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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
GABRIELA DE OLIVEIRA RODRIGUES
Desenvolvimento de método para quantificação do teor de glicerol livre em amostras de biodiesel por cromatografia líquida
de alta eficiência
Lorena – SP
2015
GABRIELA DE OLIVEIRA RODRIGUES
Desenvolvimento de método para quantificação do teor de glicerol livre em amostras de biodiesel por cromatografia líquida
de alta eficiência
Trabalho de Conclusão de Curso de Graduação apresentado à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo como requisito parcial para conclusão da graduação do curso de Engenharia Química.
Orientadora: Profa. Dra. Heizir Ferreira de Castro
Lorena - SP
2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIOCONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizadoda Escola de Engenharia de Lorena,
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Rodrigues, Gabriela de Oliveira Desenvolvimento de método para quantificação doteor de glicerol livre em amostras de biodiesel porcromatografia líquida de alta eficiência / Gabrielade Oliveira Rodrigues; orientadora Heizir Ferreirade Castro. - Lorena, 2015. 67 p.
Monografia apresentada como requisito parcialpara a conclusão de Graduação do Curso de EngenhariaQuímica - Escola de Engenharia de Lorena daUniversidade de São Paulo. 2015Orientadora: Heizir Ferreira de Castro
1. Biodiesel. 2. Glicerol livre. 3. Quantificação.4. Clae-dad. 5. Otimização. I. Título. II. de Castro,Heizir Ferreira, orient.
Dedico este trabalho aos meus pais por todo apoio e dedicação e principalmente
por colocarem a minha educação em primeiro lugar.
AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço a Deus por iluminar o meu caminho e me abençoar. Agradeço aos meus pais, Raul e Rosa, por me amarem incondicionalmente, serem a minha fortaleza e meus maiores exemplos e em especial à minha mãe por todo o apoio para escrever esse trabalho. Agradeço aos meus familiares que mesmo de longe me incentivaram e sempre compreenderam a minha ausência. Agradeço as minhas amigas Natalia, Mariana, Giovanna e Naiara que estiverem ao meu lado desde o primeiro ano da faculdade. Agradeço ao meu orientador de estágio Antonio Noronha, que me proporcionou a maioria dos conhecimentos presentes neste trabalho e contribuiu de uma maneira significativa no meu desenvolvimento profissional. Agradeço ao meu futuro colega de profissão Mario Luiz da Silva Barroso que me transmitiu todo seu conhecimento e me ajudou com todas as análises desse trabalho, sem esse apoio nunca seria possível. Agradeço a minha orientadora Heizir Ferreira de Castro, por toda a colaboração e conselhos, que foram imprescindíveis para o sucesso. Agradeço a professora Marivone Nunho Sousa que me deu a chance de ser sua aluna de iniciação científica, onde os conhecimentos desse trabalho se iniciaram. Agradeço aos meus amigos do Laboratório de formulações pelos conhecimentos e bons momentos compartilhados. Agradeço a todos os professores e colegas que contribuíram de alguma forma para a execução deste trabalho.
RESUMO
RODRIGUES, G. O. Desenvolvimento de método para quantificação do teor de glicerol livre em amostras de biodiesel por cromatografia líquida de alta eficiência. 2015. 67 p. Trabalho de conclusão de curso para graduação em Engenharia Química – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2015.
Este projeto teve como objetivo desenvolver uma metodologia de quantificação de glicerol livre em amostras de biodiesel por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) como método alternativo ao método atualmente empregado (cromatografia gasosa). O método por cromatografia líquida pode ser considerado mais eficiente devido aos menores tempos de análise e a possibilidade do uso de água como solvente. Para o desenvolvimento do método foram avaliados os parâmetros cromatográficos a fim de determinar as condições ideais para a análise de glicerol, que configura uma parte importante na etapa de controle de qualidade do produto final de biodiesel comercial.
Palavras-chave: Biodiesel. Glicerol Livre. Quantificação. CLAE-DAD. Otimização.
ABSTRACT
RODRIGUES, G.O. Method development for determination of free glycerol content in biodiesel samples by high-performance liquid chromatography. 2015. 67 p. Monograph for Chemical Engineering (Degree) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2015. This project aimed at developing a methodology for measuring free glycerol in biodiesel samples using high-performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD) as an alternative method to the currently employed method (gas chromatography). Liquid chromatography can be considered more efficient due to less time of analysis and the possibility of the use of water as solvent. For the method development, chromatographic parameters were evaluated to determine the optimal conditions for glycerol analysis, which composes a important part in the final product quality control step of commercial biodiesel. Keywords: Biodiesel. Free glycerol. Quantification. HPLC-DAD. Optimization.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fontes de triglicerídeos mais usadas por região do Brasil ................... 17
Figura 2 - Evolução da composição do biodiesel no Brasil ................................... 18
Figura 3 - Esquema da reação em etapas de síntese de biodiesel ...................... 19
Figura 4 - Esquema da reação global de síntese de biodiesel ............................. 20
Figura 5 - Fórmula estrutural do glicerol ............................................................... 22
Figura 6 - Sistema cromatográfico ........................................................................ 24
Figura 7 - Esquema de funcionamento do DAD .................................................... 25
Figura 8 - Cálculo de resolução do método .......................................................... 29
Figura 9 - Cálculo de eficiência do método ........................................................... 31
Figura 10 - Cálculos de simetria dos sinais ........................................................... 32
Figura 11 - Cálculo de fator de capacidade .......................................................... 33
Figura 12 - Cálculo de seletividade ....................................................................... 34
Figura 13 - Cromatograma da amostra sem purificação - 144,31 mg ................... 45
Figura 14 - Cromatograma da amostra sem purificação - 256,60 mg ................... 45
Figura 15 - Cromatograma de amostra após purificação - 412,17 mg .................. 46
Figura 16 - Cromatograma de amostra após purificação - 506,99 mg .................. 46
Figura 17 - Cromatograma do padrão I ................................................................. 48
Figura 18 - Cromatograma do padrão II ................................................................ 49
Figura 19 - Cromatograma do padrão III ............................................................... 49
Figura 20 - Curva de calibração ............................................................................ 50
Figura 21 - Dados obtidos na construção da curva ............................................... 51
Figura 22 - Quantificação da amostra sem purificação - 144,31 mg ..................... 53
Figura 23 - Quantificação da amostra sem purificação - 256,60 mg ..................... 53
Figura 24 - Gráfico da linearidade do glicerol ....................................................... 56
Figura 25 - Cromatograma da amostra branco ..................................................... 57
Figura 26 - Cromatograma comparativo da amostra sem purificação e padrão ... 58
Figura 27 - Cromatograma comparativo da amostra após purificação e padrão .. 59
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Especificação do biodiesel ................................................................... 21
Tabela 2 - Dados utilizados para construção da curva ......................................... 51
Tabela 3 - Resultado da quantificação das amostras ........................................... 53
Tabela 4 - Resultado de todas as quantificações ................................................. 54
Tabela 5 - Valores calculados de LD e LQ ............................................................ 55
Tabela 6 - Linearidade dos padrões de glicerol .................................................... 56
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1 - Fórmula para cálculo de resolução ................................................... 29
Equação 2 - Fórmula completa da resolução ........................................................ 30
Equação 3 - Cálculo do número de pratos teóricos .............................................. 31
Equação 4 - Cálculo do limite de detecção ........................................................... 34
Equação 5 - Cálculo do limite de quantificação .................................................... 35
Equação 6 - Equação padrão de uma reta ........................................................... 35
Equação 7 - Cálculo de massa da amostra .......................................................... 35
Equação 8 - Cálculo de porcentagem mássica ..................................................... 36
LISTA DE ABREVIAÇÕES
a Coeficiente Angular da Reta AM Amostra
ANP Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOCS American Oil Chemists’ Society APROBIO Associação dos Produtores de Biodiesel do Brasil ASTM American Society for Testing and Materials b Coeficiente Linear da Reta CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CRQ Conselho Regional de Química DAD Detector de Arranjo de Diodos
GC Cromatografia a Gás HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
HTCG Cromatografia Gasosa de Alta Temperatura
k’ Fator de Capacidade
L Litro
LC Cromatografia Líquida
LD Limite de Detecção
LQ Limite de Quantificação
m Massa M Concentração Molar
mAu Um Milésimo de Unidade de Absorbância min Minuto mm Milimetro mM Milimol mg Miligrama
ml Mililitro
N Número de Pratos Teóricos
P Padrão
PNPB Programa Nacional de Produção e uso do Biodiesel
r Coeficiente de Correlação
R Resolução
s Desvio S Simetria
t Tempo
tR Tempo de Retenção
UV-VIS Ultravioleta Visível
X Eixo das Abcissas
Y Eixo das Ordenadas
W Largura
LISTA DE SÍMBOLOS
α Seletividade
Δ Diferença
° C Graus Celsius
µm Micrometro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 14 2 OBJETIVO ......................................................................................................... 16 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 17 3.1 Biodiesel ........................................................................................................ 17 3.1.1 Definição ...................................................................................................... 17 3.1.2 Histórico ....................................................................................................... 18 3.1.3 Reação de transesterificação ....................................................................... 19 3.1.4 Separação do glicerol ................................................................................... 20 3.1.5 Normas técnicas ........................................................................................... 20 3.2 Glicerol ........................................................................................................... 22 3.2.1 Definição ...................................................................................................... 22 3.2.2 Métodos de quantificação utilizados ............................................................ 23 3.3 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE – DAD) ............................ 23 3.4 Desenvolvimento de método cromatográfico ............................................ 25 3.4.1 Parâmetros cromatográficos ........................................................................ 26 3.4.2 Conceitos essenciais de qualidade em cromatografia ................................. 29 3.5 Quantificação do glicerol ............................................................................. 35 4 MATERIAIS E METODOLOGIA ........................................................................ 37 4.1 Materiais ......................................................................................................... 38 4.1.1 Descrição das amostras ............................................................................... 38 4.1.2 Preparação primária da amostra .................................................................. 38 4.1.3 Preparação secundária da amostra ............................................................. 39 4.1.4 Desenvolvimento do método ........................................................................ 39 4.2 Equipamentos ................................................................................................ 39 4.2.1 Preparações das amostras .......................................................................... 39 4.2.2 Preparo de solventes ................................................................................... 40 4.2.3 Análise cromatográfica ................................................................................. 40 4.3 Metodologia ................................................................................................... 40 4.3.1 Preparação primária das amostras .............................................................. 40 4.3.2 Preparação secundária da amostra ............................................................. 41 4.3.3 Desenvolvimento da metodologia de análise ............................................... 42 4.3.4 Análise da amostra branco ........................................................................... 43 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 44 5.1 Cromatograma das amostras ....................................................................... 44 5.2 Padronização e quantificação ...................................................................... 47 5.3 Análise dos conceitos de qualidade em cromatografia ............................ 57 5.4 Análise dos parâmetros cromatográficos .................................................. 61 6 CONCLUSÃO .................................................................................................... 63 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 64 APÊNDICE ............................................................................................................ 67
14
1 INTRODUÇÃO
Desde o lançamento do Programa Nacional de Produção e uso do
Biodiesel (PNPB) pelo governo federal em 2004 que teve como objetivo incentivar
a inserção deste combustível na matriz energética brasileira, a produção de
biodiesel é crescente. Como publicado pela ANP – Agência Nacional do Petróleo,
Gás Natural e Biocombustíveis no Boletim Mensal de Biodiesel de abril de 2015, o
país possui 58 plantas produtoras de biodiesel autorizadas para operação,
correspondendo a uma capacidade total de 20.853,51m³/dia (ANP, 2015). Esse
crescente desenvolvimento da indústria no país favorece também o crescimento
de pesquisas para obtenção de biodiesel de qualidade aceitável pela legislação,
visando maior economia e menor impacto ambiental. Além disso, para sua
comercialização o biodiesel deve atender padrões de qualidade regulamentados
também pela ANP, conforme descrito na Resolução ANP No 45, de 25.08.2014,
que estipula valores mínimo e máximo para os teores de qualidade tanto do
produto purificado (teores de ésteres, viscosidade, densidade), como dos
subprodutos e intermediários (glicerol, monoglicerídeos e diglicerídeos).
Deste modo, o monitoramento desses parâmetros de qualidade requer a
utilização de técnicas analíticas avançadas para quantificação precisa desses
componentes, principalmente aqueles que comprometem a qualidade do produto
para utilização como biocombustível. No caso especifico do glicerol, o teor
máximo permitido é da ordem de 0,02% em massa para o glicerol livre e de
0,25% de glicerol total. Valores superiores às especificações estipuladas pela
ANP podem causar baixo desempenho, causar danos aos motores, como
entupimento de injetores, aumentar a quantidade de emissão de substâncias
poluentes, como aldeídos, e também causar problemas durante o
armazenamento do biodiesel, devido à separação do glicerol nos tanques. A
queima do biodiesel não purificado a partir 180 ºC pode levar a formação de
acroleína, substância de alta toxicidade ao meio ambiente (MARQUES, 2011).
Desta forma, as unidades produtivas de biodiesel devem conter
laboratórios de controle de qualidade, com necessidade de métodos cada vez
15
mais rápidos, econômicos e precisos para a caracterização e a análise contínua
da qualidade do produto acabado (KNOTHE et al, 2006).
Os métodos de análises indicados para a determinação de cada
parâmetro do biodiesel são estabelecidos pela Resolução No45 da ANP. Para a
quantificação de glicerol livre a norma recomenda a cromatografia gasosa, porém
a busca de melhoria contínua é sempre necessária.
Desta forma, o presente trabalho propõe o desenvolvimento de um
método de dosagem por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em
substituição ao método tradicional por cromatografia gasosa (CG). Apesar de
pouca explorada em larga escala a cromatografia líquida apresenta vantagens
adicionais, devido ao menor tempo de análise e a possibilidade de utilização de
água como solvente (KNOTHE et al, 2006).
16
2 OBJETIVO
Este trabalho teve como objetivo desenvolver um método utilizando a
técnica de análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de
arranjo de diodos, para a quantificação do glicerol livre residual em amostras de
biodiesel obtidas por transesterificação pela rota etanólica. Os objetivos
específicos são:
• Comprovar a eficiência, precisão e capacidade de resposta do método
desenvolvido na quantificação de glicerol livre presente em biodiesel por
CLAE-DAD com a qualidade necessária;
• Determinar os teores de glicerol livre presente no biodiesel acabado de
modo a atender às normas das agências regulamentadoras.
17
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Biodiesel
3.1.1 Definição
Biodiesel é um combustível biodegradável formado por ésteres mono
alquílicos que pode ser utilizado em motores automotivos ou motores
estacionários a diesel, obtido por reação de transesterificação de óleos vegetais,
gorduras animais ou óleos de descarte (óleos provenientes de resíduos de fritura),
com álcool de cadeia curta (metanol ou etanol) na presença de um catalisador.
Diversas variações nas matérias-primas podem ser realizadas, quanto às
espécies vegetais ou animais, utilizadas como fontes lipídicas, o álcool ou até
mesmo o catalisador (KNOTHE et al, 2006).
As espécies vegetais que podem ser utilizadas dependem da
disponibilidade geográfica, conforme ilustrado na Figura 1, geralmente as mais
utilizadas no Brasil são: soja, algodão, girassol, canola/colza, entre outras
(BIODIESELBR, 2015; ARAUJO, 2015).
Figura 1 - Fontes de triglicerídeos mais usadas por região do Brasil
Fonte: PNPB
18
Quanto às fontes lipídicas de origem animal podem ser utilizadas sebo
bovino, banha de porco e outras gorduras residuais de outros animais como
frango, carneiro e peixe, ou mesmo óleo purificado de peixe, como óleo de fígado
de bacalhau (ARAUJO, 2015).
O agente acilante utilizado pode ser etanol ou metanol, normalmente o
metanol é predominantemente utilizado devido ao seu baixo custo, porém no
Brasil, é incentivado o uso de etanol devido a sua elevada disponibilidade em
função da tecnologia implementada no país. Álcoois de cadeia mais longas
também apresentam viabilidade técnica, entretanto não são viáveis
economicamente para uso comercial (KNOTHE et al, 2006).
3.1.2 Histórico
No Brasil o desenvolvimento do biodiesel foi acelerado pelo lançamento
do PNPB – Programa Nacional de Produção e uso do Biodiesel que consiste em
um programa de incentivo do Estado e implementou a adição do biodiesel à
matriz energética brasileira pela medida provisória 214/2004 (APROBIO, 2015),
sob a nomenclatura BX, onde X indica a porcentagem de biodiesel na mistura.
A mistura do biodiesel ao petrodiesel foi iniciada com o uso autorizativo
de 2% em volume de biodiesel, sendo modificado, em 2008, o caráter da adição
autorizada para uso obrigatório. Com essa nova caracterização houve projeções
para aumentar a porcentagem de adição, que ocorreram conforme ilustrado na
Figura 2 (ANP, 2015).
Figura 2 - Evolução da composição do biodiesel no Brasil
Fonte: BIODIESELBR
19
3.1.3 Reação de transesterificação
A reação de transesterificação é a forma mais utilizada para obtenção do
biodiesel. A reação consiste na formação de ésteres alquílicos derivados dos
ácidos graxos de óleos vegetais e gorduras animais na presença de um
catalisador e de álcool, formando além dos ésteres o glicerol (Figura 3). A
transesterificação é composta por três reações reversíveis em sequência, na qual
os triglicerídeos da fonte lipídica são reduzidos a diglicerídeos, consecutivamente
reduzidos a monoglicerídeos, então novamente reduzidos a ésteres de ácidos
graxos, conforme ilustrado na Figura 4 (MARQUES, 2011).
Normalmente o álcool é utilizado em excesso de modo a garantir o
deslocamento da reação no sentido de formação dos produtos, aumentando o
rendimento em ésteres e facilitando a separação do glicerol (MARQUES, 2011).
Figura 3 - Esquema da reação em etapas de síntese de biodiesel
Fonte: KNOTHE et al, 2006
20
Figura 4 - Esquema da reação global de síntese de biodiesel
Fonte: KNOTHE et al, 2006
3.1.4 Separação do glicerol
O glicerol é insolúvel no biodiesel, o que facilita sua remoção por métodos
simples como decantação ou centrifugação. O glicerol deve ser removido durante
etapa de lavagem aquosa, geralmente efetuada com água quente (KNOTHE et al,
2006).
Ao final da reação de transesterificação é possível notar claramente uma
massa líquida composta por duas fases, formadas por ésteres e glicerol.
Dependendo da eficiência do processo de produção ainda podem estar presentes
em maior ou menor quantidade compostos como glicerídeos que reagiram
parcialmente ou que não reagiram, sabões formados e álcool residual, compostos
os quais são indesejados no produto final (MARQUES, 2011).
3.1.5 Normas técnicas
As especificações do biodiesel quanto ao controle de qualidade para
qualquer agente que disponibiliza o produto em todo o território nacional, seja o
biocombustível nacional ou importado, está descrito no regulamento técnico N°
3/2014 da ANP, presente na resolução ANP N° 45 de 25 de agosto de 2014.
Esta resolução também define os métodos que devem ser efetuados para
a análise de cada parâmetro de qualidade, bem como os valores para a aceitação
do padrão de qualidade adotado nacionalmente, conforme descrito na Tabela 1.
21
Tabela 1 - Especificação do biodiesel
CARACTERÍSTICA UNIDADE LIMITE MÉTODO
ABNT NBR ASTM D EN/ISO Aspecto - LII (1) (2) - - -
Massa específica a 20º C kg/m³ 850 a 900 7148 14065
1298 4052
EN ISO 3675 EN ISO 12185
Viscosidade Cinemática a 40ºC
mm²/s 3,0 a 6,0 10441 445 EN ISO 3104
Teor de água, máx. mg/kg 200,0 (3) - 6304 EN ISO 12937
Contaminação Total, máx. mg/kg 24 15995 - EN 12662 (5)
Ponto de fulgor, mín. (4) ºC 100,0 14598 93 EN ISO 3679
Teor de éster, mín % massa 96,5 15764 - EN 14103 (5)
Cinzas sulfatadas, máx. (6) % massa 0,020 6294 874 EN ISO 3987
Enxofre total, máx. mg/kg 10 15867 5453 EN ISO 20846 EN ISO 20884
Sódio + Potássio, máx. mg/kg 5 15554 15555 15553 15556
- EN 14108 (5) EN 14109 (5) EN 14538 (5)
Cálcio + Magnésio, máx. mg/kg 5 15553 15556
- EN 14538 (5)
Fósforo, máx. (7) mg/kg 10 15553 4951 EN 14107 (5) EN 16294 (5)
Corrosividade ao cobre, 3h a 50 ºC, máx. (6)
- 1 14359 130 EN ISO 2160
Número Cetano (6) - Anotar - 613 6890 (8)
EN ISO 5165
Ponto de entupimento de filtro a frio, máx.
ºC (9) 14747 6371 EN 116
Índice de acidez, máx. mg KOH/g 0,50 14448 -
664 -
EN 14104 (5)
Glicerol livre, máx. % massa 0,02 15771 15908 (5) -
6584 (5) -
EN 14105 (5) EN 14106 (5)
Glicerol total, máx. (10) % massa 0,25 15344 15908 (5)
6584 (5) -
EN 14105 (5)
Monoacilglicerol, máx. % massa 0,7 15342 (5) 15344 15908 (5)
6584 (5) EN 14105 (5)
Diacilglicerol, máx. % massa 0,20 15342 (5) 15344 15908 (5)
6584 (5) EN 14105 (5)
Triacilglicerol, máx. % massa 0,20 15342 (5) 15344 15908 (5)
6584 (5) EN 14105 (5)
Metanol e/ou Etanol, máx. % massa 0,20 15343 - EN 14110 (5)
Índice de Iodo g/100g Anotar - - EN 14111 (5)
Estabilidade à oxidação a 110ºC, mín. (11)
h 6 (12) - - EN 14112 (5) EN 15751 (5)
Fonte: ANP Res N° 45
22
Dos dados fornecidos pela ANP apresentados na Tabela 1, no presente
trabalho somente o valor limite para o teor de glicerol livre, que corresponde a
0,02% em massa, será avaliado.
3.2 Glicerol
3.2.1 Definição
O glicerol é um álcool trihidroxilado (Figura 5), obtido como coproduto na
reação de transesterificação. A presença de um grupo OH ligado a cada carbono
torna o glicerol reativo, possibilitando a participação em diversas reações
químicas. O glicerol se apresenta na forma líquida, transparente, inodora, de
sabor doce, viscoso e de densidade levemente maior que a da água (UMPIERRE
et al, 2013).
Figura 5 - Fórmula estrutural do glicerol
Fonte: KNOTHE et al, 2006
O glicerol pode ser encontrado em fontes diversas tanto na forma livre ou
combinada, para formar os glicerídeos, mono, di e triglicerídeos. A quantificação
do glicerol total consiste na determinação do somatório dos teores de glicerol livre
e combinado, enquanto a quantificação do glicerol livre, só determina,
obviamente, o teor de glicerol livre.
O glicerol é atualmente usado em quase todas as áreas da indústria, mas
principalmente nas áreas de medicamentos, alimentos, cosméticos e produtos
para higiene (KNOTHE et al, 2006). Porém com a mudança na balança comercial
do glicerol, com o aumento de produção devido ao aumento da produção de
23
biodiesel, novos usos têm sido desenvolvidos para compensar o aumento de
estoque (RIVALDI, 2008).
3.2.2 Métodos de quantificação utilizados
A literatura apresenta vários métodos para a quantificação de glicerol livre
e combinado, porém o método que é largamente aplicado é a cromatografia a gás
em altas temperaturas (HTGC). Entretanto, outros métodos cromatográficos
também foram estudados, como cromatografia em camada delgada com detecção
por ionização de chama, cromatografia por exclusão molecular e cromatografia
líquida de alta eficiência, com diversos detectores. Outros tipos de métodos como
espectrofotometria no UV-VIS e métodos eletroanalíticos também já foram
propostos (MARQUES, 2011).
3.3 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE – DAD)
A cromatografia é um método de separação de componentes presentes
numa amostra por meio de interações desta com duas fases, uma estacionária,
que é a coluna, e outra móvel, os solventes, sendo as duas imiscíveis. As
polaridades da fase móvel e da fase estacionária são sempre opostas para
acentuar a separação dos compostos, no caso da análise por fase reversa a
coluna é apolar e os solventes polares. Todos os constituintes de um sistema
cromatográfico podem ser observados na Figura 6.
24
Figura 6 - Sistema cromatográfico
Fonte: COLLINS, 2009
O tempo de retenção dos compostos presentes na amostra varia
conforme maior ou menor interação com uma das fases, móvel ou estacionária,
pois o caminho que esses compostos fazem para atravessar a coluna é diferente
devido a essas interações. Por exemplo, um composto apolar terá uma interação
maior com a coluna, sendo esta apolar como no exemplo anterior, o composto
será mais retido que um outro composto polar que terá maior interação com a
fase móvel polar, saindo mais rápido da coluna.
A quantificação propriamente dita ocorre somente no detector, parte final
do equipamento de cromatografia, após a amostra passar pela etapa de
separação na coluna. Os detectores normalmente têm o funcionamento muito
parecido com outras técnicas de análise.
O detector mais utilizado é o ultravioleta, porém o detector de arranjo de
diodos (DAD), Figura 7, tem o mesmo tipo de funcionamento, que consiste na
capacidade da amostra de absorver energia emitida por uma fonte de luz. Além
disso, o DAD realiza varredura da amostra em diversos comprimentos de onda ao
25
mesmo tempo, o que o torna detector ideal para realizar desenvolvimento de uma
metodologia por CLAE (CIENFUEGOS, 2000).
Figura 7 - Esquema de funcionamento do DAD
Fonte: COLLINS, 2006
A vantagem da cromatografia líquida em relação à gasosa está no fato
das inúmeras configurações disponíveis na primeira, o que permite uma enorme
versatilidade de aplicações e assim possibilita a separação de misturas
complexas como isômeros, pois existe no mercado grande diversidade de colunas
cromatográficas com diferentes configurações de recheio e também diversos
detectores
3.4 Desenvolvimento de método cromatográfico
Os parâmetros descritos a seguir são alguns pontos importantes no
desenvolvimento de métodos analíticos de cromatografia líquida e a análise
minuciosa da influência destes permite chegar a uma otimização do método a ser
desenvolvido. Os fatores descritos são interdependentes, conforme as relações
descritas a seguir, presentes em Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010.
26
3.4.1 Parâmetros cromatográficos
• Composição da fase móvel (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
A mistura de solventes deve produzir soluções homogêneas, caso
contrário podem prejudicam o desempenho da bomba, da coluna e induzem
ruídos no detector além de alterar os tempos de retenção e interferir nas análises
quantitativas.
A fase móvel deve dissolver completamente todos os componentes da
amostra facilitando o transporte através da coluna, sendo que a fase móvel
também deve apresentar inércia química com a fase estacionária e os
componentes da amostra, para evitar perda de amostra ou danos à coluna
durante a análise.
• Dimensões da coluna e interações químicas (Agilent Technologies, 2011 e
Katálysis, 2010)
A coluna é a parte do cromatógrafo onde, de fato, ocorre a separação da
amostra. A amostra, que está dissolvida em um solvente, é injetada na coluna
cromatográfica, cujo recheio é chamado de fase estacionária.
Um bombeamento com vazão constante leva a fase móvel para dentro da
coluna, de modo que a amostra percorra o comprimento da coluna, deslocando os
componentes da mistura através dela e fazendo com que estes se distribuam de
acordo com a afinidade de cada um.
Se um componente da mistura tem afinidade com a fase móvel, ele
continua percorrendo o comprimento da coluna dissolvido no solvente. Porém, se
possui afinidade com o recheio da coluna, ele fica retido por um determinado
tempo nesta posição, interagindo com a fase estacionária.
• Fluxo dos solventes (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
Os solventes são bombeados pelo sistema cromatográfico até a coluna,
sob pressão, a um fluxo constante. Esse fluxo é responsável por empurrar todos
27
os compostos presentes na coluna até o detector para que possam ser
detectados. O aumento do fluxo leva a uma eluição mais rápida de todos os
compostos independentemente de interações químicas.
Outro fator que cresce quando o fluxo é aumentado é a pressão do
sistema, pois ao aumentar a vazão de bombeamento da fase móvel a pressão de
retorno exercida pela fase estacionária no interior da coluna também aumenta.
Porém, ao reduzir o fluxo de solventes, a pressão na coluna é diminuída
preservando a qualidade do recheio e tempo de vida da coluna, porém aumenta-
se o tempo de eluição dos componentes da amostra e, consequentemente, o
tempo total da análise.
• Pressão do equipamento (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
A variação da pressão da coluna depende de fatores tais como a vazão
da fase móvel, o comprimento da coluna, a viscosidade da fase móvel, o diâmetro
das partículas e o empacotamento do recheio da coluna. Quando a viscosidade
da fase móvel é elevada acarreta em dificuldades no bombeamento e em
aumento da pressão da coluna.
A pressão exercida deve ser controlada conforme o valor suportado pela
coluna. Essa informação está presente no encarte do fabricante que vem junto
com a coluna no momento da aquisição. Caso a pressão exceda o valor
suportado, a coluna terá sua vida útil reduzida.
O aumento de pressão também poderá causar a formação de caminhos
preferenciais da amostra por dentro do recheio da coluna, o que prejudica a
interação do analito com a fase estacionária e também a separação dos
componentes da amostra a ser analisada.
• Temperatura do forno da coluna (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis,
2010)
A temperatura influencia fortemente parâmetros como solubilidade,
difusividade, polaridade e viscosidade da fase móvel. Em temperaturas mais
28
elevadas, a viscosidade é reduzida e a velocidade de difusão aumenta, fazendo
com que a velocidade de transferência de massa entre a fase estacionária e a
fase móvel seja aumentada e com ela a eficiência, tornando possível diminuir
substancialmente o tempo de análise.
• Comprimento de onda do detector (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis,
2010)
Com o detector DAD pode-se selecionar o melhor comprimento de onda
para cada um dos picos analisados, dessa forma, otimizando a sensibilidade. Isso
é extremamente importante na determinação de impurezas em sínteses e no
controle de qualidade de princípios ativos.
• pH da fase móvel (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
Em cromatografia líquida, quando se faz a separação de compostos
ácidos ou básicos, o controle do pH é muito importante. Na grande maioria das
vezes, faz-se o uso da fase móvel constituída de uma solução tampão, enquanto,
em outras vezes, usa-se como fase móvel uma solução adicionada de um ácido
fraco ou base fraca, de maneira a não sofrer alterações significativas de pH.
• Volume de injeção (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
O volume de injeção consiste na quantidade de amostra a ser sugado
pela agulha do amostrador automático e injetada no looping do sistema
cromatográfico. Volumes maiores de amostras aumentam a intensidade de sinais,
mas podem causar uma sobrecarga na coluna, causando alargamento dos picos,
assim, deixando o cromatograma com menor qualidade.
Ao aumentar o volume de amostra injetado aumenta-se também o sinal
das impurezas nas amostras e padrões e pode aumentar muito a relação desses
interferentes com o analito, prejudicando a análise.
O volume de injeção máximo pode ser calculado em função do volume
interno da coluna, que é calculado pelo volume de um tubo, a partir do diâmetro e
comprimento da coluna. O volume ideal de injeção é determinado balanceando-se
29
a capacidade de detecção e o efeito de interferentes.
3.4.2 Conceitos essenciais de qualidade em cromatografia
• Resolução (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
A medida de resolução (R) é tida como a capacidade de separar os picos
dos analitos na linha de base do cromatograma, conforme a figura 8. Uma boa
resolução é o objetivo primário da cromatografia, ou seja, o principal ponto é uma
boa separação dos picos dos compostos de interesse, no qual um método tido
como ótimo apresenta bandas estreitas completamente resolvidas umas das
outras.
Equação 1 - Fórmula para cálculo de resolução
R = t!(!) − t!(!)W(!) +W(!)
2
Fonte: KATÁLYSIS, 2010
Figura 8 - Cálculo de resolução do método
Fonte: KATÁLYSIS, 2010
A resolução é afetada por outros parâmetros como eficiência, fator de
30
capacidade e seletividade, que serão descritos na sequência, de acordo com a
formula descrita abaixo.
Equação 2 - Fórmula completa da resolução
Fonte: KATÁLYSIS, 2010
• Eficiência (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
A eficiência do método é obtida através de um cálculo que permite medir
a capacidade de uma coluna em fazer a separação ideal de compostos. É feito
uma relação entre o número de pratos teóricos (N) com a eficiência, assim como
em uma torre de destilação.
A situação que define uma boa medida de eficiência é a que apresenta
picos mais estreitos, onde há distribuição mais discreta de dados, para o mesmo
tempo de retenção. É ideal evitar o alargamento das bandas cromatográficas, pois
evita-se a supressão de picos e possibilita uma melhor separação sem que haja
um afastamento notável dos picos.
A maior influência na eficiência do método se dá por parâmetros
relacionados às colunas utilizadas, como comprimento, diâmetro, tipo do recheio
e tamanho de poro, assim, é tido como um método para se medir a performance
da coluna.
Esse cálculo matemático leva em consideração o tempo de retenção de
um analito (tR) e a largura desse mesmo pico a meia altura (W1/2). Desta forma,
quanto maior o número de pratos teóricos, maior a eficiência do método e melhor
a performance da coluna.
31
Equação 3 - Cálculo do número de pratos teóricos
N = 5,54 t!W!/!
!
Fonte: KATÁLYSIS, 2010
Figura 9 - Cálculo de eficiência do método
Fonte: KATÁLYSIS, 2010
• Simetria (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
A simetria do pico é um fator que analisa o formato do pico, um pico ideal
deve apresentar um formato de uma distribuição gaussiana, o qual assume que o
formato do pico deve ter uma leve assimetria. Uma boa simetria consiste num
pico levemente assimétrico, sem ombros e caudas.
Deve-se analisar a assimetria do pico e o fator de cauda. Os fatores que
influenciam em uma assimetria muito grande são a interação excessiva do
composto com a coluna ou quando um volume de amostra muito grande é
32
injetado, podendo deformar o pico, o que é percebido durante a análise de
simetria.
Os valores de assimetria e fator de cauda podem ser calculados conforme
figura abaixo.
Figura 10 - Cálculos de simetria dos sinais
Fonte: KATÁLYSIS, 2010
• Fator de capacidade (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
O fator de capacidade ou fator de retenção (k’) calcula o grau de retenção
de um composto, ou seja, o tempo que esse componente permanece na fase
estacionária em relação ao tempo de permanência deste na fase móvel. No
cálculo deste fator leva-se em consideração o tempo necessário para que um
composto que não é retido leva do local da injeção até chegar no detector,
chamado de t0.
33
Figura 11 - Cálculo de fator de capacidade
Fonte: KATÁLYSIS, 2010
Os fatores que mais influenciam a retenção dos compostos são
mudanças nas fases móvel e estacionária, uma vez que esse parâmetro relaciona
a interação das fases com os analitos.
• Seletividade (Agilent Technologies, 2011 e Katálysis, 2010)
A seletividade de um método permite relacionar a capacidade do método
em apresentar os picos resolvidos um dos outros. O cálculo da seletividade (α) é
possível através do cálculo da separação relativa de dois picos a partir da
retenção destes, ou seja, o fator de capacidade relativo destes picos.
Como a seletividade é somente uma comparação de fatores de
capacidade, os fatores que influenciam a retenção dos picos, também influenciam
a seletividade do método de análise.
34
Figura 12 - Cálculo de seletividade
Fonte: KATÁLYSIS, 2010
• Limite de Detecção e Quantificação (Agilent Technologies, 2011 e
Katálysis, 2010)
O limite de detecção (LD) equivale a mínima concentração de analito
analisada que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificada.
Enquanto, o limite de quantificação (LQ) indica a menor concentração do analito
que pode ser mensurada utilizando um determinado procedimento experimental.
Segundo Ribani, 2004 um dos tipos de cálculo dos limites de detecção e
quantificação adotados mais confiável estatisticamente consiste no método de
parâmetros da curva analítica, no qual os limites podem ser expressos em função
do desvio padrão da resposta, que corresponde ao desvio padrão do coeficiente
linear da equação (sL), e da inclinação da curva de analítica que corresponde ao
coeficiente angular da curva (a), segundo as equações 4 e 5.
Equação 4 - Cálculo do limite de detecção
𝐿𝐷 = 3,3 × 𝑠!𝑎
Fonte: Adaptada de RIBANI, 2004
35
Equação 5 - Cálculo do limite de quantificação
𝐿𝑄 = 10 × 𝑠!𝑎
Fonte: Adaptada de RIBANI, 2004.
3.5 Quantificação do glicerol
A quantificação do glicerol pode ser feita a partir da utilização de uma
curva de calibração com padronização de massa e concentração conhecida.
O primeiro passo é o cálculo da reta padrão, na qual deve-se calcular as
áreas encontradas na integração dos picos resultantes da injeção de cada padrão
e com suas respectivas massas proceder uma regressão linear, tendo-se a área
(Y) e a massa (X) conhecidas, a equação da reta será obtida segundo a equação
6.
Equação 6 - Equação padrão de uma reta
Y = aX+ b Fonte: Própria
O cálculo da massa da amostra é feito utilizando a equação obtida (Y= aX
+ b) e a área resultante da análise para calcular a massa (mg) real presente na
amostra analisada. A massa real de glicerol presente na amostra é calculada pela
equação 7, substituindo as incógnitas pelos dados utilizados nos experimentos
(massa e área) e também os resultando da equação 6.
Equação 7 - Cálculo de massa da amostra
m!"#$"%&'(' = Area− b
a
Fonte: Própria
Porém a massa real obtida é dada em miligramas, para encontrar a
porcentagem de glicerol na amostra é necessário fazer o cálculo em % (m/m),
segundo a equação 8, somente substituindo os dados utilizados nos
experimentos.
36
Equação 8 - Cálculo de porcentagem mássica
% m m = m!"#$"%&'('
m!"#$%$ × 100
Fonte: Própria
A integração da área do pico obtido na análise é feita automaticamente
pelo software do equipamento, assim como o cálculo de massa real encontrada,
conforme foi descrito acima, uma vez que as informações de massa das amostras
pesadas e padrões e valores de pureza sejam inseridos no software.
Um ponto importante na análise da qualidade na quantificação do ativo é
a linearidade da curva de calibração, essa informação é mostrada pela correlação
linear da reta obtida na curva de calibração.
A correlação linear é frequentemente utilizada para indicar o quanto a reta
pode ser considerada adequada como modelo para o estudo de caso. O valor
esperado para o coeficiente de correlação (r) deve ser ≥ 0,99, provando desta
forma a linearidade do modelo, ou seja, mostrando que a área encontrada na
integração dos picos dos cromatogramas têm uma relação linear com a massa da
amostra.
37
4 MATERIAIS E METODOLOGIA
O presente trabalho foi encaminhado para a resolução de três desafios:
desenvolvimento do método analítico, verificação da confiabilidade e da faixa de
trabalho do método desenvolvido para determinar um padrão de qualidade para
as análises dos dados, além da verificação da efetiva concentração de glicerol
livre em amostras de biodiesel.
Os objetivos do trabalho foram direcionados segundo da Resolução RE no
899, de 29 de maio de 2003 da ANVISA e CRQ-IV/SP,2010, somente alguns
parâmetros foram considerados, uma vez que dentre os objetivos deste trabalho
não constava a validação da metodologia desenvolvida, devido à falta de
disponibilidade necessária de amostras e do equipamento e suficientes para uma
validação completa.
O principal objetivo do trabalho foi o desenvolvimento de um método
analítico por cromatografia líquida capaz de quantificar glicerol livre em amostras
de biodiesel, sendo fator preponderante a determinação de parâmetros
cromatográficos ideais para a análise, deste modo foram avaliados os fatores
isoladamente visando a otimização do método.
No desenvolvimento desse projeto também foram avaliadas as influências
dos seguintes parâmetros cromatográficos pertinentes ao equipamento:
composição da fase móvel, química da coluna, volume de injeção da amostra,
fluxo dos solventes, pressão interna da coluna, temperatura do forno da coluna,
comprimento de onda do detector, pH da fase móvel e interação do analito com o
solvente.
Além de estabelecer os parâmetros do equipamento foram avaliados
fatores que determinam a qualidade dos cromatogramas, tais como resolução e
simetria dos picos, eficiência, fator de capacidade e seletividade do método.
Esses parâmetros são fatores de caráter informativo quanto à qualidade, porém
não são usados para rejeição da metodologia.
As análises cromatográficas foram realizadas no laboratório de Garantia
da Qualidade da BASF SA em Guaratinguetá, localizado no prédio C25.
38
4.1 Materiais
4.1.1 Descrição das amostras
Neste trabalho foram utilizadas amostras de biodiesel preparadas por
mestrandos do Programa de Pós-graduação em Engenharia Química da Escola
de Engenharia de Lorena (EEL-USP). Estas amostras foram obtidas por
transesterificação de óleo palmiste com etanol via catálise heterogênea básica
com óxido de nióbio (SANTOS, 2015).
Foram utilizados dois tipos de amostras. No primeiro, a amostra foi
referente ao final da reação de transesterificação, sem nenhum tipo de tratamento
ou purificação (denominadas amostras sem purificação). Enquanto o segundo tipo
de amostra foi separado após a etapa de purificação (denominadas amostras
após purificação).
Para a purificação das amostras foram utilizados variados métodos de
purificação, um dos métodos de purificação utilizados foi descrito por Carvalho,
2011, porém o objetivo desse trabalho é analisar a quantidade de glicerol nas
amostras antes e após a etapa de purificação, independente da metodologia
utilizada na purificação. Deste modo, o método desenvolvido pode ser utilizado
para quantificar o glicerol livre presente em qualquer tipo de amostra de biodiesel.
Para este trabalho, o glicerol das amostras analisadas já havia sido
isolado previamente, portanto a preparação primária não foi realizada neste
trabalho. Porém como consiste em uma etapa indispensável à metodologia
desenvolvida, esta etapa encontra-se descrita neste método.
4.1.2 Preparação primária da amostra
Para o isolamento do glicerol das amostras de biodiesel foi utilizado
hexano PA e um solvente de trabalho que consiste em uma solução de
etanol/água destilada na proporção 1:1. Além destes, foram utilizadas soluções 10
mM de metaperiodato de sódio e 0,2 M de acetilacetona.
39
Outros materiais utilizados para separação das fases foram pipetas de
Pasteur e tubos de vidro.
4.1.3 Preparação secundária da amostra
Para o preparo secundário da amostra foi necessária a preparação de
uma solução diluente de acetonitrila grau HPLC da marca J.T. Baker e água
deionizada na proporção volumétrica de 70% de acetonitrila e 30% de água.
Outros materiais necessários foram balões volumétricos de 10 ml de Vidro
Boro-Silicato certificados da marca Pyrex e filtro de membrana RC hidrofílico para
filtração de solventes orgânicos e aquosos de 0,2 µm, da marca Sartorius.
4.1.4 Desenvolvimento do método
Glicerol PA 85% (Merck) foi usado como padrão para implementação do
método de análise. As amostras de biodiesel foram preparadas no Laboratório de
Biocatálise da Escola de Engenharia de Lorena (EEL-USP) e foram obtidas por
transesterificação de óleo palmiste com etanol via catálise heterogênea.
Outros materiais que foram utilizados, além dos já descritos acima, são:
proveta graduada, pipeta volumétrica, vials de 2 ml.
4.2 Equipamentos
4.2.1 Preparações das amostras
Para a preparação primária da amostra foi utilizada uma centrífuga,
agitador e um banho de água termostizado.
Para a pesagem das amostras para o preparo de soluções para análise
foi utilizada uma balança analítica com resolução de 0,1 mg, modelo XS205 dual
range da Mettler-Toledo.
40
4.2.2 Preparo de solventes
Para o preparo da água ultrapura a ser usada na fase móvel
cromatográfica foi utilizado um sistema de purificação de água modelo Milli‑Q
Reference Ultrapure Water Purification System Type 1, da Merck Millipore, USA.
Para a homogeneização da fase móvel usada no preparo da amostra de
análise e da própria amostra de análise foi utilizado um banho ultrassônico de
modelo USC3300, da Eco Sonics, BR.
4.2.3 Análise cromatográfica
Para análise de cromatografia líquida foi utilizado o sistema
cromatográfico modelo Agilent 1200 series com bomba quaternária, injetor
automático de amostras, forno de coluna e detector de arranjo de diodos, Diode
Array Detector – DAD, com uma coluna modelo ZORBAX NH2 de dimensões 4.6
x 250 mm com 5 mm de diâmetro de poro, todos da marca Agilent Technologies,
USA. Somente a lâmpada de ultravioleta do detector foi utilizada neste método.
4.3 Metodologia
A partir do objetivo de desenvolver um método de quantificação de
glicerol livre por cromatografia líquida de alta eficiência, foram tomadas por base
metodologias descritas em LOZANO, 1996; LOURENÇO, 2009; HOL, 1999;
BONDIOLI, 2005 e DRUZIAN, 2005, efetuando as modificações necessárias ao
longo do desenvolvimento.
4.3.1 Preparação primária das amostras
As amostras foram submetidas a uma primeira etapa de preparação de
amostras, que consistiu no isolamento do glicerol da amostra de biodiesel. Essa
etapa é necessária para proteger a coluna do cromatógrafo e facilitar a separação
dos compostos, pois quanto menos compostos presentes na amostra, mais fácil é
a separação.
41
A metodologia utilizada para isolamento de glicerol já estava sendo
utilizada por alunos do laboratório de biocatálise quando a quantificação de
glicerol livre é feita via espectrofotometria, segundo metodologia descrita em
BONDIOLI, 2005.
Essa etapa de preparo de amostra consistiu na extração do glicerol do
biodiesel e foi feita pela pesagem de 1 grama de biodiesel e adição de 4 mL de
hexano e 4 mL de solvente de trabalho.
Após essa adição, as amostras foram submetidas a agitação em vortex
durante 5 minutos para garantir uma extração eficiente. Em sequência, as
amostras foram centrifugadas a 2000 rpm por 15 min e o sobrenadante foi
removido com pipeta Pasteur e descartado.
Uma alíquota de 0,5 ml da fase inferior contendo o glicerol foi transferido
para um tudo de vidro, no qual foram adicionados 1,5 ml de solvente de trabalho
(Etanol: água, 1:1), 1,2 ml de solução 10 mM de meta periodato de sódio e 1,2 ml
de solução 0,2 M de acetilacetona. Posteriormente as amostras foram levadas a
um banho de água termoestatisado a 70°C por cerca de 1 min e em seguida
resfriadas por imersão em água a 20°C por 2 min.
4.3.2 Preparação secundária da amostra
A segunda etapa da preparação das amostras iniciou com o preparo da
solução diluente, de concentração 70% acetonitrila e 30% água deionizada e
consistiu em misturar em um frasco de 1 L as quantidades exatas medidas em
proveta graduada e deixar a solução em banho ultrassom por 10 minutos, para
homogeneizar a amostra e retirar as bolhas de ar que são prejudiciais ao
cromatógrafo.
O segundo passo foi a da preparação da solução de análise para a
injeção no cromatógrafo. Da amostra obtida após a primeira etapa foram pesados
250 mg da amostra sem purificação ou 500 mg após purificação separadamente
em balões volumétricos de 10 ml e completados até pouco antes do menisco com
a solução diluente preparada.
42
Após completar o balão com a solução diluente, os balões são levados a
um banho ultrassom por 5 minutos, de modo que a solução fique homogênea.
Logo após a retirada do banho o menisco foi aferido com o diluente e o balão foi
agitado manualmente para homogeneização final.
A última etapa é filtrar a amostra com filtro de membrana para completa
retirada de precipitados e ar. Após esta etapa, transferir uma pequena porção da
amostra para o vial de análise usado no amostrador automático do cromatógrafo.
4.3.3 Desenvolvimento da metodologia de análise
A metodologia foi desenvolvida utilizando padrão de glicerol PA 85% em 3
concentrações utilizando curva de calibração por padronização externa. Foram
pesados padrões com 3,30 mg, 7,00 mg e 10,30 mg para criar a curva de
calibração e os padrões foram preparados com a mesma metodologia usada na
preparação das amostras, como descrito no item 4.3.2.
O método foi desenvolvido com corridas consecutivas da amostra até
otimizar cada um dos parâmetros descritos no item 3.4.1, para garantir que o
método teve condições ideais de análise. O método final resultou dos testes de
cada parâmetro, seguido pela otimização de cada um deles.
Os parâmetros de equipamento obtidos como ideais para esse método
são: temperatura do forno de coluna de 25° C, fluxo de fase móvel de 1,5 ml/min,
volume de injeção de 80,0 µl e comprimento de onda do detector de 195 nm.
A fase móvel utilizada no método consistia em 80% acetonitrila e 20%
água deionizada em proporção volumétrica e os componentes foram levados ao
equipamento em frascos separados, a mistura foi feita pelo sistema de bomba
quaternária do cromatógrafo. A fase móvel foi bombeada para a coluna de forma
isocrática.
A pressão do equipamento foi ajustada para estar entre 0 e 400 bar, caso
a pressão supere 400 bar o equipamento foi programado para interromper o fluxo
de solventes para a coluna e parar a análise, deste modo foi evitado o desgaste
43
da coluna. Esses valores de pressão foram retirados do encarte que acompanha
a coluna e são dados que dependem da coluna utilizada.
O pH da água deionizada foi controlado para estar sempre na faixa entre
5 e 8 para não danificar a coluna, durante o preparo da solução o pH da água foi
medido e anotado para conhecimento, porém não foi determinado um pH fixo
para este método, apesar de notado que o pH sempre esteve na faixa ideal.
4.3.4 Análise da amostra branco
Para a confirmação de que nenhum outro composto tem o mesmo tempo
de retenção do glicerol e assim atrapalhar o desempenho da quantificação, foi
realizado um teste com uma amostra branco, que consistiu em uma amostra de
análise preparada da mesma forma que as outras porém sem a adição de glicerol
na amostra, sendo assim no balão somente foi adicionada a fase móvel.
44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados mostrados a seguir foram obtidos pelas análises
cromatográficas das amostras descritas utilizando o método desenvolvido e
descrito no presente trabalho. Foram realizadas análises de duas amostras
utilizando-se duas massas diferentes para cada uma delas e do padrão de glicerol
em três diferentes concentrações.
5.1 Cromatograma das amostras
As amostras foram preparadas com massas diferentes, 150 e 250 mg
para a amostra sem purificação e 400 e 500 mg para a amostra após purificação,
segundo a metodologia descrita neste método, esta alteração foi feita visando
avaliar a influência do aumento da massa da amostra na área do sinal detectado
e mantendo o resultado dentro dos valores determinados pela curva de
calibração.
O resultado esperado é que a resposta da relação massa/área para todas
as análises realizadas seja constante, de modo que o modelo de linearização
adotado realmente seja o mais adequado e possa ser utilizado. Além disso, pouco
desvio dessa relação indica que o método desenvolvido apresenta boa precisão
para quantificar o ativo da amostra.
45
Figura 13 - Cromatograma da amostra sem purificação - 144,31 mg
Fonte: Própria
Figura 14 - Cromatograma da amostra sem purificação - 256,60 mg
Fonte: Própria
46
Figura 15 - Cromatograma de amostra após purificação - 412,17 mg
Fonte: Própria
Figura 16 - Cromatograma de amostra após purificação - 506,99 mg
Fonte: Própria
47
Para a amostra após purificação, a preparação foi feita pesando massas
maiores, pois a concentração esperada de glicerol para essas amostras é menor
do que nas amostras sem purificação. Essa modificação foi necessária para
manter a concentração dentro da curva de calibração elaborada para esse
método.
Outro fator decisivo para realizar esse aumento da massa das amostras
foi devido a concentração esperada ser muito baixa, assim o aumento da massa
pesada facilitaria a detecção do pico. Para todas as amostras analisadas o valor
de massa pesada corrigida pela pureza encontrava-se na faixa de concentração
analisada na curva de calibração.
Com base na análise dos cromatogramas obtidos foi possível perceber
que nas amostras após purificação, mesmo preparadas com o dobro do peso da
massa das amostras sem purificação, não houve detecção do pico do glicerol.
5.2 Padronização e quantificação
A padronização foi feita utilizando-se um método absoluto, pois dispensa
a identificação de todos os compostos presentes na amostra, visto que o objetivo
era somente quantificar o composto de interesse, ou seja, o glicerol. Também foi
levado em conta que a padronização absoluta é excelente para quantificar
amostras que apresentam baixa concentração de componentes.
O método de padronização absoluta utilizado foi a padronização externa,
que consiste na criação de uma curva de calibração a partir das análises dos
padrões feitas separadamente das amostras, sendo ambos injetados no
equipamento sob a mesmas condições de preparo e parâmetros de análise.
No método de padronização externa não é feita a fortificação das
amostras com padrões, os padrões são analisados separadamente para a
construção de uma curva de calibração que será utilizada para a quantificação
das amostras.
A curva de calibração foi elaborada a partir da construção de uma reta,
onde no eixo das abcissas (X) foram adicionados os valores de massas corrigidas
48
dos padrões, ou seja, a massa pesada corrigida pela pureza do padrão utilizado.
No eixo das ordenadas (Y) foram adicionados os valores de área encontrados na
integração dos picos cromatográficos.
Os pontos da curva adotados foram executados pela análise de três
padrões de concentrações diferentes. Foram pesados 3,30; 7,00 e 10,30 mg de
glicerol PA 85% de pureza para um balão de mesmo volume, ou seja, de 10 mL,
segundo a metodologia descrita anteriormente.
Porém, a massa real utilizada para cálculos foi a massa pesada
considerando a pureza do padrão de glicerol de 85%, assim as massas reais de
glicerol utilizadas para a elaboração da curva de calibração são I - 2,81; II - 5,97 e
III - 8,83 mg.
Figura 17 - Cromatograma do padrão I
Fonte: Própria
49
Figura 18 - Cromatograma do padrão II
Fonte: Própria
Figura 19 - Cromatograma do padrão III
Fonte: Própria
50
Figura 20 - Curva de calibração
Fonte: Própria
51
Os dados de massas reais das amostras e áreas obtidas nas integrações
dos sinais das análises dos padrões I, II e III utilizados para a construção da curva
de calibração estão descritos na tabela 2, enquanto que os dados resultantes da
curva de calibração, encontram-se na figura 21.
Tabela 2 - Dados utilizados para construção da curva
Fonte: Própria
Figura 21 - Dados obtidos na construção da curva
Fonte: Própria
O coeficiente de correlação obtido através da curva de calibração
elaborada com os padrões para o presente trabalho foi de 0,99992. Essa
correlação indica uma relação direta entre X (massa) e Y (área) com um grau de
ajuste perfeito pela linearização utilizada, pois apresenta valor maior que 0,99.
Esse tipo de padronização foi escolhido devido ao fato do padrão ter uma
pureza não muito alta para ser utilizado em análise por HPLC, ou seja, devido ao
fato do teor de impurezas do padrão ser elevado, o que poderia interferir na
52
análise das amostras caso fosse usada a padronização interna, na qual o padrão
seria adicionado ao balão volumétrico em conjunto com as amostras.
Após a curva de calibração ser elaborada, a quantificação do glicerol livre
foi feita pela regressão linear das áreas dos picos encontradas nas análises com
base na curva de calibração montada para o experimento, assim criando uma
relação entre a área dos sinais cromatográficos das amostras e as áreas e
massas dos três padrões utilizados, permitindo, portanto, a determinação do teor
de glicerol livre, conforme a figura 21.
Portanto, o primeiro passo para a quantificação é a integração dos sinais
cromatográficos para a obtenção da área equivalente utilizada na fórmula de
cálculo de massa descrita para a quantificação do glicerol. A integração utilizada
foi obtida de modo automático pelo equipamento e os dados que o equipamento
utilizou estão mostrados no apêndice.
Após a integração dos sinais cromatográficos, as concentrações do
glicerol nas amostras foram obtidas a partir da substituição dos dados das
massas encontradas pela regressão linear da curva de calibração (Figura 22 e 23)
na equação 7. Para o cálculo efetivo da concentração das amostras analisadas, a
massa encontrada de ativo foi inserida na equação 8, juntamente com a massa
pesada de amostra, deste modo foi possível encontrar a porcentagem mássica de
glicerol presente nas amostras sem purificação, os dados encontram-se na tabela
4.
53
Figura 22 - Quantificação da amostra sem purificação - 144,31 mg
Fonte:Própria
Figura 23 - Quantificação da amostra sem purificação - 256,60 mg
Fonte: Própria
Tabela 3 - Resultado da quantificação das amostras
Fonte: Própria
54
Na análise dos resultados das amostras sem purificação foram
encontrados valores muito pequenos de coeficiente de variação e de desvio
padrão para tempo de retenção, relação área/massa e concentração de ativos.
Tabela 4 - Resultado de todas as quantificações
Fonte: Própria
Em todas as análises realizadas, nas quais o glicerol foi detectável, a
eluição do glicerol ocorreu em torno do tempo de 4 minutos e 50 segundos, tanto
nas análises das amostras quanto nas análises dos padrões, com um coeficiente
de variação e um desvio padrão muito pequeno, conforme indicado na tabela 5.
O pequeno valor do desvio padrão obtido nas medições da relação linear
de área/massa das análises e também do tempo de retenção do glicerol indica
que a metodologia apresenta boa precisão, com resposta consistente e com boa
performance na separação e quantificação do glicerol, além de indicar que
55
variações da massa não alteram a capacidade de detecção e quantificação do
analito.
Para os cromatogramas obtidos com as amostras após purificação, o
glicerol não foi detectável, portanto, a concentração pode ser interpretada como
menor que o limite de detecção do método, pois a impossibilidade de detecção e
integração da área do pico indica que a quantidade de glicerol na amostra possui
a mesma grandeza que o ruído do equipamento impossibilitando assim sua
detecção.
Porém, calculando-se o limite de detecção, possibilita-se a determinação
de uma grandeza para a concentração de glicerol das amostras após purificação.
Além de verificar se a qualidade das análises e as especificações das amostras
atendem as normas da ANP quanto à concentração de glicerol livre permitida na
amostra final de biodiesel.
Os cálculos do limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) foram
realizados segundo a equação 4 e 5, respectivamente, e resultaram em valores
descritos na tabela 6.
Tabela 5 - Valores calculados de LD e LQ
Fonte: Própria
Outro fator importante analisado foi a linearidade de todos os padrões
utilizados no desenvolvimento do método, a partir destes dados foi construída
uma reta com sete pontos para analisar a relação entre massa e área dos
padrões na faixa de trabalho.
56
Tabela 6 - Linearidade dos padrões de glicerol
Fonte: Própria Figura 24 - Gráfico da linearidade do glicerol
Fonte: Própria
A partir do resultado da plotagem do gráfico da linearização de 7 pontos
com um coeficiente de correlação de 0,9999 percebe-se que a faixa de trabalho
57
da curva de calibração apresenta um perfil linear na porção analisada, o que
indica boa capacidade de resposta do método desenvolvido e uma curva de
calibração com boa qualidade.
5.3 Análise dos conceitos de qualidade em cromatografia
Abaixo estão mostradas as figuras em que foram feitas comparações dos
perfis cromatográficos das amostras com o do padrão intermediário (P II). Foram
comparadas tanto as amostras antes e quanto as amostras depois da purificação,
além do perfil da amostra branco sem glicerol.
De todos cromatogramas obtidos foram analisados todos os parâmetros
relativos aos conceitos de qualidade em cromatografia, como por exemplo,
simetria, eficiência, resolução, fator de capacidade e seletividade.
Estes parâmetros não tem poder de invalidar o desenvolvimento do
método, somente indicam características específicas e servem para analisar e
avaliar a qualidade do método desenvolvido e possibilitar comparações
necessárias para a otimização dos parâmetros do equipamento durante o
processo de desenvolvimento.
Figura 25 - Cromatograma da amostra branco
Fonte: Própria
58
Figura 26 - Cromatograma comparativo da amostra sem purificação e padrão
Fonte: Própria
59
Figura 27 - Cromatograma comparativo da amostra após purificação e padrão
Fonte: Própria
60
A partir dos perfis analisados, com as comparações das amostras e dos
padrões apresentados nas figuras acima foi possível perceber que não há
nenhum interferente junto ou próximo do pico do glicerol que possa atrapalhar no
desempenho da quantificação do analito.
Com base nos cromatogramas analisados foi possível perceber que o
sinal apresenta boa simetria, pois o pico não apresenta caudas ou ombros. Os
sinais analisados não apresentam assimetria notável e são satisfatórios quanto à
simetria.
Além disso, os picos analisados apresentam formato fino e alongado,
picos com formato afilado e não arredondados indicam que o método tem boa
eficiência de separação do ativo. Devido ao formato percebido, a eficiência do
método em separar o glicerol dos outros componentes da amostra foi ideal.
Quanto à resolução, os picos apresentaram boa separação um dos outros
quando analisados pela linha de base dos cromatogramas. Como não há outros
picos próximos ao glicerol, isso indica que o método tem ótima resolução, pois
forneceu completo isolamento do ativo do resto dos compostos, esse fato é
resultado da otimização de todos os outros parâmetros.
O fator de capacidade do método se mostrou alto, pois o pico do composto
de interesse está bem afastado dos picos dos compostos não retidos, que não
tem nenhum tipo de interação com a coluna. Isto ocorre devido ao fato do glicerol
apresentar boa interação com a coluna e permanecer retido tempo suficiente para
ser bem separado.
A seletividade do método foi notada como satisfatória, como não há dois
compostos de interesse para calcular o tempo de retenção relativo entre pico de
componentes, então foi analisada pelo fator do alto isolamento dos outros
compostos, sendo que este é superior a 2 minutos.
Essa boa seletividade do método indica que fatores como composição da
fase móvel, quantidade de solvente orgânico, pH da fase móvel, temperatura da
coluna e fase estacionária foram bem otimizados, pois esses fatores influenciam
61
diretamente na seletividade de um método. Por este motivo, a otimização de cada
um dos parâmetros do método foi analisada.
5.4 Análise dos parâmetros cromatográficos
• Massa da amostra
A massa pesada da amostra deve ser 250 g para amostras sem
purificação e 500 mg após purificação. A decisão pela quantidade de massa na
preparação na amostra foi tomada levando em consideração a faixa linear de
trabalho da curva de calibração, além do limite de detecção do método. Com as
quantidades descritas acima ambos os parâmetros estão atendendo a norma
vigente.
• Composição da fase móvel
A fase móvel composta de acetonitrila (80%) e água deionizada (20%) foi
a melhor mistura encontrada para interagir com a amostra o suficiente para
ocorrer a separação necessária do composto na coluna.
• Dimensões da coluna e interações químicas
A coluna escolhida Zorbax NH2 possui essencialmente uma camada
monomolecular de aminopropilsilanos ligados quimicamente a um suporte
totalmente poroso de sílica gel com dimensões de 4,6 x 250 mm e 5 µm de
tamanho de partícula. A escolha da coluna foi baseada em DRUZIAN, 2005 e
após testes iniciais apresentou resultados satisfatórios e, portanto, foi mantida.
• Volume de injeção da amostra
O volume de injeção utilizado foi aumentado ao máximo suportado pela
coluna até 80 µl para que desse modo a intensidade do sinal cromatográfico fosse
maximizada.
62
• Fluxo dos solventes
O fluxo da fase móvel foi mantido em 1,5 ml por dois motivos, primeiro a
manutenção da pressão do equipamento dentro dos limites ideais e também para
garantir a separação bem resolvida do glicerol em um tempo de análise curto.
• Pressão do equipamento
A pressão do equipamento foi controlada em até 400 bar, importante para
a preservação da vida útil da coluna e dos selos do equipamento, além do fato de
não prejudicar a conformação espacial do recheio da coluna.
• Temperatura do forno da coluna
A temperatura do forno da coluna foi mantida na temperatura inicial de 25o
C, pois não mostrou ter grande influência na análise. Então a temperatura foi
mantida no menor grau possível, uma vez que a separação nesta temperatura era
boa.
• Comprimento de onda do detector
O comprimento de onda do detector foi mantido em 195 nm de modo a
minimizar o sinal dos interferentes e ainda possibilitando quantificar o glicerol, e
visto que ainda se encontra fora da região do UV Cutoff dos solventes utilizados.
• pH da fase móvel
O pH da fase móvel não foi um fator importante, pois tanto a fase móvel
quanto a fase estacionária apresentam força química intermediária e foi
simplesmente controlado dentro de uma faixa que não cause danos à coluna ou
ao detector.
63
6 CONCLUSÃO
A análise dos parâmetros de qualidade apresentados e analisados mostra
que o método desenvolvido apresentou resultados consistentes para a
concentração de glicerol nas amostras analisadas, independentemente do tipo da
amostra e do tipo de purificação.
Com o presente trabalho foi possível concluir que a metodologia
desenvolvida por HPLC atende as necessidades descritas nos objetivos, pois
apresenta uma resposta rápida de análise de 6 minutos e não necessita de
nenhuma derivatização para a realização da leitura do composto. A análise pode
ser feita em baixas temperaturas com gasto de pouco volume de solvente,
aproximadamente 25 ml por amostra. Este método é capaz de quantificar glicerol
livre em pequenas concentrações com alta precisão, resolução, eficiência e
sensibilidade.
Para atender as especificações regulamentadas nas normas existentes
na resolução No 45 da ANP, o biodiesel para sem comercializado necessita
apresentar uma porcentagem mássica de glicerol inferior a 0,02%. Deste modo,
conclui-se que o método é capaz de detectar a concentração mínima necessária,
porém as análises das amostras sem purificação indicam que é necessária uma
etapa de purificação para atender as normas em vigor e que a purificação
utilizada atender as especificações necessárias.
Assim, foi possível concluir que o método desenvolvido é capaz de
separar e quantificar glicerol livre em amostras de biodiesel feito a partir de óleo
palmiste com etanol por catálise heterogênea de óxido de nióbio, com a qualidade
exigida pelas especificações exigidas pela ANP.
64
REFERÊNCIAS
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APÊNDICE
Dados de integração dos sinais cromatográficos
Fonte: Própria
