN, 1997).
A indústria têxtil gera efluentes líquidos, gasosos e resíduos sólidos. Os efluentes
originários dos diversos processos têxteis são uma função direta do tipo de substrato têxtil
que está sendo processado, dos corantes utilizados e do tipo de equipamento. Portanto,
Revisão ______________________________________________________________
4
pode-se observar uma gama enorme de variações das características quantitativas e
qualitativas dos efluentes, principalmente dos efluentes líquidos (CPRH, 2001).
Geralmente, os despejos de várias etapas do processamento têxtil apresentam
compostos orgânicos como amido, dextrinas, gomas, graxas, pectinas, álcoois, ácido
acético, corantes, sabões e detergentes; e, compostos inorgânicos como hidróxido de sódio,
carbonato, sulfato e cloreto. O pH varia entre 8 e 11 e a cor depende do corante utilizado.
Os sólidos totais (ST) e em suspensão (SSP) variam entre 1000 e 1600 mg/L e de 30 a 50
mg/L, respectivamente. O volume de água utilizado por metro de tecido processado varia
entre 120 e 380 litros (BRAILE & CAVALCANTI, 1993).
Um estudo com as águas residuárias de 60 indústrias têxteis de Santa Catarina,
realizado por LONGO em 1987 (citado por BALAN, 1998), apresentou valores de
demanda bioquímica de oxigênio (DBO) entre 130 e 1200 mg O2/L e demanda química de
oxigênio (DQO) entre 540 e 5400 mg O2/L. Também foi observada a presença de corante e
pigmentos diversos de difícil remoção e de detergentes não biodegradáve is; fibras
removíveis por processos mecânicos, além de pequena concentração de material orgânico
biodegradável, poucos sólidos sedimentáveis e grande variação num ciclo de 24 horas.
De acordo com vários estudos apresentados por VALDEVIVERE (1998) os
efluentes têxteis são tóxicos à vida aquática. CONSTAN et al. (2003, citado por
VALDEVIVERE, 1998) classificou o efluente têxtil em segundo lugar em termos de
toxicidade, dentre oito setores industriais, utilizando uma série de bioensaios verificando a
toxicidade aguda, subletal e crônica, em vários níveis tróficos.
Sem dúvida o maior problema no tratamento de efluentes têxteis deve-se à presença
de corantes oriundos, principalmente, da etapa de tingimento, durante os chamados
beneficiamentos secundários do processamento têxtil (Fig. 2.1). Estes corantes
normalmente são recalcitrantes (compostos que permanecem num determinado ambiente
de forma inalterada, podendo ser naturais ou xenobióticos) ou apresentam uma cinética de
degradação muito lenta para processos biológicos convencionais, e geram efluentes finais
(após o tratamento) com coloração ainda muito intensa (KUNZ,1999).
A princípio o volume de corante lançado no ambiente pode parecer pouco
significativo quando comparado com o parque de máquinas instalado, no entanto devemos
atentar para o alto potencial colorante destes compostos. O olho humano pode detectar
concentrações de corantes reativos na ordem de 5 ? g/L em águas claras de rios,
particularmente nas regiões do espectro entre o vermelho e o púrpuro (KUNZ,1999).
Revisão ______________________________________________________________
5
FILAMENTOS SINTÉTICOS
TEXTURIZAÇÃO
PREPARAÇÃO À FIAÇÃO
FIBRAS NATURAIS FIBRAS QUÍMICAS
URDIMENTO
ENGOMAGEM
TECELAGEM
PREPARAÇÃO AO TINGIMENTO
FIAÇÃO
TINGIMENTO e ESTAMPARIA
ACABAMENTO
CONFECÇÃO
Operações com geração de efluentes líquidos Figura 2.1 – Fluxo tradicional do processo têxtil (ABRAHÃO & SILVA, 2002, citado por
OMORI, 2004).
A poluição dos corpos d’água com estes compostos provoca, além da poluição visual,
alterações em ciclos biológicos afetando principalmente mecanismos de fotossíntese.
Algumas classes de corantes e seus subprodutos, especialmente azocorantes, podem ser
carcinogênicos e/ou mutagênicos (KUNZ, 1999).
A abundância de normas e regulamentações desenvolvidas ao longo dos anos para
controle de rejeitos coloridos tem criado um grande impacto na indústria de corantes e seus
correlatos, além de ter criado grande confusão aos consumidores. Relativamente, encontra-
se na literatura muito pouca informação sobre o impacto desses rejeitos na qualidade da
água e em ecossistemas aquáticos. Alguns autores têm até defendido a tese de que devido à
alta diluição, poucos corantes solúveis poderiam causar efeitos ecológicos agudos em
concentrações em que não sejam visíveis a olho nu. No entanto, dependendo do tipo de
corante e do modo de aplicação requerido, a etapa final da tintura pode contribuir
significativamente no lançamento de rejeitos de diversas substâncias químicas com
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6
composição variável (corante, umectante, antiespumante, eletrólitos, dispersantes, etc.)
utilizadas nas etapas de montagem e fixação (GUARATINI & ZANONI, 2000).
2.2 CORANTES TÊXTEIS
Corantes têxteis são substâncias coloridas usadas para garantir uma cor permanente
em outras substâncias. Seu uso mais importante é na coloração de fibras em fábricas têxteis
(GUARATINI & ZANONI, 2000).
Os corantes são moléculas orgânicas altamente estruturadas e de difícil degradação
biológica. Grandes quantidades de corantes estruturalmente diversos são utilizadas na
tintura de tecidos, assim como em outras aplicações industriais (ZOLLINGER, 1991,
citado por HEINFLING et al.,1997).
Muitos corantes sintéticos têm sido cada vez mais usados em indústrias têxteis, de
papel, de cosméticos, farmacêuticas e de comida devido a sua facilidade de uso, eficácia de
custos nas sínteses, estabilidade e variedade de cor, comparada com corantes naturais
(CHAGAS & DURRANT, 2001). Aproximadamente 10000 corantes e pigmentos
diferentes são produzidos anualmente em todo mundo e usados nas indústrias de
tingimento e estamparia, e mais de 7.105 toneladas desses corantes são anualmente
produzidas em todo o mundo (ZOLLINGER, 1987, citado por SELVAM et al., 2003).
Muitos destes corantes são estáveis à luz, temperatura e ataques microbiológicos, fazendo
deles compostos recalcitrantes, além de muitos deles serem também tóxicos (GREGORY,
1993, citado por LEVIN et al., 2004).
A molécula de corante utilizada para tingimento de fibra têxtil pode ser dividida em
duas partes principais, o grupo cromóforo e a estrutura responsável pela fixação à fibra.
Baseados na estrutura química do grupo cromóforo, os corantes são classificados como azo
corantes, antraquinones, trietilmetino, phtalocianino, etc. (ZOLLINGER, 1991, citado por
HEINFLING et al.,1997). Aproximadamente metade de todos os corantes conhecidos são
azo corantes, fazendo deles o maior grupo de corantes sintéticos (ZOLLINGER, 1987,
citado por SELVAM et al., 2003).
Os corantes também podem ser classificados de acordo com a forma pela qual ele é
fixado à fibra têxtil. De acordo com GUARATINI & ZANONI (2000), os principais
grupos de corantes classificados pelo modo de fixação são:
Corantes Reativos - são corantes contendo um grupo eletrofílico (reativo) capaz de
formar ligação covalente com grupos hidroxila das fibras celulósicas, com grupos amino,
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hidroxila e tióis das fibras protéicas e também com grupos amino das poliamidas. Existem
numerosos tipos de corantes reativos, porém os principais contêm a função azo e
antraquinona como grupos cromóforos e os grupos clorotriazinila e sulfatoetilsulfonila
como grupos reativos. Neste tipo de corante, a reação química se processa diretamente
através da substituição do grupo nucleofílico pelo grupo hidroxila da celulose.
Corantes Diretos - este grupo de corantes caracteriza-se como compostos solúveis
em água capazes de tingir fibras de celulose (algodão, viscose, etc.) através de interações
de Van der Waals. A afinidade do corante é aumentada pelo uso de eletrólitos, pela
planaridade na configuração da molécula do corante ou a duplaligação conjugada que
aumenta a adsorção do corante sobre a fibra. Esta classe de corantes é constituída
principalmente por corantes contendo mais de um grupo azo (diazo, triazo e etc.) ou pré-
transformados em complexos metálicos.
Corantes Azóicos - são compostos coloridos, insolúveis em água, que são realmente
sintetizados sobre a fibra durante o processo de tingimento. Nesse processo a fibra é
impregnada com um composto solúvel em água, conhecido como agente de acoplamento
(e.g. naftol) que apresenta alta afinidade por celulose. A adição de um sal de diazônio
(RN2 +) provoca uma reação com o agente de acoplamento já fixado na fibra e produz um
corante insolúvel em água.
Corantes Ácidos - o termo corante ácido corresponde a um grande grupo de
corantes aniônicos portadores de um a três grupos sulfônicos. Estes grupos substituintes
ionizáveis tornam o corante solúvel em água, e têm vital importância no método de
aplicação do corante em fibras protéicas (lã, seda) e em fibras de poliamida sintética. No
processo de tintura, o corante previamente neutralizado (solução contendo cloreto, acetato,
hidrogenossulfato, etc.) se liga à fibra através de uma troca iônica envolvendo o par de
elétrons livres dos grupos amino e carboxilato das fibras protéicas, na forma não-
protonada. Estes corantes caracterizam-se por substâncias com estrutura química baseada
em compostos azo, antraquinona, triarilmetano, azina, xanteno, ketonimina, nitro e nitroso,
que fornecem uma ampla faixa de coloração e grau de fixação.
Corantes à Cuba - é uma grande e importante classe de corantes baseada nos
índigos, tioindigóides e antraquinóides. Eles são aplicados praticamente insolúveis em
água, porém durante o processo de tintura eles são reduzidos com ditionito, em solução
alcalina, transformando-se em um composto solúvel (forma leuco). Posteriormente, a
subsequente oxidação pelo ar, peróxido de hidrogênio, etc., regenera a forma original do
corante sobre a fibra.
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Corantes de Enxofre - é uma classe de corantes que após a aplicação se
caracterizam por compostos macromoleculares com pontes de polissulfetos (- Sn -), os
quais são altamente insolúveis em água. Em princípio são aplicados após pré-redução em
banho de ditionito de sódio que lhes confere a forma solúvel, são reoxidados
subsequentemente sobre a fibra pelo contato com ar. Estes compostos têm sido utilizados
principalmente na tintura de fibras celulósicas, conferindo cores preto, verde oliva, azul
marinho, marrom, apresentando boa fixação. Entretanto, estes corantes usualmente
apresentam resíduos altamente tóxicos.
Corantes Dispersivos - constituem uma classe de corantes insolúveis em água
aplicados em fibras de celulose e outras fibras hidrofóbicas através de suspensão
(partículas entre 1 a 4 micra). Durante o processo de tintura, o corante sofre hidrólise e a
forma originalmente insolúvel é lentamente precipitada na forma dispersa (finalmente
dividido) sobre o acetato de celulose. O grau de solubilidade do corante deve ser pequeno,
mas definido, e influencia diretamente o processo e a qualidade da tintura. Usualmente o
processo de tintura ocorre na presença de agentes dispersantes com longas cadeias que
normalmente estabilizam a suspensão do corante facilitando o contato entre o corante e a
fibra hidrofóbica. Esta classe de corantes tem sido utilizada principalmente para tinturas de
fibras sintéticas, tais como, acetato celulose, nylon, poliéster e poliacrilonitrila.
Corantes Pré-Metalizados - são úteis principalmente para tintura de fibras protéicas
e poliamida. Os corantes são caracterizados pela presença de um grupo hidroxila ou
carboxila na posição ortho em relação ao cromóforo azo, permitindo a formação de
complexos com íons metálicos. Neste tipo de tintura explora-se a capacidade de interação
entre o metal e os agrupamentos funcionais portadores de pares de elétrons livres, como
aqueles presentes nas fibras proteicas. Exemplos mais comuns deste grupo são os
complexos estáveis de cromo: corante (1:1) ou (1:2). A desvantagem ecológica deste tipo
de corante está associada ao alto conteúdo de metal (cromo) nas águas de rejeito.
Corantes Branqueadores - as fibras têxteis no estado bruto por serem compostas
primariamente de materiais orgânicos, apresentam como característica uma aparência
amarelada por absorver luz particularmente na faixa de baixo comprimento de onda. A
diminuição dessa tonalidade tem sido efetuada na indústria ou na lavanderia pela oxidação
da fibra com alvejantes químicos ou utilizando os corantes brancos também denominados
de branqueadores ópticos ou mesmo branqueadores fluorescentes. Estes corantes
apresentam grupos carboxílicos, azometino (-N=CH-) ou etilênicos (-CH=CH-) aliados a
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sistemas benzênicos, naftalênicos, pirênicos e anéis aromáticos que proporcionam reflexão
por fluorescência na região de 430 a 440 nm quando excitados por luz ultravioleta.
Com relação aos corantes, é importante salientar que muitos contêm metais pesados
em sua composição, como por exemplo, alguns corantes de enxofre que possuem
dicromato de potássio como oxidante, gerando, no despejo, cromo hexavalente solúve l em
água. Outros corantes de cromo também liberam cromo hexavalente no efluente. Alguns
corantes diretos também possuem metais (CETESB, 1993).
Os corantes reativos são extensivamente utilizados na indústria têxtil,
principalmente em função de características como: facilidade de produção, baixo custo,
constância de estrutura e grande variedade de cores. Esse conjunto de adequadas
características, aliado à sua capacidade de fixar-se nas fibras via ligações covalentes, faz
com que a produção e utilização de corantes reativos sejam cada vez mais difundidas
(ZAMORA et al., 2002).
Estima-se que pelo menos 20% dos corantes têxteis sejam descartados em
efluentes, devido às perdas ocorridas durante o processo de fixação da tintura às fibras. A
remoção desses compostos dos rejeitos industriais é um dos grandes problemas ambientais
enfrentados pelo setor têxtil (ZANONI & CARNEIRO, 2001).
No caso de corantes reativos, mais de 50% do corante é perdido a partir da hidrólise
durante o processo de tingimento e por isso estão presentes no efluente (PAGGA E
BROWN, 1986; SHAUL et al, 1991, citados por HEINFLING et al., 1997)
Os corantes empregados na indústria têxtil estão continuamente sendo melhorados e
substituídos por compostos superiores. Os fabricantes vêm sofrendo uma pressão constante
para o desenvolvimento de corantes que possam ser aplicados com sucesso de forma a
empregar menores quantidades de reagentes auxiliares, especialmente sais, e assim reduzir
problemas ambientais associados aos efluentes texteis (O’NEILL et al., 1999).
Por outro lado, os corantes mais modernos são desenvolvidos para resistirem à ação
do tempo, à exposição da luz solar, à água, ao sabão, aos alvejantes e à transpiração. A
durabilidade da cor, a estabilidade e a resistência à degradação, têm dificultado a remoção
de cor dos efluentes têxteis (CAMMAROTA & COELHO, 2001). Desta forma, verifica-se
a necessidade do estudo de novas formas de degradação destes corantes que sejam
realmente efetivas e satisfatórias.
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2.3 PROCESSOS DE REMOÇÃO DE COR DE EFLUENTES TÊXTEIS
A indústria têxtil contribui significativamente para a poluição dos rios em algumas
regiões do Brasil, ao transformar fibras naturais e sintéticas em tecidos e outros produtos.
Em algum ponto do processo de fabricação de tecidos, operações de processamento
químico úmido são necessárias para preparar, purificar, colorir ou acabar adequadamente o
produto. Isso resulta na geração de efluentes, cuja carga de poluentes provém não somente
da remoção de impurezas das próprias matérias-primas, como também dos reagentes
químicos residuais usados no processamento (CAMMAROTA & COELHO, 2001).
Enquanto compostos orgânicos colorantes geralmente conferem apenas uma fração
minoritária da carga orgânica residuária, sua coloração presta- lhe um aspecto inaceitável.
A descarga de efluente da indústria têxtil e de materiais corantes nas vizinhanças de corpos
receptores hídricos, assim como os atuais sistemas de tratamento das águas residuárias, têm
causado, atualmente, significantes preocupações para as agência s regulatórias do meio
ambiente (BANAT et al., 1996).
Águas residuárias de indústrias têxteis, de papel e de estamparia, e de tinturarias
são caracterizadas por altas demandas químicas e bioquímicas de oxigênio (DQO e DBO),
sólidos suspensos e cor intensa devido ao uso intensivo de corantes sintéticos. O descarte
direto destes efluentes no esgoto municipal e/ou no ambiente pode causar a formação de
produtos tóxicos cancerígenos. Como corantes de estrutura molecular complexa são
resistentes à remoção por populações microbiológicas típicas e podem ser tóxicos para os
microrganismos presentes no tratamento de esgoto, o descarte destes no sistema de
tratamento de esgotos pode levar ao seu fracasso (NYANHONGO et al., 2002).
Deste modo, métodos para remoção da cor das águas de rejeito têm recebido
enorme atenção nos últimos anos. De um modo geral, a efetividade da remoção da cor
pode ser avaliada por um padrão espectrofotométricamente permitido, o qual pode ser
usado para controlar a diluição do corante nas águas dos rios. Assim, através da
comparação direta entre absorbância da amostra de um efluente e o padrão de qualidade
requerido para coloração em rios, é possível avaliar o grau de contaminação previsto.
Entretanto, a níveis não detectáveis em escala espectrofotométrica, o problema é mais sério
e envolve acumulação, bio-disponibilidade, etc (GUARATINI & ZANONI, 2000).
As discussões em torno da eficiência, viabilidade e custos dos métodos de
tratamento empregados, estão bastante presentes nas investigações sobre efluentes têxteis.
Comumente, são determinadas as propriedades físicas, como temperatura, turbidez, teor de
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sólidos, odor, cor, vazão, material retido, removido ou produzido; químicas: DBO, DQO,
formas de nitrogênio (orgânico, amoniacal, nitritos e nitratos), fósforo, óleos e graxas, sais,
metais, pH, alcalinidade e propriedades biológicas: número e tipos de microrganismos
(BALAN, 1999).
Têm-se utilizado vários métodos de remoção de corantes e de outros compostos
químicos existentes no efluente. Normalmente utilizam-se processos físico-químicos como
oxidação química (empregando como agentes oxidantes cloro, H2O2 ou ozônio),
coagulação/floculação, precipitação, troca iônica, adsorção (em carvão ativado e bio-
adsorventes), tecnologias com membranas (ultrafiltração, microfiltração e nanofiltração) e
processos biológicos convencionais, em que o processo de lodo ativado é
reconhecidamente o mais representativo, dentre os mais utilizados na indústria têxtil
(BRÁS et al., 2002).
Processos físico-químicos e biológicos convencionais, como coagulação química e
lodo ativado, apresentam bons resultados na redução carbonácea, no entanto têm como
inconveniente a alta produção de lodo e a necessidade de disponibilidade de grandes áreas
para a implantação do processo de tratamento e de aterros sanitários industriais para a
disposição deste lodo (HASSEMER & SENS, 2002).
A adsorção parece ser o método de remoção de cor mais eficiente dentre os
testados. O adsorvente mais comumente usado é carvão ativado em pó, que é caro.
Recentes relatórios indicaram a possibilidade de uso de outros adsorventes como zeólitas,
bentonitas, banosintéticos, lava, etc. no lugar do carvão ativado em pó, para a remoção de
cor do efluente. No entanto, os corantes não podem ser convertidos em CO2 a partir da
adsorção, eles são transferidos da fase líquida para a sólida (KAPDAN et al., 2000).
O uso da técnica de coagulação/floculação usando polieletrólitos e/ou floculantes
inorgânicos (sais de ferro e alumínio) apresenta grau variável de sucesso como tratamento
terciário para remoção da cor do efluente têxtil. O método pode efetivamente remover a
coloração de rejeitos tratados logo na fonte de saída, ou seja, antes da descarga nos
reservatórios a níveis de padrão permitidos. O resultado depende do tipo de corante a ser
removido, composição, concentração e fluxo de produção do rejeito. Entretanto, para se
obter uma alta eficiência da técnica normalmente utiliza-se um excesso de polieletrólito
(Al2(SO4)3, amônia, etc.), que por sua vez irá acrescentar um resíduo potencial no efluente
(GUARATINI & ZANONI, 2000).
Processos de separação molecular, fundamentados na utilização de membranas,
podem ser bastante eficientes. Entretanto, a completa remediação deste tipo de efluente
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implica a utilização de processos de ultra ou nanofiltração, economicamente inviáveis para
o tratamento de grandes volumes de efluente (ZAMORA et al., 2002).
É importante verificar que os processos descritos anteriormente como alternativa no
tratamento do efluente gerado pela indústria têxtil, além das desvantagens assinaladas,
correspondem a processos não destrutivos. Desta forma, novos processos envolvendo a
degradação dos compostos presentes no efluente estão sendo desenvolvidos.
Segundo GUARATINI & ZANONI (2000) as técnicas de tratamento utilizando-se
degradação química baseiam-se principalmente na reação oxidativa pelo cloro ou ozônio.
As técnicas de destruição baseadas no uso de ozônio têm se mostrado mais efetivas do que
aquelas com cloro, que são insatisfatórias para alguns tipos de corantes (corantes dispersos
e diretos), além de apresentarem a vantagem adicional de não produzir íons inorgânicos,
como no tratamento com cloro. O método é baseado na remoção da cor do efluente através
da clivagem das moléculas do corante em processo catalítico ou radiação ultravioleta. Tais
técnicas podem ser usadas em grandes volumes de efluente, sendo razoavelmente rápidas,
porém apresentam um alto custo.
De acordo com os autores, processos de eletrólise dos corantes também têm sido
utilizados como medida alternativa. Neste sistema a degradação da molécula é realizada
eletroquimicamente pela aplicação de potencial ou corrente controlada, ou através de
reagentes secundários gerados eletrolíticamente. O alto gasto com a energia usada, além da
produção de reações paralelas, tais como cloro, radicais hidroxila e outras reações
indesejáveis, têm diminuído a potencialidade do método. Entretanto, alguns autores têm
demonstrado que métodos de degradação destes produtos via oxidação química ou
eletroquímica poderiam ser melhor aproveitados com investimento em novos estudos
visando a geração de metabólitos com características menos tóxicas e diminuição no custo.
Como corantes sintéticos são resistentes à degradação biológica, a remoção de cor
por bioprocessos é difícil. A descoloração geralmente ocorre pela adsorção de corantes na
bactéria, mais que pela oxidação em sistemas aeróbicos. Alguns microrganismos
anaeróbicos podem biodegradar corantes por atividade de azoredução. No entanto, o
efluente pode se apresentar tóxico, no fim da biodegradação do corante. Além disso, se
expor os produtos da degradação anaeróbica ao oxigênio, pode ocasionar uma coloração
reversa (KAPDAN et al., 2000). Estes problemas limitam a utilização em larga escala da
descoloração por bactérias.
Novos estudos e pesquisas vêm sendo desenvolvidos de forma a se resolver o
problema do tratamento dos efluentes têxteis e manter o equilíbrio ecológico. Neste
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contexto, a descoloração de resíduos com corantes utilizando fungos ligninolíticos e suas
enzimas têm se tornado uma alternativa promissora para substituir ou complementar os
processos de tratamento convencionais.
2.4 OS FUNGOS
Os fungos, também chamados bolores, mofos ou cogumelos, estão presentes
constantemente em nossas atividades diárias (AZEVEDO, 1997). Durante muito tempo
eles foram considerados como vegetais e, somente em 1969, passaram a ser classificados
em um reino à parte denominado Fungi (TRABULSI & ALTERTHUM, 2004).
Os fungos apresentam um conjunto de características que permitem sua
diferenciação das plantas: não sintetizam clorofila nem qualquer pigmento fotossintético;
não têm celulose na parede celular, e não armazenam amido como substancia de reserva. A
presença de substâncias quitinosas na parede da maior parte das espécies fúngicas e a
capacidade de armazenar glicogênio os assemelham às células animais (TRABULSI &
ALTERTHUM, 2004).
Os fungos são seres vivos eucarióticos e unicelulares, como as leveduras, ou
multicelulares, como os fungos filamentosos ou bolores e os cogumelos (fungos
macroscópicos) (TRABULSI & ALTERTHUM, 2004).
Os fungos, na maioria, são terrestres e aeróbios, e crescem rapidamente. As hifas o
qualquer outra estrutura somática e, portanto não necessariamente as estruturas
reprodutivas, são capazes de regene rar um novo indivíduo. As hifas freqüentemente se
anastomosam, mesmo originadas de micélios ou esporos diferentes, aumentando assim a
superfície e as relações que podem estabelecer com o ambiente (BONONI, 1999).
Os fatores climáticos que mais influenciam no desenvolvimento dos fungos são a
umidade e a temperatura. Para que o esporo germine é preciso uma umidade relativa
ambiental alta para a maioria das espécies. Com relação à temperatura, esta deve se
manter entre os limites suaves de 10 a 25ºC, para a grande maioria dos fungos. No entanto,
existem espécies que se desenvolvem em baixas ou altas temperaturas, em pleno inverno,
ou em pleno verão (CALONGE, 1990).
Com relação ao pH, é conhecido e demonstrado que os fungos suportam pH ácido,
de forma que para a grande maioria dos fungos o pH ótimo oscila entre 4 e 6, o que não
indica que seja uma regra geral, uma vez que na natureza podemos observar espécies
fúngicas adaptadas aos mais diferentes solos (CALONGE, 1990).
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Além destes, existem outros fatores que podem influenciar no crescimento dos
fungos, tais como luz, anidrido carbônico, oxigênio, entre outros. Existem espécies que
para se formarem necessitam de uma determinada intensidade de luz e, ás vezes de um tipo
especial de comprimentos de onda nas radiações recebidas, que atuam como estimulantes.
Outras, no entanto, se desenvolvem em escuridão completa, outras em penumbra e
algumas, ainda, sofrem de fototropismo (CALONGE, 1990).
A parede celular dos fungos é uma estrutura rígida que dá forma à hifa e a protege
das agressões do meio externo. É constituída principalmente de quitina, glucanas,
mananas, proteínas e lipídios, porém a quitina é o constituinte principal pois, é o que
realmente dará o componente estrutural da parede. Além disso, se tem demonstrado que
fatores externos tais como: composição do meio, valores do pH e a temperatura influem
profundamente sobre a composição das paredes (RAVEN et al., 2001).
O Reino Fungi é constituído pelos filos Cytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota
e Basidiomycota. Dentro do filo Basidiomycota, uma das classificações mais aceitas em
nível de Classe é: Classe Basidiomycetes, que inclui todos os fungos com basidiomas
macroscópicos, Classe Teliomycetes, que inclui as ferrugens e Classe Ustomycetes
incluindo os carvões (BONONI, 1999). Fungos pertencentes à Basidiomycetes vem sendo
muito estudados quanto à sua utilização em processos bioctenológicos.
A maioria dos processos biotecnológicos utilizando fungos basiodiomicetos baseia-
se nos seus produtos metabólicos, como enzimas e polissacarídeos. A importância do
aparato enzimático dos basidiomicetos está diretamente relacionada à bioconversão de
resíduos lignocelulósicos, tanto para a produção de alimento quanto para a produção de
polissacarídeos. Além disso, este mesmo aparato enzimático está relacionado com os
processos de biodegradação de compostos xenobióticos, como por exemplo na
biorremediação de solos contaminados e no tratamento de efluentes da indústria papeleira e
têxtil (BONONI, 1999).
A maioria das espécies de basidiomicetos utiliza os componentes da madeira para
seu crescimento. Dentre os degradadores de madeira, pode-se destacar dois grande grupos:
1) fungos causadores da podridão branca e 2) fungos causadores da podridão parda. Os
causadores da podridão branca são providos de sistema enzimático que os tornam capazes
de utilizar fontes complexas de carbono, sendo assim responsáveis pela degradação da
celulose, hemicelulose e lignina, quebrando-a em moléculas menores de CO2 e água. Por
isso, são denominados fungos lignocelulíticos. Esta capacidade está associada, pelo menos
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em parte, ao fato dos fungos secretarem peróxido de nitrogênio e uma família de enzimas
peroxidades (lignina peroxidades-LiP, manganês peroxidase-MnP) (BONONI, 1999).
De modo geral o processo de degradação inicia-se com a liberação das enzimas
extracelulares para o meio externo à hifa do fungo, onde irá ocorrer a degradação das
moléculas complexas do substrato, como lignina, celulose e hemicelulose, quebrando-as
em moléculas menores para então serem absorvidas pelo fungo para sua nutrição
(BONONI, 1999).
Foi a partir do entendimento deste mecanismo básico de degradação da lignina por
fungos de podridão branca que se propôs a utilização destes fungos na degradação de
poluentes ambientais (BONONI, 1999).
Os estudos acerca da utilização de basidiomicetos tanto na biorremediação de
materiais e ambientes contaminados quanto no tratamento de efluentes industriais é
bastante recente no mundo e está começando a despertar interesse no Brasil. Sabendo-se
que a biodiversidade brasileira é uma das fontes de recursos a ser melhor conhecida e
estudada, pode-se afirmar que existe grande potencial de aplicação de espécies de fungos
basidiomicetos a ser pesquisado e adaptado a processos de descontaminação ambiental
(BONONI, 1999).
2.5 DEGRADAÇÃO DE CORANTES E EFLUENTES TÊXTEIS POR FUNGOS
Nos últimos anos, os estudos de degradação de xenobióticos por fungos
basidomicetos, têm-se intensificado e diferentes taxas de degradação têm sido
demonstradas, considerando as diferenças entre as espécies e as condições de crescimento
utilizadas para tanto. Considerando-se a enorme diversidade dos fungos basidiomicetos é
necessário, inicialmente, selecionar as espécies que apresentem maior potencialidade de
degradação de xenobióticos e que consigam se desenvolver nas condições de meio ou
materiais a serem biorremediados (BARR & AUST, 1994).
A capacidade dos basidiomicetos em degradar compostos xenobióticos deve-se à
semelhança entre as estruturas da molécula de lignina e as moléculas de alguns compostos
sintéticos, principalmente compostos aromáticos.
Segundo BONONI (1999), a natureza inespecífica deste mecanismo de degradação
permite que até mesmo misturas complexas de poluentes sejam degradadas. Esta
capacidade de mineralizar uma grande variedade de compostos químicos estruturalmente
diferentes pode ter muitas vantagens na biodegradação de poluentes ambientais. AUST
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(1990) resumiu algumas das vantagens de se utilizar os fungos lignocelulósicos em
processos de biorremediação e tratamento de resíduos, quais sejam:
1. o sistema enzimático, sendo extracelular, pode atuar em substratos insolúveis ou
complexados aos solos, e, portanto pouco acessíveis à ação bacteriana;
2. o sistema, sendo inespecífico, pode ser usado para uma ampla variedade de poluentes
orgânicos ou mesmo de misturas deles;
3. o sistema, sendo produzido em resposta às condições de limitação de nutrientes, não
necessita ser induzido pela exposição prévia ou pela presença de lignina ou do composto
poluente;
4. este grupo de fungos possui vantagens competitivas, com relação aos outros
microrganismos, quando materiais lignocelulósicos são utilizados como fontes de carbono;
5. a degradação da lignina ocorre até que sua concentração seja reduzida a níveis não
detectáveis e os produtos finais são CO2 e água. Este é o tipo de processo desejável na
degradação de xenobióticos.
Como os fungos da podridão branca não requerem precondicionamento para
poluentes em particular, porque a secreção da enzima depende mais da limitação de
nutriente, tanto nitrogênio como carbono, do que da presença de poluentes, o sistema de
enzimas extracelulares possibilita a estes fungos tolerarem altas concentrações de
poluentes (KAPDAN et al., 2000).
Os primeiros estudos relatando a descoloração de corantes por fungos ligninolíticos
foram publicados no início da década de 80 quando GLENN & GOLD (1983) utilizaram
corantes poliméricos em seus ensaios, buscando compostos mais simples, baratos e
disponíveis comercialmente com alto grau de pureza em substituição as ligninas
radiomarcadas utilizadas como substratos nos ensaios de biodegradação de lignina. Os
ensaios revelaram que a descoloração era conseqüência do metabolismo secundário do
Phanerochaete chrysosporium, ocorrendo paralelamente à degradação da lignina, sendo
também reprimida por altos níveis de nitrogênio, fortemente dependente da concentração
de oxigênio e inibida por inibidores conhecidos da degradação da lignina.
Os estudos prévios, em sua maioria, enfocam as enzimas degradadoras de lignina
de Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor. Recentemente, no entanto, tem-se
verificado aumento no interesse em estudar as enzimas modificadoras de lignina de grande
número de fungos da podridão branca, não apenas do ponto de vista da biologia
comparativa, mas também com a expectativa de encontrar melhores sistemas degradadores
de lignina para o uso em várias aplicações biotecnológicas (LEVIN et al., 2004).
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Com o intuito de testar a atividade ligninolítica e celulósica de microrganismos, o
complexo celulose-RBBR (“remazol brilhante blue R”) foi empregado por VYAS &
MOLITORIS (1995) para detectar a quebra e a descoloração do corante. A remoção do
corante por Phanerochaete chrysosporium foi devida à ação da enzima lignina peroxidase
(LiP), por ele produzida. No entanto, a descoloração por Pleurotus ostreatus ocorreu
mesmo sem a presença de LiP.
BANAT et al. (1996) testaram a degradação de dezoito azo-corantes em várias
concentrações, sendo que o fungo P. chrysosporium mostrou-se capaz de descolorir os
corantes, particularmente quando o álcool veratrílico estava presente no meio. Acredita-se
que o álcool veratrílico estimula a atividade das ligninases, aparentemente ligadas à
descoloração. Entre os dezoito azo-corantes testados, somente oito foram degradados com
40-70% de remoção de cor, sendo essa degradação devida ao sistema enzimático
degradador de lignina ou por adsorção desses à massa miscelial.
YOUNG & YU (1997) compararam a capacidade de degradabilidade de oito
corantes (incluindo índigo, complexos metálicos, antraquinona e azo) por Phanerochaete
chrysosporium e Trametes versicolor. De acordo com os autores, P. chrysosporium é um
degradador versátil de corantes sintéticos de várias estruturas químicas, sendo as reações
catalisadas por ligninases e não peroxidades dependentes de manganês. Os corantes com
diferentes estruturas foram descoloridos em taxas diferentes e geralmente altas
concentrações do corante resultaram em menores taxas de descoloração.
Tem-se demonstrado que culturas vários fungos ligninolíticos da podridão branca
degradam e descolorem vários tipos de corantes e, que outras enzimas, tais como
manganês peroxidase, lacase e aril álcool peroxidase, além da lignina peroxidase, estão
envolvidas nestes processos (VYAS & MOLITORIS, 1995; RODRIGUEZ et al., 1999).
Além disso, os estudos demonstraram que entre os fungos capazes de descolorir e degradar
corantes, utilizando suas enzimas ligninolíticas, estão as espécies pertencentes aos gêneros
Pleurotus, Coriolus, Lentinus, Trametes, Bjerkandera, entre outros. CHAGAS &
DURRANT (2001) avaliando a descoloração de azocorantes afirmam que as enzimas Mn-
peroxidase e ? -glucosidase podem estar envolvidas na descoloração dos corantes por P.
chrysosporium e, que para Pleurotus sajorcaju, além da lacase, a enzima glucose-1-
oxidase pode participar do processo.
Dezesseis linhagens de fungos, conhecidas por sua habilidade em degradar
materiais ligninocelulósicos ou derivados de lignina, foram testadas por HEINFING et al.
(1997) em seu potencial em descolorir corantes têxteis reativos comercialmente usados.
Revisão ______________________________________________________________
18
Primeiramente, os autores testaram a descoloração de três azo corantes, laranja reativo 96,
violeta reativo 5 e Preto reativo 5, e dois corantes phthalocyanine, azul reativo 15 e azul
reativo 38, em placas de meio sólido de glicose, contendo os corantes na concentração de
200 mg/L e 15 g/L de ágar, utilizando dezesseis espécies de fungos da podridão branca.
Dos dezesseis fungos testados apenas Bjerkandera adusta, Trametes versicolor e
Phanerochaete chrysosporium foram capazes de descolorir todos os corantes testados.
Em seguida, B. adusta, P. chrysosporium e T. versicolor foram escolhidos pelos
autores para um detalhado estudo de transformações do violeta reativo 5 (HRV5), um
corante que contém cobre, e do azul reativo 38 (HRB38), um complexo de níquel-
phthalocyanina, em meio líquido. Os autores verificaram que HRB38 foi descolorido por
volta de 40% por B. adusta e T. versicolor em 24 horas e 95% de descoloração foi
alcançada em 4 dias. Houve redução de 30% da concentração de níquel durante o
tratamento com B. adusta e T. versicolor. A descoloração de HRV5 começou mais
lentamente que a descoloração de HRB38 e alcançou 95% de descoloração em 6 dias com
B. adusta e T. versicolor. A concentração de cobre permaneceu constante durante o
experimento.
A descoloração em meio sólido dos corantes amaranto, new coccine (vermelho),
orange G (alaranjado) e tartrazina, foi avaliada utilizando Phanerochaete chrysosporium e
Pleurotus sajorcaju. Foram determinadas as atividades enzimáticas de lignina peroxidase,
álcool veratrílico oxidase (AVO), lacase (o-dianisidina e siringaldazina) e manganês
peroxidase. Após oito dias P. chrysosporium não havia descolorido totalmente tartrazina e
amaranto, porém descoloriu totalmente new coccine e orange G, enquanto Pleurotus sajor-
caju descoloriu totalmente amaranto e new coccine e, parcialmente, orange G. Nenhum
dos fungos apresentou atividade de LiP ou AVO nas condições experimentais. P.
chrysosporium praticamente não mostrou atividade de lacase (o-dianisidina), mas
apresentou atividade de MnP, CBQ, ? -glucosidase e lacase (siringaldazina). P. sajor-caju
não apresentou atividade de MnP, no entanto mostrou atividade de lacase (CHAGAS &
DURRANT, 1999).
Segundo SHIN et al. (1997), Pleurotus produz um tipo de peroxidase extracelular
(PoP), glucose oxidase e um sistema gerador de H2O2. A especificidade da PoP ao
substrato é similar à conhecida para MnP que não oxida compostos fenólicos, mas não é
dependente da atividade catalítica do manganês. De acordo com estes autores, a correlação
entre a degradação da lignina e a descoloração de RBBR já foi demonstrada. O RBBR é
semelhante a certos compostos poliméricos aromáticos que são substratos para LiP.
Revisão ______________________________________________________________
19
Embora ainda não se conheça com precisão qua is as enzimas que são capazes de degradar
a lignina “in vivo”, dois grupos de peroxidases, a lignina peroxidase (LiP) e a manganês
peroxidase (MnP), parecem estar associadas à atividade ligninolítica. Essas enzimas têm
sido extensivamente estudadas em P. chrysosporium e outros fungos da podridão branca,
tais como Panus tigrinus, Panus brevispora, Trametes versicolor e Phlebia radiata.
Trametes versicolor, Bjerkandera sp., Pleurotus ostreatus e Trametes hirsuta, além
de Phanerochaete chrysosporium, foram utilizados por SWAMY & RAMSAY (1999),
para avaliar a habilidade de descoloração de amaranto, tropaeolin O, preto remazol B,
laranja remazol 3R, azul brilhante remazol R e azul reativo 15 em placas de agar-malte
2%. Das cinco espécies testadas, P. chrysosporium, T. versicolor e Bjerkandera sp.
apresentaram a maior extensão de descoloração. As três espécies não descoloriram os
corantes em cultivo estático. Em cultivo agitado, a 200 rpm e com formação de “pellets”,
Bjerkandera sp. descoloriu amaranto, preto remazol B e laranja remazol. Os “pellets” de P.
chrysosporium e T. versicolor foram capazes de descolorir a maioria dos corantes, sendo
que a descoloração por T. versicolor foi muito mais rápida. Culturas em batelada de
Bjerkandera sp. e P. chrysosporium apresentaram habilidade limitada para descolorir
adições repetidas de corantes. Entretanto, T. versicolor descoloriu rapidamente adições
repetidas de diferentes corantes e misturas dos mesmos, sem se verificar qualquer adsorção
visual do corante aos “pellets”. A escolha da solução tampão teve um profundo efeito
sobre a adição repetida de corante, e conseqüentemente, à descoloração. A utilização de
ácido 2,2’-dimetilsuccínico permitiu um excelente controle de pH e resultou em alta
habilidade de descoloração.
Culturas de P. sanguineus foram testadas por THOMAS & PINKOSKI (1999) na
descoloração dos corantes vermelho congo e verde malaquita. Verificou-se que houve
redução da concentração do vermelho congo em todas soluções inoculadas com
Pycnoporus sanguineus, sendo que as maiores variações ocorreram quando foi adicionada
glicose às soluções, tanto em pH 5,0 como em pH 6,0. Constatou-se que as maiores taxas
de redução do corante aconteceram nas primeiras 48 horas. Ao final do período de
incubação as porcentagens de remoção variaram de 52%, nas soluções de glicose com pH
5,0, a 92% nas soluções de glicose a pH 6,0. Porém, com relação ao corante verde
malaquita em pH 5,0, não houve muita diferença na remoção do corante, na presença ou
não de glicose, alcançando uma redução de 28% da concentração inicial ao final do
período de incubação. Em pH 6,0, houve um máximo de 40% de descoloração.
Revisão ______________________________________________________________
20
RODRÍGUEZ et al. (1999) estudaram a descoloração de 23 corantes industriais por
fungos da podridão branca. Culturas dos fungos Phanerochaete chrysosporium (ATCC
24725) e Pleroutus ostreatus (IE8) crescendo em meio complexo de agar contendo um dos
23 corantes testados mostraram que P. ostreatus foi capaz de descolorir 12 dos 23 corantes
industriais, enquanto P. chrysosporium descoloriu apenas cinco. Extratos extracelulares de
Trametes híspida crescidos em grãos de cereais foram capazes de descolorir “in vitro” 11
dos 23 corantes industriais. Segundo os autores, todas as linhagens de P. ostreatus
apresentaram alta atividade de lacase e manganês peroxidase, mas a maior atividade
volumétrica de lacase foi encontrada em T. hispida.
Segundo BALAN (1998), a descoloração por basidiomicetos em meio líquido
contendo uma concentração de 0,02% do corante índigo, indicou a descoloração e remoção
do corante. A descoloração iniciou-se em poucas horas, sendo 100% do corante degradado
por Phellinus gilvus no quarto dia. As porcentagens de descoloração obtidas por Pleurotus
sajor-caju, Pycnoporus sanguineus e Phanerochaete chrysosporium foram de 94%, 90% e
70-75%, respectivamente. Uma quantidade parcial do corante índigo foi removida do meio
por adsorção no micélio.
A descoloração do corante cristal violeta por fungos foi estudada em cultura líquida
e monitorada por espectrofotometria. Phanerochaete chrysosporium apresentou a menor
porcentagem de descoloração, 62%, no entanto, Coriolus versicolor e Fumagalia troggi
descoloriram 92% e 82%, respectivamente (YESILADA, 1995).
KAPDAN et al. (2000) testaram a descoloração dos corantes amarelo everzol 4GL,
vermelho everzol RBN, Orange K-GL, Amarelo supra everdirect PG e Azul turquesa
everzol G por Phanerochaete chrysosporium 671.71, P. chrysosporium MUCL, Coriolus
versicolor e Coriolus versicolor MUCL em frascos agitados por um período de 9 dias de
incubação. Os autores verificaram uma descoloração pelo P. chrysosporium por volta de
90% para todos os corantes testados. Para o Coriolus versicolor o grau de descoloração
variou entre 34% a 100%.
TEKERE et al. (2001) estudaram o crescimento, descoloração de corantes,
atividade ligninolítica e temperatura ótima de fungos da podridão branca do Zimbábue. A
temperatura ótima foi encontrada entre 25-37ºC, variando de acordo com os isolados. Os
isolados foram testados por sua habilidade em degradar os corantes poliméricos azul
dextran e Poly R478 e os corantes trifenilmetanos vermelho cresol, violeta cristal e azul
bromofenol. Os autores não detectaram presença de lignina peroxidase nos isolados, mas
todos os isolados apresentaram atividade de manganês peroxidase e lacase. Os autores
Revisão ______________________________________________________________
21
verificaram que as maiores taxas de descoloração em culturas líquidas para o corante Poly
R478 foram obtidas utilizando Trametes cingulata, Trametes versicolor, Trametes poças,
DSPM95 (uma espécie a ser identificada), Datronia concentrica e Pycnoporus sanguineus.
CHAGAS & DURRANT (2001) examinaram a descoloração de quatro azo-
corantes em duas culturas de fungos da podridão branca. Em meio de cultura solidificado,
Phanerochaete chrysosporium descoloriu parcialmente todos os corantes testados,
enquanto Pleurotus sajorcaju descoloriu totalmente amaranto, new coccine e laranja G,
mas não tartrazina. Em meio de cultura líquido, P. chrysosporium descoloriu totalmente
amaranto, new coccine e laranja G e 60% tartrazina. P. sajorcaju descoloriu totalmente
amaranto e new coccine, 50% laranja G e no máximo 20% tartrazina. Segundo as autoras
nenhum dos fungos apresentou atividade de lignina peroxidase ou álcool veratrílico
oxidase. Atividades de manganês peroxidase e ? -glucosidase podem estar envolvidas na
descoloração dos corantes por P. chrysosporium, enquanto para P. sajorcaju, lacase e
glicose-1 oxidase podem participar no processo de descoloração.
GUGLIOTA (2002), citado por OMORI (2004), recentemente avaliou a capacidade
de basidiomicetos em descolorir o corante índigo carmim em meio sólido de extrato de
malte acrescido de corante. Todas as linhagens foram capazes de crescer neste meio de
cultura, sendo que das 30 linhagens avaliadas, 28 foram capazes de descolorir o corante.
Apenas as linhagens Pycnoporus sanguineus CCB277 e Hydnopolyporus fimbriatus
CCB289 não formaram halo de descoloração no período de quatorze dias. As linhagens
que apresentaram maior halo de descoloração associado a maior taxa de extensão micelial
foram: Hygrocybe sp. CCB342, Panaeolus papilionaceus CCB187, Psilocybe castanella
CCB444, Stereum ostrea CCB267, Trametes villosa CCB165 E CCB291. Numa segunda
etapa, três linhagens foram selecionadas e avaliadas quanto à capacidade de descolorir um
efluente têxtil em meio de cultura líquida (batata-dextrose) adicionada de efluente. As
porcentagens de remoção de cor do efluente foram 75,32% para Panaeolus papilionaceus
CCB187, 87,82% para Trametes villosa CCB165 e 92,89% para Hygrocybe sp. CCB342.
HARAZONO et al. (2003) investigaram a descoloração de um corante azo-reativo,
vermelho reativo 120, por um fungo da podridão branca, Phanerochaete sordida linhagem
YK-624. Em cultura líquida de P. sordida em um meio contendo 3% de extrato de malte e
200mg/l do corante, obteve-se uma descoloração do corante de 90,6 % após sete dias. A
atividade de Manganês Peroxidase (MnP) foi detectada durante o processo de
descoloração. Os autores verificaram que o corante pode ser descolorido por MnP
purificada de P. sordida na presença de Mn(II) Tween 80. Sob agitação, o corante pode ser
Revisão ______________________________________________________________
22
descolorido sem adição de peróxido de hidrogênio. Além disso, observaram que a
descoloração não ocorre em condições anaeróbicas, sugerindo que a descoloração do
corante por MnP é influenciada por oxigênio dissolvido.
A habilidade do fungo da podridão branca Lentinus edodes em descolorir vários
corantes sintéticos foi investigado por BOER et al. (2004) usando culturas em estado
sólido com sabugo de milho como substrato. Para testar a habilidade deste sistema em
estado sólido em descolorir corantes industriais, cada corante foi adicionado na cultura de
espiga de milho e glicose em uma concentração de 200 ppm. As autoras observaram,
visualmente, uma completa descoloração, após dezoito dias, de oito dos dez corantes
testados: preto amido, vermelho congo, azul trypan, verde metil, RBBR, violeta metil,
violeta etil e Poly R478. Dois corantes, azul cresyl brilhante e azul metileno, foram
parcialmente descoloridos.
A produção de enzimas ligninolíticas pelo L. edodes em culturas de espiga de milho
também foi analisada pelas autoras, que detectaram alta atividade de manganês peroxidase
e muito baixa atividade de lignina peroxidase e lacase.
SANTOS (2004) selecionou fungos ligninolíticos para descoloração do corante
RBBR. Os fungos estudados foram Lentinus edodes CCB047, Lentinus edodes 1, Lentinus
edodes 2, Phanerochaete chrysosporium CCB478, Pleurotus cornucopiae var.
citrinopileatus CCB085, Pleurotus ëous CCB016, Pleurotus ëous CCB440, Pleurotus
ostreatus CCB002, Pleurotus pulmonarius CCB017, Pleurotus pulmonarius CCB019,
Pleurotus pulmonarius CCB020, Agaricus blazei, Pleurotus ostreatus, Schizophuyllum
comumne, Rhyzopus arrhyzus, e quatro fungos isolados de efluente têxtil não identificados.
Na seleção dos fungos foi utilizado meio agar extrato de malte-2% acrescido de 0,05 % de
“Remazol Brilliant Blue R”. Todos os fungos avaliados apresentaram crescimento no meio
utilizado, entretanto, nem todos foram capazes de descolorir o meio corante. Dentre os
fungos avaliados, os isolados Pleurotus ëous CCB016 E CCB040 e Pleurotus pulmonarius
CCB019 foram os que se destacaram, apresentando potencial para descoloração deste
corante.
LEVIN et al. (2004), comparando com o bem conhecido degradador de corante
Phanerochaete chrysosporium, identificaram um novo fungo potencialmente candidato ao
uso em processos de biodescoloração: Coriolus versicolor antarcticus. Segundo os autores
culturas de dezoito dias deste fungo foram capazes de descolorir em uma hora 28 %, 30 %,
43 %, 88 % e 98 % de Xylidine (24 mg/L), Poly R-478 (75 mg/L), Remazol Brilliant Blue
R (9 mg/L), verde malaquita (6 mg/L) e Índigo Carmine (23 mg/L), respectivamente. Os
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23
autores também verificaram a presença da enzima lacase nos fluidos extracelulares no dia
de incubação. Manganês peroxidase e lignina peroxidase não foram detectadas.
KIM et al. (2004) estudaram a descoloração de soluções coloridas em um biorreator
com membrana (MBR) usando fungos da podridão branca. Os autores combinaram a
descoloração das soluções coloridas por Trametes versicolor (KCTC 16781) com filtração
em membrana. A aplicabilidade do MBR usando biodegradação por fungos foi estudada
com membranas de nanofiltração e osmose inversa para melhorar o fluxo de permeado a
eficiência da separação. Os autores verificaram que a combinação do MBR fúngico com
RO se apresenta eficiente para descoloração e remoção orgânica de efluente colorido.
CHRISTIAN et al. (2005) avaliaram a descoloração do corante Remazol Brilliant
Blue R (RBBR) pelo fungo Trametes versicolor. Os autores verificaram que a
descoloração do RBBR por T. versicolor envolve a atividade de LiP e uma atividade
dependente de H2O2 a qual não é influenciada por álcool veratrílico e Mn(II). No entanto a
descoloração do RBBR foi observada largamente como uma função de LiP durante os
últimos estágios do crescimento.
EICHLEROVÁ et al. (2005) recentemente avaliaram a descoloração, em meio
líquido, dos corantes Alaranjado G e Remazol Brilliant Blue R (RBBR) pelos fungos da
podridão branca Dichomitus squalens, Ischonoderma resinosum e Pleurotus calyptratus.
As três linhagens de fungos descoloriram tanto Alaranjado G como RBBR, mas eles se
diferenciaram na capacidade de descoloração dependendo das condições de cultivo e da
produção de enzimas ligninolíticas. Duas tendências diferentes de descoloração foram
encontradas nas linhagens: a descoloração do Alaranjado G por I. resinosum e P.
calyptratus foi causada principalmente por lacase, enquanto a descoloração do RBBR foi
afetada por manganês peroxidase (MnP); no caso de D. squalens, lacase e MnP
cooperaram nos processos de descoloração.
Além de avaliar fungos e corantes de forma isolada, alguns autores também
avaliaram a descoloração fúngica de misturas de corantes, a utilização seqüencial dos
fungos, bem com a descoloração de efluentes têxteis.
SANTOS et al. (2002) estudou o isolado Pleurotus pulmonarius CCB019 quanto a
descoloração de uma mistura de corantes comerciais reativos: azul R (122 ppm), vermelho-
4B (3 ppm) e azul-5G (4 ppm) em meio líquido. As variáveis testadas foram quantidade de
biomassa (10, 20 e 30 % (v/v)) e pH (4.5, 5.0 e 5.5). No sétimo dia de experimento 2 mL
de uma solução com 5 g/L de glicose foi acrescentada ao meio. A descoloração iniciou
somente depois da adição de glicose e as porcentagens de descoloração obtidas foram
Revisão ______________________________________________________________
24
maiores que 30 %. A melhor descoloração foi 85 % quando se utilizou 30 % de inóculo em
pH 4,5, no décimo nono dia experimental.
Recentemente, HAZAROMO & NAKAMURA (2005) avaliaram a descoloração de
misturas dos corantes RB5, RG5, RO14 e RR120 por um fungo basidiomiceto da podridão
branca Phanerochaete sordida. O fungo P. sordida descoloriu em 90 %, após 48 h, as
misturas de corantes (200 mg/L) em meio líquido de glicose-amônia com nitrogênio
limitante. Os autores verificaram que para a descoloração das misturas de corantes foi
preciso a adição de Mn2+ e Tween 80 ao meio.
Os autores testaram o efeito da presença de PVA, SDBS e amido na descoloração
das misturas de corantes e verificaram que SDBS e amido nas concentrações de 10-1000
mg/L não afetaram a descoloração por culturas de P. sordida na presença de 1 % de Tween
80. Para verificar o efeito inibitório de PVA, cada corante foi tratado com MnP adicionado
de Tween 80 na presença de várias concentrações de PVA. Apesar do PVA não afetar na
descoloração de RB5, RG5 e RO14 com MnP, ele inibiu a descoloração de RR120 com
MnP.
Após avaliar diferentes meios de cultivo para descoloração do corante RBB-R e do
corante amarelo BF-3R pelos fungos Pleurotus pulmonarius, Phanerochaete
chrysosporium e Lentinula edodes e determinar o meio de extrato de levedura como sendo
o melhor para o três fungos, OMORI (2004) avaliou a descoloração dos corantes de forma
seqüencial pelos mesmos. A autora utilizou a seqüência Phanerochaete chrysosporium - P.
pulmonarius - L. edodes para descolorir 0,5 g/L de cada corante, sendo o tempo de contato
entre o meio e cada fungo de 15 dias. A percentagem de descoloração no final da sucessão
foi de 93,2% para o corante RBB-R e de 21% para o amarelo reativo BF-3R, indicando que
a ordem sucessional aplicada foi mais eficiente para a descoloração do corante RBB-R. Da
percentagem total de remoção dos corantes 75,9% e 20,9% foi proporcionada pelo fungo
P. chrysosporium; 5,6% e 20,9% pelo P. pulmonarius e 11,7% e 0% pelo isolado L.
edodes, respectivamente, para os corantes RBB-R e amarelo BF-3R. Segundo a autora, não
ocorreu adsorção de corante ao micélio e o sistema enzimático fúngico, representado pelas
enzimas lacase, manganês peroxidase e lignina peroxidase, foi responsável pelo processo
de descoloração.
O fungo da podridão branca Thelephora sp. foi usado por SELVAM et al. (2003)
para a descoloração de corantes como alaranjado G (50?M), vermelho congo (50?M) e
preto amido 10B (25 ? M) em meio limitado de carbono. As descolorações obtidas foram
de 33,3%, 97,1% e 98,8% para alaranjado G, vermelho congo e preto amigo 10B,
Revisão ______________________________________________________________
25
respectivamente. Os autores também utilizaram o fungo para tratar um efluente têxtil em
modo batelada e contínuo. Uma descoloração máxima de 61% foi alcançada no terceiro
dia, em modo batelada, e uma máxima descoloração de 50% foi obtida no sétimo dia, em
modo contínuo.
2.6 DEGRADAÇÃO DE CORANTES E EFLUENTES TÊXTEIS POR ENZIMAS DE
FUNGOS
Uma vez que os fungos ligninolíticos têm sido apontados como os mais eficientes
degradadores de corantes sintéticos devido, principalmente, às suas enzimas ligninolíticas
extracelulares, vários estudos têm sido desenvolvidos para otimizar a produção das
mesmas e aplicá- las na degradação/descoloração de corantes (WESENBERG et al., 2003).
As principais enzimas ligninolíticas produzidas pelos fungos são oxiredutases, ou
seja, dois tipos de peroxidases, lignina peroxidase (LiP) e manganês peroxidase (MnP), e
uma fenoloxidase, a lacase. Alguns fungos produzem todas estas enzimas enquanto outros
produzem apenas uma ou duas delas. O interesse pelas lacases tem aumentado nos últimos
anos devido ao seu grande potencial de aplicação na degradação de vários corantes
industriais (WESEMBERG et al., 2003; ZILLY et al., 2002; SOUZA et al., 2002).
A lacase (benzenodiol oxigênio redutase [EC 1.10.32]) pertence a um grupo de
enzimas chamado cobre azul oxidase capaz de oxidar fenóis e aminas aromáticas a partir
da redução de oxigênio molecular da água. A lacase está espalhada na natureza e tem sido
encontrada em plantas, fungos, bactérias e insetos. Esta enzima é a mais encontrada em
sistemas de fungos ligninolíticos envolvidos na degradação de lignina (HOU et al., 2003).
Em basidiomicetos, as lacases extracelulares são formadas em metabolismos secundários e
são geralmente produzidas em pequenas quantidades, por isso é ainda importante aumentar
a habilidade dos microrganismos em produzir lacases para aplicação industrial. A produção
de lacase pode ser estimulada por compostos aromáticos ou fenólicos, como ABTS, ácido
ferulicos, 2-5-xilidina, ou álcool veratrílico. Além disso, a produção de lacase pode ainda
ser influenciada por diferentes condições de cultivo (HOU et al., 2003).
Estudos recentes indicaram que as lacases têm especificidade de substrato, sendo
que esta especificidade pode ser estendida a sub-unidades não-fenólicas usando
mediadores, representando um papel importante no ciclo global do carbono e podendo
ajudar na degradação de uma grande variedade de xenobióticos como corantes têxteis
(HOU et al., 2003).
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HOU et al. (2003) verificaram que a produção de lacase a partir de Pleurotus
ostreatus 32 foi influenciada pelas condições de cultivo. Os autores observaram que o
crescimento e a produção de lacase sob cultivo estático foi superior ao cultivo sob
agitação, tanto para meio rico ou limitado de nitrogênio. Também verificaram que a
produção de lacase também pode ser influenciada pela concentração de nitrogênio no meio
de cultivo. A atividade observada em meio com 5 g/L de uréia foi cerca de 80% a da
observada utilizando meio com 0,5 g/L, o que sugere que uma alta concentração de
Nitrogênio pode inibir a produção de lacase.
De acordo com WONG & YU (1999), T. versicolor libera lacase como sua
principal enzima extracelular, a qual catalisa a oxidação de compostos fenólicos e a
redução de uma molécula de oxigênio para duas moléculas de água. O mecanismo de
descoloração de corantes por lacase catalisadora não é muito claro ainda. Comparada à
lignina peroxidase de P. chrysosporium, no entanto, lacase pode ser produzida por T.
versicolor sob condições associadas ao crescimento na presença de carbono e/ou
nitrogênio como nutrientes. O mais importante é que lacase é uma oxidase com um
potencial redox de 780 mV e pode catalisar a oxidação de poluentes orgânicos por redução
de oxigênio molecular diretamente a água na ausência de peróxido de hidrogênio ou ainda
outros metabólitos secundários. Esta simplicidade de descoloração enzimática de corantes
pode ser valiosa para tratamento de águas residuárias reais se o mecanismo e versatilidade
da descoloração de corantes sintéticos por lacase puder ser entendida.
Pesquisadores têm relatado diversos dados relacionados à degradação de diversos
corantes reativos por lacase, estudados pelo processo de descoloração (grupo cromóforo de
degradação) ou pelo desaparecimento do produto por metodologia espectrofotométrica ou
cromatográfica. Como exemplo, PERALTA-ZAMORA et al. (2003) citam a
desintoxicação de derivados de metil, metoxi, cloro e nitro substituintes de 4(4’-sulfofenil-
azo)-fenol a partir da utilização de um lacase de Pirycularia oryzae disponível
comercialmente. Estes autores relatam, ainda, que a lacase de Coriolopisis gallica foi
imobilizada em agarose ativada e testada para descoloração repetida de corantes
industriais. A lacase imobilizada reteve 85% da atividade inicial depois de 10 ciclos e 70%
após 3 meses de uso intermitente na descoloração do corante reativo Azul 198. Além disso,
os autores reportam que corantes antraquinones representaram substratos que foram
diretamente oxidados pela lacase, enquanto que a descoloração de corantes azo e índigo
exigiu a utilização de pequenas moléculas metabólicas (mediadores, como HOBT).
Revisão ______________________________________________________________
27
Segundo os estudos realizados por WONG & YU (1999), a descoloração de
corantes por lacases mostrou-se limitada muito mais pela concentração de compostos
mediadores do que pela atividade da enzima na solução.
Corantes têxteis industriais como triarilmetano, antraquinones e índigos foram
eficientemente descoloridos por enzimas preparadas de diferentes fungos. A na tureza dos
substituintes nos anéis benzênicos do corante influenciou a atividade enzimática, e grupos
amino e hidroxil aumentaram a descoloração (ABADULLA et al., 2000).
Muitas iso-enzimas da lacase de Pleurotus ostreatus têm sido purificadas e
caracterizadas: POXC, a mais abundantemente produzida sob todas as condições de
crescimento examinadas, etos, POXA1b, POXA3a, e POXA3b. Remazol Brilliant Blue R
(RBBR) foi degradado pelas isoenzimas de lacase POXC, POXA3a e POXA3b na
ausência de mediadores redox. O nível final de descoloração do corante e a taxa final de
reação foram as mesmas usando POXA3a ou POXA3b, apesar da eficiência do processo
aumentar usando misturas das isoenzimas POXC e POXA3a/b (PALMIERI et al., 2005).
O potencial da polpa de coco como matéria-prima para a produção de lacase
extracelular pelo fungo da podridão branca Trametes hirsuta foi investigado por COUTO
& SANROMÁN (2004), assim como a aplicação do líquido extracelular na descoloração
do corante Lissamine Green B. Uma máxima atividade de lacase de 333,280 nkat/L foi
produzida, a qual foi aumentada quase 3 vezes quando sulfato de cobre (2mM) foi
adicionado no meio de cultura. A descoloração do corante têxtil Lissamine Green B foi
testada tanto in vitro com in vivo. In vitro foi investigado o efeito de diferentes tempos de
cultivo (14, 21 e 32 dias). Os autores observaram que o líquido extracelular de 14 dias
apresentou o menor percentual de descoloração. O maior percentual correspondeu ao
líquido extracelular de 21 dias. In vivo foi observada uma descoloração superior a 96 % em
2,5 horas.
A habilidade de descolorir corante antraquinonas pela enzima lacase de Pleurotus
ostreatus 32 foi estudada por HOU et al. (2003). Os autores testaram lacase bruta na
descoloração do corante Remazol Brilliant Blue SN4R e após 2, 4, 6, e 8 h de incubação e
verificaram percentagens de descoloração de 8,8, 18,4, 27,1, 48,3 e 66,3%,
respectivamente. Ou autores também testaram a descoloração do corante utilizando
pequenas adições do mediador ABTS e uma ótima taxa de descoloração foi observada
quando adicionado 0.16% do mediador. Após uma incubação de 1, 2, 3, 4 e 5 horas a taxa
de descoloração foi de 9,7, 31,8, 57,5, 76,9 e 90%, respectivamente.
Revisão ______________________________________________________________
28
PERALTA-ZAMORA et al. (2003) estudaram a descoloração de corantes reativos
(Remazol brilliant blue R, Remazol Black B, Reactive orange 122 e Reactive Red 25)
utilizando enzima livre e imobilizada de Trametes versicolor. Para todos os corantes a
descoloração mostrou-se maior usando enzima imobilizada quando comparada com a
enzima livre. Os autores também estudaram o efeito da utilização de HOBT como
mediador da lacase e não verificaram diferença significativa nas descolorações para os
corantes RBBR, preto remazol B and vermelho reativo 25. No entanto, para o corante
alaranjado reativo 122 foi observada uma pequena diferença na descoloração. Neste caso,
um aumento de aproximadamente 10 pontos foi observado quando a enzima imobilizada
foi usada na presença de HOBT, atingindo uma descoloração de aproximadamente 55%, a
maior dentre os testes realizados.
ABADULLA et al. (2000) testaram a descoloração de sete corantes têxteis (azul
reativo 221, preto reativo 5, azul direto 71, vermelho básico 9, azul reativo 19, azul ácido
225, azul ácido 74) por Trametes hirsusta e pela lacase purificada do mesmo fungo. Exceto
para o preto reativo 5 e para o vermelho básico 9, uma tendência similar foi observada para
degradação microbiológica e enzimática, sugerindo que a lacase extracelular seria a
principal responsável pela degradação dos corantes. Corantes antraquinônicos e índigo
carmim (azul ácido 74) foram degradados duas vezes mais rapidamente que os outros
corantes, por ambos T. hirsuta e a enzima purificada. A adsorção dos corantes no micélio
não contribuiram na descoloração microbiológica uma vez que um máximo de 1,5% do
corante adicionado foi encontrado junto ao micélio, exceto para vermelho básico 9 para o
qual 7% do corante foi encontrado no micélio após 6 dias de incubação.
Os autores também testaram a desintoxicação dos corantes pela lacase imobilizada
de T. hirsusta. Vários dos corantes têxteis foram descoloridos pela lacase imobilizada, e a
toxicidade dos produtos degradados foi determinada. O grau das descolorações foi
padronizado em 80% para todos os corantes. Sob estas condições, os corantes
antraquinônicoss foram degradados em aproximadamente 80%, enquanto a toxicidade dos
corantes azo preto reativo 5 e azul direto 71 reduziu 13% e 40%, respectivamente. O
corante que contém cobre, azul reativo 221, foi levemente degradado pelo tratamento
enzimático (4,1%).
Quatro espécies de basidiomicetes ligninolíticos, Trametes modesta, Trametes
hirsuta, Trametes versicolor e Sclerotium rolfsii, foram comparados pela habilidade em
produzir lacases. A lacase dos fungos foi testada em sua habilidade de descolorir oito
corantes sintéticos (antraquinonicos, azo, índigo e triarilmetano). A taxa de descoloração
Revisão ______________________________________________________________
29
dependeu tanto da fonte da enzima preparada como da estrutura do corante. Baseado na
produção de lacase e capacidade de descoloração do corante, T. modesta foi selecionado
para estudos subseqüentes. Todos os corantes testados foram descoloridos pela lacase de T.
modesta mais eficientemente sob condições de pH ácido (pH 3-6), mas o pH ótimo para
descoloração de cada corante variou. A taxa de descoloração usando esta lacase aumentou
na faixa de temperatura de 50-60ºC. A eficiência da descoloração pela lacase de T.
modesta foi aumentada extraordinariamente na presença de mediadores como HBT e MPT
(NYANHONGO et al., 2002).
SOARES et al. (2001) estudaram a descoloração do corante RBBR por uma
formulação comercial de lacase (CLF), contendo lacase, um mediador redox e um
surfactante não iônico. Componentes de baixo peso molecular foram removidos da CLF
por filtração a gel, o que tornou possível a comparação da utilização da lacase isolada.
Exceto por uma termoestabilidade ligeiramente melhor da CLF quando comparada com a
da enzima isolada, os perfis do pH e da temperatura foram similares apesar da presença dos
compostos de baixo peso molecular. A lacase isolada não descoloriu o corante RBBR. Um
mediador redox de baixo peso molecular (HBT) foi necessário para a descoloração ocorrer.
A descoloração utilizando CLF também foi testada. As descolorações utilizando a lacase
isolada adicionada de HBT e utilizando a CLF foram comparadas e apresentaram
resultados semelhantes, chegando a 100 % após 2 horas.
Uma mistura preparada de lacase bruta de culturas de Pleurotus ostreatus
suplementada com cobre e ácido felúrico foi usada por PALMIERI et al. (2005) para
descolorir o corante antraquinonico Remazol Brilliant Blue R (RBBR). A performance
deste sistema enzimático foi testada e uma descoloração máxima de 70 % foi alcançada
sob condições ótimas. A mistura bruta da enzima foi imobilizada por encapsulamento em
gotas de alginato de cobre alcançando 65 % de rendimento da atividade enzimática. A
estabilidade da lacase imobilizada foi extraordinariamente aumentada em comparação com
enzima livre. A eficiência do sistema com enzima imobilizada foi avaliada durante adições
sucessivas de corantes em operações em batelada. Sob as condições ótimas, 70 % de
descoloração do RBBR foi alcançada depois de 20 ciclos, apesar do tempo de descoloração
aumentar exponencialmente após o décimo ciclo.
Com relação ao gênero Pleurotus, muitas espécies têm sido descritas como
produtoras de lacase. Apesar do uso potencial de P. pulmonarius em processos de
biorremediação já ter sido descrito, muitos aspectos relacionados com a produção e
caracterização da enzima lacase continuam inexplorados (SOUZA et al., 2002).
Revisão ______________________________________________________________
30
SOUZA et al. (2002) estudaram a produção de lacase por P. pulmonarius em
fermentação no estado sólido usando grãos de trigo. Dentre as enzimas oxidativas e
hidrolíticas avaliadas (lacase, álcool arílico oxidase, lignina peroxidase, manganês
peroxidase, xilanase e celulase), lacase foi a principal enzima produzida por P.
pulmonarius. O pH e temperaturas ótimos para atividade de lacase foram obtidos como
sendo 6.5 e 50ºC. A enzima mostrou-se altamente estável em pH alcalino, mas o mesmo
não ocorreu em pH ácido. Além disso, as autoras constataram que a atividade de lacase
parece estar correlacionada com a habilidade do extrato bruto em descolorir vários corantes
industriais.
ZILLY et al. (2002) avaliaram a habilidade de Pleurotus pulmonarius em
descolorir corantes sintéticos de diferentes estruturas em estado sólido e em culturas
submersas. As autoras também avaliaram a produção de quatro enzimas nas culturas
filtradas (lacase, álcool arílico oxidase, lignina peroxidase e manganês peroxidase) e
verificaram que somente a lacase foi produzida pelo fungo. As autoras avaliaram, então, a
descoloração in vitro de três corantes (Remazol Brilliant Blue R, Trypan Blue e Methyl
green) e verificaram que todos os corantes foram descoloridos pelos extratos extracelulares
brutos. A lacase pode, portanto, ser considerada a principal enzima envolvida na habilidade
do P. pulmonarius em descolorir corantes industriais
CAPÍTULO 3
MATERIAIS E MÉTODOS
O trabalho foi dividido em duas etapas de acordo com a forma de descoloração
utilizada. A primeira etapa consistiu de vários ensaios para avaliar a habilidade dos
isolados fúngicos Ganoderma lucidum, Lentinus edodes e Pleurotus pulmonarius em
descolorir o corante Remazol Brilliant Blue R, o qual é um importante corante industrial.
Uma segunda etapa consistiu em avaliar a descoloração de diferentes corantes reativos e de
um efluente têxtil utilizando a enzima lacase produzida pelo fungo Pleurotus pulmonarius.
3.1 DESCOLORAÇÃO DO CORANTE REATIVO REMAZOL BRILLIANT BLUE R
POR FUNGOS LIGNINOLÍTICOS
3.1.1 Corante
Para os ensaios de descoloração desta etapa utilizou-se o corante reativo Remazol
Brilliant Blue R. Este corante é derivado de antraceno e representa uma importante classe
de organopoluentes geralmente tóxicos e recalcitrantes (CHRISTIAN et al., 2005). Os
comprimentos de onda de máxima e mínima absorbância deste corante são 590nm e
455nm, respectivamente.
3.1.2 Fungos ligninolíticos
Os isolados de Ganoderma lucidum e Lentinus edodes foram cedidos pelo
Departamento de Biologia da Universidade Estadual de Maringá. O isolado Pleurotus
pulmonarius (CCB019) foi doado pela Coleção de Culturas de Basidiomicetos do Instituto
de Botânica de São Paulo.
Materiais e Métodos ____________________________________________________
32
3.1.3 Meios de cultura e preparo de inóculo
Para o preparo de inóculo sólido os isolados foram inicialmente cultivados em
placas-de-Petri contendo meio mínimo de Pontecorvo, descrito por BALAN (19980,
acrescido de glicose (Tabela 3.1) e 8 g/L de ágar por 7-10 dias a 28ºC. O inóculo líquido
de cada fungo foi preparado inoculando-se discos de inóculo sólido (? 6mm) colonizados
pelos fungos em erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de meio mínimo com glicose. As
culturas submersas foram incubadas a 28ºC, por 7-10 dias, e então o meio foi
homogeneizado e utilizado nos testes.
Tabela 3.1 – Composição do meio mínino com glicose.
Nutrientes Concentração (g/L)
KH2PO4 6,0
KCl 0,5
MgSO4 0,5
FeSO4 0,02
ZnSO4 0,001
NaNO3 0,03
Glicose 1,0
Em algumas etapas do trabalho os isolados foram cultivados em meio extrato de
malte-ágar (MEA) e meio de extrato de malte líquido (Tabela 3.2). O preparo de inóculos
utilizando estes meios seguiu o mesmo procedimento descrito anteriormente utilizando
meio mínimo com glicose.
Tabela 3.2 – Composição do meio de extrato de malte.
Nutrientes Meio sólido
Concentração (g/L)
Meio líquido
Concentração (g/L)
Extrato de malte 20 2,0
Peptona 1,0 0,1
Glicose 20 2,0
Agar 15 ----
Materiais e Métodos ____________________________________________________
33
3.1.4 Ensaios de descoloração fúngica
Os experimentos, com exceção do primeiro, foram realizados em batelada e em
duplicata, a 28ºC. Experimentos controles foram realizados conforme os experimentos
teste, porém utilizando-se biomassa morta dos fungos. O tempo de incubação variou de
acordo com o experimento. Para todos os testes foi utilizada uma proporção de 1mL de
inóculo para cada 5 mL de meio reacional.
Para o primeiro teste, realizado para avaliar a capacidade de descoloração do
corante pelos fungos P. pulmonarius, L. edodes e G. lucidum, discos de inóculo sólido (?
6mm) colonizados pelos fungos foram transferidos para tubos de ensaio contendo 5 mL de
meio mínimo com glicose acrescidos de 0,5 g/L do corante, na proporção de 1 disco para
cada 5 mL de meio. Os tubos foram mantidos à temperatura ambiente, ao abrigo da luz,
por 14 dias quando as amostras foram filtradas e o filtrado foi utilizado para a
determinação da descoloração, redução de DQO e redução de glicose. Os ensaios foram
realizados em batelada e em triplicata para cada fungo. Controles foram preparados
utilizando-se o mesmo meio sem adição de fungo e com adição de meio sólido sem fungo.
Em seguida, novos testes foram propostos a fim de se avaliar a descoloração do
corante em meio com limitação de nutrientes, de forma a não se aumentar a DQO do meio
reacional.
Desta forma, erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de uma solução do corante
RBBR (0,5 g/L), sem adição de outros nutrientes, foram inoculados com 10 mL de cada
cultura dos fungos. Os erlenmeyers foram incubados por 14 dias, durante os quais
alíquotas foram retiradas periodicamente para acompanhamento da descoloração e da
redução de DQO.
Avaliou-se, em seguida, a descoloração do corante por inoculação sucessiva dos
fungos. Para este teste, erlenmeyers contendo 50 mL de uma solução 0,5 g/L do corante
RBBR foram inoculados com 10 mL de inólculo do isolado de G. lucidum. Os frascos
foram incubados por 7 dias, e então, as amostras foram filtradas em membrana Millipore
de 0,45 µm e retirou-se alíquotas para análises. Os meios filtrados foram então
autoclavados, novamente inoculados com G. lucidum e incubados por mais 7 dias, quando
foram novamente filtrados, seguindo o procedimento anterior. Os meios filtrados foram
então inoculados com o isolado de L. edodes e incubados por mais 7 dias, sendo então
filtrados e utilizados para realização de análises finais. Alíquotas também foram retiradas
em dias intermediários do experimento e centrifugadas, sendo o sobrenadante usado para
Materiais e Métodos ____________________________________________________
34
análises. Durante este experimento foram determinadas a descoloração do corante em
590nm, atividade das enzimas lacase, MnP e LiP e redução de DQO e glicose.
Como os resultados obtidos no testes sucessional não foram os esperados, outro
teste foi realizado. Erlenmeyers de 50 mL contendo 10mL de meio mínimo com glicose
sem diluir e diluído 1:10, 1:50 e 1:100, adicionados de 0,5 g/L do corante, foram
inoculados com 2mL de cada cultura dos fungos e incubados por 14 dias. Alíquotas foram
retiradas periodicamente e centrifugadas para monitoramento da descoloração.
Como os resultados obtidos nestes primeiros testes não foram satisfatórios para que
se pudesse concluir a respeito do meio ideal para a descoloração do corante pelos fungos,
avaliou-se ainda meios de cultivo ricos em outros substratos além da glicose. Desta forma,
erlenmeyers de 50 mL contendo 10 mL de meio mínimo acrescido de glicose, peptona e
extrato de malte, nas quantidades apresentadas na Tabela 3.3, e 0,5 g/L de corante foram
inoculados com 2 mL de inóculo de G. lucidum, L edodes e P. pulmonarius. Os frascos
foram incubados por 10 dias e alíquotas foram retiradas a cada 2 ou 3 dias para verificar a
descoloração.
Tabela 3.3 – Nutrientes adicionados ao meio mínimo.
I. TESTE Glicose (g/L) Extrato de malte
(g/L)
Peptona (g/L)
1 0,1 0 0
2 1 0 0
3 0 0,1 0
4 0 1 0
5 0 0 0,01
6 0 0 0,1
7 0,1 0,1 0,01
8 1 1 0,1
Em função dos resultados obtidos no teste anterior, realizou-se um segundo teste
sucessional. Assim, erlenmeyers de 500 mL contendo 150 mL de meio mínimo acrescido
de 1g/L de glicose, 1 g/L de extrato de malte, 0,1 g/L de peptona e 0,5 g/L do corante
RBBR foram inoculados inicialmente com 30 mL de inóculo de P. pulmonarius, o qual
permaneceu no meio reacional por sete dias. No sétimo dia os meios foram filtrados e
Materiais e Métodos ____________________________________________________
35
foram retiradas alíquotas do filtrado para realização das análises. Os meios foram então
autoclavados e inoculados com 30 mL de inóculo de L. edodes o qual permaneceu no
meio por mais 7 dias, sendo, então, filtrados seguindo-se o procedimento anterior.
Finalmente o meio foi inoculado com G. lucidum, seguindo o mesmo procedimento dos
isolados anteriores.
Alíquotas também foram retiradas, a cada 2 ou 3 dias de experimento, e
centrifugadas, sendo o sobrenadante utilizado para determinação da descoloração em
590nm, aumento de cor em 455nm, redução de DQO e glicose, além da atividade das
enzimas LiP, MnP e lacase.
3.2 DEGRADAÇÃO DE CORANTES REATIVOS PELA LACASE DO FUNGO
P. PULMONARIUS
3.2.1 Enzima
A Lacase preparada a partir do cultivo de P. pulmonarius foi cedida pelo
Departamento de Bioquímica da Universidade Estadual de Maringá. O procedimento de
preparação da mesma foi descrito por SOUZA & PERALTA (2003). A atividade
enzimática da solução de lacase era de 7360 U/L.
3.2.2 Corantes reativos e efluente têxtil
Além do RBBR, foram utilizados nove corantes reativos obtidos junto a uma
lavanderia local. Também foi avaliada a descoloração enzimática do efluente de um banho
de tingimento da mesma lavanderia. Realizou-se uma varredura espectrofotemétrica do
efluente e de uma solução 1 g/L de cada corante para determinar os comprimentos de onda
de máxima aborbância. Para o efluente, 665nm, 624nm, 340nm, 265nm, e 194nm foram
identificados como os comprimentos de onda de máxima absorbância. Os corantes e seus
respectivos comprimentos de onda de máxima absorbância foram: Azul BF-R: 590nm;
Azul turquesa: 663 and 625nm; Azul marinho-BLE: 590nm; Amarelo-3R: 417nm;
Amarelo-GLE: 403nm; Vermelho-4B: 542nm; Vermelho escarlate: 495nm; Preto: 496nm;
Cinza: 480 and 596nm.
Materiais e Métodos ____________________________________________________
36
3.2.3 Ensaios de descoloração enzimática
A mistura reacional utilizada para avaliar a descoloração dos corantes, com exceção
do corante Azul turquesa, consistiu de: 0,5 mL de uma solução aquosa de corante (1 g/L),
0,7 mL da solução preparada de enzima (7360 U/L) e tampão fosfato 0,1M pH 6,5 em um
volume total de 10 mL.
Como o corante azul turquesa é o principal corante presente no banho de
tingimento que gerou o efluente estudado neste trabalho, a sua concentração na mistura
reacional foi estabelecida de forma a ser semelhante a sua concentração no efluente. Desta
forma a mistura reacional utilizada na descoloração enzimática do corante Azul turquesa
consistiu de: 4,3 mL de uma solução aquosa do corante (0,0375 g/L) e 0,7 mL da solução
preparada de enzima (7360 U/L), em um total de 5 mL de mistura reacional.
Para avaliar a descoloração enzimática do efluente foi utilizada a seguinte mistura
reacional: 4,3 mL do efluente (diluído 1:2 e pH corrigido para 6,5) e 0,7 mL da solução de
enzima (7360 U/L).
Cada experimento foi realizado em duplicata, a 45ºC e 100 rpm. Para cada teste as
amostras eram retiradas em diferentes intervalos de tempo durante 4 horas (com exceção
do corante Turquesa e do efluente, cujos experimentos duraram 6 horas), para verificação
da descoloração. Iniciou-se a contagem do tempo de cada teste a partir da adição da enzima
à mistura reacional. Foram realizados experimentos controles, sem adição de enzima e sem
adição de corante ao meio reacional, nas mesmas condições dos experimentos teste.
3.3 METODOLOGIA DAS ANÁLISES REALIZADAS
Determinou-se a glicose residual do meio utilizando o Kit para glicose oxidase da
Laborclin.
A demanda química de oxigênio foi determinada de acordo com a metodologia
descrita no STANDARD METHODS – APHA (1995) que está apresentada no anexo I.
A atividade das enzimas lacase, manganês peroxidase e lignina peroxidase foi
determinada de acordo com as metodologias modificadas descritas por SOUZA et al.
(2002), RODRÍGUEZ et al. (1999) e TIEN & KIRK (1983), respectivamente. Estas
análises estão descritas no Anexo II.
Além das análises citadas acima, fez-se a varredura espectrofotométrica dos meios
de descoloração para determinar a descoloração do corante pelo fungo, assim como a
Materiais e Métodos ____________________________________________________
37
descoloração dos corantes reativos e do efluente pela enzima. Esta foi determinada em
termos de percentagem de descoloração no comprimento de onda de máxima absorbância
dos corantes e do efluente e percentagem de aumento de cor no comprimento de onda de
mínima absorbância, em relação aos experimentos controle.
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. A varredura
espectrofotométrica e as leituras de absorbância foram realizadas utilizando os
espectrofotômetros da marca Shimadzu, modelo UV-1601PC e HACH, modelo DR/2010.
O cultivo dos microrganismos e os ensaios de descoloração foram realizados em
incubadoras da marca Tecnal, modelos TE390 e TE422.
CAPÍTULO 4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 DESCOLORAÇÃO DO CORANTE REATIVO REMAZOL BRILLIANT
BLUE R (RBBR) POR FUNGOS LIGNINOLÍTICOS
No primeiro teste realizado para avaliar a descoloração do corante RBBR pelos
isolados de P. pulmonarius, L. edodes e G. lucidum, observou-se descoloração acima de
90% por P. pulmonarius e G. lucidum, enquanto o isolado de L. edodes não chegou a
descolorir 20% do corante (Fig. 4.1).
-20
0
20
40
60
80
100
P. pulmonarius L. edodes G. lucidum
% redução glicose
% redução DQO
% descoloração (590nm)
% aumento cor (455nm)
Figura 4.1 – Resultados de redução de glicose, redução de DQO, descoloração em 590nm
e aumento de cor em 455nm para os isolados P. pulmonarius, L. edodes e G. lucidum.
Resultados e Discussão ___________________________________________________
39
O consumo de glicose no presente trabalho acompanhou a descoloração do corante
por P. pulmonarius e G. lucidum, ficando entre 40 e 50%. Para L. edodes a redução de
glicose foi levemente superior à descoloração, não ultrapassando 30% de redução.
De acordo com KAPDAN et al. (2000), os fungos consomem e crescem em fontes
de carbono prontamente disponíveis nas fases inc iais de crescimento e então produzem
metabólitos secundários e enzimas extracelulares, para biodegradação de corantes em
baixas concentrações de carbono ou nitrogênio. A fonte de carbono mais prontamente
utilizada pelos fungos da podridão branca é a glicose.
Apesar de uma redução de glicose de até 50%, a redução de DQO não passou de
10% nos tubos inoculados com G. lucidum e nos meios inoculados pelos outros isolados a
redução de DQO ficou entre 5 e 7%. Isto pode ter ocorrido em função da difusão de
compostos presentes no inóculo sólido para o meio líquido. Observou-se aumento de cor
em 455 nm para os isolados que conseguiram descolorir o corante, indicando que houve
formação de um novo composto, cuja cor era visivelmente mais pronunciada neste
comprimento de onda. Os resultados foram obtidos com base nos controles, para os quais
foram utilizados discos de meio sólido sem micélio dos isolados, de forma que os valores
de descoloração obtidos não incluem a descoloração por adsorção do corante nos discos de
meio sólido.
Os resultados demonstraram a capacidade dos fungos testados em descolorir o
corante RBBR. A descoloração deste mesmo corante por L. edodes também foi verificada
por BOER et al. (2004), que avaliou a descoloração em meio sólido de sabugo de milho e
glicose e após 18 dias de incubação verificou a completa descoloração do corante pelo
fungo.
A habilidade de P. pulmonarius e L. edodes em descolororir o corante RBBR
também foi avaliada por OMORI (2004). A autora utilizou meio mínimo com celulose
como substrato e após 14 dias verificou descolorações de 40% e 30% do corante por P.
pulmonarius e L. edodes, respectivamente. Apesar da autora ter utilizado um meio
semelhante ao utilizado neste trabalho, o resultado obtido por ela utilizando o isolado de P.
pulmonarius foi inferior, o que pode significar que celulose não seja um substrato tão bom
para este fungo, quanto a glicose.
A descoloração do corante RBBR por outros fungos também foi verificada por
diversos autores. SWAMY & RAMSAY (1999) avaliaram a descoloração deste corante
por P. chrysosporium, T. versicolor e Bjerkandera sp. em meio de Kirk tamponado com
2,2’-dimetil succinato (2,2’-DMS) e sob agitação de 200 rpm. Os autores verificaram
Resultados e Discussão ___________________________________________________
40
descolorações de 65% por Bjerkandera sp., 83% pelo fungo P. chrysosporium e 100% por
T. versicolor, após 20, 11 e 1 dia de incubação, respectivamente. KASINATH et al. (2003)
avaliaram a descoloração do mesmo corante por Irpex lacteus em estado estacionário e sob
agitação. As descolorações obtidas foram de 100 e 95%, respectivamente, utilizando uma
concentração de 150 µg/mL do corante RBBR. LEVIN et al. (2004) verificaram uma
descoloração de 43% do corante RBBR (9 g/L) em meio de extrato de malte e glicose por
Corioulus versicolor f. antarcticus, após uma hora de incubação.
Com o intuito de reduzir a DQO inicial dos meios utilizados nos ensaios de
descoloração e avaliar o desempenho dos fungos em concentrações mínimas de nutrientes,
avaliou-se a descoloração de uma solução 0,5 g/L do corante RBBR sem adição de
nutrientes. Os únicos nutrientes presentes eram aqueles presentes no inóculo dos fungos.
Os resultados demonstraram que somente G. lucidum foi capaz de degradar o
corante nestas condições, atingindo mais de 90% de descoloração (Fig. 4.2). No entanto,
não houve redução de DQO do meio, o que se observou foi um aumento do valor deste
parâmetro, provavelmente devido à formação de compostos que conferiram DQO ao meio
(Fig 4.3).
0
20
40
60
80
100
5 10 15Tempo (dias)
Des
colo
raçã
o (%
)
Figura 4.2 – Descoloração de uma solução
0,5g/ de RBBR pelos isolados de P.
pulmonarius (?), L. edodes (¦ ) e G.
lucidum (? ).
-20
0
20
40
60
P. pulmonarius L. edodes G. lucidum
Red
ução
de
DQ
O (
%)
Figura 4.3 – Redução de DQO nos meios
inoculados com os isolados fúngicos.
P. pulmonarius e L. edodes não foram capazes de descolorir o corante neste meio,
no entanto, verifica-se que houve um consumo dos nutrientes presentes no meio, uma vez
que houve redução na DQO.
Estes resultados, assim como os do experimento anterior, indicaram a necessidade
de maior concentração de nutrientes no meio reacional para que ocorresse a descoloração.
Resultados e Discussão ___________________________________________________
41
A partir dos resultados deste teste, decidiu-se realizar um teste de descoloração
sucessiva do corante por G. lucidum, de forma a se obter maior descoloração. A
descoloração sucessiva foi proposta considerando que o fungo perde sua atividade de
descoloração e a adição sucessiva do isolado faria com que houvesse continuidade da
mesma.
Com a primeira inoculação de G. lucidum obteve-se uma descoloração de 75,8% do
corante no sétimo dia de experimento. No entanto, a adição sucessiva de G. lucidum do
sétimo ao décimo quarto dia não proporcionou um aumento significativo na descoloração,
de forma que, do décimo quarto ao vigésimo primeiro dia de experimento, inoculou-se o
meio com L. edodes (Fig. 4.4). Entretanto, esta mudança de fungo nos últimos dias da
sucessão também não proporcionou a continuidade na descoloração do meio com corante.
Assim, a descoloração observada ao final da sucessão foi de 78,5%, ou seja, houve
aumento de somente 2,7% na descoloração do sétimo ao vigésimo primeiro dia de
experimento.
0
20
40
60
80
100
7 14 21Tempo (dias)
% d
esco
lora
ção
(590
nm)
Figura 4.4 – Porcentagem de descoloração do corante RBBR pela sucessão de G.lucidum -
G.lucidum - L. edodes.
Analisando as concentrações de DQO e glicose durante o experimento (Fig. 4.5)
verificou-se diminuição de ambas variáveis, nos sete primeiros dias de experimento,
podendo significar que a redução na DQO do meio nestes dias ocorreu principalmente
Resultados e Discussão ___________________________________________________
42
devido ao consumo de glicose por G. lucidum. É importante salientar que ocorreu
descoloração significativa do corante neste período. O aumento da concentração de glicose
a partir do sétimo dia de experimento implica que o consumo de glicose pelos isolados
neste período foi inferior à concentração de glicose do inóculo adicionado ao meio e apesar
de ter-se verificado uma redução da DQO do décimo quarto ao vigésimo primeiro dia de
experimento o mesmo não foi verificado para a glicose, indicando a falta de atividade de L.
edodes no período.
0
200
400
600
800
1000
0 7 14 21Tempo (dias)
Con
cent
raçã
o (m
g/L)
DQO Glicose
Figura 4.5 – Concentração de DQO e glicose residual durante o experimento de sucessão
de G.lucidum - G.lucidum - L. edodes.
No experimento de sucessão fúngica verificou-se diminuição da atividade de MnP e
LiP a partir do sétimo dia de experimento e pequena atividade da enzima lacase durante o
experimento (Fig. 4. 6).
A diminuição na atividade enzimática com a adição sucessiva dos fungos pode
indicar que houve formação de compostos inibidores da atividade dos mesmos, implicando
na não continuidade da descoloração. Além disso, pode indicar a necessidade de adição de
concentrações maiores de nutrientes ao meio a ser descolorido.
Resultados e Discussão ___________________________________________________
43
0
2
4
6
8
10
12
14
0 7 14 21
Tempo (dias)
Ativ
idad
e en
zim
átic
a (U
/L)
Figura 4.6 – Atividades enzimáticas de MnP (?), LiP (? ) e lacase (¦ ) durante os
experimento de sucessão de G.lucidum - G.lucidum - L. edodes.
A sucessão de fungos lingninolíticos para a descoloração de corantes têxteis foi
recentemente avaliada por OMORI (2004). A autora utilizou a seqüência Phanerochaete
chrysosporium - P. pulmonarius - L. edodes em meio de extrato de levedura, utilizando um
tempo de contato de 15 dias de cada isolado com o meio. Uma descoloração final de 93,2%
foi verificada, sendo que desta porcentagem 75,9% foi obtida pelo isolado P.
chysosporium, 5,6% por P. pulmonarius e 11,7% por L. edodes. Apesar da autora também
não ter verificado uma grande continuidade na descoloração, os seus resultados foram
melhores que os obtidos neste trabalho. Um fator que pode ter influenciado nos melhores
resultados foi o meio utilizado pela autora em seus experimentos, mais concentrado em
nutrientes. A autora também verificou as maiores taxas de consumo de glicose e redução
de DQO durante os primeiros quinze dias de experimento.
A utilização de um meio com concentrações mínimas de nutrientes para a
descoloração do corante RBBR mostrou-se eficiente somente ao utilizar-se G. lucidum.
Desta forma, novos meios foram avaliados com intuito de se obter maiores descolorações
por P. pulmonarius, L. edodes e G. lucidum, utilizando pequenas quantidade de nutrientes.
Os resultados de descoloração obtidos para G. lucidum, P. pulmonarius e L. edodes,
utilizando meio mínimo com glicose sem diluição e diluído 1:10, 1:50 e 1:100 estão
demonstrados na Figura 4.7.
Resultados e Discussão ___________________________________________________
44
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14
Tempo (dias)
Des
colo
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o (%
)
(a)
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60
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0 2 4 6 8 10 12 14Tempo (dias)
Des
colo
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o (%
)
(b)
0
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40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14Tempo (dias)
Des
colo
raçã
o (%
)
(c)
Figura 4.7 – Descoloração do corante RBBR pelos isolados de (a) G. lucidum, (b) P.
pulmonarius e (c) L. edodes, em diferentes diluições de meio mínimo + glicose: (?) sem
diluição; (¦ ) diluído 1:10; (? ) diluído 1:50 e (x) diluído 1:100.
G. lucidum descoloriu melhor o corante em meio mínimo com glicose sem diluição.
Entretanto, a descoloração obtida no décimo quarto dia, 89%, foi menor que a obtida
anteriormente, utilizando-se apenas uma solução com 0,5 g/L de RBBR, sem adição de
nutrientes. Isto pode indicar um enfraquecimento do fungo nos cultivos com meio mínimo
com glicose e agar. Desta forma, optou-se por transferir o cultivo dos isolados para MEA.
Para P. pulmonarius a maior descoloração obtida foi 30% utilizando meio diluído a
1:50 e a 1:10. Uma descoloração muito baixa foi obtida utilizando-se meio mínimo com
glicose sem diluição, podendo indicar que o meio utilizado pode conter nutrientes
inibidores da atividade do fungo. No entanto, a baixa descoloração obtida para todos os
meios também pode indicar que este isolado necessita de outras fontes de substrato além
do carbono fornecido pela glicose.
Resultados e Discussão ___________________________________________________
45
Para L. edodes verificou-se um comportamento semelhante ao P. pulmonarius, com
relação aos meios utilizados. Para esta espécie, no entanto, a descoloração chegou a 50%
utilizando-se meio mínimo com glicose diluído a 1:50.
Meio mínimo com baixa concentração de nitrogênio também foi utilizado por
NOVOTNÝ et al. (2001) para descolorir o corante RBBR utilizando o fungo Irpex lacteus.
Após duas semanas de experimento os autores verificaram descoloração de
aproximadamente 92%, semelhante ao resultado obtido no presente trabalho utilizando G.
lucidum.
BALAN & MONTEIRO (2001) também utilizaram meio mínimo para avaliar a
descoloração do corante azul índigo (CI Vat Blue I) por Phellinus gilvus, Phanerochaete
chrysosporium, Pycnoporus sanguineus e Plerotus sajor-caju. Após quatro dias de
experimento os autores verificaram descolorações de 100%, 70-75%, 90% e 94%,
respectivamente.
Os experimentos utilizando somente meio mínimo com glicose em diferentes
diluições não forneceram resultados que indicassem o melhor meio a ser utilizado para
descoloração, principalmente, por P. pulmonarius e L. edodes. Além disso, resultados de
outros trabalhos (OMORI, 2004; LEVIN, 2004; SANTOS, 2004; HARAZONO et al.,
2003) indicaram boa descoloração de diversos corantes com meios adicionados de outros
nutrientes. Desta forma, a adição de extrato de malte e peptona ao meio mínimo foi
avaliada como alternativa para se alcançar maiores descolorações do corante pelos isolados
fúngicos.
P. pulmonarius descoloriu melhor o corante, quando se utilizou meios com maior
concentração de extrato de malte e peptona. Para estes meios, descolorações acima de 80%
foram alcançadas. Uma descoloração acima de 90% foi observada no meio contendo 1g/L
de glicose, 1 g/L de extrato de malte e 0,1 g/L de peptona. Os meios contendo somente
glicose não favoreceram a descoloração por este isolado (Fig. 4.8). Verificou-se também
que as maiores porcentagens de aumento de cor em 455 nm ocorreram nos testes nos quais
houve maior descoloração do corante, confirmando que houve degradação do corante, uma
vez que compostos com nova coloração foram formados.
Resultados semelhantes foram observados nos meios inoculados com L. edodes,
porém com porcentagens de descoloração acima de 80% para cinco dos meios utilizados.
Descolorações entre 40 e 60% foram obtidas para os meio acrescidos de 1 g/L de glicose,
0,1 g/L de glicose e 0,01 g/L de peptona (Fig. 4.9).
Resultados e Discussão ___________________________________________________
46
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Tempo (dias)
% d
esco
lora
ção
(590
nm)
-10
10
30
50
70
0 2 4 6 8 10
Tempo (dias)
% a
umen
to d
e co
r (4
55nm
)
Figura 4.8 – Resultados de descoloração do RBBR em 590nm e aumento de cor em
455nm por P. pulmonarius em meio mínimo acrescido dos nutrientes: (?) glicose 0,1 g/L;
(¦ ) glicose 1 g/L; (? ) extrato de malte 0,1 g/L; (x) extrato de malte 1g/L; (?) peptona 0,01
g/L; (?) peptona 0,1 g/L; (+)glicose 0,1 g/L, extrato de malte 0,1 g/L e peptona 0,01 g/L; (-
)glicose 1 g/L, extrato de malte 1 g/L e peptona 0,1 g/L.
0
20
40
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0 2 4 6 8 10
Tempo (dias)
% d
esco
lora
ção
(590
nm)
-100
-50
0
50
100
150
200
0 2 4 6 8 10
Tempo (dias)
% a
umen
to d
e co
r (45
5nm
)
Figura 4.9 Resultados de descoloração do RBBR em 590nm e aumento de cor em 455nm
por L. edodes em meio mínimo acrescido dos nutrientes: (?) glicose 0,1 g/L; (¦ ) glicose 1
g/L; (? ) extrato de malte 0,1 g/L; (x) extrato de malte 1 g/L; (?) peptona 0,01 g/L; (?)
peptona 0,1 g/L; (+)glicose 0,1 g/L, extrato de malte 0,1 g/L e peptona 0,01 g/L; (-)glicose
1 g/L, extrato de malte 1 g/L e peptona 0,1 g/L.
Para G. lucidum, obteve-se descolorações acima de 85%, no quinto dia de
experimento, para todos os meios testados. A maior descoloração, em torno de 96%, foi
obtida utilizando o meio com 0,1 g/L de glicose, sendo que um resultado semelhante foi
obtido utilizando o meio acrescido de 1 g/L de extrato de malte. Descolorações em torno
Resultados e Discussão ___________________________________________________
47
de 93% foram obtidas para os meios acrescidos de 0,1 g/L de extrato de malte, 0,01 g/L de
peptona, 0,1 g/L de peptona, 0,1 g/L de glicose, 0,1 g/L de extrato de malte e 0,01 g/L de
peptona e para o meio acrescido de 1 g/L de glicose, 1 g/L de extrato de malte e 0,1 g/L de
peptona. A menor descoloração, 85%, foi verificada utilizando o meio acrescido de 1g/L
de glicose (Fig. 4.10).
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10Tempo (dias)
% d
esco
lora
ção
(590
nm)
-40
-20
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Tempo (dias)
% a
umen
to d
e co
r (4
55nm
)
Figura 4.10 – Resultados de descoloração do RBBR em 590nm e aumento de cor em
455nm por G. lucidum em meio mínimo acrescido dos nutrientes: (?) glicose 0,1 g/L; (¦ )
glicose 1 g/L; (? ) extrato de malte 0,1 g/L; (x) extrato de malte 1 g/L; (?) peptona 0,01
g/L; (?) peptona 0,1 g/L; (+)glicose 0,1 g/L, extrato de malte 0,1 g/L e peptona 0,01 g/L; (-
)glicose 1 g/L, extrato de malte 1 g/L e peptona 0,1 g/L.
Culturas ligninolíticas de vários fungos da podridão-branca têm sido citadas por sua
capacidade de degradação e descoloração de corantes. Entretanto, espera-se que nem todos
os fungos apresentem a mesma habilidade para degradar e descolorir corantes devido às
suas diferentes necessidades qualitativas e quantitativas para produzir enzimas. As
características genéticas das espécies e/ou isolados, o pH, a oxigenação, a temperatura e a
presença de nitrogênio e minerais interferem na produção de enzimas e na atividade
enzimática. A habilidade de descoloração dos fungos também depende da estrutura dos
corantes (WESEMBERG et al., 2003; FU & VIRARAGHAVAN, 2001; BALAN, 1998).
OMORI (2004) avaliou a descoloração de RBBR em três diferentes meios: meio
mínimo com celulose, batata dextrose e extrato de levedura modificado, por P.
chrysosporium, L. edodes e P. pulmonarius. As maiores taxas de descoloração por P.
chrysosporium e P. pulmonarius foram verificadas utilizando o meio de extrato de
Resultados e Discussão ___________________________________________________
48
levedura modificado, no entanto para L. edodes a maior descoloração foi observada
utilizando meio mínimo com celulose.
Extrato de malte foi utilizado por HARAZONO et al. (2003), para testar a
descoloração do corante vermelho reativo 120 por Phanerochaete sordida. Os autores
utilizaram um meio reacional contendo 3% de extrato de malte e 200 mg/L do corante.
Após 7 dias de experimento os autores verificaram descoloração de 90,6%.
EICHLEROVÁ et al. (2005) recentemente avaliaram a descoloração do corante
RBBR em meio de Kirk, enr iquecido e limitado em nitrogênio, em condições estáticas e
sob agitação, por D. squalens, I. resinosum e P. calyptratus. Após 14 dias de tratamento,
descolorações semelhantes e próximas a 98% foram obtidas sob todas as condições
testadas para I. resinosum. Utilizando D. squalens melhores resultados foram obtidos em
cultura estática com meio enriquecido de nitrogênio. P. calyptratus foi o que apresentou
menores porcentagens de descoloração sendo o melhor resultado (78%), obtido em
condições estáticas com meio limitado em nitrogênio.
SELVAM et al. (2003) investigaram a descoloração dos corantes: Alaranjado G,
vermelho congo e preto amido 10B em meio limitado em carbono por Thelephora sp. Os
autores verificaram que o fungo descoloriu 33,3% do corante Alaranjado G após 9 dias,
97% do corante vermelho congo após 8 horas e 98,8% do corante Preto amido 10 B após
24 horas.
No presente trabalho, os resultados obtidos mostraram que P. pulmonarius e L.
edodes requerem meios mais ricos em substratos além do carbono, enquanto G. lucidum
mostrou ser capaz de descolorir o corante mesmo em meio acrescido apenas de 0,1 g/L de
glicose. Em função destes resultados, um novo teste sucessional foi proposto utilizando-se
meio mínimo acrescido de 1 g/L de glicose, 1 g/L de extrato de malte e 0,1 g/L de peptona.
O processo de descoloração foi iniciado por P. pulmonarius, uma vez que este isolado
requer maior quantidade de nutrientes, seguido por L. edodes, considerando períodos de
incubação de 7 dias. Supondo que após 14 dias de experimento parte dos nutrientes já teria
sido consumido pelos isolados, completou-se a sucessão inoculando-se o meio com G.
lucidum, o qual mostrou-se capaz de descolorir o corante na presença de baixas
concentrações de nutrientes.
Ao final do sétimo dia de experimento, verificou-se descoloração de 70% por P.
pulmonarius. No entanto, após a autoclavagem do meio e inoculação fungo L. edodes
verificou-se descoloração de apenas 56% no mesmo dia, sugerindo que pode ter ocorrido
alguma reação durante a autoclavagem provocando este aumento de cor. Nos dias que
Resultados e Discussão ___________________________________________________
49
seguiram não se verificou significativa descoloração por L. edodes, sendo que no décimo
quarto dia de experimento observou-se uma descoloração de 58%. Neste dia, fez-se nova
autoclavagem e inoculando G. lucidum. Verificou-se aumento na descoloração de 11%
após sete dias de incubação, sendo que a descoloração final foi de 69% (Fig. 4.11).
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
0 5 10 15 20
Tempo (dias)
% d
esco
lora
ção
e au
men
to d
e co
r
Figura 4.11 – Porcentagem de descoloração em 590nm (x) e de aumento de cor em 455nm
(? ) durante o experimento de adição sucessiva de P. pulmonarius, L. edodes e G. lucidum.
Assim, como no teste anterior, não foi verificada continuidade significativa na
descoloração do corante a partir da sucessão dos fungos ligninolíticos, o que confirma a
afirmação de OMORI (2004), de que nem sempre a degradação do meio por um
determinado fungo torna-o mais acessível para a ação de outro, mesmo pertencendo ao
mesmo grupo.
Além disso, a descoloração obtida utilizando-se P. pulmonarius, nos sete primeiros
dias de experimento, foi inferior à descoloração por este fungo, verificada anteriormente
utilizando-se este mesmo meio de cultura. Um fator que pode ter influenciado é a
quantidade de meio a ser descolorido, que para este teste foi de 150 mL, 15 vezes maior
que para os testes com diferentes meios (10 mL). Uma vez que os testes foram
desenvolvidos em condições estáticas, acredita-se que com esta quantidade maior de meio
tenha havido dificuldade de difusão do fungo e de suas enzimas em todo o volume do
mesmo.
Resultados e Discussão ___________________________________________________
50
Com relação à demanda química de oxigênio durante o experimento, verificou-se
redução considerável da mesma em relação à concentração inicial. Esta redução de DQO
está relacionada ao consumo de glicose somente nos sete primeiros dias de experimento,
uma vez que a partir do sétimo dia não houve redução de glicose (Fig. 4.12).
0
500
1000
1500
2000
2500
0 3 6 9 12 15 18 21
Tempo (dias)
Con
cent
raçã
o (m
g/L
)
DQO GLICOSE
Figura 4.12 – Concentração de DQO e glicose residual durante o experimento de adição
sucessiva dos fungos P. pulmonarius - L. edodes - G. lucidum.
As atividades de Lignina peroxidase (LiP), Manganês peroxidase (MnP) e Lacase
também foram acompanhadas durante o experimento (Fig. 4.13). A máxima atividade
verificada foi de MnP, 47 U/L, no sétimo dia de experimento, diminuindo nos dias
subseqüentes. Atividade de lacase somente foi verificada nos dias de experimento com P.
pulmonarius. Atividade de LiP foi verificada nos dias de experimento com L. edodes e G.
lucidum.
BOER et al. (2003) também acompanharam a atividade destas três enzimas durante
experimentos de descoloração dos corantes RBBR e Poly R478 por Lentinus edodes. As
autoras verificaram grande quantidade de MnP no extrato não purificado do fungo,
enquanto quantidades muito baixas de LiP e lacase foram detectadas no material.
Nos dois testes sucessionais realizados neste trabalho verificou-se decaimento das
atividades enzimáticas de MnP e LiP durante os dias de inoculação de L. edodes ao meio
reacional. No entanto, para os dois experimentos foi verificada uma atividade de MnP
superior a 7 U/L, chegando próximo a 20 U/L no terceiro dia de inoculação deste fungo, no
Resultados e Discussão ___________________________________________________
51
segundo teste sucessional. A atividade de LiP produzida por L. edodes no primeiro teste
sucessional apresentou-se menor que de MnP, no entanto, no segundo teste sucessional a
produção de LiP foi semelhante à de MnP no terceiro e quinto dias após a inoculação desta
espécie, e apresentou-se superior no sétimo dia após a inoculação do mesmo. Estes
resultados indicam a influência dos nutrientes do meio na produção das enzimas.
0
10
20
30
40
50
0 5 10 15 20
Tempo (dias)
Ativ
idad
e en
zim
átic
a (U
/L)
Figura 4.13 – Atividades enzimáticas de MnP (?), LiP (x) e lacase (? ) durante o
experimento de adição sucessiva dos fungos P. pulmonarius - L. edodes - G. lucidum.
OKINO (1996), citado por BALAN (1998), estudou a atividade ligninolítica de
basidiomicetos brasileiros, apontando a existência de atividade da lacase e peroxidase em
Phellinus gilvus CCB254, Pleurotus ostreatoroseus CCB440, Pleurotus sp e Picnoporus
sanguineus CCB277 e CCB458. A atividade de lacase foi detectada no início do
crescimento, podendo estar relacionada com o metabolismo primário.
De acordo com LANG et al. (1997), Pleurotus sp tem alta atividade de MnP e
lacase em meio enriquecido de glicose. No presente trabalho foi possível verificar este
comportamento utilizando-se P. pulmonarius, que apresentou alta atividade de MnP e
lacase principalmente no sétimo dia após a inoculação do mesmo. Atividade de LiP
também foi verificada nos primeiros dias de inoculação deste fungo.
Resultados e Discussão ___________________________________________________
52
4.2 DEGRADAÇÃO DE CORANTES REATIVOS PELA LACASE DE P.
PULMONARIUS
A degradação de 10 corantes reativos, e de um efluente de lavanderia, pela lacase
de P. pulmonarius foi acompanhada por meio de espectrofotometria, durante 4 ou 6 horas
de experimento, dependendo do corante.
Todos os corantes foram descoloridos em alguma extensão pela lacase (Figura 4.14).
No entanto, os resultados de descoloração para os corantes vermelho escarlate, vermelho
4b, amarelo 3r e cinza (em 480 nm) foram inferiores a 20%, o que pode ser devido às
diferenças estruturais, com relação a seus grupos cromóforos.
0
20
40
60
80
100
0 60 120 180 240
Tempo (h)
Des
colo
raçã
o (%
)
0
4
8
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16
20
0 60 120 180 240
Tempo (h)
Des
colo
raçã
o (%
)
Figura 4.14 – Descoloração enzimática, via lacase de P. pulmonarius, dos corantes
reativos: (?) cinza (596nm), (-) preto (596nm), (?) Azul BF-R (590nm), (+) RBBR
(590nm), (x) Amarelo GLE (403nm), (?) Azul Marinho (590nm), (¦ ) amarelo 3r (417nm),
(?) vermelho 4B (542nm), (? ) vermelho escarlate (495nm) e (?) cinza (480nm).
SANTOS (2004) avaliou a descoloração dos mesmos corantes por P. pulmonarius e
também verificou que todos foram descoloridos em alguma extensão pelo fungo. No
entanto, as porcentagens de descoloração verificadas pela autora variaram entre 47% e
98%. As menores taxas de descoloração, 47 e 60%, verificadas para os corantes vermelho
4b e amarelo 3r, apresentaram-se superiores aos resultados obtidos no presente trabalho
utilizando a enzima lacase do mesmo fungo. Isto ocorreu, muito provavelmente porque,
quando o fungo está presente no meio de descoloração, outras enzimas e produtos do
metabolismo, como mediadores, podem contribuir para o processo de descoloração. No
Resultados e Discussão ___________________________________________________
53
entanto, apesar dos resultados obtidos no presente trabalho utilizando a lacase do fungo P.
pulmonarius terem-se apresentado inferiores aos resultados obtidos por SANTOS (2004),
um fator muito importante pode ser considerado quando se trata de tratamento de efluentes,
o tempo utilizado no processo, que no caso da utilização da enzima variou entre 4h e 6h,
enquanto que para a descoloração pelo fungo P. pulmonarius o tempo de incubação foi de
7 dias.
De acordo com PERALTA-ZAMORA et al. (2003), a lacase isolada tem um efeito
limitado na biorremediação devido à sua especificidade por subunidades fenólicas da
lignina. No entanto, a gama de substratos da lacase pode ser extendida a partir da inclusão
de mediadores, como 1-hydroxybenzotriole (HOBT). Apesar dos autores afirmarem que a
descoloração de corantes não-substratos é limitada pela concentração de compostos
mediadores mais do que pela atividade de lacase na solução, corantes têxteis comerciais
triarilmetanos, antraquinones e índigos foram eficientemente descolororidos pela enzima
preparada a partir de vários fungos. A lacase não purificada de Pleurotus ostreatus, por
exemplo, foi utilizada por HOU et al. (2003) para descolorir o corante antraquinonico
SN4R. Os autores verificaram uma descoloração de 66% após 10 horas de incubação a
50ºC e utilizando tampão acetato (20mM) pH 4.5.
ZHANG et al. (2005) também utilizaram a lacase de Panus rudis para descolorir três
corantes. O corante antaquinonico Verde ácido 27 foi descolorido pela enzima em 40%
após 0,5 h utilizando 0,005 mg/mL da proteína e em 74% após 0,5 h utilizando 0,016
mg/mLl da proteína, de forma que a descoloração foi proporcional à concentração de
enzima. Quando uma concentração de enzima de 1,7 µg/mL foi utilizada os autores
verificaram descolorações de 26 e 12% para os corantes Violeta ácido 27 e Índigo Carimne
respectivamente. No entanto na presença do mediador ABTS (16,7 µM), apenas 0,005
µg/mL da enzima foi necessária para descolorir os corantes em 47% e 81%, em 0,5 h de
experimento.
PODGORNIK et al. (2001) avaliaram a descoloração do corante Índigo Carmine
pelas isoenzimas LiP e MnP de Phanerochaete chrysosporium e verificaram que o corante
foi descolorido, em uma grande extensão, pelas enzimas após 2 horas de experimento.
A lacase não purificada preparada a partir de P. ostreatus também foi utilizada por
PALMIERI et al. (2005) para descolorir o corante Remazol Brilliant Blue R (RBBR). Os
autores obtiveram descoloração máxima de 70% em 1 h, sob condições de 20ºC na
presença de 20 ou 100 U/mLda enzima.
Resultados e Discussão ___________________________________________________
54
SOARES et al. (2001) estudaram a descoloração do corante RBBR por uma
formulação comercial de lacase (CLF), contendo lacase, um mediador redox e um
surfactante não iônico, e pela lacase isolada. Os autores verificaram que um mediador
redox de baixo peso molecular (HBT) foi necessário para a descoloração total ocorrer após
duas horas. A lacase isolada não descoloriu o corante RBBR.
PERALTA-ZAMORA et al. (2003) avaliaram a descoloração de quatro corantes
reativos (Remazol brilliante Blue R, Remazol Black B, Reactive orange 122 e Reactive
Red 251), por lacase livre e imobilizada produzida por Trametes versicolor. Os melhores
resultados da descoloração foram obtidos utilizando lacase imobilizada. Em 30 minutos, a
descoloração dos corantes RBBR e Reactive orange 122 pela lacase, a qual foi imobilizada
em sílica de imidazol modificado, foi de aproximadamente 45% para ambos os corantes.
Os autores também estudaram o efeito da utilização de HOBT como mediador e nenhuma
mudança significativa foi verificada. A máxima descoloração observada foi de 55% para o
corante Reactive orange 122. Para o corante RBBR, a descoloração foi de 45%.
Enzimas ligninolíticas (LiP, MnP e lacase) de Thelephora sp. foram avaliadas por
SELVAN et al. (2003) quanto à descoloração dos corantes Alaranjado G, vermelho congo
e preto amido 10B. A lacase (15 U/mL) apresentou as maiores degradações dos corantes,
19%, 12% e 15%, respectivamente.
Comparando os resultados de outros autores na descoloração do corante RBBR pela
enzima lacase com o resultado obtido no presente trabalho, observa-se que todos os autores
obtiveram menores descolorações do corante utilizando a enzima livre sem adição de
mediadores ao meio reacional. Melhores resultados foram obtidos somente quando
mediadores foram adicionados ao meio reacional.
Os resultados da descoloração enzimática do efluente e do corante Azul turquesa
estão apresentados na figura 4.15. A máxima descoloração obtida foi de 40% para o
efluente no comprimento de onda de 663 nm. Para o corante azul turquesa obteve-se uma
maior descoloração no comprimento de onda de 625 nm atingindo 35% de descoloração.
Segundo BRAILE & CAVALCANTI (1993), os despejos gerados pela indústria
têxtil possuem diversos compostos orgânicos e inorgânicos, sendo que muitos deles
apresentam propriedades que os tornam difíceis de serem biodegradados. Apesar disto, a
enzima lacase de Pleurotus pulmonarius, mostrou-se eficiente na degradação de um
efluente têxtil uma vez que uma descoloração de 40% foi observada utilizando-se esta
enzima.
Resultados e Discussão ___________________________________________________
55
-10
0
10
20
30
40
0 60 120 180 240 300 360
Tempo (min)
Des
colo
raçã
o (%
)
Figura 4.15 – Descoloração enzimática, via lacase de P. pulmoraius, de: (?) efluente em
625nm; (¦ ) efluente em 663nm; (?) azul turquesa em 625nm e (?) azul turquesa em
663nm.
SANTOS (2004) também avaliou a descoloração do mesmo efluente utilizado neste
trabalho por P. pulmonarius. Após 5 dias de incubação a autora obteve 68,72% da
descoloração do efluente, utilizando agitação de 50 rpm e 50% v/v de inóculo. Apesar do
experimento ter tido duração de 5 dias, bastante superior ao tempo utilizado em nosso
experimento com lacase de P. pulmonarius (6h), os resultados obtidos pela autora foram
sensivelmente maiores.
SELVAN et al. (2003) avaliaram a descoloração de um efluente de indústria de
corantes pela cultura de Theleophora sp. e por suas enzimas ligninolíticas purificadas. O
fungo removeu 61% da cor do efluente no terceiro dia de incubação em modo batelada,
enquanto que em modo contínuo uma descoloração máxima de 50% foi obtida no sétimo
dia. Utilizando as enzimas MnP, LiP e lacase purificadas de Theleophora sp. os autores
observaram descolorações do efluente de aproximadamente 10, 14 e 17%,
respectivamente, após 1h de incubação a 37ºC e utilizando enzimas com atividade de 15
U/mL.
Apesar do resultado obtido neste trabalho, utilizando-se lacase de P. pulmonarius
para descolorir um efluente têxtil, mostrar-se melhor que o obtido por SELVAN et al.
(2003), melhores condições devem ser estudadas de forma a se obter a completa
descoloração do efluente pela enzima. Um parâmetro a ser avaliado é a utilização de
compostos mediadores da enzima lacase nos experimentos de descoloração do efluente.
CAPÍTULO 5
CONCLUSÕES
Os resultados de descolorações do corante RBBR por P. pulmonarius, L. edodes e
G. lucidum demonstraram que todos são capazes de descolorir o corante, sendo que dentre
estas três espécies o G. lucidum apresentou maior desempenho na descoloração. Os
experimentos também mostraram que as percentagens de descoloração são dependentes do
meio de cultura utilizado.
P. pulmonarius e L. edodes mostraram-se mais eficientes na descoloração quando
se utilizaram meios com outras fontes de nutrientes além do carbono (no caso glicose). Por
outro lado, G. lucidum mostrou-se capaz de descolorir o corante em meio de cultura com
pequena quantidade de glicose.
A remoção de DQO, avaliada durante os experimentos, não acompanhou a
degradação do corante. Em alguns casos, a mesma aumentou durante o processo de
descoloração pelos fungos.
As sucessões de fungos mostraram que não houve continuidade na descoloração do
corante, confirmando a idéia de que nem sempre o produto da degradação do corante por
um fungo seja mais facilmente degradado por outro fungo. Além disso, foi possível
verificar que os compostos formados pela degradação do corante por um isolado fúngico
podem provocar inibição da degradação pelos demais fungos.
A lacase de P. pulmonarius mostrou-se capaz de descolorir todos os corantes
avaliados e o efluente têxtil. Os corantes Azul BF-R, RBBR e Azul Marinho foram
degradados em mais de 70% pela enzima. A descoloração dos outros corantes ficou abaixo
de 60%.
Apesar do efluente têxtil possuir diversos compostos orgânicos e inorgânicos, além
do corante, a enzima lacase foi capaz de descolorir este efluente em 40%. Esta
Conclusões _____________________________________________________________
57
descoloração foi superior à obtida para o corante azul turquesa, principal corante presente
no efluente. Isto demonstra o grande potencial de aplicação desta enzima no tratamento
deste tipo de efluente, desde que novas condições de utilização da mesma sejam avaliadas
para que maiores taxas de descoloração sejam alcançadas.
CAPÍTULO 6
PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS
Os resultados obtidos neste trabalho deixam em aberto vários pontos que podem ser
melhor elucidados. A seguir são apresentadas algumas sugestões para dar continuidade à
pesquisa, a fim de esclarecer estes pontos e viabilizar a aplicação de fungos liginolíticos
em processos de tratamento de efluentes:
??Avaliar a descoloração de efluentes têxteis por Ganoderma lucidum uma vez
que este se mostrou muito eficiente na descoloração do corante RBBr em
diferentes meios de cultivo, inclusive em meios com escassez de nutrientes;
??Caracterizar os produtos e os intermediários formados, por meio de
cromatografia líquida-espectro de massa, durante o processo de descoloração de
corantes e efluentes têxteis;
??Avaliar a descoloração seqüencial de corantes e efluentes têxteis pelos fungos
utilizando agitação para maior homogeneização da mistura reacional e
eficiência na descoloração;
??Avaliar diferentes condições de utilização da enzima lacase, como a utilização
da enzima imobilizada e a utilização de compostos mediadores;
??Avaliar a descoloração de corantes por fungos ligninolíticos, e pelas enzimas
purificadas dos mesmos, em escala semi-piloto, considerando os custos do
processo.
CAPÍTULO 7
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ANEXOS
ANEXO I - DETERMINAÇÃO DE DEMANDA QUÍMICA DE OXIGÊNIO POR
MICRO MÉTODO (APHA, 1995)
Reagentes
a) Solução Oxidante:
Dissolver em 500 mL de água destilada 10,216 g de K2Cr2O7, previamente seco à
1030C por 2 h, 33,3 g de HgSO4 e adicionar 167 mL de H2SO4 concentrado. Dissolver,
esperar esfriar e após, completar o volume de 1000 mL com água destilada.
b) Solução Catalítica
Dissolver 10 gramas de Sulfato de Prata (Ag2SO4) em 1 litro de ácido Sulfúrico
(H2SO4) concentrado.
c) Solução padrão
Pesar 0,8509 g de Biftalato de Potássio P.A. (C8H5KO4) seco em estufa à 1000C por
2 horas e dissolver em água destilada, logo após completar o volume a 1000 mL. Esta
solução corresponde a uma concentração de 1000 mg de O2 / L.
Procedimento:
Anexos ________________________________________________________________
66
Preparação da curva de calibração:
Preparar uma série de soluções padrões de 100 a 700 mg de O2/L a partir da solução
padrão de acordo com a Tabela 1.
Tabela 1 - Série de soluções padrões de 100 a 700 mg de O2/L a partir da
solução padrão
Volume da solução padrão a
elevar a 100 mL
Concentração (mg de O2 / L)
10 100
20 200
30 300
40 400
50 500
60 600
70 700
Conhecida a concentração de oxigênio a ser oxidado em cada amostra, fazer o
procedimento abaixo para cada solução e determinar a absorbância para solução e construir
uma reta de calibração. O branco é preparado substituindo-se a amostra por água destilada.
Determinação da DQO:
Colocar em tubos de oxidação 1,5 mL de solução oxidante; 2,5 mL da amostra
(DQO menor que 600 mg de O2 / L); 3,5 mL de solução catálise. Fechar e agitar. Colocar
no reator (COD – REACTOR HACH) à 1500C durante duas horas. Ler a absorbância a 620
nm após ligeiro resfriamento. Ler a curva de calibração e determinar a concentração de
oxigênio necessário para oxidar a amostra.
Obs.: Se a amostra contiver íons Cl-, a leitura deve ser realizada a quente, pois os
íons Cl- precipitam com a prata, a frio, interferindo na leitura.
Anexos ________________________________________________________________
67
ANEXO II - DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Lignina peroxidase
A atividade da lignina peroxidase (LiP) foi determinada pela oxidação do álcool
veratrílico a aldeído veratrílico (?310 = 9 300 M-1cm-1), a 37oC, segundo metodologia
modificada de TIEN & KIRK (1983). A mistura reacional foi composta de 0,50 mL de
meio de cultivo filtrado, 0,75 mL de tampão tartarato de sódio 0,5 mM pH 3,0, 0,25 mL de
álcool veratrílico 4 mM, 0,10 mL de peróxido de hidrogênio 10 mM. O aparecimento do
aldeído veratrílico foi determinado por meio da leitura de absorbância após 5 minutos em
310 nm. Utilizou-se como branco, para leitura de absorbância, o mesmo meio reacional
contendo meio de cultivo fervido por 15 minutos. Uma unidade de LiP correspondeu à
quantidade da enzima que oxidou 1,0 µmol de álcool veratrílico por minuto e por mL de
meio de cultivo.
Manganês peroxidase
A atividade da enzima manganês peroxidase foi determinada, segundo metodologia
modificada de RODRÍGUEZ et al. (1999), pela oxidação de sulfato de manganês, a
temperatura ambiente. O meio reacional continha 0,60 mL de tampão malonato de sódio
50 mM pH 4,5, 1,20 mL de meio de cultivo filtrado, 0,60 mL de sulfato de manganês 4,5
mM e 0,30 peróxido de hidrogênio 9 mM. A absorbância foi medida após 5 minutos em
270 nm. Utilizou-se como branco, para leitura de absorbância, o mesmo meio reacional
contendo meio de cultivo fervido por 15 minutos. Uma unidade de MnP correspondeu à
quantidade da enzima que oxidou 1,0 µmol de sulfato de manganês por minuto e por mL
de meio de cultivo (?270 = 11 590 M-1cm-1).
Lacase
A atividade da lacase foi determinada, segundo metodologia modificada de
SOUZA et al. (2002), pela oxidação de siringaldazina a sua forma quinona (?525 = 65 000
M-1cm-1), a 50oC, em meio reacional contendo 1,40 mL de tampão fosfato de potássio 0,1
mM pH 6,5, 0,20 mL de siringaldazina 0,5 mM (em etanol 100%) e 0,20 mL de meio de
Anexos ________________________________________________________________
68
cultivo filtrado. Após 5 minutos, mediu-se a absorbância em 252 nm. Utilizou-se como
branco, para leitura de absorbância, o mesmo meio reacional contendo meio de cultivo
fervido por 15 minutos. Uma unidade de lacase correspondeu à quantidade da enzima que
oxidou 1,0 µmol de siringaldazina por minuto e por mL de meio de cultivo.
Cálculo da atividade enzimática
Uma unidade enzimática foi definida como a quantidade de enzima capaz de oxidar
1,0 µmol de substrato por minuto e por L de meio de cultivo filtrado, de acordo com a
equação II.1.
(Eq. II.1)
? Abs = diferença entre a leitura de absorbância do meio reacional contendo enzima
ativa e o branco.
? = comprimento de onda de máxima absorbância do produto resultante da
oxidação do substrato
Va = volume da amostra (mL)
Vt = volume total do meio reacional (mL)
d = fator de diluição
e = absortividade molar do produto resultante da oxidação do substrato (M-1cm-1)
I = caminho óptico (cm)
t = tempo de reação (min)
610**)/(tIVdVAbsLUAtividade
a
t
??????
?
?
?
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