HIV BLOT 2.2TESTE WESTERN BLOT

Observação: alteraçõesrealçadas.

(kit de 18 testes) : 11030-018(kit de 36 testes) : 11030-036

O MP Diagnostics (MPD) HIV BLOT 2.2 é um imunoensaioqualitativo para a detecção in vitro de anticorpos contra o vírusda imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) e tipo 2 (HIV-2) nosoro e plasma humanos. Destina-se a ser usado como um testecomplementar mais específico para amostras de soro ouplasma humanos que apresentaram resultados repetidamentereativos por procedimentos de triagem ou rastreamento, comoos testes imunoenzimáticos ELISA.

Existem vários testes de triagem ou rastreamento para adetecção de anticorpos tanto contra o HIV-1 como contra oHIV-2, os agentes etiológicos da síndrome da imunodeficiênciaadquirida (AIDS). Esses testes podem ser extremamentesensíveis porém menos específicos, levando a interpretaçõesfalso positivas. Por isso, são necessários testes independentescomplementares de especificidade elevada para confirmar apresença de anticorpos contra o HIV-1 e/ou HIV-2.

O kit HIV BLOT 2.2 da MP Diagnostics foi concebido paraser usado como teste complementar mais específico paraamostras de soro ou plasma humanos que apresentaramresultados repetidamente reativos pelo teste de ELISA.Antígenos virais específicos do HIV-1 separados e incorporadosem fitas por procedimentos eletroforéticos seguidos deeletrotransferência, combinados na mesma fita com umpeptídeo sintético específico do HIV-2, permitem observarmelhor as respostas mediadas por anticorpos para proteínasvirais específicas. Cada fita inclui também um controle internode adição de amostra para minimizar o risco de falso-negativosprovocados por erros operacionais e para assegurar a adiçãode amostras.

Os símbolos gráficos usados ou encontrados nos produtos eembalagens MP Diagnostics estão indicados a seguir. Estessão os símbolos mais comuns em dispositivos médicos erespectivas embalagens. Estes símbolos são explicados commais detalhes no British and European Standard BS EN 980:2003.

Usar atéSinônimos:Data de Validade

Código do loteSinônimos:Número do loteCódigo da remessa

Limites detemperatura

Fabricante

Contém o suficientepara <n> testes

Não reutilize

As fitas de nitrocelulose são incorporadas com proteínasantigênicas separadas e fixadas do HIV-1, parcialmentepurificado e inativado, por procedimentos de transferência(blotting) eletroforética e nas mesmas fitas incorpora-se umpeptídeo sintético específico do HIV-2. Cada fita de nitroceluloseé incubada com soro ou plasma diluídos e controles. Osanticorpos específicos contra o HIV-1 e HIV-2, caso estejampresentes nas amostras, vão fixar-se às proteínas do HIV-1 eao peptídeo do HIV-2 nas fitas. As fitas são lavadas pararemover o material não fixados. Os anticorpos que se fixam,especificamente às proteínas do HIV, podem ser visualizadospor uma série de reações que envolvem o uso de anticorpocaprino anti-IgG humana conjugado à fosfatase alcalina e dosubstrato BCIP/NBT. Este método é suficientemente sensívelpara detectar quantidades mínimas de anticorpos específicoscontra o HIV no soro ou plasma.

Descrição do Componente QuantidadeFornecida

FITAS DE NITROCELULOSEIncorporadas com lisado deHIV-1, com peptídeoespecífico do envoltório doHIV-2 e com uma banda decontrole de adição de soro.Mantenha seco e ao abrigo daluz.

NOME E APLICAÇÃO

INTRODUÇÃO

COMPONENTES DO KIT

PRINCÍPIOS QUÍMICOS E BIOLÓGICOS DOPROCEDIMENTO

1

DESCRIÇÃO DE SÍMBOLOS USADOS

Dispositivomédicopara diagnósticoin vitro

Número decatálogo

Atenção.Ver Instruçõesde Uso

RepresentanteAutorizado naComunidadeEuropéia

Consulte asinstruções de uso

Disponívelem 18 ou

36 fitas

DATA DE REVISÃO: 05/05MAE 0011-BRA-0

0123

CONTROLE NÃO-REATIVOSoro humano normalinativado, não reativo paraantígenos superficiais dehepatite B (HBsAg), nem paraanticorpos contra HIV-1/2 eHCV. Contém azida sódica etiomersal como conservantes.

CONTROLE REATIVOFORTESoro humano inativadocontendo título elevado deanticorpos contra HIV-1 e HIV-2, e não reativo para HBsAgnem para anticorpos contraHCV. Contém azida sódica etiomersal como conservantes.

CONTROLE REATIVOFRACOSoro humano inativado quecontém título baixo deanticorpos APENAS contraHIV-1 e não reativo paraHBsAg e anticorpos contraHIV-2 e HCV. Contém azidasódica e timerosal comoconservantes.

SOLUÇÃO-TAMPÃOESTOQUE CONCENTRADA(10x)Solução-tampão Tris com sorocaprino normal inativado pelocalor. Contém timerosal comoconservante.

SOLUÇÃO-TAMPÃO DELAVAGEM CONCENTRADA(20x)Tris com Tween-20. Contémtimerosal como conservante.

CONJUGADOAnticorpo caprino anti-IgGhumana conjugado à fosfatasealcalina. Contém azida sódicacomo conservante.

SUBSTRATOSolução de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) e azul denitrotetrazólio (NBT).

PÓ PARA BLOTTINGLeite desnatado em pó

Bandejas de incubação,9 poços cada

Manual de Instruçõesl

Pinça

Nota: O volume de reagentes fornecido é suficiente para 4processamentos.

1. Para uso exclusivo em diagnóstico in vitro.2. Exclusivamente para uso profissional.3. Solicitamos consultar a documentação dos produtos para

informações sobre componentes potencialmenteperigosos.

INFORMAÇÕES DE SAÚDE E SEGURANÇA

CUIDADO: Este kit contém material de origemhumana. Nenhum método de teste pode oferecergarantia total que os produtos de sangue humanonão transmitam infecções.

MANUSEIE AS AMOSTRAS ASSIM COMO OS CONTROLESREATIVOS FORTES, REATIVOS FRACOS E OSCONTROLES NÃO REATIVOS COMO AGENTESPOTENCIALMENTE INFECCIOSOS. Recomenda-se que oscomponentes e as amostras do teste sejam manuseados deacordo com as boas práticas de laboratório. O descarte deveráser realizado de acordo com procedimentos de segurançavigentes.

O Controle Reativo Forte, o Controle Reativo Fraco e oControle Não Reativo contêm timerosal e azida sódica,enquanto a Solução-Tampão Estoque Concentrada e aSolução-Tampão de Lavagem Concentrada contêm timerosale o Conjugado contém azida sódica. A azida sódica pode reagircom o cobre e o chumbo usados em alguns sistemas decanalização formando sais explosivos. Embora as quantidadesusadas neste kit sejam pequenas, o descarte de materiaiscontendo azida deve ser feito por lavagem com volumesrelativamente altos de água de forma a evitar a formação deazida metálica no sistema de canalização. As frases de risco(R) pertinentes são:

R22 Nocivo se ingerido.

O Substrato contém 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato e azulde nitrotetrazólio, classificado pelas Diretivas da ComunidadeEconômica Européia (CEE) aplicáveis como nocivo (Xn). Asfrases de risco (R) pertinentes são:

R20/21/22 Nocivo por inalação, em contato com a pele e emcaso de ingestão.

1. Evite a contaminação microbiana dos reagentes ao abrire retirar alíquotas dos frascos originais.

2. Não pipete com a boca.3. Manuseie as amostras de testes, as fitas de nitrocelulose

e os Controles Reativos, Fracos e Não Reativos comoagentes potencialmente infecciosos.

4. Use vestuário de laboratório e luvas descartáveis durantea realização do teste. Descarte as luvas em sacos plásticospara lixo biológico perigoso. A seguir, lave bem as mãos.

5. É altamente recomendável que este teste seja realizadonuma câmara adequada para material biológico perigoso.

6. Mantenha todo o material longe de alimentos e bebidas.7. Em caso de acidente ou contato com os olhos, lave

imediatamente com água em abundância e procure ajudamédica.

8. Consulte imediatamente um médico caso ocorra ingestãode materiais contaminados ou contato destes com feridasabertas, ou outras soluções de continuidade da pele.

AVISOS E PRECAUÇÕES

2

1 frasco(80 Øl)

1 frasco(80 Øl)

1 frasco(20 ml)

1 frasco(70 ml)

1 frasco(120 Øl)

1 frasco(100 ml)

10 embalagens(1 g cada)

2 ou 4 bandejas

1 exemplar

1 frasco(80 Øl)

1 par

9. Enxugue imediatamente derramamentos de materiaisinfecciosos com papel absorvente e limpe imediatamentea área contaminada com solução de hipoclorito de sódioa 1 % antes de continuar o trabalho. O hipoclorito de sódionão deve ser usado em derramamentos contendo ácidos,a não ser que a área seja primeiro enxugada com papelabsorvente. O material usado (inclusive as luvasdescartáveis) deve ser descartado como material biológicopotencialmente perigoso. Não esterilize em autoclavematerial que contenha hipoclorito de sódio.

10. Antes do descarte, esterilize em autoclave a 121°C e 15p.s.i, durante 30 minutos, todo o material contaminadoutilizado. Alternativamente, descontamine o material emsolução de hipoclorito de sódio a 5 % durante 30-60minutos antes de descartar em sacos para lixo biológicoperigoso.

11. Descontamine todos os produtos químicos e reagentesusados adicionando um volume suficiente de hipocloritode sódio para obter uma concentração final de pelo menos1 %. Deixe agir durante 30 minutos para garantir umadescontaminação eficiente.

12. Não é recomendável reutilizar as bandejas de incubação.

PRECAUÇÕES ANALÍTICAS

1. Para garantir um desempenho perfeito do teste énecessário SEGUIR À RISCA os procedimentos descritosneste Manual de Instruções. A inobservância destesprocedimentos podem acarretar resultados anômalos.

2. NÃO MODIFIQUE OU SUBSTITUA REAGENTES DE UMLOTE DE KIT PARA OUTRO. Os controles, o conjugadoe as fitas de Western Blot são combinadas entre si paraoferecer um desempenho perfeito. Use somente reagentesfornecidos com o kit.

3. Não use componentes do kit após a data de validadeimpressa na caixa do kit.

4. Evite a contaminação microbiana dos reagentes ao abrire retirar alíquotas dos frascos originais. A contaminaçãoreduz prematuramente a vida útil dos kits e forneceresultados errôneos. Use técnicas assépticas como porexemplo pipetas ou ponteiras de pipetas descartáveis pararetirar alíquotas dos frascos.

5. Em cada processamento de amostras de pacientes, deve-se testar os controles do kit em paralelo.

6. Use uma ponteira de pipeta nova para cada alíquota deamostra, para evitar contaminação cruzada,

7. Para melhores resultados, aplique todos os reagentesenquanto ainda estiverem frios e retorne-os aoarmazenamento entre 2°C e 8°C, o mais depressapossível.

8. Recomenda-se que a vidraria a ser usada com osreagentes seja lavada com ácido clorídrico 2M eenxaguada abundantemente com água destilada oudeionizada antes do uso.

9. Use somente água de qualidade grau reagente,deionizada ou destilada, para diluir os reagentes.

10. Todos os reagentes devem ser bem misturados antes douso.

11. A solução de Conjugado de Trabalho, a Solução-Tampãode Lavagem Diluída e a Solução-Tampão para Blottingdevem ser preparadas logo antes do uso.

12. A solução de Conjugado de Trabalho deve ser preparadausando um recipiente ou bécher de polipropileno.

13. Não exponha os reagentes nem realize testes em áreasque apresentem altos níveis de vapores de desinfetantesquímicos (e.g., vapores de hipoclorito) durante as etapasde armazenamento ou de incubação. O contato inibe areação colorida. Da mesma forma, não exponha osreagentes à luz intensa.

14. O teste deverá preferencialmente ser realizado àtemperatura ambiente (25°C ± 3°C).

15. Certifique-se que as fitas de teste estão dispostas comos números nas fitas voltados para cima.

16. Para a prova de Western Blot, é importante usar umagitador de plataforma oscilante e não um agitadorrotativo. Caso contrário, o desempenho do kit ficarácomprometido. A velocidade e o ângulo de inclinaçãorecomendados para o agitador são de 12 a 16 ciclos porminuto, e 5 a 10 graus, respectivamente.

17. Se usar equipamento automático, confira se está aferidoantes do uso.

18. Certifique-se que as amostras são adicionadas longe dafita. A bandeja pode ser agitada e a amostra adicionadano local onde a solução-tampão for coletada naextremidade inferior. Isto evitará a formação de manchasescuras devido à adição de amostra na fita.

19. Evite o uso de congeladores do tipo frost free paraarmazenar reagentes e amostras.

20. Não recomendamos o uso de amostras diluídas ouliofilizadas, pois podem fornecer resultados falsos. Seformarem parte ou a totalidade do painel QC, deverá serefetuada a validação.

1. Conserve o kit HIV BLOT 2.2 MPD e seus componentesentre 2°C e 8°C quando não estiverem em uso.

2. Todos os reagentes e fitas do teste permanecem estáveisaté a data de validade fornecida no kit, se conservadosentre 2°C a 8°C. Não congele os reagentes.

A. Fitas com antígeno• Evite a exposição desnecessária das fitas de antígenos

à luz.B. Reagentes

• Conserve os reagentes em seus recipientes originais emantenha-os tampados ao armazená-los.

• Aplique todos os reagentes ainda frios e volte aarmazená-los entre 2°C e 8°C o mais rápido possível.

• Quando o substrato for conservado entre 2°C e 8°Cpoderão se formar precipitados. Isto não afetará odesempenho do kit.

Cuidado: Evite a exposição desnecessária dosubstrato à luz.

Podem ser usadas amostras de soro ou plasma coletadas emEDTA, heparina ou citrato de sódio. Antes do armazenamento,certifique-se que os coágulos e/ou as células sangüíneas foramseparadas por centrifugação.

As amostras devem ser conservadas entre 2°C e 8°C se oteste for realizado dentro de 7 dias após a coleta, ou congeladasa -20°C se for previsto que o teste será realizado em mais de7 dias após coleta. É preferível usar amostras límpidas e nãohemolisadas. Amostras lipêmicas, ictéricas ou contaminadas(partículas) devem ser filtradas (0,45Øm) ou centrifugadas antesdo teste.

3

INSTRUÇÕES DE ARMAZENAMENTO

COLETA, TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DEAMOSTRAS

As amostras dos pacientes podem ser inativadas, mas estanão é uma exigência para um desempenho ótimo do teste.

Inative da seguinte forma:1. Afrouxe as tampas dos recipientes de amostra.2. Aqueça a amostra a 56 °C durante 30 minutos em banho-

maria.3. Deixe a amostra esfriar antes de reapertar as tampas.4. A amostra pode ser mantida congelada até o momento da

análise.

Recomendamos que as amostras dos pacientes não sejamsubmetidas a mú ltiplos ciclos de congelamento edescongelamento antes das análises.

• Água deionizada ou destilada• Luvas descartáveis• Plataforma oscilante (com velocidade de agitação na faixa

de 12 a 16 oscilações por minuto e com capacidade deinclinação entre 5° e 10°, para lavagem uniforme dasmembranas)

• Pipetadores e ponteiras de volumes adequados• Sistema de aspiração e contenção em hipoclorito de sódio• Banho-maria a 56°C (opcional)• Hipoclorito de sódio para descontaminação

1. SOLUÇÃO-TAMPÃO DE LAVAGEM DILUÍDA(a) A SOLUÇÃO-TAMPÃO DE LAVAGEM DILUÍDA deve

ser preparada logo antes do uso.(b) Dilua 1 volume de SOLUÇÃO-TAMPÃO DE LAVAGEM

CONCENTRADA (20X) com 19 volumes de água graureagente. Misture bem.

2. SOLUÇÃO-TAMPÃO PARA BLOTTING(a) A SOLUÇÃO-TAMPÃO PARA BLOTTING deve ser

preparada logo antes do uso.(b) Dilua 1 volume de SOLUÇÃO-TAMPÃO ESTOQUE

CONCENTRADA (10X) com 9 volumes de água graureagente. Misture bem.

(c) Adicione 1 g de PÓ PARA BLOTTING a cada 20 ml deSOLUÇÃO-TAMPÃO ESTOQUE diluída, preparada naetapa 2(b) acima. Agite para dissolver completamenteo pó.

(d) Agite novamente antes de aplicar.

3. SOLUÇÃO DE CONJUGADO DE TRABALHONota : Prepare a solução num recipiente ou bécher de

polipropileno.(a) A SOLUÇÃO DE CONJUGADO TRABALHO deverá

ser preparada logo antes do uso.(b) Prepare a SOLUÇÃO DE CONJUGADO DE

TRABALHO diluindo o CONJUGADO a 1:1000 emSOLUÇÃO-TAMPÃO PARA BLOTTING, por exemplo,5 Øl de CONJUGADO para 5 ml de SOLUÇÃO-TAMPÃO PARA BLOTTING.

4. SOLUÇÃO DE SUBSTRATO (pronta para uso)(a) Distribua diretamente o volume necessário a partir do

frasco. Use uma pipeta limpa. Feche bem após o uso.

Nota: a) Os usuários podem usar o assay rápido ou de noitefuncionar os testes. As faixas do HIV são maistornadas e mais faixas podem aparecer com o assayde noite, mas o desempenho total dos dois assays éo mesmo.

b) Aspire todos os reagentes e produtos químicosusados para um recipiente de contenção comhipoclorito de sódio.

c) Todas as incubações devem ser realizadas emplataforma de agitação por oscilação.

Cuidado:Algumas amostras provocam manchas escuras no ponto dafita em que são aplicadas. Para evitar este problema, deve-se:

i. Aplicar a amostra somente após a adição da SOLUÇÃO-TAMPÃO PARA BLOTTING.

ii. Inclinar a bandeja ligeiramente, elevando a extremidadesuperior ou inferior da bandeja. A Solução-Tampão paraBlotting fluirá para a extremidade mais baixa da bandeja.Adicione a amostra onde a Solução-Tampão para Blotting écoletada. Quando todas as amostras tiverem sidoadicionadas, retorne a bandeja à posição horizontal original.Certifique-se que as fitas mantêm-se sempre úmidasdurante o procedimento.

iii. Alternativamente, caso não deseje inclinar a bandeja, asamostras podem ser adicionadas na extremidade superiorou inferior do poço. Desta forma, a leitura da fita não seráafetada caso tenham se desenvolvido manchas escuras.

Procedimento:

1. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO-TAMPÃODE LAVAGEM DILUÍDA a cada poço.

2. Usando pinça, retire cuidadosamente onúmero necessário de FITAS do tubo ecoloque-as em cada poço com a facenumerada voltada para cima. Inclua fitaspara controles Reativo Forte, ReativoFraco e Não Reativo.

3. Incube as fitas durante 1 e 2 minutos àtemperatura ambiente (25±3°C) sobreuma plataforma oscilante (velocidade de12 a 16 ciclos por minuto). Remova asolução-tampão por aspiração.(Nota: Não permita que as tiras sequema falha pode resultar em marcas aquosasem tiras desenvolvidas para algunsespécimes.)

4. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO-TAMPÃOPARA BLOTTING a cada poço.

5. Adicione 20 Øl de cada soro de pacienteou de controle nos poços apropriados.Deve-se ter cuidado para ter a certezaque as amostras não são adicionadasdiretamente sobre as fitas.

6. Cubra a bandeja com a tampa fornecidae incube durante 1 hora à temperaturaambiente (25±3°C) na plataformaoscilante.

7. Retire cuidadosamente a tampa, evitandorespingos ou misturar as amostras. Inclinea bandeja para aspirar a mistura dospoços. Troque as ponteiras de aspiraçãoentre as aplicações de amostras paraevitar contaminação cruzada.

PREPARAÇÃO DOS REAGENTES

4

MATERIAIS ADICIONAIS NECESSÁRIOS MAS NÃOFORNECIDOS

PROCEDIMENTO DO TESTE - PROVA RÁPIDA

2 ml

2 minutos

2 ml

20 ØØØØØl

60 minutos

8. Lave cada fita 3 vezes com 2 ml deSOLUÇÃO-TAMPÃO DE LAVAGEMDILUÍDA e deixe-as imersas durante5 minutos sobre a plataforma oscilanteentre cada lavagem.

9. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO DECONJUGADO DE TRABALHO a cadapoço.

10. Cubra a bandeja e incube durante 1 horaà temperatura ambiente (25±3°C) naplataforma oscilante.

11. Aspire o CONJUGADO dos poços. Lavecomo na etapa 8.

12. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO DESUBSTRATO em cada poço.

13. Cubra a bandeja e incube-a durante15 minutos na plataforma oscilante.(Nota: A reação pode ser parada antesde 15 minutos se todas as faixas foremvisíveis.)

14. Aspire o SUBSTRATO e enxágüe as fitaspelo menos três vezes com água de graureagente para interromper a reação (alavagem insuficiente nesta etapa poderáprovocar o desenvolvimento de um fundoescuro).

15. Usando pinça, retire cuidadosamente asfitas e coloque-as sobre toalhas de papel.Cubra com toalhas de papel e seque.Alternativamente, deixe as fitas secaremnos poços da bandeja.

16. Monte as fitas sobre folha de papel branconão absorvente. Não aplique fita adesivasobre as bandas reveladas. Observe asbandas (ver Interpretação de Resultados)e interprete os resultados. Paraarmazenamento, conserve as fitas emlocal escuro.

Procedimento:

1. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO-TAMPÃODE LAVAGEM DILUÍDA a cada poço.

2. Usando pinça, retire cuidadosamente onúmero necessário de FITAS do tubo ecoloque-as em cada poço com a facenumerada voltada para cima. Inclua fitaspara controles Reativo Forte, ReativoFraco e Não Reativo.

3. Incube as fitas durante 1 e 2 minutos àtemperatura ambiente (25±3°C) sobreuma plataforma oscilante (velocidade de12 a 16 ciclos por minuto). Remova asolução-tampão por aspiração.(Nota: Não permita que as tiras sequema falha pode resultar em marcas aquosasem tiras desenvolvidas para algunsespécimes.)

4. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO-TAMPÃOPARA BLOTTING a cada poço.

5. Adicione 20 Øl de cada soro de pacienteou de controle nos poços apropriados.

6. Cubra a bandeja com a tampa fornecidae incube overnight (16 - 20 horas) àtemperatura ambiente (25±3°C) naplataforma oscilante.

7. Retire cuidadosamente a tampa, evitandorespingos ou misturar as amostras. Inclinea bandeja para aspirar a mistura dospoços. Troque as ponteiras de aspiraçãoentre as aplicações de amostras paraevitar contaminação cruzada

8. Lave cada fita 3 vezes com 2 ml deSOLUÇÃO-TAMPÃO DE LAVAGEMDILUÍDA e deixe-as imersas durante5 minutos sobre a plataforma oscilanteentre cada lavagem.

9. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO DECONJUGADO DE TRABALHO a cadapoço.

10. Cubra a bandeja e incube durante30 minutos à temperatura ambiente(25 ±3°C) na plataforma oscilante.

11. Aspire o CONJUGADO dos poços. Lavecomo na etapa 8.

12. Adicione 2 ml de SOLUÇÃO DESUBSTRATO em cada poço.

13. Cubra a bandeja e incube-a durante15 minutos na plataforma oscilante.(Nota: A reação pode ser parada antesde 15 minutos se todas as faixas foremvisíveis.)

14. Aspire o SUBSTRATO e enxágüe as fitaspelo menos três vezes com água de graureagente para interromper a reação (alavagem insuficiente nesta etapa poderáprovocar o desenvolvimento de um fundoescuro).

15. Usando pinça, retire cuidadosamente asfitas e coloque-as sobre toalhas de papel.Cubra com toalhas de papel e seque.Alternativamente, deixe as fitas secaremnos poços da bandeja.

16. Monte as fitas sobre folha de papel branconão absorvente. Não aplique fita adesivasobre as bandas reveladas. Observe asbandas (Ver Interpretação de Resultados)e interprete os resultados. Paraarmazenamento, conserve as fitas emlocal escuro.

RESUMO DOS PROTOCOLOS DO TESTE

Reagentes Qtde Temp Amb Temp AmbProva Rápida Prova Overnight

Fita denitrocelulose 1 - -Solução-Tampão 2 ml 1-2 min 1-2 minde LavagemSolução-Tampão 2 ml - -para BlottingAmostra 20 Øl 60 min Overnight

(16 - 20 horas)Solução-Tampão 3 x 2 ml 3 x 5 min 3 x 5 minde LavagemConjugado 2 ml 60 min 30 minSolução-Tampão 3 x 2 ml 3 x 5 min 3 x 5 minde LavagemSubstrato 2 ml 15 min 15 min(pronto para uso) (ou menos) (ou menos)

Água destilada 3 x 2 ml - -

PROCEDIMENTO ALTERNATIVO - TESTE OVERNIGHT

5

3 x 2 ml

2 ml

2 minutos

2 ml

20 ØØØØØl

overnight

3 x 2 ml

15 minutos

2 ml

3 x 2 ml

60 minutos

2 ml

15 minutos

2 ml

3 x 2 ml

30 minutos

2 ml

3 x 2 ml

3 x 2 ml

QUANTIDADE NECESSÁRIA DE REAGENTESPARA QUANwTIDADES DIFERENTES DE FITAS

Reagentes NÚMERO DE FITAS A USAR

3 6 9 15 20 27 36Solução-Tampão 60 100 140 240 300 400 520de Lavagem 1X (ml)Solução-Tampão 20 40 60 80 100 120 160para Blotting 1X (ml)Conjugado (Øl) 11 17 23 35 45 59 77Substrato (ml) 11 17 23 35 45 59 77Pó para Blotting (g) 1 2 3 4 5 6 8

Recomenda-se processar os controles Não Reativo, ReativoForte e Reativo Fraco junto a cada teste, independentementedo número de amostras sob análise. Para que todos osresultados obtidos nos testes sejam considerados válidos, asseguintes condições deverão ser preenchidas:

1. CONTROLE NÃO REATIVONão se devem observar bandas específicas para HIV-1 eHIV-2 nas fitas de controle Não Reativo. A banda para ocontrole de soro deve ser visível (Fig 1c).

2. CONTROLE REATIVO FORTETodas as bandas de peso molecular relevantes devem estarevidentes. A Figura 1a fornece um guia das posiçõesrelativas de bandas visualizadas com o HIV BLOT 2.2 MPDe permite a identificação das bandas observadas com oCONTROLE REATIVO FORTE. As bandas observadas sãop17, p24, p31, gp41, p51, p55, p66, gp120/gp160, Outrasbandas associadas a antígenos do centro (core) viral (p39,p42) também podem estar visíveis. Cuidado para nãointerpretar estas bandas erroneamente como gp41. Osantígenos de envoltório, gp41, gp120/gp160, sendo típicasde glicoproteínas, aparecem como bandas difusas. A bandade soro controle estará visível. A banda específica de HIV-2 também deverá estar visível como mostrado na Figura1a.

3. CONTROLE REATIVO FRACOO controle Reativo Fraco fornece uma medida dasensibilidade do kit. Devem aparecer bandas fracas em p24e/ou gp41 e em gp120/gp160. Bandas fracas adicionaispodem ou não estar presentes. A banda de soro controleestará visível (Fig 1b).

NOTA : As fitas reveladas devem estar completamente secaspara evitar erros de interpretação.

A presença ou ausência de anticorpos contra o HIV-1 naamostra é determinada pela comparação de cada fita denitrocelulose sob teste com as fitas de controle analisadas comos controles NÃO REATIVO, REATIVO FORTE e REATIVOFRACO.

A Figura 1a é apresentada como uma ajuda para a identificaçãodas várias bandas reveladas na fita que reagiu com o ControleREATIVO FORTE.

POR FAVOR, NOTE: A extremidade numerada das fitas deveser colocada na parte inferior como mostrado na Figura, i.e.as bandas gp120/gp160 são as mais afastadas da extremidadenumerada.

CONTROLE DE QUALIDADE

INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS

PESO GENE ANTÍGENO DESCRIÇÃOMOLECULAR

gp 160 ENV Forma polimérica Glicoproteínada gp41 difusa e larga

gp 120 ENV Membrana externa Glicoproteína difusa

p66 POL Transcriptase Banda discretaReversa

p55 GAG Proteína precursora Banda discreta

p51 POL Transcriptase Banda discretareversa logo abaixo de p55

p39 GAG Fragmento de p55 Banda discreta

gp41 ENV Transmembrana Glicoproteína difusa

p31 POL Endonuclease Dupla

p24 GAG Proteína central Banda larga

p17 GAG Proteína central Banda larga

Alguns dos antígenos mencionados na tabela acima derivamde uma mesma proteína precursora e podem ter epítopossobrepostos. Isto deve ser considerado quando se interpreta opadrão, por exemplo:

1. É pouco provável detectar gp41 na ausência de gp160porque a gp160 é a forma polimérica da gp41 e aconcentração de gp160 é mais elevada do que a de gp41no HIV BLOT 2.2 MPD. A gp41 aparece como uma bandadifusa. Qualquer banda nítida e discreta na região da gp41não deve ser interpretada como uma banda gp41. Muitasamostras normais e não infectadas pelo HIV apresentam-se reativas a este antígeno que não pertence ao HIV, masque parece ter origem na linhagem de células humanasutilizadas para cultivar o HIV.

2. A banda p55 é geralmente detectada quando existereatividade forte para p24 e/ou p17. As bandas visualizadascomo p42 e p39 são ambas fragmentos de GAG e nãodevem ser interpretadas como gp41 (ENV).

3. As bandas POL p66, p51 e p31 são geralmente detectadassimultaneamente. Contudo, as sensibilidades de p66 e p31são maiores que a de p51.

4. A reatividade cruzada do HIV-2 é variável mas tipicamenteexibe reatividade com antígenos GAG e/ou POL. No entanto,em alguns casos pode ocorrer reatividade cruzada com abanda gp160, mas raramente, com a gp41.

5. Existe também uma banda de alto peso molecular comaproximadamente 160 kDa que se presume ser umaproteína precursora de GAG-POL. Isto é observado emalguns soros com títulos elevados para HIV-2 ouindeterminados (reativos somente para GAG) mas o padrãoda banda é uma banda discreta, diferente da banda difusada gp160 do ENV.

6

O procedimento de interpretação envolve as seguintes etapas:

1. Confirmar se a banda de soro controle está visível. Se ocontrole estiver negativo, os resultados deverão serconsiderados inválidos, visto que isto indica um erro técnicotal como não adição de amostra, conjugado ou substrato.

2. Identificação dos pesos moleculares de todas as bandasda fita de teste usando as fitas de Controle REATIVO FORTEe/ou FRACO como guia.

3. A interpretação da fita do teste baseia-se, pois, na detecçãode padrões de bandeamento específicos conforme asrecomendações das autoridades competentes (i.e.,Ministério da Saúde, Organização Mundial da Saúde, etc.)

As diretrizes específicas para a interpretação podem divergirdependendo de normas locais. A MPD recomenda seguir asnormas aceitas em conformidade com os regulamentos locais.A seguir, indicam-se os critérios de orientação recomendadospor diversos organismos internacionais de regulamentação.

ORGÃO CRITÉRIOS DEREGULAMENTADOR INTERPRETAÇÃOCenters for Disease Control Pelo menos uma ENV (gp41 e gp120/160)(CDC) e ASTPHLD e p24American Food and Drug p24 e p31 e gp41 ou gp120/gp160Administration (FDA)Centre National Transfusion Duas bandas ENV com GAG ou POLSanguineOrganização Mundial da Saúde Duas bandas ENV com ou sem GAG(WHO) ou POLConsortium for Retrovirus Uma banda de p24 ou p31 e banda ENVSerology StandardizationCruz Vermelha Americana Uma banda cada de GAG, POL e ENVGerman Association for Control Uma banda ENV e pelo menos uma bandaof Viral Diseases (DVV) GAG ou POL, ver também DIN 58 969,

parte 41

Para interpretar o HIV BLOT 2.2 MPD recomendamos aplicaras orientações. Os resultados devem ser registrados para cadabanda detectada e interpretados como NEGATIVO, POSITIVOou INDETERMINADO.

PADRÃO INTERPRETAÇÃO

Nenhuma banda viral específica presente NEGATIVO

Detecção de anticorpos contra p17 NEGATIVOUNICAMENTE e ausência total deoutras bandas.

Detecção de 2 ENV HIV-1 POSITIVO(gp160/gp41 e gp120) e GAG(p17, p24, p55) ou POL (p31, p51, p66)

Detecção de 2 ENV HIV-1 POSITIVO(gp160/gp41 e gp120) e GAG com(p17, p24, p55) ou POL (p31, p51, p66) INDÍCIOS DE HIV-2e a banda específica de HIV-2 é visível.

Quaisquer bandas virais específicas INDETERMINADOpresentes mas o padrão não satisfazos critérios para POSITIVO

Quaisquer bandas virais específicas INDETERMINADOpresentes mas o padrão não satisfaz os comcritérios para POSITIVO e a banda INDÍCIOS DE HIV-2específica de HIV-2 é visível.

A detecção de anticorpos contra HIV-1 não constitui umdiagnóstico da síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS).Um BLOT NEGATIVO não garante ausência do agentecausador da AIDS. Embora um blot POSITIVO para anticorposcontra o HIV-1 indique infecção pelo vírus, o diagnóstico deAIDS só pode ser feito clinicamente se a pessoa reunir ascaracterísticas que definem a AIDS, estabelecida pelo Centerfor Disease Control (EUA), pela Organização Mundial da Saúdeou por outras autoridades competentes.

Sabe-se que pessoas que se tornaram soropositivas há poucotempo podem apresentar padrões incompletos masdesenvolverão crescente reatividade (tanto no número quantona intensidade das bandas) quando são acompanhadas porperíodos de dois a seis meses. A maioria dos blots comresultados POSITIVOS apresentarão outras bandas viraisespecíficas.

Os blots INDETERMINADOS não deverão ser usados comobase para o diagnóstico de infecção por HIV. Recomenda-seque todos os BLOTS INDETERMINADOS sejam reanalisadosusando-se a amostra original e amostras subseqüentes. Osdoadores de sangue com blots INDETERMINADOS devem sernovamente testados usando-se uma amostra nova, após doisa seis meses. Sabe-se também que anticorpos específicos parap24 e p31 diminuem no decurso da AIDS, ocasionando umamudança na interpretação do blot de POSITIVO paraINDETERMINADO. Em tais situações, a interpretação dosresultados deve portanto ser baseada em testes de blot eavaliações clínicas subseqüentes.

Devido à sua natureza altamente específica, a NÃOREATIVIDADE de amostras com o peptídeo específico doenvoltório do HIV-2 num blot viral classificado comoIndeterminado, não exclui a possibilidade de infecção por outrascepas de HIV-2.

As amostras que indicam infecções por HIV-2 devem serposteriormente analisadas com o Kit de Western Blot paraHIV-2.

O desempenho do HIV BLOT 2.2 MPD para a detecção deanticorpos contra HIV-1 ou HIV-2 foi avaliado em estudosclínicos.

Tabela 1 : Estudo da sensibilidade da reatividade do antígenoviral de HIV-1 com amostras soropositivas para HIV-1 (Número de amostras = 197)

PERFIL HIV BLOT 2.2 HIV-1 WBSOROLÓGICO NÚMERO (%) DUPONT/ORTHO

NÚMERO (%)

GAG, POL eENV 192 (97,5 %) 188 (95,4 %)p24, p31, gp41e/ou 187 (94,9 %) 179 (90,9 %)gp120/gp160

ENV e GAG ouPOL 197 (100,0 %) 197 (100,0 %)

7

CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE DESEMPENHO

LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Tabela 2: Estudo da especificidade da reatividade de antígenoviral de HIV-1 com amostras de doadores normaise soros com outras infecções virais.

TIPO DE NÚMERO POSITIVOS REATIVIDADE PARA HIV-1

AMOSTRA INDETERMINADA* NEGATIVA

DoadoresNormais 208 0 11 197

HTLV-1 5 0 0 5

CMV 5 0 1 4

EBV (IgM) 5 0 1 4

V.zoster (IgG) 5 0 1 4

Sarampo 6 0 2 4

Rubéola 5 0 1 4

Caxumba 4 0 1 3

Adenovírus 5 0 2 3HSV 5 0 0 5

Dengue 5 0 1 4

Total 258 0 21 237

*Todas exibiam apenas as bandas p24 ou p17.

Tabela 3 : Estudo da sensibilidade da banda do peptídeo doHIV-2 com amostras soropositivas para HIV-2.(Número de amostras = 178)

Western Blot HIV-2 Reatividade para o peptídeo do HIV-2Perfil sorológico@ Positiva Negativa

GAG, POL e 2 ENV 160 0

GAG, POL e 1 ENV 18 0

@Soros definidos como positivos pelo NEW LAV Blot 2 daDiagnostics Pasteur.Dados fornecidos pelos Drs. Oliviero E.Varnier e Flavia Lillo. Laboratório de Retrovírus Humanos,Universidade de Gênova.

Tabela 4 : Estudo da especificidade da banda do peptídeo doHIV-2 com soros positivos para HIV-1, amostras desoros de doadores normais e soros com outrasinfecções virais.

TIPO DE AMOSTRA NÚMERO REATIVIDADE PARA OPEPTÍDEO DO HIV-2

POSITIVA NEGATIVA

Soropositivo paraHIV-1 197 16a 181

Doadores Normais 208 0 208

Soropositivo paraHTLV-1 5 0 5

CMV 5 0 5

EBV (IgM) 5 0 5

V.zoster (IgG) 5 0 5

Sarampo 6 0 6

Rubéola 5 0 5

Caxumba 4 0 4

Adenovírus 5 0 5

HSV 5 0 5

Dengue 5 0 5

Total 455 16 439

aQuando analisadas pelo Western Blot para HIV-2 da MPD, 6destas amostras apresentaram reatividade com ENV e GAGou POL, 9 reagiram apenas com GAG e/ou POLe 1 amostra era negativa.

Um total de 15 painéis comerciais de soroconversão de HIV-1foram testados com HIV Blot 2.2 MPD e os resultadosmostraram que o HIV Blot 2.2 MPD foi capaz de detectaranticorpos contra HIV antecipadamente ou na mesma amostraem todos os painéis.

O fabricante não oferece nenhuma outra garantia expressasenão a de que o kit de teste funcionará como um ensaio dediagnóstico in vitro dentro das especificações e limitaçõesdescritas neste Manual de Instruções do Produto quando usadoem conformidade com as instruções nele contidas. O fabricanteisenta-se de qualquer garantia, expressa ou implícita, incluindoas garantias expressas ou implícitas em relação à capacidadede comercialização, de utilização ou utilidade implícita paraquaisquer outros fins. A responsabilidade do fabricante limita-se à substituição do produto ou ao reembolso do preço decompra do produto. O fabricante não será consideradoresponsável pelo comprador nem por terceiros por quaisquerdanos, prejuízos ou perdas de caráter econômico causadospelo uso ou aplicação do produto.

Caso haja algum problema técnico ou queixa, solicitamosproceder da seguinte forma:1. Anote o número de lote do kit e a data de validade.2. Conserve o kit e os resultados obtidos.3. Contate o escritório MP Biomedicals mais próximo ou o

seu distribuidor local.

8

ISENÇÃO DE RESPONSABILIDADE EXPLÍCITALIMITADA

PROBLEMAS TÉCNICOS/ QUEIXASPROBLEMASTÉCNICOS / QUEIXAS

1. V.C.W.Tsang, K. Hancock, M. Wilson. D.F. Palmer, S.Whaley, J.S. Mc Dougal, and S. Kennedy. March 1985.Developmental Procedure : Enzyme-linked Immunoelectro-transfer Blot technique for HTLV-III/LAV antibodies; CDC,Altanta.

2. H. Towbin, T. Staehlin, and J. Gordon. 1979. Electrophoretictransfer of proteins from polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets: procedure and some applications.Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 76: 4350-4354.

3. J. Schupbach, M. Popovic, R. V. Gilden. M.A. Gonda, M. G.Sarngadharan and R. C. Gallo. 1984. Serological Analysisof subgroup of Human T-Lymphotropic retroviruses (HTLV-III) associated with AIDS. Science 224, 503-505.

4. M. G. Sarngadharan, M. Popovic, L. Bruch, J. Schupbachand R. C. Gallo. 1984. Antibodies reactive with human T-Lymphotropic retroviruses (HTLV-III) in the serum of patientswith AIDS. Science 224, 506-608.

5. CDC. 1985. “ Provisional public health service inter-agencyrecommendations for screening donated blood and plasmafor antibody to the virus causing Acquired ImmuneDeficiency Syndrome” - United States Morbidity andMortality Weekly Report 34 (1) :1-5.

6. WHO Collaborating Group on HIV-2 1990, WHO WeeklyEpidem. Rec. 10, p74-75.Sarngadharan and R. C. Gallo.1984. Serological Analysis of subgroup of Human T-Lymphotropic retroviruses (HTLV-III) associated with AIDS.Science 224, 503-505.

7. F. Clavel, D. Guetard., F. Brun-Vezinet, et al. 1986 Isolationof a new human retrovirus from West African patients withAIDS. Science; 233:343-346,

8. F. Clavel., 1987. HIV-2, the West African AIDS virus. AIDS1:135-140,

9. R.S. Tedder, A. Hughes, T. Corrah et al 1988. Envelopecross-reactivity in Western Blot for HIV-1 and HIV-2 maynot indicate dual infection. Lancet 11:927-930,

10. Bottiger B., A. Karlsson, F. Andreasson et al. 1990. Envelopecross-reactivity between Human Immunodeficiency VirusType 1 and Type 2 detected by different serological methods:Correlation between cross-neutralization and reactivityagainst the main neutralizing site. J. Virol. 64(7):3492-3499.

9

REFERÊNCIASMP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd.85 Science Park Drive#04-01, The CavendishSingapore Science ParkSingapore 118259Tel N°. : + 65 6775 0008Fax N°. : + 65 6775 4536E-mail : enquiry_ap@mpbio.com

Medical Technology PromedtConsulting GmbHAltenhofstrasse 80D-66386 St. IngbertAlemanhaTel N°. : + 49 68 94 58 1020Fax N°. : + 49 68 94 58 1021E-mail : info@mt-procons.com

Escritórios Regionais:

MP Biomedicals Suisse S.A.Halle de Fret/AeroportP.O. Box 10151211 Genebra 5SuíçaTel N°. : (4122) 788-1908Fax N°. : (4122) 788-1986E-mail: mpbiosuisse@mpbio.com

* E.U.A. Patente 5.721.095

* O nome e o logotipo Genelabs são licenciadosda Genelabs Technologies, Inc.

FIGURA 1

a. Controle Reativo Forte (Reativopara HIV-1 e HIV-2)

b. Controle Reativo Fraco (Reativosomente para HIV-1).

c. Controle Não Reativo.d. Um soro soropositivo para HIV-2

característico.

10

gp 160gp 120

p 66p 55p 51

gp 41p 39

p 31

p 24

p 17

Controlesoro

HIV-2

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